Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфологические и молекулярно-биологические характеристики пограничных опухолей яичников

Виноградов Илья Игоревич

На правах рукописи

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ЬИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОГРАНИЧНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЯИЧНИКОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.03.02 патологическая анатомия

Рязань-2015

Работа выполнена на кафедре патологической анатомии с курсом судебной медицины ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет имени акал И.Г1.

Павлова»

Научные руководители:

доктор медицинских наук

Андреем Юлия Юрьепня

доктор биологических наук

Завялишивя Лариса Эдуардовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, зав. лаборатори- Мяннонис Александр ')луярлович ей иммуноморфолоти ГБУ Ростовской области «Патолого-анатомическое бюро»

доктор медицинских наук, профессор, зав. Щеголев Александр Иванович 2-м паггологоанитомическим отделением ФГЬУ «Научный центр акушерство, гинекологии и перинаталогии им. академика В.И. Кулаковц» Минздрава России

Ведущая оргянщааня: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени II И. Пирогова Минздрава России (11797, г Москна, ул. Островитянова, д 1)

Зашитя диссертации состоится 25 июня 2015 года в 12 00 часов на заседании диссертационного совета Д. 001.004.01 при ФГКНУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» (117418, г Москва, ул. Цюрупы, д.З).

С диссертацией можно ознакомиться н библиотеке ФГЫ1У «Нвучно-нсслсдопнгсльский институт' морфологии чслопско» , а так же па сайте www.morrolhum.ru

Автореферат разослан

2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета докгор медицинских наук

Михайлова Лилия Но ровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В структуре неоплазий яичников доля пограничных опухолей составляет около 10-15%, показатели заболеваемости варьируют в различных странах от 1,8 до 4,8 %о. При этом, общая выживаемость пациенток при ранних стадиях опухолевого процесса приближается к 100% (Trope С. et al.,2009; Ewald-Riegler N.L. et al., 2012). В отличие от рака яичников пограничные опухоли значимо чаще выявляются у молодых женщин. Средний возраст больных на момент установления диагноза составляет 40 лет, при этом более чем в 30% наблюдений пограничные опухоли яичников (ПОЯ) обнаруживают у пациенток в возрастном интервале 15-29 лет (Tinelli R. et al., 2006; Skirnisdottir I. et al., 2008; Somsukolrat, S., 2012).

По мнению ряда авторов, одним из наиболее значимых факторов риска развития ПОЯ является бесплодие. В то время как беременность и лактация, напротив, оказывают протективный эффект (Riman Т. et al., 2001). Таким образом, проблема ПОЯ имеет социальной характер.

Вопросы сохранения фертильности занимают одно из центральных мест в планировании методов терапии данной патологии. В течение довольно долгого периода подход к лечению пациенток почти не отличался от такового при раке яичников - выполнялась экстирпация матки с придатками, субтотальная резекция большого сальника с последующей химиотерапией. В связи с тем, что выживаемость больных с ПОЯ достаточно высока, а чувствительность к применяемым химиопрепаратам крайне низкая, в последние годы в клиническую практику все шире внедряются органосохраняющие методы лечения. Однако число рецидивов пограничной опухоли после применения таких методик возросло (Skirnisdottir I. et al., 2008; Trope С. et al.,2009).

В настоящее время активно обсуждается прогностическая значимость некоторых морфологических особенностей ПОЯ, таких как гистологический вариант, наличие микроинвазии, образование микрососочковых структур и

псаммомных телец, поскольку убедительных данных о том, что перечисленные критерии являются независимыми прогностическими факторами, получено не было (Gershenson DM , 2002; Trillschl F. et al., 2010).

Для определения биологической агрессивности ПОЯ использу]от им-муногистохимические методы с применением широкого спектра антител: белков-регуляторов клеточного цикла, молекул адгезии, индукторов апоптоэа, и других (Naylor M.S. et al., 1994; Vassilopoulos I. et al., 2003; Fauvet R. et al., 2005; Kim D.J. et al., 2006; Ozer H.et al., 2012). К сожалению, до сих пор не удалость выявить спектр маркеров, позволяющих прогнозировать риск рецидива заболевания, оценивать целесообразность выполнения органо-сохраняющих операций, особенно при наличии двустороннего поражения яичников.

В изучении молекулярно-биологических свойств ПОЯ большое внимание уделяется исследованию мутаций регуляторного гена BRAF, наличие которых, как считается ассоциировано с профессией серозных пограничных опухолей (СПО). BRAF является протоонкогеном, кодирующим белок B-Raf, который играет важную роль в регуляции киназного сигнального пути, влияющего на пролиферацию и дифференцировку клеток. Имеются данные о более высокой частоте встречаемости мутации гена BRAF при прогрессиро-вании ПОЯ (Singer G. et al., 2003). Тем не менее, значимость этих генетических нарушений для прогноза ПОЯ не установлена (Jones S. et al., 2012).

Высокий удельный вес женщин репродуктивного возраста с одной стороны и возможное развитие рецидива заболевания - с другой, требуют поиска новых и тщательной оценки существующих факторов, влияющих на прогноз ПОЯ.

Цель исследования

Оценка морфологических, иммуногистохимических и генетических факторов прогноза, выявление признаков биологической агрессивности пограничных опухолей яичника.

Задачи исследования

1. Оценить прогностическую значимость морфологических особенностей пограничных опухолей яичника, таких как формирование микрососочко-вой архитектуры и псаммомных телец;

2. Оценить значение имплантов при серозных пограничных опухолях и выяснить механизм возникновения их инвазивных подтипов;

3. Провести иммунофенотипический анализ пограничных опухолей с рецидивами и без рецидивов;

4. Оценить влияние наличия мутации в 15 экзоне гена ВЯАГ на развитие рецидива пограничной опухоли яичника;

5. Выявить иммуногистохимические и молекулярно-генетические различия пограничных опухолей яичника и высокодифференцированных адено-карцином, развивающихся на их фоне.

Научная новизна

На основе анализа результатов проведенного комплексного исследования выявлены прогностические морфологические критерии, наиболее высокой значимостью из которых обладает наличие микрососочковой архитектуры (вероятность развития рецидива - 99,9%), так же, с прогнозом пограничных опухолей яичника значимо связано выявление имплантов (вероятность рецидива - 51,9%) и многочисленных псаммомных телец (вероятность рецидива - 30%).

Впервые установлена высокая диагностическая значимость иммуноги-стохимических маркеров, (металлопротеиназы ММР-1 и ММР-9, регулятор \уп1-пути бета-катенин, индуктор алоптоза Вах, ингибитор металлопротеиназ Т1МР-2), обладающих предиктивными возможностями и позволяющая планировать тактику ведения больных.

Изучена частота встречаемости мутации р.УбООЕ в 15 экзоне гена

ВИАР, ответственного за пролиферацию и дифференцировку клеток в погра-

5

ничных опухолях яичников и высокодифференцированных серозных карциномах. Получены данные о наличии мутации в гене 5Л4/% свидетельствующие об общности патогенеза и последовательности этапов канцерогенеза серозных новообразований яичников.

Практическая значимость

Разработан протокол гистологического заключения по исследованию - операционного материала больных пограничными опухолями яичников, отражающий значимые параметры, необходимые для стадирования заболевания и определения тактики лечения.

Разработанная иммуногистохимическая панель, прогностических маркеров, включающая Кь67, Ьс1-2, индуктор апоптоза Вах, циклин 01, ингибитор апоптоза сурвивин и ингибитор металлопротеиназ Т1МР-1 дает новые возможности для дифференциальной диагностики пограничных опухолей яичника и высокодифференцированных карцином, развивающихся на их фоне. Выявление при микроскопическом исследовании таких прогностически значимых факторов как наличие микрососочковой архитектуры и псам-момных телец в опухоли, а так же применение иммуногистохимической панели, содержащей металлопротеиназы ММР-1, ММР-9, их ингибитор Т1МР-2, бета-катенин и Вах позволяют оптимизировать лечебную тактику с учетом потенциальной биологической агрессивности опухоли, позволяют проводить дальнейшие клинико-морфологические сопоставления для улучшения результатов лечения.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в научную и практическую работу Рязанского областного онкологического диспансера, Рязанской областной клинической больницы, Тверского областного онкологического диспансера, кафедры патологической анатомии с курсом судебной медицины РязГМУ им. акал. И.П. Павлова.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены, доложены и обсуждены на VIII всероссийском съезде онкологов (Москва, 2013); конференции молодых ученых патологоанатомов и судебных медиков ЦФО (Москва, 2014); межкафедральном совещании кафедр патологической анатомии с курсом судебной медицины, гистологии и биологии, онкологии с курсом лучевой диагностики ФПДО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России 31 октября 2014г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них - 3 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Объем рукописи составляет 144 страницы машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 42 рисунками. Библиографический указатель включает 29 отечественных и 194 зарубежных источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы

Материалом для исследования послужили парафиновые блоки от 122 пациенток, проходивших лечение или консультированных в МНИОИ им. П.А. Герцена и Рязанском областном клиническом онкологическом диспансере с 2006 по 2012 год. Клинические данные анализировали по амбулаторным картам и историям болезни. Средний возраст пациенток составил 34,5 лет (от 18 до 74 лет).

Исследование включало 101 пограничную опухоль яичника, из которых 79

(78,2%) были представлены ее серозным подтипом, 14 (13,8%) - муциноз-

ным, 5 (5%) опухолей оказались смешанными, (серозно-муцинозными) и 3

7

(3%) эндометриоидными. Такие редкие формы пограничных опухолей как переходноклеточные и светлоклеточные не встречались.

Пациентки были разделены на две группы:

1 группа - больные без рецидивов ПОЯ (83 человека - 82,2%);

2 группа - больные с рецидивом ПОЯ (18 человек - 17,8%).

В качестве группы сравнения был отобран 21 случай высокодифференци-рованной серозной аденокарциномы яичника на фоне серозной пограничной опухоли.

Для иммуногистохимического исследования был использован широкий спектр коммерческих моноклональных антител (Dako, TermoFisher): для оценки пролиферативной активности использован маркер Ki-67, который определяется во всех активных фазах клеточного цикла, а так же циклин D1. ответственный за первую контрольную точку клеточного цикла; для анализа апоптотической активности использован маркер bcl-2 и его прямой антагонист Вах, а так же член семейства ингибиторов белков апоптоза (IAP) - сур-вивин, действующий опосредованно, через инактивацию проапоптотических белков; в качестве одного из наиболее известных супрессоров опухолевого роста использован маркер р53, а так же активизируемый им белок р21; маркер бета-катенин использован как компонент сиг нального wnt-пути, который является активатором транскрипции; для определения инвазивного и миграционного потенциала ПОЯ использованы матриксные металлопротеиназы (ММР-1, ММР-2, ММР-9) их тканевые ингибиторы (TIMP-1, TIMP-2).

С отобранных парафиновых блоков были изготовлены срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоалгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 18 часов.

Восстановление антигенной активности проводили в модуле предобработки для автостейнера при температуре 97°С в течение 25 мин. и последующим охлаждением до 65 °С в течение 20 мин в цитратном буфере рН 6.0 или в трис-ЭДТА буфере рН 9,0.

В качестве детекционной системы применяли систему «FnVision Flex»

8

(«Dako»), в качестве хромогена - диаминобензидин. Для получения результатов пригодных для количественной обработки реакции проводили с помощью автоматического иммуногистостейнера «Avtosteiner Dako Link 48».

Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме (ММР2, ММР9, TIMPI, TIMP2) и на мембранах клеток (бета-катенин) оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3: 0 - отсутствие реакции, 1- реакция слабая; 2 - умеренная; 3 - сильная.

Оценку экспрессии Ьс12, В АХ, K.i-67, р21, циклина D1 и сурвивина проводили путем подсчета количества окрашенных клеток на 100 клеток препарата в 3 полях зрения (увеличение х40) и выражали полученные результаты в процентах.

Препараты изучали на световом микроскопе Axioskop «OPTON» со стандартным набором оптики. Микрофотографирование проводили на микроскопе биологическом универсальном Leica DM4000B с цветной цифровой камерой DFC495 при помощи стандартного программного средства Leica Application Suite v. 3.7.0.

В качестве генетического исследования определяли наличие мутации p.V600E в 15 экзоне гена BRAF. Для этого выделяли ДНК из операционного материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин, с использованием коммерческого набора «ДНК-Сорб» (ИнтерЛабСервис, РФ). Прямое секвенирование последовательностей экзонов проводили с использованием праймеров, которые применяли для амплификации. Секвенирование выполняли по протоколам ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits ("Applied Biosystems", США). Компьютерный анализ ДНК проводили с использованием программы Oligo 4.0. и базы данных Blast. Анализ хроматограмм секве-нированных последовательностей выполнен с помощью программы Chromas.

Анализ результатов оценивали с помощью программы STATISTICA v.8.0 и MedCalk 12.0, с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, определения квартилей, U-критерия Манна-Уитни, критерия Хи-квадрат, расчета

коэффициента корреляции. При сравнении частот мутации гена BRAF в раз-

9

ных группах пациентов использовали точный двусторонний критерий Фишера. Уровень значимости (р) принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологические факторы прогноза. Пограничные опухоли яичника без рецидивов были представлены на 74,7% (62 из 83) серозным подтипом, на 21,7% (18 из 83) - муцинозным, на 3,6% (3 из 83) - эндометриоидным. В группе ПОЯ с рецидивом лишь I опухоль из 18 (5,6%) оказалась муцинозной, остальные (94,4%) были серозными.

Несмотря на известный факт, что имнланты встречаются гораздо чаще при серозном подтипе ПОЯ, что предопределяет более благоприятное течение других пограничных опухолей и сниженный риск рецидивов, при изучении распределения типов ПОЯ в исследуемых группах, статистически значимых различий в исследуемых группах выявлено не было (критерий хи-квадрат, р > 0,05). Возможно, данный факт связан с малой статистической выборкой более редко встречающихся гистологических подтипов ПОЯ, поэтому изучение биологического поведения пограничной опухоли в зависимости от ее гистологического типа является актуальной темой для дальнейших исследований.

Импланты были выявлены в 26,7% (27 из 101) случаях ПОЯ. В группе без рецидивов они встречались в 15,7% (13 из 83) случаев, а в группе с рецидивами - в 77,8% (14 из 18). При этом в 1 группе все импланты были неинва-зивными, тогда как во 2 группе, в двух случаях (14.3%) отмечены инвазивные импланты, доля неинвазивных имплантов составила 85,7% (12).

При этом нами выявлены статистические значимые различия в частоте встречаемости имплантов в исследуемых группах (критерий хи-квадрат, р < 0,0001) (рис. 1). Было установлено увеличение частоты обнаружения имплантов у пациенток с наличием рецидивов ПОЯ. Возможно, это обусловлено тем, что при наличии перитонеальных имплантов в брюшной полости могут

оставаться не выявленные при ревизии микроскопические очаг и ПОЯ, кото-

10

рые и являются субстратом развития рецидива. Таким образом, вероятность развития рецидива у пациенток с наличием имплантов составляет 51,9% (р<0,0001 по критерию хи-квадрат).

В литературе имеются данные о том, что при дополнительной вырезке материала ПОЯ с наличием инвазивных имплантов, в первичном очаге, среди структур пограничной опухоли обнаруживаются очаги инвазивной высоко-дифференцированной аденокарциномы (Burks R.T., Sherman М.Е., Kurman R.J., 1996; Seidman J.D., Kurman R.J.. 1996, 2000).

lOO.O*

80.0*

£ 60,0*

I

Q-

c

40.04b

20.0*

o.cm

Рис. 1. Частота встречаемости имплантов в исследуемых фуппах ПОЯ

Инвазивные импланты по морфологической картине были более схожи с высокодифференцированной (low grade) серозной аденокарциномой, тогда как в первичном очаге морфологическая картина соответствовала типичной серозной ПОЯ.

Поэтому была проведена исследование дополнительных срезов с блоков первичной опухоли. В результате, при микроскопическом исследовании обеих рецидивных ПОЯ с наличием инвазивных имплантов, в дополнительных срезах, на фоне пограничной опухоли, в яичнике были выявлены микроочаги инвазивной высокодифференцированной серозной аденокарциномы,

II

которые, вероятнее всего и послужили источником метастазирования.

Таким образом, нами были подтверждены данные ряда авторов о том, что в типичных ПОЯ могут обнаруживаться только неинвазивные импланты (8е1£)тап .ГО, УагаНо МЯ. 2007). При обнаружении инвазивных имплантов в ПОЯ патологоанатому следует предпринять дальнейшее тщательное исследование первичной опухоли (1 блок/1 см3) для поиска невыявленных очагов высокодифференцированной аденокарциномы.

Псаммомные тельца были отмечены в 29,7% случаев (30 из 101) всех ПОЯ. У пациенток с наличием рецидива они были отмечены в 50% случаев (9 из 18), а у пациенток без рецидивов - в 25,3% (21 из 83). При этом были обнаружены статистически значимые различия между исследуемыми группами. Выявлено, что псаммомные тельца чаще встречаются в рецидивирующих опухолях, а вероятность развития рецидива при наличии этого признака составляет 30% (критерий хи-квадрат, р = 0.049) (рис. 2). Это может быть связано с тем, что в псаммомных тельцах выявляется повышенное содержании коллагена IV типа, что может послужить причиной активации металлопротеиназ, участвующих в процессах миграции и инвазии опухолевых клеток.

Рис. 2. Частота встречаемости псаммомных телец в исследуемых группах ПОЯ

Микрососочковая гистоархитектура опухоли выявлена в 8 (из 101) случаях (7,9%). При этом все случаи были представлены ПОЯ с рецидивом.

В пограничных опухолях без рецидива микрососочковые структуры не выявлялись.

Установлено, что наличие микропапиллярных структур наиболее характерно для рецидивирующих опухолей. Вероятность развития рецидива у пациенток с микрососочковой СПО составляет 99,9% (р < 0,0001) (рис. 3).

Полученные нами результаты подтверждаются данными литературы, включая последнюю классификацию ВОЗ опухолей женской репродуктивной системы, переизданную в 2014 году (WHO classification of tumours of female reproductive organs, 2014).

Согласно этой классификации, для микропапиллярных серозных пограничных опухолей правомочно использование термина «неинвазивная low-grade серозная карцинома», а при морфологическом кодировании после дроби следует указывать цифру 2 (карцинома in situ), что свидетельствует о более высокой биологической агрессивности этих опухолей.

Агрессивность микрососочковых опухолей, вероятно, связана с тем, что при неиерархическом ветвлении сосочков, отсутствии фиброзной стро-мы, а так же активации протеаз, связанных с клеточной миграцией, снижается адгезия опухолевых клеток, увеличивая риск их имплантации. Это в свою очередь может привести к реализации рецидива.

Молекулярно-биологические факторы прогноза. В результате проведенного исследования, при изучении пролиферативной активности, не было выявлено статистически значимых различий экспрессии Ki-67 в зависимости от отсутствия или наличия рецидива ПОЯ. В то же время, при исследовании группы сравнения, выявлено, что для высокодифференцированных адено-карцином, в отличие от пограничных опухолей, характерна экспрессия Ki-67 более, чем 20% клеток опухоли (р=0,021, критерий Манна-Уитни).

нет KTb

Микрососочки

Рис. 3. Частота встречаемости микрососочковых структур в исследуемых группах ПОЯ

Полученные результаты согласуются с данными литературы, в которой имеются указания на тот факт, что степень пролифсративной активности увеличивается от пограничной опухоли яичников к low-grade карциноме (Vassilopoulos I. et al., 2003).

Статистически значимые различия экспрессии циклина D1 в исследуемых группах пограничных опухолей отсутствовали. Однако различия были обнаружены при сравнении ПОЯ с группой аденокарцином. Так в пограничных опухолях реакция циклина была значимо меньше, чем в 30% клеток, в то время как для аденокарцином его экспрессия составила 60% и более (р =0,014, критерий Манна-Уитни).

Низкий уровень пролиферативных сигналов и, как следствие, слабая экспрессия циклина Д1 может объяснить индолентное поведение ПОЯ. Однако мы не встретили литературных данных, относительно прогностической значимости этого маркера для ПОЯ.

В опубликованных исследованиях обнаружены сведения о наличии гипер-

экспрессии циклииа Dl при серозном раке яичников, согласующиеся с полученными нами результатами (Hung W.C. et al., 1996; Worsley S.D., Ponder В., Davis R.R., 1997; Shigemasa К. et al., 1999; Sui L. et al., 1999).

Известно, что белок p21 обладает ингибирующим влиянием на клеточный цикл, и его слабая экспрессия могла быть признаком агрессивного потенциала опухоли или неблагоприятным прогностическим фактором (Vassilopoulos I. et al., 2003). Однако статистически значимых различий его реакции ни в исследуемых группах ПОЯ, ни в группе сравнения выявлено не было (/>>0,05; критерий Манна-Уитни).

Экспрессия мутантного белка р53 - важный критерий прогноза злокачественных новообразований разных локализаций и дифференциальной диагностики предопухолевых процессов (Barisik N.O. et al., 2010; Abo-Elwafa, H.A., 2011). При оценке экспрессии этого маркера не было выявлено связи ее выраженности с наличием или отсутствием рецидивов ПОЯ.

При сравнении с группой аденокарцином значимых различий так же выявлено не было (р>0,05; критерий Манна-Уитни). Этот факт, в определенной степени подтверждает, что для пограничных опухолей и высокодифференци-рованной серозной аденокарциномы характерны мутации KRAS, BRAF и редко ТР53 (Singer G. et al., 2002, 2003, 2005).

Протеин bcl-2 является ингибитором апоптоза и для разных карцином показана его различная прогностическая ценность, однако в литературе практически отсутствуют данные по изучению этого маркера в ПОЯ.

В исследованном материале не было выявлено зависимости уровня экспрессии bcl-2 от отсутствия или наличия рецидивов пограничной опухоли яичников (р>0,05, критерий Манна-Уитни). Но были выявлены статистически значимые различия при сравнении реакции данного маркера между ПОЯ и высокодифференцированными серозными аденокарциномами. ПОЯ характеризовались экспрессией bcl-2 менее, чем в 3% клеток, в то время как уровень экспрессии в аденокарциномах был значимо выше 15% (р=0,004, критерий Манна-Уитни), что можно объяснить более интенсивным ингибировани-

15

ем апоптоза и, как следствие, более агрессивным потенциалом аденокарци-ном.

Протеин Вах является антагонистом bcl-2 и, следовательно, индуктором апоптоза. В литературе имеются сообщения о том, что высокая экспрессия Вах характерна для пограничных и злокачественных опухолей яичника по сравнению с доброкачественными (Ozer H.et а)., 2012), однако исследования, посвященные изучению связи этого маркера с биологическим поведением именно пограничных опухолей яичника, в настоящее время отсутствуют.

Наше исследование показало усиление экспрессии Вах в группе с рецидивами ПОЯ выше 80% и снижение менее 50% в группе ПОЯ без рецидивов. Таким образом, для опухолей без рецидивов диагностически значимым является уровень экспрессии Вах менее 50%, тогда как в группе с рецидивами -он выше 80% (критерий Манна-Уитни, р = 0,043).

Аналогичные данные получены при сравнении реакции данного маркера в зависимости от стадии ПОЯ. Так в опухолях I стадии экспрессия Вах была статистически значимо ниже 50%, при II стадии - выше 80% (р=0,05; критерий Манна-Уитни). Полученные результаты характеризуют Вах как маркер агрессивности ПОЯ. При сравнении пограничных и злокачественных опухолей выявлено, что для аденокарцином характерен уровень экспрессии Вах 90% опухолевых клеток и выше, тогда как интенсивность этого маркера для ПОЯ была значимо ниже 90% (/7=0,004).

Обнаруженная нами усиленная экспрессия белка Вах в аденокарциномах не является прямым показателем усиления апоптотической активности в опухолевых клетках при раке, т.к. важен не собственно уровень проапопто-тических и антиапоптотических белков, а их соотношение, в частности соотношение Вс12/Вах.

Вероятно, для опухолей яичников повышение уровня экспрессии Bel 2 превышает усиление экспрессии Вах, что ведет к уменьшению числа опухолевых клеток, которые вступают в процесс запрограммированной клеточной

гибели. Кроме того, важно отметить выявленный высокий уровень экспрес-

16

сии внутриклеточного белка сурвивина, который также ингибирует апоптоз и участвует в митотическом делении клеток. Поэтому ни один из этих маркеров не может является единственным показателем апототической активности опухолевых клеток и требуется изучение их количественного соотношения (Пальцев М.А., 2010).

Сурвивин - это эндогенный белок из семейства ингибиторов апоптоза (1АР), принимающий участие в регуляции клеточного деления и апоптоза. Считается, что его выраженная экспрессия для многих опухолей ассоциирована с плохим прогнозом и низкой выживаемостью (\№а11ёуг5ка-81ас11ига .1. й а1., 2012). Однако исследования о прогностической значимости этого протеина для ПОЯ в настоящее время в литературе отсутствуют.

В ходе нашего исследования прогностической значимости экспрессии сурвивина для ПОЯ не было получено (р>0.05, критерий Манна-Уитни). Однако при исследовании группы сравнения нами было выявлено, что для аде-нокарцином характерна экспрессия сурвивина в более чем 70% клеток. В то время как в пограничных опухолях реакция этого маркера была значимо менее 70% (р=0,002; критерий Манна-Уитни). Полученные результаты в целом согласуются с данными литературы, указывающими на гиперэкспрессию сурвивина при раке различных локализаций (Вольпина О.М. с соавт., 2011; \VaJigyrska-Stachura .1. Ы а1., 2012).

Бета-катенин - белок, участвующий в активации транскрипции в сигнальном пути, тем самым, влияя на пролиферацию клеток. \Vnts - секрети-руемые гликопротеиды, которые играют важную роль в регуляции пролиферации клеток, так как влияют непосредственно на формирование митотиче-ского веретена.

В литературе имеются данные о том, что экспрессия бета-катенина становится более интенсивной, начиная от нормального эпителия кист-включений, к цистаденомам и пограничным опухолям, достигая наибольшей выраженности в карциномах яичника У. е1 а!., 2002). При этом, в высокодиффе-

ренцированных опухолях наблюдается более выраженная экспрессия, по

17

сравнению с низкодифференцированными раками. Этот факт можно объяснить повышением накопления белка бета-катенина вследствие мутации гена CTNNBI.

В нашем исследовании в ПОЯ без рецидива преобладала слабая и умеренная и реакция данного маркера (31,6% и 35,5%, соответственно), в то время как в большинстве рецидивных опухолей выявлена выраженная экспрессия бета-катенина (75,0%). При этом, различия были статистически значимыми (р=0,0001, критерий Манна-Уитни).

Таким образом, для ПОЯ, склонных к рецидивам характерна выраженная экспрессия бета-катенина, что можно объяснить увеличением мутаций гена CTNNB1, и как следствие, более агрессивный биологический потенциал таких образований. Так же нами были выявлены статистически значимые различия экспрессии бета-катенина для разных стадий ПОЯ (р=0,041, критерий Манна-Уитни). При I стадии чаще выявлялась слабая и умеренная экспрессия маркера (29,0% и 39,1%, соответственно); в опухолях II стадии преобладала выраженная экспрессия (68,8); при III стадии имела место примерно одинаковая частота всех уровней реакции.

Подобный характер экспрессии маркера отражает важный этап прогресси-рования ПОЯ, когда уровень экспрессии бета-катенина статистически значимо повышается при переходе от первой стадии заболевания ко второй и сопровождает экстраовариальное распространение опухоли, постепенно снижаясь при дальнейшем прогрессировании. Этот факт может имеет большое клиническое значение и требует дальнейшего изучения в тесной взаимосвязи с клиницистами.

Матриксные металлопротеиназы (ММР) - класс ферментов из группы эн-допротеаз. Эти мембранные белки разрушают компоненты внеклеточного матрикса, в частности, ММР-1, ММР-2 и ММР-9 играют ключевую роль в деградации коллагена IV типа, основного компонента базальных мембран, чем способствуют инвазии и метастазированию опухолей.

Результаты исследования ММР-1 показали значимое усиление ее экспрес-

18

сии в рецидивирующих ПОЯ (метод Мамна-Уитни, р<0,05), что, скорее всего, связано с повышением инвазивного и миграционного потенциала опухоли, так как по данным литературы, повышенная экспрессия ММР-1 связана с инвазией и миграцией клеток рака яичника (Young T.N. et al., 1996; Nagase H„ Woessnc J.F., 1999; Kanwar J.R., Kamalapuram S.K., Kanwar R.K., 2013).

В нашем исследовании не выявлено статистически значимых различий экспрессии ММР-2 в группах ПОЯ и в группе сравнения (р>0,05; критерий Манна-Уитни). При изучении данных литературы отмечено, что работы, посвященные экспрессии ММР-2 в пограничных опухолях яичника свидетельствуют об усилении реакции в микроинвазивных ПОЯ. В тоже время литературные данные, касающиеся изучения ММР-2 в серозной карциноме яичника весьма противоречивы: одни исследования, говорят о том. что экспрессия ММР-2 в опухолевых клетках является индикатором благоприятного прогноза при раке яичников, другие - о том, что экспрессия ММР-2 связана с низкой выживаемостью (Garzetti G. et al., 1995; Sillanpaa S. et al., 2007).

Отсутствие значимых показателей реакции ММР-2 в ПОЯ предположительно объясняется склонностью этого маркера экспрессироваться в более агрессивных опухолях с неблагоприятным прогнозом. Для пограничных же опухолей, наоборот, характерно индолентнос течение с высокими показателями общей выживаемости. Представляется, что в ПОЯ механизмы миграции опухолевых клеток, опосредованы не через ММР-2, а через другие металло-протеиназы.

Изучение экспрессии ММР-9 в ПОЯ показало ее значимое усиление в опухолях без рецидивов и снижение в опухолях с рецидивами (р=0,003, критерий Манна-Уитни), хотя по данным литературы для агрессивного фенотипа должно быть характерно усиление реакции этого маркера (Sillanpaa S. et al., 2007).

Возможно, в нашей серии наблюдений синтез ММР-9 в определенной степени регулировался действием ингибиторов матриксных протеииаз, что подтверждается результатами изучения экспрессии Т1МР-2.

19

Члены семейства тканевых ингибиторов металлопротеинаэ (Т1МР), как считается, ассоциированы с прогрессией рака яичников. Так, по данным литературы экспрессия TIMP-1 коррелирует с неблагоприятным прогнозом и агрессивным течением серозного рака яичников (Rauvala М., Puistola U., Turpeenniemi-Hujanen Т., 2005; Maata М. et al., 2007).

В ПОЯ наиболее часто встречалось отсутствие либо слабая экспрессия TIMP-1 (36,6% и 40,7%, соответственно), при этом в аденокарциномах чаще выявлялось умеренное и выраженное окрашивание (42,9% и 19,1% наблюдений, соответственно). Различия оказались статистически значимыми (р<0,0001, критерий Манна-Уитни). Этот факт, вероятнее всего, связан с низким злокачественным потенциалом ПОЯ и, в определенной степени подтверждает данные литературы о неблагоприятном прогностическом значении этого ингибитора.

Экспрессия TIMP-1 значимо не различалась в зависимости от отсутствия или наличия рецидива ПОЯ (р>0,05; критерий Манна-Уитни).

Имеются сообщения о том, что экспрессия TIMP-2 значительно выше в карциномах яичника по сравнению с доброкачественными и пограничными опухолями (Maata М. et al., 2007). При анализе реакции Т1МР-2 мы обнаружили отсутствие экспрессии данного маркера в ПОЯ без рецидивов, а так же слабое и умеренное окрашивание в опухолях с рецидивом. Возможно, это обусловлено тем, что в рецидивирующих пограничных опухолях увеличивается агрессивный потенциал, за который, отчасти, отвечают ингибиторы мат-риксных протеиназ.

BRAF- это протоонкоген, который играет важную роль в регуляции MAP kinase/ ERKs сигнального пути, влияющего на пролиферацию и дифференци-ровку клеток. Известно, что BRAF мутации являются характерными для СПОЯ и чаще встречаются при их прогрессии (Singer G. et al., 2003; Shih I., Kurman R„ 2005).

Однако, в нашем исследовании не выявлено связи между наличием мутации p.V600E в 15 экзоне гена BRAF и развитием рецидивов ПОЯ. Так же не

20

выявлено различий между наличием данной генетической аномалии в ПОЯ и высокодифференцированных серозных аленокарциномах.

Отсутствие различий во встречаемости мутации гена BRAF во всех исследуемых группах подтверждает теорию о двойственном пути канцерогенеза рака яичников, согласно которой у пограничных опухолей яичника и low-grade карцином имеются общие генетические аномалии, а именно мутации в генах KRAS и BRAF, в то время как для high-grade карцином характерными являются мутации гена ТР53 (Singer G. el al., 2002, 2005).

В связи с этим, мы считаем нецелесообразным определение мутации гена BRAF для прогнозирования рецидивов ПОЯ.

Таким образом, в результате проведенного многофакторного анализа нами выявлены факторы благоприятного и неблагоприятного прогноза пограничных опухолей (табл. 1).

Таблица 1.

Факторы прогноза ПОЯ

ПОЯ без рецидива ПОЯ с рецидивом

Морфологические факторы прогноза Отсутствие микрососочко-вой архитектуры Наличие микрососочковой архитектуры

Отсутствие имплантов Наличие имплантов

Отсутствие псаммомных телец Наличие псаммомных телец

Молекулярно- биологические факторы прогноза Экспрессия Вах менее 50% Экспрессия Dax более 80%

Экспрессия ММР-9 +++ Отсутствие экспрессии ММР-9

Экспрессия ММР-1 +++

Экспрессия бета-катенина +++

Экспрессия TIMP-2 + и ++

К!-67, Ьс1-2, сусИп 01, сурвивин и Т1МР-1 не имеют прогностического значения для планирования рецидива пограничной опухоли, однако могут

оказать значительную помощь в дифференциальной диагностике между ПОЯ и высокодифференцированной серозной аденокарциномой на ее фоне (табл. 2).

Таблица 2.

Дифференциальная диагностика СПО и высокодифференцированной серозной аденокарциномы

Маркер СПО Аденокарцинома

К1-67 - Более 20%

Циклин 01 Менее 30% Более 60%

Ьс1-2 Менее 3% Более 15%

Вах Менее 90% 90% и более

Сурвивин Менее 70% Более 70%

Т1МР-1 0/+ -Н-/+++

Матриксная металлопротеиназа ММР-2 а так же супрессоры опухолевого роста р53 и р21 не имеют прогностического значения при планировании рецидива ПОЯ, что, вероятно, связано с другими механизмами ответственными за апоптотический и инвазивный потенциал этих опухолей.

Мутация р.УбООЕ 15 экзона гена В КАР не является фактором риска рецидива ПОЯ.

Выводы

1. Наличие микрососочконой архитектуры в пограничной опухоли яичника свидетельствует о ее повышенной биологической агрессивности (риск развития рецидива - 99,9%).

Выявление множественных псаммомных телец в серозной пограничной опухоли связано с неблагоприятным прогнозом (риск развития рецидива -30%).

2. Наличие неинвазивных имплантов значительно повышает риск рецидива пограничной опухоли яичника (до 51,9%).

3. Инвазивные импланты при серозной пограничной опухоли характеризуются морфологическими признаками высокодифференцированной аде-нокарциномы (клеточная атипия, повышения ядерной градации), и вероятнее всего, свидетельствует о невыявленных микроочагах аденокарциномы в первичной опухоли.

4. Гиперэкспрессия индуктора апоптоза Вах, регулятора wnt-пути бета-катенина и металлопротеиназы ММР-1 в сочетании со слабой и умеренной экспрессией ингибитора металлопротеиназ TIMP-2 коррелирует с рецидивирующим течением пограничных опухолей яичников.

Выраженная экспрессия металлопротеиназы ММР-9 связана с безрецидивным течением по1раничных опухолей яичников.

При переходе от I к II клинической стадии пограничных опухолей яичников отмечается усиление экспрессии Вах и бета-катенина. что следует учитывать в клинической практике.

5. Высокодифференцированные серозные аденокарциномы отличаются от серозных пограничных опухолей экспрессией маркеров пролиферации Ki-67 и cyclin D1 более 20% и 60% клеток, соответственно; ингибиторов апоптоза bcl-2 и сурвивина - более 15% и 70%. соответственно; индуктора апоптоза Вах - 90% и более, а так же умеренной и выраженной реакцией ингибитора металлопротеиназ TIMP-1.

6. Наличие мутации p.V600E в 15 экзоне гена BRAF не является фактором риска рецидива пограничных опухолей яичников. Вместе с тем, сходный характер мутаций p.V600E в 15 экзоне гена BRAF в пограничных опухолях яичников и аденокарциномах может служить свидетельством многоступенчатого развития опухоли.

Практические рекомендации

Морфологическое заключение при пограничной опухоли яичника должно содержать:

• Гистологический вариант опухоли:

23

• Наличие микрососочковой архитектуры;

• Наличие псаммомных телец;

• Наличие имплантов и их подтип;

При обнаружении микрососочковой архитектуры правомерно употребление термина «неинвазивная low-grade серозная карцинома», а при морфологическом кодировании (ICD-O) после дроби необходимо указать цифру 2 (карцинома in situ).

При обнаружении иивазивных имплантов в типичной СПО следует предпринять дорезку блоков и архивного материала с целью тщательного исследования первичной опухоли (1 блок/1см3) для поиска невыявленных очагов высокодифференцированной аденокарциномы.

• Иммуногистохимическая панель для определения биологического потенциала ПОЯ должна включать: Вах, бета-катенин, MMP-l, ММР-9, Т1МР-2.

• Для дифференциальной диагностики СПО и высокодифференцированной серозной аденокарциномы: Ki-67, bcl-2, Вах, циклин D1, сурвивин, TIMP-I.

• Усиленная коэкспрессия Вах и бета-катенипа требует дополнительного обследования пациентки для уточнения стадии процесса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Значение маркеров пролиферации и апоптозадля пограничных опухолей яичника / Виноградов И.И. [и др.] // Росс, мед.-биол. вестник. -2013. - №3. - С. 130-135. (соавт.: Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Ахидова Е.В., Вольпипа О.М., Волкова Т.Д., Короев Д.О).

2. Клинико-морфологические факторы прогноза при пограничных опухолях яичника / Виноградов И.И. [и др.] // Онкология. Журнал им.

П.А. Гериена. - 2014. - №3. - С.22-25. (соавт.: Андреева Ю.Ю., Новикова Е.Г., Шевчук A.C.. Завалишина Л.Э., Франк Г.А.).

3. Роль диспластических изменений эпителия маточной трубы в гистогенезе рака яичников / Данилова Н.В. [и др.] // Архив патологии. -2014. - №4. - С.9-14. (соавт.: Андреева Ю.Ю.. Королев A.B., Виноградов И.И., Завалишина Л.Э.).

4. Анализ мутаций гена BRAF при пограничных опухолях и аденокарци-номах яичника / Завалишина Л.Э. [и др.] // Мат. VIII всеросс. съезда онкологов. - 2013,- Т.2. - С.722. (соавт.: Кекеева Т.В., Андреева Ю.Ю.. Виноградов И.И., Воронина О.В.).

5. Виноградов И.И. Значение маркеров пролиферации и апоптоза для пограничных опухолей яичника / Виноградов И.И., Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э. Межрегион. Сборник науч. Трудов. - Рязань. - 2013. -С.48.

6. Виноградов И.И. Значение маркеров пролиферации и апоптоза для пограничных опухолей яичника / Виноградов И.И., Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э. Современные методы лабораторной и инструментальной диагностики травм и заболеваний. Сборник мат. Науч.-практ. Конф. Мол. Ученых суд.мед. и патанат. ЦФО. - Москва. -2014. - С.12-16.

Научное издание

ВИНОГРАДОВ ИЛЬЯ ИГОРЕВИЧ

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГНЧЕСК11Е ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОГРАНИЧНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЯИЧНИКОВ

14.03.02 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Сдано в печать 18.05.2015. Формат 60x84/16. Бумага писчая. Гарнитура Times. Печать офсетная. Уел печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ №630.

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.II Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9

Отпечатано в редакиионно-издательском отделе ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России 390026, г Рязань, ул. T Шевченко. 34 Тел : 8(4912) 46-08-72 E-mail: по zasorkina@yandex.m

U8- Si

2015675427