Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Молекулярно-генетические, гормональные и иммунологические особенности врожденной соматотропной недостаточности у детей

на правах рукописи

ЧИКУЛАЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ, ГОРМОНАЛЬНЫЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВРОЖДЕННОЙ СОМАТОТРОПНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У ДЕТЕЙ

(14.00.03 - эндокринология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации аа соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена в НИИ Детской эндокринологии ГУ Эндокринологический научный центр Российской Академии Медицинских Наук (директор - академик РАН и РАМН, профессор И.И.Дедов)

Научный руководитель: доктор медицинских наук

профессор В.Л.Петеркова

Научный консультант: кандидат медицинских

наук С.А.Прокофьев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

профессор Е.И.Марова

доктор медицинских наук профессор В.В.Санрнов

Ведущее учреждение: Российская государственная

медицинская академия последипломного образования

Защита диссертации состоится 28 октября 2005 года в 14.00 часов на заседании диссертационного Совета Д.001.013.01 при ГУ Эндокринологический научный центр РАМН по адресу: 117036, Москва, ул. Дм. Ульянова, д.11

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ЭНЦ РАМН Автореферат разослан «_»_2005 года

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук

Т.В.Семвчева

20Q6 -fr /Z /22

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования.

С развитием молекулярной генетики и введением в клиническую практику рекомбинантных форм гормона роста в последние годы коренным образом изменились представления о генезе соматотропной недостаточности. Был открыт ряд генов, молекулярные дефекты которых приводят к нарушению синтеза, секреции или периферического действия гормона роста и ростовых факторов. Однако многие вопросы частоты встречаемости и характера поломки генов при различных формах врожденной соматотропной недостаточности остаются на сегодняшний день до конца не выясненными.

В отечественной медицинской науке это приоритетное направление в настоящее время успешно развивается как на молекулярном, так и клиническом уровне (И.И.Дедов, В.А.Петеркова, П.М.Рубцов, О.В.Фофанова, О.В.Евграфов).

Нарушение секреции гормона роста может быть следствием дефекта гена самого гормона роста (GH1), рецептора рилизинг-фактора гормона роста (GHRH1), гипофизарного фактора транскрипции 1 (IHt 1), предшественника Pit-1 (PROP I), гипофизарного Lim-белка (LHX 3) и гомеобокс-фактора кармана Ратке (HESX 1) (Phillips J.A. 1981; Cogan J.D. 1993; Herr W. 1988; Pfaffle R. 1992, 1998; Fofanova O.V. 1998). Проведение молекулярно-генетического исследования на сегодняшний день является необходимым компонентом комплексного обследования пациентов, генетического консультирования и разработки новых видов лечения.

Основной целью ростостимулирующей терапии в детском возрасте является достижение социально приемлемого роста и улучшения качества жизни пациентов. Пациенты с соматотропной недостаточностью различной этиологии по-разному реагируют на терапию гормоном роста. Изучая эффективность терапии гормоном роста клиницисты пришли к выводу, что ответ на лечение рГР является следствием различных этиологических причин, лежащих в основе нарушения роста, включая генетическую предрасположенность и нарушения обмена.

В последние годы многие педиатры-эндокринологи признают необходимость прогнозирования эффективности лечения рГР с целью улучшения показателей роста у конкретного пациента. Эту задачу решают прогностические модели роста, которые разработаны в настоящее время для различных вариантов низкорослости (Zadik Z.1992; Ranke F. 1993,1999; Bletten S.L. 1993; Schönau E. 2001). Своевременная коррекция проводимой терапии рГР позволит существенно улучшить отдаленный эффект лечения пациентов.

Гормон роста обладает не только ростостимулирующим эффектом, но и влияет на различные обменные процессы в организме, многие из которых неизвестны. Недавние исследования (Kelly K.W. 1994, Clark R.1997, Foster M.P.2000) показывают, что гормон роста и ИФР-1 играют важную роль в регулировании лимфопоэза и иммунологической реактивности. В настоящее время доказано, что гормон роста экспрессируется во всех лимфоидных тканях (Hooghe-Peters E.L. 1995, Kooijman R. 2000), однако детали общего и локального воздействия ГР и ИФР-1 на организм человека остаются еще до конца не выясненными.

Цель работы.

Изучение взаимосвязи молекулярно-генетических, гормональных и иммунологических особенностей различных форм врожденной соматотропной недостаточности с клиническими проявлениями у детей и прогнозом ростового эффекта на фоне терапии рекомбинантным гормоном роста.

Задачи исследования:

1. Исследовать гены CHI; GHRH-R; HESX1; LHX3; POUlFl[Pit-l]; PROP1, участвующие в развитии передней доли гипофиза, синтезе и секреции гормона роста при различных вариантах врожденной соматотропной недостаточности у детей российской популяции.

2. Выявить взаимосвязь ИФР-1, ИФРСБ-3 с молекулярно-генетическими нарушениями у детей с врожденной соматотропной недостаточностью и определить их диагностическое и прогностическое значение.

3. Изучить резервные возможности гипофиза у детей с врожденной соматотропной недостаточностью с помощью стимуляционных проб с рилизинг-гормонами гипофизарных гормонов и оценить их диагностическую значимость;

4. Изучить функциональное состояние иммунной системы у детей с дефицитом гормона роста до и на фоне лечения рГР.

5. Апробировать «Кёльнскую математическую модель» прогноза роста в российской популяции, исследовать зависимость прогностической скорости роста от возраста, пола, степени дефицита гормона роста.

Научная новизна исследования.

Представленная работа является первым в Российской федерации исследованием, в котором впервые у большой группы пациентов с множественным дефицитом гормонов аденогипофиза и изолированной соматотропной недостаточностью проведено полное молекулярно-гене-тическое исследование генов GH1\ GHRH-R; HESX1-, LHX3; TO(/2FI[Pit-l]; PROP1, участвующих в развитии передней доли гипофиза, синтезе и секреции гормона роста. Выявлена частота встречаемости мутаций данных генов при различных вариантах врожденной соматотропной недостаточности у детей российской популяции (31,9%). Показано, что наиболее частой мутацией у пациентов с МДГА является мутация PROP1 гена (34,7%), у пациентов с ИДГР - мутация гена GH1 (26,1%).

Впервые в РФ изучено состояние системы «гипоталамус-гипофиз» у пациентов с врожденной соматотропной недостаточностью, показано, что при проведении стимуляционной пробы с тиролиберином в 37% случаев выявляется гипоталамический уровень поражения. Однако нормальная реакция ТТГ на стимуляцию тиролиберином не исключает развитие, в последующем, вторичного гипотиреоза. Проба с тиролиберином позволяет выявить также парциальный дефицит пролактина при гипопитуитаризме у детей. Нарушение секреции гормона роста у подавляющего большинства пациентов (96 %) имеет гипофизарный характер.

Впервые в РФ изучено состояние иммунной системы у пациентов с гипопитуитаризмом, установлен дисбаланс исходных показателей клеточного иммунитета, изменение функциональной активности различных клеток иммунной системы и восстановление функциональной активности клеток на фоне терапии рГР. Впервые на большой группе детей с врожденной соматотропной недостаточностью изучены особенности

секреции ИФР-1, ИФРСБ-3 и их изменение в динамике на фоне терапии рекомбинантным гормоном роста.

Представленная работа является первым в Российской федерации исследованием, направленным на изучение прогнозирования ростового эффекта на фоне терапии рГР у пациентов с врожденной соматотропной недостаточностью; доказана точность математической формулы прогноза роста у пациентов с гипопитуитаризмом вне зависимости от пола, возраста пациентов, варианта гипопитуитаризма и выраженности соматотропной недостаточности.

Практическая значимость.

Полученные в работе данные позволяют расширить представления о врожденной соматотропной недостаточности у детей. Внедрение в клиническую практику молекулярно-генетического исследования у детей с врожденной соматотропной недостаточностью позволит проводить раннее выявление центрального гипотироидизма, гипогонадизма и гипокортициз-ма; избежать нейрохирургического вмешательства у пациентов с объемным образованием гипофиза при выявлении мутации РЯОР-1 гена. При доказанной молекулярно-генетической основе соматотропной недостаточности проведение повторного функционального тестирования на выброс гормона роста может быть исключено. Определены практические рекомендации для осуществления целенаправленного поиска мутаций генов у детей с различными формами врожденной соматотропной недостаточности. Используемая в работе математическая модель прогноза роста позволяет уже через три месяца вносить коррекцию в применяемые дозы рГР, пересматривать дальнейший алгоритм лечения и наблюдения. Результаты исследования свидетельствуют о необходимости проведения стимуля-ционных проб с гонадолиберином перед назначением заместительной терапии половыми стероидами для дифференциальной диагностики вторичного гипогонадизма и задержки полового созревания.

Апробация работы.

Результаты работы доложены на I Всероссийской школе-семинаре детских эндокринологов «Новые возможности диагностики и терапии болезней эндокринной системы у детей» (Томск, 2003), И Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы нейроэндокринологии", посвященной заместительной терапии гипоталамо-гипофизарной недостаточности (Москва, 2001), рабочем совещании детских эндокринологов г.Москвы (Москва, 2004), Московском съезде эндокринологов (Москва, 2003), III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы нейроэндокринологии» (Москва, 2003), II Всероссийской школе-семинаре детских эндокринологов (Москва, 2004).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них две работы - в зарубежной печати.

Структура в объем работы.

Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, четырех глав собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Работа изложена на листах машинописного текста, иллюстративный материал представлен рисунками и таблицами. Список литературы включает названий ( работ отечественных и зарубежных авторов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Под наблюдением в детской клинике ГУ ЭНЦ РАМН (руководитель -профессор В.А.Петеркова) находилось 197 пациентов с врожденной соматотропной недостаточностью (143 мальчика, 54 девочки) в возрасте 10,6 ± 4,7 лет (2,0-^18,5 лет). SDS роста этих пациентов варьировал от -7,74 до -1,58 (-3,65±1,21). В этой группе пациентов проводилось общеклиническое обследование, включающее сбор анамнеза, жалоб, физикальный осмотр, оценку физического и полового развития. Особенности секреции инсулиноподобного фактора роста (ИФР-1) и связывающего его белка (ИФРСБ-3) изучены исходно у 177 пациентов (102 пациента с ИДГР; 75 - с МДГА); у 65 пациентов эти показатели проанализированы через 1, 2, 3 года лечения рГР.

Молекулярно-генетическое исследование проведено 72 пациентам (42 мальчикам, 30 девочкам); из них 49 пациентов имели множественный дефицит гормонов аденогипофиза и 23 - изолированный дефицит гормона роста. Средний возраст пациентов при проведении обследования составил 11,3 ± 4,7 лет (2,2-Н20,7 лет). В исследование были включены 8 семейных случаев СТГ-недостаточности (15 пациентов), в шести из них (12 пациентов), пациентам был диагностирован МДГА и в двух (3 пациента) -ИДГР.

В группу исследования прогностической модели роста было включено 93 пациента (69 мальчиков и 24 девочки) в возрасте 10,6 ± 3,7 лет (2,8-Пб,9 лет). Все пациенты данной группы ранее не получали лечение генноинженерными препаратами гормона роста.

Иммунологическое исследование проведено у 52 пациентов в возрасте 10,1 ± 4,7 лет (2,8+17,9 лет) до, через 6 и 12 месяцев лечения рГР.

Исследование функции гипоталамо-гипофизарной системы проведено у 30 пациентов с ДГР в возрасте от 4,5 до 19,0 лет (средний возраст 12,8 ± 4,5 лет). Перед проведением стимуляционных проб с рилизинг-гормонами все пациенты не получали заместительную терапию ГР, как минимум, в течение четырех недель.

Оценка физического развития осуществлялась на основании антропометрических показателей - длины и массы тела. Рост, длина верхнего и нижнего сегмента тела измерялись при помощи механического ростомера (Harpenter stadiometer, Holtain Ltd, Crymych, Dyfed, UK) с точностью до 0,1см. Для оценки степени отклонения роста пациента от среднего роста в популяции рассчитывался коэффициент стандартного отклонения SDS (Standard Deviation Score) по формуле: SDS - X - X'/SD, где X - рост пациента, X* - средний конечный рост для данного пола, SD -стандартное отклонение для данного пола. Аналогичным образом оценивалась степень отклонения длины верхнего и нижнего сегмента. Данная методика соответствует Международным Британским стандартам

(Tanner JM, Goldstein H, Whitehouse RH, 1970). Размах рук измерялся по стандартным методикам.

Оценка полового развития проводилась согласно классификации Tanner (1968). Объем тестикул у мужчин оценивался с помощью орхидометра Prader.

Гормональные исследования с использованием радиоиммунных методов осуществлялись в лаборатории гормонального анализа ГУ ЭНЦ РАМН (руководитель-профессор Н.П.Гончаров). Для оценки соматотропной функции гипофиза использовались провокационные тесты с клонидином и/или инсулином. Клофелин (клонидин) вводился per os в дозе 0,15 мкг/м2 поверхности тела. Забор крови для определения уровня СТГ проводился до и через 30, 60, 90, 120 минут после введения препарата. Инсулин (Actrapid НМ, Novo Nordisk, Дания) применялся в дозе 0,1 Ед/кг массы тела, в/в. Пробы крови для определения уровня СТГ забирались до и через 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минут после введения инсулина.

Для оценки соматотропной, тиреотропной, гонадотропной функции гипофиза использовались провокационные тесты с соматолиберином (ГР-РГ), тиролиберином (Т-РГ), гонадолиберином (Г-РГ). ГР-РГ (GHRH, Ferring, Германия) вводился в дозе 1 мкг/кг массы тела. Т-РГ (TRH, Ferring, Германия) вводился в дозе 200 мкг, в/в. Г-РГ (LHRH (Ferring, Германия) вводился в дозе 60 мкг/ма, в/в. Пробы крови для определения СТГ, ТТГ, ЛГ, ФСГ, пролактина забирались до (-15, О мин.) и через 15, 30, 45, 60, 90, 120 минут после введения препаратов. В ходе пробы оценивался базальный уровень свободного Т4, тестостерона (у мальчиков) и эстрадиола (у девочек). Также для оценки гонадотропной функции использовалась стимуляционная проба с диферелином. Диферелин (Diphereline, Ipsen, Франция) вводился в дозе 0,1мг п/к, однократно. Пробы крови для определения ЛГ, ФСГ забирались до и через 1, 4 часа после введения препарата.

Определение уровней ИФР-1, ИФРСБ-3 проводилось иммунорадио-метрическим (IRMA) методом в лаборатории Университетской детской клиники г. Гиссен, Германия (рук. - профессор W.F.Blum) до начала лечения и через 1, 2, 3 года лечения рГР. Определение диоксипиридинолина (DPD), маркера костной резорбции, в образце суточной мочи пациентов через четыре недели от начала лечения рГР осуществлялось в лаборатории Университетского детского госпиталя г. Кельн, Германия (рук. - профессор E.Schonau).

Молекулярно-генетическое исследование проводилось в лаборатории ДНК-анализа GeNeSIS г. Лейпцига, Германия (рук.- профессор R.Pfaffle). Исследовалось шесть генов: у пациентов с ИДГР - GH1 (5 экзонов), GHRH-R (13 экзонов); у пациентов с МДГА - HESX1 (4 экзона), LHX3 (6 экзонов), PROP1 (3 экзона) и POU1F1 (Pit-1; 6 экзонов). Все кодирующие экзоны изучаемых генов, включая последовательности фланкирующих интронов, были исследованы методом денатурирующей высокоскоростной жидкостной хромотографии (dHPLQ. При выявлении аномальной последовательности методом dHPLC, этот фрагмент далее анализировался путем секвенирования ДНК (dideoxy-DNA-seguencing).

Иммунологическое исследование осуществлялось в лаборатории иммунологии и генетики ГУ ЭНЦ РАМН (рук. - к.м.н. С.А.Прокофьев) Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови проводилась иммунофлуоресцентным методом с помощью моноклональных антител (МкАТ) к дифференцировочным маркерам лимфоцитов человека

(Becton Dickienson, США) на проточном цитометре ФАКСкалибур (Becton Dickicnson, США). Было исследовано относительное и абсолютное количество CD3+; CD4+; CD8+; CD16+; CD20+ клеток крови; индекс CD4+/CD8+. Проведена оценка относительного количества CD23+, CD38+, CD54+. Пролиферативная активность лимфоидных клеток изучалась методом реакции властной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) - спонтанной и стимулированной различными митогенами (фитогемагтлютитин, конканавалин А, митоген лаконоса). Оценка результатов реакции бласттрансформации осуществлялась через 72 часа по включению меченого тритием тимидина на сцинтилляционном счетчике (Mark III, USA). Исследование фагоцитоза нейтрофилов и моноцитов периферической крови проводилось с использованием St.aureus на проточном цитометре ФАКСкалибур. Спонтанная и индуцированная зимозаном хемилю-минесценция осуществлялась на хемилюминометре (LKB, Швеция). Иммуноглобулины A, M, G определялись методом радиальной иммунодиффузии по Манчини («Медицинская иммунология», Россия).

Рентгенография кистей рук с лучезапястными суставами проводилась в отделе рентгенологии (рук. - проф. А.И.Бухман) ГУ ЭНЦ РАМН. Степень дифференцировки скелета оценивалась по методу Greulich 8s Pyle, 1959.

Магнитно-резонансная томография головного мозга проводилась в отделении MP-томографии (рук. - д.м.н. А.В.Воронцов) ГУ ЭНЦ РАМН на томографе фирмы "Siemens Magnetom Impact" (Erlanger, Germany) с напряженностью магнитного поля 1 Тесла. Толщина среза составляла 3 мм для сагиттальных и фронтальных изображений и 4 мм для аксиальных изображений. Исследование осуществлялось в положении пациента лежа на спине, без предварительной подготовки и премедикации.

Все пациенты получали заместительную терапия рекомбинантным гормоном роста «Хуматроп» (Eli Lilly, США) в виде ежедневных подкожных инъекций в дозе 0,033 мг/кг (0,1 Ед/кг) в вечернее время. Препарат вводился шприц-ручкой «ХуматроПен MG» в графической линии дизайна. Для подкожных инъекций использовались одноразовые иглы «МикроФайн».

Статистический анализ материала проводился с использованием пакета компьютерных программ STATISTICA 6.0 for Windows. Данные при параметрическом распределении показателей представлены в виде: среднее±стандартное OTKAOHCHHc(M±SD[min+max]); при непараметрическом - медиана (3%о^97%о).

Автор выражает благодарность компании Eli Lilly за спонсорскую поддержку проведенных исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Молекулярно-гснетическое исследование детей с врожденной соматотропной недостаточностью.

Отбор пациентов для генетического исследования проводился по совокупности ряда клинических и гормональных параметров, при помощи бальной оценки признаков (Pfäffle R., Blum W.F., 1999).

Во всех исследованных образцах крови (п=72) было обнаружено 23 мутации (31,9%), большая часть найденных изменений выявлена у пациентов с МДГА, причем все они были связаны с PROP1 геном (табл 1).

При обследовании семейных случаев соматотропной недостаточности мутации различных генов были найдены у девяти пациентов из пяти

неродственных семей (всего обследовано восемь семейных случаев; 15 пациентов). В трех семьях (п=б) у пациентов с МДГА были выявлены мутации РЯОР1 гена: 1) ДОАЗО1 /302;8ег1 <Шег; 2) ДСАЗО1/302; Зег1071ег/ДА150; ЭегЮ^г; 3) ДОА301/302;8ег1(тег/С294Т; И991ег); в двух семейных случаях (п=3) у пациентов с ИДГР обнаружена мутация йН1:

Таблица 1.

Общая характеристика выявленных мутаций

МДГА / гены (число пациентов, п=49) Обнаружено мутаций (число пациентов, п (%)

• Pit 1 -

• PROP1 17

• HEXS1 -

• LHX3 -

Всего: 17 (34,7%)

ИДГР / гены (число пациентов, п*23) Обнаружено мутаций (число пациентов, п (%)

• GH1 5

• GHRH-R 1

Всего: 6 (26,1%)

Исследование генов GH 1. GHRH-Rv пациентов с ИДГР fn=23).

Мутации генов, ответственных за синтез ГР, были диагностированы у шести пациентов (26,1%), пять из которых относились к гену GH 1, и одна к гену GHRH-R.

Все выявленные мутации гена GH 1 были доминантно негативными и являлись мутациями de novo У четырех детей обнаружена мутация IVS3+1G—»А; в одном случае - мутация C127T;Q127X / ... Мутация гена GHRH-R была компаундной гетерозиготной - ехЗ Ala57Thr / ех4 Glyl23Asp (таблица 2).

Таблица 2.

Генотип и фенотип пациентов с ИДГР. _

№ Пол, (семья) Возраст постановки диагноза Костный возраст SD8 роста SDS ИФР-1 SD8 ИФРСВ-3 Ген / мутация

1. М(1) 9,0 3,0 -3,49 -6,12 -4,29 GHRH-R Ala57Thr / Glyl23Asp

2. Ж (2) 5,9 2,0 -4,21 -7,86 -2,59 GHI IVS3+1G>A

3. Ж (2) 2,8 2,0 -4,91 -7,09 -5,90 GHI IVS3+1G>A

4. Ж(3) 13,2 11,5 -3,31 -5,23 -1,74 GHI Ex 5 C127T; Q127ter/..

5. Ж (4) 2,0 2,0 -3,06 -6,96 -7,15 GHI IVS3+1G>A

б. М(5) 5,0 3,0 -2,61 -4,94 -4,36 GHI IVS3+1G>A

Таблица 3.

Фенотип ■ генотип пациентов с МДГА с мутациями PROP 1 гена.

№ Пол, (семья) Дефицит гормонов Возраст постановка диагноза ДГР Возраст постановки диагноза гипотиреоз sds роста до начала лечения sds ифр-1 до лечения 8D8 ИФРСВ-3 до лечения Данные мрт Мутация

1. м(1) стг, ттг 14,00 14,00 -7,74 -7,25 -8,94 «Пустое» турецкое седло AGA301 /302;Serl07ter

2. м{2) стг, ттг 4,60 2,50 -2,69 -1,41 -1,28 Норма. AGA301/302;Ser 107ter

3. м(2) стг, ттг, ПРЛ, гтг 7,20 6,00 -2,67 - - Гипоплазия аденогипофиза AGA301/302;Ser 107ter

4. Ж(3) стг, ттг 3,30 3,20 -1,83 -5,29 -0,92 Микроаденома гипофиза AGA301/302;Serl07ter

5. Ж (4) стг, ттг 6,00 7,00 -4,86 -13,50 -6,66 Гипоплазия аденогипофиза AGA301 /302;Serl07ter

6. М(5) стг, ттг 13,00 13,00 -5,74 -13,90 -9,15 Гипоплазия аденогипофиза AGA301 /302;Serl07ter

7. М (6) стг, ттг 10,70 10,50 -4,89 -11,70 -7,11 Норма AGA301/302;Ser 107ter

8. Ж (7) стг, ттг 5,5 4,5 -4,89 -10,2 -8,63 Микроаденома гипофиза—» «пустое» турецкое седло AGA301 /302;Ser 107ter

Таблица 3 (продолжение).

9. М(8) стг, ттг 8,0 8,0 -4,5 -13,99 -3,21 Микроаденома гипофиза —» гипоплазия ДА150;8ег1071ег

10. Ж(9) стг, ттг, ПРЛ, АКТГ 15,2 8,0 -6,4 -12,20 -5,83 Гипоплазия аденогипофиза ДвАЗО 1/302;8егКтег/ ДА150;8ег1071ег

11. М (10) стг, ттг 5,50 6,50 -5,48 -7,05 -5,34 Микроаденома гипофиза ДОАЗО1 /302;5ег1071ег/ ДА150;8ег1071ег

12. М (11) стг, ттг 3,00 3,00 -4,75 -6,01 -5,67 Не проведено ДОАЗО 1/302;Эег КШег/ ДА150;8ег1071ег

13. М(12) стг, ттг 14,4 7,0 -5,34 -12,20 -3,77 Микроаденома гипофиза ДОАЗО1/302;вег1071ег/ ДА150;8ег107<жг

14. Ж (13) стг, ттг 14,50 6,00 -5,06 -9,94 -4,12 Норма ДОА301/302;8ег1071ег/ С294Т; И991ег

15. Ж (13) стг, ттг 14,50 6,00 -6,44 -13,80 -4,05 Гипоплазия аденогипофиза ДОАЗО 1/302;Зег1(Шег/ С294Т; И991ег

16. Ж (13) стг, ттг, гтг 11,50 5,00 -4,16 12,70 -4,20 •Пустое» турецкое седло Д0301/302;8ег1071»г/ С294Т; 1?991ег

17. Ж (14) стг, ттг, ПРЛ, гтг 7,0 3,50 -4,36 -13,60 -5,43 Микроаденома гипофиза -» гипоплазия С295Т; А991ег/ДА150

Исследование генов HESX1-, LHX3\ POUlFl\Pit-l). PROP1 у пациентов с МДГА (п-49).

Все мутации, обнаруженные у пациентов с МДГА, относились к PROP1 гену. Они найдены в образцах ДНК 17-ти пациентов (34,7%; 9 мальчиков, 8 девочек) из 14 неродственных семей. Выявленные мутации PROP1 гена были различными и не зависели от фенотипа пациентов (таблица 3). У 8 пациентов из 7 неродственных семей выявлена классическая гомозиготная мутация - AGA301/302;Serl07ter; у одного пациента -гомозиготная мутация -AA150;Serl07ter. У 8 пациентов из 6 неродственных семей описаны 3 различных компаундных гетерозиготных мутации - 1) AGA301 /302;Ser 107ter/ДА 150;Ser 107ter (4 пациента); 2) ДвАЗО 1/302; Ser 107ter/C294T; R99ter (3 пациента); 3) C295T; A99ter/AA 150 (1 пациент).

Система «гипоталамус-гипофиз» у пациентов с врожденной соматотропной недостаточностью.

Стимуляционная проба с ГР-РГ. После введения ГР-РГ у большинства пациентов (96 %) не отмечалось адекватного повышения концентрации ГР в сыворотке крови, максимальные значения ГР на пробе не превышали 5,0 нг/мл. Медиана максимального уровня СТГ на пробе составила 1,43 нг/мл (0,14-4,26), рис.3.

Таким образом, у большинства пациентов с врожденной соматотропной недостаточностью имеет место гипофизарный характер нарушения секреции ГР. После стимуляции ГР-РГ отмечается более высокий выброс СТГ, чем после введения клофелина, хотя статистически достоверных различий обнаружено не было (р=0,3).

Время (мин)

Рис.3 Выброс СТГ в ответ на введение ГР-РГ.

Выброс ТТГ в ответ на введение тиролиберина. В зависимости от различия на стимуляцию Т-РГ реакция ТТГ классифицировалась следующим образом (Mehta А., Hindmarsh P.C. 2003): «сниженная» (ДТТГ <4,5 мЕд/л с пиковым значением ТТГ в 30 мин. после введения Т-РГ); «нормальная» (Д

ТТГ 4,5-17,5 мЕд/л с пиком концентрации ТТГ в 30 мин. после введения Т-РГ); «интенсивная» (Д ТТГ >17,5 мЕд/л); «замедленная» (пиковая концентрация ТТГ через 60 мин. и более после введения Т-РГ).

Большинство пациентов (14 человек) имели базальные сывороточные уровни ТТГ в пределах нормальных значений <3,5 мЕд/л, повышенная концентрация ТТГ наблюдалась у пяти пациентов (35,7%), рис.4. Медиана базального уровня ТТГ в группе обследованных пациентов составляла 3,29 мЕд/л (0,07+8,0).

В ответ на введение Т-РГ медиана максимального выброса ТТГ составила 21,16 мЕд/л (0,3^41,0), медиана ДТТГ 17,0 мЕд/л (0,0+33,0). После стимуляции Т-РГ семь пациентов (37,0%), продемонстрировали «замедленную» и усиленную реакцию ТТГ (на 90-120 мин), они могут быть рассмотрены, как пациенты с гипоталамическим уровнем поражения.

Время (мин)

Рис.4 Выброс ТТГ в ответ на введение Т-РГ.

Выявлены высокие корреляции между базальным и максимальным уровнем ТТГ (г - 0,86, р<0,05); между базальным уровнем ТТГ и Д ТТГ (г = 0,80, р<0,05); между пиковым значением ТТГ на пробе и «триадой» специфических изменений, выявленных у пациентов при проведении МРТ головного мозга (г= 0,70, р<0,05).

Таким образом, реакция ТТГ на введение Т-РГ у пациентов с ДГР очень индивидуальна и не зависит от особенностей поражения гипоталамо-гипофизарной области. Стимуляционный тест с Т-РГ выявляет сниженную функцию тиреотрофов. Проведение пробы с тиролиберином у пациентов с соматотропной недостаточностью позволило выявить гипоталамический уровень поражения в 37% случаев, однако роль теста с ТРГ в оценке тиреоидной функции у пациентов с гипопитуитаризмом умеренная. Нормальный и интенсивный тест с Т-РГ не исключает развития, в последующем, вторичного гипотиреоза.

Выброс ПРЛ в ответ на введение Т-РГ. В зависимости от различия на стимуляцию Т-РГ реакция ПРЛ классифицировалась следующим образом (Ranke М. et al. 1992): «сниженная» (увеличение ПРЛ менее чем в 2 раза); «нормальная» (увеличение ПРЛ более чем в 2 раза с пиком концентрации

ПРЛ через 15-30 мин. после введения Т-РГ); «замедленная» (пик ПРЛ после 30 мин. от введения Т-РГ).

30 45 60 Время (мин)

Рис. 5 Выброс пролактина в ответ на введение Т-РГ.

Большинство пациентов (89,5%; 17 человек) имели базальные сывороточные уровни ПРЛ в пределах нормальных значений (67,0 - 580 мЕд/л), повышенная концентрация ПРЛ наблюдалась у 2 пациентов (10,53%). Медиана базального уровня ПРЛ в группе обследованных пациентов составляла 273,0мЕд/л (95,0-1016,0).

Таблица 4.

Уровень пролактина при стимуляции ТР-РГ у мальчиков и девочек с ДГР.

Показатели Девочки N = 5 Мальчики N = 14 Общая группа N - 19

ПРЛ базальный (N90,0-580,ОмЕд/л) 198,0 (95,00 + 321,00) 244,5 (106,0 + 949,0) 273,0 (95,0 - 1016,0)

ПРЛ шах 414,0 (162,0 - 735,0) 673,5 (209,0 + 1518,0) 423,0 (162,00 - 1518,00)

Л ПРЛ 140,0 (67,00 - 420,00) 320,0 (30,00 - 663,00) 295,00 (30,00 - 663,00)

Увеличение ПРЛ (количество раз) 1,7 (1,5 + 2,3) 2,0 (1,17 + 7,25) 2,14 (1,17 + 7,25)

Не было отмечено статистически достоверных различий между различными показателями ПРЛ у девочек и мальчиков, общей группой пациентов (р=0,1-0,3), таблица 4.

В ответ на введение Т-РГ медиана максимального выброса ПРЛ составила 423,0 мЕд/л (162,0-1518,0), медиана ДПРЛ 295,0 мЕд/л (30,0+663,0), среднее увеличение ПРЛ на пробе было в 2,38 ± 1,35 (1,17 -7,25) раза по сравнению с минимальным базальным значением ПРЛ в сыворотке крови.

Семь пациентов (36,8%) при нормальном базальном уровне сывороточного ПРЛ продемонстрировали «сниженную» реакцию ПРЛ на стимуляцию ТРГ (парциальный дефицит ПРЛ), рис.5. Два пациента имели проявления базальной гиперпролактинемии (базальный уровень ПРЛ -

1016,0 и 974,0 мЕд/л). На введение Т-РГ они ответили небольшим повышением ПРА (в 1,46 и 1,56 раз, соответственно). Эти пациенты имели типичную триаду изменений в гипоталамо-гипофизарной области по данным МР-томографического исследования; базальный уровень ТТГ у них также был выше нормальных значений.

Выявлены высокие корреляции между пиковыми значениями ПРЛ и базальным уровнем ТТГ (г = 0,75, р<0,05); между максимальным уровнем ПРЛ и А ТТГ после введения Т-РГ (г = 0,75, р<0,05); умеренная корреляция отмечена между пиковым значением ПРЛ и «триадой» специфических изменений головного мозга при МР-томографическом исследовании (г = 0,47, р<0,05).

Стимуляционная проба с гонадолиберинами. Критерием проведения стимуляционных проб с гонадолиберинами было отсутствие признаков полового созревания и достижение костного возраста 12,5 лет у девочек и 13,5 лет у мальчиков. Для оценки гонадотропной функции пациентам проводилось две стимуляционные пробы - внутривенное введение ЬНИН и подкожное введение диферелина.

лг фсг

Время (мм) Врем« (МММ)

Рис.7 Стимуляционная проба с ШИН.

У пяти пациентов уровень максимального ЛГ и ФСГ был выше 3,0 мЕд/л, рис.7. У одного пациента, из пяти ответивших на стимуляцию, уровень максимального ЛГ был 9,9 мЕд/л, а уровень ФСГ - 12,35 мЕд/л, что свидетельствовало об активации гипоталамо-гипофизарной системы и ожидаемом пубертате. У остальных четырех умеренное повышение уровня ЛГ и ФСГ в ходе стимуляционной пробы позволяет предположить гипогонадотропный гипогонадизм, однако этим пациентам требуется наблюдение в динамике. Девять пациентов не ответили на стимуляцию, что расценивается как проявления гипогонадотропного гипогонадизма.

При проведении пробы с диферелином получены аналогичные результаты.

Особенности гормональной секреции у пациентов с мутацией РКОР-1 гена.

Стимуляционные пробы с рилизинг-гормонами проведены у четырех пациентов с мутациями РЯОР1 гена в возрасте от 3,5 до 15 лет. Максимальный выброс СТГ на введение ГР-РГ у всех пациентов не превышал 3,0 нг/мл. При стимуляции Т-РГ у трех пациентов отмечалась «замедленная» и сниженная реакция ТТГ. Одна пациентка не ответила на введение Т-РГ - максимальное значение ТТГ у нее было зарегистрировано в «нулевой» точке и составило 0,3 мЕд/л.

Все пациенты с мутацией РЯОР-1 гена продемонстрировали «сниженную» реакцию ПРА на стимуляцию Т-РГ, несмотря на нормальный уровень базального ПРА. Повышение ПРА от исходного уровня было значительно ниже нормального увеличения (в 1,48; 1,96; 1,15; 1,19 раза, соответственно у пациентов 1; 2; 3; 4), что может быть расценено, как парциальный дефицит пролактина (рис.6).

Выброс СТГ в ответ на ГР-РГ

7 -

^ б Ч

| 5

11 = 4

-Д.А, 3,5 г. -И.Д.бл. -Д.Е, 15 л. -Л.М, 12 л.

15 30 45 60 90 120 150

Выброс ТТГ в ответ на Т-РГ

30

25

£ 20

г

15

и 10

н

5

0

15 30 45 60 90 120 ISO

Время (мин)

Выброс ПРЛ в ответ на Т-РГ

0 1S 30 43 60 90 120 ISO

Время (мин)

Рис.6 Выброс СТГ, ТТГ и ПРА в ответ на введение ГР-РГ, Т-РГ у пациентов с мутацией PROP-1 гена.

Применение математической модели прогноза роста у детей с врожденной соматотродиой недостаточностью н ее клиническое значение.

Целью данного раздела работы явилось апробирование математической модели прогноза роста Schönau Е. et al. (Cologne model; Schönau E. 2001) на группе детей с ДГР Российской популяции. В ней впервые использованы показатели краткосрочной эффективности ГР у конкретных пациентов: маркер костного метаболизма (диоксипиридинолин; DPD); трехмесячная скорость роста на фоне лечения рГР.

Скорость роста на первом году лечения (см/год)= 3,543 - (2,337 х отставание костного возраста) - (0,010 х уровень ИФР-1 до лечения[ц^/Ь]) + (0,100 х DPD после 1 месяца лечения [в нмоль/ммоль креатинина]) + (0,299 х скорость роста после трех месяцев лечения рГР[см/год]). До начала лечения у всех пациентов были определены уровни ИФР-1 и ИФРСБ-3; через четыре недели после первой инъекции рГР в пробе суточной мочи пациента определялось содержание диоксипиридинолина; через три месяца терапии у пациента измерялся рост. При получении результатов указанных обследований проводилось вычисление прогнозируемой скорости роста по математической формуле Schönau Е. Фактическая скорость роста оценивалась у пациентов после первого года лечения рГР. При сравнении прогнозируемой и фактической скорости роста статистически достоверных различий получено не было (р=0,2). Математически вычисленный прогноз роста практически совпадал с фактической прибавкой роста.

Прогнозируемая скорость роста = 10,16 ± 2,91 (5,4 - 20,8) см/год

Фактическая скорость роста - 10,9 ± 3,35 (5,6 - 19,4) см/год

Зависимость скорости роста от пола ребенка. При разделении по полу группа мальчиков и группа девочек была сопоставима по всем признакам. За первый год терапии девочки выросли несколько больше (фактическая скорость роста 11,37 ± 3,61 см/год), чем мальчики (10,6 ± 3,61 см/год), однако различия оказались статистически недостоверными (р - 0,34). Прогнозируемая скорость роста в обеих группах также практически совпала с фактической скоростью роста (таблица 3).

Таблица 3.

Прогнозируемая и фактическая скорость роста _в зависимости от пода ребенка. _

Показатели Общая группа (п-93) Мальчики (п=б9) Девочки (п=24)

Прогнозируемая скорость роста (см/год) 10,16 ±2,91 (5,4 - 20,8) 9,87 ± 2,84лл (5,4 - 20,8) 11,13 ±3,29* (7,7 - 19,6)

Фактическая скорость роста (см/год) 10,90 ± 3,35 (5,6-19,4) 10,60 ± 3,16Л (5,6 - 19,4) 11,37 ±3,61** (6,3-17,9)

*р -0,76- прогнозируемая скорость роста девочек и мальчиков;

лр = 0,33- фактическая скорость роста девочек и мальчиков;

ллр - 0,16 - прогнозируемая и фактическая скорость роста мальчиков;

**р - 0,81 - прогнозируемая и фактическая скорость роста девочек;

Зависимость скорости роста от возраста начала лечения. Для изучения возраста начала терапии рГР на скорость роста пациенты были разделены на две группы - до и старше 10 лет.

Прогнозируемая скорость роста у пациентов до 10-летнего возраста (11,57±3,20 см/год (5,7+20,8), была значительно выше, чем у пациентов старшего возраста (9,14±2,23 см/год (5,4-^15,5), р<0,001. Аналогичные тенденции прослеживались при анализе как абсолютной прибавки роста за

первые три месяца лечения рГР, так и роста фактической скорости роста этих групп (р<0,001) . рис1.

см

до 10 лат старше 10 лет

N•38 N * 65

Рис. 1 Прогнозируемая и фактическая скорость роста в зависимости от возраста начала лечения.

Зависимость скорости роста от уровня ИФР-1 до лечения. Для оценки влияния уровня ИФР-1 на прогнозируемую и фактическую скорость роста пациенты были разделены на две группы. Границей деления был взят уровень ИФР-1 ниже 0,1 перцентили (<-3,0 ЭОЭ ИФР-1); р<0,00001.

см

14-,

SD8 ИФР-1 < -3,0 SDS ИФР-1 > -3,0 N - 8в N « 35

Рис.2. Прогнозируемая и фактическая скорость роста в зависимости от уровня ИФР-1 до лечения.

У пациентов с SDS ИФР-1 <-3,0 и прогнозируемая, и фактическая скорость роста значительно превышали аналогичные показатели в другой группе. Такая же закономерность отмечалась и в отношении абсолютной прибавки роста за первые 3 месяца лечения рГР, рис.2.

Таким образом, «Кёльнская математическая модель» прогноза роста обеспечивает точный прогноз скорости роста на фоне лечения рГР вне зависимости от пола, возраста пациентов, варианта гипопитуитаризма, выраженности соматотропной недостаточности. Используемая модель позволяет уже через три месяца лечения пациента, при необходимости, вносить коррекцию в применяемые дозы рГР, пересматривать дальнейший алгоритм лечения и наблюдения.

Результаты заместительной терапии рекомбинантным гормоном роста детей с врожденной соматотропной недостаточностью.

Уровни ИФР-1. SPS ИФР-1. ИФРСБ-3. SPS ИФРСБ-3 в сыворотке крови определялись до начала заместительной терапии рГР и через 1, 2, 3 года лечения. Исходно, у пациентов с МДГА показатели ИФР-1, ИФРСБ-3 были достоверно ниже, чем у пациентов с ИДГР (р<0,0001). На фоне проводимой терапии рГР через 1 год отмечалось достоверное увеличение показателей как ИФР-1 (рис.8), так и ИФРСБ-3 (рис.9); р<0,0001.

Дод

1 год 2 года Згой дееш лечеши доеш

шгвг

■ 0,811,9 1-5,7 + 3,04) •0,811,1 (- 3,05 * 2,6)

Рис. 8 Динамика ЭРБ ИФР-1 на фоне Рис.9 Динамика ЭРЗ ИФРСБ-3 лечения рГР. на фоне лечения рГР.

Изменение антропометрических показателей у детей с ДГР на фоне заместительной терапии рГР. Обследовано 65 пациентов (47 мальчиков, 18 девочек) в возрасте 10,1±3,55 лет (2,8^16,3) исходно и каждые 6 месяцев в течение трех лет лечения рГР. При анализе исходных антропометрических показателей выявлено, что для пациентов с ДГР характерно гармоничное развитие: соотношение верхнего и нижнего сегмента, среднее значение ИМТ находятся в пределах нормальных значений; приближается к единице показатель размаха рук к росту. Отмечается наибольшее отставание от нормы верхнего сегмента тела по сравнению с линейным ростом и нижним сегментом. На фоне проводимой терапии рГР нормальные пропорции тела сохраняются, отмечается достоверное увеличение вРЭ роста, верхнего и нижнего сегментов через 12, 24 и 36 месяцев лечения (р<0,0001), (рис.10).

-5 I I iii I

До лечения * ГОД 2 года 3 года

лечения лечения лечения

^ Линейный рост □Верхний сегмент [Ц Нижний сегмент

Рис.10. Антропометрические показатели на фоне терапии рГР.

Влияние терапии рГР на иммунную систему детей с ДГР.

При исследовании расширенной иммунограммы у пациентов с врожденной соматотропной недостаточностью до начала терапии рГР выявлен дисбаланс основных популяций лимфоидного ряда: относительное снижение Т-клеточного звена лимфоцитов (CD3+); значительное снижение количества экспрессии молекул адгезии (CD54+ ICAM1); повышение количества NK-клеток (CD 16+) при нормальном уровне В-клеточного звена лимфоцитов (CD20+) и уровне иммуноглобулинов. Отмечалось состояние напряженности иммунной системы в виде повышения уровня спонтанной бласттрансформации лимфоцитов; повышения относительного количества Т-супрессоров (CD8+), NK-клеток (CD16+), которое, возможно, является следствием снижения их функциональной активности (Lebi J. 2000; Bildmaier М. 1997; Geffner М. 1997; Clark R.1997). У пациентов в обследуемой группе не было отмечено изменений фагоцитоза нейтрофилов и моноцитов, но при исследовании хемилюминесценции отмечалось снижение бактерицидных свойств фагоцитарных клеток.

На фоне проводимой терапии рГР у пациентои с врожденной соматотропной недостаточностью происходит (рис.11):

1.Нормализация относительного состава основных популяций лимфоцитов: повышение уровня Т-клеток, CD3+ (р<0,05 через 12 месяцев терапии рГР); нормализация уровня NK-клеток, CD 16+ (р<0,05 через 6 месяцев; р<0,001 через 12 месяцев лечения).

2. Отмечается восстановление функциональной активности клеток иммунной системы: по данным реакции хемилюминесценции (р<0,05 через 6 месяцев; р<0,001 через 12 месяцев терапии рГР), происходит увеличение бактерицидной активности фагоцитов; повышение количества клеток, экспрессирующих молекулы адгезии CD54+ICAM1 (р<0,05); снижение уровня спонтанной бласттрансформации лимфоцитов и коэффициентов активации, вызванных действием митогена КонА (конканавалин А) и PWM (митоген лаконоса), (р<0,05).

CD3+

Хемилюминес цешои спонтавная

Неходко 13 нес.

б мес.

CD16+ НК

Исходна 12 мес. б шее.

CD54+ 1С AMI

X «.«•»о

Исходя^ ^

12 мес.

Рис. 11 Показатели иммунного статуса у пациентов с ДГР на фоне лечения рГР.

ВЫВОДЫ.

1. При исследовании всех известных потенциальных генов (GH1-, GHRH-R; HESX1; LHX3-, POUlFl[Pit-l]; PROP1), ответственных за развитие аденогипофиза, синтез и секрецию гормона роста, молекулярно-генетическая основа врожденной соматотропной недостаточности доказана у 31,9% пациентов российской популяции (23 из 72 обследованных). Наиболее частой мутацией у пациентов с множественным дефицитом гормонов аденогипофиза является мутация PROP 1 гена (17 пациентов; 34,7%). У пациентов с изолированным дефицитом гормона роста - мутация гена GH 1 (26,1%).

2. Проведение пробы с тиролиберином у пациентов с соматотропной недостаточностью позволило выявить гипоталамический уровень поражения в 37% случаев. Нормальная реакция ТТГ на стимуляцию тиролиберином не исключает развитие, в последующем, вторичного гипотиреоза.

3. Стимуляционная проба с гонадолиберином позволяет дифференцировать вторичный гипогонадизм и задержку полового созревания у пациентов с соматотропной недостаточностью с целью выбора соответствующей тактики лечения.

4. Содержание инсулиноподобного фактора роста-1 и ИФР-связывающего белка-3 у детей с соматотропной недостаточностью значительно ниже нормы (ЭИв -6.2 ± 2.9 и -4.1 ± 2.9, соответственно). Заместительная терапия гормоном роста приводит к достоверному увеличению обоих показателей. Уровень ЭБЭ ИФР-1 менее 0,1 перцентили (ЗОЭс-З.О) характерен для пациентов с выраженным дефицитом ГР и является одним из основных показаний для проведения молекулярно-генетического обследования.

5. Использование «Кёльнской математической модели» прогноза роста обеспечивает точный прогноз прибавки роста у пациентов с соматотропной недостаточностью. Прогнозируемая скорость роста первого года лечения рГР составляет 10.16 ± 2.91 (5.4 - 20.8) см/год, фактическая 10.9 ± 3.35 (5.6 - 19.4) см/год, (р=0,2). Прогнозируемая скорость роста зависит от возраста пациентов и уровня ИФР-1 (выше у пациентов младшего возраста и/или при ЭИб ИФР-1<-3,0) и не зависит от пола пациента.

6. При иммунологическом исследовании пациентов с соматотропной недостаточностью имеет место исходное изменение показателей клеточного иммунитета, функциональной активности лимфоцитов, нормальных киллерных клеток и фагоцитов. В результате 6 - 12 месячного лечения рГР наблюдается нормализация субпопуляционного состава лимфоидных клеток и восстановление функциональной активности фагоцитарных клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. При обнаружении мутаций генов НЕБХ!; ЬНХЗ; РКОР1; РОШРЦРй-1] пациентам с врожденной соматотропной недостаточностью необходим постоянный контроль гормонального профиля с целью раннего выявления центрального гипотироидизма, гигюгонадизма и гипокортицизма и своевременного назначения заместительной терапии.

2. Идентификация мутаций генов у пациента с дефицитом гормона роста должна служить показанием для проведения медико-генетического обследования его семьи и настораживать врача в отношении возможных генетических дефектов у сибсов пациента.

3. Доказанная молекулярно-генетическая основа соматотропной недостаточности является основанием необходимости длительной терапии гормоном роста пациентов и исключения проведения повторного функционального тестирования на выброс гормона роста.

4. «Кёльнская математическая модель прогноза роста» может быть использована в клинической практике педиатра-эндокринолога. Используя математически вычисленную прогностическую скорость роста уже после трех месяцев лечения, практический врач (врач-исследователь) может, при необходимости, провести коррекцию дозы вводимого препарата гормона роста, чтобы добиться более высокой скорости роста на фоне проводимой терапии.

5. Перед назначением заместительной терапии половыми стероидами у пациентов с соматотропной недостаточностью необходимо проведение стимуляционной пробы с гонадолиберинами для дифференциальной диагностики вторичного гипогонадизма и глубокой задержки полового созревания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Ростостимулирующее действие генноинженерного препарата гормона роста «Хуматроп» у детей с соматотропной недостаточностью. Материалы X Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство» Москва, 2003, стр.478, (соавт. Безлепкина О.Б., Петеркова В.А. Цибина Л.В.).

2.Использование математической модели краткосрочного прогноза роста для оценки эффективности лечения генноинженерным гормоном роста у детей с соматотропной недостаточностью. III Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы нейроэндокриноло-гии» Москва, 2003, стр.326-327. (соавт. Безлепкина О.В., Цибина Л.В., Петеркова В.А.).

3.Международная программа «GeNeSIS». Ill Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы нейроэндокринологии», Москва, 2003, стр.210-215. (соавт. Цибина Л.В., Безлепкина О.Б., Стребкова Н.А., Таранушенко Т.Е., Чистоусова Г.В., Иванова И.Е.).

4.Новые возможности применения гормона роста. Материалы медико-фармацевтического форума, стр.66-67. Москва, 2003. (соавт. Безлепкина О.Б., Нагаева Е.В., Донина Е.Ю., Чеботникова Т.В.).

5. Программа GeNeSIS в России. «Гормон роста в лечении низкорослости детей» (опыт применения в России) под редакцией И.И. Дедова, Москва, 2003, стр.25-30. (соавт. Безлепкина О.Б., Стребкова Н.А.)

6. Распространенность переломов при гипопитуитаризме. «Остеопороз и остеопатии» №3, 2004, стр.6-8. (соавт. Дедов И.И., Безлепкина О.Б., Нагаева Е.В., Донина Е.Ю., Петеркова В.А.).

7.Использование сгимуляционных проб с гонадолиберинами в диагностике вторичного гипогонадизма у детей с соматотропной недостаточностью. «Достижения науки - в практику детского эндокринолога», Москва, 2005, стр. 181. (соавт. СемичеваТ.В., Петеркова В.А.)

8. Система гипоталамус-гипофиз-щитовидная железа у детей с гипопитуитаризмом. «Достижения науки - в практику детского эндокринолога», Москва, 2005, стр. 182. (соавт. Петеркова В.А.)

9. Модель прогноза роста для оценки эффективности лечения у детей с соматотропной недостаточностью. «Достижения науки - в практику детского эндокринолога», Москва, 2005, стр.130 (соавт. Безлепкина О.Б., Блюм В., Цибина Л.В., Шоенау Е., Петеркова В.А.)

10. Bone Status and Fracture Prevalence in Russian Adults with Chidhood Onset Growth Hormone Deficiency. J Clin Endocrinology and Metabolism, 2004, №10, P4993-4998. (соавт. R. Bouillon, E. Koledova, O. Bezlepkina, J. Nijs, E. Shavrikhova, E. Nagaeva, V. Peterkova, I. Dedov, A. Bakulin, V. Oganov, A. Attanasio).

11. Bone Status and Fracture Prevalence in Russian adults with Childhood Onset Growh Hormone Deficiency. The 86th Annual meeting of the Endocrine Sociey New Orleans, June 16-19, 2004, PI-517 (соавт. R.Bouillon, E.Koledova, O. Bezlepkina, J. Nijs, E. Shavrikova, E. Nagaeva, O. Chikulaeva, V. Peterkova, I. Dedov, A Bakulin, V. Oganov, A. Attanasio).

Список сокращений

ГР - гормон роста

ГР-РГ - гормон роста-рилизинг-гормон

ДГР - дефицит гормона роста

ИДГР - изолированный дефицит гормона роста

ИМТ - индекс массы тела

ИФР-1 - инсулиноподобный фактор роста 1

ИФРСБ-3 - ИФР-связывающий белок 3

ЛГ - лютеинизирующий гормон

МДГА - множественный дефицит гормонов аденогипофиза

ПТС - «пустое» турецкое седло

рГР - рекомбинантный гормон роста

ПРЛ - пролактин

Св. Т4 - свободный Т4

СТГ - соматотропный гормон

Т-РГ - тиреотропин-рилизинг-гормон

ТТГ - тиреотропный гормон

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

vi

Типография ООО «Аведа» 117342, Москва, ул. Введенского, д.8, тел. 332-50-94.

Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. 1.0 пл. Бумага New SvetoCopy.

»176 17

РНБ Русский фонд

2006-4 18122

Актуальность темы.

С развитием молекулярной генетики и введением в клиническую практику рекомбипантных форм гормона роста в последние годы коренным образом изменились представления о генезе соматотропнои недостаточности. Был открыт ряд генов, молекулярные дефекты которых приводят к нарушению синтеза, секреции или периферического действия гормона роста и ростовых факторов. Однако многие вопросы частоты встречаемости и характера поломки генов при различных формах врожденной соматотропнои недостаточности остаются на сегодняшний день до конца не выясненными.

В отечественной медицинской науке это приоритетное направление в настоящее время успешно развивается как на молекулярном, так и клиническом уровне (И.И.Дедов, В.А.Петеркова, П.М.Рубцов, О.В.Фофанова, О.В.Евграфов).

Нарушение секреции гормона роста может быть следствием дефекта гена самого гормона роста (GH1), рецептора рилизинг-фактора гормона роста (GHRH-R), шпофизарного фактора транскрипции 1 (POUlFl[Pit 1]), предшественника Pit-1 (PROP1), гипофизарного Lim-белка (LIIX 3) и гомеобокс-фактора кармана Ратке (HESX1) (Phillips J.A. 1981; Cogan J.D. 1993; Herr W. 1988; Pfdffle R. 1992, 1998; Fofanova O.V. 1998). Проведение молекулярно-генетического исследования на сегодняшний день является необходимым компонентом комплексного обследования пациентов, генетического консультирования и разработки новых видов лечения.

Основной целью ростостимулирующей терапии в детском возрасте является достижение социально приемлемого роста и улучшения качества жизни пациентов. Пациенты с соматотропнои недостаточностью различной этиологии по-разному реагируют на терапию гормоном роста. Изучая эффективность терапии гормоном роста клиницисты пришли к выводу, что ответ на лечение рГР является следствием различных этиологических причин, лежащих в основе нарушения роста, включая генетическую предрасположенность и нарушения обмена.

В последние годы многие педиатры-эндокринологи признают необходимость прогнозирования эффективности лечения рГР с целыо улучшения показателей роста у конкретного пациента. Эту задачу решают прогностические модели роста, которые разработаны в настоящее время для различных вариантов низкорослости (Zadik Z.1992; Ranke M.B. 1993,1999; Blethen S.L. 1993; Schönau E. 2001). Своевременная коррекция проводимой терапии рГР позволит существенно улучшить отдаленный эффект лечения пациентов.

Гормон роста обладает не только ростостимулирующим эффектом, но и влияет на различные обменные процессы в организме, многие из которых неизвестны. Недавние исследования (Kelley K.W. 1994, Clark R.1997, Foster M.P.2000) показывают, что гормон роста и ИФР-1 играют важную роль в регулировании лимфопоэза и иммунологической реактивности. В настоящее время доказано, что гормон роста экспрессируется во всех лимфоидных тканях (Hooghe-Peters E.L. 1995, Kooijman R. 2000), однако детали общего и локального воздействия ГР и ИФР-1 на организм человека остаются еще до конца не выясненными.

Цель работы.

Изучение взаимосвязи молекулярно-генетических, гормональных и иммунологических особенностей различных форм врожденной соматотропной недостаточности с клиническими проявлениями у детей и прогнозом ростового эффекта на фоне терапии рекомбинантным гормоном роста.

Задами исследования:

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать гены GHJ; GHRH-R; HESX1; LHX3\ POUlFl[Pit-l]\ PROP1, участвующие в развитии передней доли гипофиза, синтезе и секреции гормона роста при различных вариантах врожденной соматотропной недостаточности у детей российской популяции.

2. Выявить взаимосвязь ИФР-1, ИФРСБ-3 с молекулярно-генетическими нарушениями у детей с врожденной соматотропной недостаточностью и определить их диагностическое и прогностическое значение.

3. Изучить резервные возможности гипофиза у детей с врожденной соматотропной недостаточностью с помощью стимуляционных проб с рилизинг-гормонами гипофизарных гормонов и оценить их диагностическую значимость;

4. Изучить функциональное состояние иммунной системы у детей с дефицитом гормона роста до и на фоне лечения рГР.

5. Апробировать «Кёльнскую математическую модель» прогноза роста в российской популяции, исследовать зависимость прогностической скорости роста от возраста, пола, степени дефицита гормона роста.

Научная новизна исследования.

Представленная работа является первым в Российской федерации исследованием, в котором впервые у большой группы пациентов с множественным дефицитом гормонов аденогипофиза и изолированной соматотропной недостаточностью проведено полное молекулярно-генетичсское исследование генов GH1\ GHRH-R; HESX1; LIIX3; POUlFl[Pit-l]; PROP1, участвующих в развитии передней доли гипофиза, синтезе и секреции гормона роста. Выявлена частота встречаемости мутаций данных генов при различных вариантах врожденной соматотропной недостаточности у детей российской популяции (31,9%). Показано, что наиболее частой мутацией у пациентов с МДГА является мутация PROP1 гена (34,7%), у пациентов с ИДГР - мутация гена GH1 (21,7%).

Впервые в РФ изучено состояние системы «гипоталамус-гипофнз» у пациентов с врожденной соматотропной недостаточностью, показано, что при проведении стимуляционпой пробы с тиролнберином в 37% случаев выявляется гипоталамический уровень поражения. Однако нормальная реакция ТТГ на стимуляцию тиролнберином не исключает развитие, в последующем, вторичного гипотиреоза. Проба с тиролнберином позволяет выявить также парциальный дефицит пролактина при гипопитуитаризме у детей. Нарушение секреции гормона роста у подавляющего большинства пациентов (96 %) имеет пшофнзарный характер.

Впервые в РФ изучено состояние иммунной системы у пациентов с гипопитуитарнзмом, установлен дисбаланс исходных показателей клеточного иммунитета, изменение функциональной активности различных клеток иммунной системы и восстановление функциональной активности клеток на фоне терапии рГР. Впервые на большой группе детей с врожденной соматотропной недостаточностью изучены особенности секреции ИФР-1, ИФРСБ-3 и их изменение в динамике на фоне терапии рекомбинантным гормоном роста.

Представленная работа является первым в Российской федерации исследованием, направленным на изучение прогнозирования ростового эффекта на фоне терапии рГР у пациентов с врожденной соматотропной недостаточностью; доказана точность математической формулы прогноза роста у пациентов с гипопитуитарнзмом вне зависимости от пола, возраста пациентов, варианта гипогштуитаризма и выраженности соматотропной недостаточности.

Практическая значимость.

Полученные в работе данные позволяют расширить представления о врожденной соматотропной недостаточности у детей. Внедрение в клиническую практику молекулярно-генетического исследования у детей с врожденной соматотропной недостаточностью позволит проводить раннее выявление центрального гипотироидизма, гипогонадизма и гипокортицизма; избежать нейрохирургического вмешательства у пациентов с объемным образованием гипофиза при выявлении мутации Р1ЮР1 гена. При доказанной молекулярно-генетической основе соматотропной недостаточности проведение повторного функционального тестирования на выброс гормона роста может быть исключено. Определены практические рекомендации для осуществления целенаправленного поиска мутаций генов у детей с различными формами врожденной соматотропной недостаточности. Используемая в работе математическая модель прогноза роста позволяет уже через три месяца вносить коррекцию в применяемые дозы рГР, пересматривать дальнейший алгоритм лечения и наблюдения. Результаты исследования свидетельствуют о необходимости проведения стимуляциопных проб с гонадолиберином перед назначением заместительной терапии половыми стероидами для дифференциальной диагностики вторичного гипогонадизма и задержки полового созревания.

Апробация работы.

Результаты работы доложены на I Всероссийской школе-семинаре детских эндокринологов «Новые возможности диагностики и терапии болезней эндокринной системы у детей» (Томск, 2003), II Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы нейроэндокринологии", посвященной заместительной терапии гипоталамо-гипофизарной недостаточности (Москва, 2001), рабочем совещании детских эндокринологов г.Москвы (Москва, 2004), Московском съезде эндокринологов (Москва, 2003), III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы нейроэндокринологии» (Москва, 2003), II Всероссийской школе-семинаре детских эндокринологов (Москва, 2004).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них две работы - в зарубежной печати.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, четырех глав собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Работа изложена на 166 листах машинописного текста, иллюстративный материал представлен 36 рисунками и 31 таблицами. Список литературы включает 214 названий (19 работ отечественных и 195 зарубежных авторов).

выводы.

1. При исследовании всех известных потенциальных генов (GH1; GHRH-R; IIESX1; LHX3; POU1F1 [Pit-1]\ PROP1), ответственных за развитие аденогипофиза, синтез и секрецию гормона роста, молекулярно-генетическая основа врожденной соматотропной недостаточности доказана у 31,9% пациентов российской популяции (23 из 72 обследованных). Наиболее частой мутацией у пациентов с множественным дефицитом гормонов аденогипофиза является мутация PROP 1 гена (17 пациентов; 34,7%). У пациентов с изолированным дефицитом гормона роста - мутация гена GH1 (21,7%).

2. Проведение пробы с тиролиберином у пациентов с соматотропной недостаточностью позволило выявить гипоталамический уровень поражения в 37% случаев. Нормальная реакция ТТГ на стимуляцию тиролиберином не исключает развитие, в последующем, вторичного гипотиреоза.

3. Стимуляционная проба с гонадолиберином позволяет дифференцировать вторичный гипогонадизм и задержку полового созревания у пациентов с соматотропной недостаточностью с целью выбора соответствующей тактики лечения.

4. Содержание инсулиноподобного фактора роста-1 и ИФР-связывающего белка-3 у детей с соматотропной недостаточностью значительно ниже нормы (SDS ИФР-1: -5,62 ± 3,9 и SDS ИФРСБ-3: -2,94 ± 3,1). Заместительная терапия гормоном роста приводит к достоверному увеличению обоих показателей. Уровень SDS ИФР-1 менее 0,1 перцентили (SDS<-3,0) характерен для пациентов с выраженным дефицитом ГР и является одним из основных показаний для проведения молекулярно-генетического обследования.

5. Использование «Кёльнской математической модели» прогноза роста обеспечивает точный прогноз прибавки роста у пациентов с соматотропной недостаточностью. Прогнозируемая скорость роста первого года лечения рГР составляет 10,16 ± 2,91 (5,4 - 20,8) см/год, фактическая 10,9 ± 3,35 (5,6 -19,4) см/год, (р=0,2). Прогнозируемая скорость роста зависит от возраста пациентов и уровня ИФР-1 (выше у пациентов младшего возраста и/или при БОБ ИФР-1 <-3,0) и не зависит от пола пациента.

6. При иммунологическом исследовании пациентов с соматотропной недостаточностью имеет место исходное изменение показателей клеточного иммунитета, функциональной активности лимфоцитов, нормальных киллерных клеток и фагоцитов. В результате 6 - 12 месячного лечения рГР наблюдается нормализация субпопуляционного состава лимфоидных клеток и восстановление функциональной активности фагоцитарных клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. При обнаружении мутаций генов НЕЯХ1; Ы1ХЗ; Р1ЮР1; РОи1П[РИ-1] пациентам с врожденной еоматотропной недостаточностью необходим постоянный контроль гормонального профиля с целью раннего выявления центрального гипотироидизма, гипогонадизма и гипокортицизма и своевременного назначения заместительной терапии.

2. Идентификация мутаций генов у пациента с дефицитом гормона роста должна служить показанием для проведения медико-генетического обследования его семьи и настораживать врача в отношении возможных генетических дефектов у сибсов пациента.

3. Доказанная молекулярно-генетическая основа еоматотропной недостаточности является основанием необходимости длителыюй терапии гормоном роста пациентов и исключения проведения повторного функционального тестирования на выброс гормона роста.

4. «Кёльнская математическая модель прогноза роста» может быть использована в клинической практике педиатра-эндокринолога. Используя математически вычисленную прогностическую скорость роста уже после трех месяцев лечения, практический врач (врач-исследователь) может, при необходимости, провести коррекцию дозы вводимого препарата гормона роста, чтобы добиться более высокой скорости роста на фоне проводимой терапии.

5. Перед назначением заместительной терапии половыми стероидами у пациентов с еоматотропной недостаточностью необходимо проведение стимуляционной пробы с гонадолиберинами для дифференциальной диагностики вторичного гипогонадизма и глубокой задержки полового созревания.