Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Морфофункциональные особенности культивируемых эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток человека в условиях измененной силы тяжести

На правахрукописи

МЕРЗЛИКИНА

Наталья Викторовна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК И МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ СИЛЫ ТЯЖЕСТИ

14.00.32 — авиационная, космическая и морская медицина 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном научном центре РФ -Институте медико-биологических проблем РАН

Научные руководители:

доктор медицинских наук Буравкова Людмила Борисовна доктор биологических наук Таирбеков Мурад Гарунович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Миташов Виктор Иванович доктор биологических наук Шенкман Борис Стивович

Ведущая организация:

факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «_»_2005 года в_часов на заседании

диссертационного совета К002.111.01 в Государственном научном центре РФ - Институте медико-бологических проблем РАН по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН.

Автореферат «'разослан-'^_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

И. П. Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Освоение человеком космического пространства поставило вопросы о влиянии микрогравитации на живые системы различного уровня организации с целью использования полученных знаний как для установления механизмов действия гравитационного фактора и создания средств профилактики неблагоприятного воздействия факторов космического полета, так и для анализа возможностей использования микрогравитации в биотехнологических разработках.

Исследования, проведенные с использованием различных клеточных моделей в условиях реальной и моделируемой микрогравитации, выявили разнообразные морфофункциональные изменения культивируемых клеток [Cogoli, Tschopp, 1984; Gmünder, Cogoli, 1988; 1991; Cogoli et at., 1989; Genty, 1993; Hammond et al, 2000; Buravkova, Romanov, 2000; Lewis, 1999, 2002; Papaseit et al., 2000]. При этом различия в выявленных эффектах могут быть объяснены как разной гравичувствительностью клеток, так и методами моделирования и исследуемыми параметрами. Концепция о гравитационной индифферентности клеток, выдвинутая в 1970"" - 1980™ годах прошлого столетия [Парфенов, 1981; Таирбеков, Парфенов, 1981], в настоящее время существенно скорректирована [Cogoli, 1996; Schmitt et al., 1996; Lewis et al., 1998; Hughes-Fulford, 2001; Романов, Буравкова, 2000; Таирбеков, 2002].

Несмотря на широкий спектр используемых в гравитационной биологии клеточных культур, чувствительность эндотелиальных клеток (ЭК) к гравитационному стимулу не изучалась, хотя результаты фундаментальных исследований говорят о непосредственном участии клеточных элементов сосудистой стенки в формировании ответа организма на микрогравитацию [Convertino et al., 1997]. К тому же известно, что именно эндотелий, обладая механочувствительностью, регулирует сосудистый тонус через взаимодействие с гладкомышечными клетками [Ткачук и др., 1998, 2001; Vanhoutte, Mombouli, 1996] и, следовательно, может играть важную роль в функционировании сердечно-сосудистой системы в условиях измененной гравитации. Немаловажным фактором, привлекающим внимание к исследованию свойств эндотелия, является его биологическая активность, а также участие в воспалительных и иммунных реакциях организма, регуляции кроветворения и процессов свертывания крови.

Снижение пролиферативной активности клеток, ингибирование митогенных сигналов в условиях микрогравитации [Hughes-Fulford, Lewis, 1996; Rucci et al., 2002], а также атрофические перестройки опорно-двигательного аппарата [Oganov et al., 1991; Шенкман, 2002], изменение способности к восстановлению и самообновлению тканей в условиях космического полета [Mitashov et al., 1996] позволяют предположить, что микрогравитация

может приводить к морфофункциональным модификациям клеток-предшественников, перестройке их функциональной активности и способности дифференцироваться в тканевые элементы.

Основным источником стволовых клеток во взрослом организме является костный мозг, способный генерировать как гемопоэтические, так и мезенхимальные клетки, которые могут дифференцироваться в большинство известных клеточных типов, таких как остеобласты, хондроциты, адипоциты, а также другие типы клеток [Friedenstem, 1987; Pittenger et al., 1999; Kassem et al.f 2004]. Недавно несколькими исследовательскими группами описано получение эндотелиальных клеток (ЭК) и их предшественников из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (MCK) [Reyes et al., 2002; Pittenger, Martin, 2004; Oswald et al., 2004]. Важную роль во взаимодействии стволовых и дифференцированных клеток в органах и тканях играют коммитированные клетки-предшественники. Однако вопрос о механочувствительности МСК и, в частности, их гравитационной чувствительности, остается открытым, хотя ряд экспериментальных работ свидетельствует о реакции этих клеток в культуре на широкий спектр факторов микроокружения.

Таким образом, исследование свойств низкодифференцированных мезенхимальных стволовых клеток - важного элемента регуляции системы функционирования тканевых систем - в условиях измененной силы тяжести является актуальной проблемой наряду с изучением другого ее значимого компонента, тесно связанного с МСК — дифференцированного эндотелия сосудов.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение

морфофункциональных особенностей эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток человека в модельных условиях измененной силы тяжести in vitro.

В соответствии с поставленной целью решались следующие основные задачи:

1. Исследование пролиферативной активности эндотелиальных клеток человека при длительном клиностатировании.

2. Изучение особенностей организации актинового цитоскелета ЭК человека в условиях измененного вектора гравитации.

3. Определение продукции цитокинов и экспрессии молекул адгезии эндотелиальными клетками при клиностатировании.

4. Отработка методов культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, изучение пролиферативной активности и экспрессии маркеров МСК при длительном клиностатировании.

5. Исследование особенностей организации актинового циоскелета меэенхимальных стволовых клеток человека в условиях измененного направления вектора гравитации.

6. Определение продукции цитокинов МСК при длительном изменении вектора гравитации in vitro.

Научная новизна. Получены первые доказательства высокой чувствительности культивируемых ЭК пупочной вены человека и МСК костного мозга человека к изменению гравитационного окружения. Впервые выявлено угнетение пролиферативной активности культивируемого эндотелия при длительном воздействии измененного направления вектора гравитации. Впервые установлено, что реорганизация архитектуры актиновых филаментов эндотелия начинается уже в первые часы клиностатирования, при этом ремоделирование в ответ на изменение гравитационного окружения носит обратимый характер и протекает быстрее, чем его восстановление. Выявленное увеличение концентрации «стрессового» провоспалительного цитокина ИЛ-6 (интерлейкина-б) в культуральной среде эндотслиальных клеток после кратковременного клиностатирования также указывает на их чувствительность к гравитационному стимулу.

Впервые показано снижение пролиферативной активности культивируемых МСК человека при длительном клиностатировании, которое является обратимым и восстанавливается при возвращении клеток в стандартные условия культивирования. Выявлена реорганизация структуры актинового цитоскелета как в первые часы изменяющегося вектора гравитации, так и при более длительном воздействии. Установлено повышение концентрации ИЛ-6 в культуральной среде МСК человека при кратковременном клиностатировании. Впервые показано изменение экспрессии клеточных маркеров a-SMA (a-актина гладкомышечных клеток), CD 105, HLA class I при длительном культивировании под воздействием измененного гравитационного микроокружения.

Научно-практическая значимость работы. Представленные экспериментальные данные являются важным шагом на пути к пониманию механизмов действия гравитационного сигнала на клетку. Результаты исследования способствуют расширению сложившихся представлений о клеточной биологии эндотелия и мезенхимальных стволовых клеток человека в условиях измененного гравитационного окружения. Полученные данные позволяют приблизиться к более глубокому пониманию влияния измененной гравитации на низкодифференцированные стволовые и дифференцированные эндотелиальные клетки человека. Результаты работы необходимо учитывать при анализе функциональных изменений сердечно-сосудистой системы и процессов регенерации в условиях микрогравитации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментально доказана гравитационная чувствительность культивируемых эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток человека.

2. Условия измененной силы тяжести (клиностатирование) приводят к реорганизации элементов цитоскелета (F-актин) ЭК и МСК, при этом перестройка структуры актиновых филаментов носит обратимый характер.

3. При одновременном действии клиностатирования и активации клеток провоспалительным цитокином ФНО-а модифицируется экспрессия молекул клеточной адгезии (Е-селектина, VCAM-1, ICAM-1) на поверхности ЭК, что может приводить к изменению взаимодействия «клетка - субстрат» и «клетка -клетка».

4. Различные типы культивируемых клеток человека: дифференцированные (ЭК) и низкодифференцированные (МСК) демонстрируют сходные ответные реакции, проявляющиеся в снижении пролиферативной активности, увеличении продукции ИЛ-6 и перестройке актинового цитоскелета.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2003 г.), Конференциях молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2003, 2004, 2005 г.), 54th International Astronautical Congress (Bremen, Germany, 2003 г.), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность», посвященном памяти академика Г.М. Франка (Пущино, Россия, 2004), 25"1 International Gravitational Physiology Meeting (Moscow, 2004), Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005).

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ — ИМБП РАН «Космическая биология и физиология».

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на £ страницах, иллюстрирован 30 рисунками и 3 таблицами. Список литературы содержит 234 работы, из них 35 отечественных и 199 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и культивирование ЭК человека. Для получения первичных культур ЭК пупочной вены человека использовали метод ОипЬгопе е! а1. (1974) в модификации Антонова и соавт. (1981); вместо коллагеназы использовали 0,15% раствор диспазы. Средой роста для ЭК являлась среда 199 с добавлением 25 мМ ЫЕРЕ8, 2 мМ Ь-глутамина, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1мМ пирувата натрия, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 5 Ед./мл гепарина и 50 мкг/мл фактора роста ЕСОР. Клетки высевали на предварительно покрытые 0,2% раствором желатина чашки Петри. Культуру помещали в СО2-инкубатор в условиях 37°С, 5% СО2, 95% воздуха, 100% влажности. Через 18 — 24 ч культуры отмывали раствором Эрла и заменяли среду культивирования на свежую, в дальнейшем смену среды проводили через 48 ч.

Культивирование МСК человека. Мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из костного мозга человека, были любезно предоставлены д.б.н. ЮА Романовым (ИЭК РКНПК МЗ РФ). Для культивирования использовалась среда БМЕМ-Ю с 20 мМ ЫЕРЕ8, 2 мМ Ь-глутамином, 1 мМ пируватом натрия, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 4% сывороткой из пуповинной крови человека. Первичные культуры через две недели после выделения отмывали сбалансированным солевым раствором Хенкса, снимали с флакона раствором 0,05% трипсина - 0,02% ЭДТА и пересевали в новый флакон с культуральной поверхностью 75 см2. Смена среды осуществлялась через 2-3 дня.

Моделирование измененной силы тяжести осуществляли в лабораторных условиях, используя метод клиностатирования, позволяющий за счет постоянного вращения флакона с культурами вокруг оси, изменять направление вектора силы тяжести (гравитационного вектора) по отношению к монослою. Для этого конфлуэнтные первичные культуры или культуры 1 - 2-ю пассажей ЭК из флакона 75 см2 (с плотностью 5х106 клеток) снимали трипсином - ЭДТА и пересевали с разведением 1:3 на покрытые 0,2% раствором желатина культуральные флаконы с площадью поверхности 25 см2. Через 18 - 24 ч клетки отмывали раствором Эрла, который заменяли свежей средой культивирования. При этом флаконы заполняли средой полностью, не оставляя пузырьков воздуха, после чего дополнительно герметизировали эластичной пленкой «Парафильм» и закрывали крышками. Клиностатирование клеток осуществляли непосредственно в СО2-янкубаторе на горизонтальном клиностате со скоростью вращения 6 об/мин при 37°С. Контрольные культуры находились в аналогичных флаконах в стационарных условиях. Для дополнительного контроля использовали шейкер, обеспечивающий постоянное

перемешивание среды культивирования, наблюдаемое при длительном клиностатировании [Романов, Буравкова, 2000].

Субконфлуэнтные культуры МСК снимали с поверхности флаконов 75 см с плотностью посадки 4хЮб клеток и пассировали во флаконы с поверхностью 25 см2 при разведении 1:3. В экспериментах использовали клетки 2, 3, 6-го пассажей. Условия клиностатирования не отличались от условий, описанных для ЭК. Контрольные культуры растили в аналогичных флаконах в стационарных условиях.

Анализ пролиферативной активности. Дня подсчета количества клеток использовали метод компьютеризированной видео-микроскопии (использовался микроскоп Axiovert 25 (Zeiss, Германия), оборудованный цифровой видеокамерой Mintron OS-75D, (Тайвань). Клетки на полученных фотографиях подсчитывали с использованием программы SigmaScan Рго5 (Sigma-Aldiich, США). Фотографирование опытных и контрольных культур клеток проводили через 2, 4, 24 ч культивирования с последующим возвращением клиностатированных клеток на 4 ч в стандартные условия роста, а также через 48,72, 96, 120 и 144 ч с последующим культивированием клиностатируемых клеток в стационарных условиях в течение 24 ч. В каждом флаконе было изучено не менее трех стационарных полей (равных полям зрения микроскопа площадью 1,55 мм2), в которых подсчитывали число клеток.

Флуоресцентная микроскопия актиновых филаментов. Для выявления актиновых филаментов (F-актина) культуры фиксировали 4% раствором параформальдегида на фосфатном буфере Дульбекко (ФБД) с добавлением 0,1% раствора тритона Х-100 и выдерживали клетки в 1мкг/мл растворе РИТЦ-фаллоидина [Lacerda et al., 1996]. Препараты клеток анализировали на флуоресцентном микроскопе Axiovert 25 или Axiovert 200 (Zeiss) (X = 450 - 490 нм).

Количественное определение цитокшнов в среде роста клеток. Уровень цитокинов в культуральной среде измеряли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов "Human IL-la",. "Human IL-6", "Human TNF-a", "Human VEGF" (BioSource International Inc., Бельгия) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Концентрацию цитокинов определяли по калибровочной кривой, построенной по стандартам с известными концентрациями.

Исследование экспрессии молекул клеточной адгезии. Экспрессию Е-селектина, ICAM-1 и VCAM-1 на поверхности эндотелия изучали с использованием авидин-биотин-пероксидазного метода. Культуры отмывали от среды и фиксировали в 1% параформальдегиде, приготовленном на ФБД, в течение 15 мин. Затем препараты промывали несколько раз раствором 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) - ФБД и

инкубировали в течение 45 мин при +37°С с первичными мышиными моноклональными антителами (Becton Dickinson). Последующие шаги определения были выполнены с использованием Monoclonal Detector Kit (Biomeda, США). Клеточные ядра дополнительно окрашивали гематоксилином Маера. Препараты анализировали на микроскопе Axiovert 25 (Zeiss, Германия).

Иммунофепотипирование МСК человека. Для подтверждения статуса МСК клетки костного мозга фенотипировали на разных стадиях культивирования (2, 3, 6-е пассажи) с помощью проточной цитофлуориметрии. Для идентификации клеточных культур использовали антитела к поверхностным маркерам CD34, CD36, CD38, CD45, CDw90, CD105, CD106, CDH7 (Immunotech, Франция), HLA class I, HLA-DR и внутренним маркерам: виментин, коллаген I, a-SMA (Sigma-Aldiich, США). В качестве изотипического контроля использовали IgGl. Иммунофенотипирование проводили обязательно перед началом экспериментов с клиностатированием для определения статуса и состояния МСК. Количественную оценку изменения экспрессии маркеров мезенхимальными стволовыми клетками под воздействием измененного направления вектора гравитации проводили в пролиферирующих культурах после 144 ч клиностатирования и в субконфлуэнтаых культурах после 72 ч клиностатирования (использовались маркеры HLA class I, CD105, ASMA).

Для анализа поверхностных маркеров клетки снимали раствором трипсина — ЭДТА, фиксировали 1% раствором параформальдегида и отмывали центрифугированием в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на фосфатном буфере Дюльбекко (ФБД-БСА). Для выявления внутренних клеточных маркеров клетки дополнительно инкубировали в течение 10 мин в 0,1% растворе ТХ-100 на ФБД после фиксации. МСК инкубировали в течение 45 мин с моноклональными мышиными антителами к соответствующему антигену («первые антитела») или изотипическим контролем, приготовленными на ФБД-БСА. После отмывки центрифугированием в ФБД-БСА клетки инкубировали с ФИТЦ-меченными козьими антителами («вторые антитела») в течение 30 мин. Затем МСК отмывали ФБД-БСА и анализировали в ФБД. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). В каждом образце анализировали 3000 - 7000 событий.

Статистический анализ. Все данные были получены в нескольких независимых сериях. Достоверность различий между экспериментальными данными определяли с использованием параметрических (критерий Стьюдента) и непараметрических (критерий Крускала-Уоллиса) методов. Отклонения от среднего значения, приведенные в тексте работы, соответствуют SD (среднеквадратичному отклонению).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование влияния клиностатировавия на культуру ЭК человека.

При выделении эндотелиальных клеток из пупочной вены ферментативной обработкой (диспазой) получается суспензия, состоящая из агрегатов и одиночных клеток. Через 3-4 суток после посадки клетки вытягивались и становились веретеноввдными. На 5 — 7-е сутки культивирования ЭК формировали конфлуэнтный монослой, состоящий из полигональных, плотно прилегающих друг к Другу клеток. При увеличении времени культивирования до 10 суток не наблюдалось характерного для фибробластов и гладкомышечных клеток наслаивания друг на друга. Клетки ранних (1 — 3-го) пассажей обладали сходной морфологией, достигали конфлуэнтного монослоя на 5 — 7-е сутки (как и первичные культуры), что подтверждало описанную в литературе способность ЭК к быстрой пролиферации.

Доказательствами эндотелиальной природы получаемых культур служили контактное ингибирование пролиферации и экспрессия специфических маркеров ЭК (РЕСАМ-1, фактора фон Виллебранда).

Пролиферативная активность ЭК человека при клиностатировании. Литературные данные об изменении пролиферативной активности многих типов клеток в условиях микрогравитации [Таирбеков, 1997; Cogoli et al., 1993; Hughes-Fulford, 2003] позволили предположить, что если культивируемые ЭК чувствительны к гравитационному стимулу, то они должны отвечать изменением скорости роста. При исследовании пролиферативной активности ЭК in vitro в условиях кратковременного клиностатирования не выявлено значительных изменений пролиферации в первые часы воздействия (рис1). Через 24 ч воздействия наблюдалось снижение пролиферативной активности клиностатируемых ЭК по сравнению с контрольными клетками. После 4 ч культивирования в стандартных условиях ЭК, клиностатируемых до этого в течение 24 ч, регистрировали частичное восстановление пролиферации. Сходные изменения пролиферативной активности отмечались при вертикальном клиностатировании ЭК.

При продолжении клиностатирования наблюдалось дальнейшее снижение темпов пролиферации ЭК (в среднем в 1,7 раза), которое сохранялось во время всего периода клиностатирования. Эти результаты согласуются с показанным ранее снижением пролиферации ЭК человека при длительном клиностатировании [Романов, Буравкова, 2000]. Возвращение культур в стандартные условия после 144 ч клиностатирования приводило к восстановлению темпов пролиферации. Максимальная плотность эндотелиальных монослоев, сформированных в условиях клиностатирования, составляет

гас

время культ*вмрова имя, часы

Рисунок 1. Пролиферативная активность культивируемых ЭК человека при длительней клиностатиро ванин (р<0,01, начиная с 48 часов воздействия).

300

аром кульпюироаания, часы

Рисунок 2. Продукция ИЛ-6 контрольными и клиностатируемьши ЭК человека (« - р<0,05, ** - р<0,01 по сравнению с контролем).

670+52 клеток на 1 мм2, а максимальная плотность контрольных культур равна 820+25 клеткам на 1 мм2.

Таким образом, данное исследование продемонстрировало и подтвердило значительное снижение пролиферативной активности ЭК человека в условиях длительного клиностатирования по сравнению со стандартными условиями культивирования, что свидетельствует о гравитационной чувствительности эндотелия in vitro.

Ремоделирование танинового цитоскелета ЭК человека при клиностатировании. Актиновый цитоскелет является одной из наиболее лабильных структур клетки, быстро реагирующих на изменение окружающей среды, в том числе микрогравитации, что выражается в реорганизации его архитектуры [Hughes-Fulford, Lewis, 1996; Lewis et al., 1998]. Эти данные в совокупности с полученными раннее доказательствами перестройки актинового цитоскелета конфлуэнтных культур ЭК человека [Романов, Буравкова, 2001] поставили вопрос о динамике изменений в структуре цитоскелета на ранних и длительных сроках воздействия у пролиферирующих ЭК, а также о возможности его ремоделирования при возвращении клеток к нормальным условиям культивирования.

В контрольных пролиферирующих культурах ЭК, окрашенных через сутки после начала эксперимента, F-актин был представлен организованной сетью филаментов, расположенных как в центре клетки, так и по ее периферии. Эта картина не изменялась в контрольных клетках до конца эксперимента (рис.ЗА,Б). Через 2 ч клиностатирования выявлялись клетки с ярко очерченным краем, обогащенным F-актином. Количество фибрилл в центре заметно уменьшалось по сравнению с контрольными клетками, и волокна становились более тонкими (рисЗВ). Через 24 ч наблюдалась полная перестройка актинового цитоскелета: тонкие филаменты, перераспределенные к периферии клетки, и практически свободная от актиновых фибрилл центральная часть. В то же время в большинстве клеток в области межклеточных контактов формировался так называемый «волнистый» край, обогащенный F-актином. Кроме этого в культивируемых ЭК наблюдались глыбки неструктурированного актина (рисЗГ). Увеличение длительности клиностатирования до 144 ч не выявило каких-либо дополнительных перестроек архитектуры цитоскелета по сравнению с 24-часовой экспозицией (рис.ЗД).

Для анализа возможности восстановления архитектуры цитоскелета ЭК после длительного воздействия исследовали культуры, клиностатированные в течение 144 ч и затем помещенные на 24 ч в нормальные условия, подобно контролю. После периода реадаптации структура актинового цитоскелета клиностатированных ЭК практически не отличалась от контрольных клеток (рис. ЗЕ). Эксперименты, проведенные на культурах ЭК

Рисунок 3. Структура актинового цитоскелета контрольных и клиностатируемых ЭК человека. А - контроль, 24 часа культивирования, Х600; Б - контроль, 144 ч культивирования, Х600; В-клиностат, 2 часа культивирования, Х945; Г - клиностат, 24 часа культивирования, Х945; Д - клиностат, 144 часа культивирования, Х600; Е - клиностат, 144 часа клиностатирования и 24 часа культивирования в стандартных условиях, Х600.

человека в условиях вертикального клиностатирования, выявили сходные изменения актинового цитоскелета.

Полученные данные свидетельствуют о том, что цитоскелет культивируемых ЭК является структурой, чувствительной к изменению направления вектора гравитации, и его реорганизация начинается уже в первые часы клиностатирования. Ремоделирование актинового цитоскелета в ответ на изменение гравитационного окружения носит обратимый характер и протекает быстрее, чем его восстановление.

Участие цитоскелета в сигнальной трансдукции и переходе клеток из стадии покоя к стадии активной пролиферации, его чувствительность к изменениям гравитации, были показаны в работе Ингбера [Ingber, 1999]. Было отмечено, что группа высокоаффинных рецепторов ростовых факторов концентрируется на комплексах фокальной адгезии, тесно связанных с актиновыми филаментами [Ingber, 1999]. Микрофиламенты, связанные с ними Rho ОТРазы и интегрины, по данным ряда исследователей, оказывают значительное влияние на процессы клеточного цикла и клеточную пролиферацию [Boyd et al., 1995; Ingber et al, 1995; Iwig, 1995; Ridley, 1995].

Таким образом, приведенные данные позволяют предположить тесную взаимосвязь между выявленными нами реорганизацией актинового цитоскелета и снижением пролиферативной активности ЭК и выдвинуть гипотезу, что изменения актиновой сети являются одним из важных компонентов перестройки клеточной структуры, приводящей к снижению скорости пролиферации в условиях измененного вектора гравитации. Наблюдаемая реорганизация актинового цитоскелета может носить приспособительный характер.

Определение количественного содержания иитоокинов в культуральной среде ЭК человек при клиностатировании. Экспрессия ИЛ-6 в клетках in vitro может регулироваться механическим [Kawai et al., 2002; Kobayashi et al., 2003] и, в частности, гравитационным стимулом [Kumei et al., 1996; Lambert et al., 2000]. Вероятно, данный цитокин участвует в сигнальных путях механотрансдукции в клетке [Kawai et al., 2002; Lambert et al., 2000]. Эти данные позволили предположить, что в условиях постоянно изменяющегося направления вектора гравитации продукция ИЛ-6 эндотелиальными клетками будет изменяться, подтверждая гипотезу о чувствительности ЭК не только к механическому напряжению и «сдвигу жидкости» (shear stress), но и к гравитационному стимулу.

Результаты экспериментов показали, что после 3 ч воздействия постоянно изменяющегося вектора гравитации не происходит повышения продукции ИЛ-6 клиностатируемыми культурами (рис.2). Значительное увеличение экскреции ИЛ-6 ЭК в

среду инкубации наблюдается через 5 ч клиностатирования по сравнению с контрольными культурами (р<0,05). Продукция ИЛ-6 продолжала нарастать в течение 24 ч воздействия и была почти в 2,5 раза выше концентрации ИЛ-6 контрольных клеток (р<0,01).

Сходные результаты были показаны в экспериментах с механической стимуляцией, выполненных также на эндотелиальных клетках пупочной вены человека [Sasamoto et al., 2004]. В условиях механического растяжения (напряжения) увеличивались экспрессия тРНК ИЛ-6 и синтез ИЛ-6 через активацию интегринов и сигнального каскада, включающего протеинкиназу С (РКС) и ядерный фактор траскрипции NF-kB.

Исследования других цитокинов (VEGF, ИЛ-1а и ФНО-а) выявили их следовые количества в культуралъной среде как контрольных, так и клиностатированных ЭК.

Полученные результаты и литературные данные позволяют предположить, что любое изменение механической нагрузки со знаком «+» или «-» вызывает реакции стрессового характера, модифицирующиеся по мере адаптации клеток к новым условиям существования. Повышенная продукция ИЛ-6 эндотелиальными клетками в период до 24 часов клиностатирования по сравнению с контрольными образцами, позволяет предположить, что при изменении гравитационного сигнала в комплексный ответ ЭК на стимуляцию вовлечены интегрины и протеинкиназа С.

Исследование экспрессии молекул клеточной адгезии при клиностатировании. В условиях измененной силы тяжести рядом исследователей отмечается изменение адгезивных свойств клеток in vitro [Таирбеков, 1997; Dintenfass et al., 1986, 1990]. На модификацию адгезивных свойств эндотелия косвенно указывают также увеличение «распластывания» клеток на субстрате и повышение их миграционной активности [Буравкова, Романов, 2001] при клиностатировании. Одной из причин этого может быть быть индукция экспрессии молекул клеточной адгезии на поверхности ЭК. Для проверки данного предположения изучали экспрессию поверхностных молекул ICAM-1, VCAM-1 и Е-селектина. Дополнительно в экспериментах был использован фактор некроза опухолей (ФНО-а), повышающий экспрессию адгезивных молекул на поверхности эндотелия.

Исследования, проведенные совместно с д.б.н. ЮЛ. Романовым, показали, что контрольные ЭК, за редким исключением, не содержали на своей поверхности определяемых количеств Е-селектина и VCAM-1, но были положительными к ICAM-1 (табл.1). Это подтверждает эксперименальные данные о низком спонтанном уровне экспрессии молекул исследуемых молекул адгезии. Добавление провоспалительного цитокина ФНО-а уже в течение 6 - 8 ч индуцировало экспрессию Е-селектина и VCAM-1 и приводило к значительному повышению ICAM-1. Через 24 ч клиностатирования неактивированные клетки аналогично контролю практически не экспрессировали Е-

селектин и VCAM-1, но интенсивность окрашивания на ICAM-1 значительно возрастала. В ответ на добавление ФНО-а экспрессия Е-селектина и VCAM-1 была значительно ниже при клиностатировании, а экспрессия ICAM-1 существенно увеличивалась. Результаты экспериментов позволяют предположить, что такие изменения экпрессии молекул адгезии могут модифицировать способность ЭК взаимодействовать с клетками крови, что подтверждается результатами экспериментов межклеточного взаимодействия между эцдотелием и лимфоцитами [Romanov, Buravkova, 2004]. Вероятно, в основе нарушения процессов клеточного взаимодействия лежит блокирование селектин-зависимого механизма распознавания клеток.

Таблица. 1. Экспрессия молекул клеточной адгезии ЭК человека в условиях кляностатирования.

ФНО-а Е-селектин VCAM-1 ICAM-1

контроль +

добавление ++ -н-ъ ++

клиностат - - ++

добавление + + +++

Таким образом, регистрируемые при клиностатировании снижение пролиферативной активности культивируемого эндотелия, перестройка актинового цитоскелета, повышенная продукция ИЛ-6 и изменение экспрессии молекул клеточной адгезии свидетельствуют о модификации морфофункционального статуса и восприимчивости к гравитационному стимулу ЭК человека.

Исследование влияния клииостатирования на культуру МСК человека.

Культивирование МСК человека. Исследования показали, что в первичных культурах мезенхимальные стволовые клетки человека, выделенные из костного мозга, формировали типичные колонии адгезивных, активно пролиферирующих фибробластоподобных клеток и достигали стадии субконфлуэнта к концу второй недели. МСК 2, 3 и 6-го пассажей представляли собой гомогенную и однородную по морфологии популяцию, что свидетельствовало об оптимальных условиях культивирования, позволяющих удерживать клетки от процессов спонтанной дифференцировки. Время культивирования от момента

пассирования клеток до достижения культурой стадии конфлуэнта составляло пять - семь дней, и было практически одинаковым на всех изученных нами пассажах.

Идентификация выделенных и культивируемых МСК с помощью проточной цитофлуориметрии показала, что клетки экспрессировали следующие клеточные маркеры: HLA class I, CDw90, CD105, a-SMA, коллаген I, фибронектин и виментин, и не экспрессировали HLA-DR, CD34, CD36, CD38, CD45, CD106, CD117. Таким образом, по морфологическим свойствам и результатам иммунофенотипирования клеток можно сделать вывод, что культуры МСК по своим характеристикам обладали свойствами, сходными с описанными в литературе [Minguell et al., 2001; Jones et al., 2002; Lee et al., 2004; Pittenger, Maitin, 2004].

Пролиферативной активность МСКчеловека при клиностатировании. Выявленные нами изменения актинового цитоскелета и пролиферации ЭК человека при клиностатировании, а также показанное в условиях микрогравитации снижение митогедной активности многих дифференцированных и преддифференцированных клеток [Bierkens et al., 1993; Cogoli, 1993, 1997] позволили предположить, что недифференцированные МСК также могут изменять пролиферативную активность в ответ на гравитационной стимул.

Полученные данные в экспериментах in vitro показали, что динамика снижения пролиферации МСК на разных пассажах при клиностатировании была практически одинаковой. Пролиферативная активность клиностатируемых МСК незначительно отличалась после 24 ч воздействия от пролиферативной активности контрольных МСК (рис. 5). Через 48 ч клиностатирования прирост опытных клеток составлял 41,7% по отношению к фону, а прирост контрольных клеток - 132,2%, что свидетельствовало о значительных изменениях пролиферации клиностатируемых культур. Низкая пролиферация сохранялась в последующем и незначительно возрастала после перевода клеток на 24 ч в стандартные условия после 144 ч воздействия измененного вектора гравитации. Максимальная плотность культур МСК, сформированных в условиях клиностатирования составляла 119±35 клеток на 1 мм2, а максимальная плотность контрольных культур равнялась 222±21 клеткам на 1 мм2.

Снижение пролиферативной активности МСК, относящихся к достаточно быстро пролиферирующим культурам [Tocci, Fortel, 2003], может указывать на протекание серьезных перестроек в клетках при клиностатировании. Ряд исследователей считает, что пролиферация или клеточный цикл могут быть связаны с направленностью дифференцировки [Shao, Lazar, 1997; Fajas, 2003; McBeath, 2004]. Это позволило предположить, что выявленное снижение пролиферации может отчасти активировать дифференцировочные процессы в МСК человека.

ПС

время культивирования, часы

Рисунок 5. Пролиферативная активность культивируемых МСК человека при длительном клиностатировании (р<0,01, начиная с 48 ч воздействия).

Ш контроль

**

йклиностат * юяюн

4 в

время культивирования, часы

Рисунок 6. Продукция ИЛ-6 контрольными и клиностатируемыми МСК человека (* - р<0,01, * '* - р<0,05 по сравнению с контролем).

Ремоделирование малинового цитоскелета МСК неломка в условиях клиностатирования. Влияние измененного направления вектора гравитации на структуру актинового цитоскелета мезенхимальных стволовых клеток было изучено после 2, 4, 6, 8, 24 ч клиностатирования. Показано, что в контрольных пролиферирующих культурах, окрашенных после 6 и 24 ч культивирования, F-актин был представлен организованной сетью филаментов, расположенных как в центре клетки, так и по ее периферии (рпс.7А,Б). После 2 ч клиностатирования большое число клеток изменяли свои очертания, приобретая «амебоидную» форму. Края клеток становились неровными, с многочисленными выемками, происходило некоторое утончение микрофиламентов (рис.7В).

Через 4 ч воздействия клетки сохраняли «амебоидную» форму, у некоторых из них усиливалось образование выемок на границах. Края клеток становились более ярко очерченными и «сворачивались» у некоторых клеток. Наблюдалось снижение количества филаментов в клетках и их истончение (рис.7Г). После 6 ч клиностатирования отмечалось усиление тенденций «сворачивания» клеток и утончения фибрилл (рис.7Д). Визуализация актиновых филаментов клеток, клиностатируемых в течение 8 ч выявило аналогичную картину структуры цитоскелета. Через 24 ч клиностатирования клетки сохраняли измененную форму с неровными краями, однако уменьшалось количество «свернутых» клеток. Наблюдалось некоторое утолщение филаментов клеток по сравнению с 4 - 8 ч клиностатирования, которое, однако, не достигало контрольного состояния (рис.7Е).

Изучение свойств низкодифференцированных клеток позволило предположить, что реорганизации клеточной структуры МСК могут быть связаны с модификацией их статуса «стволовости». Данные, представленные в литературе, свидетельствуют, что изменения экспрессии интегринов, кадгеринов и цитоскелетных белков во время коммитирования стволовых клеток определяют дальнейшую морфологию и судьбу клеток [Gumbiner, 1996]. Следует также отметить, что состояние сети актиновых филаментов по-разному действует на процессы дифференцировки клеток. Так, разрушение актинового цитоскелета способствует адипогенной дифференцировке [Spiegelman, Ginty, 1983; Fernandez, Ben-Ze'ev, 1989]. Остеогенная дифференцировка требует присутствия неповрежденного, интактного цитоскелета [Toma et al, 1997; Pavalko et al., 1998]. Таким образом, приведенные данные предполагают важную роль организации актинового цитоскелета в процессах коммитирования клеток. Модификация актинового цитоскелета гравичувствительных клеток [Hughes-Fulford, 2001; Rucci et al., 2002] при изменении гравитационного сигнала позволяют предположить, что перестройка F-актина и снижение пролиферативной активности этих клеток в условиях клиностатирования могут свидетельствовать о гравитационной чувствительности МСК человека. Эти доводы

Рисунок 7 Структура актинового цитоскепета контрольных и кпиностатируемых МСК

четовска

А - контроль 6 часов культивирования, Б - контроль, 24 ч культивирования, В - клиностат, 2 часа культивирования. Г - клиностат, 4 часа культивирования, Д - клиностат. 6 часов культивирования. Е - клиностат. 24 часа культивирования Х945

поддерживаются высокой чувствительностью МСК к восприятию внешних сигналов, в том числе из их микроокружения [Bianco, 2002]. Показанные перестройки актинового цитоскелета и снижение пролиферативной активности МСК позволяют предположить изменение функциональной активности и модификацию статуса стволовых клеток, а также возможное начало клеточного коммитирования.

Определение количественного содержания цитокинов в кулътуральной среде МСК человека при клиностатировании. В результате проведенных экспериментов было показано, что одновременно со снижением скорости пролиферации МСК возрастает секреция ИЛ-б в клиностатированных культурах, причем контрольные культуры при большем количестве клеток продуцируют меньше ИЛ-б (рис. 6). Увеличение продукции ИЛ-6 наблюдалось в течение 4-6 ч клиностатирования (р<0,01). Через 24 ч воздействия разница между уровнем экспрессии ИЛ-6 контрольных и клиностатируемых клеток была менее выраженной (р<0,05).

Исследования других цитокинов (VEGF, ИЛ-lö и ФНО-а) выявили их следовые количества в культуральной среде как контрольных, так и клиностатированных ЭК.

Анализ литературных данных и полученных нами результатов позволяет сделать вывод о том, что высокая продукция ИЛ-6 может свидетельствовать о протекании стрессовых реакций в стромалышх клетках костного мозга. Увеличенная экспрессия данного цитокина согласно работам, проведенным на ЭК, фибробластах и остеобластах [Lambert et al., 2000; Kawai et al., 2002; Rucci et al., 2002; Sasamoto et al., 2004], дает основание говорить о механочувствительности МСК, а также в совокупности с другими показанными структурными и функциональными изменениями - о способности мезенхимальных стволовых клеток воспринимать гравитационный стимул и реагировать на него изменениями физиологического статуса.

Иммуинофенотипирование МСК после клиностатирования. Как уже упоминалось, модификация клеточной формы, актинового цитоскелета и, соответственно, тесно связанной с ними митогенной активности клеток могут влиять на процессы дифференцировки, поэтому оценка статуса МСК по экспрессии маркеров являлась одной из задач работы.

При клиностатировании не было обнаружено достоверных изменений в экспрессии а-SMA между контролем и культурами, клиностатируемыми на стадии субконфлуэнта в течение 72 ч (35,51+2,72% против 38,93+3,15% от общего количества клеток), а также между контрольными МСК и клетками, клиностатируемыми на стадии активной пролиферации в течение 144 ч (27,34+3,51% против 31Д1+2,32%). Напротив, выработка

Контроль Клиностат

1

N тЧ a-SMA N d a-SMA

4» с О 72ч к 4» С 3 ■ £ 72ч Ль

г Гт в J 1

S 1 ¡ГОД ТТЯИ^ПЯ^^ИГТТЯЯ!

. 1 1008 FITC 1 1000 FITC

1 1

о «0 HLA class I N 1Л HLA class I

Count Г Count Л™'

В , J4 в г \

. 1 1880 FITC . 1 1888 FITC

и га CD105 N 10 CD105

4» е 3 ■ 0 и , 72 ч А 4* С S ■ 0 и Л "

S J 1\ в / \

1 1008 FITC 1 1008 FITC

Рисунок 8. Экспрессия маркеров МСК человека при длительном клиностатировании по результатам проточной цитофлуориметрии.

молекул антигенов HLA class I МСК достоверно понижалась после 144 ч клиностатирования пролиферирующих культур по сравнению с контрольными клетками (клиностатаруемые МСК - 40,7±11,77%, контроль - 60,55+9,15% от общею количества клеток). Экспрессия CD 105 также снижалась в субконфлуэнтных клиностатируемых культурах по сравнению с контрольными клетками (клиностатируемые МСК - 7,73±3,49%, контрольные — 29,78±4,27%). Результаты проточной цитофлуориметрии одного из экспериментов представлены на рисунке 8.

Интересно, что экспрессия a-SMA культивируемыми стромальными клетками может быть связана с фазами роста культуры [Blank et aL, 1990; Peled et al., 1991] и указывает на миовдную дифференцировку, по крайней мере, in vitro [Preston et al., 2003]. Возможно, выявленная тенденция к увеличению экспрессии a-SMA в культурах, клиностатируемых на стадии пролиферации, связана с обнаруженным ранее угнетением пролиферативной активности клеток. Следует отметить, что механическое воздействие может регулировать выработку a-SMA у миобластов и мезенхимальных стволовых клеток [Peled et al, 1991;Tomasek et al., 2002; Park et al, 2004].

Изменение экспрессии CD 105 и HLA class I также может указывать на серьезные перестройки культивируемых МСК при клиностатировании. Известно, что CD105 является рецептором трансформирующего ростового фактора- и, следовательно, может быть вовлечен в регулирование клеточной адгезии, пролиферации и миграции. Данный факт позволяет предположить, что уменьшение экспрессии CD105 в клиностатируемых МСК может быть связано с откреплением клеток и снижением пролиферативной активности культур, подвергавшихся воздействию. Понижение экспрессии уровня HLA class I может вызывать изменение иммунологических реакций клеток, в том числе снижение возможности «узнавания» МСК клетками иммунной системы.

Таким образом, обнаруженные структурные и функциональные изменения в культуре МСК костного мозга человека, включая снижение пролиферативной активности, реорганизацию актинового цитоскелета, изменение экспрессии клеточных маркеров и повышение продукции ИЛ-6, свидетельствуют о гравитационной чувствительности этого типа клеток. Выявленные признаки модификации клеток являются доказательством значительных, хотя и обратимых функциональных и структурных перестроек биохимических и физиологических процессов в МСК человека in vitro. Полученные результаты указывают на преобразование статуса МСК при изменении гравитационной стимуляции, что позволяет предположить возможность индукции дифференцировки в этих условиях.

выводы

1. Моделируемое изменение гравитационного окружения с помощью клиностатирования приводит к снижению пролиферации ЭК и MCK in vitro. После возвращения клеток в стандартные условия культивирования пролиферативная активность восстанавливается до нормального уровня.

2. Актиновый цитоскелет ЭК и МСК человека является структурой, восприимчивой к постоянному изменению направления вектора гравитации, и его реорганизация начинается уже в первые часы клиностатирования и завершается через 24 ч. Изменение структуры актииовых филаментов ЭК сохраняется при увеличении времени воздействия до 144 ч.

3. Ремоделирование актинового цитоскелета ЭК человека в ответ на изменение гравитационного окружения носит обратимый характер. Восстановление структуры актиновых филаментов протекает несколько медленнее, чем ее перестройка, вызываемая постоянным изменением вектора гравитации.

4. Клиностатирование неактивированных ЭК в течение 24 ч приводило к увеличению экспрессии ICAM-1. Добавление провоспалительного цитокина ФНО-а при клиностатировании не вызывало выраженного увеличения экспрессии E-селектина и VCAM-1, но повышало выработку ICAM-1. Регистрируемые изменения экспрессии молекул клеточной адгезии свидетельствуют о нарушениях процессов межклеточного взаимодействия в условиях измененного направления вектора гравитации.

5. В условиях клиностатирования in vitro происходит увеличение продукции «стрессового» провоспалительного цитокина ИЛ-6 в ЭК и МСК человека уже в первые часы воздействия, которое сохраняется в течение 24 часов клиностатирования.

6. Экспрессия клеточных маркеров CD10S и HLA class I мезенхимальных стволовых клеток человека снижается в условиях длительного воздействия измененного вектора гравитации, а экспрессия a-SMA незначительно увеличивается, что свидетельствует об изменениях фенотипа и функциональной активности МСК.

7. Различные типы культивируемых клеток, к которым относятся дифференцированные ЭК н низкодифференцированные МСК человека, обладают способностью воспринимать гравитационный стимул и демонстрируют сходные ответные реакции, проявляющиеся в снижении пролиферативной активности, увеличении продукции интерлейкина-6 и перестройке актинового цитоскелета.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Исследования изменений актинового цитоскелета эндотелиалъных клеток человека в условиях клиностатирования // Тезисы докладов Шестой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». Санкт-Петербург, 2003. С. 109 -110 (соавт. Андреева ЕА).

2. Восстановление цитоскелета культивируемых эндотелиальных клеток человека после клиностатирования // Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва, 2003. С. 14 -15.

3. Исследование процессов апоптоза культивируемых клеток методом проточной цитофлуориметрии // Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва, 2004. С. 19 - 21.

4. F-actin architecture changes ofhuman endothelial cells cultured in long-term clinorotation // Abstracts of International symposium «Biological moulity». Pushchino, 2004. P. 192 - 193 (соавт. Buravkova L.B., Romanov YuA, Buravkov S.V.).

5. The effects of clinorotation on cultured mesenchymal stem cells // Abstracts of 25* International Gravitational Physiology Meeting, 2004. P. 95. (соавт. Buravkova L.B., Romanov YuA).

6. Ремоделирование актинового цитоскелета культивируемых эндотелиальных клеток человека в условиях клиностатирования // Авиакосм, и эколог, мед, 2004. Т .38. №6. С. 56-61 (соавт. Буравкова Л Б.).

7. The primary effects of clinorotation on cultured mesenchymal stem cells // J. Gravil. Physiol.,

2004. Vol.11. №2. P. 177 -180. (соавт. Buravkova L.B., Romanov YuA).

8. Первичные эффекты, наблюдаемые при клиностатировании культивируемых мезенхимальных стволовых клеток человека // Цитология, 2004. Т. 46. №10. С. 900 -901. (соавт. Буравкова Л.Б., Романов ЮА).

9. Исследование актинового цитоскелета методом флуоресцентной микроскопии в условиях длительного клиностатирования // Тезисы VII Всероссийской конференции по патологии клетки. Москва, 2005. С. 82-83. (соавт. Буравков С.В ).

10. Исследование архитектуры актинового цитоскелета мезенхимальных стволовых клеток человека методом флуоресцентной микроскопии в условиях клиностатирования // Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва, 2005. С. 31 - 32.

Типография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД № 00595

Подписано в печать 08.06.2005 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Бумага «Снегурочка» 1,5 печ.л. Заказ № П 423

¡I

/

►ж • »«яде***«

11 ню/] 2005 ;

С Л««fíypr* ¡

Гравитация является фундаментальной основой, определяющей нормальное функционирование и морфологию организмов на протяжении всего существования органического мира. Развитие жизни на Земле происходило в условиях постоянного гравитационного поля, и как следствие, структура и функции органов, тканей и всего организма в течение длительной эволюции многих поколений приспосабливались к этим условиям.

Одним из основных факторов космического полета, изменяющим привычное существование человека, является невесомость. В настоящее время существует большое количество данных, демонстрирующих влияние измененной силы тяжести на состояние физиологических систем живых организмов [Газенко, 1984; Григорьев, Егоров, 1997; Kozlovskaya et al, 1981; Oganov et al, 2000]. Исследования, проведенные в условиях космического полета и в модельных экспериментах, свидетельствуют, что вряд ли найдется система, неизменно функционирующая в условиях гипогравитации и невесомости. И хотя клеточные механизмы наблюдаемых изменений до настоящего времени остаются не до конца ясными, совершенно очевидно, что на один из основных вопросов гравитационной биологии - о возможности влияния измененной силы тяжести на клетку, однозначно можно ответить положительно. Большое число экспериментальных данных, выполненных на разных типах клеток в условиях космического полета и моделируемой гипогравитации, неоспоримо свидетельствуют, что клетка является структурой, чувствительной к гравитационному стимулу и отвечает на него изменением структуры и функциональной активности [Таирбеков, 2002; Gmimder, Cogoli, 1988; Cogoli et al, 1989; Cogoli, Gmimder, 1991; Buravkova, Romanov, 2000].

Одним из наиболее перспективных направлений исследований в космической биологии и медицине должно стать изучение клеточных механизмов, определяющих изменения, происходящие в живом организме в условиях измененной силы тяжести, и определение компонентов, обуславливающих взаимосвязь клеточного и iv^ организменного уровня организации живой системы. Накопленный к настоящему времени экспериментальный материал о структурно-функциональной организации и морфологических характеристиках различных типов клеток в условиях измененной силы тяжести дает основание выдвинуть ряд предположений о путях и способах адаптации живых систем к условиям гипогравитации на клеточном уровне [Романов, Буравкова, 2000; Таирбеков, 2002; Cogoli et al, 1990; Lewis, 1999; Lewis, 2002]. Тем не менее, вопрос о механизмах влияния гравитационного фактора на функционирование организма человека на уровне клеточной организации крайне сложен и до сих пор остается открытым. Несомненно, что его решение важно как для формирования представлений о процессах, лежащих в основе перестроек живых организмов в условиях микрогравитации, и в первую очередь, человека, так и для использования результатов исследований в практике космической биологии и медицины с целью совершенствования систем жизнеобеспечения и разработки космических биотехнологий.

Актуальность исследования. Исследования, проведенные с использованием различных клеточных моделей в условиях реальной и моделируемой микрогравитации выявили разнообразные морфофункциональные изменения культивируемых клеток [Cogoli, Tschopp, 1984; Genty, 1993, Hammond et al, 2000;

Papaseit et al, 2000]. При этом различия в выявленных эффектах могут быть объяснены Г f как различной гравичувствительностью клеток, так и методами моделирования и исследуемыми параметрами. Концепция о гравитационной индифферентности клеток, выдвинутая в 1970ых - 1980ых годах прошлого столетия [Парфенов, 1981; Таирбеков,

Парфенов, 1981], в настоящее время существенно скорректирована [Cogoli, 1996; Schmitt et al, 1996; Lewis et al, 1998; Hughes-Fulford, 2001; Романов, Буравкова, 2000; Таирбеков, 2002].

Несмотря на широкий спектр используемых в гравитационной биологии клеточных культур, чувствительность эндотелиальных клеток к гравитационному стимулу не изучалась, хотя результаты фундаментальных исследований говорят о непосредственном участии клеточных элементов сосудистой стенки в формировании ответа организма на микрогравитацию [Convertino et al, 1997]. Например, в экспериментах с моделированием измененной силы тяжести была выявлена реорганизация структуры сосудов крыс [Мао et al, 1998]. В основе регистрируемых эффектов микрогравитации, таких как снижение объема циркулирующей крови, нарушение регуляции сосудистого тонуса, ортостатическая неустойчивость, могут лежать изменения реактивности сосудов и модификация составных компонентов сосудистой стенки, в том числе, и эндотелия [Zhang, 2001].

К тому же известно, что именно эндотелий, обладая механочувствительностью, регулирует сосудистый тонус через взаимодействие с гладкомышечными клетками [Ткачук, 1998; Tkachuk, Voyno-Yasenetskaya, 1991; Ivanov et al, 2001; Vanhoutte, Mombouli, 1996] и, следовательно, может играть важную роль в функционировании сердечно-сосудистой системы в условиях измененной гравитации. Немаловажным фактором, привлекающим внимание к исследованию свойств эндотелия, является его биологическая активность, а также участие в воспалительных и иммунных реакциях организма, регуляции кроветворения и процессов свертывания крови [Becker et al, 2000].

Снижение пролиферативной активности разных типов клеток, ингибирование митогенных сигналов в условиях микрогравитации [Rucci et al, 2002; Hughes-Fulford, Lewis, 1996], а также атрофические перестройки опорно-двигательного аппарата

Oganov et al, 1991; Шенкман, 2002], изменение способности к восстановлению и самообновлению тканей в условиях космического полета [Mitashov et al, 1996] позволяют предположить, что в основе действия механических факторов (в том числе микрогравитации) на опорно-двигательный аппарат могут лежать морфофункциональные модификации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), точнее перестройка их функциональной активности, и способности диффреренцировки в тканевые элементы. Возможно, именно такие изменения могут приводить к нарушению процессов физиологической регенерации тканей, особенно костной и мышечной, преобразованию их клеточного, белкового и минерального состава, так как известно, что обновление тканей организма человека и их репарация в случае повреждения осуществляются при непосредственном участии низкодифференцированных клеток-предшественников, так называемых «стволовых клеток».

Основным источником стволовых клеток у взрослых организмов является костный мозг, способный генерировать как гемопоэтические, так и мезенхимальные клетки, которые могут дифференцироваться в большинство известных клеточных типов, таких как остеобласты, хондроциты, адипоциты, а также другие типы клеток. Недавно несколькими исследовательскими группами описано получение эндотелиальных клеток и их предшественников из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [Reyes et al, 2002; Pittenger, Martin, 2004; Oswald et al, 2004]. Это открывает широкие перспективы для использования костномозговых клеток в терапевтических целях. МСК могут являться источником эндотелиальных клеток и участвовать в ангиогенезе трансплантированных органов, ишемических тканей и восстановлении поврежденных сосудов [Kassem et al, 2004; Tateishi-Yuyama et al, 2001; Pittenger, Martin, 2004].

Таким образом, исследования свойств низкодифференцированных мезенхимальных стволовых клеток — элемента слаженной системы функционирования органов человека в условиях измененной силы тяжести становится необходимым и важным наряду с изучением другого ее значимого компонента, тесно связанным с МСК -дифференцированным сосудистым эндотелием.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение морфофункциональных особенностей эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток человека в модельных условиях измененной силы тяжести in vitro. В соответствии с поставленной целью решались следующие основные задачи:

- исследование пролиферативной активности эндотелиальных клеток человека при длительном клиностатировании;

- изучение особенностей организации актинового цитоскелета ЭК человека в условиях измененного вектора гравитации; определение продукции цитокинов и экспрессии молекул адгезии эндотелиальными клетками при клиностатировании;

- отработка методов культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, изучение пролиферативной активности и экспрессии маркеров МСК при длительном клиностатировании; исследование особенностей организации актинового цитоскелета мезенхимальных стволовых клеток человека в условиях измененного направления вектора гравитации;

- определение продукции цитокинов МСК при длительном изменении вектора гравитации in vitro.

Научная новизна. Получены первые доказательства высокой чувствительности культивируемых ЭК пупочной вены человека и МСК костного мозга человека к изменению гравитационного окружения. Впервые выявлено угнетение пролиферативной активности культивируемого эндотелия при длительном воздействии измененного направления вектора гравитации. Впервые установлено, что реорганизация архитектуры актиновых филаментов эндотелия начинается уже в первые часы клиностатирования, при этом ремоделирование в ответ на изменение гравитационного окружения носит обратимый характер и протекает быстрее, чем его восстановление. Выявленное увеличение концентрации «стрессового» провоспалительного цитокина ИЛ-6 (интерлейкина-6) в культуральной среде эндотелиальных клеток после кратковременного клиностатирования также указывает на их чувствительность к гравитационному стимулу.

Впервые показано снижение пролиферативной активности культивируемых МСК человека при длительном клиностатировании, которое является обратимым и восстанавливается при возвращении клеток в стандартные условия культивирования. Выявлена реорганизация структуры актинового цитоскелета как в первые часы изменяющегося вектора гравитации, так и при более длительном воздействии. Установлено повышение концентрации ИЛ-6 в культуральной среде МСК человека при кратковременном клиностатировании. Впервые показано изменение экспрессии клеточных маркеров a-SMA (a-актина гладкомышечных клеток), CD 105, HLA class I при длительном культивировании под воздействием измененного гравитационного микроокружения.

Научно-практическая значимость работы. Представленные экспериментальные данные являются важным шагом на пути к пониманию механизмов действия гравитационного сигнала на клетку. Результаты исследования способствуют расширению сложившихся представлений о клеточной биологии эндотелия и мезенхимальных стволовых клеток человека в условиях измененного гравитационного окружения. Полученные данные позволяют приблизиться к более глубокому пониманию влияния измененной гравитации на низкодифференцированные стволовые и дифференцированные эндотелиальные клетки человека. Результаты работы необходимо учитывать при анализе функциональных изменений сердечно-сосудистой системы и процессов регенерации в условиях микрогравитации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментально доказана гравитационная чувствительность культивируемых эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток человека.

2. Условия измененной силы тяжести (клиностатирование) приводят к реорганизации элементов цитоскелета (F-актин) ЭК и МСК, при этом перестройка структуры актиновых филаментов носит обратимый характер.

3. При одновременном действии клиностатирования и активации клеток провоспалительным цитокином ФНО-а модифицируется экспрессия молекул клеточной адгезии (Е-селектина, VCAM-1, ICAM-1) на поверхности ЭК, что может приводить к изменению взаимодействия «клетка - субстрат» и «клетка - клетка».

4. Различные типы культивируемых клеток человека: дифференцированные (ЭК) и низкодифференцированные (МСК) демонстрируют сходные ответные реакции, проявляющиеся в снижении пролиферативной активности, увеличении продукции ИЛ-6 и перестройке актинового цитоскелета.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2003 г.), Конференциях молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2003,2004, 2005 г.), 54th International Astronautical Congress (Bremen, Germany, 2003 г.), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность», посвященном памяти академика Г.М. Франка (Пущино, Россия, 2004), 25th International Gravitational Physiology Meeting (Moscow, 2004), Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005).

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая биология и физиология».

выводы

1. Моделируемое изменение гравитационного окружения с помощью клиностатирования приводит к снижению пролиферации ЭК и МСК in vitro. После возвращения клеток в стандартные условия культивирования пролиферативная активность восстанавливается до нормального уровня.

2. Актиновый цитоскелет ЭК и МСК человека является структурой, восприимчивой к постоянному изменению направления вектора гравитации, и его реорганизация начинается уже в первые часы клиностатирования и завершается через 24 ч. Изменение структуры актиновых филаментов ЭК сохраняется при увеличении времени воздействия до 144 часов.

3. Ремоделирование актинового цитоскелета ЭК человека в ответ на изменение гравитационного окружения носит обратимый характер. Восстановление структуры актиновых филаментов протекает несколько медленнее, чем ее перестройка, вызываемая постоянным изменением вектора гравитации.

4. Клиностатирование неактивированных ЭК в течение 24 ч приводило к увеличению экспрессии ICAM-1. Добавление провоспалительного цитокина ФНО-а при клиностатировании не вызывало выраженного увеличения экспрессии Е-селектина и VCAM-1, но повышало выработку ICAM-1. Регистрируемые изменения экспрессии молекул клеточной адгезии свидетельствуют о нарушениях процессов межклеточного взаимодействия в условиях измененного направления вектора гравитации.

5. В условиях клиностатирования происходит увеличение продукции «стрессового» провоспалительного цитокина ИЛ-6 ЭК и МСК человека in vitro уже в первые часы воздействия, которое сохраняется в течение 24 часов клиностатирования.

6. Экспрессия клеточных маркеров CD 105 и HLA class I мезенхимальных стволовых клеток человека снижается в условиях длительного воздействия измененного вектора гравитации, а экспрессия a-SMA незначительно увеличивается, что свидетельствует об изменениях фенотипа и функциональной активности МСК. Различные типы культивируемых клеток, к которым относятся дифференцированные ЭК и низкодифференцированные МСК человека, обладают способностью воспринимать гравитационный стимул и демонстрируют сходные ответные реакции, проявляющиеся в снижении пролиферативной активности, увеличении продукции интерлейкина-6 и перестройке актинового цитоскелета.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многочисленные исследования свидетельствуют о серьезных перестройках живых систем в условиях реальной и моделируемой микрогравитации, механизмы которых реализуются на клеточном уровне. Восприятие гравитационного стимула и формирование ответной реакции клеткой является основополагающим фактором, запускающим сложный комплекс изменений. Несмотря на растущее число публикаций о влиянии микрогравитации на морфофункциональные характеристики различных типов клеток in vitro, механизмы наблюдаемых эффектов до сих пор остаются неизвестными. В то же время, ряд наблюдаемых клеточных изменений при действии микрогравитации аналогичен в различных клеточных культурах, что заставляет предположить вовлечение общих механизмов, независимо от клеточной сигнализации. С другой стороны, вариации в выраженности регистрируемых сдвигов и изменение экспрессии специфичных генов указывает на различную чувствительность клеток к изменению гравитационного сигнала.

Исследование свойств, эндотелия, одного из главных компонентов регуляции сердечно-сосудистой системы, является важным для формирования современных представлений о процессах, происходящих в клетке в условиях измененной силы тяжести.

Значительное снижение пролиферативной активности ЭК in vitro, выявленное уже на вторые сутки клиностатирования и сохраняющееся в течение всего времени воздействия, свидетельствует о гравитационной чувствительности эндотелия, что согласуется с данными, полученными в экспериментах с другими типами клеток [Lewis et al, 1998; Hammond etal, 1999,2000; Gubano, Lewis,2000].

Следует отметить, что исследования, проводимые в космических полетах и при клиностатировании, показывают, что в условиях измененной силы тяжести часто наряду с измененем пролиферации клеток наблюдается и модификация цитоскелета [Gruener et al, 1993; Piepmeier et al, 1997; Hughes-Fulford, Gilbertson, 1999; Vassy et al, 2001]. Сходные данные были получены нами при клиностатировании ЭК человека. Результаты наших экспериментов демонстрируют, что перестройка сети актиновых филаментов культивируемого эндотелия начинается уже в первые часы воздействия и сохраняется при длительном изменении гравитационного стимула. Следует отметить, что выявленные изменения носят обратимый характер. Полученные данные свидетельствуют о том, что цитоскелет культивируемых ЭК является структурой, чувствительной к изменению гравитационного стимула. Результаты наших экспериментов дополняют информацию о механочувстительности эндотелия и механизмах ее реализации.

Интересно, что участие цитоскелета в сигнальной трансдукции и переходе клеток из стадии покоя к стадии активной пролиферации, его чувствительность к изменениям гравитации, были показаны в работе Ингбера [Ingber, 1999]. Было отмечено, что группа высокоаффинных рецепторов ростовых факторов концентрируется на комплексах фокальной адгезии, тесно связанных с актиновыми филаментами [Ingber, 1999]. Микрофиламенты, связанные с ними Rho GTPa3bi и интегрины, по данным ряда исследователей, оказывают значительное влияние на процессы клеточного цикла и клеточную пролиферацию [Boyd et al, 1995; Ingber et al, 1995; Iwig, 1995; Ridley, 1995].

Таким образом, приведенные данные позволяют предположить тесную взаимосвязь между выявленными нами реорганизацией актинового цитоскелета и снижением пролиферативной активности ЭК и выдвинуть гипотезу, что изменения актиновой сети являются одним из важных компонентов перестройки клеточной структуры, приводящей к снижению скорости пролиферации в условиях измененного вектора гравитации.

К тому же, рядом авторов показано, что дестабилизация микрофиламентов цитохалазинами приводит к ингибированию синтеза ДНК и процессов роста [Iwing, Glaesser, 1985; McPherson, Ramachanddran, 1990; Fasshauer et al, 1998], что также подтверждает важную роль актиновых фибрилл в регуляции процессов роста и пролиферации клеток.

Не менее важную роль играет реорганизация цитоскелета в реализации процессов апоптоза, что было отмечено во многих случаях его проявления [Janmey, 1998]. Все типы филаментов, в том числе и актиновые фибриллы, реорганизуются и деградируют в процессе апоптоза [Janmey, 1998]. Выявленная нами реорганизация актинового цитоскелета свидетельствует о нарушении процессов нормальной клеточной пролиферации и, вероятно, о возможности активации апоптотических реакций в клетке. На это может указывать и значительное снижение пролиферативной активности в условиях клиностатирования. Нельзя исключить также и открепление некоторых клеток от поверхности флакона в этих условиях. В пользу этой гипотезы свидетельствуют сходные изменения в структуре актинового цитоскелета, обнаруженные при клиностатировании остеобластов, которые, по мнению исследователей, являлись причиной открепления и последующего апоптоза суспензионных клеток, вызываемых изменением вектора гравитации [Sarkar et al, 2000].

Возможно, разные типы клеток обладают общими путями механочувствительности, которые определяют, будет ли механическое воздействие индуцировать или подавлять апоптоз [Graf et al, 2003]. Вероятно, различные клетки используют общий молекулярный механизм регуляции апоптотических процессов [Graf et al, 2003]. В связи с этим интересно отметить предположение ряда исследователей, что клетки, стимулированные разными способами и обладающие разными путями механотрансдукции, проводят сигнал через сходные механизмы на молекулярном уровне [Huang, 2003]. Способность механического воздействия, например, циклического растяжения или shear stress, вызывать открепление эндотелиальных клеток человека и апоптоз активацией различных каспаз была недавно показана в работе Michel [2003], что также позволяет предполагать возможность негативного влияния самых разных механических воздействий, в том числе и измененного вектора гравитации на процессы роста и гибели клеток.

Данную гипотезу поддерживает выявленная повышенная продукция цитокина ИЛ-6 эндотелиальными клетками, экспрессия которого является чувствительной к механическому, в том числе и гравитационному стрессу [Kumei et al, 1996]. Необходимо отметить тот факт, что индукция выработки ИЛ-6 под воздействием механического стимула осуществляется по сигнальному пути, включающему в себя интегрины и протеинкиназу С [Samasoto et al, 2004].

В условиях клиностатирования наблюдается изменение экспрессии МКА на поверхности культивируемого эндотелия. Сходные ответные реакции ЭК регистрировались при воздействии потока жидкости in vitro [Nagel et al., 1994; Sheikh et al., 2003]. Интересно, что МКА структурно связаны с белками актинового цитоскелета [Mimura, Asano, 1987; Gimbrone et al., 1997], участвуют в сигнальных путях клеток, в том числе, вероятно, и в каскаде различных ростовых факторов [Lampugnani, Dejana, 1997]. Выявленные изменения, а также отмеченное в литературе участие молекул клеточной адгезии в процессах механотрансдукции [Chiu et al., 2004], позволяют предположить важную роль регистрируемого эффекта в реакциях межклеточного взаимодействия ЭК, а также в проведении гравитационного стимула в клетку.

Таким образом, регистрируемые при клиностатировании снижение пролиферативной активности, перестройка структуры актинового цитоскелета, повышенная продукция ИЛ-6 и изменения экспрессии МКА ЭК человека свидетельствуют о гравитационной чувствительности данного типа клеток. Полученные данные позволяют предположить, что в сложный процесс восприятия гравитационного стимула и формирования ответной реакции вовлечены интегрины и протеинкиназа С. Участие данных компонентов механотрансдукции в перестройке цитоскелета, процессах пролиферации, регуляции формы клеток и экспрессии большого количества молекул делает их ключевыми элементами основных биохимических реакций клетки. Это позволяет выдвинуть гипотезу, что ответ клетки на изменившиеся условия существования является комплексным и в него вовлечены все клеточные процессы и функции. Показанные изменения морфофункциональных характеристик ЭК, вероятно, могут носить приспособительный характер.

Эндотелиальные клетки являются механочувствительными клетками и, следовательно, могут быть способны к восприятию гравитационного стимула, являющегося разновидностью механического воздействия. Высокая чувствительность МСК к сигналам, поступающим из их микроокружения, а также из внешней среды, позволяет также предполагать восприимчивость данного типа клеток к механическому стимулу. Недавно было показано, что механическое растяжение регулирует экспрессию маркеров гладкомышечных клеток сосудов на мезенхимальных стволовых клетках человека и коллагена I и способно индуцировать диффренцировку в гладкомышечные клетки сосудов, что служит доказательством механочувствительности данного типа клеток [Park et al, 2004]. Способность МСК воспринимать механический стимул позволяет предположить и гравитационную чувствительность клеток. Реорганизация структуры и функциональной активности МСК и ЭК человека может лежать в основе сложного комплекса негативного влияния невесомости на организм человека или его адаптации к новым условиям существования.

Выявленное значительное снижение скорости пролиферации МСК при клиностатировании позволило предположить гравитационную чувствительность данного типа клеток. Следует отметить, что уменьшение пролиферативной активности МСК и незначительное восстановление скорости пролиферации при возвращении клеток в стандартные условия культивирования указывает на функциональные изменения в клетках и может быть связано с процессами дифференцировки.

Показанное изменение структуры актинового цитоскелета в первые часы и сутки клиностатирования также свидетельствует о чувствительности МСК к изменению гравитационного стимула.

Изучение свойств низкодифференцированных клеток позволило предположить, что реорганизации клеточной структуры мезенхимальных стволовых клеток могут быть связаны с модификацией их статуса «стволовости». Данные, представленные в литературе, свидетельствуют, что изменения экспрессии интегринов, кадгеринов и цитоскелетных белков во время коммитирования стволовых клеток определяют дальнейшую морфологию и судьбу клеток [Gumbiner, 1996]. Следует также отметить, что состояние сети актиновых филаментов по-разному действует на процессы дифференцировки клеток. Так, разрушение актинового цитоскелета способствует адипогенной дифференцировке [Fernandez, Ben-Ze'ev, 1989; Spiegelman, Ginty, 1983]. Остеогенная дифференцировка требует присутствия неповрежденного, интактного цитоскелета [Pavalko et al, 1998; Toma et al, 1997]. Сходные результаты были получены с МСК человека, в которых разрушенный химическими реагентами актин усиливал адипогенез и ослаблял процессы остеогенеза [McBeath et al, 2004]. В то же время было показано, что быстрое разрушение актинового цитоскелета является важным компонентом индуцирования нейрональной дифференцировки стромальных клеток костного мозга [Neuhuber et al, 2004]. Таким образом, приведенные данные предполагают важную роль организации актинового цитоскелета в процессах коммитирования клеток.

Регистрируемая повышенная продукция ИЛ-6 мезенхимальными стволовыми клетками в первые часы клиностатирования свидетельствует о протекании стрессовых реакций и изменении функциональной активности клеток и подтверждает гравитационную чувствительность МСК.

Выявленное увеличение секреции ИЛ-6 в совокупности с показанными функциональными и структурными перестройками стромальных клеток костного мозга позволило предположить изменение экспрессии и некоторых клеточных маркеров. Было показано, что в условиях длительного клиностатирования происходит некоторое повышение выработки a-SMA, а также более выраженное снижение экспрессии CD 105 и HLA class I. Некоторые исследователи считают, что экспрессия a-SMA находится в зависимости от стадии роста культуры [Blank et al, 1990]. Данное утверждение позволяет предположить, что некоторое увеличение экспрессии a-SMA в клиностатируемых культурах может быть связано с регистрируемым снижением пролиферативной активности МСК. Кроме этого, существуют экспериментальные данные о том, что экспрессия клеточных маркеров может изменяться под воздействием механического стимула [Park et al, 2004].

Уменьшение экспрессии CD 105, HLA class I также может указывать на перестройки фенотипа культуры МСК при клиностатнровании. Снижение выработки CD 105, являющегося рецептором трансформирующего фактора роста-p, участвующего в процессах адгезии и пролиферации, может быть связано с угнетением пролиферативной активности клиностатированных культур. Обнаруженные изменения экспрессии HLA class I позволяют предположить снижение способности «узнавания» МСК клетками иммунной системы.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о гравитационной чувствительности МСК, выраженной в виде перестроек структуры и функциональной активности клеток. Реорганизация актинового цитоскелета, изменение экспрессии клеточных маркеров, снижение пролиферативной активности и повышенная продукция ИЛ-6 могут указывать на вероятную модификацию статуса мезенхимальных стволовых клеток.

Изменения морфофункциональных характеристик дифференцированных ЭК и низкодифференцированных МСК человека в условиях постоянно изменяющегося вектора гравитации демонстрируют сходный характер ответных реакций. Можно предположить, что восприятие гравитационного стимула и реакции, формируемые данными типами клеток в ответ на изменение гравитационного окружения, протекают с вовлечением аналогичных сигнальных путей. Вероятно, ключевыми регуляторами данных процессов, приводящими к перестройкам физиологических и биохимических реакций в ЭК и МСК, являются комплексы, включающие интегрины и протеинкиназу С. Выявленные преобразования, возможно, являются приспособительными и могут быть важными компонентами системы адаптации клеток к измененным условиям существования.