Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Молекулярно-генетические маркеры невынашивания беременности и плацентарной недостаточности

На правах рукописи

Никитина Людмила Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

14.00.01 - акушерство и гинекология 03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

0 иисяй8572

МОСКВА 2007

003159572

Работа выполнена

на кафедре биологической и медицинской химии Московского Государственного университета имени МВ Ломоносова, в отделении патологии беременности клиники акушерства и гинекологии имени С Ф Снегирева Московской медицинской академии имени й М Сеченова Научные руководители.

доктор медицинских наук, профессор, зав отделением патологии беременности клиники акушерства и гинекологии

ММА им И М Сеченова Е М Демидова

доктор биологических наук, ст научный сотрудник кафедры биологической и медицинской химии

МГУ им М В Ломоносова В Н Бочков

Официальные оппоненты-

доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства и гинекологии Российского

государственного медицинского университета Р И Шалина

кандидат биологических наук, вед научный сотрудник лаборатории клеточной подвижности ФГУ Российский Кардиологический Научно-производственный Центр

Росздрава А В Воротников

Ведущая организация Московский областной НИИ акушерства и гинекологии

Защита диссертации состоится « Ж <У>Оуп % 2007 года в // часов на заседании Диссертационного совета Д 212 203 01 Российского университета дружбы народов по адресу 119333, г Москва, ул Фотиевой, д 6

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов (117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6) Автореферат разослан « %$> О2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор И М Ордиянц

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования.

Невынашивание беременности (НБ) является актуальной проблемой современного акушерства Частота этого осложнения остается стабильной и высокой в течение многих лет, составляя 15 - 30% от общего числа всех желанных беременностей

По данным Коллегии Минздрава РФ за 2002 г 50% самопроизвольных прерываний беременности происходит в 1 триместре, а 25% из них приходится на привычное невынашивание

Невынашивание беременности (НБ) является одним из клинических признаков, указывающих на возможность формирования первичной плацентарной недостаточности (ПН) По данным В М Сидельниковой и совт (2002) частота формирования ПН при привычном НБ составляет от 50 до 80% Плацентарная недостаточность (ПН) - патофизиологический феномен, состоящий из комплекса нарушений трофической, эндокринной и метаболических функций плаценты, ведущий к ее неспособности поддерживать полноценный обмен между организмом матери и плода Основным звеном патогенеза ПН является нарушение плодово-плацентарного кровотока, приводящее к неадекватному обеспечению растущего плода кислородом и питательными веществами, а также гипоксии тканей плода и плаценты (Кулаков В И и соавт 1999, Милованов А П, и соавт 2002, Сидельникова В М и соавт 2002)

Наиболее частым клиническим маркером ПН является задержка роста плода (ЗРП) Многолетние наблюдения ряда авторов установили, что при формировании ПН и ЗРП происходит не только резкое увеличение перинатальной смертности, но и многочисленные изменения в организме ребенка, которые на протяжении первых лет жизни являются причиной нарушений его физического и умственного развития, а также повышенной соматической и инфекционной заболеваемости в дальнейшей жизни (Вихляева ЕМ и соавт 1984, Радзинский ВЕ и соавт 2001) Терапия препаратами, улучшающими маточно-плацентарный кровоток, проводимая, как правило, со П-го триместра беременности при выявлении УЗИ-критериев ЗРП, часто оказывается неэффективной, т к в основе таких изменений лежат уже сформировавшиеся нарушения сосудистого русла плаценты В связи с этим, актуальность приобретает изучение локальных молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе развития ПН, для уточнения патогенетических механизмов ПН, поиска новых подходов к диагностике и терапии, а также разработке профилактических мероприятий для ее предотвращения

Актуальным направлением в прогнозировании и профилактике ПН является выявление генетической предрасположенности к НБ Носительство тех или иных аллелей определенных генов может видоизменять течение биохими-

ческих процессов в организме матери и способствовать формированию ПН и НБ (Макацария АД и соавт,2001) В связи с тем, что нарушение плодово-плацентарного кровотока, является одним из патогенетических механизмов, приводящих к развитию НБ и ПН, большой интерес представляет изучение генетических полиморфизмов в системе свертывания крови На сегодняшний день известен ряд полиморфизмов, приводящих к гиперкоагуляции, наиболее изученными из которых являются полиморфизм С677Т гена метилентетрагид-рофолатредуктазы (MTHFR), Лейденская мутация V фактора, протромбина, P1AI/P1A2 гена гликопротеина Ilia (GPIIIa), 4G/5G ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1) Носительство Лейденской мутации и G20210A гена протромбина по мнению большинства исследователей имеет четкую взаимосвязь с потерей беременности (Rey Е et al, 2003), а данные о роли других полиморфизмов в патогенезе НБ остаются противоречивыми (Holmes ZR et al,

1999, Unfried G et al, 2002, O'Shaughnessy KM et al, 2003, Podciechowski L et al, 2005, Dossenbach-Glamnger A et al, 2003) В связи с этим вопрос о целесообразности проведения ДНК-диагностики тромбофилических полиморфизмов и проведения профилактической антикоагулянтной терапии у женщин с НБ остается открытым Существует также ряд генетических полиморфизмов, которые приводят к гипокоагуляции Одним из таких полиморфизмов является полиморфизм R353Q VII фактора свертывания крови Влияние данного полиморфизма активно изучалось в области кардиологии, где было показано его протективное влияние на формирование ИБС и ее осложнений (Girelli D et al,

2000, Wu AH et al, 2001) В настоящее время отсутствуют данные, касающиеся влияния данного полиморфизма на формирование и течение акушерской патологии

Другим важным направлением в поиске новых подходов к терапии и профилактике ПН и НБ является изучение клеточно-молекулярных взаимодействий, происходящих в тканях эндометрия и плаценты, начиная с этапа инвазии бластоцисты и до момента развития родовой деятельности Важную роль в поддержании гомеостаза в плаценте играют цитокины, факторы роста, белки межклеточной адгезии и других факторов, функционирующих в тесном взаимодействии друг с другом под контролем стероидных гормонов (Das С et al, 2002)

В основе правильного функционирования маточно-плацентарного кровотока лежат такие молекулярно-клеточные процессы, как ангиогенез и локальный гемостаз При морфологическом исследовании ворсин в плацентах с ЗРП, было показано, что наиболее частым морфологическим проявлением ЗРП является нарушение созревания терминальных ворсин, являющихся основным местом газообмена, то есть при данной патологии имеется нарушение процессов ангиогенеза в плаценте (Волощук И Н и соавт, 2001, Kaufmann Р et al, 2004) В связи с этим, перспективным направлением поиска терапевтических мише-

ней и подходов к профилактике ПН имеет изучение изменений в экспрессии факторов ангиогенеза, а также белков, регулирующих локальный гемостаз и воспалительный ответ Особое место в формировании ЗРП и ПН имеет нарушение экспрессии в плаценте факторов роста, необходимых для правильного развития плода По данным литературы на рост плода могут оказывать влияние инсулиноподобные факторы роста (Guidice et al, 1995), а также лептин (Laird SM et al, 2001) Между данными группами факторов существуют регуляторные взаимодействия, а изменения экспрессии тех или иных групп факторов может приводить к нарушению регуляции процессов ангиогенеза или локального гемостаза и играть важную роль в формировании ПН

Многофакторный характер этиологии и патогенеза ПН и ЗРП с одной стороны, и недостаточность и противоречивость данных о роли отдельных факторов в их развитии, с другой, определяют необходимость углубленного изучения наиболее значимых факторов коагуляции, роста, ангиогенеза и медиаторов воспаления Данные исследования являются принципиально важными для рационализации лечебно-профилактических мероприятий при НБ и ПН

Цель исследования.

Целью исследования явилась комплексная оценка молекулярно-генетических маркеров НБ и ПН факторов коагуляции, ангиогенеза, медиаторов воспаления и факторов роста для совершенствования подходов к диагностике, терапии и прогнозированию репродуктивных потерь и гипотрофии плода

Задачи исследования.

1 Изучить частоту встречаемости полиморфных аллелей 677Т MTHFR, 1691А фактора V, Р1А2 GPIIIa, 353Q VII фактора свертывания крови в группе женщин с угрозой прерывания беременности и контрольной группе популяционной выборки Провести оценку относительного риска формирования симптомокомплекса НБ при носительстве полиморфных аллелей генов MTHFR, VII фактора и GP Illa и их сочетаний у женщин с угрозой прерывания беременности

2 Изучить уровень экспрессии генов регуляции ангиогенеза (P1GF, PDGFA, PDGFB, FGF-2, ANGPT-1, ANG, TSP), коагуляции и фибринолиза (TF, uPA, uPA-R, PAI-1) в плацентах у женщин с ЗРП

3 Изучить уровень экспрессии генов медиаторов воспаления (МСР-1, ICAM, СОХ-2, MIP-la, MIP-lb, TGF-b, IL-8, MIF, RANTES, HO-1) в плацентах у женщин с ЗРП

4 Изучить уровень экспрессии генов ростовых факторов IGF-1, IGF-2 и леп-тина в плацентах у женщин с ЗРП

Научная новизна.

1 Впервые определены группы риска развития НБ, обусловленного генетической предрасположенностью среди женщин с угрозой прерывания беременности

2 Впервые выявлена протективная роль полиморфизма 11353(3 VII фактора свертывания крови при НБ, а также установлена прогностическая значимость сочетаний генотипов С677Т МТНРЯ, Р1А1/Р1А2 СРШа и 11353(5 VII фактора свертывания крови для оценки риска потери беременности

3 Впервые получена комплексная количественная оценка уровня экспрессии генов регуляции ангиогенеза (РЮР, РОСРА, РБвРВ, РОР-2, VEGF, А^РТ-1, АЫв, ТБР), коагуляции и фибринолиза (иРА, иРА-Я, РА1-1, ТР), медиаторов воспаления (МСР-1, 1САМ, СОХ-2, М1Р-1а, М1Р-1Ь, ТСР-Ь, 1Ь-8, МШ, РАЫТЕЗ, НО-1), факторов роста (лептина, ЮР-1, ЮБ-2) в плацентах у женщин с ЗРП и первичной ПН, а также физиологическим течением беременности

Практическая значимость

Полученные данные по частотам полиморфизмов С677Т МТНРК, Р1А1/Р1А2 ОРШа и 11353*3 VII фактора свертывания крови позволили выделить среди женщин с НБ группу риска с генетической предрасположенностью к НБ, связанной с изменениями в системе свертывания крови Таким образом, определен контингент женщин с НБ, которым необходимо проводить геноти-пирование на тромбофилические полиморфизмы Наибольшее диагностическое и прогностическое значение имеет выявление 2-х и более неблагоприятных генетических факторов, что может свидетельствовать о целесообразности проведения у таких женщин терапии антикоагулянтами на различных этапах беременности в соответствии с результатами исследования системы гемостаза

Сравнительная оценка уровня экспрессии генов основных регуляторных белков в плацентах женщин с первичной ПН и ЗРП позволило выявить маркеры функциональной недостаточности плаценты Такими маркерами явились фермент гемоксигеназа (НО-1), белки, вовлеченные в процесс регуляции ангиогенеза - VEGF, РОР-2, РБвРВ, А^рМ, МСР-1, а также лептин, важный регулятор обмена веществ Полученные данные позволяют рекомендовать терапию, направленную на усиление маточно-плацентарного кровотока на ранних сроках беременности, которая будет способствовать правильному созреванию сосудов плаценты и ее нормальному функционированию в более поздние сроки

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Генетические факторы оказывают наиболее выраженное влияние на формирование симптомокомплекса невынашивания беременности у женщин с повторными выкидышами при отсутствии других факторов риска невынашивания беременности

2 Наличие аллелей 677Т MTHFR и P1A1GP Illa в гомозиготном состоянии является фактором риска формирования неблагоприятных исходов беременности, гетерозиготный генотип R353Q VII фактора свертывания крови оказывает протективное действие на течение беременности при угрозе невынашивания Сочетание генотипов Т677Т MTHFR и Р1А1/Р1А1 GP Illa при отсутствии протективного генотипа R353Q VII фактора связано с максимальным риском потери беременности Наличие полиморфизма -675 4G/5G гена PAI-1 не связано с развитием симптомокомплекса невынашивания беременности

3 При первичной ПН и ЗРП в плаценте происходит активация экспрессии факторов, активирующих процессы ангиогенеза VEGF, FGF-2, PDGF, Angpt-1, МСР-1, повышение экспрессии гена PAI-1, гена НО-1 и лептина

Апробация работы, внедрение результатов работы в практику

Основные положения и результаты исследования представлены и обсуждены на Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» - (Санкт-Петербург, 2005), Международной Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2006), Московской Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2006 (Москва, 2006), Европейском Конгрессе по репродуктивной иммунологии (Грац, Австрия, 2006), Европейской студенческой конференции будущих врачей и молодых ученых (Берлин, Германия, 2006), Итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татья-нин день» (Москва, 2007), Международном конгрессе по репродуктивной иммунологии (Опатия, Хорватия, 2007), 14-й Международной студенческой конференции по исследованиям в медицине (Гронинген, Голландия), Летней школе Европейской организации по изучению имплантации эмбрионов (EMBIC) (Йена, Германия, 2007), на апробационной комиссии МГУ им Ломоносова 28 февраля 2007 года

На основании данных, полученных в диссертации, подан патент «Применение ДНК-диагностики на наличие полиморфизма R353Q в гене фактора VII свертывания крови для оценки предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности и способ оценки предрасположенности к этому заболеванию путем анализа полиморфизмов С677Т гена MTHFR и R353Q гена фактора VII»

Предложенный алгоритм по выявлению генетической предрасположенности у женщин с НБ используется в отделении патологии беременности №2 клиники Акушерства и гинекологии ММА им Сеченова

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, иллюстрированного 40 рисунками и 30 таблицами Указатель литературы включает в себя 254 источника отечественной и зарубежной литературы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы.

Объекты исследования:

Для решения поставленных задач, нами были обследованы 132 пациентки, из них 110 пациенток с клиникой угрожающего выкидыша, 10 пациенток с ЗРП и угрозой прерывания беременности и 12 пациенток с физиологическим течением беременности, а также 340 доноров российской популяции Исследование состояло из 2-х частей 1) Анализ влияния некоторых генетических факторов на формирование НБ и первичной ПН, 2) Оценка изменений экспрессии генов факторов ангиогенеза, фибринолиза, медиаторов воспаления и ростовых факторов при первичной ПН и ЗРП

1. Анализ генетических полиморфизмов.

В данной части работы был проведен анализ диагностической и прогностической значимости выявления генетической предрасположенности к первичной плацентарной недостаточности и НБ В качестве генетических маркеров были выбраны полиморфизмы генов факторов, оказывающих влияние на процессы коагуляции и тем самым способствующих формированию первичной плацентарной недостаточности MTHFR (С677Т), GP Illa (Р1А1/Р1А2), фактора Лейден, VII фактора свертывания крови (R353Q), PAI-I (4G/5G) ДНК-диагностика была проведена в следующих группах

1 группа - 110 женщин с клиническими признаками угрозы прерывания беременности на ранних сроках (до 16 недель)

Критерии включения Наличие клинических признаков угрозы прерывания беременности кровянистые выделения из половых путей, тянущие боли внизу живота

Критерии исключения Наличие хромосомной патологии, антифосфолипидный синдром, Rh-конфликт, анатомические аномалии репродуктивных органов

Всем пациенткам 1 группы выдавалась анкета-опросник, где были отражены следующие критерии наследственность по соматической и гинекологической патологии, сопутствующая соматическая и гинекологическая патология, особенности менструальной функции, особенности генеративной функции, проводимая терапия

Ретроспективно проводился опрос женщин для выяснения исхода текущей беременности

2 группа - контрольная по отношению к 1 -й группе - 340 доноров российской популяции Данная группа была выбрана для определения частот исследуемых полиморфизмов в популяции У всех обследуемых 1 и 2 групп производился забор венозной крови

Последующий анализ производился по следующей схеме

1 Выделение ДНК

2 Постановка полимеразной цепной реакции с рестрикцией и аллель-

специфичной ПЦР на полиморфизмы генов MTHFR (С677Т), GP Illa

(Р1А1/Р1А2), FVL, VII фактора свертывания крови (R353Q), РАН (4G/5G)

3 Анализ ПЦР-фрагментов путем электрофореза в агарозном геле

4 Статистическая обработка результатов по критерию Фишера и %-2 с использованием статистического пакета Statistica 6 0

2. Анализ экспрессии генов.

Во 2-й части работы была проведена оценка молекулярных изменений, происходящих в плаценте при формировании первичной плацентарной недостаточности В качестве критерия плацентарной недостаточности был выбран синдром задержки роста плода (ЗРП), который сформировался после эпизода угрозы прерывания беременности на ранних сроках Наличие угрозы прерывания беременности на ранних сроках дало возможность охарактеризовать имевшуюся у этих женщин плацентарную недостаточность как первичную, т к уже на ранних сроках имелись признаки неблагополучного состояния формирующейся плаценты В плацентах женщин с ЗРП и контрольной группы был проанализирован уровень экспрессии генов факторов, ответственных за протекание в плаценте таких основополагающих процессов, как ангиогенез, фибри-нолиз, иммунный ответ, рост и дифференцировка клеток Для этого были выбраны следующие группы женщин

3 группа - женщины с угрозой прерывания данной беременности на ранних сроках, у которых беременность была сохранена, но осложнилась ПН и гипотрофией плода и была завершена родами путем операции кесарева сечения -10 человек

Критерии включения угроза прерывания беременности до 16 недель, своевременные роды в сроке 38-40 недель путем операции кесарева сечения,

вес новорожденных<2800г, МРП (массо-ростовой показатель) новорожденных <60

Критерии исключения хромосомные аномалии и пороки развития у новорожденных, выраженная экстрагенитальная патология у матери (сахарный диабет, пороки сердца, заболевания щитовидной железы, аутоиммунные заболевания и т д), рост матери менее 160 см

4 группа - контрольная к 3-й группе - женщины с физиологическим течением беременности и рождением детей с массой тела в пределах нормальных значений- 2800-3 800г- 12 женщин

У женщин групп 3 и 4 получали образцы ткани плаценты с децидуальной и трофобластической сторон, не затрагивая соединительнотканные перегородки и крупные сосуды

Дальнейший анализ образцов проходил по следующей схеме

1 Выделение тотальной РНК

2 Постановка обратной транскрипции

3 Анализ экспрессии изучаемых генов путем определения концентрации

кДНК на приборе Real-time ПЦР с использованием интеркалирующего

красителя SYBR-green методом относительного количественного анализа

(AACt)

• P1GF, FGF, PDGFA, PDGFB, VEGF, ANG, ANGPT, TSP, участвующих в регуляции процессов ангиогенеза,

• Регуляторов фибринолиза uPA, uPA-R, PAI-1

• Медиаторов воспаления и иммунного ответа МСР-1, ICAM, СОХ-2, MIP-la, MIP-lb, TF, TGF-b, IL-8, MIF, RANTES

• HO-1 - белка, участвующего в антиоксидантной защите ткани

• лептина, IGF-I, IGF-II, факторов роста плода и плаценты

4 Данные обрабатывали статистически по непараметрическому критерию

Mann-Whitney с использованием статистического пакета Statistica 6 0

КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ЖЕНЩИН

Средний возраст пациенток обследованных групп составил 29,8 + 4,7 у пациенток 1-й группы, у пациенток 3-й и 4-й группы 25,7±3,2 и 27,7 ± 4,6 соответственно Данные статистически не различаются, т е женщины всех групп были сопоставимы по возрасту Около половины женщин 1-й и 4-й групп составили возрастную группу 27-35 лет, подавляющее большинство женщин 3-й группы (80%) были моложе 27 лет Среднее значение ИМТ соответствовало нормальным значениям, достоверных отличий в этих показателях между женщинами во всех группах не было Структура сопутствующей соматической па-

тологии у всех обследованных женщин существенно не отличалась Следует отметить высокую заболеваемость ОРВИ у пациенток 1 группы, частота которой (60%) была достоверно выше, чем у женщин остальных групп

Среди обследованных женщин средний возраст менархе соответствовал популяционным и не имел различий во всех группах Длительность менструального цикла, а также продолжительность менструаций также были сопоставимы у женщин всех групп и соответствовали физиологическим параметрам В то же время частота нарушений менструального цикла у женщин 1 и 3 групп наблюдалась в 1,5-2 раза чаще, чем у женщин 4-й группы

Структура гинекологической заболеваемости обследованных женщин разнообразна, однако наибольший удельный вес занимают воспалительные гинекологические заболевания, суммарная частота которых была существенно выше у пациенток 1 группы и составила 65,5%

Характеристика генеративной функции женщин 1 группы представлена в табл 1

Таблица 1

Характеристика генеративной функции женщин 1 группы

Анамнестические дан- Настоящая беремен-

Параметр ные ность

11=110 % п=110 %

Своевременные роды 61 55,5 83 75,4

• из них кесарево сечение 15 24,6

Преждевременные роды 11 10 6 5,4

• из них кесарево сечение 3 27,3 0 0,0

Внематочная беременность 9 8,2 0 0,0

Искусственный аборт 49 44,5 0 0,0

Самопроизвольные выкидыши 66 60 8 7,3

до 12 недель 59 53,6 8 7,3

13-21 неделя 5 4,6 0 0

22-24 недели 2 1,8 0 0

Неразвивающаяся беремен- 35 31,8 3 2,7

ность

ЗРП 24 21,8 15 13,6

Как следует из представленных в табл 1 данных, у большинства женщин 1 группы (60%) в анамнезе отмечались случаи самопроизвольных выкидышей и замершей беременности, т е данный эпизод невынашивания был повторным За время госпитализации в отделении патологии беременности женщины получали своевременную комплексную патогенетически обоснованную терапию Своевременное адекватное лечение угрозы выкидыша в I триместре позволило

большинству наблюдавшихся женщин (75,4%) доносить беременность до срока физиологического родоразрешения

Средние значения массы новорожденных и массо-ростового показателя (МРП) у женщин обследуемых групп представлены в табл 2

Таблица 2

Средние значения массы новорожденных и МРП у женщин изучаемых групп

группы Масса плода, г МРП

1 группа 3100+253 62,1± 2,7

3 группа 2374 ± 398 * 51,2 ±6,5*

4 группа 3491 ±228 66,7 ± 3

*Р<0,05

Как следует из представленных в табл 2 данных, у женщин 3-й группы наблюдается достоверное снижение массы тела новорожденных и МРП по сравнению с аналогичными показателями у женщин 1-й и 4-й групп (р<0,001), что позволяет рассматривать женщин 4-й группы, как контрольную группу для 3-й группы женщин

Приведенная нами клиническая характеристика всех обследованных женщин, составивших исследуемые группы, подчеркивает их сопоставимость по основным параметрам (возрасту, социальному положению, условиям труда и быта, соматической и гинекологической заболеваемости, паритету и т п

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Анализ генетических полиморфизмов

В соответствии с поставленными задачами, для исследования взаимосвязи генетических полиморфизмов V фактора, МТНР11, СРШа, VII фактора, РА1-1 и НБ, нами было обследовано 110 женщин с клиническими признаками угрозы прерывания беременности (1 группа) и 340 доноров (2-я группа, контрольная) для выявления популяционных частот исследуемых полиморфизмов

Частоты аллелей в группе 2 (доноры) не отличались от рассчитанных на основе закона Харди-Вайнберга (р=0 98), что свидетельствовало о возможности использования частот генотипов, полученных в группе доноров, как значений популяционных частот

На основе анамнестических данных и ретроспективной оценки исходов настоящей беременности среди 110 пациенток 1 группы были выделены следующие подгруппы

• Женщины с наличием воспалительных гинекологических заболеваний,

как наиболее распространенного в данной группе фактора риска невынашивания беременности - 72 пациентки,

• Женщины без сопутствующей воспалительной гинекологической патологии - 38 пациенток,

• Женщины без неблагоприятных исходов беременности, которым удалось сохранить данную беременность и родить здорового ребенка, и которые не имели выкидышей/замершей беременности в анамнезе - 32 пациентки,

• Женщины с наличием неблагоприятных исходов в анамнезе В эту группу вошли женщины, у которых либо настоящая беременность, либо предыдущие завершились самопроизвольными выкидышами либо имелась неразвивающаяся беременность- 78 пациенток

В вышеуказанных подгруппах женщин был проведен анализ частот изучаемых полиморфизмов С677Т МЮТК, Р1А1/А2 ОРШа, 40/50 РАМ

Частоты генотипов полиморфизма С677Т МТИРII в подгруппах женщин с наличием и отсутствием воспалительных заболеваний представлены в табл 3

Таблица 3

Частоты генотипов С677Т М ГНЬ Я у женщин с наличием и отсутствием воспалительных заболеваний и в популяции (* Р<0,05)

МГН№ С/С мтотл с/т МТЭТЫ Т/Т Всего

Нет воспалит заболеваний п 14 16 7 37

% 37,84% 43,24% 18,92% * 100%

Есть воспалит заболевания п 36 27 8 71

% 50,70% 38,03% 11,27% 100%

Популяц п 166 143 31 340

% 48,8% 42,1% 9,1% 100%

Как следует из представленных в табл 3 данных, в подгруппе женщин с отсутствием сопутствующих воспалительных гинекологических заболеваний частота генотипа МТЫБЯ Т/Т (18,9%) превышала этот показатель в подгруппе женщин с воспалительными гинекологическими заболеваниями (11,2%, р=0,1) и в популяции (9%, р<0,05) Таким образом, при отсутствии воспалительного фактора, носительство гомозиготного генотипа 677ТТ является неблагоприятным для формирования симптомокомплекса НБ

Частоты генотипов полиморфизма 113530! VII фактора свертывания крови в подгруппах женщин с наличием и отсутствием воспалительных гинекологических заболеваний представлены в табл 4

Таблица 4.

Частоты генотипов 143530 VII фактора у женщин с наличием и отсутствием воспалительных гинекологических заболеваний и в популяции (* Р<0,05)

VII фактор R/R VII фактор R/Q VII фактор Q/Q Всего

Нет воспалит п 35 2 0 37

заболеваний % 94,6% 5,41% 1= 0,0% 100%

Есть воспалит п 54 15 2 71

заболевания % 76,06% 21,13% 2,82% 100%

iBWiiÄSli

Популяц и 257 75 8 340

% 75,6% 22,0% 2,4% 100%

Как следует из представленных в табл 4 данных, частота генотипа VII Я/<3 в подгруппе женщин с отсутствием сопутствующих воспалительных гинекологических заболеваний была ниже (5,4%), чем в группе с воспалительными гинекологическими заболеваниями (21,1%, р<0,05) и в популяции (22%, р<0,05) В связи с этим, можно предположить, что гетерозиготное носительст-во Я353<3 VII фактора оказывает протективное влияние на формирование угрозы выкидыша

Отличий по частотам полиморфизмов Р1А1/А2 вРШа и 40/50 РА1-1 у женщин с угрозой прерывания беременности без сопутствующей воспалительной гинекологической патологии найдено не было

Таким образом, при исключении воспалительной патологии женской репродуктивной сферы, как основного фактора риска формирования угрозы прерывания беременности, нам удалось выявить взаимосвязь между генотипами Т677Т МТНРЯ и Н353К VII фактора и формированием данной патологии Так, генотип Т677Т МТНРЯ проявлял себя, как неблагоприятный фактор, способствующий прерыванию беременности, в то время как генотип 11353С2, напротив, оказывал протективное влияние на течение беременности

Анализ частот генотипов изучаемых полиморфизмов был проведен у 78 женщин с наличием неблагоприятных исходов беременности (выкидыши, неразвивающаяся беременность) по сравнению с 32 женщинами, у которых не было потери беременности в анамнезе и которым удалось доносить данную беременность, несмотря на эпизод угрозы выкидыша в 1 триместре Данные по частотам генотипов сравнивали с популяционной частотой Также была проведена оценка частоты неблагоприятных исходов беременности в зависимости от генотипа исследуемых полиморфизмов, а также их комбинаций

Частоты генотипов полиморфизма С677Т МТЫБЯ у женщин с наличием неблагоприятных исходов беременности и у пациенток с угрозой прерывания беременности без потерь беременности представлены в табл 5

Таблица 5

Частоты генотипов полиморфизма С677Т МТШ К у женщин с неблагоприятными исходами беременности и без потерь беременности и в популяции (* Р<0,05)

MTHFR С/С MTHFR С/Т MTHFR Т/Т Всего

Не было неблагоприятных исходов беременности п 18 13 1 32

% 56,25% 40,63% 3,13% 100%

Были неблагоприятные исходы беременности п 34 30 14 78

% 43,59% 38,46% 17,95% * 100%

¡11 'Сёго ,110.1.,'-"

Популяция п 166 143 31 340

% 48,8% 42,1% 9,1% 100%

Как следует из представленных в табл 5 данных, в группе женщин с наличием неблагоприятных исходов беременности частота генотипа МТОТК Т/Т была выше (17 9%), чем в группе пациенток без репродуктивных потерь (3%, СЖ=5,67, р<0,05) и в популяции (9%, (Ж=1,9, р=0,3)

Частота неблагоприятных исходов у носителей генотипа Т677Т составила 93% по сравнению с генотипами СТ (70%, ОЯ==1,3) и СС (65,3%, СЖ=1,4) Таким образом, нам удалось выявить взаимосвязь гомозиготного носительства ТТ МТЫБЯ с формированием неблагоприятных исходов беременности

Частоты генотипов полиморфизма 11353(3 VII фактора у женщин с наличием неблагоприятных исходов беременности и у пациенток с угрозой прерывания без потерь беременности представлены в табл 6

Таблица 6

Частоты генотипов полиморфизма 1*353(3 VII фактора у женщин с неблагоприятными исходами беременности и у женщин без потерь беременности (* Р<0,05)

VII фактор R/R VII фактор R/Q VII фактор Q/Q Всего

Не было неблагоприятных исходов беременности п 21 11 0 32

% 65,63% 34,38% 0,00% 100%

Были неблагоприятные исходы беременности п 70 6 2 78

% 89,74% 7,69% * 2,56% 100%

(| &!№%. >5Т - "к, ^ V 91* - "" , 17" , 2 " 110

Популяция п 257 75 8 340

% 75,6% 22,0% 2,4% 100%

Как следует из представленных в табл 6 данных, частота генотипа R353Q VII фактора у женщин с наличием неблагоприятных исходов была ниже (7,7%), чем в группе остальных пациенток (34,4% , OR=4,5, р<0,05) и в популяции (22%, р=0,24)

Частота неблагоприятных исходов беременности у женщин с генотипом RQ была ниже (35,3%), чем у женщин с генотипом RR (77%, OR=2,2, р<0,01) Таким образом, было выявлено протективное влияние генотипа R353Q VII фактора при формировании угрозы прерывания беременности

Частоты генотипов полиморфизма Р1А1/А2 GP Illa у женщин с наличием неблагоприятных исходов беременности и у пациенток с угрозой прерывания беременности без потерь беременности представлены в табл 7

Таблица 7.

Частоты генотипов полиморфизма Р1А1/А2 GP Ша у женщин с неблагоприятными исходами беременности и у женщин без потерь беременности (* Р<0,05)

GP Ша Р1А1/Р1А1 GP Ша Р1А1/Р1А2 GP Illa Р1А2/Р1А2 Всего

Не было неблагоприятных исходов беременности п 18 14 0 32

% 56,25% 43,75% 0,00% 100%

Были неблагоприятные исходы беременности п 61 15 2 78

% 78,21%* 19,23% 2,56% 100%

** ^ ».-тСйЕвта' 79.

Популяция п 237 97 6 340

% 69,7% 28,6% 1,7% 100%

Как следует из представленных в табл 7 данных, наблюдалось достоверное повышение частоты генотипа Р1А1/А1 GP Ша у женщин с неблагоприятными исходами в анамнезе (77%) по сравнению с группой остальных пациенток (58%), р<0,05

Частота неблагоприятных исходов беременности в группе женщин с генотипом Р1А1/Р1А1 была выше (77,2%), чем в группе женщин с генотипом Р1А1/Р1А2 (51,7% OR=l,5, р<0,05) Из-за малочисленности носителей генотипа Р1А2/Р1А2 (2 человека), мы не анализировали эти данные

Таким образом, в результате проведенного исследования была продемонстрирована взаимосвязь между гомозиготным генотипом Р1А1/Р1А1 GPIIIa и формированием неблагоприятных исходов беременности

Отличий по частоте неблагоприятных исходов в зависимости от генотипа PAI-1 4G/5G у женщин с неблагоприятными исходами беременности и женщин без репродуктивных потерь найдено не было

Основываясь на полученных данных о взаимосвязи неблагоприятных исходов беременности и генотипов Т/Т МТНРК и Р1А1/А1 вРШа и протективном эффекте генотипа 11(3 VII фактора, были выделены следующие пары благоприятных и неблагоприятных для вынашивания беременности сочетаний генотипов В группах женщин с данными сочетаниями генотипов был проведен анализ частоты неблагоприятных исходов беременности Данные по частотам неблагоприятных исходов при благоприятных и неблагоприятных для вынашивания беременности сочетаниях генотипов представлены в табл 8

Таблица 8

Распределение частот и относительный риск неблагоприятных исходов у женщин с благоприятными и неблагоприятными для вынашивания беременности сочетаниями генотипов МТНРК, VII фактора и вРШа

Благоприятное сочетание генотипов Частота неблагоприятных исходов Неблагоприятное сочетание генотипов Частота неблагоприятных исходов Относит риск Р

MTHFR ТТ-/ VIIRQ+ 31% MTHFR ТТ+/ VIIRQ- 92% 2,97 р<0,001

GP Illa Р1А1А1-/VIIRQ+ 25% GP Illa Р1А1А1+/ VIIRQ- 81,4% 3,26 р<0,01

MTHFR ТТ-/ GP Illa Р1А1А1-/VIIRQ+ 33% MTHFR ТТ+/ GP Illa Р1А1А1+/ VIIRQ- 92,3% 2,8 р<0,01

Как следует из представленных в табл 8 данных, можно отметить, что при неблагоприятном сочетании 2-3-х генотипов, относительный риск формирования невынашивания беременности повышается в 3 раза, тогда как при 1 неблагоприятном генетическом факторе относительный риск составлял всего лишь 1,3-2,2

Анализ экспрессии генов.

При изучении уровня экспрессии генов факторов регуляции ангиогенеза, с трофобластической стороны плацент с ЗРП по сравнению с нормальными наблюдалось повышение экспрессии РБОРВ (р=0,008), РОБ (р=0,025), УЕСР (р=0,007), ДИОРТ (р=0,04) Наблюдалась также тенденция к повышению экспрессии АТМО, однако эти данные не были достоверными (р=0,11) Мы не нашли различий в экспрессии РЮБ, РОСРА В то же время с трофобластической стороны плацент с ЗРП также отмечалось снижение экспрессии ТБР (р=0,025) (рис 1)

контроль ЗРП

а

УЕвЯ Трофобластическая часть

контроль В

ЗРП

ТЭР Трофобластическая часть

контроль ЗРП б

АлдрН Трофобластическая часть 0,0070 -0,0035

1 0 0007 § 0 0004

7Е-5 3.5Е-5

7Е-1 3 5Е-6

р = 0,0458 *

__!__ _

контроль ЗРП Г

Рис 1 Количественная оценка уровня экспрессии генов ангиогенеза в трофобласти-ческой части плацент у женщин с ЗРП и контрольной группе: а) РБСКВ, б) РСР-2, в) УЕСР, г) А^рЫ, д) ТвР.

ЗРП

контроль Д

Мы не обнаружили изменений в экспрессии РЮР, РБСРА, ангиогенина По-видимому, изменения экспрессии данных факторов не являются характерными для ЗРП

При изучении уровня экспрессии генов регуляции фибринолиза, у женщин с ЗРП мы наблюдали повышение экспрессии РА1-1 (р=0,0017) (рис 2)

*

р-00017

т I

■

контроль зрп

Рис 2 Количественная оценка уровня экспрессии РА1-1 в децидуальной части плацент женщин с ЗРП и контрольной группе

При изучении уровня экспрессии генов факторов, участвующих в воспалительном ответе с децидуальной и трофобластической сторон плацент женщин с ЗРП наблюдалось достоверное повышение экспрессии МСР-1 (р=0,014), а с трофобластической стороны - снижение экспрессии НО-1 (р=0,021) (рис 3)

МСР-1 Децидуальная часть

МСР-1 Трофобластическая часть

контроль ЗРП

контроль ЗРП

НО-1 Трофобластическая часть _ 0 080

контроль б

ЗРП

Рис 3 Количественная оценка уровня экспрессии генов факторов регуляции воспалительного ответа в плацентах женщин с ЗРП и физиологическим течением беременности а) МСР-1, б) НО-1

При изучении экспрессии генов инсулиноподобных факторов роста и лептина с децидуальной стороны плацент у женщин с ЗРП мы наблюдали снижение экспрессии лептина (р=0,003), а также тенденцию к снижению экспрессии ЮБ-П (р=0,22) Не было найдено различий в экспрессии ЮБ-! (рис 4)

Лептин Децидуальная часть

5 0000г

S 0 0050

0 0005

Рис 4 Количественная оценка уровня экспрессии гена лептина в плацентах с ЗРП и контрольной группе

контроль ЗРП

Выводы:

1 Наличие аллелей 677Т MTHFR и P1A1GP Ша в гомозиготном состоянии является фактором риска формирования невынашивания беременности, тогда как гетерозиготный генотип R353Q VII фактора свертывания крови оказывает протективное влияние на течение беременности

2 ДНК-диагностику для выявления генетической предрасположенности к невынашиванию беременности и плацентарной недостаточности целесообразно проводить в группах женщин с повторными случаями невынашивания беременности и/или при отсутствии других факторов риска формирования данной патологии

3 Сочетание нескольких неблагоприятных вариантов в генах коагуляции имеет наибольшее значение для формирования невынашивания беременности

4 В плацентах женщин с задержкой роста плода и первичной плацентарной недостаточностью наблюдается снижение экспрессии НО-1, что может является косвенным свидетельством гипоксии ткани и показателем нарушения антиоксидантной защиты плаценты

5 Первичная плацентарная недостаточность характеризуется изменениями экспрессии генов факторов, регуляции ангиогенеза (повышение экспрессии VEGF, PDGFB, FGF-2, Angpt-1, снижение экспрессии TSP-1, повышение экспрессии МСР-1, фибринолиза (повышение экспрессии PAI-1), медиаторов воспаления и факторов роста (снижение экспрессии генов лептина и IGF-II) Изменения экспрессии изученных генов могут рассматриваться в качестве молекулярных маркеров формирования первичной плацентарной недостаточности и задержки роста плода

Практические рекомендации.

1 Женщины с угрозой прерывания беременности, имеющие НБ в анамнезе или при спорадических случаях с неустановленной этиологией подлежат проведению у них ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к НБ по выявлению полиморфизмов МТНРЯ С677Т, VII фактора 11353(2, бРШа Р1А1/А2 Такое проведение ДНК-диагностики позволит уточнить патогенез и выбрать адекватную тактику лечения для улучшения прогноза и исхода беременности

2 Патогенетически обоснованным является применение препаратов с антиоксидантным действием у женщин с первичной плацентарной недостаточностью У женщин с высоким риском формирования первичной ПН необходимо применять препараты, улучшающих кровоток на более ранних этапах беременности (1 триместр) для правильного становления маточно-плацентарного кровотока, тогда как во 2-3-м триместре такая терапия может оказаться неэффективной

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Никитина Л А, Черепнина А Л Экспрессия генов факторов - регуляторов ангиогенеза и фибринолиза в плаценте женщин с хронической плацентарной недостаточностью// Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения» Тез докл - С-Пб, 2005 - С 11

2 Никитина Л А Частота полиморфизма С677Т метилентетрагидрофо-латредуктазы у женщин с невынашиванием беременности // 1 Международная (X Всероссийская) Пироговская студенческая научная медицинская конференция Тез докл - M, 2006 - С 228-229

3 Никитина Л А Генетические и транскрипционные механизмы плацентарной недостаточности // Московская Международная конференция «Биотехнология и медицина» Тез докл - M , 2006 - С 65

4 Садекова О H , Никитина Л А Роль генетической предрасположенности в развитии невынашивания беременности// XIII Международная конференция «Ломоносов-2006» Тез докл - M , 2006 - С 515

5 Садекова О H , Никитина Л А Роль генетической предрасположенности в развитии невынашивания беременности// Вестник молодых ученых «Ломоносов» Выпуск III M Макс Пресс, 2006 —С 374-382

6 Никитина Л А , Демидова Е M , Радзинский В Е , Демидов Б С , Са-моходская Л M , Роль матриксных белков, цитокинов и факторов ангиогенеза маточно-плацентарного комплекса в регуляции имплантации и плацентации//Вестник РУДН -2006 -№4(36) - С 131-143

7 Nikitina LA, Cherepnma AL, Neizhko ES, Panma OB, Bochkov VN Sélective up-regulation of monocyte chemotactic protein - 1 gene expression m placentas from mtrauterine growth restriction pregnancies American Journal of Reproductive Immunology 2006 - Vol 56(1) -P 51-52

8 Sadekova О N , Nikitina L A, Azarova О Yu , Demidova E M , Bochkov V N, Samokhodskaya L M Association of gene polymorphisme C677T MTHFR and R353Q VII coagulation factor with adverse pregnancy outcomes// European Journal of Médical Research -2006 - Vol ll,suppl II - P 94

9 E M Демидова, Б С Демидов, Л А Никитина, Т H Рашидов, Е В Сысолятина Клеточно-молекулярные взаимодействия в эндометрии Роль в генезе потерь беременности // Научно-практическая конференция «Новые медицинские технологии в поликлинической практике» Тез докл -M,2006 - С 85

10 Садекова О H , Никитина Л А Взаимосвязь полиморфизмов С677Т MTHFR и R353Q гена VII фактора с развитием привычного невынашивания беременности// Итоговая научная студенческая конференция с международным участием «Татьянин день» Тез докл -М,2007 - С 12

11 Никитина JT А , Демидова Е M , Радзинский В Е , Демидов Б С , Са-моходская Л M Молекулярные взаимодействия в регуляции процессов имплантации и плацентации //Акушерство и гинекология - 2007 - №3 -С 5-10

12 Никитина Л А , Абдуллаев С M , Садекова О H , Азарова О Ю , Бочков В H , Демидова Е M , Самоходская Л M Генетические аспекты невынашивания беременности // Молекулярный полиморфизм человека -2007 - Т 2 - M РУДН - С 459-483

13 Nikitma LA, Lukanova ЕА, Buchulaeva NA, Cherepnina AL, Neizhko ES, Рашпа OB, Bochkov VN, Voloschuk IN Abnormal villous tree development m intrauterine growth restriction is accompanied by increased VEGF expression // American Journal of Reproductive Immunology -2007 - Vol 57(6) -P 444

14 ON Sadekova, L A Nikitma, О Yu Azarova, EM Demidova, VN Bochkov, L M Samokhodskaya Adverse pregnancy outcomes a redictive role of gene polymorphisms C677T MTHFR and R353Q VII coagulation factor // Abstract-book of 14th International Student Congress of Medical Sciences -2007 - Groenmgen, Netherlands - P 157

15 Nikitina LA, Sadekova О N , Rashidov T N, Voloschuk IN, Bochkov VN, Demidova EM, Samokhodskaya LM, Tkachuk VA Recurrent early pregnancy loss endometrium is accompanied by decreased VEGF and increased P1GF gene expression // Abstract book of 3d EMBIC Summer School -2007 - Jena, Germany - p 11

«Молекулярно-генетические маркеры невынашивания беременности и плацентарной недостаточности»

Никитина Людмила Александровна (Россия)

Работа посвящена изучению роли ряда генетических и молекулярных факторов в патогенезе невынашивания беременности и первичной плацентарной недостаточности Проанализирована прогностическая значимость проведения ДНК-диагностики на наличие полиморфизмов факторов, оказывающих влияние на процессы свертывания крови (С677Т MTHFR, G1691A V фактора, Р1А1/Р1А2 GPIIIa, R353Q VII фактора) у женщин с невынашиванием беременности

Получены новые данные об изменениях экспрессии генов ангиогенных, ростовых факторов, воспалительных цитокинов при первичной плацентарной недостаточности и задержке роста плода Обсуждаются молекулярные механизмы патогенеза плацентарной недостаточности и задержки роста плода и возможные подходы к лечению и профилактике данной патологии

Molecular-genetic markers of precnancy loss and placental insufficiency.

LiudmilaA Nikitma (Russia)

The aim of the work was to evaluate the role of some genetic and molecular factors m pathogenesis of pregnancy loss and primary placental insufficiency The prognostic significance of DNA-diagnostics of C677T MTHFR, G1691A V factor, P1A1/P1A2 GPIIIa, R353Q VII factor gene polymorphisms m pregnancy loss was analyzed These factors are involved m blood coagulation proceses

New data, concerning changes in gene expression pattern of angiogenic, growth factors and inflammatory cytokines were observed Molecular mechanisms of placental insufficiency and fetal growth restriction pathogenesis and potential therapy and prevention methods are discussed

Заказ № 239/09/07 Подписано в печать 18 09 2007 Тираж 100 экз Уел п л 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \пт> с/г ги, е-таи т/о@с/г ги

Актуальность исследования.

Невынашивание беременности (НБ) является актуальной проблемой современного акушерства. Частота этого осложнения остается стабильной и высокой в течение многих лет, составляя 15 - 30% от общего числа всех желанных беременностей.

По данным Коллегии Минздрава РФ за 2002 г. 50% самопроизвольных прерываний беременности происходит в 1 триместре, а 25% из них приходится на привычное невынашивание.

Одним из механизмов, приводящих к невынашиванию беременности (НБ) на ранних сроках является первичная плацентарная недостаточность. Плацентарная недостаточность (ПН) - патофизиологический феномен, состоящий из комплекса нарушений трофической, эндокринной и метаболических функций плаценты, ведущий к неспособности поддерживать адекватный обмен между организмом матери и плода [4],[6], [12].

Основным звеном патогенеза ПН является нарушение плодово-плацентарного кровотока, приводящее к неадекватному обеспечению растущего плода кислородом и питательными веществами. Окончательное формирование плодово-плацентарного кровотока происходит к 15-16 неделям беременности. При нарушении этого процесса возникает первичная ПН, которая клинически проявляется угрозой прерывания беременности, замершей беременностью и самопроизвольными абортами, наступающими до 16 недель беременности.

Выявление групп риска по формированию ПН и НБ позволило бы прогнозировать это тяжелое осложнение беременности, осуществлять адекватный мониторинг течения гестационного процесса и проводить своевременную коррекцию выявленных нарушений.

Известно, что этиология ПН и НБ является мультифакториальной и включает в себя влияние как экзогенных (социальных, экологических, инфекционных), так и эндогенных (генетических, эндокринных, иммунологических) факторов [11].

Немаловажное место среди других факторов риска формирования НБ при первичной ПН занимает генетическая предрасположенность. Носительство тех или иных аллелей определенных генов может видоизменять течение биохимических процессов в организме матери и способствовать формированию ПН и НБ [5]. Учитывая тот факт, что нарушение плодово-плацентарного кровотока является одним из патогенетических механизмов, приводящих к развитию ПН и НБ, большой интерес представляет изучение генетических полиморфизмов, которые могут измененять процессы свертывания крови. На сегодняшний день известен ряд тромбофилических полиморфизмов, наиболее изученными из которых являются С677Т MTHFR, Лейденская мутация V фактора, мутация нук-леотида 20210 протромбина, Р1А1/Р1А2 GPIIIa, 4G/5G PAI-1. Носительство Лейденской мутации и G20210A гена протромбина по мнению большинства исследователей имеет четкую взаимосвязь с потерей беременности [206]. Данные о роли других полиморфизмов в патогенезе НБ остаются противоречивыми [123]; [237];[189];[198]; [76]. В связи с этим вопрос о необходимости ДНК-диагностики на носительство тромбофилических полиморфизмов у женщин с НБ остается открытым.

Тромбофилия и гиперкоагуляция, к которой приводят вышеописанные полиморфизмы, могут способствовать формированию НБ. Однако существует ряд полиморфизмов, которые приводят к гипокоагуляции. Одним из таких полиморфизмов является полиморфизм R353Q VII фактора свертывания крови. Влияние данного полиморфизма активно изучалось в области кардиологии, где было показано его протективное влияние на формирование ИБС и ее осложнений [93], [246]. В настоящее время отсутствуют данные, касающиеся влияния данного полиморфизма на формирование и течение акушерской патологии.

В ряде случаев первичная ПН может перейти в хроническую плацентарную недостаточность, клиническим проявлением которой является задержка роста плода (ЗРП), в результате функциональной недостаточности плаценты на протяжении всего срока гестации. Многолетние наблюдения ряда авторов установили, что при формировании ПН и ЗРП происходит не только резкое увеличение перинатальной смертности, но и многочисленные изменения в организме ребенка, которые на протяжении первых лет жизни являются причиной нарушений его физического и умственного развития, а также повышенной соматической и инфекционной заболеваемости [1], [10]. Терапия препаратами, улучшающими маточно-плацентарный кровоток и антиоксидантами, проводимая на протяжении беременности у женщин с выявленной ЗРП часто оказывается неэффективной, т.к. в основе таких изменений лежат уже сформировавшиеся нарушения сосудистого русла плаценты.

В связи с этим, актуальность приобретает изучение локальных молекулярных и клеточных механизмов развития ПН, которое является основой поиска новых подходов к диагностике и терапии, а также разработки профилактических мероприятий для ее предупреждения.

В последние десятилетия все большее внимание уделяется изучению кле-точно-молекулярных диалогов, происходящих в тканях эндометрия и плаценты, начиная с этапа инвазии бластоцисты и до момента развития родовой деятельности. По данным современной литературы важную роль в поддержании го-меостаза в плаценте играют цитокины, факторы роста, белки межклеточного взаимодействия и др. Функционирование этих факторов проходит в тесном взаимодействии друг с другом и контролируется уровнем стероидных гормонов [70].

Однако, несмотря на прогресс в области изучения локальных молекулярных механизмов имплантации и плацентации, эти данные являются пока недостаточными для представления всего спектра молекулярных процессов, происходящих в тканях маточно-плацентарного комплекса. Совершенно очевидно, что необходимы дальнейшие исследования, которые помогут расширить представления о локальных регуляторных взаимодействиях в плаценте, что, в свою очередь, позволит предложить новые подходы к решению проблем акушерства.

Цель исследования.

Целью исследования явилась комплексная оценка молекулярно-генетических маркеров НБ и ПН, таких как факторы коагуляции, ангиогенеза, медиаторы воспаления и факторы роста для совершенствования подходов к диагностике, терапии и прогнозированию репродуктивных потерь и гипотрофии плода.

Задачи исследования.

1. Изучить частоту встречаемости полиморфных аллелей 677Т MTHFR, 1691А фактора V, Р1А2 GPIIIa, 353Q VII фактора свертывания крови в группе женщин с угрозой прерывания беременности и контрольной группе популяционной выборки. Провести оценку относительного риска формирования симптомокомплекса НБ при носительстве полиморфных аллелей генов MTHFR, VII фактора и GP Ша и их сочетаний у женщин с угрозой прерывания беременности.

2. Изучить уровень экспрессии генов регуляции ангиогенеза (P1GF, PDGFA, PDGFB, FGF-2, ANGPT-1, ANG, TSP), коагуляции и фибринолиза (TF, uPA, uPA-R, PAI-1) в плацентах у женщин с ЗРП.

3. Изучить уровень экспрессии генов медиаторов воспаления (МСР-1, ICAM, СОХ-2, MIP-la, MIP-lb, TGF-b, IL-8, MIF, RANTES, HO-1) в плацентах у женщин с ЗРП.

4. Изучить уровень экспрессии генов ростовых факторов IGF-1, IGF-2 и леп-тина в плацентах у женщин с ЗРП.

Научная новизна.

1. Впервые определены группы риска развития НБ, обусловленного генетической предрасположенностью среди женщин с угрозой прерывания беременности на ранних сроках.

2. Впервые выявлена протективная роль полиморфизма R353Q VII фактора свертывания крови при НБ.

3. Впервые установлена более высокая прогностическая значимость сочетаний генотипов С677Т MTHFR, Р1А1/Р1А2 GPIIIa и R353Q VII фактора свертывания крови для оценки риска потери беременности по сравнению с каждым из этих полиморфизмов в отдельности.

4. Впервые получена количественная оценка уровня экспрессии генов регуляции ангиогенеза (P1GF, PDGFA, PDGFB, FGF-2, VEGF, ANGPT-1, ANG, TSP), коагуляции и фибринолиза (TF, uPA, uPA-R, PAI-1), медиаторов воспаления (МСР-1, ICAM, СОХ-2, MIP-la, MIP-lb, TGF-b, IL-6, IL-8, MIF, RANTES, HO-1) и факторов роста (лептина, IGF-1, IGF-2) в плацентах у женщин с ЗРП и первичной ПН, а также физиологическим течением беременности.

Практическая значимость

Полученные данные по частотам полиморфизмов С677Т MTHFR, Р1А1/Р1А2 GPIIIa, R353Q VII фактора свертывания крови позволили выделить среди женщин с НБ группу риска с генетической предрасположенностью к НБ, связанной с изменениями в генах свертывания крови; таким образом, определен контингент женщин с НБ, которым целесообразно проводить генотипирование на генетические маркеры тромбофилии. Наибольшее диагностическое и прогностическое значение имеет выявление 2-х и более неблагоприятных генетических факторов, отражающих тромбофилическое состояние в организме женщины, что может указывать на необходимость проведения у таких женщин терапии антикоагулянтами на различных этапах беременности в соответствии с результатами исследования системы гемостаза.

Сравнительная оценка уровня экспрессии генов основных регуляторных белков в плацентах женщин с первичной ПН и ЗРП позволила выявить молекулярные маркеры, коррелирующие с функциональной недостаточностью плаценты. Такими маркерами явились: фермент гемоксигеназа (НО-1), белки, вовлеченные в процесс регуляции ангиогенеза - VEGF, FGF-2, PDGF, Angpt-1, МСР-1, а также лептин, важный регулятор обмена веществ.

Полученные данные могут свидетельствовать о нарушении регуляции процессов ангиогенеза в плаценте при первичной ПН, которые сохраняются до поздних сроков беременности. Полученные данные позволяют рекомендовать терапию, направленную на усиление маточно-плацентарного кровотока на ранних сроках беременности, которая будет способствовать правильному созреванию сосудов плаценты и ее нормальному функционированию в более поздние сроки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Генетические факторы оказывают наиболее выраженное влияние на формирование симптомокомплекса невынашивания беременности у женщин с повторными выкидышами при отсутствии других факторов риска невынашивания беременности.

2. Наличие аллелей 677Т MTHFR и P1A1GP Ша в гомозиготном состоянии является фактором риска формирования неблагоприятных исходов беременности; гетерозиготный генотип R353Q VII фактора свертывания крови оказывает протективное действие на течение беременности при угрозе невынашивания. Сочетание генотипов Т677Т MTHFR и Р1А1/Р1А1 GP Ша при отсутствии протективного генотипа R353Q VII фактора связано с максимальным риском потери беременности. Наличие полиморфизма -675 4G/5G гена PAI-1 не связано с развитием симптомокомплекса невынашивания беременности.

3. При первичной ПН и ЗРП в плаценте происходит активация экспрессии факторов, активирующих процессы ангиогенеза VEGF, FGF-2, PDGF, Angpt-1, МСР-1, повышение экспрессии гена PAI-1, снижение экспрессии гена НО-1 и лептина.

Апробация работы, внедрение результатов работы в практику

Основные положения и результаты исследования представлены и обсуждены на Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» - (Санкт-Петербург, 2005), Международной Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2006), Московской Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2006 (Москва, 2006), Европейском Конгрессе по репродуктивной иммунологии (Грац, Австрия, 2006), Европейской студенческой конференции будущих врачей и молодых ученых (Берлин, Германия, 2006), Итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татьянин день» (Москва, 2007), Международном конгрессе по репродуктивной иммунологии (Опатия, Хорватия, 2007), Летней школе Европейской организации по изучению имплантации эмбрионов (EMBIC) (Йена, Германия, 2007), на апро-бационной комиссии МГУ им. Ломоносова 28 февраля 2007 года.

На основании данных, полученных в диссертации, подана заявка на патент «Применение ДНК-диагностики на наличие полиморфизма R353Q в гене фактора VII свертывания крови для оценки предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности и способ оценки предрасположенности к этому заболеванию путем анализа полиморфизмов С677Т гена MTHFRh R353Q гена фактора VII»

Предложенный алгоритм по выявлению генетической предрасположенности у женщин с НБ используется в отделении патологии беременности №2 клиники Акушерства и гинекологии ММА им. Сеченова

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, иллюстрированного 40 рисунками и 30 таблицами. Указатель литературы включает в себя 254 источника отечественной и зарубежной литературы.

ВЫВОДЫ.

1. Наличие аллелей 677Т MTHFR и P1A1GP Ilia в гомозиготном состоянии является фактором риска формирования невынашивания беременности, тогда как гетерозиготный генотип R353Q VII фактора свертывания крови оказывает протективное влияние на течение беременности.

2. ДНК-диагностику для выявления генетической предрасположенности к невынашиванию беременности и плацентарной недостаточности целесообразно проводить в группах женщин с повторными случаями невынашивания беременности и/или при отсутствии других факторов риска формирования данной патологии.

3. Сочетание нескольких неблагоприятных вариантов в генах коагуляции имеет наибольшее значение для формирования невынашивания беременности.

4. В плацентах женщин с задержкой роста плода и первичной плацентарной недостаточностью наблюдается снижение экспрессии НО-1, что может является косвенным свидетельством гипоксии ткани и показателем нарушения антиок-сидантной защиты плаценты.

5. Первичная плацентарная недостаточность характеризуется изменениями экспрессии генов факторов, регуляции ангиогенеза (повышение экспрессии VEGF, PDGF, FGF-2, Angpt-1, снижение экспрессии TSP-1, повышение экспрессии МСР-1), фибринолиза (повышение экспрессии PAI-1), факторов роста (снижение экспрессии генов лептина и IGF-II). Изменения экспрессии изученных генов могут рассматриваться в качестве молекулярных маркеров формирования первичной плацентарной недостаточности и задержки роста плода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Женщины с угрозой прерывания беременности, имеющие НБ в анамнезе или при спорадических случаях с неустановленной этиологией подлежат проведению у них ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к НБ по выявлению полиморфизмов MTHFR С677Т, VII фактора R353Q, GPIIIa Р1А1/А2, Такое проведение ДНК-диагностики позволит уточнить патогенез и выбрать адекватную тактику лечения для улучшения прогноза и исхода беременности.

Патогенетически обоснованным является применение препаратов с ан-тиоксидантным действием у женщин с первичной плацентарной недостаточностью. У женщин с высоким риском формирования первичной ПН необходимо применять препараты, улучшающих кровоток на более ранних этапах беременности (1 триместр) для правильного становления маточно-плацентарного кровотока, тогда как во 2-3-м триместре такая терапия может оказаться неэффективной.