Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфогенез деструктивных и репаративных реакций скелетных мышц при метаболических нарушениях различного генеза (токсических повреждениях, генетически детерминированной миопатии, пароксизмальной миогло

На правах рукописи

Бакарев Максим Александрович

МОРФОГЕНЕЗ ДЕСТРУКТИВНЫХ И РЕПАРАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЯХ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА

(токсических повреждениях, генетически детерминированной миопатии, пароксизмальной миоглобинурии)

14.00.15—патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск—2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Непомнящих Лев Моисеевич

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Сидорова Лидия Дмитриевна

Заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Шкурупий Вячеслав Алексеевич доктор медицинских наук Волков Александр Михайлович

Ведущая организация:

ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Москва).

Защита диссертации состоится " ? " ни*зи& 2005 г. в . /О часов на заседании диссертационного совета Д 208.062.05 в ГОУ ВПО Новосибирской государственной медицинской академии МЗСР РФ (630091, Новосибирск, Красный проспект, 52).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирской государственной медицинской академии МЗСР РФ (630091, Новосибирск, Красный проспект, 52).

Объявление в Бюллетене ВАК № 3, 2005 г. Автореферат разослан . 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.062.05

доктор медицинских наук, профессор Волков Аркадий Васильевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мышечные сокращения, по образному выражению И.М.Сеченова, отражают все многообразие внешних проявлений мозговой деятельности (Шмерлинг М.Д. и др., 1991). Широкий диапазон предъявляемых требований и постоянно меняющиеся условия микро- и макроокружения определяют необычайную сложность и динамичность комплекса механизмов, обеспечивающих выполнение мышечным волокном специфической функции. Нарушения тонкого равновесия в их работе, связанные с изменениями параметров клеточного метаболизма, могут приводить к запуску последовательности дистрофических, некробиоти-ческих и компенсаторных реакций, сопровождающих многие заболевания и интоксикации, составляющих основу патологического процесса при миопатиях различной природы (Бритван И.Я., 1989; Непомнящих Л.М. идр., 1999; Сухих Г.Т. и др., 2001; Emery A.E.H., 1998; Brass E.P., Hiatt W.R., 2000; Larsson N.G., Oldfois A., 2001; Ventura-Clapier R. et al., 2002; Warren J.D. et al., 2002; Gosker H.R. et al., 2003).

Несмотря на очевидную практическую и теоретическую значимость, морфология и механизмы этих изменений изучены недостаточно. Последнее обусловлено рядом обстоятельств: заболевания, при которых повреждения соматических мышц составляют основу патологического процесса (показано гистологическое исследование), как правило, редки; биопсия мышц производится на стадии выраженных клинических проявлений, когда гистологическая картина отражает сложный результат взаимодействия деструктивных и компенсаторно-приспособительных реакций.

Указанная ограниченность гистологического метода может быть значительно уменьшена при условии проведения исследований на самых ранних стадиях развития миопатологического процесса с последующим анализом динамики его развития. Подобный методический подход был с успехом использован в экспериментах при изучении острых очаговых метаболических повреждений миокарда (Непомнящих Л.М., 1991,1996) и соматических мышц (Целла-риус С.Ф., Целлариус Ю.Г., 1979).

Адекватность полученных представлений о морфогенезе дис-метаболических процессов в значительной степени зависит от того, насколько параметры экспериментального процесса отражают универсальные механизмы развития повреждения. Для тканей с высо-

кой зависимостью функционально и активности от окислительного метаболизма, к которым относится скелетная мускулатура, такими механизмами в первую очередь являются первичная и вторичная дисфункция митохондрий и связанные с ней дефицит энергии, нарушения ионного гомеостаза и активация свободнорадикальных процессов (Cassarino D.S., Bennett J.P., 1999; Mirabella M. et al., 2000; Weiss J.N. et al., 2003; Brookes P.S. et al., 2004). Изучение особенностей структурной реализации этих механизмов в многоядерных мышечных клетках, в которых отдельные ядра контролируют последовательные сегменты волокна, а митохондриальный компартмент отличается качественной и количественной гетерогенностью (Adhihetty P.J., Hood DA, 2003; Tews D.S., 2003) является новым и перспективным направлением фундаментальных исследований.

Для выяснения закономерностей структурной реорганизации мышечных волокон при дисметаболических состояниях различного генеза большое значение имеет сравнительный анализ морфо-функциональных изменений скелетных мышц при генетически детерминированных миопатиях и токсико-метаболических повреждениях. Одной из моделей наследственно обусловленных миопатий являются преждевременно стареющие крысы OXYS, у которых ключевую роль в патогенезе мультиорганной патологии играют прогрессирующие с возрастом нарушения энергетического метаболизма, обусловленные изменениями в соотношениях цитохромов внутренней мембраны митохондрий, снижением активности FjF0-ATO-синтетазы, дыхательного контроля и скорости фосфорилирования (Шабалина И.Г и др., 1995; Колосова Н.Г., и др., 2001). Косвенными признаками окислительного стресса являются накопление окислительных повреждений белков и липидов, усиление предмутацион-ных изменений в тотальной ДНК (Крысанова Ж.С. и др., 1995; Колосова Н.Г., и др., 2003).

Повреждения скелетных мышц, вызванные токсическими агентами (диметилпарафенилендиамином и бупивакаином) имеют другую динамику (Mascres С, Jasmin G., 1974; Draper R.P. et al., 1994; McLoon L.K. et al., 1998; Gregorevic P. et al, 2000; Hill M. et al., 2003) - воздействия носят «экстремальный» характер, однако их основной мишенью также являются митохондрии. Образование при окислении диметилпарафенилендиамина альтернативных путей транспорта электронов в дыхательной цепи (Munday R., 1992; Yabe К., 1992) и вызываемое бупивакаином разобщение окислительного

фосфорилирования приводят к острым нарушениям энергетического метаболизма и ионного гомеостаза (Bemardi Р., 1999; Irwin W. et al., 2001). Получение материала через различные промежутки времени после введения препаратов позволит реконструировать последовательность развития острых токсико-метаболических повреждений и ход регенерации.

Сравнительный анализ полученных результатов может помочь в интерпретации биопсийного, аутопсийного и экспериментального материала при таком редком и «строго локальном» в географическом смысле (Авцын А.П., 1972) заболевании, как алиментарно-токсическая пароксизмальная миоглобинурия. Непредсказуемость его кратковременных вспышек затрудняет, даже в современных условиях, применение многих клинических и экспериментальных методов исследования (Buchholz U. et al., 2000). Морфологические исследования проводились в небольшом числе случаев, главным образом на секционном материале и с использованием только световой микроскопии (Берман Ю.З., Струсевич А.В., 1957). Новые интересные данные были получены во время последней крупной вспышки этого заболевания (Сидорова Л.Д. и др., 1989), однако токсическое начало так и не было выделено, патогенетические механизмы остались неясными, а общая картина — пестрой и в некоторой степени «статичной».

Цель и задачи исследования. Цель работы — изучение морфогенеза деструктивных и компенсаторно-приспособительных процессов в соматической мышечной ткани при острых и хронических нарушениях клеточного метаболизма различного генеза.

Для достижения этой цели был использован экспериментальный и клинический (биопсийный и аутопсийный) материал и поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфогенез деструктивных и компенсаторно -приспособительных реакций в соматической мышечной ткани при генетически детерминированной метаболической миопатии у крыс линии OXYS.

2. Изучить особенности деструктивных реакций и регенераторный потенциал скелетных мышц крыс OXYS и Вистар при острых повреждениях соматической мускулатуры, вызванных бупивакаином.

3. Изучить морфогенез острых токсико-метаболических повреждений и репаративных реакций соматической мускулатуры, возникающих при введении диметилпарафенилендиамина.

4. Провести комплексный анализ структурных изменений в соматической мышечной ткани при алиментарно-токсической паро-ксизмальной миоглобинурии по данным биопсий и аутопсий.

5. Изучить морфологические особенности патологического процесса в соматической мышечной ткани при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии в зависимости от выраженности клинической картины в эксперименте.

6. Провести сопоставление полученных данных в плане интерпретации структурных проявлений и разработки элементов общей концепции деструктивных и компенсаторно-приспособительных процессов в соматической мускулатуре при метаболических нарушениях различного генеза.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное морфологическое исследование соматической мускулатуры на разных уровнях структурной организации при метаболических повреждениях различного генеза. Устанавлено единство структурных реакций скелетных мышц, включающих в себя адаптивные реакции митохонд-риального компартмента (при хроническом характере стрессового воздействия), универсальные изменения миофибрилл (как один из основных индикаторов состояния мышечного волокна) и интегральные изменения в мышечной ткани (отражение процессов компенсации и декомпенсации нарушенных функций).

По результатам изучения моделей острого и хронического нарушения клеточного гомеостаза выделены основные типы изменений сократительного аппарата — контрактурные повреждения и лизис, наличие и соотношение которых в патоморфологической картине позволяет судить об особенностях взаимодействия универсальных деструктивно-компенсаторных механизмов, связанных со скоростью нарастания, выраженностью сдвигов клеточного метаболизма и длительностью их существования.

Впервые при генетически детерминированной миопатии у преждевременно стареющих крыс ОХУ8 выявлены универсальные структурные реакции мышечных волокон при хроническом нарушении окислительного метаболизма. Показано, что в условиях прогрессирующей дисфункции митохондрий первые адаптивные реакции митохондриального компартмента (гиперплазия митохондрий с увеличением площади рабочей поверхности), сопровождающиеся ремоделированием и минимальной деструкцией фибриллярных структур, с течением времени сменяются его структурной

декомпенсацией — фрагментацией митохондриального компарт-мента и распространенными деструктивными изменениями митохондрий. Это повышает восприимчивость мышечных волокон к стрессовым стимулам, приводит к более частому возникновению очагов миоцитолизиса и контрактурных изменений, на тканевом уровне - к уменьшению компенсаторной гипертрофии и усилению атрофии мышечных волокон в диафрагме.

При токсико-метаболических повреждениях, вызванных бупи-вакаином, впервые показана эффективность репаративной регенерации у крыс OXYS, что указывает на сохранение при наследственно обусловленной дисфункции митохондрий пролифератив-ного и репопулятивного потенциала миогенных клеток-предшественников.

На основе последовательного анализа экспериментального материала, полученного через различные промежутки времени, была реконструирована динамика контрактурных повреждений при остром нарушении митохондриального метаболизма диметилпарафе-нилендиамином, показано значение структурно-метаболических характеристик волокна-мишени и типоспецифических особенностей распространения повреждения в определении формы, протяженности и эволюции контрактурного очага.

Изучение и сопоставление биопсийного, аутопсийного и экспериментального материала в одной «системе координат» позволило впервые представить комплексную патоморфологическую оценку изменений соматической мышечной ткани при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии с применением современных методов светооптического, поляризационного, фазово-кон-трастного и электронно-микроскопического анализа.

На фоне выраженной неоднородности морфологической картины показано, что из двух основных форм реакции в острой патологии поперечно-полосатой мускулатуры (контрактурные повреждения и внутриклеточный миоцитолизис), выходящих при алиментарно-токсической миоглобинурии на первый план, ведущая роль принадлежит литическим процессам. Отражением функциональной асинхронности и структурно-метаболической гетерогенности мышечных волокон является стадийная и типовая неоднородность морфологической картины с сохранением в ней вне зависимости от тяжести заболевания широкого спектра стереотипных патологических реакций.

Как при остром, так и при хроническом воздействии наиболее уязвимыми для повреждения оказываются работающие мышечные волокна. Подтверждением этого положения являются более выраженные изменения в постоянно работающем органе (диафрагме), обнаруживаемые при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии и в ранние сроки опыта с введением диметилпара-фенилендиамина (большее количество поврежденных волокон), а также при метаболической миопатии у крыс СКУв (повышенный фон очаговых изменений, особенности динамики морфо-стереоло-гических показателей).

Практическая значимость. Полученные результаты, раскрывающие закономерности и особенности тканевых, клеточных и субклеточных реакций в соматической мускулатуре при острых и хронических нарушениях клеточного метаболизма, составляют базу для разработки морфологических критериев диагностики и прогноза алиментарно-токсической миоглобинурии и метаболических повреждений соматических мышц различного генеза

Данные о закономерностях и механизмах повреждений скелетных мышц, полученные на экспериментальных моделях и отражающие универсальные механизмы повреждения и смерти клеток, могут быть экстраполированы на аналогичные процессы в патологии человека и использованы при интерпретации многообразия структурных перестроек в клиническом материале.

Результаты по использованию антиоксидантных препаратов (Темпола) для коррекции дисметаболических повреждений могут быть использованы для разработки новых терапевтических подходов при острых и хронических нарушениях митохондриального метаболизма в патологии человека.

Выявленные закономерности структурных реакций в условиях острого и хронического нарушения энергетического метаболизма составляют элементы общей концепции морфогенеза деструктивно-приспособительных реакций в патологии скелетных мышц и могут использоваться в различных обастях миопатологии. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Структурная перестройка скелетных мышц при метаболических нарушениях сопровождается комплексом стереотипных структурных изменений, в основе которых лежат адаптивные и деструктивные реакции митохондриального компартмента, универсальные изменения миофибрилл и структурная реорганизация мышечной

ткани (отражение процессов компенсации и декомпенсации нарушенных функций).

2. Морфологическую основу острой патологии скелетных мышц составляют универсальные очаговые реакции мышечных волокон, связанные с характерными изменениями миофибриллярного аппарата: контрактурные повреждения и очаговый миоцитолизис. Существенным фактором, определяющим особенности их структуры и эволюции является целостность сарколеммы

3. Спектр структурных реакций и преобладание в нем отдельных форм определяются не столько специфичностью повреждающего стимула, сколько его выраженностью и динамикой, а также адаптивным потенциалом мышечного волокна, связанным со структурно-метаболическим типом, функциональным состоянием и факторами микроокружения. Определенное значение в течении патологического процесса имеют видовые различия, не затрагивающие основные механизмы его развития.

4. При постепенно прогрессирующем нарушении клеточного метаболизма на первый план выходят адаптивные реакции митохон-дриального компартмента, которые с течением времени сменяются его структурной декомпенсацией с нарастанием деструктивных изменений миофибрилл, уменьшением компенсаторной гипертрофии мышечных волокон. Быстрая и эффективная репаративная регенерация указывает на сохранение в этих условиях пролифера-тивного и репопулятивного потенциала миогенных клеток-предшественников.

5. Межклеточная и внутриклеточная структурно-функциональная гетерогенность в значительной степени определяет типичную черту патологического процесса в скелетных мышцах: асинхрон-ность развития общего каскада деструктивно-компенсаторных реакций, в том числе на территории одного мышечного волокна, приводящую к стадийной, типовой и внутритиповой неоднородности патологических изменений, формированию множества промежуточных форм.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции «Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине» (Новосибирск, 1995), научной сессии сотрудников Новосибирского медицинского института (Новосибирск, 1995), II съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), первом Российском Конгрессе

по патофизиологии с международным участием «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы» (Москва, 1996), Первом Российском съезде патологоанатомов (Москва, 1996), Новосибирской городской конференции «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 1998), конференции «Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН (Новосибирск, 1998), VI Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2000), Международной конференции по физиологии мышечной деятельности (Москва, 2000); IV конференции молодых ученых СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2002), Ш Российском Конгрессе по патофизиологии «Диз-регуляционная патология органов и систем (Москва, 2004), Международном Конгрессе «Новые методы в диагностике, профилактике и лечении» (Ганновер, Германия, 2004), 6-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Гастро — 2004» (Санкт-Петербург, 2004), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально-значимых заболеваниях (Новосибирск, 2004), Ученом совете ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликована 29 работ, из них в рецензируемых журналах - 14, по списку ВАК - 7.

Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 231 странице машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы — 1 глава, характеристики материала и методов исследования — 1 глава, собственных исследований — 5 глав, обсуждения — 1 глава, выводов и списка литературы (480 работ), иллюстрирована 3 таблицами, 3 диаграммами, 95 микрофото-и электронограммами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика исследованного материала. Для исследования генетически детерминированной метаболической миопатии использовали 48 крыс-самцов ОХУВ массой тела от 130 до 520 г, в возрасте 2, 9, 12, 18 и 24 мес, контролем для которых служили 15 крыс-самцов Вистар массой от 110 до 665 г, аналогичного возраста.

С целью изучения роли митохондрий и окислительного стресса в повреждении мышечных клеток использована методика моделирования острой дисфункции митохондрий, включающая индуцированное местным анестетиком бупивакаином разобщение окислительного фосфорилирования и превентивное применение Темпола — ан-тиоксиданта из группы нитроксидов (Tempol). Исследовано 38 животных OXYS и 38 крыс Вистар в возрасте 6 мес, контролем для которых служили по 5 одновозрастных интактных животных каждой линии. Группы OXYS1 и Вистар1: 0,2 мл 0,75% бупивакаина вводили в переднюю большеберцовую мышцу. Забой производили через 3 ч, 1 сут, 3 сут, 7 сут, 14 сут. Группы OXYS2 и Вистар2: за 20-30 мин до введения бупивакаина внутрибрюшинно вводили Tempol в дозе 150 мг/кг. Забой производили через 3 ч, 1 сут, 7 сут. В каждую группу входило по 5 животных (в группах OXYS1 3 ч и Вистар1 3 ч - по 3 животных). У всех животных для контроля забирали кон-тралатеральную интактную мышцу, в двух случаях из каждой группе в нее вводили 0,2 мл стерильного изотонического раствора.

Модель острых метаболических повреждений волокон соматической мускулатуры была получена путем однократного подкожного введения экспериментальным животным диметилпарафени-лендиамина в дозе 2,5 мг на 100 г массы (Целлариус С.Ф., 1974; Jasmin, 1961). Использовано 39 крыс-самцов Вистар массой 150 — 300 г, 4 из которых служили контролем. Животных забивали через 6,12 ч, 1,3 и 5 сут после введения препарата.

Биопсийный, аутопсийный и экспериментальный материал алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии получен во время последней крупной вспышки этого заболевания в 1984 — 1985 г. в Новосибирской области (оз. Убинское). Клинический раздел составили 12 наблюдений АТПМ, в 8 случаях - по данным биопсий икроножной мышцы, в 4 - по данным аутопсий с исследованием скелетных мышц различной локализации. Материалом для экспериментального исследования АТПМ служили беспородные кошки (2 самца и 10 самок) исходной массой 770 — 4900 г. Подопытных животных кормили вареной и сырой рыбой, подозреваемой на токсичность; контрольные кошки получали нетоксичную вареную рыбу. В зависимости от выраженности клинической картины болезни подопытные животные были разделены на группы со слабовыраженными клиническими признаками, с выраженной клинической картиной и группу животных в терминальном

состоянии. Забой кошек проводили под нембуталовым наркозом по мере проявления признаков заболевания.

Для получения препаратов мыщц голени в «натяжении покоя» в моделях острых токсических повреждений (Целлариус С.Ф., Цел-лариус Ю.Г., 1979) после декапитации у животного ампутировали заднюю левую конечность на уровне тазобедренного сустава, быстро отсепарировали кожу в соответствующей области и помещали в охлажденный до 4оС 4% параформальдегид, приготовленный на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,4) целиком. Диафрагму фиксировали вместе с реберным кольцом. После предварительной фиксации в течение 1 сут от макрообразцов были отсечены фрагменты икроножной мышцы и диафрагмы, приемлемые для дальнейшей обработки.

Методы светооптического и электронно-микроскопического исследования. Для светооптического исследования фрагменты мышц фиксировали в 10% нейтральном формалине, обрабатывали по стандартной методике и заключали в парафин, учитывая ориентацию мышечных волокон. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином в сочетании с реакцией Перлса, по методу ван Гизона с до краской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию.

Для электронно-микроскопического исследования фиксированные в 4% параформальдегиде образцы постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия и после обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне заключали в смесь эпона и аралдита (Уикли Б., 1975). Полутонкие (1 мкм) срезы готовили на ультратоме Тесла, окрашивали реактивом Шиффа и 1% раствором азура II. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB III, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу, изучали в электронном микроскопе JEM 100 SX при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Методы поляризационной и фазово-контрастной микроскопии. Для выявления состояния фибриллярного аппарата мышечных клеток в поляризованном свете исследовали парафиновые окрашенные и неокрашенные срезы с продольно ориентированными мышечными волокнами на универсальном биологическом микроскопе Docuval (К. Zeiss).

Фазово-контрастная микроскопия мышечных волокон позволяет отчетливо выявлять в мышечной клетке миофибриллы, митохонд-

рии, ядра, а также определять уплотнение или снижение плотности саркоплазмы. Исследования в фазовом контрасте проводились в качестве дополнительного метода к поляризационной микроскопии.

Методы морфометрического и стереологического анализа. На

поперечных полутонких срезах с помощью окулярного микрометра МОВ-1-15х измеряли средний диаметр мышечных волокон (не менее 60 измерений для каждого животного). С помощью окулярной многоцелевой тестовой системы коротких отрезков (Непомнящих Л.М. и др., 1984; Weibel et al., 1966; Gundersen et al., 1988) проводили стереологический анализ тканевой организации икроножной мышцы и диафрагмы. В качестве первичных стереологи-ческих параметров вычисляли численную, поверхностную и объемную плотность мышечных волокон, объемную плотность стромы; затем рассчитывали поверхностно-объемные и объемные отношения исследуемых компартментов, а также площадь поперечного сечения мышечных волокон и индекс капилляризации (Ripoll et al., 1979).

При статистической обработке данных, полученных в результате морфометрического и стереологического анализа, применяли критерий Стьюдента; различия считали значимыми, если вероятность ошибки Р была меньше 0,05 (Лакин Г.Ф., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЕНЕТИЧЕСКИ-ДЕТЕРМИНИРОВАННАЯ МИСПАШЯ УПРЕЖДЕВРЕМЕННО СТАРЕЮЩИХКРЫС OXYS

Линия преждевременно стареющих крыс OXYS (первоначально зарегистрированная как W/SSM) создана в Институте цитологии и генетики СО РАН (Соловьева Н.А. и др., 1975). Этих животных характеризуют снижение продолжительности жизни, повышенная частота возникновения злокачественных опухолей, ранние инволютивные изменения внутренних органов, в том числе - кар-диомиопатии (Непомнящих Л.М. и др., 1995).

Дальнейшие исследования показали, что ключевую роль в патогенезе преждевременного старения крыс OXYS играют нарастающие с возрастом нарушения структуры и функций митохондрий.

В условиях хронического нарушения клеточного гомеостаза в светооптической картине доминировали умеренные неспецифические миопатические изменения, отражающие баланс альтератив-

ных и компенсаторных процессов в соматической мускулатуре: вариабельность диаметра, продольное расщепление мышечных волокон, неравномерное распределение в них зерен гликогена. У взрослых жиютных часто наблюдалось огрубение соединительнотканного каркаса, связанное с накоплением пучков коллагеновых волокон.

По данным количественного структурного анализа, во всех возрастных группах отмечалось увеличение вариабельности размеров мышечных волокон как проявление процессов компенсации-декомпенсации и, как следствие, гипертрофии и атрофии мышечных волокон. Однако динамика этих изменений и их выраженность в разных мышцах неодинаковы (см. рисунок). В икроножной мышце отмечалось более постепенное и прогрессивное нарастание среднего значения диаметров мышечных волокон (на 6% у 2-месячных и на 11% у 9-месячных животных в сравнении с одновозрастным контролем) при резком увеличении коэффициента вариации в старшей возрастной группе (почти в 2 раза по сравнению с контролем).

В диафрагме признаки хронического нарушения клеточного метаболизма проявлялись уже в возрасте 2 мес, когда средний диаметр мышечного волокна достоверно возрастал на 13%, а коэффициент вариации — в 1,5 раза, в то время как в старшей группе они снова приближались к контрольным значениям, что может свидетельствовать об уменьшении компенсаторной гипертрофии мышечных волокон при усилении в них дистрофических процессов. Обращает на себя внимание, что индекс капилляризации (число капилляров, приходящихся на мышечное волокно) несколько уменьшался (в диафрагме) или почти не изменялся (в икроножной мышце) при увеличении размеров волокон в сравнении с контролем. Это «отставание» особенно заметно в диафрагме 2-месячных животных (см. таблицу).

Таким образом, динамика морфо-стереологических показателей показывает, что истощение компенсаторных реакций быстрее наступает в диафрагме - постоянно работающей мышце, содержащей большую долю оксидативных мышечных волокон (Шмерлинг М.Д. и др., 1991) и, по-видимому, более чувствительной к хроническому нарушению окислительного метаболизма.

Характерным признаком электронно-микроскопической картины у крыс линии OXYS e возрасте 2мес была гетерогенность внутриклеточной организации, заключающаяся в уменьшении упорядоченности упаковки миофибрилл, частом расщеплении миофиб-

Изменение диаметра (Б) мышечных волокон и коэффициента вариации (СУ0) у крыс опытной (ОХУ8) и контрольной (ММаг) групп с возрастом,

а — икроножная мышца; б — диафрагма.

:~Во> % ЗраСг ^

■н Ь о -Ттг-2-

¡ГрйиШ ® Г|овёрхност-о ЗСМЙфЛна*« ^ Пб^^хнрс^- Йбъемйая*я .^ивотйыХ ^ная МЛ ОТ" о Плотность* ^ на-объемное ~ плотность^*

~ Р о Я* "ноетв^В Е2 5 -МВ^ ^ р1нош<Уше я ^стромЫ ~

МЕГ

Объёмное;^

"П —ГС К

-отношещ|<"

->■ ,

у строи ы; к ,р гпарен* имей

-Площ'гиК

гх, I™ V;

гюперс.чн§

го сечёнид о Л

•^ИКзекс о

■^аййлря-^ физйции С

I § £ "3 I ^ £ьфсй> Ц Щ |м5смЗ | Ц флЗ' I §

Я &.Я

и я с, ~

С- '1 Мес ¿1. ^ ^ ^^ кон'трбЛь 0.081 ±0.016 ^ 0?7(>6±&:098 £ 0,11 бЫл 12 '¿о^з&аЬ 17 о X -- й х 3 ё £ Ь Д0.36050,0223 е.; Г^ ^ , ¡4 V-.

опыт 0.092±0.023 0.710±0.051 0.130±0.021 0.263±0.063 0,370±0,006 936+18* 1.18±0.10

\ 9 мес контроль ■ 0,053±0.006 0,618±0.012 0.086±0.017 0.301±0.012 0.487±0,030 . 1975±31 1.50±0.08

опыт 0.056±0.008 0.691 ±0,043* 0.081 ±0.009 0.284±0.037 Диафрагма 0,411 ±0,011* 2385±86* 1.53±0 07 .

2 мес контроль 0.079±0,012 0,655±0,075 0,121±0,059 0,196±0,021 0.299±0.012 879±21 1.21±0.10

ОПЫТ 0,076±0.006 ; 0,668±0,059 ; 0,114±0,017 ; 0,202±0,013 :о.зо2±о.ою 1062x48* 1.15±0.02

.9|\кс- контроль;?. 0,064±0.010 г ОГ599±0,061 0,10^0.016 ^0,226±0,017 •10.37740^032} 1675±56 1.48±0,01

л- '1 опькГ й у; 0,061*0.009 'а обоз±р;о$5 0Л0Т±0^029 0,231 ±0,008 |0.383±0.01&Г 1789±42*'

примечаний: МВ'гг мышечные волокна;,* р* 0Л5тг сравнению с контролем."

риллярных пучков, нерегулярности, смещениях и поперечных деформациях Z-дисков. Встречались небольшие (1 — 2 саркомера) участки дезагрегации и лизиса миофибрилл.

Однако на первый план выходили изменения митохондриаль-ного компартмента, отчетливее выраженные в красных мышечных волокнах. Многочисленные митохондрии компактно группировались в межмиофибриллярных пространствах и в подсарколеммальной зоне. По сравнению с митохондриями мышечных волокон крыс Вистар их количество было увеличено, размеры и форма более вариабельны, матрикс более осмифильный; кристы характеризовались иррегулярной упаковкой. В отдельных митохондриях внутреннее пространство крист было расширено.

Значительное увеличение объема межмиофибриллярных митохондрий способствовало проявлению трехмерной структуры «этажей» митохондриального ретикулума (Kirkwood S.P. et al., 1986), обычно скрытой за 2-мерностью ультратонкого среза: местами было отчетливо видно, что крупные «парные» митохондрии с плотно упакованными кристами, которые, как правило, располагаются по обеим сторонам Z-дисков саркомеров, на самом деле представляют собой поперечные срезы боковых ответвлений, окружающих каждую миофибриллу на уровне I-дисков (Ogata Т., Yamasaki Y., 1997). Продольные митохондриальные колонны, образованные плотно контактирующими митоходриями, а иногда, по-видимому, непрерывными отростками, продолжались в области А-диска, соединяя соседние этажи.

Наблюдались признаки внутриклеточной регенерации - скопления свободных рибосом и полирибосом, особенно многочисленные на периферии редких очагов миоцитолизиса, у культей миофибрилл.

В возрасте 9-12 мес у животных опытной линии отмечались более выраженная вариабельность ширины миофибриллярных пучков, частое их расщепление, иногда — контрактурные изменения. Очаговый лизис и дезагрегация миофибрилл захватывали, как правило, от одного до нескольких саркомеров с обнажением трубочек Т-системы, расширенных и вакуолизированных профилей саркоп-лазматической сети. В очагах разрежения миофибрилл обнаруживался хлопьевидный субстрат.

Межклеточная и внутриклеточная гетерогенность митохондри-ального компартмента коррелировала с другими признаками, отра-

жающими общее состояние мышечного волокна. В мышечных волокнах с достаточно большим количеством гликогена, как правило, наблюдалась гиперплазия и группировка митохондрий, хотя и менее выраженные, чем у 2-месячных животных. Однако разветвленные структуры, подобные описанным ранее, не обнаруживались. Многие митохондрии, особенно в участках миоцитолизиса, характеризовались выраженным полиморфизмом, дезорганизацией внутренней структуры с редукцией крист, набуханием или гетерогенностью и умеренной электронной плотностью матрикса. Некоторые из вытянутых митохондрий имели сужения и перетяжки.

Значительная редукция митохондриального компартмента обычно сочеталась с почти полным отсутствием гранул гликогена. В таких случаях «пустые» межмиофибриллярные пространства наряду с единичными сохраненными мелкими митохондриями содержали большое количество полиморфных деструктурированных орга-нелл и миелиновых фигур. Митохондрии с выраженными изменениями, в том числе резким уплотнением отдельных крист, очаговым отеком и просветлением матрикса, электронно-плотными включениями, признаками разрушения наружной мембраны часто встречались в зонах дезагрегации и лизиса миофибрилл. Отмечено увеличение числа аутофагосом (содержащих фрагменты митохондрий), липидных капель, резко осмиофильных резидуальных телец. Признаки внутриклеточной регенерации, в том числе в очагах миоци-толизиса, менее выражены, чем у крыс Вистар того же возраста.

В большинстве мышечных волокон 18-, и особенно, 24-месячных крыс ОХУв снижено число митохондрий и содержание гликогена, отмечены множество деструктурированных митохондрий, многочисленные аутофагосомы, содержащие фрагменты митохондрий, а также полиморфные резидуальные тельца. Тем не менее сохранялась существенная популяция мышечных волокон, содержащих довольно большое количество мелких митохондрий с редкими крис-тами и гомогенным, умеренно электронно-плотным матриксом. Это свидетельствовало о гетерогенности мышечных клеток, обеспечивающей адаптивно-компенсаторный потенциал у особей данной линии, доживших до критического возраста (максимальная продолжительность жизни у крыс OXYS составляет 24,6 ± 4,3 мес против 36 мес в среднем у Вистар). Митохондрии мышечных волокон животных контрольной группы варьировали по размерам и имели меньшую степень выраженности дегенеративных изменений.

Пролиферация и структурные аномалии митохондрий (увеличение размера, полиморфизм, деструкция крист, включения) являются самыми частыми признаками, выявляемыми более чем у половины больных с первичными митохондриальными заболеваниями при морфологическом анализе скелетных мышц. Эти изменения наиболее характерны для состояний, связанных с дефектами в дыхательной цепи и в сопряжении процессов окисления и фосфо-рилирования, гораздо реже они встречаются при нарушениях транспорта и утилизации субстратов (Rollins S. et al., 2001; Vogel H., 2001). Описанный нами комплекс изменений митохондрий согласуется с обнаруженными ранее изменениями в соотношениях цитохромов внутренней мембраны, снижением активности FjFq -АТФ-синтета-зы, дыхательного контроля и скорости фосфорилирования (Шаба-лина И.Г. и др., 1995; Колосова Н.Г., и др., 2001), указывающими на возможную локализацию первичного дефекта в дыхательной цепи с развитием состояния «мягкого» разобщения.

Прогрессирующая дисфункция митохондрий (вследствие накопления груза мутационных и окислительных повреждений) ведет к дефициту энергии, сдвигу в системе про- и антиоксидантов, развитию окислительного стресса, который, в свою очередь, может быть одной из причин изменения морфологии и функции этих органелл. В частности, многие структурные характеристики митохондрий в данной модели (набухание, очаговый отек и просветление матрикса, признаки разрушения наружной мембраны) могут быть связаны с переходом мембраны митохондрий в состояние повышенной проницаемости (МРТ) вследствие открытия РТ-поры, наиболее важными физиологическими индукторами которой являются ионы Са2+ и активные формы кислорода (Crompton V., 1999; Zorov D.B. et al., 2000). Продолжительное открытие РТ-поры вызывает осмотическое набухание матрикса, распрямление крист внутренней мембраны, разрыв внешней мембраны с необратимым повреждением митохондрий и высвобождением проапоптотичес-ких молекул из межмембранного пространства (Weiss J.N. et al., 2003).

Возможности экспериментального исследования позволили проследить за адаптивной реакцией митохондриального компартмента. Согласно опубликованным данным, отклонения в функционировании дыхательной цепи митохондрий печени крыс OXYS регистрируются уже в 2-3 мес, однако снижения синтеза АТФ не наблюдается (Салганик Р.И. и др., 1995). Объяснением этому может быть

обнаруженная ранее в печени (Колосова Н.Г. и др., 2001), а также в настоящей работе компенсаторная гиперплазия митохондрий с увеличением площади их рабочей поверхности.

Согласно современным представлениям, митохондрии являются высоко динамичными органеллами, способными изменять свое количество и структуру в ответ на стрессовые воздействия, регулируя относительную частоту расщепления и слияния (Bereiter-Hahn J, Voth M., 1994; Karbowski M, Youle R.J., 2003; Lee Y. et al., 2004). Ряд фактов указывает на то, что, по крайней мере в определенных условиях, митохондрии образуют физически связанные сети, создавая тем самым эффективную систему, участвующую в координации синтеза энергии и/или кальциевом сигналлинге (De Giorgi F. et al., 2000; Skulachev V.P., 2001). Слияние и расщепление внутри динамической сети может служить механизмом межмитохондри-альной генетической комплементации через обмен геномами, способствуя репарации накапливающихся с возрастом мутаций мито-хондриальной ДНК (Nakada К. et al., 2000). Подобные механизмы адаптационных перестроек могут иметь место и у крыс OXYS, у которых делеци и мтДНК начинают обнаруживаться с 3-месячного возраста, что совпадает по времени с максимальной выраженностью черт ретикулярного строения митохондриального компартмента.

К 9-12-месячному возрасту в скелетно-мышечных волокнах крыс OXYS нарастали признаки структурной «декомпенсации» митохондрий, совпадающие с исчезновением их разветвленной морфологии. Наблюдались митохондрии с перетяжками, свидетельствующие о процессах расщепления. Показано, что в условиях, компрометирующих функцию митохондрий, таких как дефекты митохон-дриальной ДНК или воздействие токсических веществ, происходит фрагментация разветвленной структуры с образованием мелких округлых органелл (Gilkerson R.W. et al., 2000; Legros F. et al., 2002). Это способствует изоляции поврежденного участка митохондри-альной системы от ее интактных частей. Если повреждение не ре-парируется и условия, вызывающие МРТ, продолжают действовать, отделившаяся митохондрия после разрыва внешней мембраны подвергается полной деструкции и удаляется аутофагосомами. Подобные изменения, называемые некоторыми авторами «митоптозом» (Skulachev V.P., 2000), наблюдались у крыс OXYS в старших возрастных группах и часто совпадали с ограниченными зонами дезагрегации и лизиса структурных белков.

Таким образом, структурная и функциональная разобщенность и гетерогенность митохондрий усиливаются при хроническом стрессовом воздействии. Кроме негативных аспектов, связанных с нарушением координации отдельных «энергетических единиц» (Saks VA et al., 2001) и снижением общей эффективности работы мышечного волокна, это может иметь существенное адаптивное значение, затрудняя распространение локальных метаболических сдвигов на всю территорию клетки.

Наличие отдельных митохондрий или их кластеров со сниженной функцией может сопровождаться локальным, возможно преходящим, МРТ, или другими механизмами, приводящими к выходу небольшого количества цитохрома с (Petrosillo G. et al., 2003), активации каспаз, локальному лизису белков цитоскелета и ремоделированию структур энергетической единицы (пространственная реорганизация митохондрий, деформация Z-дисков и расщепление миофибрилл с уменьшением диффузионного расстояния для адениловых нуклео-тидов). Облегчение энергетических потоков внутри единицы и восстановление контрактильной активности, возможно прямо сопряженной через компоненты цитоскелета с метаболической функцией митохондрий (Milner D. et al., 2000), могут способствовать компенсации митохондриалъного дефекта. В случае неудачи, митоптоз и продолжающийся лизис заканчиваются удалением несостоятельных структур одного или нескольких саркомеров.

Фенотип удаления, по-видимому, определяется скоростью нарастания локального дефицита АТФ. В случае, если быстро протекающие энергозависимые процессы апоптотической деструкции не успевают завершиться до того как недостаток энергии блокирует их осуществление (Eguchi Y. et al., 1997; Leist M. et al., 1997), выход Са2+ из деполяризованных митохондрий и нарушение его обратного захвата вызывает гиперконтрактуру миофибрилл с возможным механическим разрушением сарколеммы (Weiss J.N. et al., 2003), макро-фагальной реакцией и другими признаками некротического пути развития. В данной модели такие изменения встречались редко. Постепенно нарастающий характер стрессовых стимулов и успевающие развиться адаптивно-компенсаторные механизмы препятствуют резкому падению локального энергетического потенциала и способствуют преобладанию «щадящих» вариантов деструкции.

Однако эти изменения, несмотря на ряд общих черт, отличаются от типичной для других типов клеток картины апоптоза —

характерная для его поздних стадий морфология ядра была обнаружена только в нескольких наблюдениях. По-видимому, это объясняется другой динамикой апоптотических изменений на территории многоядерной клетки-си мпласта (Lockshin R.L., Zakeri Z., 1996; Borisov A.B., Carlson B.M., 2000; Mirabella M. et al., 2000): процесс локальной перестройки цитоплазматических структур (очаговая дезагрегация и лизис миофибрилл) носит более затяжной характер, и гораздо более очевиден, чем «мимолетная» апоптотическая трансформация отдельного ядра.

Судьба целого мышечные волокна, вероятно, зависит от соотношения дефектных (деэнергизированных, с накопившимся грузом окислительных повреждений, мутациями мтДНК) и нормальных митохондрий. Поскольку дефектные митохондрии, испытывающие хроническую интоксикацию свободными радикалами, пролифери-руют быстрее нормальных, тем самым компенсируя нехватку энергии, доля мутантных мтДНК в постмитотических тканях прогрессивно увеличивается (Сукерник Р.И. и др., 2002). Показано, что аккумуляция в определенном сегменте мышечного волокна митохондрий, содержащих делеции мтДНК, достигая порогового уровня экспрессии, приводит к сегментарной атрофии мышечного волокна (Wanagat J. et al., 2001). Это может быть связано с накоплением локальных апоптотических изменений (Sandri M, 2002; Leeuwenbuigh С, 2003; Tews D.S., 2005), а также с нарушениями сигнальных путей и изменением экспрессии генов ядра, контролирующего данный сегмент, приводящими к снижению синтеза фибриллярных белков.

С другой стороны, структурная и метаболическая гетерогенность мышечных волокон в сочетании с гетерогенным распределением митохондриальных дефектов в разных клетках и на протяжении одного волокна создают условия для длительного поддержания адаптивного потенциала не только за счет внутриклеточных процессов (ремоделирования и регенерации), но и за счет компенсаторной гипертрофии тех мышечных волокон, в которых выраженность митохондриальных нарушений не достигла значительной экспрессии.

К 9-месячному возрасту, несмотря на ультраструктурные признаки замедления процессов внутриклеточной регенерации, мор-фостереологические показатели гипертрофии мышечных волокон в икроножной мышце крыс OXYS все еще сохраняли тенденцию к увеличению (при двукратном повышении коэффициента вариа-

ции), в то время как в диафрагме, постоянно работающей преимущественно оксидативной мышце, они начинали снижаться.

Уменьшение компенсаторной гипертрофии и усиление атрофии скелетных мышц у взрослых крыс OXYS, кроме срыва компенсаторных механизмов внутри самого мышечного волокна, могут быть обусловлены возможным снижением пролиферативного и репопулятивного потенциала клеток-сателлитов (основных источников постмитотических ядер в скелетных мышцах), связанным как с истощением пула при повторных циклах повреждения - регенерации (Chakravarthy M.V. et ah, 2000), так и с изменением микроокружения вследствие метаболических нарушений и структурных перестроек скелетно-мышечных клеток.

Чтобы проверить эту гипотезу, был проведен анализ эффективности регенераторной реакции, а также особенностей дегенерации скелетных мышц при остром повреждении, вызванном бупивакаином.

ДЕСТРУКЦИЯ И РЕГЕНЕРАЦИЯ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ КРЫС OXYS И ВИСТАР, ВЫЗВАННЫЕ БУПИВАКАИНОМ

Механизм разобщения окислительного фосфорилирования некоторыми местными анестетиками и, в частности, бупивакаином до сих пор является предметом обсуждения (Schonfeld P. et al., 1992; Sztark F. et al., 1994; Irwin W. et al., 2001). Такой интерес во многом обусловлен стремлением понять основы миотоксичности этого препарата, способность которого вызывать быструю дегенерацию мышечных волокон часто используется для изучения регенерации скелетных мышц (Marsh D.R. et al., 1997; Gregorevic P. et al., 2000; Hill M. et al., 2003). Однако вне зависимости от конкретного механизма, непосредственной причиной бупивакаин-индуцированной деполяризации митохондриальных мембран в изолированных мышечных юлокнах, по-видимому, является активация РТ-поры (Irwin W. et al., 2001), следствием чего становится снижение синтеза АТФ и нарушение кинетического баланса между высвобождением и обратным захватом Са2+ саркоплазматическим ретикулумом: было показано, что деполяризация митохондрий предшествует повышению концентрации цитоплазматического Са2+ и развитию необратимой контрактуры (Bernardi P., 1999).

Основной целью данного этапа исследования стало изучение регенераторного потенциала и особенностей дегенеративной фазы

повреждения скелетных мышц у преждевременно стареющих крыс OXYS с учетом особого физиологического контекста, который создают предсуществующее напряжение гомеостатических механизмов и адаптивные перестройки митохондриального компартмента. Одной из основных точек такого напряжения у этих животных является баланс в системе «про- и антиоксиданты» (Колосова Н.Г. и др., 2003). В связи с этим, с целью дополнительной оценки роли окислительного стресса в каскаде повреждения мышечной клетки была предпринята попытка превентивного применения Темпола -антиоксиданта из группы нитроксидов (Hahn S.M. et al., 1992). Его эффективность в нетоксических концентрациях была показана in vitro и in vivo в случаях, когда реакции окисления вызваны супероксид-анионом, перекисью водорода, органическими гидроперекисями, ионизирующей радиацией (Mitchell J.B. et al., 2001).

Для эксперимента была выбрана передняя большеберцовая мышца, поскольку ее строение дает возможность оценить реакцию различных типов мышечных волокон на повреждение. В этой мышце четко различаются две зоны - наружная светлая, состоящая преимущественно из белых мышечных волокон, и внутренняя, более глубокая, основная часть мышечных волокон в которой имеет типичные для красных волокон признаки (Шмерлинг М.Д. и др, 1991).

Несмотря на относительно небольшое количество вводимого препарата (в 3 — 5 раз меньше использовавшегося в большинстве работ для получения субтотального повреждения), дегенеративные изменения носили распространенный характер и развивались очень быстро, причем красные мышечные волокна, по-видимому, проявляли относительную устойчивость к повреждающему воздействию.

Через 2 — 4 ч во всех группах в наружной зоне наблюдалась отечность мышечных волокон и эндомизия. При исследовании в обычном свете во многих участках отмечалась потеря поперечной исчерченности. Ограниченные и протяженные очаги контрактур-ных изменений обладали высокой плотностью и гомогенностью. Нередко в одном волокне наблюдалось несколько узлов сокращения, разделенных полосками спавшейся сарколеммы. Участки пересокращения и уплотнения переходили в зоны резкого перерастяжения или были оторваны от остальной части волокна. Однако чаще всего изменения захватывали мышечные волокна на значительном протяжении. При исследовании в поляризованном свете, а также на полутонких срезах участки пересокращения (контрактуры II сте-

пени) и перерастяжения с нарушениями взаимной упорядоченности миофибрилл встречались и в зоне красных мышечных волокон. В этой же зоне отмечались начальные проявления мелкоочагового лизиса миофибриллярных структур.

Иногда (на полутонких сезах) дезагрегация миофибрилл напоминала картины «дискоидного распада» (Секамова СМ. и др., 1976) — А-диски отличались выраженным диастазом, теряли взаимопараллельное расположение, полосы 1-дисков выглядели «пустыми», отдельные группы саркомеров как будто рассыпались.

В группах ОХУ82 и Вистар2 (после превентивного введения Темпола) картина в целом соответствовала описанной, за исключением того, что отек мышечных волокон и особенно интерстиция был менее выражен, мышечная ткань выглядела более «плотной».

Через 1 сут в зонах повреждения наблюдалось множество очагов на поздней стадии развития со снижением анизотропии в кон-трактурном конгломерате, глыбчатый распад очагов и выраженная мононуклеарная клеточная инфильтрация с примесью сегментоя-дерных лейкоцитов. В участках далеко зашедшей резорбции инфильтрат полностью заполнял территорию волокна на значительном протяжении. В относительно интактных при исследовании в обычном свете мышечных волокнах, вокруг которых не было клеточной инфильтрации, отмечалось значительное количество мелкоочаговых литических повреждений. Существенных различий между группами не наблюдалось.

Через 3 сут после введения бупивакаина в препаратах сохранялись зоны некротизированных волокон с признаками распада и почти полным отсутствием ядер. Вокруг этих зон располагались поля клеточной инфильтрации, в значительной степени представленной пролиферирующими миобластами, сливающимися в тонкие базофильные миотрубочки. Макрофаги и миобластоподобные клетки заполняли профили пустых сарколеммных трубок, группы более крупных мышечных трубочек с центральными ядрами образовывали пучки. Ближе к зоне красных волокон архитектура мышечной ткани была в целом сохранена. Отдельные тонкие миотру-бочки прилежали к мышечным волокнам, сохраняющим нормальное строение. Иногда складывалось впечатление, что миобласты, сливающиеся в симпласт, соединяли сохранившиеся фрагменты одного мышечного волокона. Отставания пролиферативной фазы регенераторной реакции у крыс ОХУ8 не отмечалось.

Через 7 сут архитектура мышечной ткани начинала восстанавливаться. Характерной чертой было созревание миотрубочек, образующих группы, состоящие из незрелых мышечных волокон, а также рассеянные тонкие, но уже менее базофильные волокона с поперечной исчерченностью и центрально расположенными светлыми ядрами. Иногда несколько таких тонких трубочек-волокон находились внутри остатков сарколеммной трубки.

Через 14 сут общая архитектура скелетной мышцы была практически восстановлена. Мелкие волокна теряли базофилию, менее отчетливо выделялись на общем фоне, однако еще не достигали нормального размера. Около 20% мышечных волокон сохраняли центральные ядра. Признаков фиброза не отмечалось.

При ультраструктурном исследовании в красных мышечных волокнах митохондриальный компартмент представлен многочисленными полиморфными органеллами, различными по размеру, форме, плотности матрикса и содержанию крист, местами с умеренными деструктивными изменениями. В белых волокнах митохондрии были более мономорфны и чаще деструктивно изменены.

В развитии альтерации мышечных волокон в данной модели можно предполагать первичное поражение митохондрий. При сохранении ультраструктурной организации миофибрилл или их умеренных контрактурных изменениях в межмиофибриллярных пространствах отмечалась диффузная тотальная деструкция митохондрий с формированием электронно-прозрачных пузырьков. Подобные митохондриальные останки обнаруживались и среди дезагрегированных, беспорядочно расположенных миофиламентов на заключительной стадии контрактурного повреждения, а также в расширенных вследствие отека межмиофибриллярных промежутках.

Регенерация мышечных волокон в динамике эксперимента происходит на внутриклеточном и клеточном уровне, ассоциируясь с активацией ядер мышечных волокон, а также клеток-сателлитов. Активированное состояние ядер подсарколеммальной локализации выражалось в увеличении площади их поверхности за счет фестончато-сти нуклеолеммы, возрастании ширины и количества ядерных пор, появлении двух-трех крупных ядрышек. В перинуклеарной зоне у одного или обоих полюсов ядра скапливалось большое количество мелких митохондрий с плотным матриксом и преимущественно упорядоченными многочисленными кристами, появлялись свободные рибосомы, визуализировались короткие расширенные каналь-

цы цитоплазматической сети, формировались тонкие, хаотично ориентированные филаментозные структуры. В созревающих миотру-бочках и незрелых мышечных волокнах «цепочки» ядер дислоцированы в центральной части волокна, миофибриллярный аппарат имеет регулярное строение, «хаотичной» регенерации не наблюдается.

В некоторых случаях наблюдались непосредственные ультраструктурные признаки активации клеток-сателлитов. В покоящемся состоянии это резко истонченные клетки, расположенные между базальной пластинкой и сарколеммой, содержащие уплощенное ядро с мелкими маргинальными глыбками гетерохроматина и одиночные цитоплазматические органеллы. Первыми структурными признаками их активации были появление ядрышка и гиперплазия гранулярной цитоплазматической сети с неравномерным расширением цистерн. В дальнейшем клетки приобретали бочонкооб-разную форму за счет укрупнения ядра и гиперплазии митохондрий, что обеспечивало индукцию белоксинтетической функции и фенотипическую модификацию с образованием вытянутых ци-топлазматических отростков.

В свете возобновившейся дискуссии о возможности секвестрации ядер дегенерирующего волокна и их участии в образовании новых мышечных волокон (Charge S.B.P., Rudnicki MA, 2004) интересным наблюдением была картина, наблюдавшаяся в перифо-кальной зоне очага выраженного лизиса миофибрилл с признаками деструкции сарколеммы и напоминавшая клазмацитоз — от-шнуровывание выбухающей в сторону эндомизия ядросодержа-щей части волокна с небольшим количеством цитоплазмы, заполненной многочисленными мелкими митохондриями.

Таким образом, внутримышечное введение бупивакаина вызывает быстрое развитие распространенных деструктивных изменений преимущественно в белых мышечных волокнах (очаги кон-трактурного типа) или в волокнах обоих типов (очаги миоцито-лизиса). Причиной такой относительной избирательности могут быть больший компенсаторный резерв митохондриального компартмента в красных мышечных волокнах. Интересно, что при мышечной дистрофии Дюшенна, в патогенезе которой считаются значимыми первичные или вторичные нарушения целостности сарколеммы и нарушения кальциевого гомеостаза, белые мышечные волокна (lib типа) также более подвержены контрактурным («гиалиноз» цитоплазмы) изменениям (Webster С. et al., 1988).

Бупивакаин, по-видимому, не оказывает существенного повреждающего действия на естественное микроокружение, необходимое для полноценной регенерации мышечной ткани: клетки-сателлиты, сосуды, нервные окончания, а также базальные мембраны, которые образуют направляющий каркас для пролиферирующих ми-областов и растущих миотрубочек (Gullberg D. et al., 1999). Подтверждая эти наблюдения, эффективная регенерация с восстановлением нормальной архитектуры мышечной ткани, продемонстрированная во всех группах в настоящем исследовании, указывает на сохранение пролиферативного и репопулятивного потенциала мио-генных клеток-предшественников при наследственно обусловленной дисфункции митохондрий у крыс OXYS.

Однократное превентивное применение антиоксиданта (Тем-пола) при экстремальном местном токсическом воздействии вызвало уменьшение отечности мышечных волокон и интерстиция в ранний срок эксперимента, но оказалось недостаточным для уменьшения выраженности деструкции. Однако, учитывая этот неполный эффект, а также другие данные, показывающие эффективность длительного применения комплексных антиоксидантных препаратов и экстракта черники у животных этой линии (Шаба-лина И.Г. и др., 2001; Лоскутова Л.В. и др., 2003), можно рассчитывать на перспективность многократного или хронического применения анитоксидантов при острых и хронических нарушениях ми-тохондриального метаболизма в патологии человека.

Быстрота и массивность повреждений при местном воздействии бупивакаина не позволяют оценить многие детали и динамику изменений в дегенеративной фазе реакции скелетных мышц на острое нарушение митохондриальной функции. Такая возможность появляется при более «мягком» общем воздействии.

КЛЕТОЧНЫЕ И ТКАНЕВЫЕ РЕАКЦИИ СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЫ

ПРИ ОСТРЫХ НАРУШЕНИЯХ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА, ВЫЗВАННЫХДИМЕТИЛПАРАФЕНИЛЕНДИАМИНОМ

Известно, что ряд производных парафенилендиамина вызывают повреждения скелетных и/или сердечной мышцы у экспериментальных животных (Mascres С, Jasmin G., 1974; Draper R.P. et al., 1994). Такая избирательность эффектов в-отношении тканей с высокой зависимостью от окислительного метаболизма может объяс-

няться тем, что соединения этого типа активно окисляются митохондриями, образуя альтернативные пути транспорта электронов в дыхательной цепи. Это сопровождается снижением показателей дыхательного контроля и отношения АДФ:О, а величина митохон-дриальных эффектов хорошо коррелирует со способностью вызывать повреждения скелетных мышц (Munday R., 1992).

После введения животным диметилпарафенилендиамина первые видимые изменения мышечных волокон были зарегистрированы через 6 ч. Обращали на себя внимание очаговый характер и избирательность поражений: в одном и том же препарате среди значительного количества волокон, не затронутых патологическим процессом, встречались волокна с изменениями различной протяженности и степени выраженности. Однако особенностью патологического процесса в данной модели, по крайней мере на свето-микроскопическом уровне, была относительная типовая однородность повреждений, выражавшаяся в ранних и демонстративных изменениях сократительного аппарата - сегментарных контрактурах отдельных мышечных волокон.

Такой характер изменений наводит на мысль, что среди последствий острой дисфункции митохондрий в данной модели на первый план выходят резкий дефицит энергии и нарушения кальциевого гомеостаза, выраженность которых при воздействии ДПФД была показана в эксперименте (Yabe К.., 1992).

Контрактурное повреждение проходит отчетливую эволюцию, которую удалось проследить на основе последовательного анализа экспериментального материала, полученного через различные промежутки времени (6 - 12 ч, 1,3 и 5 сут). Одно из ведущих мест в этом анализе занимала поляризационная микроскопия, позволявшая судить о состоянии молекулярных структур сократительного аппарата, обнаруживая самые ранние стадии повреждения на светооптическом уровне и облегчая прицельное использование других методик.

Первые, относительно однородные по своему характеру признаки контрактурных изменений обнаруживались на самых ранних этапах (через 6 ч) в виде очагов по ходу отдельных мышечных волокон и были связаны с повышением анизотропии А-дис-ков, их сближением, слиянием в сплошной анизотропный конгломерат - контрактуры I, II и III степени соответственно (Целлариус С.Ф., Целлариус Ю.Г., 1979; Непомнящих Л.М., 1991). Только самая последняя фаза этого процесса поддавалась идентификации в обыч-

ном свете в виде гомогенных, восковидных участков. В это же время в очаге появляется ШИК-позитивная реакция, устойчивая к обработке амилазой и, по-видимому, связанная с пропитыванием белками плазмы вследствие нарушения целостности сарколеммы. На это указывает положительная реакция Кунса с применением меченого противоплазменного у-глобулина в опытах с очаговыми повреждениями миокарда (Целлариус С.Ф., Ерисковская Н.К., 1970), а также другие данные (Kent S.P., 1967). Ранние изменения, связанные с пересокращением миофибрилл, наблюдались и на следующих этапах (12 ч, 1 сут), однако их количество прогрессивно уменьшалось в пользу более поздних стадий — начинающейся и все более выраженной фрагментации, макрофагальной резорбции и, наконец, репаративных и остаточных изменений.

Среди повреждений контрактурного типа в мышечных волокнах отчетливо дифференцировались два крайних вида очаговых изменений. Очаги большого размера простирались на значительное расстояние по продольной оси, охватывая весь поперечник волокна и, как правило, сохраняя его поперечный размер. На ранних стадиях развития для них характерны нечеткие границы, черед ова-ние участков пересокращения с зонами незначительного перерастяжения, поврежденное волокно постепенно переходит в нормальное. Очаги ограниченного размера имели небольшую протяженность по длине волокна, имея вид «узла сокращения». Они выпуклы, иногда оттесняют соседние волокна, деформируя их и создавая впечатление инородного тела с четкими и резкими границами. За пределами поврежденного участка образуются ограниченные зоны резкого перерастяжения саркомеров. В этих же зонах начинается ранняя фрагментация очага в виде четко определяемых полосок свободного пространства, отделяющего его от остального волокна. Нередко в одном волокне появлялось несколько ограниченных очагов, которые разделялись участками нормального строения или узкими тяжами спавшейся сарколеммы.

По нашим наблюдениям, протяженные очаги («ленты») встречаются преимущественно в тонких мышечных волокнах, обнаруживающих при электрон но-микроскопическом исследовании черты мышечных волокон I типа (большое количество крупных митохондрий, широкие с зубчатыми краями Z-диски), а ограниченные («медальоны») — в более толстых мышечных волокнах, ультраструктура которых соответствует быстрым гликолитическим мы-

шечным волокнам lib типа (малое количество мелких митохондрий, более узкие Z-диски). Кроме размера и формы, «ленты» и «медальоны» имели некоторые различия в характере и течении процесса.

В ранние сроки после введения повреждающего агента (через 6 ч) в красных волокнах (очагах-«лентах») наблюдались все стадии контрактур (I - III степени). В отдельных очагах выраженное уплотнение контрактурного материала сочеталось с падением анизотропии (контрактуры IV степени). В случаях ее отсутствия участок повреждения представлял собой полностью изотропный, восковид-ный в обычном свете фрагмент, иногда с начальными признаками глыбчатого распада Таких очагов становилось больше через 12 ч..

Через 1 сут от начала эксперимента при исследовании в поляризованном свете был виден глыбчатый распад миофибрилл. Большинство глыбок, сохраняя в обычном свете гомогенное восковид-ное состояние, характеризовались изотропией, реже — слабо анизотропной продольной или поперечной исчерченностью. Умеренная клеточная инфильтрация была представлена преимущественно макрофагами, а также, в незначительном количестве, полинуклеарами крови. Они располагались в пределах поврежденного участка или были приурочены к границам очага повреждения равномерно со всех сторон, как у полюсов, так и у сарколеммного края.

Через 3 сут от начала эксперимента в некоторых очагах полностью исчезали миофибриллярные структуры. Многие ленты были изотропны, «нафаршированы» клетками инфильтрата, в основном макрофагами —довольно крупными, отросчатыми клетками с большим округлым ядром, богатым хроматином, и широкой зоной цитоплазмы. Определенная часть клеток, иногда более вытянутых, с базо-фильной цитоплазмой и светлым ядром, возможно являлись проли-ферирующими миобластами. Через 5 сут количество макрофагов на месте лент уменьшалось, исчезали четкие границы инфильтратов.

В белых мышечных волокнах (очагах-«лентах») уже в первые часы обнаруживались главным образом контрактуры IV степени. Однако изменения, следующие за пересокращением волокон - образование восковидного субстрата, глыбчатый распад, клеточная инфильтрация и резорбция некротизированного вещества, запаздывали: глыбчатый распад значительного количества медальонов был отчетливо заметен лишь на 3-й сутки от начала эксперимента, причем клеточный инфильтрат часто скапливался у полюсов, в меньшей степени проникая вглубь очага повреждения. Даже через

5 сут среди клеток, инфильтрирующих медальоны, видны отдельные ШИК-положительные глыбки, иногда с остатками слабо анизотропной продольной исчерченности.

«ленты» «медальоны»

6-12 ч все стадии контрактур (1 - IV) в основном контрактуры IV степени

1 сут глыбчатый распад миофибрилл

3 сут исчезновение миофибриллярных структур в некоторых очагах, очаги заполнены клеточными нфильтратами, изотропны глыбчатый распад миофибрилл, клеточные инфильтраты в основном у полюсов очага

5 сут уменьшение количества макрофагов, исчезновение четких границ инфильтратов среди клеток инфильтратов сохраняются отдельные глыбки, иногда слабо анизотропные

Таким образом, одно из главных различий в характере и течении процесса для разных видов очагов контрактурных изменений состоит в том, что развитие контрактуры (I - III степени) в медальоне протекает значительно быстрее, а фаза некробиоза (контрактура IV степени) затягивается, что, вероятно, связано с большей плотностью контрактурных очагов, присущим волокнам II типа.

При ультраструктурном исследовании как в лентах, так и в медальонах наблюдались однотипные изменения миофибриллярного аппарата. Однако ранние стадии контрактурного повреждения можно проследить в основном на территории красных мышечных волокон. Необходимо отметить, что самые первые признаки сокращения - появление полос сокращения на уровне Z-дисков и сближение А-дисков на протяжении нескольких саркомеров — сочетались с выраженным относительным смещением Z-дисков и саркомеров в смежных миофибриллах на уровне поврежденного участка. Это может говорить о уже имеющем место лизисе компонентов цитос-келета, в частности, десмина и плектина, которые обеспечивают поперечное сопряжение Z-дисков. Асинхронное сокращение, связанное с локальным повышением цитоплазматического Са, может усиливать разрушение ослабленных сшивок.

На возможную причину нарушения кальциевого гомеостаза указывало наличие крупных, набухших митохондрий с просветленным матриксом и расширенными, фрагментированными крис-тами в поврежденных участках красных волокон. По ходу волокна

рядом с пересокращенными участками определялись районы перерастяжения, в которых значительно увеличена высота 1-дисков, цистерны саркоплазматического ретикулума расширены, часть митохондрий имели просветленный матрикс, однако многие крупные межмиофибриллярные митохондрии, сохраняя нормальную структуру, образовывали удлиненные продольные профили и митохонд-риальные колонны, распространяющиеся по всей длине саркомера, указывая на сохраненную связь между этажами митохондриально-го ретикулума.

Поскольку в белых мышечных волокнах контрактура быстро достигает максимума, в поле зрения чаще всего оказывался очаг повреждения, представлявший собой компактную массу миофиб-рилл с резко сокращенными саркомерами, в которой отмечались участки, лишенные поперечных структур. За пределами плотного участка лежали электронно-прозрачные зоны продольно ориентированных полностью разобщенньгх миофиламентов, в которых были хорошо видны элементы растянутого саркоплазматического рети-кулума и мелкие митохондрии с резким уплотнением отдельных крист, очаговым просветлением матрикса, признаками разрушения наружной мембраны, а также митохондрии обычного размера с просветленным матриксом, фрагментированными и редуцированными кристами. На уровне зоны резкого перерастяжения часто происходит отслаивание сарколеммы, которая в этих случаях приобретает волнообразные очертания. В заключительной стадии контрактур-ного повреждения очаги представляли собой массу дезагрегированных, беспорядочно расположенных миофиламентов.

Изменения митохондрий, подобные вышеописанным, но менее выраженные, наблюдались и в некоторых относительно интактных мышечных волокнах или волокнах с минимальными изменениями и относились, по-видимому, к самым ранним структурным признакам.

Несмотря на значительное преобладание контрактурных повреждений, определенное место в гетерогенном спектре структурных реакций принадлежало очагам миоцитолизиса. На ультраструктурном уровне им соответствовали небольшие (от 2-3 саркомеров) зоны, в которых исчезали /-диски, расположение протофибрилл теряло поперечную упорядоченность, обнаруживалась дезагрегация и дезориентация толстых и тонких миофиламентов, благодаря чему отдельные саркомеры не определялись. Отличительная особенность этих очагов - бедность митохондриями. Обращало на себя внима-

ние отсутствие в них ШИК-положительного субстрата и клеточной реакции, что косвенно указывало на целостность сарколеммы.

Таким образом, наиболее типичными изменениями в скелетных мышцах при остром нарушении митохондриального метаболизма, вызванном диметилпарафенилендиамином, были повреждения контрактурного типа. Тот факт, что изменения возникают преимущественно в высоко энергозависимых тканях (скелетных мышцах и миокарде) и не носят тотального характера, говорит о «сублетальности» воздействия, в фенотипической реализации которого большую роль играют типоспецифические особенности и текущее состояние волокна-мишени: вовлеченность в сократительную активность, а также структурно-метаболическая неоднородность его сегментов и энергетических комплексов, резко увеличивающаяся в состоянии энергетического дефицита. Было показано, что в физиологических условиях потенциалы митохондриальных мембран характеризуются умеренной гетерогенностью, а при дефиците субстратов их внутриклеточная вариабельность может быть чрезвычайно выраженной (Romashko D.N. et al, 1998), отражаясь в появлении метаболических осцилляции, волн и «пятен».

Нарушение электронного транспорта, вызванное диметилпара-фенилендиамином, может способствовать образованию и закреплению таких «горячих» точек, в которых снижение потенциала внутренней мембраны сенситизирует РТ-пору к ионам Са. Можно предположить следующую последовательность изменений: при наложении физиологического импульса (кальциевой осцилляции), стойкое и продолжительное открытие РТ-поры, сопровождаясь набуханием матрикса и разрывом внешней митохондриальной мембраны, приводит к выходу проапоптотических факторов и активации каспаз, одними из первых мишеней которых являются белки цитоскелета (смещения и деформации Z-дисков на самых ранних стадиях повреждения). Однако при остром воздействии адаптивные перестройки и «превентивная» фрагментация митохондриального ретикулу-ма произойти не успевают, и развитие МТР в целом «отсеке» вызывает локальный энергетический коллапс и стойкое повышение ци-топлазматического Са, стимулирующее его захват митохондриями соседнего кластера. Это способствует распространению митохондриаль-ной кальциевой волны, сопровождаемой, волной деполяризации внутренних мембран митохондрий и сокращения миофибрилл (Duchen M.R., 1999). Была показана связь подобных волн с апоптотическими

изменениями ядер мышечных трубочек (РаеИег Р., Щпскжку в., 2001).

Одновременно с процессами распространения повреждения включаются и механизмы его ограничения. Развивающаяся контрактура приводит к образованию узла пересокращения, ограниченного зонами резкого перерастяжения. В этих зонах усиливается лизис белков саркомерного цитоскелета, связанный с активацией Са-зависимых протеаз (кальпаина), что способствует разрыву связей между саркомерами, элементами митохондриального ретикулума, и, тем самым, — механическому и «метаболическому» отрыву необратимо поврежденного участка от остального волокна. Разрушение в этих же участках субмембранного цитоскелета приводит к ослаблению механической прочности сарколеммы, ее отслойке (наблюдаемой при электронно-микроскопическом исследовании) и разрывам под действием сил натяжения. Это, кроме дополнительного входа Са и усиления контрактуры, сопровождается высвобождением из мышечного волокна факторов, усиливающих миграцию макрофагов к поврежденному участку и, тем самым, ускоряющих его фрагментацию и резорбцию. В связи с этим интересно отметить премуще-ственную локализацию клеток инфильтрата у полюсов медальона.

Подобные механизмы аварийного «механического» гомеостаза могут играть большую роль на территории белых мышечных волокон, которые характеризуются быстрым и сильным сокращением и слабым развитием митохондриального ретикулума. В красных волокнах, с их разветвленными митохондриальными структурами и медленным, градуальным развитием сократительной реакции, распространение волны повреждения по митохондриальной сети опережает замедленную и менее выраженную реакцию ограничения. Это определяет особенности контрактурных очагов: большую протяженность, нечеткие границы, чередование участков пересокращения с зонами незначительного перерастяжения.

Однако более развитый митохондриальный компартмент, способствуя большему распространению нарушений митохондриаль-ной функции, обладает и большими ее резервами. Возможно именно этим объясняется значительная неоднородность очагов повреждения по степени выраженности на протяжении красного мышечного волокна, а также то, что именно на территории этих волокон чаще встречались нехарактерные в целом для данной модели очаги внутриклеточного миоцитолизиса, подобные тем, которые были описаны у преждевременно стареющих крыс ОХУ8.

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПРИ АЛИМЕНТАРНО-ТОКСИЧЕСКОЙ ПАРОКСИЗМАЛЬНОЙ МИОГЛОБИНУРИИ

Ведущим клиническим синдромом являлось поражение соматической мускулатуры, сопровождавшееся приступами сильных болей в мышцах, мышечной слабостью, скованностью, миоглобине-мией и миоглобинурией.

Исследование биопсийного и секционного материала. При све-тооптическом исследовании обращали на себя внимание пестрота и многообразие общей картины. Эта гетерогенность наблюдалась как в одном срезе, так и при сравнении разных срезов одной мышцы, групп соматических мышц и различных наблюдений. По данным комплексного структурного анализа, ведущее место в морфогенезе алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии принадлежит очаговым процессам в соматической мускулатуре. Признаки очаговой дегенерации мышечных волокон имелись во всех без исключения наблюдениях, варьируя от небольших изменений поляризационно-оптических и тинкториальных свойств единичных волокон (в некоторых биоптатах) до развернутой картины с преобладанием в спектре очаговых реакций самых тяжелых форм и поражением большинства мышечных волокон в поле зрения (аутопсийный материал).

Анализ показал, что во всем разнообразии очаговых форм отчетливо выделяются две большие группы, первая из которых связана с явлениями пересокращения и уплотнения контрактильного материала (контрактуры 1-^ степени) с последующим глыбчатым распадом и макрофагальной резорбцией, во второй на первый план выходила очаговая дезагрегация фибриллярных структур (миоци-толизис). Кроме того, на ультраструктурном уровне был выделен особый вариант развития, в котором распространенные литические и контрактурные изменения сочетались на фоне выраженного внутриклеточного отека.

Зоны пересокращения, находящиеся на начальных этапах своего развития, как правило, не распространялись на большие расстояния. Характерной чертой являлось сочетание на протяжении одного волокна участков изотонического и изометрического сокращения с зонами перерастяжения, в которых отмечалось снижение анизотропии. В аутопсийном материале, где очаги контрактурных по-

вреждений обнаруживались с большим постоянством, они чаще всего были представлены очагами типа «лент» и находились на развернутых и поздних стадиях развития, отличаясь заметной гетерогенностью структуры на всем протяжении. Гомогенные, восковидные, полностью изотропные участки чередовались с фрагментами, сохраняющими продольную, а иногда и остатки поперечной исчерченнос-ти. Постконтрактурный клеточный инфильтрат, состоящий преимущественно из макрофагов с примесью лейкоцитов и тучных клеток, иногда полностью заполнял территорию лентовидного очага.

Очаги, имевшие вид классических «медальонов» в клиническом материале встречались исключительно редко, однако определенную часть общего спектра контрактурных повреждений составляли промежуточные формы (типа коротких лент), по-видимому, отражающие существование мышечных волокон с «промежуточными» структурно-метаболическими характеристиками.

Особенностью структурных проявлений при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии у людей было существенное место, которое в исследуемом материале занимали литические изменения, с трудом выявлявшиеся на светооптическом уровне. При анализе полутонких срезов в перерастянутых (чаще всего) сегментах иногда удавалось рассмотреть некоторые детали: начинающееся «провисание» миофибрилл, их мозаичное «растворение», поперечные разрывы отдельных саркомеров — возможно, соответствующие самым начальным стадиям образования очага внутриклеточного миоцитолизиса

На более поздних этапах своего развития такие очаги были представлены «пустыми» изотропными участками небольшого размера и неправильной формы, лишенными поперечной исчерченно-сти, как бы выломанными из мышечного волокна. Иногда в изотропном очаге сохранялись слабо анизотропные продольные структуры, но исчезала поперечная исчерченность. В пределах поврежденного участка миофибриллы теряли взаимопараллельное расположение и прямолинейное направление, казались провисшими ШИК-реакция в очагах миоцитолизиса была отрицательна, клеточная реакция отсутствовала.

Ультраструктурные изменения на ранних стадиях развития контрактур соответствовали картине, наблюдавшейся при индуцированных диметилпарафенилендиамином повреждениях. В отдельных случаях, как крайнее проявление контрактурных изменений, ветре-

чал ись мышечные волокна, в которых наблюдались несколько групп сокращения, представленных электронно-плотными скоплениями мио-фибриллярного материала, между которыми в электронно-прозрачной саркоплазме располагались «слипшиеся» фибриллярные структуры.

Ранними ультраструктурными признаками очагового миоцито-лизиса были лизис /-дисков, диспозиция и дезагрегация тонких, а затем и толстых филаментов в зоне нескольких саркомеров. В таких участках часто видны Т-трубочки и анастомозирующие тубулы сар-коплазматической сети, на периферии очага часто отмечались скопления свободных рибосом и полисом. Умеренные изменения митохондрий (деструкция крист, просветление матрикса) отмечались даже в относительно интактных мышечных волокнах, а также в волокнах с ранними контрактурными и литическими изменениями.

Отличительной чертой ультраструктурной картины при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинуриибыл особый вариант изменений мышечных волокон, в котором на первый план выходил выраженный диффузный отек и лизис структурных белков саркоплазмы, которая становилась электронно-прозрачной, практически не содержала гранул гликогена. В результате отека имели место дискомпозиция органелл, особенно в околоядерной зоне, увеличение расстояний между миофибриллярными пучками и миофиламентами. Истончение и лизис миофибрилл сочетались с их контрактурными изменениями, сопровождались расщеплением миофибриллярных пучков. В расширенных межпучковых промежутках между /-дисками угадывались обрывки лизированных структур цитоскелета. В участках выраженного лизиса миофибрилл отмечен также лизис терминальных цистерн и тубул саркоплазмати-ческой сети. Митохондрии резко изменены и полиморфны - крупные, неправильной формы, или мелкие округлые, с диффузным просветлением или очаговой деградацией матрикса, деструкцией и фрагментацией крист, которые имели среднюю или очень высокую плотность, иногда образуя плотные пластинчатые структуры. Отмечались частые признаки нарушения целостности митохонд-риальных мембран. В зонах выраженной деструкции митохондрий встречались вторичные лизосомы крупных размеров с осмиофиль-ными включениями.

На светооптическом уровне подобным изменениям, возможно, сооветствовали участки разрыхленной структуры мышечного волокна с потерей отчетливого рисунка поперечной исчерченности,

которые нередко обнаруживались на территории мышечных волокон, в которых отмечалось сочетание разных стадий и типов очаговых повреждений.

Можно предположить, что развитие таких изменений связано с замедленной динамикой вторичных (постапоптотических) некротических изменений на территории красного мышечного волокна: в условиях дефицита энергии вторичная контрактура разобщенных и частично лизированных миофибрилл не образует плотного субстрата, способствующего ограничению зоны повреждения, результатом чего является распространение дисфункции и деструкции митохондрий, активация кальпаин-катепсинового протеолиза, нарушение целостности сарколеммы, выраженные нарушения равновесия ионов с внутриклеточным отеком, диспозицией и лизисом структур саркоплазмы. Возможно, однако, что подобные события, опережающие образование первичного контрактурного очага, могут иметь место и на ранних фазах контрактурного повреждения, приводя к первичному сегментарному или тотальному «онкозу» мышечной клетки (Majno G., Joris., 1995; Van Cruchten S., Van Den Broeck W., 2002).

Деструктивные изменения мышечной ткани сопровождались признаками регенерации. На активацию клеток-сателлитов указывало увеличение во многих сегментах мышечных волокон количества ядер — часто более крупных и образующих цепочки, а также формирование местами на поврежденных концах мышечных волокон так называемых «мышечных почек» — «натеков» базофильной саркоплазмы, лишенной миофибрилл, содержащих скопления округлых ядер с крупными ядрышками.

Сосудистые нарушения были редки и связаны, в основном, со стазом капилляров и диапедезом эритроцитов в районах деструкции. Ультраструктура капилляров эндомизия в целом не изменена. Их просветы и интерстициальные пространства часто заполнены хлопьевидным веществом высокой плотности.

Таким образом, основными отличительными особенностями структурных реакций при алиментарно-токсической пароксизмаль-ной миоглобинурии в биопсийном и секционном материале были преобладание литических повреждений и более высокая степень гетерогенности (сочетание разных типов и стадий очаговых повреждений не только в соседних мышечных волокнах, но и на протяжении одного волокна), отражающая фундаментальное свойство соматической мышечной ткани - внутриклеточную и меж-

клеточную структурно-метаболическую неоднородность, многократно усиленную патологическим процессом. Такая неоднородность, по-видимому, приводила к усилению гетерогенности механических свойств саркомеров мышечного волокна (Gordon et al., 1966; Flitney, Hirst, 1978), внутриволоконной и межволоконной дискоординации и дезинтеграции процессов сокращения и расслабления, что может объяснять часто наблюдавшиеся продольные и поперечные деформации мышечных волокон — извилистость, скрученность, изгибы.

Исследование алиментарно-токсической миоглобинурии в эксперименте. Алиментарно-токсическая миоглобинурия поражает не только людей, но и некоторых животных. Кошки страдают чаще всего и наиболее постоянно и, в силу этого, являются своеобразным биологическим индикатором наступающей вспышки данного заболевания.

Необходимо отметить, что морфологическая (как и клиническая) картина алиментарно-токсической миоглобинурии у кошек несколько отличалась от картины данного заболевания у людей. В первую очередь, это находило свое отражение в перераспределении спектра типовых очаговых реакций в сторону преобладания повреждений контрактурного типа. Среди последних преобладали медальоны, встречались «промежуточные» очаги веретеновидной формы и классические ленты. Медальоны часто образовывали цепочки по длине волокна.

Окружающие выпуклые медальоны волокна часто были значительно деформированы, образовывали своеобразные складки, которые напоминали «лучи», расходящиеся от некротизированного фрагмента. В таких местах отмечались контрактурные изменения, признаки деструкции соседних волокон. На полутонких срезах в них видна изломанность Z-полос.

Значительно шире представлены процессы регенерации. Их проявления можно наблюдать, как правило, в непосредственной близости от очагов повреждения в виде мышечных почек и мышечных трубочек, заполненных плотно упакованными крупными ядрами. Регенераторные реакции наблюдались также на протяжении некоторых волокон в виде базофильных участков, содержащих в центре и по периферии цепочки крупных продолговатых ядер с оптически светлой кариоплазмой, мелкодисперсным хроматином и крупными ядрышками. Местами группы мышечных трубочек находились под базальной мембраной фрагментов «выживших» волокон.

Такая картина указывает на то, что повреждение было достаточно сильным, чтобы вызвать пролиферацию и слияние миобластов, однако при этом сохранились предсуществующие волокна.

Одной из целей проведенных экспериментальных исследований стал анализ морфологических особенностей патологического процесса в зависимости от выраженности клинической картины. У контрольных животных волокна соматических мышц равномерно окрашивались эозином. В поляризованном свете в мышечных волокнах наблюдалась равномерная поперечная исчерчен ность.

В группах кошек со слабо выраженными и выраженными клиническими признаками и у животных в терминальном состоянии одной из главных черт морфологической картины была гетерогенность патологических реакций, преимущественно за счет контрактур и глыбчатого распада мышечных волокон. Увеличение доли поздних контрактурных изменений и глыбчатого распада, большая распространенность повреждений мышечных волокон и мононук-леарной инфильтрации при увеличении тяжести заболевания отражали определенный клинико-морфологический параллелизм.

Таким образом, хотя этиологические факторы и механизмы при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии остаются неизвестными, их миотропность, а также существенные структурные корреляции с экспериментальным патологическим процессом позволяют предположить общность ключевых звеньев патогенеза.

Сравнение клинического и экспериментального материала алиментарно-токсической миоглобинурии показывает, что спектр структурных реакций у кошек больше напоминал патоморфологичес-кую картину индуцированных диметилпарафенилендиамином повреждений скелетных мышц. Тот факт, что одно и то же токсическое воздействие может вызывать у животных различных видов разную (в спектральном отношении) картину, а разные вещества - близкую, подтверждает предположение, что при сходной выраженности и динамике воздействия, итоговый результат определяется не столько причиной токсического стресса, сколько видовыми и индивидуальными особенностями, определяющими структурный и физиологический контекст, в котором происходит взаимодействие гомеопатических механизмов.

Таким образом, результаты изучения экспериментальных и клинических моделей метаболических повреждений скелетных мышц показывают, что, несмотря на сохраняющуюся тенденцию рассмат-

ривать повреждение клетки в контексте «выбора» одной из двух форм клеточной смерти, наиболее типичным ответом мышечной ткани и отдельного мышечного волокна на стрессовое воздействие является сочетание адаптивных процессов и деструктивных реакций, значительную часть которых невозможно однозначно связать с апоптотическими или некротическими механизмами. Многие из проявлений деструкции имеют приспособительный («ограничительный») характер с точки зрения более высокого уровня организации.

Можно предположить, что любое воздействие, нарушающее структурно-метаболическое равновесие клетки, приводит к запуску общего каскада деструктивно-компенсаторных реакций (имеющего множество точек входа и «разветвлений»), который асинхронно протекает в гетерогенном клеточном и внутриклеточном поле, оставляя сложный фенотипический след. Его параметры определяются не столько специфичностью повреждающего стимула (точкой входа), сколько его выраженностью и динамикой, а также адаптивным потенциалом мышечного волокна, связанным со структурно-метаболическим типом, функциональным состоянием и факторами микроокружения.

Поскольку митохондрии, по-видимому, являются универсальной контрольной точкой, определяющей судьбу клетки и «объединяющей» большинство стрессовых сигналов с аппаратом клеточной деструкции (Mills E.M. et al., 2002), при постепенном нарастании стрессовой ситуации первые адаптивные реакции разворачиваются на уровне энергетических комплексов мышечного волокна (увеличение объема митохондриального компартмента). Наиболее отчетливо такие реакции прослеживаются в оксидативных мышечных волокнах, более чувствительных к умеренным нарушениям митохон-дриальной функции, однако обладающих и большими ее резервами.

Недостаточность компенсации митохондриальных дефектов приводит к предапоптотическои ситуации, в которой происходит активация факторов, стимулирующих расщепление митохондрий (Labrousse et al., 1999; Karbowski M. et al., 2002). Фрагментация митохондриального ретикулума имеет в некоторой степени «превентивный» характер, способствуя устранению необратимо поврежденных митохондрий и локализации возможных распространенных деструктивных изменений, и, таким образом, может рассматриваться как первый («метаболический») этап клеточной стратегии, направленной на ограничение повреждения. Нарастание декомпенса-

ции митохондриальной функции сопровождается распространенной деструкцией митохондрий и приводит к более частому возникновению очагов миоцитолизиса, обладающих некоторыми характерными для апоптоза чертами (сохранение целостности клеточных мембран, отсутствие признаков воспалительной инфильтрации).

Динамика острого токсического стресса не оставляет времени для развития адаптивных процессов на уровне митохондриального компартмента, которые могли бы сдержать активацию эффектор-ных механизмов. В ситуации, когда возникает угроза тотального разрушения сложной цитоархитектуры, восстановление которой de novo сопряжено с большими затратами, критическое значение в стратегии ограничения приобретает «механическая» фрагментация мышечного волокна, связанная с деструктивными (и в то же время аварийно-приспособительными) реакциями сократительного и опорного аппарата, отчетливее выраженными в белых мышечных волокнах.

Поддержание функциональной пластичности и целостности мышечного волокна в изменяющейся метаболическиой ситуации, по-видимому, основано на динамическом равновесии двух основных конструктивных принципов - единства и компартментализации структур и функций. В благоприятных физиологических условиях «отдельные» митохондрии, системы саркоплазматического ретику-лума, цитоскелетные модули (Ingber D.E., 2003) демонстрируют высокую степень взаимосвязи, облегчающую обмен сигналами и механо-химическое взаимодействие гомеостатических систем на внутриклеточном и межклеточном уровнях. Однако в стрессовой ситуации такая степень интеграции становится невыгодной (поломка отдельных компонентов может иметь необратимые последствия для всей системы) и равновесие смещается в сторону ком-партментализации, облегчающей изоляцию, репарацию или удаление дефектных участков.

На первом этапе большую роль в ограничении повреждения играет усиление компартментализации «энергетических» структур. При более выраженных сдвигах, сопровождающихся нарушением целостности сарколеммы, относительно большее значение приобретает «механическая» фрагментация, а также внеклеточные факторы, обеспечивающие удаление фрагмента и репарацию образовавшегося дефекта (ограниченные контрактуры, удаление отдельных модулей-сегментов макрофагами, активация клеток-сателлитов и регенерация сохранившихся частей мышечного волокна «по про-

тяжению»). Недостаточность этих реакций (например, в красных мышечных волокнах) или экстремальный характер воздействия может приводить к распространению повреждения на значительную часть или всю территорию волокна (протяженные контрактуры), а при опережающих сдвигах водно-электролитного гомеостаза и активации литических процессов к развитию «онкоза» мышечного волокна. Такие изменения сопровождаются регенерацией мышечных волокон de novo. Полнота восстановления тканевой архитектуры в этом случае определяется соотношением между количеством поврежденных волокон, темпом регенерации и скоростью синтеза коллагеновых фибрилл.

ВЫВОДЫ

1. В результате экспериментального и патологоанатомического исследования соматических мышц на примере моделей острого и хронического нарушения клеточного метаболизма выявлен комплекс стереотипных структурных изменений, в основе которых лежат адаптивные и деструктивные реакции митохондриального ком-партмента (при хроническом характере стрессового воздействия), универсальные изменения миофибрилл (один из основных индикаторов состояния мышечного волокна) и интегральные изменения в мышечной ткани (отражение процессов компенсации и де-компенсации нарушенных функций).

2. В условиях постепенно нарастающего хронического нарушения клеточного гомеостаза при метаболической миопатии у крыс OXYS в светооптической картине доминируют такие общепатологические процессы, как гипертрофия, атрофия, дистрофия, отражающие сочетание альтеративных и компенсаторно-приспособительных процессов на всех уровнях структурной организации. Это отражается на морфо-стереологических параметрах (общая тенденция к гипертрофии мышечных волокон в сочетании со значительным повышением вариабельности их размеров).

В ультраструктурной картине адаптивная реакция митохонд-риального компартмента (гиперплазия митохондрий с увеличением площади рабочей поверхности), сопровождающаяся ремодели-рованием и минимальной деструкцией фибриллярных структур, с течением времени сменяется его структурной декомпенсацией и распространенными деструктивными изменениями митохондрий.

Это повышает восприимчивость мышечных волокон к стрессовым стимулам, приводит к более частому возникновению очагов мио-цитолизиса и контрактурных изменений, на тканевом уровне — к уменьшению компенсаторной гипертрофии и усилению атрофии мышечных волокон в диафрагме.

3. Острое нарушение клеточного метаболизма, вызванное внутримышечным введением бупивакаина крысам ОХУВ и Вистар, сопровождается быстрыми и массивными деструктивными изменениями преимущественно белых мышечных волокон (отек мышечных волокон и интерстиция, распространенные контрактурные и литические изменения), за которыми следует активная клеточная реакция, макрофагальная резорбция и эффективная регенерация, что указывает на сохранение при наследственно обусловленной дисфункции митохондрий у крыс ОХУВ пролиферативного и ре-популятивного потенциала миогенных клеток-предшественников.

4.Однократное превентивное применение антиоксиданта (Тем-пола) при экстремальном местном токсическом воздействии вызвало уменьшение отечности мышечных волокон и интерстиция в ранний срок эксперимента, но оказалось недостаточным для уменьшения выраженности деструкции.

5. Контрактурные повреждения и более редкие очаги миоцито-лизиса, возникающие в соматических мышцах белых крыс после введения диметилпарафенилендиамина, соответствуют типовым структурным реакциям, составляющим морфологическую основу острой патологии поперечно-полосатой мускулатуры человека и животных.

По данным поляризационно-оптического и ультраструктурного анализа динамика контрактурного повреждения представлена как смена последовательных фаз развития пересокращения (1-111 степени контрактуры) фазой некробиоза (IV степень) с последующей макрофагальной резорбцией. Контрактурные повреждения сопровождаются нарушением целостности сарколеммы, на что указывает плазматическое пропитывание (устойчивая к обработке амилазой ШИК-реакция в очаге контрактуры), а также электронно-микроскопические признаки. Исчезновение 7-полосок, дезагрегация, дезориентация и фрагментация миофибрилл образуют последовательность изменений при внутриклеточном миоцитолизисе. Признаков нарушения целостности клеточной мембраны и клеточной реакции в очаге повреждения, как правило, не наблюдается.

6. При изучении алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии на материале биопсий и аутопсий обнаружено, что из двух универсальных форм деструктивных реакций скелетных мышц в острой патологии соматической мускулатуры, выходящих в неоднородной морфологической картине на первый план, значительная роль принадлежит литическим процессам. Последние представлены небольшими, а нередко и весьма протяженными очагами, в которых дезагрегация и лизис миофибрилл являются доминирующими проявлениями острого нарушения клеточного метаболизма. Среди более редких в целом контрактурных повреждений преобладают очаги типа «лент», характерные для волокон I типа. В ультраструктурной картине выделен особый вариант некробиоти-ческой реакции, в котором внутриклеточный отек, диспозиция и лизис структур саркоплазмы сочетаются с умеренными контрак-турными изменениями. Деструктивные изменения сопровождаются процессами регенерации.

7. Анализ морфологических особенностей патологического процесса при экспериментальной алиментарно-токсической пароксиз-мальной миоглобинурии в зависимости от выраженности клинической картины выявил определенный клинико-морфологический параллелизм, заключающийся в увеличении доли более тяжелых форм и большей распространенности повреждений мышечных волокон при увеличении тяжести заболевания.

Перераспределение спектра типовых очаговых реакций в сторону преобладания повреждений контрактурного типа и некоторые особенности в деталях морфологических вариантов универсальных реакций при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобину-рии у кошек отражают видовые различия в течении патологического процесса, не затрагивающие основные механизмы его развития.

8. Межклеточная и внутриклеточная структурно-функциональная гетерогенность скелетных мышц в значительной степени определяет картину патологического процесса: асинхронность развития патологических изменений, их стадийную, типовую и внутри-типовую неоднородность, наличие множества промежуточных форм. Как при острых, так и при хронических воздействиях наиболее уязвимыми оказываются мышечные волокна с высокой функциональной активностью, о чем свидетельствуют более выраженные изменения в постоянно работающем органе (диафрагме), обнаруживаемые во всех изученных моделях.

9. Сопоставление результатов экспериментальных и патологоа-натомических исследований свидетельствует о наличии общей стратегии структурного реагирования соматической мускулатуры, направленной в первую очередь на ограничение повреждения и заключающейся в том, что любое стрессовое воздействие, нарушающее метаболическое равновесие клетки, приводит к запуску общего каскада деструктивно-компенсаторных реакций, который протекает асинхронно на гетерогенном тканевом, клеточном и внутриклеточном поле. Интегральная морфологическая картина определяется сочетанием фенотипических отпечатков его ранних и поздних этапов, а также многочисленных «ответвлений». Спектр структурных реакций и преобладание в нем отдельных форм определяются не столько специфичностью повреждающего стимула («точкой входа»), сколько его выраженностью и динамикой, а также адаптивным потенциалом мышечного волокна, связанным с его структурно-метаболическим типом, функциональным состоянием и факторами микроокружения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Комплексный анализ клинического (биопсийного и аутоп-сийного) материала скелетных мышц должен проводиться на всех уровнях структурной организации и обязательно включать метод поляризационной микроскопии, позволяющий судить о состоянии молекулярных структур сократительного аппарата и обнаруживать самые ранние стадии повреждения на светооптическом уровне с последующим прицельным использованием других методик.

2. При интерпретации пестрой и неоднородной морфологической картины важно учитывать морфогенетический аспект, определяя преобладающие типы и стадии структурных перестроек скелетных мышц (степень контрактур, ограниченные и распространенные литические изменения, выраженность клеточной реакции, признаки регенерации и остаточные изменения). Это дает возможность судить о выраженности и динамических характеристиках повреждающего фактора и имеет существенное прогностическое значение.

3. При анализе хронических патологических процессов в соматической мышечной ткани следует оценивать тканевые и клеточные адаптивные реакции, обращая особое внимание на состояние митохондриального компартмента (гиперплазия, фрагментация, де-

структивные изменения). Ультраструктурная оценка состояния митохондрий в очагах повреждения и в видимо интактных мышечных волокнах может дать определенное представление о механизмах развития изменений.

4. При оценке подходов к коррекции патологии скелетных мышц не следует упускать из вида возможность применения анти-оксидантов, а при хронической митохондриальной патологии — подбор определенных режимов двигательной активности, способствующих активации сохраненного миогенного резерва.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бакарев М.А. Морфологическое исследование скелетной мускулатуры при алиментарно-токсической пароксизмальной миог-лобинурии // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине: Материалы научно-практ. конф. - Новосибирск, 1995. - С 130.

2. Бакарев М А Патоморфологическое исследование соматических мышц при общепатологических процессах / / Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 1996. — С. 11.

3. Непомнящих Л.М., Бакарев М.А. Морфологическое исследование соматических мышц при алиментарно-токсической пароксиз-мальной миоглобинурии // Бюл. экспер. биол. -1996. - Т. 121, № 2. -С. 228-233.

4. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М. Типовые патологические процессы в соматической мускулатуре // Первый Российский конгресс по патофизиологии с международным участием. Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы (экспериментальные и клинические аспекты): Тезисы докл. - М., 1996. - С. 32.

5. Nepomnyashchikh L.M., Bakarev M.A. Morphological study of somatic muscles in alimentary-toxic paroxysmal myoglobinuria // Bull. Exp.Biol.Med.-Vol. 121, № 2.-N.Y.: Plenum Publ. Corp., 1996.-P. 211-216.

6. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М. Типовые патологические реакции в соматической мускулатуре // Труды 1-го съезда Российского общества патологоанатомов. — М., 1996. — С. 19.

7. Непомнящих Г.И., Непомнящих Л.М., Айдагулова С.В., Кри-ницына Ю.М., Александрова Н.М., Ермаков М.Н., Бакарев МА, Сергеева И. Г., Щербина Е.Э. Патоморфология радиационно-инду-цированных поражений кожи. - Препринт. — Новосибирск: НИИ РППМ СО РАМН, 1997. -23с.

8. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М. Патоморфологическое исследование соматической мускулатуры при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии// Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. - Новосибирск, 1998. - С. 395.

9. НепомнящихЛ.М., Бакарев МА, Циммерман В.Г.. Патомор-фологическое исследование соматических мышц при генетически детерминированной метаболической миопатии у крыс линии W/SSM // Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. — Новосибирск, 1998. — С. 42.

10. Бакарев МА, Непомнящих Л.М. Патоморфологическое исследование острых метаболических повреждений волокон соматической мускулатуры, вызванных диметилпарафенилендиамином // Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 1998. - С. 46.

11. Непомнящих Л.М., Бакарев МА, Циммерман В.Г. Общепатологические процессы в соматических мышцах при генетически детерминированной метаболической миопатии у крыс линии W/SSM // Бюл. экспер. биол- 1998. - Т. 126, № 8. - С. 228 - 233.

12. Бакарев МА, НепомнящихЛ.М., Циммерман В.Г. Структурные особенности острых очаговых метаболических повреждений волокон соматической мускулатуры, вызванных диметилпара-фенилендиамином // Бюл. экспер. биол. - 1999. - Т. 127, № 6. — С. 700 - 705.

13. Бакарев МА, Непомнящих Л.М., Циммерман В.Г Морфология метаболических повреждений соматической мускулатуры. — Новосибирск, 1999. — 31 с.

14. Nepomnyashchikh L.M., Bakarev M.A., Tsimmerman V.G. General pathological processes in somatic muscles in W/SSM rats with genetically determined metabolic myopathy // Bull. Exper. Biol. Med. -N.Y.: Plenum Publ. Corp., 1999. - Vol. 126, № 8. - P. 846 - 851.

15. Bakarev M.A., Nepomnyashchikh L.M., Tsimmerman V.G. Structural features of acute metabolic injuries in somatic muscle fibers caused by dimethylparaphenylenediamine // Bull. Exper. Biol. Med. — N.Y.: Plenum Publ. Corp., 1999. - Vol. 127, № 6. - P. 640 - 644.

16. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М.. Экспериментальная модель метаболических повреждений соматических мышц в изучении алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии // Материалы VI Всероссийской конференции по патологии клетки. -Москва, 2000.-С. 90-91.

17. Чапаева Н.Н., Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Бакарев М.А Антифосфолипидный синдром: ультраструктура эндотелио-цитов микрососудов в кожно-мышечных биоптатах при системной красной волчанке // Бюл. экспер. биол. - 2001. - Т. 131, № 2. - С. 212-217.

18. Чапаева Н.Н., Непомнящих Г.И., Айдагулова СВ., Бакарев МА Ультраструктурные и биосинтетические особенности эндотелиоци-тов гломерул и перигломерулярных артериол при системной красной волчанке // Бюл. экспер. биол. - 2001. - Т. 132, № 8. - С. 209 - 215.

19. Chapaeva N.N., Nepomnyashchikh G.I., Aidagulova S.V., Bakarev M.A. Antiphospholipid Syndrome: Ultrastructure of microvascular endotheliocytes in musculocutaneous bioptates during systemic lupus erythematosus// Bull. Exper. Biol. Med. - 2001. - Vol. 131, № 2. - P. 176 - 180.

20. Chapaeva N.N., Nepomnyashchikh G.I., Aidagulova S.V., Bakarev M.A. Ultrastructural and biosynthetic characteristics of glomerular endotheliocytes and periglomerular arterioles during systemic lupus erythematosus// Bull. Exper. Biol. Med. - 2001. - Vol. 132, № 2. - P. 791 -796.

21. Бакарев М.А., Непомнящих Л. М. Типовые структурные реакции скелетных мышц: Метаболические повреждения и регенерация // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: IV конф. молодых ученых СО РАМН. - Новосибирск, 2002.-С. 56.

22. Бакарев М.А., Непомнящих Л. М. Клинико-эксперименталь-ное исследование токсико-метаболических повреждений соматических мышц в Западной Сибири // Сибирский научный вестник. -2003.-Вып. VI.-С. 12-17.

23. Бакарев М.А., Непомнящих Л. М. Ультраструктурные признаки митохондриальной миопатии у преждевременно стареющих крыс OXYS //Дизрегуляционная патология органов и систем: III Российский конгресс по патофизиологии. - М., 2004. — С. 101.

24. Bakarev M.A., Nepomnyashchikh L.M. Mitochondrial myopathy in senescence-accelerated OXYS rats // International

congress «Advanced methods of diagnosis, prophylactics and treatment». - Hannover, 2004. - P. 82.

25. Непомнящих Г.И., Айдагулова СВ., Непомнящих Д.Л., Ба-карев М.А Патоморфогенез хронических гепатитов С и В. Материалы 6-го Международного Славяно- Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2004» // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2004. - № 2.-3. - С. М101.

26. Бакарев М.А, Непомнящих Л.М. Морфологические признаки митохондриальной миопатии у преждевременно стареющих крыс OXYS// Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально-значимых заболеваниях. - Новосибирск, 2004. - С. 72 - 73.

27. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М. Дисфункция митохондрий и патология скелетных мышц // Сибирский научный вестник. - 2004. - Вып. VII. - С. 14 -19.

28. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М. Структурные проявления нарушений митохондриальной функции в скелетных мышцах у преждевременно стареющих крыс OXYS // Бюл. экспер. биол. — 2004. - Т. 138, № 12. - С. 674 - 679.

29. Bakarev M.A., Nepomnyashchikh LM. Structural manifestations of mitochondrial dysfunction in senescence-accelerated OXYS rats // BuU. Exper. Bid. Med. - 2005. - Vol. 138, № 6. - P. 632 - 636.

Соискатель

Бакарев М.А.

Подписано в печать 12.04.2005. Формат 60x84/16. Гарнитура Таймс. Бумага Zoom. Усл печ. л. 2,0.

_Тираж 100 экз. Заказ № 11._

Отпечатано с оригинал-макета, подготовленного вГУНИИРППМСО РАМН 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2

615

Актуальность проблемы. Мышечные сокращения, по образному выражению И.М.Сеченова, отражают все многообразие внешних проявлений мозговой деятельности (Шмерлинг М.Д. и др., 1991). Широкий диапазон предъявляемых требований и постоянно меняющиеся условия микро- и макроокружения определяют необычайную сложность и динамичность комплекса механизмов, обеспечивающих выполнение мышечным волокном специфической функции. Нарушения тонкого равновесия в их работе, связанные с изменениями параметров клеточного метаболизма, могут приводить к запуску последовательности дистрофических, некробиотических и компенсаторных реакций, сопровождающих многие заболевания и интоксикации, составляющих основу патологического процесса при миопатиях различной природы (Бритван И.Я., 1989; Непомнящих Л.М. и др., 1999; Сухих Г.Т. и др., 2001; Emery А.Е.Н., 1998; Brass Е.Р., Hiatt W.R., 2000; Larsson N.G., Oldfors A., 2001; Ventura-Clapier R. et al., 2002; Warren J.D. et al., 2002; Gosker H.R. et al., 2003).

Несмотря на очевидную практическую и теоретическую значимость, морфология и механизмы этих изменений изучены недостаточно. Последнее обусловлено рядом обстоятельств: заболевания, при которых повреждения соматических мышц составляют основу патологического процесса (показано гистологическое исследование), как правило, редки; биопсия мышц производится на стадии выраженных клинических проявлений, когда гистологическая картина отражает сложный результат взаимодействия деструктивных и компенсаторно-приспособительных реакций.

Указанная ограниченность гистологического метода может быть значительно уменьшена при условии проведения исследований на самых ранних стадиях развития миопатологического процесса с последующим анализом динамики его развития. Подобный методический подход был с успехом использован в экспериментах при изучении острых очаговых метаболических повреждений миокарда (Непомнящих JI.M., 1991, 1996) и соматических мышц (Целлариус С.Ф., Целлариус Ю.Г., 1979).

Адекватность полученных представлений о морфогенезе дисметаболи-ческих процессов в значительной степени зависит от того, насколько параметры экспериментального процесса отражают универсальные механизмы развития повреждения. Для тканей с высокой зависимостью функциональной активности от окислительного метаболизма, к которым относится скелетная мускулатура, такими механизмами в первую очередь являются первичная и вторичная дисфункция митохондрий и связанные с ней дефицит энергии, нарушения ионного гомеостаза и активация свободнорадикальных процессов (Cassarino D.S., Bennett J.P., 1999; Mirabella М. et al., 2000; Weiss J.N. et al., 2003; Brookes P.S. et al., 2004). Изучение особенностей структурной реализации этих механизмов в многоядерных мышечных клетках, в которых отдельные ядра контролируют последовательные сегменты волокна, а митохондриальный компартмент отличается качественной и количественной гетерогенностью (Adhihetty P.J., Hood D.A., 2003; Tews D.S., 2003) является новым и перспективным направлением фундаментальных исследований.

Для выяснения закономерностей структурной реорганизации мышечных волокон при дисметаболических состояниях различного генеза большое значение имеет сравнительный анализ морфофункциональных изменений скелетных мышц при генетически детерминированных миопатиях и токси-ко-метаболических повреждениях. Одной из моделей наследственно обусловленных миопатий являются преждевременно стареющие крысы OXYS, у которых ключевую роль в патогенезе мультиорганной патологии играют прогрессирующие с возрастом нарушения энергетического метаболизма, обусловленные изменениями в соотношениях цитохромов внутренней мембраны митохондрий, снижением активности FiFo-АТФ-синтетазы, дыхательного контроля и скорости фосфорилирования (Шабалина И .Г. и др., 1995; Колосова Н.Г., и др., 2001). Косвенными признаками окислительного стресса являются накопление окислительных повреждений белков и липи-дов, усиление предмутационных изменений в тотальной ДНК (Крысанова Ж .С. и др., 1995; Колосова Н.Г., и др., 2003).

Повреждения скелетных мышц, вызванные токсическими агентами (диметилпарафенилендиамином и бупивакаином) имеют другую динамику (Mascres С., Jasmin G., 1974; Draper R.P. et al., 1994; McLoon L.K. et al., 1998; Gregorevic P. et al., 2000; Hill M. et al., 2003) - воздействия носят «экстремальный» характер, однако их основной мишенью также являются митохондрии. Образование при окислении диметилпарафенилендиамина альтернативных путей транспорта электронов в дыхательной цепи (Munday R.,. 1992; Yabe К., 1992) и вызываемое бупивакаином разобщение окислительного фосфорилирования приводят к острым нарушениям энергетического метаболизма и ионного гомеостаза (Bernardi Р., 1999; Irwin W. et al., 2001). Получение материала через различные промежутки времени после введения препаратов позволит реконструировать последовательность развития острых токсико-метаболических повреждений и ход регенерации.

Сравнительный анализ полученных результатов может помочь в интерпретации биопсийного, аутопсийного и экспериментального материала при таком редком и «строго локальном» в географическом смысле (Авцын А.П., 1972) заболевании, как алиментарно-токсическая пароксизмальная миогло-бинурия. Непредсказуемость его кратковременных вспышек затрудняет, даже в современных условиях, применение многих клинических и экспериментальных методов исследования (Buchholz U. et al., 2000). Морфологические исследования проводились в небольшом числе случаев, главным образом на секционном материале и с использованием только световой микроскопии (Берман Ю.З., Струсевич A.B., 1957). Новые интересные данные были получены во время последней крупной вспышки этого заболевания (Сидорова Л.Д: и др., 1989), однако токсическое начало так и не было выделено,. патогенетические механизмы, остались неясными, а общая картина - пестрой и в некоторой степени «статичной».

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение морфогенеза деструктивных и компенсаторно-приспособительных процессов в соматической мышечной ткани при острых и хронических нарушениях клеточного метаболизма различного генеза.

Для достижения этой цели; был использован, экспериментальный и клинический (биопсийный и аутопсийный) материал и поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфогенез деструктивных и компенсаторно-приспособительных реакций в соматической, мышечной ткани при генетически детерминированной метаболической миопатии у крыс линии ОХУЭ.

2. Изучить особенности деструктивных реакций и регенераторный потенциал скелетных мышц крыс ОХУ8 и Вистар при острых повреждениях соматической мускулатуры, вызванных бупивакаином.

3. Изучить морфогенез острых токсико-метаболических повреждений и-; репаративных реакций соматической мускулатуры, возникающих при вве

- дении диметилпарафенилендиамина.

4; Провести комплексный анализ структурных изменений в соматической мышечной ткани при алиментарно-токсической: пароксизмальной ми-оглобинурии по данным биопсий и аутопсий.

5. Изучить морфологические особенности патологического процесса в соматической мышечной; ткани при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии в зависимости от выраженности клинической картины в эксперименте;

6. Провести сопоставление полученных данных в плане интерпретации структурных проявлений и разработки; элементов общей концепции деструктивных и компенсаторно-приспособительных процессов в соматической мускулатуре при метаболических нарушениях различного генеза.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное морфологическое исследование соматической мускулатуры на разных уровнях структурной организации при метаболических повреждениях различного генеза. Уста-навлено единство структурных реакций скелетных мышц, включающих в себя адаптивные реакции митохондриального компартмента (при хроническом характере стрессового воздействия), универсальные изменения мио-фибрилл (как один из основных индикаторов состояния мышечного волокна) и интегральные изменения в мышечной ткани (отражение процессов компенсации и декомпенсации нарушенных функций).

По результатам изучения моделей острого и хронического нарушения клеточного гомеостаза выделены основные типы изменений сократительного аппарата - контрактурные повреждения и лизис, наличие и соотношение которых в патоморфологической картине позволяет судить об особенностях взаимодействия универсальных деструктивно-компенсаторных механизмов, связанных со скоростью нарастания, выраженностью сдвигов клеточного метаболизма и длительностью их существования.

Впервые при генетически детерминированной миопатии у преждевременно, стареющих крыс ОХУ8 выявлены универсальные структурные^ реакции мышечных волокон при хроническом нарушении окислительного метаболизма. Показано, что в условиях прогрессирующей дисфункции митохондрий первые адаптивные реакции митохондриального компартмента (гиперплазия митохондрий с увеличением площади рабочей поверхности), сопровождающиеся ремоделированием и минимальной деструкцией фибриллярных структур, с течением времени сменяются его структурной декомпенсацией - фрагментацией митохондриального компартмента и распространенными деструктивными изменениями митохондрий. Это повышает восприимчивость мышечных волокон к стрессовым стимулам, приводит к более частому возникновению очагов миоцитолизиса и контрактурных изменений, на тканевом уровне — к уменьшению компенсаторной гипертрофии и усилению атрофии мышечных волокон в диафрагме.

При токсико-метаболических повреждениях, вызванных бупивакаином, впервые показана эффективность репаративной регенерации у крыс ОХУЭ, что указывает на сохранение при наследственно обусловленной дисфункции митохондрий пролиферативного и репопулятивного потенциала миогенных клеток-предшественников.

На основе последовательного анализа экспериментального материала, полученного через различные промежутки времени, была реконструирована динамика контрактурных повреждений при остром нарушении митохондри-ального метаболизма диметилпарафенилендиамином, показано значение структурно-метаболических характеристик волокна-мишени и типоспеци-фических особенностей распространения повреждения в определении формы, протяженности и эволюции контрактурного очага.

Изучение и сопоставление биопсийного, аутопсийного и экспериментального материала в одной «системе координат» позволило впервые представить комплексную патоморфологическую оценку изменений соматической мышечной ткани при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобину-рии с применением-современных методов светооптического, поляризационного, фазово-контрастного и электронно-микроскопического анализа.

На фоне выраженной неоднородности морфологической картины показано, что из двух основных форм реакции в острой патологии поперечнополосатой мускулатуры (контрактурные повреждения и внутриклеточный миоцитолизис), выходящих при алиментарно-токсической миоглобинурии на первый план, ведущая роль принадлежит литическим процессам. Отражением функциональной асинхронности и структурно-метаболической гетерогенности мышечных волокон является стадийная и типовая неоднородность морфологической картины с сохранением в ней вне зависимости от тяжести заболевания широкого спектра стереотипных патологических реакций.

Как при остром, так и при хроническом воздействии наиболее уязвимыми для повреждения оказываются работающие мышечные волокна. Подтверждением этого положения являются более выраженные изменения в постоянно работающем органе (диафрагме), обнаруживаемые при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии и в ранние сроки опыта с введением диметилпарафенилендиамина (большее количество поврежденных волокон), а также при метаболической миопатии у крыс ОХУБ (повышенный- фон очаговых изменений, особенности динамики морфо-стереологических показателей).

Практическая значимость. Полученные результаты, раскрывающие закономерности и особенности тканевых, клеточных и субклеточных реакций в соматической мускулатуре при острых и хронических нарушениях, клеточного метаболизма, составляют базу для разработки морфологических критериев диагностики и прогноза алиментарно-токсической миоглобинурии и метаболических повреждений соматических мышц различного генеза.

Данные о закономерностях и механизмах повреждений скелетных мышц, полученные на экспериментальных моделях и отражающие универсальные механизмы повреждения и смерти клеток, могут быть экстраполированы на аналогичные процессы в патологии человека и использованы при интерпретации многообразия структурных перестроек в клиническом материале.

Результаты по использованию антиоксидантных препаратов (Темпола) для коррекции дисметаболических повреждений могут быть использованы для разработки новых терапевтических подходов при острых и хронических нарушениях митохондриального метаболизма в патологии человека.

Выявленные закономерности структурных реакций в условиях острого и хронического нарушения энергетического метаболизма составляют элементы общей концепции морфогенеза деструктивно-приспособительных реакций в патологии скелетных мышц и могут использоваться в различных обастях миопатологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Структурная перестройка скелетных мышц при метаболических нарушениях сопровождается комплексом стереотипных структурных изменений, в основе которых лежат адаптивные и деструктивные реакции мито-хондриального компартмента, универсальные изменения миофибрилл и структурная реорганизация мышечной ткани (отражение процессов компенсации и декомпенсации нарушенных функций).

2. Морфологическую основу острой патологии скелетных мышц составляют универсальные очаговые реакции мышечных волокон, связанные с характерными изменениями миофибриллярного аппарата: контрактурные повреждения и очаговый миоцитолизис. Существенным фактором, определяющим особенности их структуры и эволюции является целостность сарколеммы

3. Спектр структурных реакций и преобладание в нем отдельных форм определяются не столько специфичностью повреждающего стимула, сколько его выраженностью и динамикой, а также адаптивным потенциалом-мышечного волокна, связанным со структурно-метаболическим типом, функциональным состоянием и факторами микроокружения. Определенное значение в течении патологического процесса имеют видовые различия, не затрагивающие основные механизмы его развития.

4. При постепенно прогрессирующем нарушении клеточного метаболизма на первый план выходят адаптивные реакции митохондриального компартмента, которые с течением времени сменяются его структурной декомпенсацией с нарастанием .деструктивных изменений миофибрилл, уменьшением компенсаторной гипертрофии мышечных волокон. Быстрая и эффективная репаративная регенерация указывает на сохранение в этих условиях пролиферативного и репопулятивного потенциала миогенных клеток-предшественников.

5. Межклеточная и внутриклеточная структурно-функциональная гетерогенность в значительной степени определяет типичную черту патологического процесса в скелетных мышцах: асинхронность развития общего каскада деструктивно-компенсаторных реакций, в том числе на территории одного мышечного волокна, приводящую к стадийной, типовой и внутритипо-вой неоднородности патологических изменений, формированию множества промежуточных форм.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции «Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине» (Новосибирск, 1995), научной сессии сотрудников Новосибирского медицинского института (Новосибирск, 1995), II съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), первом. Российском Конгрессе по патофизиологии с международным участием «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы» (Москва, 1996), Первом Российском съезде патологоанатомов (Москва, 1996), Новосибирской городской конференции «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 1998), конференции «Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН (Новосибирск, 1998), VI Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 20Ö0), Международной конференции по физиологии мышечной деятельности (Москва, 2000); IV конференции молодых ученых СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2002), III Российском Конгрессе по патофизиологии «Дизрегуля-ционная патология органов и систем (Москва, 2004), Международном Конгрессе «Новые методы в диагностике, профилактике и лечении» (Ганновер, Германия, 2004), 6-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Гастро - 2004» (Санкт-Петербург, 2004), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социальнозначимых заболеваниях (Новосибирск, 2004), Ученом совете ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликована 29 работ, из них в рецензируемых журналах - 14, по списку ВАК - 7.

1. Бакарев М.А. Морфологическое исследование скелетной мускулатуры при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине: Материалы- научно-практ. конф. - Новосибирск, 1995.-С. 130.

2. Бакарев М.А. Патоморфологическое исследование соматических мышц при общепатологических процессах // Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. -Новосибирск, 1996.-С. 11.

3. Непомнящих JI.M., Бакарев М.А. Морфологическое исследование соматических мышц при алиментарно-токсической' пароксизмальной миоглобинурии // Бюл. экспер. биол. - 1996. - № 2. - С. 228 - 233.

4. Бакарев М.А., Непомнящих JI.M. Типовые патологические процессы в соматической мускулатуре // Первый Российский конгресс по патофизиологии с международным участием. Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы (экспериментальные и клинические аспекты): Тезисы докл. -М:, 1996. -С. 32: -■" - - • •

5. Nepomnyashchikh L.M., Bakarev М.А. Morphological study of somatic muscles in alimentary-toxic paroxysmal myoglobinuria // Bull. Exp. Biol. Med. -Vol. 121. — № 2. — N.Y.: Plenum Publ. Corp., 1996.-P: 211 -216.

6. Бакарев M.A., Непомнящих JI.M. Типовые патологические реакции в соматической мускулатуре // Труды 1-го съезда Российского общества патологоанатомов. - М., 1996. - С. 19.

7. Непомнящих Г.И., Непомнящих JI.M., Айдагулова C.B., Криницына Ю.М., Александрова Н.М., Ермаков М.Н., Бакарев М.А., Сергеева И.Г., Щербина Е.Э. Патоморфология радиационно-индуцированных поражений кожи. - Препринт. - Новосибирск: НИИ региональной патологии и пато-морфологии СО РАМН, 1997. - 23 с.

8. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М. Патоморфологическое исследование соматической мускулатуры при алиментарно-токсической пароксиз-мальной миоглобинурии // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. - Новосибирск, 1998. - С. 395.

9. Непомнящих JI.M., Бакарев М.А., Циммерман В.Г. Патоморфологическое исследование соматических мышц при генетически детерминированной метаболической миопатии у крыс линии W/SSM // Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 1998. - С. 42.

10. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М. Патоморфологическое исследование острых метаболических повреждений волокон соматической мускула-туры, вызванных диметилпарафенилендиамином // Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 1998. - С. 46.

11. Непомнящих Л.М., Бакарев М.А., Циммерман В.Г. Общепатологиг ческие процессы в соматических мышцах при генетически детерминированной метаболической миопатии у крыс линии W/SSM // Бюл. экспер. биол

1998.-Т: 126.-№8.-С. 228-233:

12. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М., Циммерман В.Г. Структурные особенности острых очаговых метаболических повреждений волокон соматической мускулатуры, вызванных диметилпарафенилендиамином // Бюл. экспер. биол. - 1999: - Т. 127. - № 6. - С. 700 - 705.

13. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М., Циммерман В.Г. Морфология метаболических повреждений соматической мускулатуры. - Новосибирск,

1999.-31 с.

14. Nepomnyashchikh L.M., Bakarev М.А., Tsimmerman V.G. General pathological processes in somatic muscles in W/SSM rats with genetically determined metabolic myopathy // Bull. Exper. Biol. Med. - N.Y.: Plenum Publ. Corp., 1999.-Vol. 126.-№8.-P. 846-851.

15. Bakarev M.A., Nepomnyashchikh L.M., Tsimmerman V.G. Structural features of acute metabolic injuries in somatic muscle fibers caused by dimethyl-paraphenylenediamine // Bull. Exper. Biol. Med. - N.Y.: Plenum Publ. Corp., 1999.-Vol. 127. -№ 6. - P. 640-644.

16. Бакарев M.A., Непомнящих JI.M. Экспериментальная модель метаболических повреждений соматических мышц в изучении алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии // Материалы VI Всероссийской конференции по патологии клетки. - Москва, 2000. - С. 90 - 91.

17. Чапаева Н.Н., Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Бакарев М.А. Антифосфолипидный синдром: ультраструктура эндотелиоцитов микрососудов в кожно-мышечных биоптатах при системной красной волчанке //' Бюл. экспер. биол. - 2001. - Т. 131. - № 2. - С. 212 - 217.

18. Чапаева Н.Н., Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Бакарев М.А. Ультраструктурные и биосинтетические ■ особенности эндотелиоцитов гло-мерул и перигломерулярных артериол при системной красной волчанке // Бюл. экспер. биол. - 2001. - Т. 132.-№ 8. - С. 209-215.

19. Ghapaeva N.N., Nepomnyashchikh G.I., Aidagulova S.V., Bakarev М.А. Antiphospholijpid" Syndrome: Ultrastructure of microvascular endotheliocytes in musculocutaneous bioptates during systemic lupus erythematosus // Bull. Exper. Biol. Med.-2001.-Vol. 131.-№2.- P. 176- 180.

20: Chapaeva N.N., Nepomnyashchikh G.I., Aidagulova S.V., Bakarev M.A. Ultrastructural and biosynthetic characteristics of glomerular endotheliocytes and periglomerular arterioles during systemic lupus erythematosus // Bull. Exper. Biol. Med. - 2001. - Vol. 132. - № 2. - P. 791 - 796.

21. Бакарев M.A., Непомнящих JI.M. Типовые структурные реакции скелетных мышц: Метаболические повреждения и регенерация // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: IV конф. молодых ученых СО РАМН. - Новосибирск, 2002. - С. 56.

22. Бакарев М.А., Непомнящих JI.M. Клинико-экспериментальное исследование токсико-метаболических повреждений соматических мышц в Западной Сибири // Сибирский научный вестник. - 2003. - Вып. VI. - С. 12 - 17.

23. Бакарев М.А., Непомнящих JIM. Ультраструктурные признаки ми-тохондриальной миопатии у преждевременно стареющих крыс OXYS // Дизрегуляционная патология органов и систем: III Российский конгресс по патофизиологии. - М., 2004. - С. 101.

24. Bakarev М.А., Nepomnyashchikh L.M. Mitochondrial myopathy in senescence-accelerated OXYS rats // International congress «Advanced methods of diagnosis, prophylactics and treatment». - Hannover, 2004. — P. 82.

25. Непомнящих Г.И., Айдагулова C.B., Непомнящих Д.Л., Бакарев М.А. Патоморфогенез хронических гепатитов С и В / Материалы 6-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург -Гастро-2004» // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2004. - № 2.-3. - С. М101.

26. Бакарев М.А., Непомнящих JLM. Морфологические признаки мито-хондриальной миопатии у преждевременно стареющих крыс OXYS// Кли-нико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально-значимых заболеваниях: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти проф. Ю.Г.Целлариуса. -Новосибирск, 2004. - С. 72 - 73.

27. Бакарев М.А., Непомнящих JIM. Дисфункция митохондрий и патология скелетных мышц // Сибирский научный вестник. - 2004. - Вып. VII. -С. 14-19.

28. Бакарев М.А., Непомнящих JI.M. Структурные проявления нарушений митохондриальной функции в скелетных мышцах у преждевременно стареющих крыс OXYS // Бюл. экспер. биол. - 2004. - Т. 138. - № 12. - С. 674 - 679.

29. Bakarev M.A., Nepomnyashchikh L.M. Structural manifestations of mitochondrial dysfunction in senescence-accelerated OXYS rats // Bull. Exper. Biol. Med.-2005.-Vol. 138.-№6.- P. 632-636.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. В результате экспериментального и патологоанатомического исследования соматических мышц на примере моделей острого и хронического нарушения клеточного метаболизма выявлен комплекс стереотипных структурных изменений, в основе которых лежат адаптивные и деструктивные реакции митохондриального компартмента (при хроническом характере стрессового воздействия), универсальные изменения миофибрилл (один из основных индикаторов состояния мышечного волокна) и интегральные изменения в мышечной ткани (отражение процессов компенсации и декомпенсации нарушенных функций).

2. В условиях постепенно нарастающего хронического нарушения клеточного гомеостаза при метаболической миопатии у крыс OXYS в светооп-тической картине доминируют такие общепатологические процессы, как гипертрофия, атрофия, дистрофия, отражающие сочетание альтеративных и компенсаторно-приспособительных процессов на всех уровнях структурной организации. Это отражается на морфо-стереологических параметрах (общая тенденция к гипертрофии мышечных волокон в сочетании со значительным повышением вариабельности их размеров).

В ультраструктурной картине адаптивная реакция митохондриального компартмента (гиперплазия митохондрий с увеличением площади рабочей поверхности), сопровождающаяся ремоделированием и минимальной деструкцией фибриллярных структур, с течением времени сменяется его структурной декомпенсацией и распространенными деструктивными изменениями митохондрий. Это повышает восприимчивость мышечных волокон к стрессовым стимулам, приводит к более частому возникновению очагов миоцитолизиса и контрактурных изменений, на тканевом уровне - к уменьшению компенсаторной гипертрофии и усилению атрофии мышечных волокон в диафрагме.

3. Острое нарушение клеточного метаболизма, вызванное внутримышечным введением бупивакаина крысам ОХУ8 и Вистар, сопровождается быстрыми и массивными деструктивными изменениями преимущественно белых мышечных волокон (отек мышечных волокон и интерстиция, распространенные контрактурные и литические изменения), за которыми следует активная клеточная реакция, макрофагальная резорбция и эффективная регенерация, что указывает на сохранение при наследственно обусловленной дисфункции митохондрий у крыс ОХУБ пролиферативного и репопулятив-ного потенциала миогенных клеток-предшественников.

4. Однократное превентивное применение антиоксиданта (Темпола) при экстремальном местном токсическом воздействии вызвало уменьшение отечности мышечных волокон и интерстиция в ранний срок эксперимента, но оказалось недостаточным для уменьшения выраженности деструкции.

5. Контрактурные повреждения и более редкие очаги миоцитолизиса, возникающие в соматических мышцах белых крыс после введения диметил-парафенилендиамина, соответствуют типовым структурным реакциям, составляющим морфологическую основу острой патологии поперечнополосатой мускулатуры человека и животных.

По данным поляризационно-оптического и ультраструктурного анализа динамика контрактурного повреждения представлена как смена последовательных фаз развития пересокращения (1-Ш степени контрактуры) фазой некробиоза (IV степень) с последующей макрофагальной резорбцией. Контрактурные повреждения сопровождаются нарушением целостности сарколеммы, на что указывает плазматическое пропитывание (устойчивая к обработке амилазой ШИК-реакция в очаге контрактуры), а также электронно-микроскопические признаки. Исчезновение 2-полосок, дезагрегация, дезориентация и фрагментация миофибрилл образуют последовательность изменений при внутриклеточном миоцитолизисе. Признаков нарушения целостности клеточной мембраны и клеточной реакции в очаге повреждения, как правило, не наблюдается.

6. При изучении алиментарно-токсической пароксизмальной миогло-бинурии на материале биопсий и аутопсий обнаружено, что из двух универсальных форм деструктивных реакций скелетных мышц в острой патологии соматической мускулатуры, выходящих в неоднородной морфологической картине на первый план, значительная роль принадлежит литическим процессам. Последние представлены небольшими, а нередко и весьма, протяженными очагами, в которых дезагрегация и лизис миофибрилл являются доминирующими проявлениями острого нарушения клеточного метаболизма. Среди более редких в целом контрактурных повреждений преобладают очаги типа «лент», характерные для волокон I типа. В ультраструктурной картине выделен особый вариант некробиотической реакции, в котором внутриклеточный отек, диспозиция и лизис структур саркоплазмы сочетаются с умеренными контрактурными изменениями. Деструктивные изменения сопровождаются процессами регенерации.

7. Анализ морфологических особенностей патологического процесса при экспериментальной алиментарно-токсической пароксизмальной миог-лобинурии в зависимости от выраженности клинической картины выявил определенный клинико-морфологический параллелизм, заключающийся в увеличении доли более тяжелых форм и большей распространенности повреждений мышечных волокон при увеличении тяжести заболевания.

Перераспределение спектра типовых очаговых реакций в сторону преобладания повреждений контрактурного типа и некоторые особенности в деталях морфологических вариантов универсальных реакций при алиментарно-токсической пароксизмальной миоглобинурии у кошек отражают видовые различия в течении патологического процесса, не затрагивающие основные механизмы его развития.

8. Межклеточная и внутриклеточная структурно-функциональная гетерогенность скелетных мышц в значительной степени определяет картину патологического процесса: асинхронность развития патологических изменений, их стадийную, типовую и внутритиповую неоднородность, наличие множества промежуточных форм. Как при острых, так и при хронических воздействиях наиболее уязвимыми оказываются мышечные волокна с высокой функциональной активностью, о чем свидетельствуют более выраженные изменения в постоянно работающем органе (диафрагме), обнаруживаемые во всех изученных моделях.

9. Сопоставление результатов экспериментальных и патологоанатоми-ческих исследований свидетельствует о наличии общей стратегии структурного реагирования соматической мускулатуры, направленной в первую очередь на ограничение повреждения и заключающейся в том, что любое стрессовое воздействие, нарушающее метаболическое равновесие клетки, приводит к запуску общего каскада деструктивно-компенсаторных реакций, который протекает асинхронно на гетерогенном тканевом, клеточном и внутриклеточном поле. Интегральная морфологическая картина определяется сочетанием фенотипических отпечатков его ранних и поздних этапов, а также многочисленных «ответвлений». Спектр структурных реакций и преобладание в нем отдельных форм определяются не столько специфичностью повреждающего стимула («точкой входа»), сколько его выраженностью и динамикой, а также адаптивным потенциалом мышечного волокна, связанным с его структурно-метаболическим типом, функциональным состоянием и факторами микроокружения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Комплексный анализ клинического (биопсийного и аутопсийного) материала скелетных мышц должен проводиться на всех уровнях структурной организации и обязательно включать метод поляризационной микроскопии, позволяющий судить о состоянии молекулярных структур сократительного аппарата и обнаруживать самые ранние стадии повреждения на светооптическом уровне с последующим прицельным использованием других методик.

2. При интерпретации пестрой и неоднородной морфологической картины важно учитывать морфогенетический аспект, определяя преобладающие типы и стадии структурных перестроек скелетных мышц (степень контрактур, ограниченные и распространенные литические изменения, выраженность клеточной реакции, признаки регенерации и остаточные изменения). Это дает возможность судить о выраженности и динамических характеристиках повреждающего фактора и имеет существенное прогностическое значение.

3. При анализе хронических патологических процессов в соматической мышечной ткани следует оценивать тканевые и клеточные адаптивные реакции, обращая особое внимание на состояние митохондриального компар-тмента (гиперплазия, фрагментация, деструктивные изменения). Ультраструктурная оценка состояния митохондрий в очагах повреждения и в видимо интактных мышечных волокнах может дать определенное представление о механизмах развития изменений.

4. При оценке подходов к коррекции патологии скелетных мышц не следует упускать из вида возможность применения антиоксидантов, а при хронической митохондриальной патологии - подбор определенных режимов двигательной активности, способствующих активации сохраненного мио-генного резерва.