Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфофункциональное обоснование эффективности ксимедона в коррекции токсической нефропатии, индуцированной цисплатином

005016011

на правах рукописи

Исак Ирина Николаевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЫЮЕ ОБОСНОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ КСИМЕДОНА В КОРРЕКЦИИ ТОКСИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ЦИСПЛАТИНОМ

14.03.02 — патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ульяновск 2012

о г > ■ -

005016011

Работа выполнена на кафедре нормальной анатомии с курсами судебной медицины, топографической анатомии и оперативной хирургии в ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева» Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Чаиркин Иван Николаевич Научный консультант: доктор медицинских наук Рагинов Иван Сергеевич Официальные оппоненты: Калмин Олег Витальевич - доктор медицинских наук, профессор ФГБОУ ВПО «Пензенский государственный университет», заведующий кафедрой анатомии человека Туманова Елена Леонидовна - доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой патологической анатомии №2 педиатрического факультета

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «16 » мая 2012г., в 12.00 часов, на заседании диссертационного совета Д 212.278.06 при ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по адресу: г. Ульяновск, Набережная реки Свияги, 106, ауд. 703.

I С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» и на сайте http://www.uni.ulsu.ru. и ЬИр//уак.ес1.§оу.ги.

| Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42, управление научных исследований.

Автореферат разослан « »_2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета _

кандидат медицинских наук, доцент Визе- Хрипунова М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Препарат платины цисплатин является основным при лечении опухолей крови [Budd G. et al., 1993], головы и шеи [Baur М. et al., 2002], легких [Scagliotti G. et al., 2002], пищевода [Ajani J. et al., 2002], толстого кишечника [Giacchetti S. et al., 2000], матки [Ajani J. et al., 2001], яичек [Osanto S. et al., 1992], яичников [Misset J. et al., 2001] и мочевого пузыря [Bellmunt J. et al., 1997]. Однако, применение цисплатина сопровождается нейро-, ото- и нефротоксичностью, что ограничивает его терапевтический потенциал. Прямая токсичность в отношении эпителия почечных канальцев была зафиксирована вскоре после начала клинического применения препарата [Gonzales-Vítale V. et al., 1978].

Препараты платины проявляют цитотоксический эффект, оказывая непосредственное повреждающее действие на ДНК и стимулируя образование свободных радикалов [Townsend J. et al., 2003]. В многочисленных исследованиях было показано, что антиоксиданты оказывают выраженный цитопротективный эффект в отношении эпителия почечных канальцев на фоне введения цисплатина [Uzunoglu S. et al., 2010; Rodrigues M. et al., 2011]. Однако, в настоящее время только один препарат — амифостин, разрешен к клиническому применению в качестве цитопротектора при использовании цисплатина [Kouvaris J. et al., 2007], но ряд исследований ставят под сомнение его эффективность [Sastry J., Kellie S., 2005; Gallegos-Castoreña В. et al., 2007; Uzunoglu S. et al., 2010].

Показано, что поврежденные клетки выделяют пиримидиновые и пуриновые нуклеотиды [Schwiebert Е., Zsembery А., 2003], которые, связываясь с Р2У-рецепторами на других клетках, активируют в них пролиферацию, миграцию [Weinger R. et al., 2005], дифференцировку и выживание [Erlinge D., 2011]. В здоровой почке пиримидины паракринным и аутокринным способами регулируют канальцевую реабсорбцию воды и

электролитов [Vallon V., Rieg T., 2011]. Активация Р2У2-рецепторов оказывает сосудорасширяющий эффект и ингибирует реабсорбцию электролитов [Vallon V, Rieg T., 2011]. В исследованиях in vitro введение агониста Р2У2-рецепторов на 60% уменьшает объём клеток канальцев, что сопровождается значительным уменьшением внутриклеточного содержания ионов калия и хлора [Koltsova S. et al., 2011].

Перспективным в направлении снижения нефротоксичности при введении цисплатина представляется изучение лекарственного средства из группы производных пиримидина ксимедона. Данный препарат длительное время используется в клинической практике как стимулятор репаративных процессов в послеоперационном периоде [Измайлов С.Г. и др., 2001]. Ксимедон оказывает цитопротективное действие, поддерживая экспрессию антиапоптозного белка Вс1-2 и снижая внутриклеточную концентрацию ионов Са2+ [Рагинов И.С. и др., 2006], и, что более перспективно в плане профилактики цисплатиновой нефротоксичности, препарат оказывает выраженный стимулирующий эффект на репарацию ДНК [Черепнев Г.В., 2001].

Цель исследования: Морфофункциональная оценка роли ксимедона и участия Р2У-рецепторов в нефропротекции при цисплатиновой нефропатии.

Задачи исследования:

1. Исследовать морфологические аспекты поражения почек при цисплатиновой нефропатии и определить корреляционную связь между степенью нарушения функциональных тестов (уровня мочевины и креатинина) и глубины морфологических изменений в паренхиме почек.

2. Изучить изменение морфометрических показателей кпубочкового и канальцевого аппарата почек при цисплатиновой нефропатии и под влиянием ксимедона.

3. Определить изменение экспрессии Р2У1- и Р2У2-рецепторов в клетках нефрона в норме и на модели цисплатиновой нефропатии.

4. Изучить роль Р2У1- и Р2У2-рецепторов в нефропротекции ксимедона при цисплатиновой нефропатии путем их экспрессии в клетках нефрона.

5. Оценить влияние ксимедона на уровень апоптоза в клетках нефрона при введении препарата на фоне цисплатиновой нефропатии.

Научная новизна исследования. Установлено, что под влиянием цисплатина происходит уменьшение экспрессии Р2У2-рецепторов в эпителиальных клетках проксимальных извитых канальцев нефрона, что морфологически выражается их гибелью путем апоптоза и некроза. Экспрессия Р2У1-рецепторов, выявленная в мезангиальных клетках сосудистых клубочков, не влияет на развитие цисплатиновой нефропатии.

Выявлено, что препарат из группы производных пиримидина ксимедон поддерживает активность Р2У2-рецепторов в эпителиальных клетках проксимальных канальцев нефрона, что подтверждается усилением степени экспрессии названных рецепторов в паренхиме почек. Ксимедон, начиная с ранних сроков развития цисплатиновой нефропатии, улучшает показатели функциональных почечных тестов (снижает уровень мочевины и креатинина в крови), сохраняя этот эффект на всех последующих сроках тестирования.

Установлено что ксимедон оказывает достоверный нефропротекторный эффект в отношении эпителия проксимальных извитых

канальцев нефрона, тем самым препятствует возникновению выраженных дистрофических и некротических изменений в канальцевом аппарате почек и развитию тяжелой цисплатиновой нефропатии.

Научно-практическая значимость.

Показана роль Р2У-рецепторов в развитии токсического цисплатинового повреждения проксимальных канальцев почек, что расширяет существующее представление о патогенезе этого осложнения при использовании препаратов платины, а также представлены доказательства роли Р2У2-рецепторов в нефропротекции ксимедона при

цисплатиновой нефропатии.

Полученные данные о роли Р2У-рецепторов в развитии цисплатиновой нефропатии дают возможность искать пути защиты органов-мишеней при использовании в онкологической практике высокоэффективного химиопрепарата цисплатина.

Морфологическое подтверждение нефропротекторной активности ксимедона при цисплатиновой нефропатии, полученное в ходе проведенного исследования, позволяет рекомендовать препарат к клиническому исследованию по его применению в комплексной профилактике осложнений в терапии онкологических заболеваний препаратами платины.

Положения, выносимые на защиту

1. Химиопрепарат цисплатин, используемый при лечении онкологических заболеваний, вызывает токсическую нефропатию, реализуя свое действие на эпителиальные клетки проксимальных извитых канальцев через торможение (блокаду) в них Р2У2- рецепторов, что подтверждается снижением и исчезновение экспрессии Р2У2- рецепторов в проксимальных канальцах на фоне приема цисплатина.

2. Цитопротектор ксимедон, активируя Р2У2- рецепторы в эпителиальных клетках проксимальных канальцев, осуществляет нефропротекцию, в результате чего мы наблюдали повышение степени экспрессии Р2У2- рецепторов в эпителиоцитах проксимальных канальцев почек.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре патологии с курсом патологической физиологии медицинского института Мордовского государственного университета им.Н.П. Огарева, на кафедре клинической морфологии и судебной медицины с курсом онкологии ФГБОУ ВПО «Пензенский государственный университет», на кафедре общей и клинической патологии: патологическая анатомия, патологическая физиология ГБОУ ВПО «СамГМУ Минздравсоцразвития России».

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе три статьи в журналах, рекомендованных ВАК. На XIII научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2008); XXXVII научной конференции «Огаревские чтения» Мордовского госуниверситета (Саранск, 2008); XXXVIII научной конференции «Огаревские чтения» Мордовского госуниверситета (Саранск, 2009); XIV научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского университета (Саранск, 2010).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 223 источника. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 рисунками и 6 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Характеристика экспериментального материала Экспериментальная часть исследований включала создание модели токсической нефропатии путем введения химиопрепарата цисплатана в дозе эквивалентной курсовой дозе при лечении онкологических больных на нелинейных беспородных белых крысах. Далее на модели цисплатиновой нефропатии изучался нефропротекторный эффект цитопротектора ксимедона, зарекомендовавшего себя как препарат с высокой репаративной активностью.

Эксперименты проведены на 220 животных (нелинейные половозрелые белые крысы) обоего пола, массой тела 180 - 220 г. Животных содержали в виварии в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» (от 6.04.1993г.). Кормили в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР от 10.03.1996 г. № 163. Все эксперименты выполнены в соответствии с правилами бережного обращения с лабораторными животными в соответствии с Приложением 4 к

приказу № 755 МЗ СССР.

Токсическая нефропатия у 110 животных воспроизводилась путём внутрибрюшинного введения цисплатана в дозе 2 мг/кг 2 раза в неделю [Dickey et al., 2008]. Половине этих животных, начиная с первого дня эксперимента, внутрибрюшинно вводили агонист Р2У-рецегтторов производное пиримидина ксимедон в терапевтической дозе 30 мг/кг. 55 животным аналогично вводили только ксимедон, без цисплатана. 55 животных служили контролем и им производили инъекции эквивалентного

объема физиологического раствора.

В ходе эксперимента изучались морфологические изменения в ткани почек на разных сроках введения цисплатана и ксимедона. При морфологическом исследовании нефропротекторной активности ксимедона

э

морфологическом исследовании нефропротекторной активности ксимедона на модели цисплатиновой нефропатии использовались рутинные методы окраски гистологических срезов (гематоксилином и эозином), осуществлялось морфометрическое исследование структурных компонентов паренхимы почек. Проводилось иммуногистохимическое исследование на экспрессию Р2У1- Р2У2-рецепторов в канальцах и клубочках почек. А также проводили оценку апоптоза на фоне введения ксимедона при цисплатиновой нефропатии.

На протяжении всего эксперимента у животных изучались функциональные почечные тесты (определялся уровень креатинина и мочевины в крови).

В сыворотке крови с помощью реакции Яффе (метод Поппера) определяли креатинин.

Общегистологические и морфометрические исследования проводили на поперечных парафиновых срезах почек толщиной 5-6 мкм, окрашенных гематоксилином-эозином.

Морфометрические исследования паренхимы почек включали определение площади почечного тельца (мкм2), площади капиллярных петель клубочка (мкм2), площади мочевого пространства (мкм2), диаметра проксимального извитого канальца (мкм), диаметра просвета проксимального извитого канальца (мкм), площади проксимального извитого канальца (мкм2), диаметра дистального извитого канальца (мкм), диаметра просвета дистального извитого канальца (мкм), площади дистального извитого канальца (мкм2).

Илшуногистохимические методы. Для выявления Р2У1- Р2У2-рецепторов в почке применяли ЬБАВ-кк (ЭАКО, Дания) с использованием вторичных антител конъюгированных со щелочной фосфатазой. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали, после чего помещали в физиологический раствор на Трис-НС1 буфере, рН 7,6 (ТБС). Удаляли лишнюю жидкость вокруг срезов и раскапывали на срезы

первичные антитела к P2Y1- или Р2У2-рецепторам в разведении 1:100. Инкубировали во влажной камере 30П-60 мин при комнатной температуре. Промывали в трех сменах ТБС. Удаляли лишнюю жидкость вокруг срезов и раскапывали вторичные антитела (конъюгированные со щелочной фосфатазой). Инкубировали 20П-30 мин во влажной камере. На срезы наносили 80-100 мкл свежеприготовленного субстрата для выявления активности щелочной фосфатазы с хромогеном прочный синий ВВ. Промывали в дистиллированной воде и заключали в глицерин-желатину. Оценка апоптоза в структурных элементах паренхимы почек: Апоптоз изучали с помощью иммуноцитохимического пероксидазного метода TUNEL, основанного на выявлении фрагментированных цепочек ДНК. Для выявления TUNEL-позитивных структур использовали набор реактивов Apoptag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon).

Для измерения связи между параметрами функциональных почечных тестов и морфометрических показателей, а также степени экспрессии P2Y1-или Р2У2-рецепторам в паренхиме почек высчитывали коэффициент корреляции (гху) по способу квадратов Пирсона.

Статистическую обработку проводили с использованием пакета прикладных программ для статистических обработок данных Microsoft Excel - 2007, используя критерии достоверности (р) по Стьюденту.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе проведенного экспериментального исследования к 15-м суткам от начала моделирования цисплатиновой нефропатии у тестируемых животных наблюдалось снижение функциональной способности почек в 100% случаев, что подтверждается анализом функциональных почечных проб (уровнем мочевины и креатинина). По сравнению с контролем уровень креатинина с 15 дня введения цисплатина возрастает более чем в два раза (0,09±0,01) при контрольных значениях креатинина 0,04±0,01 и в

дальнейшем данный показатель увеличивается, достигая к 60-м суткам эксперимента до 6-ти кратного увеличения (0,25±0,01).

Введение ксимедона в течение 60-и суток здоровым животным не влияет на уровень креатинина, который соответствует значениям у контрольных животных.

Начиная с 15-х суток эксперимента, введение ксимедона на фоне цисплатиновой нефропатии способствует снижению уровня креатинина и на 30-е сутки под влиянием ксимедона его уровень достоверно ниже на 22%(Р<0,05) и составляет 0,07±0,01. На сроках 45-ти и 60-ти суток от начала эксперимента под влиянием ксимедона уровень креатинина также достоверно ниже показателей при цисплатиновой нефропатии и разница составляет 29%(Р<0,05) и 32%(Р<0,05) соответственно.

Показатели уровня мочевины также возрастали по мере увеличения срока введения цисплатина и существенно были ниже при использовании

ксимедона (табл.1)

Таблица 1

Показатели мочевины в крови на разных с роках эксперимента

Группа 15 суток 30 суток 45 суток 60 суток

Контроль 4,2±0,21 4,3±0,18 4,3±0,14 4,3±0,19

Ксимедон 4,2±0,19 4,3±0,05 4,3±0,16 4,3±0,18

Цисплатин 22,5±0,82* 25,0±0,91* 34,3±1,26* 35,0±1,24*

Ксимедон + цисплатин 19,3±0,96* 20,1±0,87** 24,4±1,02** 26,5±1,11**

* — Р<0,05 при сравнении с контрольной группой ** — Р<0,05 при сравнении с цисплатиной группой

Морфологическое исследование почек экспериментальных животных показало, что, начиная с 15-х суток от начала введения цисплатина, в интерстиции почек наблюдается выраженный отек, лимфоцитарная и нейтрофильная инфильтрация диффузного характера, полнокровие в сосудах среднего и мелкого калибра, на отдельных участках встречаются диапедезные кровоизлияния. Существенные изменения выявляются в

проксимальных извитых канальцах: набухание эпителиальных клеток, снижение базофилии в ядрах отдельных эпителиоцитов. По мере увеличения срока ведения цисплатина патологические изменения в паренхиме почек усложнялись и к 45 суткам эксперимента выражаются в вакуолизации эпителиальных клеток, потере значительным количеством ядер эпителиоцитов базофилии, кариолизисе и десквамации эпителиальных клеток, просветы проксимальных канальцев значительно расширены. В отдельных зонах истонченные канальцы, сливаясь, образуют кистоидные участки. Местами наблюдается разрыв базальной мембраны канальцев (тубулорексис) с окружающей канальцы выраженной лимфогистиоцитарной инфильтрацией. В инфильтрате видны многочисленные мононуклеарные клетки. В 1/3 клубочков выявляется фибриноидный некроз и спадение отдельных капиллярных петель.

Под влиянием ксимедона у здоровых животных не зафиксировано значимых морфологических изменений ни со стороны канальцев, ни со стороны клубочкового аппарата почек.

У животных с экспериментальной нефропатией, которые в дополнение к цисплатину получали ксимедон, все патологические изменения в почках были менее выраженными, как на ранних сроках введения препаратов, так и на 45-е и 60-е сутки эксперимнта: имело место расширение проксимальных извитых канальцев, но было не столь выраженным в сравнении с изменениями при введении только цисплатина. Не наблюдали в проксимальных канальцах столь часто тубулорексиса, как это было при введении цисплатина, особенно на сроках 45-ти и 60-ти суток эксперимента. На сроке 15-ти и 30-ти суток введения ксимедона было заметным полнокровие капилляров сосудистых клубочков. Фибриноидный некроз и спадение отдельных капиллярных петель клубочков наблюдалось лишь в единичных клубочках ближе к 45 и 60-ти суткам введения препаратов.

Проведенное морфометрическое исследование паренхимы почек животных с цисплатиновой нефропатией показало, что на фоне приема цисплатина существенно меняются показатели проксимальных извитых канальцев. Показатели, характеризующие дистальные извитые канальцы, практически не отличаются от контрольных значений. В почечных тельцах изменения касаются исключительно сосудистого клубочка. Кроме того, изменению подвергается только часть клубочков, другая часть клубочков остается абсолютно интактной. Повреждения клубочков носит вторичный характер за счет потери канальцами функциональной способности, обусловленное их значительным повреждением. С учетом этих данных мы проводили морфометрическое исследование и с измененными сосудистыми клубочками, и с интактными клубочками.

На сроке 30-ти суток введения цисплатина диаметр просвета проксимальных извитых канальцев уменьшается за счет выраженной вакуолизации эпителиальных клеток канальцев по сравнению с контролем на 25,2% (Р<0,05) и составляет 13,68± 7,34 (Р<0,05). К 45 суткам на фоне цисплатина за счет тотального некроза эпителиоцитов и диффузного расширения канальцев диаметр просвета проксимальных извитых канальцев увеличивается на 58,6%(Р<0,05) и становится равным 28,96± 9,43, а к 60-ти суткам эксперимента -30,26± 11,32 соответственно, что означает увеличение на 65,8%(Р<0,05) в сравнении с контролем. К 45-м суткам введения цисплатина в 1/3 почечных телец происходит уменьшение площади почечного тельца на 38,2% (Р<0,05) по сравнению с контролем. Это уменьшение происходит в наибольшей мере за счет уменьшения площади капиллярного клубочка, которая уменьшается на 42,2% по сравнению с контролем (Р<0,05). 2/3 почечных телец не имели существенных отклонений от нормальных значений их площади. Площадь не измененных сосудистых клубочков также не имела отклонений от контрольных значений.

При одновременном введении ксимедона с цисплатином на сроке 30-ти суток мы наблюдали увеличение площади капиллярного клубочка на 23,8% (Р<0,05), а площадь почечного тельца увеличивалась на 26% (Р<0,05). Диаметр просвета проксимальных извитых канальцев на сроке 30-ти суток приближался к норме по сравнению с контролем.

К 45 суткам эксперимента площадь сосудистых клубочков приближается к нормальным показателям, а просвет проксимальных канальцев увеличивается лишь на 19,2%(Р<0,05) и составляет 19,26±7,33, что значительно ниже в сравнении с показателями на фоне введения только цисплатина(табл .2).

Таблица 2

Изменения площади и диаметра проксимальных канальцев почек при цисплатиновой нефропатии и при введении ксимедона на разных сроках эксперимента__

Показатель Значения (М ± ш)

Контроль ЗО-суток 45-суток 60-суток

Диаметр проксимального канальца, мкм 35,53 ±6,43 37,36 ± 8,34* 35,53 ± 6,43* 35,53 ± 6,43*

Диаметр просвета проксимального канальца мкм 18,26±6,51 19,26±7,33* 22,07±7,62* 23,37±8,25*

Площадь проксимального канальца, мкм2 130,61 ± 38,27 138,43 ± 37,64* 176,54 ±44,43* 210,43 ± 54,72*

* — Р<0,05 при сравнении с контролем

Проведенный в ходе эксперимента корреляционный анализ показывает что, при цисплатиновой нефропатии имеется прямая зависимость между уровнем креатинина крови и показателями диаметра просвета и площади проксимальных канальцев почек (г=0,96).

При введении ксимедона одновременно с цисплатином между показателями функциональных почечных проб (уровнем креатинина и мочевины в крови) и показателями диаметра просвета и площади

проксимальных канальцев почек также выявлялась прямая корреляционная взаимосвязь (г=0,86).

Проведенное иммуногистохимическое исследование на активность Р2У1- Р2У2-рецепторов в канапьцевом аппарате почек на фоне введения цисплатина и при введении цитопротектора ксимедона показало, что в почках контрольных животных выраженная позитивная иммуногистохимическая экспрессия (+++) на Р2У2-рецепторы наблюдалась в эпителиальных клетках проксимальных извитых канальцев. Положительная экспрессия (++) на Р2У1-рецепторы была зафиксирована в мезангиальных клетках почечных телец. В эпителиоцитах канальцев почек положительная экспрессия на Р2У1 -рецепторы в нашем исследовании не была выявлена.

Положительная экспрессия (+++) на Р2У1-И Р2У2-рецепторы была аналогичной контрольной, в почках экспериментальных животных, получавших только ксимедон.

При введении цисплатина в течение 15-ти дней эксперимента экспрессия Р2У2-рецепторов в эпителиальных клетках проксимальных извитых канальцев заметно снижается (++Хрис.1а). При одновременном введении ксимедона и цисплатина степень экспрессии Р2У2-рецепторов в проксимальных извитых канальцах почек значительно возрастает(+-Н-) и становится не отличимой от контрольной группы(рис.1б).

При введении цисплатина в течение 30-ти дней эксперимента экспрессия Р2У2-рецепторов в эпителиальных клетках проксимальных извитых канальцев значительно снижается (++,+)(рис.2а). При одновременном введении ксимедона и цисплатина степень экспрессии Р2У2-рецепторов в проксимальных извитых канальцах почек заметно возрастает (++). Однако, по сравнению с контролем экспрессия Р2У2-рецепторов в канальцевом аппарате почек ниже (рис.2б).

Рис. 1. Иммуногистохимическая реакция с антителами против Р2У2-рецепторов в почке на фоне цисплатина(а) и цисплатина +ксимедона(б) в течение 15-ти суток. Осадок темно-синего цвета соответствует позитивной реакции. х400.

Рис. 2. Иммуногистохимическая реакция с антителами против Р2У2-рецепторов в почке на фоне введения цисплатина(а) и цисплатина+ксимедона(б) в течение 30-ти суток. Осадок темно-синего цвета соответствует позитивной реакции. х400.

При экспериментальной цисплатиновой нефропатии на сроке 45-ти суток от начала введения цисплатина в корковом веществе почки определяется слабое иммуногистохимическое окрашивание преимущественно ядер эпителиальных клеток проксимальных извитых канальцев (+).

Под влиянием ксимедона происходит восстановление экспрессии Р2У2-рецепторов и цитоплазме части клеток канальцев (++,+)• Иммуногистохимическое исследование с антителами против Р2У2-рецепторов показало; при отсутствии экспрессии Р2У2-рецепторов в проксимальных извитых канальцах, сохраняется таковая в дистальных извитых канальцев.

В ходе проведенного корреляционного анализа между степенью экспрессии Р2У2-рецепторов в эпителиальных клетках проксимальных извитых канальцев почек и изменением функциональных показателей работы почек (уровнем креатинина и мочевины) при введении цисплатина выявлено, что между степенью экспрессии Р2У2-рецепторов в эпителиоцитах и изменением функциональных почечных тестов имеется обратная (отрицательная) корреляционная связь (г=-0,26).

При введении ксимедона одновременно с цисплатином между степенью экспрессии Р2У2-рецепторов в эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев почек и изменением функциональных почечных тестов также выявлялась отрицательная корреляционная взаимосвязь (г=-0,29).

Проведенные исследования по изучению роли апоптоза при цисплатиновой нефропатии и на фоне нефропротекции ксимедоном показало, что при введении ксимедона здоровым животным, также как и в контрольной группе, определяются только единичные ТЦЫЕЬ+-клетки ткани почек. Показано, что ксимедон не влияет на развитие апоптоза в клетках как клубочкового, так и канальцевого аппарата почек.

К 30-м суткам под влиянием цисплатина в почечном тельце определяется большое число Т1ЛЧЕЬ+-клеток. Разнообразная картина распределения ТЦЫЕ1/-клеток зафиксирована нами в канальцах почки. В части канальцев все клетки являются Т1ЖЕЬ+, в некоторых определяются единичные ТиЫЕЬ+-клетки, а в ряде канальцев таких клеток нет. Мы предполагаем, что данное явление связано с различной функциональной нагрузкой, которую испытывают канальцы в процессе развития цисплатиновой нефропатии. Часть нефронов, изначально более активных, существенно интенсивнее подверглись воздействию цисплатина и процессы гибели в них закончились, а в результате этого нагрузка была перенесена на другие нефроны, в которых позже начался апоптоз эпителиальных клеток.

К 30-м суткам введения ксимедона на фоне цисплатиновой нефропатии нами не зафиксировано значительных изменений количества ТЦМЕЬ+-клеток в почечном тельце и канальцах.

Полученные данные указывают, что ксимедон непосредственно или опосредованно через поддержание экспрессии Р2У1- и Р2У2-рецепторов не оказывает влияние на количество вступающих в апоптоз клеток на всех сроках эксперимента.

ВЫВОДЫ

1. Интоксикация цисплатином проявляется яркой картиной поражения почек, выражающейся в значительных дистрофических и некротических изменениях паренхимы почек.

2. При цисплатиновой нефропатии определена прямая корреляционная зависимость между уровнем креатинина в крови и морфометрическими показателями диаметра просвета и площади проксимальных канальцев почек (г=0,96).

3. Цитопротектор ксимедон достоверно оказывает нефропротекторный эффект при цисплатиновой нефропатии, который проявляется снижением степени дистрофии и некроза эпигелиоцитов, уменьшением диаметра просвета и площади проксимальных извитых канальцев почек.

4. Токсическая нефропатия при введении цисплатина реализуется за счет снижения активности Р2У2 —рецепторов в эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев, что подтверждается снижением или исчезновением их экспрессии в названных структурах паренхимы почек.

5. Нефропротекторный эффект ксимедона реализуется путем поддержания активности Р2У2-рецепторов в эпителиальных клетках

проксимальных извитых канальцев почек, что выражается усилением экспрессии рецепторов в названных структурах паренхимы почек.

6. Установлена обратная корреляционная связь между степенью экспрессии Р2У2 — рецепторов в эпителиоцитах проксимальных канальцев почек и уровнем функциональных тестов (мочевины и креатинина)( г=-0,26, г=-0,29).

7. Р2У1 -рецепторы, обнаруженные в мезангиальных клетках сосудистого клубочка неповрежденного нефрона, не принимают участия в развитии цисплатиновой нефропатии и нефропротекции ксимедоном.

8. Цитопротектор ксимедон не влияет на уровень апоптоза клеток нефрона при цисплатиновой нефропатии.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи в ведущих журналах, рекомендованных ВАК

1. Исак И.Н. Влияние цитопротектора ксимедона на морфофункциональные изменения в почках и печени при токсическом их повреждении химиопрепаратом цисплатином / Н.В.Чаиркина, И.Н. Чаиркин, И.С. Рагинов // Морфологические ведомости. Москва. 2009. № 3-4. С. 83-86.

2. Исак И.Н. Влияние ксимедона на периферическую полинейропатию, индуцированную цисплатином / И.С. Рагинов, И.Н. Чаиркин, И.Н. Вафина // Морфологические ведомости. Москва-Берлин. №1-2.2008. С. 122-123.

3. Исак И.Н. Влияние ксимедона на индуцированную цисплатином нефропатию / Н.В. Чаиркина, И.С. Рагинов, И.Н. Чаиркин // Морфологические ведомости. Москва. № 2.2011. С. 127-130.

Статьи в периодических изданиях, сборниках и материалах конференций

4. Исак И.Н. Влияние ксимедона на развитие нефро- и нейропатии при использовании цисплатина / Н.В. Чаиркина, И.С. Рагинов, И.Н. Чаиркин // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные науки - практики». Ижевск. 2008. С.45.

5. Исак И.Н. Применение производных пиримидина для терапии полинейропатии. Применение цитопротекторов метаболического действия в лечении заболеваний / Н.В. Чаиркина, И.Н. Вафина, И.С. Рагинов, И.Н. Чаиркин // Сборник научных работ. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. 2008. С.80.

6. Исак И.Н. Влияние применения производных пиримидина (ксимедона) на развитие нефро- и нейропатии при использовании цисплатина / И.Н. Чаиркин, Н.В. Чаиркина, И.С. Рагинов // Актуальные проблемы медицинской науки и образования: труды II межрегиональной научной конференции. Пенза: Информационно- издательский центр ПензГУ. 2009. С.104.

7. Исак И.Н. Применение ксимедона в терапии периферической полинейропатии и нефропатии. Ill Международная научно-практич. конференция « Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» / И.Н. Чаиркин, Н.В. Чаиркина, А.Б. Коршунова, И.С. Рагинов // Сборник научных работ. Ростов-на-ДонуД-4 октября. 2009. С. 184.

8. Исак И.Н. Цитопротективный эффект препарата из группы производных пиримидина - ксимедона на фоне химиотерапевтической нефротоксичности. Актуальные вопросы хирургии, травматологии и интенсивной терапии: материалы межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию со дня рождения профессора Н.И. Атясова / Н.В. Чаиркина, И.С. Рагинов, И.Н. Чаиркин // Саранск: Типография «Прогресс». 2011. С. 207-209.

Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Тайме. Печать способом ризографии. Усл. печ. л. 1,6. Уч.- изд. л. 0,8. Тираж 100 экз. Заказ № 46 от 11.04.2012 г.

Отпечатано с оригинала-макета заказчика в ООО «Референт». 430000, г. Саранск, пр. Ленина, 21. Тел. (8342) 48-25-33.