Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Молекулярно-генетическая диагностика острой перемежающейся порфирии

Лучинина Юлия Алексеевна

Молекулярно-генетическая диагностика острой перемежающейся порфирии

14.01.21 - Гематология и переливание крови 03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Москва, 2010

004613921

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН

Научные руководители:

академик РАН и РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.И. Воробьев кандидат биологических наук A.B. Лукьяненко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович кандидат медицинских наук Демидова Ирина Анатольевна

Ведущее научное учреждение:

Федеральное Государственное учереждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агенства (ФГУ «РосНИИГТ» ФМБА России)

Защита состоится « 8 » декабря 2010 г. в 14.00 часов

на заседании диссертационного Совета Д 001.042.02 при Учреждении Академии Медицинских Наук Гематологический научный центр РАМН по адресу: 125167 Москва, Новый Зыковский проезд, д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Академии Медицинских Наук Гематологический научный центр РАМН

Автореферат разослан >> Р/С/с^^Ь^- 2010 года

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Е.Е.Зыбунова.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Порфирия - редкое наследственное заболевание, имеющее восемь нозологических форм, каждая из которых ассоциирована с дефицитом одного из ферментов системы биосинтеза гема. Для всех нозологий этого заболевания характерно накопление тех или иных промежуточных продуктов порфиринового обмена в зависимости от дефицита ферментов соответствующих метаболических стадий, избыток которых приводит к клиническому проявлению болезни. Острая перемежающаяся порфирия вместе с вариегатной порфирией, врожденной копропорфирией и порфирией, обусловленной дефицитом дегидратазы 5-аминолевулиновой кислоты, образует группу острых печеночных порфирий. Все острые порфирии имеют аутосомно - доминантный тип наследования. Повышенный интерес клиницистов и генетиков к группе острых порфирий обусловлен тем, что эти заболевания, проявляющиеся в виде повторяющихся острых приступов с преимущественным поражением нервной системы, при неправильной диагностике и лечении представляют серьезную угрозу для жизни пациентов. Приступы провоцируются рядом эндогенных и экзогенных факторов (лекарственные препараты, алкоголь, изменение гормонального статуса и др.), стимулирующих экспрессию синтетазы дельта-аминолевулиновой кислоты, первого фермента в цепи биосинтеза гема.

В ГНЦ РАМН работы по обследованию и лечению больных с нарушением порфиринового обмена ведутся с 1996г. За это время обследовано 638 человек с направительным диагнозом острая порфирия, среди которых выявлено 133 больных с острыми формами порфирий, а с диагнозом ОПП оказалось 102 человека. Такое доминирование острой перемежающейся порфирии, наиболее тяжелой и распространенной формы острых порфирий, определяет повышенную актуальность наиболее детального обследования пациентов с этим диагнозом.

Острая перемежающаяся порфирия вызывается частичным дефицитом фермента порфобилиногендезаминазы и клинически чаще всего проявляется после достижения пубертатного возраста. В мире известны единичные случаи заболевания детей, и все они связаны с гомозиготным носительством дефектного гена, в то время как взрослые за редчайшими исключениями являются гетерозиготными носителями.

\

Своевременная точная диагностика и адекватная терапия позволяют спасти подавляющее большинство больных. В период развернутых острых проявлений заболевания, как правило, удается установить правильный диагноз острой перемежающейся порфирии, основываясь на клинических признаках и биохимической диагностике. Что же касается асимптомных носителей, то для них даже биохимическая диагностика, основанная на измерении активности порфобилиногендезаминазы в эритроцитах, далеко не всегда дает однозначный ответ на вопрос о носительстве заболевания, поскольку диапазоны уровней активности фермента у таких пациентов перекрываются с нормальными значениями. Поэтому особое значение приобретает молекулярно-генетическое исследование, позволяющее выявлять латентных, асимптомных носителей дефектного гена, потенциально имеющих риск развития клинической стадии заболевания.

Острая перемежающаяся порфирия (ОПП), имея доминантный характер

наследования, характеризуется невысокой пенетрантностью (по максимальным

оценкам до 10-15%), свидетельствующей о том, что мутация в гене

порфобилиногендезаминазы (ПБГД) является необходимым, но не достаточным

условием клинического проявления болезни, основная тяжесть которого связана не с

недостатком конечного продукта ферментативной реакции, катализируемой ПБГД,

а с накоплением избытка токсичного субстрата-предшественника. Поскольку 50% -

ное снижение активности ПБГД за счет мугантного аллеля не является достаточным

основанием для образования патологического фенотипа, должны существовать

какие-то дополнительные генетические факторы, предопределяющие клиническое

проявление у гетерозиготных носителей мугантного гена. Интенсивные

исследования в области молекулярной генетики острых порфирий ведутся во многих

странах мира. Однако, многие авторы отмечают неполноценность современного

медико-генетического консультирования острых порфирий из-за невозможности

дифференцированного подхода к асимптомным носителям заболевания (особенно,

детям и подросткам) и выделения среди них каких-либо групп риска. Это

обусловлено отсутствием информации о дополнительных генетических факторах,

сонаследующихся с мутантными генами и принципиально влияющих на патогенез

заболевания. Такие факторы в настоящее время обнаружены только для двух

доминантно наследуемых форм порфирий, не относящихся к острым -

4

эритропоэтической протопорфирии и поздней кожной порфирии. Для острых порфирий, к которым относится ОПП, о таких факторах ничего не известно.

Цели исследования:

Определение спектра мутаций в гене ПБГД и характера их возникновения у больных ОПП из различных регионов РФ и стран СНГ, наблюдаемых в ГНЦ РАМН, с использованием эффективных систем генетической диагностики. Выявление дополнительных генетических факторов, предопределяющих клиническое проявление у гетерозиготных носителей мутантного гена.

Задачи исследования:

1) Поиск мутаций в гене ПБГД у больных ОПП, наблюдаемых в ГНЦ РАМН.

2) Разработка скрининговых методов тестирования наиболее часто встречающихся мутаций в гене ПБГД.

3) Выявление асимптомных носителей в семьях больных ОПП, у которых найдено мутационное нарушение в гене ПБГД.

4) Установление просхождения (полифилетическое или монофилетическое) наиболее распространенных мутаций в гене ПБГД у пациентов с ОПП при помощи анализа гаплотипов.

5) Поиск при помощи анализа полиморфных вариантов гена ПБГД функционально неполноценных аллелей этого гена, сочетание которых с мутантным аллелем может определять клиническое проявление ОПП.

6) Изучение возможного влияния на клинику ОПП сочетаний мутантного гена ПБГД с аллельными вариантами различных генов 1-й и 2-й фаз системы детоксикации: цитохромов Р450 (CYP1A1, CYP2E1), микросомальной эпоксидгидролазы (mEPXHl), глутатионтрансфераз (GSTM1, GSTT1), N-ацетилтрансферазы (NAT2).

Научная новизна:

Проведено исследование российских больных ОПП с целью выяснения распределения мутаций в гене ПБГД по типу и локализации в сравнении с другими популяциями. Мутационный анализ, проведенный для 75 больных, выявил 50 различных дефектов в гене ПБГД, 29 из которых ранее в мировой популяции не

встречались. Выявлен характер возникновения наиболее часто встречающихся мутаций и показано, что мутации 53delT и IVS13+2T—>G;+6(+G) имеют монофилетическое происхождение. Впервые изучена возможная ассоциация аллельных вариантов генов фазы 1: CYP1A1 (A2455G), CYP2E1 (G-1259C) и 4-х генов фазы 2: NAT2 (С481Т , G590A G857A), mEPHXl: Tyrll3His - 3-й экзон, Hisl39Arg - 4-й экзон, GSTM1 (Del), GSTT1 (Del) с клиническим проявлением ОПП.

Практическая ценность:

Установление носительства мутантного гена ПБГД у родственников больных ОПП и их своевременное информирование, позволяет избежать развития тяжелой клинической стадии болезни, что приводит к сокращению сроков их лечения, снижению инвалидизации и значительному улучшению качества жизни.

Анализ генетического полиморфизма гена N-ацетилтрансферазы и глугатионтрансферазы можно рекомендовать в качестве прогностического теста для оценки риска клинического проявления ОПП.

Положения, выносимые на защиту.

1. Мутационный анализ гена ПБГД, проведенный для 75 неродственных больных ОПП, выявил 50 различных генных дефектов, 29 из которых ранее в мировой популяции не встречались.

2. Выявление наиболее часто встречающихся мутаций в гене ПБГД и создание для них скрининговых систем тестирования позволяют в ряде случаев сократить время и денежные затраты, необходимые для проведения молекулярно-генетического обследования больных ОПП и их родственников.

3. Проведение генетической диагностики в семьях больных ОПП и выявление асимптомных носителей заболевания помогает избежать тяжелых клинических случаев, требующих дорогостоящего лечения и приводящих к инвалидизации больных.

4. Низкая пенетрантность ОПП (около 10%) свидетельствует о том, что мутация в гене ПБГД является необходимым, но не достаточным условием клинического

проявления болезни, которое в случае ОПП не зависит от сонаследования мутантного аллеля гена ПБГД с функционально неполноценным аллелем этого же гена дикого типа.

5. Исследование полиморфизмов различных генов системы детоксикации показало неслучайную ассоциацию между клиническим проявлением заболевания и генотипом N/N по полиморфизмам гена NAT2.

6. Несмотря на отсутствие статистически достоверных отличий, можно говорить об определенном влиянии полиморфных вариантов генов GSTT и GSTM на клиническое проявление заболевания.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Апробация работы

Диссертационная работа апробирована 5 июля 2010 года на совместном заседании проблемных комиссий «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» и «Опухоли лимфатической системы, патология красной крови, порфирии» Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН.

Основные положения работы доложены на Международной конференции по генетике человека (Прага, 2005г.) и Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы» (Москва, 2006г.).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 141 странице машинописного текста и включают 22 рисунка, 19 таблиц и список литературы из 157 источников.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика больных

В настоящей работе представлены результаты обследования 75 неродственных больных с диагнозом ОПП и их родственников (всего 236 человек). Дифференциальный диагноз ОПП устанавливали на основе сочетания характерных клинических признаков с увеличенным содержанием порфиринов и их предшественников в моче, нормальным содержанием общих порфиринов в кале и сниженной активностью ПБГД в эритроцитах. В обследованной выборке больных отмечается значительное преобладание пациентов из Москвы и Московской области, что объясняется территориальной близостью ГИД РАМН (г. Москва) и более высоким уровнем медицинского обслуживания в столичном регионе.

Среди больных ОПП преобладают женщины (69 из 75). Средний возраст пациентов-мужчин - 42.4 года. Самому молодому - 26 лет, самому пожилому - 62 года. Средний возраст пациенток - 38.6 лет. Самой молодой из пациенток - 20 лет.

Значительную роль в провокации приступов ОПП играет гормональный фон, обусловленный функцией яичников. Он определяет преобладание женщин над мужчинами среди страдающих ОПП (11:1), наблюдаемых в ГНЦ РАМН. У 14% пациентов, в том числе у одного мужчины, причиной приступа стал приём порфириногенных лекарственных препаратов. Инфекции, преимущественно вирусные (СМУ, НВУ, НСУ), стали причиной приступов ОПП у пяти пациенток. Приём алкоголя вызвал приступы у четырёх больных. Двое из них мужчины. Стрессовые ситуации явились причинами приступов у двух пациенток. Контакт с бытовыми красителями привел к приступу ОПП у одной больной. Примерно у 20% больных, наблюдаемых в ГНЦ РАМН, порфириногенный фактор остался неизвестным. В том числе, у троих из шести мужчин.

Среди выборки преобладают больные с тяжёлым течением(75%), что характерно для этой патологии, у остальных больных наблюдались приступы средней и легкой степени тяжести. Стационарное лечение больных ОПП в ГНЦ РАМН занимало от 8 до 270 дней. Средний койко-день - 52.1 дня.

Материалы и методы

Выделение ДНК и РНК: ДНК и РНК выделяли из ядерных клеток периферической крови. Геномную ДНК выделяли по стандартной методике, включающей обработку протеиназой К (200 мкг/мл) и додецилсульфатом натрия (0,5%) в течение ночи при температуре 37°С или 3-4 часов при 55°С с последующей фенольной экстракцией. Тотальную РНК из ядерных клеток периферической крови выделяли при помощи лизиса в гуанидин-изотиоцианатном буфере (4M) с последующей фенольной экстракцией.

ОТ-ГЩР: Реакцию обратной транскрипции проводили в течение 1 часа при 37'С в 20 мкл реакционной смеси, содержавшей 1-2 мкг тотальной РНК, буфер ("Promega"), смесь 4 dNTP ( 1 мМ по каждому), 15 пмоль праймера рр15га, 40 ед. акт. РНКазина ("Promega") и 200 ед. акт. обратной гранскриптазы ("Promega"). ПДР проводили в стандартной смеси (25мкл), содержавшей 20 мМ трис-HCl, pH 8.9, 15 мМ сульфат аммония, 170 мкг/мл BS А, смесь dNTP (200 мкМ по каждому), 2 мМ хлористый магний, по 15 пмоль каждого из праймеров и 2 ед. активности Taq-полимеразы, в две стадии ("nested" PCR): ПЦР I - с аликвотой ОТ-смеси (2 мкл) в качестве матрицы и парой внешних праймеров ppld (или pp2d) и рр 15га; ПЦР II - с аликвотой ПЦР 1-смеси (2 мкл) и парой внутренних праймеров pplda и ppl5rb.

ПЦР: Амплификацию фрагментов гена ПБГД, содержащих отдельные экзоны с фланкирующими их интронными последовательностями, проводили с использованием в качестве матрицы ядерной ДНК (0,1-0,2 мкг) в описанной выше реакционной смеси с парами праймеров, приведенными в таблице 1.

Анализ полученных после проведения ПЦР фрагментов осуществляли при помощи электрофореза в 6% полиакриламидном геле с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете после прокрашивания геля бромистым этидием.

Секвенирование проводили в ЦКП «Геном» ИМБ РАН с помощью набора реактивов ABI PRISM®BigDye™ Terminator v.3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant или вручную по модифицированному методу Сенгера с использованием системы «Macrophore»(Sweden).

Таблица 1. Праймеры, использованные для ОТ-ПЦР, ПЦР и секвенирования фрагментов кДНК и гена ПБГД

Название ,. Структура Локализация Позиция*

Праймеры для ОТ-ПЦР

ррЫ СССАСАСАСАСССТАСТТТСС экзон 1 1070-1089

ррга СТССТАСТАТССССТСССТС экзон 2 4081-4100

рр\да ССТАСТТТССААОССОАССС экзон 1 1081-1100

ррЫЬ СССАТОТСГССТААСОаСАА экзон 1 1098-1117

рр15га _ ТААТСАСТССССАОАТАОСА экзон 15 9437-9418

рр15гЬ ОООАТСТАООСАСГСОАСАСС экзон 15 9394-9374

Праймеры для ПЦР

ррМ СССТАТТТСААССТТОТАОСА 5'-область 769-789

рр!-2 АТОССААССТССООССААТС интрон 1 1208-1189

ррЗ-1 АСАСТАСАААСАОАООООАС интрон 2 42704289

рр1т ОСАООААСААААСАССССОААО экзон 3 4310-4332

рр4-2 АСООССТТТАССТАТАОССА интрон 4 48644845

рр47т ССТАААСАСОСТТТТСТССАСААТ экзон 6 5300-5276

ррб-2 ССААОАОАССТАССАТАСТА интрон 6 5403-5384

РР7-1 СТС АТ АСССТТТСТСТТТС СС интрон 6 5702-5722

рр119т ОТСОТОООААССАОСАСССТ экзон 9 6250-6270

РР9-2 ОСТОТСТСССТСАСТСТТСС интрон 9 6376-6357

РР10 ОСТСАОАОСТСОААОАТСАС интрон 9 7351-7370

ррЮ-2 ААООАОАТОСАОАТОАССТС интрон 10 7630-7611

ррП-1 ССААСТСССАТСТСАСЮСС интрон 10 8106-8125

рр155т ССТАООАТОТТТТТССАТСС интрон11 8442-8462

РР12-2 САОСТСТССААОТССССАСС интрон 12 8628-8609

рр 28т ТААСАОСССТТССАОСТСССА интрон 12 8779-8800

рр14-1х ССАТТТСТТССгеТССАТСС интрон 14 8917-8937

рр15г АСТОАТСССТАССААСТСТС экзон 15 9212-9193

рр!5-2 ССТАТСТТССССССААСТСС 3'-область 9642-9623

Праймеры для секвенирования

ррза АОАТОАОАСТСАТТСССОТС экзон 3 43314350

ррЗ ССАССССАТСТССТТСАТАС интрон 3 44804461

рр4 СССССТТСТСАТССССАСАТ интронЗ 4575-4594

рр5-б ССССАТСАТОААТССТАССА интрон 4 5059-5078

рр7 ТСТСССАССАСТСААСАСТС интрон 7 5950-5931

рр8-9 СОАОАСАОААТАОАООТСАТ интрон 7 5981-6000

ррЮ-1 ССАСАССОААССССАСОАСО интрон 9 7409-7428

РР12 ААААОССОСГСОООАОСААО интрон 11 8363-8382

РРП САССТСТАТСТАСТТОСТСС интрон 11 8394-8375

рр13-14 СТСАООТСТСТССТСАСАСО интрон 12 8751-8770

рр14г ОАСТССАОАСТССТССАСТС интрон 14 9020-9001

рр14-1 ТТСТАСОТАСТССССТСТСА интрон 13 8941-8960

*- ОепВапк ЫСВ1 Асс.№М95623 о

Рестрикционный анализ мутаций: Рестрикционный анализ ПЦР-фрагментов на наличие в них мутаций проводили в реакционной смеси (10 мкл), содержащей 5 мкл ПЦР-смеси, 1 мкл 10-кратного буфера, поставляемого вместе с ферментом, 3 мкл воды и 2 ед. активности соответствующей рестрикционной эндонуклеазы фирмы "Сибэнзим" в объеме 1 мкл. Продукты гидролиза анализировали при помощи ЭФ в 6%-ном ПААГ.

Анализ SNP и гаплотипов гена ПБГД: Используя полимеразную цепную реакцию, мы анализировали 12 известных внутригенных SNP: -234 t/с (rs686624 в базе данных SNP/NCBI) в промоторной области, -64 c/t ( rs589925) в промоторной области, 2377 с/а (rs 1799993) и 2479 g/a (rs474201) в интроне 1, 3530 c/t (rsl 144041) в интроне 3, 3581 g/a (rs 17075) в интроне 3, 3982 c/t (rs549893) в интроне 4, 5237 g/a (rs4272791) в интроне 9, 7064 с/а (rsl784304) в интроне 10, 7539 c/t (rs28990986) в интроне 12, 8578 g/a (rs640603) и 8693 c/t (rsl2276235) в З'-области гена ПБГД. Нуклеотиды были пронумерованы, начиная с первой буквы инициирующего кодона ATG для всетканевой гаоформы (+1).

Исследование полиморфизмов генов детоснкации: Данная часть исследования проводилась в тесном сотрудничестве с д.м.н. Иващенко Т.Э. (лаборатория пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отга РАМН, г. Санкт-Петербург., рук. чл. корр. РАМН Баранов B.C.).

С использованием полимеразной цепной реакции были изучены генетические полиморфизмы 2-х генов фазы 1 системы детоксикации (CYP1A1, CYP2EI) и 4-х генов фазы 2 (GSTM1, GSTT1, NAT2, mEPHXl). Амплификацию фрагментов генов детоксикации проводили как описано выше с парами праймеров, указанных в таблице 2.

Для определения полиморфных вариантов генов NAT2, CYP1A1, CYP2E1, mEPHXl продукты ПЦР подвергали рестрикционному анализу по описанной выше схеме, с использованием соответствующих рестрикционных эндонуклеаз (табл. 2). Продукты гидролиза анализировали при помощи ЭФ в 6%-ном ПААГ.

Таблица 2. Праймерные системы, использованные для исследования генов детоксикации

Ген Полиморфнз м Сочетание праймеров Размер ПЦР-продукта Эндонуклеаза рестрикции

CYP1A1 A2455G (lle462Val) F:GAACTGCCACTTCAGCTG ТСТ/ R:GAAAGACCTCCCAGCGGTCA 187 пн Hinc И

CYP2E1 G1259C D.CCAGTCGAGTCTACATTGTCA/ R:TTCATTCTGTCTTCTAACTGG 410пн Rsal

NAT2 С481Т F.GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC/ R:TTGGGTGATACATACACAAGGG 547 пн Kpnl

G590A 547 пн Taql

G8S7A 547 пн BamHl

mEPHXl экзои 3 Т337С (Tyrll3His) F.GATCGATAAGTTCCGTTTCACC/R: A.TCCTTAGTCTTGAAGTGAGGAT 162пн EcoRV

mEPHXl экзон 4 A415G (Hisl39Arg) F:ACATCCACTTCATCCACGT/ R:ATGCCTCTGAGAAGCCAT 210пн Rsal

GSTM1 F:GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC/ R:GTTGGGCTCAAATATACGGTGG 271пн

CSTT1 F:TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC/ R:TCACCGGATCATGGCCAGCA 315 пн

При анализе делеций в генах глутатион-8-трансфераз гомозиготы и гетерозиготы по нормальному аллелю "+" определяли на элекгрофореграммах по наличию продукта амплификации размером 271 п.н. (GSTMI) и 315 п.н. (GSTT1). Отсутствие соответствующих фрагментов указывало на гомозиготность индивидуума по делеции обоих аллелей. В качестве внутреннего контроля использовали амплификацию фрагмента гена CYP1A1. Гетерозиготные особи 0/+ в наших экспериментах не идентифицировались.

Математические методы анализа: Математическую обработку результатов исследования генов детоксикации проводили с использованием программы Statistica v. 5.0. Достоверность различий популяционных частот определяли с помощью точного двустороннего критерия Фишера по стандартной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений с контрольной группой и с помощью критерия хи-квардрат (%2) по стандартной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений и поправки Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой.

Результаты исследования

Поиск мутаций в гене ПБГД Для 75 неродственных больных с диагнозом ОПП были определены мутационные нарушения в гене ПБГД. В ходе исследования мы применили стратегию поиска мутаций в гене ПБГД, основанную на комплексном подходе, включающем секвенирование ПЦР-фрагментов кДНК и ДНК. Использование РНК в качестве исходного материала для анализа в большинстве случаев позволяет существенно сократить объем процедуры секвенирования в расчете на одного пациента. Информацию о первичной структуре кодирующих областей, содержащих полностью экзоны с 3 по 14, мы получали, секвенируя только один ОТ-ПЦР-фрагмент, тогда как для анализа тех же кодирующих областей на уровне ядерной ДНК требуется исследование, по крайней мере, пяти-семи ПЦР-фрагментов. Метод ОТ-ПЦР также дает возможность легко выявлять большинство мутаций сплайсинга, приводящих к выпадению из мРНК целых экзонов.

Всего нами выявлено 50 различных мутаций, 29 из которых ранее в мировой популяции не встречались (табл.3). Установленный мутационный спектр характеризуется высоким разнообразием: 41 из 50 генных нарушений зафиксированы однократно. Такое большое разнообразие генных дефектов, по крайней мере отчасти, может являться отражением более высокой популяционной и генетической гетерогенности населения России по сравнению с населением других стран, где проводились аналогичные исследования. Мутационные спектры для гена ПБГД, полученные зарубежными исследователями, также отличаются значительной гетерогенностью, но они тем не менее заметно беднее российского. Так, например, в Финляндии, где практически завершена работа по созданию полного регистра семей, затронутых ОПП, при обследовании 196 неродственных больных найдено только 26 различных мутаций. В Швеции, где проводились аналогичные работы, было обследованы 120 семей, затронутых ОПП и обнаружен 41 генный дефект.

Среди обнаруженных нами нарушений в гене ПБГД преобладают миссенс мутации (20) и мутации сплайсинга (18, включая 2 микроделеции в сайтах сплайсинга). Семь раз встретились нонсенс-мутации, 5 раз - микроделеции, у одной пациентки обнаружена микроинсерция.

Таблица 3. Спектр мутаций в гене ПБГД у больных ОПП, проходивших обследование в ГНЦ РАМН

№ п/п Кодом мутация тип мутации ссылка

1 IVS 1+1 G->A сплайсинг Grandchamp et al, 1989

2 IVS1+5 G—A сплайсинг данная работа

3.<»> 18 53delT делеция данная работа

4 24 G71A миссенс данная работа

j«U> 26 C76T миссенс Kauppinen et al, 1995

6 26 G77A миссенс Llewellyn et al, 1993

7 29 C85T нонсенс/спл данная работа

8 IVS3+5 G—+T сплайсинг данная работа

9 31 C92T миссенс данная работа

10 32 G95C миссенс данная работа

11 42 T125C миссенс Whatley et al, 1999

12 60 G178A миссенс данная работа

13 68 202-203delCT деления данная работа

14 1VS5-1 G—С сплайсинг данная работа

15 1VS5-2 А—С сплайсинг данная работа

16 93 T278A миссенс данная работа

17*<" 111 G33IA миссенс Gu et al, 1993b

18 112 C335A миссенс данная работа

19 IVS7(+2+5) delTAAG сплайсинг данная работа

20 139 G415T нонсенс данная работа

21 1VS8-1 G—»A сплайсинг данная работа

22 149 C445T нонсенс Kauppinen et al, 1995

2з«(»> 173 C517T миссенс Lee et al, 1991b

24.К) 173 G518A миссенс Delfau et al, 1990

25 192 G575A миссенс данная работа

26 200-201 delC деления данная работа

27 204 C610T нонсенс Mgone et al, 1994

28 IVS10-1 G~*C сплайсинг данная работа

29 212 T635G миссенс данная работа

30*"' 216 G647A миссенс Lundin et al, 1997

31 216 646insA инсерция данная работа

32 IVSll(-5-4) AT—TC сплайсинг данная работа

33 IVS 11-1 G-C сплайсинг Puyetal, 1997

34 225 C673T нонсенс Kauppinen et al, 1995

35*"> 247 T739C миссенс Mgone et al,1993

36 IVS12+1 G-.C сплайсинг De Siervi et al, 1999

37 IVS 12+1 G—»T сплайсинг Rosipal et al, 1997

38 IVS12-17 A-G сплайсинг данная работа

39 IVS 13+1 G-.A сплайсинг Llewellyn et al, 1996

40»w IVS 13+2 T—>G;insG(+6) сплайсинг данная работа

41 IVS 13+2 T—>A сплайсинг Gross et al, 1999

IVS13(+3+6) delAAGT сплайсинг Pischik et al, 2005

43 283 G849A нонсенс Schreiber et al, 1995

44 IVS14+2 T—>C сплайсинг данная работа

45 325 C973T нонсенс Lam et al, 2001

46 338 T1013G миссенс данная работа

47 338 TI013C миссенс данная работа

48 342-364 1024-1091del 67 деления данная работа

49 343-345 1029-103 3delGAGC A деления данная работа

50 343 T1028C миссенс Floderus et al, 2002

•-мутация найдена более, чем у одного пациента (цифра в скобках обозначает количество человек, у

которых обнаружена данная мутация).

Следует отметить, что в ходе данной работы в двух случаях удалось установить возникновение мутаций de novo (нонсенс мутация GJul39Term и мутация сплайсинга IVS12+1 G->C).

Наиболее распространенными в России оказались мутации 53delT и Argl73Trp (встретились по 8 раз, суммарно около 23%). Причем, если мутация Argl73Trp широко распространена во многих исследованных популяциях, то делеция центрального нуклеотида в стартовом кодоне эритроидной формы ПБГД 53delT найдена только в России. Для этих двух мутаций и для мутаций GlylllArg и Argl73Gln, которые также можно отнести к распространенным в России (встретились 4 и 3 раза соответственно), созданы простые скрининговые тест-системы на основе ПЦР и рестрикционного анализа. В настоящее время эти системы используются для предварительного анализа ДНК вновь поступивших больных перед проведением полномасштабного мутационного исследования. В ряде случаев это позволяет сократить время и денежные затраты, необходимые для идентификации мутаций.

Семейная диагностика носнтельства: Определение патологических дефектов в гене ПБГД у больных ОПП дает возможность провести молекулярно-генетический анализ для их близких родственников с целью выявления асимптомных носителей заболевания. Для большинства найденных мутаций были подобраны упрощенные тест-системы, основанные на рестрикционном или гетеродуплексном анализе, при помощи которых проводилось обследование родственников. В некоторых случаях для анализа мутаций, например 53delT, IVS12-17A—>G, не распознаваемых никакими рестрикционными эндонуклеазами, были сконструированы специальные ПЦР-системы, основанные на использовании праймеров с искусственно введенными заменами, создающими рестрикционные сайты только в мутантных ПЦР-фрагментах.

Когда мутацию было невозможно определить с помощью простых тест-систем, прибегали к секвенированию. Всего за время проведения данной работы такое обследование прошли 161 человека из 50 семей и у 62 из них было обнаружено асимптомное носительство ОПП. (табл.4) Таблица 4. Молеулярно-генетический анализ у родственников больных ОПП.

Таблица 4. Молеулярно-генетический анализ у родственников больных ОПП

мутация Кол-во анализируемый метод анализа Обследованные

неродственных ПЦР-фрагмент родственники

пациентов всего носители

т 1+Ю-.А 1 рр1-1/рр1-2 се квенирование 2 1

№1+50—А 1 рр1-1/рр1-2 РА(Рсй) 6 3

ЗЗгМТ рр1ш/ррЗ РА(Вз1б1) 16 7

С1у24Азр 1 ррЗ-1/ррЗ РА(Крп1) 6 3

А^26Суз ррЗ-1/ррЗ РА(Раи1) 2 2

АГ(>26Н15 1 - - 0 0

01п29Тегт 1 ррЗЛ/ррЗ РА(Вз121Л) 2 1

1У83+50->Т 1 - 0 0

А1а31Уа1 1 - - 0 0

Агк32Рго 1 рр4/рр4-2 РА(Вз1С81) 3 1

Ьеи428ег I рр4/рр4-2- РА(Та8|)- I 0

&у60Аг§ I рр5-6/ррб-2 секвенирование 1 0

202-203с1е1СТ 1 рр4/ррб-2 ГДА 1 0

1У55-Ю—*С 1 рр5-6/рр47ш РА(ОгаШ)*** 2 0

т5-2А—С 1 рр5-6/рр6-2 РА(НаеШ) 2 0

Уа]93Ахр 1 рр7-]/рр7 РА*(Рок1) 14 5

аУ1! 1АгВ рр7-]/рр7 РА(Р$рп41) 13 3

А)а1 12Авр 1 рр7-1/рр7 РА(В5оМА1) 2 1

1УБ7(+2+5)11е1ТААС 1 рр7-1/рр9-2 ГДА" 2 0

01и139Тепп 1 рр8-9/9-2 секвенирование 3 0

1У58-Ш->А 1 рр8-9/9-2 секвенирование 1 1

Агя149Тегт 1 рр119ш/рр9-2 РАфгаШ)"* 2 0

Аг8173Тгр ррЮ/ррЮ-2 РА(НраИ) 20 6

Аг0173О1п рр10/рр10-2 РА(Вк121Л) 4 2

01у192Азр 1 ррЮ/ррЮ-2 секвенирование 1 1

200-20 Ые1С I рр10/рр10-2 РА(МзрЯ91) 5 1

ап204Тегт 1 рр10/рр10-2 РА(Асс361) 5 2

1У510-Ю->С I рр11-1/рр11 РА(ВйР51) 4 4

Ме(212Агв 1 - - 0 0

<31у216Аэр ррН-1/рр11 РА(Вше181) 4 2

646т$А 1 ррП-1/рр11 РА(Рзрп41) 0 0

1У511(-5-4)АТ—ТС 1 - - 0 0

теи-ю—С 1 рр155ш/рр12-2 РА(8та1)»»* 4 2

Агд225Тепп 1 . - 0 0

Суа247Агя рр12/рр12-2 секвенирование 2 2

1У512+Ю—С 1 рр12/рр12-2 РА(ВБ121Л) 5 0

1У512+Ю—Т 1 рр12/рр12-2 РА(Мзр1191) 2 1

1У812-17А—+0 1 рр28ш/рр14г РА(МзрИ91)*** 3 1

1У513+Ю-.А 1 рр13-14/рр15г секвенирование 3 2

1У813+2Т->0;1шС(+6) рр12/рр15г секвенирование 5 3

1У513+2Т—»А 1 рр13-14/рр14г секвенирование- 3 0

1У513(+3 6)ае1ААОТ рр!3-|4/рр!4г секвенирование 1 0

Тгр283Тепп 1 рр14-1х/рр15г РА(НтЯ) 1 1

1У514+2Т—С 1 - - 0 0

Агд325Тегт 1 - - 0 0

Ьеи338А^ 1 рр14-1/рр15гЬ РА(НраН) 4 2

Ьеи338Рго 1 рр14-1х/рр15гЬ РА(НраП) 3 1

1024-109Ш67 1 рр14-1х/рр15гЬ секвенирование 1 1

1029-1 ОЗЗаеГОАБСА 1 - - 0 0

Ьеи343Рго 1 - ■ 0 0

РА - рестрикционный анализ (в скобках указано наименование эндонуклеазы рестрикции),

**- ГДА - тетеродуплексный анализ

*** - использованы специальные ПЦР-системы с искусственным формированием сайта рестрикции в

мутантном аллеле.

Анализ гаплотипов: С целью установления общности или независимости происхождения распространенных в России мутантных аллелей гена ПБГД мы провели их гаплотипирование по 6 локализованным в разных частях этого гена (рис. 1). В исследование были включены больные и их родственники из 19 семей (всего 63 человека), с мутациями: 53(1611", Аг§173Тгр, С1у111А^, С1у216А5р и 1У513(+2)Т—>(3+6(+0).

2377А/С -64Т/С 1

24790/А 3982С/Т 7064С/А 8578Й/А

2 3 4 I 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 3'

■ III II I II ГШ II-

А А |

1 1 АгдПЗТгр I

53с1е1Т &у111Агд 1 /1/513{+2), Т->в;+в+(6)

С1у216Авр

р| *

I /1/5 13(+2), Т->0;*

Рис. 1 Схематическое расположение мутаций и полиморфизмов, использованных для гаплотипирования, в гене ПБГД.

Результаты гаплотипирования представлены в таблице 5. Нам удалось точно установить гаплотипы 58-ми неродственных аллелей гена ПБГД. В отдельных случаях, в связи с недостаточной репрезентативностью некоторых семей, точно идентифицировать аллели и расставить гаплотипы не представилось возможным.

Всего было идентифицировано 15 различных гаплотипов, из которых три оказались наиболее распространенными, 8 - редкими, а остальные встречались со средней частотой. По первым четырем позициям явно выделились три основных коровых гаплотипа - СААТ, ССАТ, ТСвТ и два минорных - ТААТ и ТССТ. Две остальные позиции были наиболее вариабельными и их альтернативные вариации встречались в сочетании практически со всеми коровыми гаплотипами, как мажорными, так и минорными. Интересно отметить, что эти два полиморфизма с динуклеотидами СО никак не связаны, но оба локализованы в олигопуриновых (олигопиримидиновых) блоках, некоторые позиции в которых, судя по всему, также обладают повышенной способностью к мутированию.

Таблица 5. Сочетание мутаций с гаплотипами гена ПБГД

гаплотипы Общее число алеллей 53с1е1Т Агв173Тгр С|у1ПАге 1\'в13(+2) Т-*С+С(+6) [31у21бА5р N(E)**

•64 Ус 2377 а/с 2479 |>/а 3982 с/1 7064 с/а 8578 к/*

С А А Т А в 6 5

С А А Т С О 10 пп219 пп72 3

С А А т С А 8 1 пп72 3

С А А т А А 4 1 1

С С А т С в 5 1 2

С С А т А в 1

С С А т С А 1 1

Т С О с А А 1

т С в с С 0 10 пп88* 1 пп219 5

Т С в т А А 1 1

т С в т С А 1 пп88 1

т С 0 с А в 3 2

т С в с С А 5 1

т А А т А О 1 1

т А А т С А 1 1

Всего 58

*- пациенты, для которых не удалось установить принадлежность мутантного аллеля к одному из двух выявленных альтернативных гаплотипов. ** - ^(Б) - нормальные аллели, сонаследующиеся с мутантными, у больных ОПГ1.

Мутация 53с!е1Т у всех пяти исследованных больных оказалась сцепленной только с одним редким гаплотипом, который в 53 остальных аллелях встретился всего один раз, что свидетельствует о ее монофилетическом происхождении. Гаплотипирование аллелей с мутацией 1У813+2Т—Ю; +6(+0), которая встретилась у наших пациентов дважды и, как делеция 53с1е1Т, нигде кроме российской популяции не была обнаружена, также показало сцепление только с одним гаплотипом. Несмотря на то, что у нас было всего два больных с таким дефектом гена ПБГД, скорее всего он тоже имеет монофилетическое происхождение, поскольку независимое возникновение подобных сложных вариаций представляется крайне маловероятным.

Как и ожидалось, мутации Аг§173Тгр и СТуШАгё оказались сцепленными с несколькими гаплотипами, что характерно для замен, возникающих в динуклеотидах Срв, являющихся, как известно, горячими точками мутагенеза у эукариот. Полифилетическое происхождение этих мутаций отмечено и в других популяциях, для которых проводились подобные исследования. Мутация 01у21бА5р

также оказалась ассоциирована с разными гаплотипами.

18

Поиск функционально неполноценных аллелей гена ПБГД: Пенетрантность мутантного гена при ОПП невысока и клинически болезнь развивается только у 1015% носителей. Так как клиническое проявление ОПП связано не с дефицитом конечного продукта (гема), а с накоплением токсичных субстратов-предшественников, и 50%-ное снижение активности ПБГД за счет мугантного аллеля не является достаточным основанием для формирования клинического фенотипа - речь идет о дополнительных генетических факторах, усиливающих дисбаланс в сисиеме фермент/субстрат. Одним из таких факторов могут быть функционально неполноценные аллели гена ПБГД дикого типа, сочетание которых с мутантным аллелем гена ПБГД может определять его пенетрантность. Такой механизм продемонстрирован группой французских исследователей для эритропоэтической протопорфирии, где найдена прямая корреляция между клиническим фенотипом и сочетанием мутантного и слабо экспрессирующегося аллелей гена феррохелатазы. В рамках данного исследования мы проверили гипотезу о существовании аналогичного механизма для ОПП.

В ходе упоминавшегося выше гаплотипирования гена ПБГД в выборке больных, асимптомных носителей и здоровых индивидов из 19 семей, затронутых ОПП, для 16 больных были точно установлены гаплотипы нормальных аллелей (табл.5) Как видно из приведенных данных, у больных ОПП мутантный аллель гена ПБГД сочетается с нормальными аллелями дикого типа, имеющими самые разные гаплотипы, причем преимущественно наиболее распространенные. Аналогичная картина наблюдается и у асимптомных носителей мутантного гена. Из полученных результатов следовало, что если функциональный полиморфизм, определяющий в сочетании с мутантным аллелем клинический фенотип ОПП, все-таки существует, то во-первых, его нет среди изученных нами БОТ, а во-вторых - он не имеет жесткого сцепления с выявленными коровыми гаплотипами.

Учитывая невысокую эффективность "точечного" поиска, основанного на анализе известных БЬ'Р, в чем мы вполне убедились на собственном опыте, а также то обстоятельство, что искомый полиморфизм может оказаться из разряда новых, до сих пор не выявленных, было решено использовать подход, основанный на секвенировании полноразмерного гена ПБГД у больных ОПП.

Мы амплифицировали и секвенировали полноразмерный ген ПБГД в виде 15-ти перекрывающихся фрагментов длиной от 580 до 1100 пн для двух пациенток с ОПП ( пп41 - мутация 53delT и пп 295 - мутация Argl73Gln ). В обоих случаях прочитанная нуклеотидная последовательность располагалась между позицией - 616 с 5'-стороны от сайта кэпирования и позицией 209 с З'-стороны от сайта полиаденилирования (соответствуют позициям 1748 и 11107 в GenBank NCBI NT_033899) и имела общую протяженность 9360 пн. Анализ расшифрованных последовательностей показал, что в них нет каких-либо новых полиморфных вариаций гена ПБГД. Подводя итоги данной части исследования, можно сказать, что даже определение полной первичной структуры гена ПБГД у больных ОПП не выявляет никаких аллельных вариантов дикого типа, которые, наследуясь совместно с мутантным аллелем, могли бы определять клинический фенотип заболевания.

Мы пытались также ответить на вопрос - может ли влиять на пенетрантность ОПП аномальный сплайсинг мРНК ПБГД, впервые обнаруженный австралийскими учеными [Ong et al, 1998]. Изучив небольшие выборки доноров и больных ОПП, они показали, что мРНК ПБГД (как при ОПП, так и в норме) способна спонтанно терять экзон 3 или экзон 12, или оба экзона вместе, при отсутствии каких-либо дефектов в соответствующих сайтах сплайсинга. Авторы пришли к выводу, что аномальный сплайсинг мРНК ПБГД не влияет на клинику данного заболевания. Поскольку основной стратегией поиска мутаций в гене ПБГД в данной работе является секвенирование кДНК, получаемой в реакции ОТ-ПЦР, аномальный сплайсинг на электрофореграммах с секвенатора мы наблюдаем достаточно часто (примерно в половине случаев). Доля аномальной мРНК, как правило, не превышает 5-10%. Однако, в среднем, у одного из десяти пациентов вклад аномально сплайсированных молекул в общий пул мРНК ПБГД оказывается существенно выше (25-40%). Именно такие пациенты и представляли для нас особый интерес. Если предположить, что аномальный сплайсинг затрагивает только аллель дикого типа, то тогда он вполне может влиять на клиническую картину ОПП. В 2007 году мы выявили двух пациенток с повышенным содержанием (около 30%) аномальной мРНК ПБГД без экзона 12 - пп290 (мутация Argl73Trp) и пп295 (Argl73Gln) (рис.2).

Рис. 2 ОТ-ПЦР-анализ образцов РНК больных ОПП.

1 - IVS12+1G—>Т (контроль); 2 - Argl73^Trp; 3 - Argl73^Trp; 4 - Argl73-*Gln; 5 - 53delT; 6 - Trp283—»Term. Фрагмент 1039 пн не содержит экзона 12.

При секвенировании фрагмента гена ПБГД, включающего экзоны с 11-го по 13-ый, а также полноразмерные интроны 11 и 12, никаких структурных аномалий у этих пациенток выявлено не было. В то же время, анализ полученных для кДНК структурных электрофореграмм, на которых мутантная позиция располагалась за точкой сбоя, вызываемого потерей экзона 12 (область "двоения", прочитываемая методом вычитания), показал, что в обоих случаях аномальный сплайсинг затрагивает обе формы мРНК, и нормальную и мутантную.

Суммируя результаты данной части исследования, можно с достаточной уверенностью сказать, что гипотеза о модуляции пенетрантности ОПП функционально неполноценным аллелем гена ПБГД дикого типа никак себя не оправдала. Более того, не было обнаружено никаких свидетельств существования подобного аллеля. Клиническое проявление ОПП определяется какими-то другими механизмами.

Изучение генов системы детоксикации: Как уже отмечалось выше, ОПП характеризуется неполной пенетрантностью и многие индивидуумы, являющиеся носителями мутационных нарушений в гене ПБГД, в течение своей жизни могут не иметь клинического проявления заболевания.

В настоящее время многие ученые проявляют большой интерес к исследованию генетических факторов, влияющих на повышенную чувствительность

человеческого организма к промышленным и сельскохозяйственным ядам, фармакологическим препаратам. Известно большое число генов, контролирующих синтез ферментов, отвечающих за детоксикацию любых чужеродных веществ, включая фармакологические препараты, поступающие в организм человека.

Поскольку провоцирующими факторами клинического проявления ОПП являются большой спектр лекарственных препаратов, химические вещества, алкоголь, в детоксикации которых принимают участие различные ферменты, мы предположили, что изучение полиморфизмов генов системы детоксикации поможет объяснить очевидные индивидуальные различия в отношении пенетрантности заболевания. Кроме этого, исследование полиморфизмов генов детоксикации представляется целесообразным, если учитывать тот факт, что клинический фенотип заболевания проявляется вследствие накопления избытка порфиринов и их предшественников в организме человека, которые, возможно, могут являться эндогенными субстратами для ферментов, задействованных в системе детоксикации.

Нами были изучены функциональные полиморфизмы 2-х генов фазы 1 системы детоксикации (CYP1A1, CYP2E1) и 4-х генов фазы 2 (Л'ЛГ2, mEPHXl, GSTM1, GSTT1). Для выявления возможной ассоциации полиморфизма генов фазы 1 и фазы 2 системы детоксикации ксенобиотиков с клиническим проявлением ОПП был проведен сравнительный анализ частот генотипов и аллелей этих генов у больных ОПП и асимптомных носителей мутации в гене ПБГД.

Полиморфизмы генов цитохромов Р450 (CYP1A1 и CYP2E1) оказались неинформативными. Почти все индивидуумы, как больные ОПП, так и асимптомные носители были гомозиготами по одному из двух возможных аллелей.

Не выявил статистически значимых отличий и сравнительный анализ распределения генотипов микросомальной эпоксидгидролазы.

При сравнительном анализе частот генотипов и аллелей гена арилами-Л'-ацетилтрансферазы между выборками больных ОПП и асимптомными носителями, нам удалось получить статистически достоверные отличия только в случае распределения генотипа N/S ацетилтрансферазы.(р=0,0428, х2=4,1033) (табл.6) Следует отметить, что в нашу группу асимптомных носителей также вошли

молодые люди и дети, у которых возможно клиническое развитие заболевания в будущем и это могло отразиться на правильности интерпретации полученных нами результатов. Опираясь на тот факт, что клинически ОПП обычно проявляется после пубертатного возраста и у возрастных носителей (старше 45 лет) первично манифестирует крайне редко, мы разграничили группу асимптомных носителей по возрастному критерию, разбив нашу первоначальную выборку на две подгруппы. К первой подгруппе мы отнесли людей старше 45 лет, а ко второй - младше 45(табл. 6). При сравнении этих подгрупп с группой больных ОПП нами были обнаружены статистически достоверные различия в распределении генотипа N/N между подгруппой асимптомных носителей возраст которых старше 45 лет и группой больных ОПП (р=0,0290, -¿=4,7676). Отсутствие статистически достоверных результатов в случае распределния генотипа N/S объясняется, по всей вероятности, резким сокращением обследуемой выборки (в два раза) при разбиении группы асимптомных носителей по возрастному критерию. Как видно из таблицы, четыре человека из пяти, имеющих генотип N/N, относятся ко второй («старшей») подгруппе, и только один человек оказался в первой («младшей») подгруппе -женщина, 36 лет. В родословной этой женщины больными являются ее мать и младшая сестра, имеющие генотип N\S ариламин-Л'-ацетилтрансферазы. Среди 60 больных ОПП генотип N/N встретился всего один раз у пожилой женщины, пережившей в молодости единичный приступ заболевания.

Таблица 6. Распределение частот генотипов и аллелей Л'-ацетилтрансферазы у больных ОПП и асимптомных носителей

Генотипы Больные ОПП Асимптомные носители ОПП Асимптомные носители ОПП (больше 45лет) Асимптомные носители ОПП (меньше 45лет)

N % N % н % п %

N/N 1 1,7 5 12,5 4 23.? 1 5,3

N/S 34 15 6 35,3 7 36,8

S/S 23 ' 59.7 20 5 0,0 7 11 57,9

Всего 58 100 40 100 17 100 19 100

Аллели

N 36 31.0 25 35,7 14 41,2 9 23,7

S 80 69,0 45 64,3 20 58,8 29 76,3

Таким образом, полученные данные дают нам определенное основание полагать, что генотип N/N N- ацетилтрансферазы может служить фактором благоприятного прогноза в предсказании пенетрантности ОПП.

Сравнительный анализ частоты делеций (0/0) генов глутатионтрансфераз классов Г и М (GSTT1 и GSTM)I между группой больных ОПП и разными группами асимптомных носителей не выявил статистически значимых различий (р>0.05). Результаты анализа частот встречаемости гомозигот GSTT1 0/0 и гомозигот GSTMJ0/0 у больных ОПП и асимптомных носителей представлены в таблице 7.

Таблица 7. Распределение частот генотипов <75777 0/0 и ОБТМЮ/О у больных ОПП и асимптомных носителей

Генотип Больные ОПП Асимптомные носители ОПП Асимптомные носители ОПП (больше 45лет) Асимптомные носители ОПП (меньше 45лет)

п % N % п % п %

GSTT10/0 12 14.35 3 S.J 1 5.') 2 10,5

GSTTJ+ 50 80,65 33 91,7 16 94,1 17 89,5

GSTM10/0 31 50,0 17 47,2 8 47,1 9 47,4

GSTM1+ 31 50,0 19 52,8 9 52,9 10 52,6

Всего 62 100 36 100 17 100 19 100

Из таблицы видно, что частота «функционально неблагоприятного» генотипа (ОЭТТЮ/О) в группе больных ОПП в два раза превышает таковую в объединенной группе асимптомных носителей. А при сравнении со «старшей» группой асимптомных носителей разница увеличивается уже в три раза. По всей вероятности, несмотря на отсутствие статистически достоверных отличий, «функционально неполноценные» варианты генов ферментов детоксикации, особенно «нулевые» варианты глутатион-8-трансфераз, приводящие к отсутствию синтеза соответствующих белковых продуктов, также можно рассматривать как один из факторов риска клинического проявления ОПП.

Также мы провели анализ по сочетанному распределению нормальных и мутантных аллелей генов С5777 и СБТМ1 у больных ОПП и асимптомных носителей. Все индивидуумы были разделены на 4 группы: 1) генотипы 05777+,

2) генотипы 08171+ , ОБТМЮ/О; 3) генотипы ОБТТЮ/О , С5Ш/+; 4) генотипы 057770/0, О5ГА/70/0(табл.8).

Таблица 8. Распределение частот сочетаний генотипов СБТТ! и С8ТМ1 у больных ОПП и асимптомных носителей

Генотип Больные ОПП Аснмптомные носители ОПП Аснмптомные носители ОПП (больше 45лст) Аснмптомные носители ОПП (меньше 45лет)

п % п % п % п %

С8ТТ1+,СЗТМ1+ 25 40,3 16 44,4 8 47,1 8 42,1

вЗТТ1+,С5 ТМ10/0 25 40,3 17 47,2 8 47,1 9 47,4

в$ТТ10/0,С8ТМ1+ 6 9,7 3 8,4 1 П 5,8 2 10,5

С5ТТ10/0, С5ТМ10/0 6 чг 0 0.(1 0 0,0 0 0.0

Всего 62 100 36 100 17 100 19 100

Полученные результаты подтвердили наше предположение о возможном участии «функционально неполноценных» («нулевых») вариантов двух исследованных глутатион-8-трансфераз в патогенезе ОПП. Сочетание нулевых аллелей этих генов встретилось только в группе больных ОПП (табл.8). Несмотря на отсутствие достоверных различий, которые в данном случае могли быть не обнаружены в силу малой репрезентативности выборки асимптомных носителей, сочетание генотипов С8ТТ10/0, С5ТМ10/0 можно рассматривать как неблагоприятный генетический фактор в пенетрантности ОПП. Кроме этого, для шести человек, у которых мы обнаружили сочетание генотипов СБТТЮ/О.СБТМЮ/О были известены провоцирующие порфириногеннные факторы. В трех случаях это были лекарства, один - инфекция, один-красители и только в одном случае болезнь была вызвана менструальной функцией. Следует отметить, что, несмотря на большое разнообразие порфириногенных факторов, изменение гормонального статуса является превалирующим, а лекарства и инфекции в качестве провоцирующего агента встречаются значительно реже. В силу того, что сочетание редких «нулевых» генотипов глутатионтрансфераз встретилось у индивидуумов, у которых в качестве порфириногенных факторов фигурировали лекарства и инфекции, можно предположить, что данный фермент задействован в детоксикации именно этих провоцирующих заболевание агентов.

Интересно отметить, что единственная больная, у которой был обнаружен редкий N/N аллель ацетилтрансферазы, ассоциированный с асимптомным носительством ОПП, получила такой же редкий аллель но уже по сочетанию нулевых генотипов глутатионтрансферазы, предположительно ассоциирующихся с клиническим фенотипом заболевания. Возможно, что именно такое сочетание «хорошего» и «плохого» генов обусловило единичный клинический приступ заболевания, перенесенный ею в молодости.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о вполне заслуженном внимании к исследованию генов детоксикации у больных и асимптомных носителей ОПП.

Выводы

1. Мутационный анализ для 75 неродственных больных с диагнозом острая перемежающаяся порфирия позволил выявить 50 различных дефектов в гене порфобилиногендезаминазы, 29 из которых ранее не были описаны в мировой литературе.

2. Наиболее распространенными мутациями у больных ОПП, проходивших обследование в ГНЦ РАМН, оказались 53 delT и С517Т (Argl73Trp).

3. Показано, что мутации 53 delT и IVS13+2T—>G;+6insG имеют монофилетическое происхождение.

4. Молекулярно-генетическое обследование родственников из 50-ти семей больных ОПП показало, что из 161 обследованных человек 62 оказались латентными носителями заболевания.

5. Клиническое проявление ОПП не связано с сонаследованием мутантного и функционально неполноценного аллелей гена порфобилиногендезаминазы.

6. Гомозиготное носительство по «быстрому» аллелю гена ацетилтрансферазы (генотип N/N) ассоциировано с латентным течением заболевания ОПП.

7. Сочетание «функционально ослабленных» генотипов глутатионтрансфераз класса Т и М (GSTT10/0.GSTM1 О/О) можно рассматривать как неблагоприятный генетический фактор в пенетрантности ОПП.

3. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пустовойт Я.С., Карпова И.В., Пивник A.B., Сурин B.J1., Лукьяненко A.B., Лучинина Ю.А. Клинические проявления нарушений порфиринового обмена // Тер. Арх. 2003г.№7 с 68-73.

2. Пустовойт Я.С., Сурин В.Л., Карпова И.В., Лукьяненко A.B., Лучинина Ю.А. Пивник A.B. Острая перемежающаяся порфирия в России: аспекты диагностики // Медицинская генетика. 2004, Т.З. № 01. с.18-35.

3. Luchinina Yu.A., Surin V.L., Luk'yanenko A.V., Karpova I.V., Pustovoit Ya.S., Kravchenko S.K. Molecular diagnostics of acute intermittent porphyria in Russia. Europe Journal Human Genetics. May 2005, Vol.12, Sup. 1, P.134,

4. Лучинина Ю.А., Сурин В.Л., Пустовойт Я.С.,Карпова И.В., Лукьяненко A.B., Кравченко С.К. Острая перемежающаяся порфирия в России: мутационный анализ.//Медицинская генетика, 2006, Т.5, №9(прил.2), с.34-39

5. Карпова И.В., Пустовойт Я.С., Лучинина Ю.А., Сурин В.Л., Лукьяненко A.B., Кравченко С.К., Кременецкая A.M. Острые порфирии: проблемы первичной диагностики в России и странах СНГ.// Терапевтический Архив, 2007 №8, с.52-56

6. Сурин В.Л., Лучинина Ю.А., Селиванова Д.С., Пустовойт Я.С., Карпова И.В., Пивник A.B., Лукьяненко A.B., Кравченко С.К.. Молекулярно-генетическое исследование острой перемежающейся порфирии в России: мутационный анализ и поиск функциональных полиморфизмов в гене порфобилиногендезаминазы.// Генетика, 2010,Т.46, №4,с.540-552.

Подписано в печать: 22.10.10

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 769157 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; wvvw.reglet.ru

Порфирия - редкое наследственное заболевание, имеющее восемь нозологических форм, каждая из которых ассоциирована с дефицитом одного из ферментов системы биосинтеза гема [ИпёшаЛ 1.Т., 1986.]. Для всех нозологий этого заболевания характерно накопление тех или иных промежуточных продуктов порфиринового обмена в зависимости от дефицита ферментов соответствующих метаболических стадий, избыток которых приводит к клиническому проявлению болезни. Острая перемежающаяся порфирия (ОПП) вместе с вариегатной порфирией (ВП), врожденной копропорфирией (ВКП) и порфирией, обусловленной дефицитом дегидратазы 8-аминолевулиновой кислоты, образует группу острых печеночных порфирий. Все острые порфирии имеют аутосомно -доминантный тип наследования. Повышенный интерес клиницистов и генетиков к группе острых порфирий обусловлен тем, что эти заболевания, проявляющиеся в виде повторяющихся острых приступов с преимущественным поражением нервной системы, при неправильной диагностике и лечении представляют серьезную угрозу для жизни пациентов. Приступы провоцируются рядом эндогенных и экзогенных факторов (лекарственные препараты, алкоголь, изменение гормонального статуса и др.), стимулирующих экспрессию синтетазы дельта-аминолевулиновой кислоты (АЛА-С), первого фермента в цепи биосинтеза гема.

В ГНЦ РАМН работы по обследованию и лечению больных с нарушением порфиринового обмена ведутся с 1996г. За это время с направительным диагнозом острая порфирия было обследовано 638 человек, среди которых было выявлено 133 больных с острыми формами порфирий, а с диагнозом ОПП оказалось 102 человека. Такое доминирование ОПП, наиболее тяжелой и распространенной формы из группы острых порфирий,. диктует нам необходимостьв наиболее детальном обследовании» пациентов с таким диагнозохМ.

ОНИ вызывается» частичным дефицитом фермента порфобилиногендезаминазы (ПБГД) и клинически! чаще всего;' проявляется после достижения; пубертатного возраста. В мире известны, единичные случаи заболевания,детей, и все они связаны, с гомозиготным носительством дефектного гена, [Hessels et al, 2004] в то время как взрослые за редчайшими исключениями являются гетерозиготными^ носителями. .Своевременная: точная* диагностика; и адекватная^ терапия позволяют спасти, подавляющее: большинство? больных. В период развернутых острых проявлений заболевания, как правило, удается установить правильный диагиоз ОПП, основываясь на: клинических признаках и биохимической- диагностике: Что же касается» асимптомных носителей; то- для* них даже биохимическая диагностика, основанная на измерении активности ПБГД в эритроцитах, далеко не всегда дает однозначный ответ на вопрос, о носительстве заболевания; поскольку диапазоны уровней- активности фермента у таких пациентов перекрываются: с нормальными значениями. Поэтому особое значение приобретает молекулярно-генетическое исследование, позволяющее выявлять,латентных, асимптомных носителей дефектного гена, потенциально имеющих риск:развития клинической^ стадии заболевания:

ОПП, имея доминантный характер* наследования, характеризуется невысокой пенетрантностью (по/ максимальным: оценкам до 10-15%), свидетельствующей о том, что мутация в гене ПБГД является необходимым,. но не достаточным условием, клинического проявления, болезни, основная тяжесть., которого связана не с недостатком конечного продукта ферментативной: реакции, катализируемой ПБГД, а с накоплением избытка токсичного субстрата-предшественника. Поскольку 50% - ное снижение активности ПБГД за счет мутантного аллеля не является достаточным основанием для образования патологического фенотипа, должны существовать какие-то дополнительные генетические факторы, предопределяющие клиническое проявление у гетерозиготных носителей мутантного гена. Интенсивные исследования в области молекулярной генетики острых порфирий ведутся во многих странах мира. Однако, многие авторы отмечают неполноценность современного медико-генетического консультирования острых порфирий из-за невозможности дифференцированного подхода к асимптомным носителям заболевания (особенно, детям и подросткам) и выделения среди них каких-либо групп риска. Это обусловлено отсутствием информации о дополнительных генетических факторах, сонаследующихся с мутантными генами и принципиально влияющих на патогенез заболевания. Такие факторы в настоящее время обнаружены только для двух доминантно наследуемых форм порфирий, не относящихся к острым — эритропоэтической протопорфирии (ЭПП) и поздней кожной порфирии (ПКП) [Gouya et al, 1999, Badminton et al, 2005]. Для острых порфирий, к которым относится Ollll, о таких факторах ничего не известно.

Цели исследования: Определение спектра мутаций в гене ПБГД и характера их возникновения у больных ОПП из различных регионов РФ и стран СНГ, наблюдаемых в ГНЦ РАМН, с использованием эффективных систем генетической диагностики. Выявление дополнительных генетических факторов, предопределяющих клиническое проявление у гетерозиготных носителей мутантного гена.

Задачи исследования:

1) Поиск мутаций в гене ПБГД у больных OlULl, наблюдаемых в ГНЦ РАМН.

2) Разработка скрининговых методов тестирования наиболее часто встречающихся мутаций в гене ПБГД.

3) Выявление асимптомных носителей в семьях больных ОПП, у которых найдено мутационное нарушение в гене ПБГД.

4) Установление просхождения (полифилетическое или монофилетическое) наиболее распространенных мутаций в гене ПБГД у пациентов с ОПП при помощи анализа гаплотипов.

5) Поиск при помощи анализа полиморфных вариантов гена ПБГД функционально неполноценных аллелей этого гена, сочетание которых с мутантным аллелем может определять клиническое проявление ОПП.

6) Изучение возможного влияния на клинику ОПП сочетаний мутантного гена ПБГД с аллельными вариантами различных генов 1-й и 2-й фаз системы детоксикации: цитохромов Р450 (CYP1A1, CYP2E1), микросомальной эпоксидгидролазы (mEPXHl), глутатионтрансфераз (GSTM1, GSTT1), N-ацетилтрансферазы (NAT2).

Научная новизна: Проведено исследование российских больных ОПП с целью выяснения распределения мутаций в гене ПБГД по типу и локализации в сравнении с другими популяциями. Мутационный анализ, проведенный для 75 больных, выявил 50 различных дефектов-в гене ПБГД, 29 из которых ранее в мировой популяции не встречались. Выявлен характер возникновения наиболее часто встречающихся мутаций и показано, что мутации 53delT и IVS13+2T—>G;+6(+G) имеют монофилетическое происхождение. Впервые изучена возможная ассоциация аллельных вариантов генов фазы 1: CYP1A1 (A2455G), CYP2E1 (G-1259C) и 4-х генов фазы 2: NAT2 (С481Т , G590A G857A), mEPHXl: Tyrll3His - 3-й экзон,

Hisl39Arg - 4-й экзон, GSTM1 (Del), GSTT1 (Del) с клиническим проявлением ОПП.

Практическая ценность: установление носительства мутантного гена ПБГД у родственников больных ОПП и их своевременное информирование позволяет избежать развития тяжелой клинической стадии болезни, что приводит к сокращению сроков их лечения, снижению инвалидизации и значительному улучшению качества жизни.

Анализ генетического полиморфизма гена N-ацетилтрансферазы и глутатионтрансферазы можно рекомендовать в качестве прогностического теста для оценки риска клинического проявления ОНИ.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 6 печатных работах и докладывались на международной конференции по генетике человека (Прага, 2005г.) и Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы» (Москва, 2006г.)

Выводы.

1. Проведен мутационный анализ для 75 неродственных больных с диагнозом острая перемежающаяся порфирия. Выявлено 50 различных дефектов в гене порфобилиногендезаминазы, 29 из которых ранее не были описаны в мировой популяции.

2. Самыми распространенными мутациями у больных 01111, проходивших обследование в ГНЦ РАМН, оказались 53 delT и С517Т (Argl73Trp).

3. Показано, что мутации 53 delT и IVS13+2T—>G;+6insG имеют монофилетическое происхождение.

4. Проведено молекулярно-генетическое обследование родственников из 50-ти семей, затронутых ОНИ. Среди 161 обследованного человека было выявлено 62 латентных носителя заболевания.

5. Модуляция пенетрантности мутантного гена при ОНИ не связана с его сонаследованием с функционально неполноценным аллелем этого же гена дикого типа.

6. Гомозиготное носительство по «быстрому» аллелю гена ацетилтрансферазы (генотип N/N) ассоциировано с латентным течением заболевания OlilL

7. Сочетание «функционально ослабленных» генотипов глутатионтрансфераз класса Т и М {GSTT10/0,GSTM10/0) можно рассматривать как неблагоприятный генетический фактор в пенетрантности ОПП.

Заключение.

В результате проведенных исследований осуществлен мутационный анализ гена ПБГД для 75 неродственных больных ОПП. Выявлено 50 различных генных дефектов, 29 из которых ранее в мировой популяции не встречались. Наиболее распространенными оказались мутации 53delT и Argl73Trp (встретились по 8 раз, суммарно около 23%). Микроделеция 53delT и мутация сплайсинга IVS13+2T—»G;+6insG имеют монофилетическое происхождение и обнаружены только у пациентов РФ. Проведено молекулярно-генетическое обследование 161 родственника больных ОПП из 50 семей, среди которых выявлено 62 латентных носителя заболевания. Для пяти больных, выявление мутации в гене ПБГД на этапе асимтомного носительства помогло избежать тяжелого клинического проявления заболевания.

Низкая пенетрантность ОПП (около 10%) свидетельствует о том, что мутация в гене ПБГД является необходимым, но не достаточным условием клинического проявления болезни. Гипотеза о модуляции пенетрантности через сонаследование мутантного аллеля и функционально неполноценного аллеля гена дикого типа, как это было показано для эритропоэтической протопорфирии[Gouya et al, 1999], в случае ОПП оказалась неверна. Секвенирование полноразмерных генов ПБГД у неродственных больных ОПП, SNP- анализ и анализ аномально сплайсированной мРНК ПБГД показали, что в случае ОПП клиническое проявление заболевания не зависит от сонаследования мутантного аллеля и функционально неполноценного аллеля дикого типа гена порфобилиногендезаминазы и определяется какими' то другими факторами.

При проведеннии исследования генов фазы 1 и 2 детоксикации ксенобиотиков нами была показана неслучайная ассоциация между асимптомным носительством ОПП и генотипом N/N по полиморфизмам гена

ИАТ2. Также, несмотря на отсутствие статистически достоверных отличий, мы можем говорить об определенном влиянии исследованных нами полиморфизмов генов тЕРНХ1, б^ТТ и С5ТМ на клиническое проявление заболевания. Ассоциаций между клиническим проявлением ОПП и функциональными полиморфизмами генов фазы 1 системы детоксикации (СУР1А1, СУР2Е1) выявлено не было.

Из всего сказанного можно сделать предварительный вывод, что в молекулярных механизмах доминантной фенотипической экспрессии мутантного гена ПБГД, определяющего патогенез ОПП, скорее всего задействованы не единичные гены, а целые группы генов. Путем сбора информации и анализа генетических детерминант, определяющих в ряде случаев пенетрантность ОПП, возможно, в будущем можно будет предсказывать вероятность проявления заболевания у асимптомных носителей мутации.