Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Молекулярно-генетическая диагностика и дифференцированная терапия гистиоцитарных пролиферативных заболеваний у детей

На правах рукописи

Масчан Михаил Александрович

Молекулярно-геиетическая диагностика и дифференцированная терапия гиетиоцитарных пролиферативных заболеваний у детей

14.01.08 педиатрия 14.01.21 гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 2 ДЕК 2011

Москва 2011

005005969

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные консультанты:

Члсн-корреснондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Румянцев Александр Григорьевич Доктор медицинских наук Новичкова Галина Анатольевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Алексеева Екатерина Иосифовна Доктор медицинских наук, профессор Сметанина Наталья Сергеевна Доктор медицинских наук, профессор Лукина Елена Алексеевна

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П.Павлова

Защита диссертации состоится «23» декабря 2012 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.050.01 в ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева по адресу - 117128, Москва, ул. Саморы Машела, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева

Автореферат разослан « » 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор В.М.Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Гистиоцитарные нролиферативные расстройства, или гистиоцитозы, -группа редких заболеваний, морфологической основой которых является патологическая пролиферация клеток гпстноцитарного ряда: тканевых макрофагов, моноцитов, дендритных клеток и их предшественников. Согласно современной классификации гистиоцигарных заболеваний, выделяют гистиоцитозы с вариабельным клиническим течением, основными представителями которых являются гнстноцитоз из клеток Лангерганса (ГКЛ) и гемофагоцитарный лимфогистиоцнтоз (ГЛГ), и злокачественные гистиоцитозы, к которым относят моноцитарные варианты острого миелобластного лейкоза, солидные опухоли из моноцитов и дендритных клеток и хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ) (современный термин - ювенильный миеломоноцитарный лейкоз (ЮММЛ)) (В.Рауага, 1998). Несмотря на различия в биологии этих заболеваний, рассмотрение гистиоцитозов как единой клинико-иатологической группы обусловлено сходной клинической презентацией у детей раннего возраста, необходимостью дифференциальной диагностики и аналогией методов терапии. Настоящее исследование сосредоточено на принципиальных вопросах биологии, диагностики и терапии трех наиболее распространенных форм гистиоцитарных расстройств у детей: первичного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза (ПГЛГ), ЮММЛ и ГКЛ.

ПГЛГ - врожденное расстройство иммунорегуляции, обусловленное генетическим дефектом механизмов клеточной цнтотоксичности (Ы.Нииег, 2002, в.Дапка, 2007). Идентифицировано четыре геиа, РМ-7, Ь'МС131Х ЗТЛГ и ЯТХВР, терминальные мутации которых ведут к формированию клинического фенотипа ПГЛГ. Сходный клинический фенотип формируется у пациентов с Х-сцепленным лимфопролиферативным синдромом (Х-ЛПС) I и II типа и синдромом Грисселли, в основе которых лежат мутации в генах 5Н21)1А, Х1АР ¡г 1ЫВ27 соответственно (1РасЫоршк 81ши(1, 2010). В отсутствие терапии ПГЛГ является смертельным заболеванием. Современная терапия ПГЛГ, основанная на последовательном применении иммуносупрессивной терапии (ИСТ) и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), позволяет излечивать около 50% пациентов (Ы.НегПег, 2007). Своевременная верификация генетической природы ПГЛГ позволяет подтвердить показания к ТГСК, выполнить генетическое консультирование и пренатальную диагностику. Исследование генетической эпидемиологии ПГЛГ в популяции российских пациентов, анализ эффективности терапии ПГЛГ и разработка алгоритма клинической и лабораторной диагностики необходимы для улучшения диагностики и результатов лечения этого заболевания

10MMJ[ - заболевание, сочетающее черты миелодисплазии и миелопролиферацни (M.Arico, 1997). В основе заболевания лежат соматические (реже - терминальные) .мутации в генах PTPNll, NRAS, KRAS. C-CBL, NFJ (M.Loh, 2010). Результатом является гиперпролиферация миелоидных н мопоцитарных предшественников, дисфункция костномозгового кроветворения и патологическая инфильтрация органов. Единственным методом, позволяющим излечивать пациентов с ЮММЛ, считается ТГСК. Выполнение ТГСК при ЮММЛ ассоциировано с 10-20% риском трансплантационной смертности и 30-40% риском рецидива заболевания (F.Locatelli, 2005). Нерешенным остается вопрос о месте нетрансплантационных методов терапии, таких как дифференцировочная терапия (ДТ) 13-цис-ретиноевой кислотой (13-RA) и высокодозпая химиотерапия (ВХТ) (M.Loh, 2010). Разработка алгоритма молекулярно-генетического анализа и клшшко-генетическое сопоставление необходимы для диагностики, определения показаний к ТГСК, мониторинга минимальной остаточной болезни и тестирования новых методик терапии. Анализ результатов ТГСК и альтернативной терапии необходим для оптимизации технологии ТГСК и определения перспективной тактики мультимодальной терапии.

ГКЛ - заболевание, в основе которого лежит клональная пролиферация миелоидных дендритных клеток, фенотипически сходных с эпидермальными клетками Лаигерганса. Манифестация ГКЛ варьирует от локализованных очагов остсолизиса до днссеминированных форм с неконтролируемым злокачественным течением. Биологическая основа этих различий и природа ГКЛ в целом остаются нерасшифрованными (M.Egeler, 2010). Данные о роли мутации V600E в гене BRAF в патогенезе ГКЛ стали новым фактом, свидетельствующим в пользу неопластической природы заболевания (G.Badalyan-Very, 2010). Подтверждение этого факта может открыть новый этап понимания биологии заболевания и новые перспективы терапии. Современным стандартом лечения ГКЛ у детей является комбинированная терапия вннбластнном (Vbl) и преднизолоном (Prn) (M.Minkov, 2011). Одной из наиболее актуальных проблем является терапия пациентов группы «высокого риска» - пациентов с мультпсистемным ГКЛ с вовлечением «органов риска» (МСОР+). Общая выживаемость (рОВ) в этой группе не превышает 70%, а в подгруппе пациентов, рефрактерных к стандартной терапии - 20% (H.Gadner, 2001, M.Minkov, 2002). В лечении резистентных форм ГКЛ наиболее перспективным представляется опыт интенсивной химиотерапии (ХТ) с использованием 2-хлор-дезоксиаденозина (2-CdA) в комбинации с цитозина арабннозидом (AraC) (F.Beraard, 2005). Таким образом, исследование молекулярного дефекта V600E BRAF при ГКЛ, анализ результатов терапии мультисистемного ГКЛ и разработка альтернативных программ терапии являются актуальным прикладным вопросом детской гематологии/онкологии и педиатрии.

Цель исследовании

Разработка и внедрение современных принципов клинико-лабораторной и молекулярно-

гснетичсской диагностики и оптимизирующих программ терапии пациентов с первичным

гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом, ювешшьпым миеломопоцитарным лейкозом и

гистноцитозом из клеток Лангерганеа.

Задачи исследовании

1. Выполнить молекулярпо-генетичеекпй анализ генов PRF1, UNC13D, STX, STXBP, SH2DIA, XIAP. RAB27 в группе российских пациентов с клиническим диагнозом ПГЛГ. Изучить клиническую презентацию и корреляцию генотип-фенотип при генетически детерминированном ГЛГ.

2. Разработать алгоритм клинико-лабораторной диагностики, молекулярно-генетической верификации и дифференциальной диагностики первичного гемофагоцитарного синдрома и его генетических субвариантов.

3. Провести анализ результатов лечения пациентов с ПГЛГ с использованием стандартных режимов программной иммуносупрессивиой химиотерапии и алло-ТГСК. Разработать практические рекомендации по выбору тактики терапии.

4. Выполнить молекулярио-биологический анализ генов PTPN1I, NRAS, KRAS и C-CBL в репрезентативной группе пациентов с ЮММЛ. Сопоставить клинические и лабораторные проявления с генетическими дефектами и разработать рациональную тактику генетической верификации диагноза и алгоритм клинико-лабораторной диагностики и дифференциальной диагностики ЮММЛ.

5. Провести анализ результатов алло-ТГСК, ВХТ и ДТ с использованием 13-RA в группе пациентов с ЮММЛ. Разработать клиническую стратификацию на основании анализа клинических и лабораторных факторов риска. Разработать стратегию выбора терапии ЮММЛ в соответствии с клииико-биологнческой стратификацией.

6. Исследовать мутацию V600E в rene BRAF в патогистологических образцах пациентов с гистноцитозом из клеток Лангерганеа. Оценить потенциальное место исследования мутационного статуса BRAF в диагностике, выборе и мониторинге терапии ГКЛ.

7. Изучить непосредственные и отдаленные результаты стандартной терапии пациентов с ГКЛ. Разработать альтернативный подход к лечению пациентов с мультиснстемным заболеванием на основе использования комбинированной ХТ 2-CdA и АгаС. Провести сравнительный анализ результатов стандартной и альтернативной терапии. Разработать практические рекомендации по выбору терапии и тактике сопроводительной терапии ГКЛ в группе высокого риска.

Научная новизна

Впервые в репрезентативной выборке российских пациентов с ПГЛГ выполнено молекулярно-генстнчсскос исследование всех известных генов (РЛ/7/. [/Л'С/ЗО, ЭТХ, ЗТХВР, БЮОИ, Х1АР, НА В27), ассоциированных с фенотипом Г1ГЛГ. Выявлено уникальное распределение генетических вариантов ПГЛГ с преобладанием ИНи, отличное от популяций иного эпического состава. Показано, что распространение в популяции мутаций с.2346_2349с1е1 и с.30371П80 обусловлено «эффектом основателя». Не выявлена значимая корреляция клинического фенотипа с генетическим вариантом ПГЛГ. В работе проведен первый в России анализ результатов терапии пациентов с ПГЛГ и убедительно продемонстрирована необходимость выполнения ТГСК всем пациентам с ПГЛГ. Показано, что основным препятствием к успеху ТГСК является высокая трансплантационная смертность (54 ± 15%). Впервые в репрезентативной выборке российских пациентов с ЮММЛ выполнено молекулярно-генетическое исследование основных генов (РТРМ11, ШАБ, КНАЭ и С-СВ1), ассоциированных с развитием ЮММЛ. В работе подтверждено характерное распределение генетических вариантов ЮММЛ и впервые выявлена корреляция клинического фенотипа с генотипом заболевания. Разработана программа лечения 13-ЯА и низкими дозами АгаС при ЮММЛ. Продемонстрирован клинико-гематологическнй эффект ДТ и установлена корреляция исходных клинико-лабораторных показателей и генетического варианта ЮММЛ с ответом на ДТ. Подробно описан феномен стойкого ответа на ДТ, выявлена перснстенция мутантного клона у пациентов в статусе полного ответа (ПО) и описано развитие поздних злокачественных (острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) и аутоиммунных (тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП)) заболеваний у пациентов с ПО на ДТ. Впервые в репрезентативной группе российских пациентов проведен анализ результатов ТГСК, 5-летняя общая выживаемость составила 38±13%, трансплантационная смертность - 28±12%, частота развития рецидива 31%. Выполнен анализ мутации У600Е ВЯЛР у пациентов с ГКЛ и подтверждена вероятная роль данного соматического генетического дефекта в патогенезе ГКЛ у 24% пациентов. Разработана оригинальная программа терапии для группы пациентов «высокого риска» на основе использования комбинации 2-Сс1А и АгаС. Показана высокая эффективность терапии рефрактерных форм МСОР+ ГКЛ, рОВ = 66+15%. Показана высокая эффективность 2-СаА и АгаС в лечении МСОР+ ГКЛ, рОВ = 88±9%, частота развития инвалидизирующих перманентных последствий - 0%. Описан необычный спектр инфекционных осложнений, включающий инфекции вакцинальным штаммом М.Ьо\-к и тяжелые инфекции, вызванные респираторными вирусами.

Практическое значение

В работе на основании анализа генетической структуры ПГЛГ в группе российских пациентов разработан алгоритм клинико-лабораторной диагностики ПГЛГ, алгоритм молекулярно-гентического анализа и методика выявления наиболее распространенных мутаций в гене \JNC13D. На основании анализа результатов ИСТ и ТГСК предложена стратегия выбора терапии, предусматривающая начало поиска донора в момент установления диагноза ПГЛГ и обязательное выполнение ТГСК не позднее 4 месяцев от момента установления диагноза. Разработан алгоритм молекулярно-генетического исследования при диагностике пациентов с клиническим диагнозом ЮММЛ, позволяющий верифицировать диагноз, осуществить рациональный выбор терапии и мониторинг заболевания после ТГСК. Разработан алгоритм выбора терапии в соответствии с клшшко-биологической стратификацией пациентов. На основании анализа результатов ХТ и ТГСК предложена стратегия выбора терапии, предусматривающая начало поиска донора в момент установления диагноза ЮММЛ и обязательное выполнение ТГСК не позднее 6 месяцев от момента установления диагноза в группе пациентов, не ответивших на ДТ. Молекулярио-генетическнй анализ мутации У600Е ВИ4Р у пациентов с ГКЛ показал, что данная генетическая аномалия потенциально является диагностическим маркером заболевания и терапевтической мишенью. Разработана и внедрена в клиническую практику эффективная программа ВХТ на основе комбинации 2-Сс1А и АгаС для лечения пациентов с рефрактерным течением ГКЛ МСОР+. Разработаны рекомендации по сопроводительной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гистноцитарные пролиферативные расстройства - гистиоцнтозы - группа фенотппически родственных заболеваний, в основе которых лежит спектр врожденных либо приобретенных молекулярных дефектов, ведущих к аномальной пролиферации и регуляции функциональной активности клеток гистиоцнтарного ряда. Новые данные о биологии гистиоцитозов диктуют необходимость разработки комплексного алгоритма диагностики, дифференцированной тактики терапии и диспансерного наблюдения пациентов с гнетпоцитозами.

2. Мутации в гене 11МС130 являются наиболее распространенным генетическим дефектом в популяции российских пациентов с ПГЛГ. Частота выявления мутаций в гене {УЛ'С/ЗО составила 54%. Распространенность этих мутаций в исследованной группе обусловлена «эффектом основателя» - персистенцией в популяции мутаций с.2346_2349с1е1 и

c.3037insG. Исследование гена UNC13D рекомендуется в качестве первого этапа молекулярно-генетической диагностики Г1ГЛГ в России.

3. Единственным методом терапии, обеспечивающим долгосрочную выживаемость пациентов с ПГЛГ, является ТГСК. 5-летняя рОВ в группе ПГЛГ составляет 37±14 % при выполнении ТГСК, 0±0% при выполнении только ИСТ, р = 0,0005. Неудачи ТГСК обусловлены высокой трансплантационной смертностью, pTRM = 54±15%, Идентификация и выбор донора являются приоритетными задачами наравне с генетической верификацией диагноза и началом иммуносупрессивиой терапии. ТГСК должна быть выполнена не позднее 4 месяцев от начала ИСТ, так как частота реактивации заболевания составляет 95%, медиана реактивации - 5 месяцев.

4. Молекулярно-геиетическое исследование генов PTPN11, NRAS, KRAS и C-CBL позволяет верифицировать диагноз у 70% пациентов с ЮММЛ. Относительная частота различных генетических дефектов составляет: PTPN11 - 35%, NRAS - 14%, C-CBL - 13%, KRAS - 11%. Стратификация пациентов на основании генетического варианта ЮММЛ (мутации в генах RAS и C-CBL), возраста манифестации (< 1 года) и содержания фетального гемоглобина (HbF) (< 10%) позволяет выделить прогностически благоприятную группу, не нуждающуюся в выполнении ТГСК в первой линии терапии. Пациентам этой группы показано проведение ДТ 13-RA + АгаС, 5-летняя рОВ при проведении ДТ составляет 75±15%.

)

5. Пациенты группы высокого риска и пациенты, не ответившие па терапию 13-RA + АгаС, нуждаются в выполнении ТГСК по витальным показаниям не позднее 6 месяцев от установления диагноза, независимо от наличия полностью совместимого донора. 5-летняя рОВ прн выполнении ТГСК составила 38±13%. Применение флударабина (Flu) в комбинации с бусульфаном (Bu) и мельфалапом (Mel) при подготовке к трансплантации обеспечивает эквивалентную частоту приживления трансплантата (90% и 60%, р = 0,24) и общую выживаемость (рОВ 47±19% и 33±19%, р = 0,72) в сравнении с стандартным режимом кондиционирования: цнклофосфамид (Су) + Bu + Mel.

6. Мутация V600E BRAF выявляется у 24% пациентов с ГКЛ и, вероятно, принимает участие в патогенезе заболевания. Значимой корреляции статуса BRAF с клиническими и лабораторными проявлениями заболевания не выявлено. Мутация V600E BRAF потенциально является диагностическим маркером и терапевтической мишенью у пациентов с ГКЛ.

7. Комбинированная XT 2-Cda и АгаС является эффективным методом лечения мультисистемного ГКЛ, резистентного к стандартной терапии, рОВ = 66±19%.

Применение 2-Cda и AraC в терапии первой линии МСОР+ ГКЛ более эффективно в сравнении со стандартной терапией. Частота достижения полных ответов составила 100% vs. 33%, рБСВ = 88±9% vs 40±11%, частота формирования перманентных осложнений - 0% vs 66%. Достоверных различий рОВ не выявлено, что обусловлено высокой эффективностью терапии второй линии. Применение ВХТ 2-Cda + AraC ассоциировано с выраженной миелосупрессией, иммуносупрессией, и высоким риском развития инфекционных осложнений. Характер иммуносупрессии определяет спектр инфекций, включающий вирусные инфекции и инфекции вакцинальным штаммом M.bovis.

Внедрение в практику

Результаты работы внедрены в практику молекулярной диагностики ПГЛГ в Медико-генетическом научном центре РАМН (зав. лабораторией профессор A.B. Поляков) и диагностики IOMMJI в лаборатории молекулярной биологии ФНКЦ ДГОИ (зав. лабораторией к.м.н. Бобрышша В.О.). Алгоритмы диагностики и оптимизированные протоколы терапии используются в отделениях гематологии и трансплантации костного мозга РДКБ н в клинике ФНКЦ ДГОИ. Основные положения и выводы диссертации используются в курсе лекций и семинаров на кафедре детской гематологии, онкологии и иммунопатологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пнрогова

Апробации диссертации

Материалы диссертации представлены в докладах на национальных и международных конференциях, в частности на конференции международного общества по изучению гнетноцитозов (Histiocyte Society) в 2005, 2008, 2009, 2011 гг., международного общества детских онкологов (SIOP) в 2010 г., европейской ассоциации гематологии (ЕНА) в 2010 году, европейского общества генетики человека (ESHG) в 2008, 2009, 2010 гг., российском национальном конгрессе «Человек н лекарство» в 2011 году. Основные положения и выводы диссертации используются в курсе лекций и семинаров по детской гематологии/онкологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Материалы диссертации опубликованы в составе 28 печатных работ, в том числе 10 в изданиях, рекоммендованых ВАК.

Апробация диссертации состоялась 15 марта 2011 г. на научно-практической конференции ФНКЦ ДГОИ.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен в 8 главах. Структура диссертации традиционна и включает разделы: введение, обзор литературы, пациенты и методы, результаты, обсуждение, выводы и практические рекоммендации. Объем диссертации составляет 350 страниц, работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

Содержание работы Пациенты и .методы

Формирование выборки. В исследование включено 180 пациентов в возрасте от 1 месяца до 17 лет с диагнозом ПГЛГ, ЮММЛ и ГКЛ. В группу ПГЛГ включены 34 пациента из 31 семьи. Молекулярно-генетическое исследование выполнено 26 пациентам. Анализ результатов терапии выполнен в группе 32 пациентов, 2 пациента с верифицированным диагнозом Х-ЛПС были исключены. В группу ЮММЛ включен 61 пациент, молекулярно-генетическое исследование выполнено 44 пациентам, анализ результатов терапии выполнен во всей группе. В группу ГКЛ включены 86 пациентов, в анализ результатов терапии включены 48 пациентов, молекулярно-генетическое исследование выполнено 37 пациентам. Основу выборки составили все пациенты (п = 143) с соответствующим диагнозом, наблюдавшиеся в отделении общей гематологии РДКБ в период с 1993 по 2010 гг. Молекулярно-генетическое исследование ГКЛ выполнено на биоматериале пациентов из различных клиник, архивные образцы которых были доступны для анализа.

Критерии диагноза. Диагноз ПГЛГ и ЮММЛ устанавливали на основании международных критериев, приведенных в табл. 1 и 2. Диагноз ГКЛ устанавливали в соответствии с рекомендациями The Histiocyte Society на основании гистологической картины и иммуногистохимической детекции маркера CD 1а на клетках патологического инфильтрата. Клиническое стадирование пациентов с ГКЛ проводили в соответствии с рекомендациями The Histiocyte Society. В соответствии с числом пораженных органов и систем выделяли моносистемное (МоноС) заболевание и мультисистемное (МС) заболевание. При мультисистемном заболевании выделяли формы с вовлечением «органов риска» (МСОР+) и без такового (МСОР-). К «органам риска» относили печень, кроветворную систему, селезенку и легкие.

Обследование пациентов. Минимальный объем клипико-лабораторного обследования включал:

1) автоматический анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы; 2) биохимический анализ

крови с определением АЛТ, ACT, ЩФ, ЛДГ, билирубина, мочевины, креатшшна, альбумина; 3)

8

коагулограмму; 4) миелограмму с окраской гематоксшшн-эозином; 5) иммуноглобулины сыворотки; 6) УЗИ брюшной полости; 7) рентгенографию грудной клетки; 8) общий анализ мочи. Дополнительный набор исследований для пациентов с ПГЛГ включал определение 1) триглицеридов сыворотки (натощак); 2) ферритина сывороткн; 3) исследование спинномозговой жидкости с определением цитоза, содержания белка, лейкоцитарной формулы цитопрепарата. Для пациентов

Таблица 1

Диагностические критерии гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза, Histiocyte Society, 2004_

• Лихорадка > 38,5» > 7 дней

• Сплепомегалия > 3 см из под края рёберной дуги

• Цитопения в > 2-хлиниях • гемоглобин < 90 г/л • тромбоциты < 100х109/л • нейтрофилы < 1 х109/л

• Гипертриглицеридемия и/или гипофибриногенеиия • триглицериды > 2,0 ммоль/л • фибриноген < 1,5 г/л

• Ферритин >500 мкг/л

> 2500 Ед/л

• Снижение цитотоксичиости НК-клеток

• Гемофагоцигоз в костном мозге, лимфатических узлах или селезенке

Дли установления диагноза необходимо выполнение 5 из 8 критериев либо молекулярно-генетическая верификация диагноза.

с ЮММЛ: 1) электрофорез гемоглобина; 2) цитогенетическое/молекулярно-генетическое исследование костного мозга с целью выявления РЬ-хромосомы/химерного транскрипта ВСЕ-АВЦ 3) культуральное исследование периферической крови с оценкой спонтанного колониеобразования гранулоцитарно-макрофагальных колоний. Для пациентов с ГКЛ: 1) пробу Зимницкого; 2) обзорную рентгенографию скелета или радиоизотопное исследование с Техиецием-99; 3) биопсию патологического очага.

Молекулярно-гснетическое исследование. В группе пациентов с ПГЛГ исследованы все экзоны генов, ассоциированных с клиническим фенотипом ПГЛГ: РЯР1, иМС130, 5ТХ, 5ТХВР, 5Н201А и Х1АР. В группе ЮММЛ исследованы экзоны 3 и 13 гена РТРМП, 2 и 3 генов А'ИАЗ и ККА5, 8 и 9 гена С-СВЬ. Молекулярно-гепетическое исследование ГКЛ было ограничено мутацией У600Е

9

BRAF. Прямое автоматическое секвенированпе в группе ПГЛГ: геномную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора DNA Prep 100 Diatom TM из образцов периферической крови. Амплификацию фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на тсрмоцнклсре МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия). Прямое автоматическое секвенировапие к группе IOMMJI: геномную ДНК выделяли из образцов периферической крови или архивных образцов костного мозга с помощью набора «ДНК-сорб-В», АмплиСенс, ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, Москва, Россия,. Амплификацию фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоцнклере Dyad, BioRad. Все фрагменты секвенированы с обеих цепей ДНК с использованием Big Dye Terminator's v 1.1 Cycle Sequencing Kit и анализатора ABl PRISM 3130x1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, США), анализ результатов проводили с помощью программы ChromasPro.

Таблица 2

Критерии диагностики ювеннльного миеломоноцитарного лейкоза [M.Loh, 20101

I. Обязательные клинические и гематологические критерии • Содержание моноцитов периферической крови >1,0х109/л

• Содержание бластов в кровн и костном мозге < 20%

• Спленомегалия

• Отсутствие Ph-хромосомы или химерного транскрипта BCR-ABL

II. Генетическое верификация • Соматическая мутация гена PTPN11 или RAS или C-CBL

• Мутация гена NF1 или клинический диагноз нейрофиброматоза 1 типа

• Моносомия 7

III. Дополнительные лабораторные критерии • Спонтанный рост гранулоцитарно-макрофагальных колоний из мононуклеаров периферической крови или гиперчувствительность к ГМ-КСФ

• Повышенное содержание HbF

• Циркуляция незрелых гранулоцитов в периферической крови

• Лейкоциты > 10х109/л

• Клональная цитогенетическая аномалия, отличная от моносомил 7

Диагностическое правило: необходимо выполнение всех критериев группы 1 и одного из критериев группы 11. При отсутствии критериев группы II, необходимо выполнение двух критериев группы III.

При исследовании гаплотппа основателя для повторяющихся мутаций в гене ШС/Зй были выбраны 8 микросателлитных маркеров на хромосоме 17ч25, в области размером 7,4 млн.п.н. вокруг исследуемого гена. Для каждого из маркеров были выбраны и пары праймеров. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с окрашиванием раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью системы веШос, BioRad, США. Выделение клеточных линий из иуклеарной фракции периферической крови проводили реагентами для

иммуномагнитной селекции производства Dynal, Invitrogen, США, в соответствии с инструкцией производителя. Исследование мутации V600E BRAF при ГКЛ: ДИК выделяли из биоптатов, фиксированных и залитых в парафин, после макроднссскцин. После депарафинизации ксилолом и проводки по спиртам проводилась инкубация с протеиназой К и фенол-хлороформная экстракция. Для выявления мутации проводилась ПЦР в реальном времени с использованием флюоресцентных зондов TaqMan. Дизайн праймеров проводился таким образом, чтобы избежать неспецпфпческой амплификации псевдогена па X хромосоме. Зонд, специфичный к нормальной последовательности гена, был помечен флуорофором FAM па 5' конце, специфичный к мутантной последовательности - HEX. Для повышения чувствительности метода в нуклеотндный состав обоих зондов были введены LNA (locked nucleic acids). Амплификацию проводили на приборе CFX-96, BioRad. Данные флюоресценции анализировали с помощью программы аллелыюй дискриминации. Все образцы амплифицировали отдельно с использованием другой пары праймеров, после чего выполняли прямое секвенировагше на приборе АВ3500, Applied Biosystems.

Определение статуса заболевания, критерии ответа на терапию и сроки оценки ответа

Первичный гемофагоцнтарнмй лимфогпстиоцитоз. Частичный ответ (40) - отсутствие лихорадки >37,7UC, сокращение размеров селезенки, тромбоциты >100х109/л, фибриноген > 1,5 г/л. Полный ответ (ПО) - отсутствие лихорадки >37,7°С, нормальный размер селезенки, нормализация показателей периферической крови (гемоглобин >100 г/л, тромбоциты >100x10 /л, нейтрофилы >0,5x109/л), триглицериды < 2 ммоль/л, ферритин < 500 мкг/л, нормальные показатели СМЖ. Активное заболевание (A3) - пациенты, не выполняющие критерии 110 и ЧО. Реактивация заболевания (РЗ) - появление >3 признаков из 7 (лихорадка >38,5°С, тромбоциты <100x107л, спленомегалия, триглицериды >2 ммоль/л, фибриноген <1,5 г/л, гемофагоцитоз, ферритин > 500 мкг/л) после достижения ПО или ЧО. Появление неврологического дефицита или характерных изменений состава спинномозговой жидкости (СМЖ) достаточно для констатации реактивации заболевания. Ответ на ИСТ оценивали через 2 месяца от начала лечения.

Ювепильнын мнеломопоцитариый лейкоз. Общепринятых критериев оценки ответа на терапию при ЮММЛ не существует. В настоящей работе были приняты следующие определения статуса заболевания: полный ответ (ПО) - разрешение всех клинических и лабораторных проявлений заболевания, не поддерживаемое терапией в течение > 1 месяца. Частичный ответ (ЧО) - лейкоциты < 1 Ох 10'/л, тромбоциты > 1 ООх 10'/л, гемоглобин > 100 г/л, сокращение размеров печени (< 3 см из-под ребра) и селезенки (< 3 см из-под ребра), отсутствие специфической инфильтрации другой локализации. Отсутствие бластемим. Стабилизация заболевания (СЗ) -

снижение лейкоцитоза на > 50% от исходного, повышение уровня тромбоцитов на > 50% от исходного, сокращение размеров печени и селезенки на > 50% от исходного. Профессия заболевания (ПЗ) - сохранение лабораторных и клинических проявлений заболевания при невыполнении условий СЗ. Совокупно ПО и 40 рассматривался как клинически значимый ответ, СЗ и ПЗ как отсутствие ответа. Ответ на терапию оценивали не ранее, чем через 2 месяца от начала терапии.

Гистиоцнтоз из клеток Лапгерганса. Полный ответ (ПО) - разрешение всех обратимых клинических и лабораторных проявлений заболевания. Частичный ответ (40) - неполное разрешение исходных клинических и лабораторных проявлений заболевания. Прогрессия заболевания (ПЗ) - появление новых очагов поражения и/или сохранение и/или ухудшение исходных очагов/клинико-лабораторных проявлений. Перманентные осложнения - необратимые изменения, развившиеся вследствие поражения органа'ткани ГКЛ: несахарный диабет, фиброз легких, фиброз/цирроз печени, гипопитуитаризм. Реактивация заболевания (РЗ) - появление клинических и лабораторных признаков заболевания после констатации достижения ПО. Сроки оценки ответа - ответ на терапию оценивали по завершении интенсивной фазы терапии (6 недель и 12 недель при терапии по стандартным протоколам) или после каждого блока ВХТ (пилотный протокол).

Терапия

Первичный гемофагоцнтарный лимфогистиоцитоз

Терапию ПГЛГ проводили в соответствии с рекомендациями протокола HLH-94 (п=24) и HLH-2004 (п=5), 3 пациента получили сопроводительную терапию. Терапия состояла из ИСТ и ТГСК.

Иммуносупрессивпая терапия. В состав ИСТ был включен этопозид (VP-16), дексаметазон (Dexa), циклоспорин A (CsA), метотрексат (МТХ)(эндолюмбально) н Ргп (эидолюмбалыю). (рис. 1) При реактивации заболевания назначали ИСТ второй линии по выбору врача. Антитимоцитарный глобулин (АТГ) (АТГАМ, Пфайзер, США) в дозе 160 мг/кг/курс, получили 2 пациента. Комбинированную ВХТ в составе Тиофосфамнд (TT) 2 мг/кг, винкристин (Ver) 1,5 мг/м2, флударабин (Flu) 150 мг/м2, Ргп 5 мг/кг/суткн получили 4 пациента. Цнклофосфамид (Су) в дозе 500 мг/м2 получили 2 пациента. Повторную терапию элементами стандартного протокола получили 12 пациентов.

Трансплантация гсмопоэтическнх стволовых клеток. ТГСК выполнена 12 пациентам. Восьми

пациентам проводили миелоаблативиое кондиционирование, 4 пациентам - кондиционирование

со сниженной интенсивностью. Трем пациентам ТГСК выполнена от HLA-совместимого сиблинга

12

(MSD), 7 пациентам - от HLA-совмсстимого неродственного донора (MUD). 2 пациентам от частично совместимого родственного донора (MMRD). Профилактику реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) проводили ингибитором капьциневрина (CsA, п - 7 или такролимус (Тасго), п = 4) в комбинации с MTX (п = 3) или мофетила микофенолятом (MMF) (п - 7). Один пациент получал MTX и MMF. У 1 пациента для профилактики РТПХ выполнили селекцию С034*-клсток на приборе CliniMacs, Miltcnyi Biotec, Германия. Детали процедуры трансплантации представлены в табл.3.

♦ ♦ ♦ ♦

Uli I I I I 1 I I

Недели О

До ТКМ

10 11 12

Дексаметазон -10 мг/м2/сутки, дни 1-14,5 мг/мг/сутки, дни 15-29, 2,5 мг/м2/сутки, дни 30-43,1,25 мг/м7/сутки, дни 44-57, per os. При необходимости - внутривенно.

Этопозид 150 мг/м2/введение, дни 1,4,8,11,15,22,29, 37,45, 53, 61, далее -1 раз в две недели, внутривенно.

ШЯШЛ ! Циклоспорин А - 5 мг/кг/сутки, ежедневно, per os, на два приема, поддерживать

концентрацию Т0 = 150-250 нг/дл. При необходимости эквивалентная доза может быть введена внутривенно.

^ Метотрексат и преднизолон - возрастная доза (см. таблицу) эндолюмбалыю, дни 15, 22,29. 37

вводится только при сохранении плеоцитоза через две недели от начала системной терапии

Дексаметазон -10 мг/м2/сутки, дни 1-3,1 раз в две недели

'Протокол HLH-94: начало терапии CsA с 8 недели

Рисунок 1

Схема терапии ПГЛГ в соответствии с протоколом HLH-2004

Таблица 3 Характеристики процедуры трансплантации в группе пациентов с первичным гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом

Донор1 Совмест имость Источник'' NC, х108/кг Кондиционирование5 Профилактика РТПХ4

18.GL3 UCB 8/10 ПК 0,8 Bu 19 мг/кг Су 120 мг/кг Flu 100 мг/м2 Atgam 90 мг/кг Тасго 0,03 мг/кг MMF 30 мг/кг

29.GL32 UCB 8/10 ПК 3,4 Ме1180 мг/м2 Flu 150 мг/м2 Thy 10 мг/кг Тасго 0,03 мг/кг MMF30 мг/кг MTX4

31.GL2.1 MUD 10/10 СКПК 22 Bu 20 мг/кг Су 120 мг/кг Flu 100 мг/м2 Atgam 90 мг/кг CsA 3 мг/кг MMF 30 мг/кг

4-GL MUD 10/10 КМ 4,1 Bu 16 мг/кг Су 120 мг/кг Flu 90 мг/м2 Atgam 90 мг/кг MMF 30 мг/кг MTX4

13.GL12 MUD 8/8 КМ 8 Bu 20 мг/кг Су 200 мг/кг Atgam 160 мг/кг CsA3 мг/кг MTX 30 мг/кг Prnl мг/кг

25.GL1 MUD 10/10 СКПК 12 Bu 20 мг/кг Су 120 мг/кг Flu 100 мг/м2 Thy 10 мг/кг Тасго 0,03 мг/кг MMF 30 мг/кг

2S.GU0 MUD 10/10 СКПК 23 Bu 8 мг/кг Су 120 мг/кг Flu 150 мг/м2 Atg-F 40 мг/кг CsA 3 мг/кг MMF 30 мг/кг MTX4

2.GL27 MMRD 8/10 КМ 8,4 Mel 180 мг/м2 TT 10 мг/кг Flu 150 мг/м2 Atgam 90 мг/кг Тасго 0,03 мг/кг MMF 30 мг/кг

17.GLU MMRD 4/6 СКПК5 8 Bu 16 мг/кг Су 200 мг/кг Flu 90 мг/м2 Atgam 90 мг/кг CsA 3 мг/кг

21.G 13 MSD 6/6 СКПК 8,2 Bu 16 мг/кг Су 120 мг/кг Flu 90 мг/м2 Atgam 90 мг/кг CsA 3 мг/кг MMF 30 мг/кг

U.GLÍ MSD 6/6 СКПК 18 TT 15 мг/кг Су 15 мг/кг Flu 90 мг/м2 Atgam 90 мг/кг CsA 3 мг/кг

35GU MSD 6/6 КМ nd6 Ви 16 мг/кг Су200 мг/кг Atgam 90 мг/кг CsA 3 мг/кг

' UCB - неродственная пуповиннзя кровь, MSD-совместимый сиблинг, MUD - неродственный совместимый донор, MMRD- родственный частично совместимый донор 1 ПК - пуповинная кровь, СКПК - стволовые клетки периферической крови, КМ - костный мозг ' TT - тиофосфамид, Mel - мельфалан, Flu -флудэрабин. Bu - бусульфан, ТИу-тимоглобулин, Су - циклофосфамид, Atg-F- АТГ-Фрезениус, ATGAM - атгам. 4 Тасго-такролимус, CsA-циклоспорин А, MMF-мофетила микофенолат, MTX-метотрексат, доза 15 мг/м2 день +3,10 мг/м2-день +6, +11, Ргп -преднизолон 5 CD34+ -селекция 6 nd- нет данных

Ювеиильпьш мнсломоиоцптариый лейкоз

В первой линии терапии пациенты с ЮММЛ получали ДТ (п = 32) или ВХТ (п = 18), ТГСК (n = 1), сопроводительную терапию (п= 10).

Диффсренцировочиая терапия. ДТ включала 13-RA в дозе 100 мг/м2/сутки, per os, ежедневно в комбинации с АгаС в дозе 10-30 мг/м2/сутки, п/к, 10-14 дней каждого месяца. Дозу ЛгаС корректировали для поддержания содержания лейкоцитов в крови в интервале 3-10x10%.

Высокодозпая химиотерапия. ВХТ проводили в соответствии со стандартными элементами программной терапии острых миелобластпых лейкозов. Блоки FLA (Flu в дозе 30 мг/м №5, АгаС в дозе 2000 мг/м2 №5), FLAM (FLA + митоксаптрон (Mit) в дозе 10-12 мг/м2 №3), FLA Ida (FLA + идарубнцин (Ida) в дозе 8-10 мг/м2 №3), ADE ( АгаС 200 мг/м2/сутки №7, дауиорубнцнн (DNR) 45-60 мг/м2 №3, VP-16 150 мг/м2 №3), AraCVp (АгаС 500 мг/м2/сугкн №5, VP-16 100 мг/м2 №5), 1FOVP-16 (ифосфамид (IFO) 2000 мг/м2/сутки №5, VP-16 100 мг/м2 №5), АМЕ (АгаС 200 мг/м2/сутки №7, Mit 10-12 мг/м2 №3, VP-16 100-150 мг/м2 №3), НАЕ (АгаС 2000-6000 мг/м2/суп<и №4, VP-16 100 мг/м2 №4). При достижении ПО или ЧО на ДТ пациенты продолжали получать ДТдо развития рецидива ЮММЛ, развития других гематологических заболеваний либо решения о выполнении ТГСК. При отсутствии ответа на ДТ пациенты получали ВХТ в качестве терапии второй линии.

Трансплантация гемопоэтическнх стволовых клеток. Аллогснная ТГСК выполнена 20 пациентам. Семнадцать пациентов получили ТГСК в отделении трансплантации костного мозга РДКБ и включены в детальный анализ результатов ТГСК, 3 пациента трансплантированы в других клиниках и включены только в анализ выживаемости. Все пациенты получили мислоаблагпвнос кондиционирование. Пяти пациентам ТГСК выполнена от MSD, 8 пациентам - от MUD, 4 пациентам - от MMRD. В качестве источника ГСК использовал» КМ (п = 7), СКГ1К (п = 7, из них в 3 случаях проводили сслскцию CD34+ клеток па приборе CliniMacs, Miltenyi Biotcc, Германия), ПК (n = 3). Профилактику РТПХ проводили ингибитором кальциневрина (CsA, n = 10 или Tacro, n = 6) в комбинации с MTX (n = 1) или MMF (n = 8) или Ргп (n = 1). Один пациент получал MTX н MMF. Детали ТГСК суммированы в табл. 4

Таблица 4 Характеристики ТГСК в группе пациентов с ювенильным миеломоноцитарным лейкозом

Донор1 Источник ГОР Доза NC. xioy кг Кондиционирование5 Проф РТПХ*

3.jmm) исв 2хГЖ 2,5 Тгео 42 г/м2 Mel 100 мг/м2 FIU150 Atgam90 Тасго 0,015 мг/кг MMF 30 мг/кг

lS.jmml исв 2хПК 1,6 Bu 20 мг/кг Су 120 мг/кг Thy 10 мг/кг Тасго 0,015 мг/кг MMF 30 мг/кг

4.jmml MUD KM nd Bu 16 мг/кг Mel 100 мг/м2 - Thy7 мг/кг Тасго 0,015 мг/кг Ргп 1 мг/кг

17.jmml MUD СКПК 10 Bu 16 мг/кг Mel 140 мг/м2 Су 120 мг/кг Atg-F 40 мг/кг CsA 1 мг/кг MMF 30 мг/кг

29.|mml MUD KM 10 Bu *19 мг/кг Mel 140 мг/м2 Flu 150 мг/м2 Thy 10 мг/кг Тасго 0,015 мг/кг MMF 30 мг/кг

43Jmml MUD СКПК 22 Bu 16 мг/кг Mel 140 мг/м2 Су120 мг/кг Atgam 90 мг/кг CsA 1 мг/кг MMF 30 мг/кг

18.jminl MUD KM 6 Bu 16 мг/кг Mel 140 мг/м2 Flul50 мг/м2 Thy 10 мг/кг Тасго 0,015 мг/кг MMF 30 мг/кг

l.)mml MUD СКПК 5 Bu 16 мг/кг Me! 140 мг/м2 Flu 150 мг/м2 Atgam 90 мг/кг Тасго 0,015 мг/кг MMF 30 мг/кг

35.Jmml MMRD скпк* 11 Bu *19 мг/кг Mel 140 мг/м2 Flu 150 мг/м2 Thy 5 мг/кг CsA 1 мг/кг

9.Jmml MMRD СКПК* 3,2 Bu 16 мг/кг Mel 100 мг/м2 Flul50 мг/м2 Atgam 60 мг/кг АгаС 10 г/м2 + Mit 30мг/м2 CsA 1 мг/кг

S2jmml MMRD скпк* 2,3 Bu 16 мг/кг Mel 100 мг/м2 Flu 150 мг/м2 Thy 6 мг/кг АгаС 10 г/м2 + Mit 30мг/м2

47.jmml MMRD км 5,6 Bu *19 мг/кг Mel 140 мг/м2 Flu 150 мг/м2 Thy 5 мг/кг CsA 1 мг/кг MMF 30 мг/кг

6.jtnml MSD км 7,8 Bu 16 мг/кг Mel 140 мг/м2 Су120 мг/кг CsA 1 мг/кг MMF 30 мг/кг

48.jmml MSD ПК 0,05 Bu 16 мг/кг Mel 140 мг/м2 Су120 мг/кг CsA 1 мг/кг

57.]mml MSD км 3,1 Тгео 42 г/м2 Mel 100 мг/м2 Flul50 мг/м2 CsA 1 мг/кг

31.{mm1 MSD КМ 12 Bu 16 мг/кг Mel 140 мг/м2 FlulSO мг/м2 CsA 1 мг/кг

46.]mml MSD СКПК 19 Bu 16 мг/кг VP-16 500 мг/м2 Су120 мг/кг CsA 1 мг/кг MTX6

1 UCB - неродственная пуповинная кровь, MSD- совместимый сиблинг, MUD-неродственный совместимый донор, MMRD - родственный частично совместимый донор 4 ПК - пуповинная кровь, КМ - костный мозг, СКПК - стволовые клетки периферической крови, * - селекция CD34+ клеток 5 Тгео -треосульфан, Mel - мельфалан. Flu —флударабин, Bu -бусульфан/ГИу -тимоглобулин, Су- циклофосфамид, Atg-F -АТГ-Фрезениус, VP-16 - этопозид, АгаС-цитозина арабинозид, Mit - митоксантрон. Bu* - бусульфан для внутривенного введения, Atgam-атгам. 6 Тасго -такролимус, CsA- циклоспорин А, доза 1 мг/кг/сутки, MMF- мофетила микофенолят, MTX- метотрексат, доза 15 мг/м2 день +3,10 мг/м2-день +б, +11.

Гистиоцнтоз из клеток Лангсрганса

Стандартная терапия первой линии. В период с 1994 по 2003 год пациенты получали терапию первой линии в соответствии с рекомендациями одного из стандартных международных протоколов: DAL-HX-90 (п = 4), LCH I (п = 5), LCH II (п = 18), LCH 111 (п = 7). Дозы и порядок введения препаратов представлены на рис. 2.

Терапия второй лшшн. В случае неудачи терапии первой линии выбор терапии второй липни осуществляли индивидуально, так как общепринятого стандарта терапии второй лшшн не существовало. Терапия второй линии суммирована в табл. 5. Пять пациентов получили терапию с использованием комбинации 2-CdA и промежуточных доз АгаС.

Альтернативная терапия первой липни. На основании публикаций и собственного опыта применения 2-CdA и АгаС в 2003 году был создан протокол для пациентов с ГКЛ группы МСОР+. Терапия состояла из трех этапов: интенсивной фазы, фазы консолидации, поддерживающей терапии. В интенсивной фазе 9 пациентов получили три (п = 8) или 4 (n = 1) курса химиотерапии в составе: 2-CdA, 9 мг/м2 № 5, АгаС, 500 мг/м2 № 10, мстилпрсднизолоп, 5 мг/кг №5. Интервал между циклами терапии составил 4 недели. В фазе консолидации - 6 циклов терапии 2-CdA в дозе 6 мг/м2 № 5 с интервалом 4 недели. Поддерживающая терапия состояла из 6-мсркаптоиурппа (6-МП), 50 мг/м2/сутки и MTX, 20 мг/м2 еженедельно, общей длительностью до 18 месяцев от начала лечения. Дизайн протокола представлен на рис. 3

LCH I

I I I I I 1 I III

I-1_I_1_1_I_I

1 7 14 21 28 35 42 метилредниюлон - 30 мг/КГ/сутки, дни 1- 3

винбластин ■ 6 мг/м'/веедение, i раз в неделю, неделя 124 а/аенно струйно

Ш III

Ml

-1_1_j_l_

Дни 1 7 14 21 28 35 42 метилреднизолон - 30 мг/КГ/сутки, дни 1- 3

Этопозид -150 мг/м'/введение, день 1-3 каждого цикла, о/оенно капельно, неделя 1-24

ИНТЕНСИВНАЯ ФАЗА

ПОДДЕРЖИВАЮЩАЯ ТЕРАПИЯ

LCH II

i i i i

7 14 21 28 35 42

Преднизолон - 40 мг/м /сутки, дни 1- 28, отмена к дню 42,

per os

Винбластин - 6 мг/м'/введение, дни 1,7,14,21,28,35, в/пенно струйно

Этопозид -150 мг/м'/введение, дни 1,7,14,21,28,35, в/венно капельно

ИНТЕНСИВНАЯ ФАЗА I

Дии

I

1 1 1

1 1 1

• 1 1 ч * 1 1 1 1 1

1 7 14 21 28 35 42

24 недели от начала терапии

Преднизолон - 40 мг/м'/сутки, дни 1- 5 каждого цикла, per os

Винбластин - 6 мг/м'/введение, в/в струйно

Этопозид - 150 мг/м /введение, день 1 каждого цикла о/венно капельно

ИНТЕНСИВНАЯ ФАЗА II

LCH

000

1 I I I I I

I_I_I_I_I I I

1 7 14 21 28 35 42

000

1 I I I I I

I I I I

J_I

7 14 21 28 35 42

I

О

Преднизолон - 40 мг/м'/сутки, дни 1- 28,

Винбластин - 6 мг/м'/введение, дни 1,7,14,21,28,35, u/венно струйно

Метотрексат - SOO мг/м'/2Д ч в/венно струйно

4

i

О

Преднизолон - 40 мг/м'/сутки, дни 1-4,7-10,14-17,21-24,28-31,3538, per os

Винбластин - 6 мг/м'/введение, дни 1,7,14,21,28,35, в/венно струйно

Метотрексат - 500 мг/м"/24 ч в/венно струйно

i, дни 1,14,28,

ПОДДЕРЖИВАЮЩАЯ ТЕРАПИЯ ГРУППА ВЫСОКОГО Р

1 i i

т i i ■» i i i i i

52 недели от начала терапии

Дни

7 14 21

28 35 42 Преднизолон - 40 мг/м'/сутки, дни 1- 5 каждого цикла, per os Винбластин - б мг/м'/введение, день 1 каждого цикла, в/в 6-меркаптопурин - 50 мг/м'/сутки, ежедневно, per os

Рисунок 2 Схема терапии ГКЛ в соответствии с программой LCH-I, LCH-II, LCH-III

Таблица S Терапия второй линии в группе пациентов с ГКЛ

№ Возраст, месяцев Терапия Статус через 6 недель Альтернативная терапия (до 2-CdA) Интервал до 2-CdA, дни 2-С()А-содержащие циклы терапии

1 5 LCH 1 ПЗ МР 30 мг/кг №3 - 2 блока 81 2CdA 6 мг/м'/сут N5, АгаС 200 мг/м /сут N5 - 2 блока

2 28 LCH 11 ПЗ 37 2CdA 7 мг/м'/сут N5, DNR 45 мг/м'/сут N3; 2CdA 7 мг/м'/сут N5, АгаС 1000 мг/м'/сут N5; 2CdA 7 мг/м'/сут N5, АгаС 1000 мг/м /сут N5 + Ida 8 мг/м'/сут N3

3 11.3 LCH II ПЗ 46 2 CdA 8мг/м'/суг N5, АгаС 1000 мг/м/сут N5-4 блока

4 6,3 LCH II ПЗ 60 2 CdA 7 (9)мг/м'/сут N5, АгаС 1000 мг/м'/сут N5 - 3 блока

5 26 LCH II ПЗ МР 20 мг/кг №3; Су 500 мг/м'+Винкристин (Ver) 0,05 мг/нг №4; Инфликсимаб 4 мг/кг №1; MTX 500 мг/м2/24 часа + МР 20 мг/кг N53 + 6-МП; MTX 500 мг/м'/24часа; FLAG 138 2 CdA 8{9)мг/м'/сут N5, АгаС 1000 мг/м'/суг N5-3 блока (в 3 + Dauno 45 мг/м'/сут N2)

6 15 LCH II ПЗ Интенсивная фаза II (рукав В, Mtx+) 87 2 CdA 6 мг/м'/сут N5, АгаС 1000 мг/м'/сут N5-3 блока

7 24 LCHII ПЗ 29 2 CdA 6 мг/м'/сут N5. АгаС 1000 мг/м'/сут N5-3 блока

9 5,2 LCHII 40 VP16 100мг/м' + МР 30 мг/кг №3- 2 блока

10 4 LCHI ПЗ АТГ 25 мг/кг/курс; Cph 500 мг/м' + DOXO 25 мг/м'; МР 30 мг/кг №3

Общий план терапии

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Интенсивная фаза: комбинированная терапия 2-Сс1А + Ага + МП, интервал 28-35 дней Консолидация: монотерапия 2-С<ЗА , интервал между циклами 28 дней

Поддерживающая терапия: 6-МП - 50 мг/м2/сутки, ежедневно рег об и Мтх 20 мг/м'/неделю

I 4

Интенсивная фаза Консолидация

I 1 I 1 I ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

АгаС - 500 мг/м2/введение, дни 1-5, 10 введений с интервалом в 12 часов,

- 2-CdA - 9 мг/мг/сутки, дни 1-5, ♦ МП - 5 мг/кг/сутки, дни 1-5,

i_I_I_I_I_I

Дни 1 2 3 4 6 6 I 2-CdA - 6 мг/м2/сутки, дни 1-5

Рисунок 3 Терапевтическая схема пилотного протокола для пациентов с MC0P+ ГКЛ

Статистическим анализ

Статистический анализ выполнен в программе Statistica 7.0, StatSoft и в программе InStat, GraphPad. Функция выживаемости и кумулятивная вероятность наступления анализируемого события рассчитана по методу Kaplan-Meier. Пациенты, живущие в ремиссии на момент анализа данных, цспзурированы 01.01.2011. Сравнение медиан выполнено при помощи теста MannWhitney, сравнение разности долей, расчет относительного риска - при помощи точного теста Fisher. При анализе факторов прогноза сравнение функции выживаемости выполнялось при помощи log-rank теста. При анализе метрических переменных формировали две группы по отношению к медиане (I - <, 2 - >). Статистически значимыми считались различия при р < 0,05.

Результаты исследования

Клииико-лабораториая характеристика группы пациентов с ПГЛГ

Исходная клинико-лабораторная характеристика 32 пациентов с ПГЛГ представлена в табл. 6.

Таблица 6

Клиническая характеристика группы пациентов с ПГЛГ (исключая пациентов с Х-ЛПС1_

Все, п = 32

Медиана, месяцев разброс

Возраст манифестации, мес 9,6 0,5-116

Возраст диагноза, мес 14,7 1-186

Интервал диагноз-манифестация, мес 1,6 0,3-134

Пол, м:ж 22:10

п %

Гемофагоцитоз 14 43

ЦНС-поражение 26 81

п %

Полный ответ на ИСТ, 7 26

Частичный ответ на ИСТ 14 52

Рефрактерность 6 22

ТГСК 12 37,5

Результаты молскулярио-гемстичсского исследовании

В результате исследования выявлен 1 пациент с компаунд-гетерозиготной мутацией в гене PRFI ранее описанная миссснс-мутация c.916G>T (p.306Gly>Cys), приводящая к изменению аминокислотной последовательности в области MAC домена, и ранее не описанная нонсенс-мутация c.1283G>A (р.428 Trp>Stop), приводящая к образованию преждевременного стон-кодона в области, кодирующей С2 домен белка. Последовательность гена UNCI3D проанализирована у 25 пациентов. Выявлено 10 пациентов с би-аллсльпымн мутациями в этом гене. Ич них I пациент с гомозиготной мутацией и 9 - компаунд-гстсрозиготы. У 3 пациентов выявлены мутации и гене UNCI3D в гетерозиготном состоянии. Среди выявленных мутаций 9 впервые описаны в данной работе. У одного пациента была выявлена не описанная ранее мутация c.675_679dcl во втором экзонс гена STX11 у гомозиготном состоянии. Обнаруженная мутация приводит к делецпи трех аминокислот, вставке одной повой, исчезновению стоп-кодона и, предположительно, к образованию более длинной мРНК (p.H225_L227delinsHFsX127). При исследовании кодирующих последовательностей гена RAB27A и STXBP не было выявлено ни одной мутации. При исследовании кодирующей последовательности гепа SH2D1A были обнаружены две мутации с. 164G>T (p.55Arg>Lcu) CD014961 у пациента GL14 и c.245_246msA (p.N82KFsX2l) CI03448X у пациента GL34. При исследовании данной группы пациентов в гене BIRC4 мутации выявлены пс были. Таким образом, наиболее распространенным гснетичсским вариантом ПГЛГ в группе российских пациентов является FHL3. Если исключить из анализа пациентов с верифицированным Х-ЛПС, то относительная частота пациентов с мутациями в гене UNC13D составляет 54%, PRF1 -4 %, STX - 4%. (рис. 4.) Все выявленные мутации суммированы в табл.7. При исследовании кодирующей последовательности гепа UNCI 3D выявлены две повторяющиеся мутации (делецпя c.2346_2349del - на четырех хромосомах, инссрция c.3037insG - на пяти хромосомах). Показано, что хромосомы, несущие мутацию c.2346_2349del, имеют общий гаплотии D17S1839-D17S1603-D17S785: 1-2-3. Для всех хромосом с мутацией c.3037insG также был выявлен общий гаплотнп D17S1301-D17S1839-D17S1603: 2-6-7. Можно предположить, что данные гаплотнны являются сохранившимися частями гаплотипов хромосом, на которых исходно в популяции возникли мутации.

Клинико-генстичсскос сопоставление

Результаты сравнения исходных клинических и лабораторных показателей в группе пациентов с мутациями в UNC13D в сравнении с другими и неустановленными вариантами ПГЛГ представлены в табл. 8. Существенных различий в клинико-лабораторпой презентации и исходе терапии заболевания в исследованных группах пс выявлено, (рис. 5)

Пац JeH т Ген Выявленные мутации Изменение аминокислотной последовательности Ссылки экзон/ интрон

GL16 PRF1 c.916G>T c.l283G>A p.G306C P.W428X Trizzino etal 2008 Trizzino et al 2008 экзон 3 экзон 3

GL1 UNC13D c.2346_2349del c.3037insG p.R782SFsXll p.D1013GFsXll ERuddetal 2008 новая экзон 24 экзон 31

GL2 UNC13D c.3037insG c.3173T>C p.D1013GFsXll P.L1058P новая новая экзон 31 экзон 32

GL3 UNCI 3D c.627delT c.l828insA p.T209TFsX40 p.R610HFsX6 ERuddetal 2008 новая экзон 8 экзон 20

GL4 UNCI 3D C.322-1G>A CD042833 c.3037insG Splice error p.D1013GFsXll Santoroetal 2006 новая интрон 4 экзон 31

GL5 UNCI 3D c.2216_2239del c.2346_2349del p.N739_S747delinsS p.R782SFsXll новая Е Rudd et al 2008 экзон 23 экзон 24

GL17 UNC13D c.3037insG c.3037insG p. D1013GFsXll p.D1013GFsXll новая новая экзон 31 экзон 31

GL19 UNC13D C.1592G>A c.2346_2349del P.W531X p.R782SFsXll новая Е Rudd et al 2008 экзон 18 экзон 24

GL27 UNC13D c.l055+5G>A c.2867C>T Splice error p.956Pro>Leu новая новая интрон 12 экзон 30

GL32 UNC13D C.9190T c.2216- 2239del p.307Gln>Stop p.N739.S747delinsS новая новая экзон11 экзон 23

GL33 UNC13D c.2346-2349 del c.3011T>C p.R782SFsXll p.l004Asp>Gly ERuddetal 2008 новая экзон 24 экзон 31

GL8* UNC13D c.2782C>T N p.R928C no ERuddetal 2008 нет экзон 29 нет

GL15* UNC13D c.2782C>T N p.R928C no ERuddetal 2008 нет экзон 29 нет

GL18* UNC13D c,1828insA N p. R610HFsX6 no новая нет экзон 20 нет

GL9 STX11 c.675.679del c.675_679del p.H225_L227delinsHFsX127 p.H225_L227delinsHFsX127 новая новая экзон 2 экзон 2

GL14 SH2D1A C.164G>T CD014961 геми p.R55L Dutz et al 2001 экзон 2

GL34 SH2D1A c.245_246insA C1034488 геми p.N82KFsX21 Halasa et al 2003 экзон 3

* пациенты с одной выявленной мутацией

UNCI 3D 42%

UNC13D гетеро 12%

Рисунок 4

Распределение генетических вариантов ПГЛГ в группе российских пациентов

22

Таблица 8. ПГЛГ: клинико-генетическое сопоставление

иЫШй, л = 15 ¡ТХ, неуточненные, п = 17 Р =

медиана разброс медиана разброс

Возраст манифестации 4,2 1-116 14,3 0,7-104 0,7724

Возраст диагноза 186 1,9-148 17,2 1-186 0,7346

Интервал диагноз-манифестация 1,38 0,3-55 1,6 0,5-134 0,5873

Пол, м:ж 9:6 13:4 0,4501

Гемофагоцитоз 10 64 4 25 0,099

ЦНС-поражение 12 81 14 81 1,0

п % п %

Полный ответ на ИСТ 3 23 4 30 1,0

Частичный ответ на ИСТ 8 62 6 46 0,6951

Рефрактерность 2 15 3 23 1,0

ТГСК 6 46 6 35 1,0

ОБ, месяцев 7,8 0,8-94 12,8 0,4-171 0,2191

Результаты терапии

Иммуносупресснвная терапия. Из 32 пациентов с ПГЛГ 2 не получили ИСТ и умерли от прогрессии заболевания. В 3 случаях ответ на терапию не подлежал оценке в связи с ранней смертью пациентов. Из 27 пациентов 6 (22%) не ответили на терапию, 7 (26%) достигли статуса ПО и 14 (52%) достигли статуса 40. Одна пациентка остается в ремиссии заболевания па сроке 40 месяцев от начала терапии и 15 месяцев от окончания. Реактивация заболевания развилась у 20 (95%) пациентов с медианой 5 месяцев, из них у 5 после окончания терапии, у 16 во время терапии первой линии. ИСТ второй линии получили 26 пациентов. ТГСК была выполнена 12 пациентам. Трансплантация гсмопозтнчсских стволовых клеток. Всего выполнено 13 ТГСК у 12 пациентов, 12 первичная и 1 повторная.

Приживление и химеризм Приживление трансплантата зарегистрировано у всех пациентов. Медиана интервала времени до приживления составила 17 дней (11-28 дней). У 1 пациента

23

развилось раннее отторжение трансплантата. Стойкое первичное приживление трансплантата достигнуто у 11 (91,2%) из 12 пациентов. Анализ гемопоэтического химеризма выполнен у 10 из 12 пациентов, из них у 9 (90%) констатирован стойкий полный донорский химеризм, у 1 (10%) пациента после немислоаблативного кондиционирования - стабильный смешанный химеризм (10% собственных клеток реципиента). Инфекционные осложнения и висцеральная токсичность. Цитомсгаловирусная (ЦМВ) - виремня была выявлена у 8 (72,7%) из 11 пациентов, упреждающая терапия ЦМВ-рсактивации ганцикловиром была эффективна у 7 пациентов. Реактивация инфекции вирусом Эпштсйна-Барр (ЭБВ) была выявлена у 1 (12,5%) из 8 пациентов, терапия рнтуксимабом (4 введения по 375 мг/м2) оказалось неэффективной. ВОБ печени не выявлена ни у одного пациента. РТПХ. Острая РТПХ II—IV степени была зарегистрирована у 7 (70%) из 10 пациентов, III—IV степени - у 3 (30%) пациентов. Хроническая экстенсивная РТПХ развилась у 1 пациента, лимитированная - у 2 пациентов. Анализ летальности. В ноетгрансплаптационном периоде умерли 7 (58,3%) из 12 пациентов. Причиной смерти 1 пациента явилось основное заболевание. Шесть пациентов умерли от токсичности, ассоциированной с процедурой ТГСК, из них 1 пациент от РТПХ и инвазивиого микоза, 1 пациент от острого повреждения легких, 1 пациент от ЭБВ-ассоциированного посттрансплантационного лимфопролиферативного заболевания (ПТЛЗ), 1 пациент от септического шока, 1 пациент от острой печеночной недостаточности, обусловленной реактивацией вирусного гепатита В на фоне цирроза печени, 1 пациент от идиопатичсского нневмонита. Трансплантационная смертность (pTRM) составила, таким образом, 54 ± 15%. Летальность в первые 100 дней после ТГСК составила 3 случая из 12 (25%). При использовании режимов кондиционирования со сниженной интенсивностью умерли 3 из 4 пациентов. Общая выживаемость. На момент анализа данных, 5 пациентов живы и находятся в ремиссии при длительности от 1,9 месяца до 13,6 лет (162,6 месяца), медиана 6,6 лет. 5-лстняя рОВ составила 37 ± 14%. (рис. 6)

Общий анализ результатов терапии

Медиана наблюдения 32 пациентов с ПГЛГ составила 9 (0,3-171) месяцев. На момент анализа результатов терапии были живы 6 пациентов. 5-лстняя рОВ составила 12 ± 7 % . (рис.7) При анализе потенциальных факторов прогноза исследованы следующие показатели: пол, возраст на момент начала заболевания, ответ на ИСТ первой линии, генетический вариант ПГЛГ, выполнение ТГСК. Показано, что единственным фактором, достоверно влияющим на ОВ, явилась ТГСК, рОВ = 30±16% vs 0%, log-rank р = 0,0005. (рис. 8)

UNC13D рОВ = 0,25±0,11, п - 15, живы - 4 другие рОВ = 0,08±0,07, п -12, живы -1

log-rank р = 0,82

О 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192

• другие ■ UNC13D

Длительность наблюдения месяцы

Рисунок 5 Сравнение общей выживаемости в зависимости от генетического варианта ПГЛГ

12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 Длительность наблюдения, месяцы

Рисунок 6 Общая выживаемость пациентов с ПГЛГ после ТГС'К

Длительность наблюдения, месяцев Рисунок 7. Общая выживаемость пациентов с ПГЛГ

Длительность наблюдения, месяцев

Рисунок 8. Общая выживаемость пациентов с ПГЛГ в зависимости от ТГСК

Заключение

Представленные результаты демонстрируют, что генетическая структура ПГЛГ в России уникальна и характеризуется преобладанием генетического субварианта РНЬЗ. Несмотря на то, что исследование не является популяционным с точки зрения формирования выборки, анализируемая группа пациентов является наиболее крупной в стране и может считаться репрезентативной. Доминирование мутаций в гене ЦЖЛЗО обусловлено, по крайней мере частично, «эффектом основателя», то есть закреплении и распространении в популяции двух мутаций, делеции с.2346_2349с!с1 и ипссрции с.ЗОЗТтвО. Эти мутации составляют 48% от всех выявленных генетических дефектов в гене ЦЖЛЗЭ и 34% от всех идентифицированных мутации. Выявление в популяции пациентов с клиническим диагнозом ПГЛГ двух больных с Х-ЛПС подчеркивает необходимость включения Х-ЛПС в дифференциальный диагноз у всех пациентов мужского пола с ПГЛГ. Результаты генетического исследования позволяют предложить исследование частых мутаций в гене (/N0130 в качестве первого этапа молекулярной диагностики ПГЛГ. С целью оптимизации расходов на поисковую молекулярную диагностику необходимо внедрение проточной цитометрии в качестве этапа комплексной клшшко-лабораторпой диагностики ПГЛГ в соответствии с разработанным алгоритмом, (рис. 9.) При отсутствии возможности функционального анализа, вторым этапом молекулярно-гснстичсской диагностики должно стать прямое секвенированис всех экзонов гена иМС13й, далее - исследование других генов. Анализ результатов терапии показал, что контроль заболевания, достигаемый ИСТ, является кратковременным и не обеспечивает долгосрочной выживаемости и что ТГСК является единственным методом терапии, способным обеспечить выздоровление пациентов с ПГЛГ. Сравнение результатов ТГСК в группе российских пациентов с опубликованными результатами зарубежных исследований подтверждает, что трансплантационная смертность является основным препятствием к успеху ТГСК. Высокая токсичность обусловлена, вероятно, кумулятивным воспалительным повреждением органов при повторных реактивациях ПГЛГ и инфекционными осложнениями длительной иммуносупрсссни. Показатель рОВ во всей группе пациентов с ПГЛГ отражает готовность отечественной педиатрической и гематологической службы к решешпо задачи своевременной диагностики и эффективной терапии пациентов с ПГЛГ. Только 7 из 32 пациентов генетический диагноз установлен при жизни. Неправильны!! инициальный клинический диагноз был установлен 16 (50%) пациентам. Доля пациентов с ПГЛГ, которым была выполнена ТГСК, составила лишь 37,5%. Медиана длительности интервала от установления диагноза до ТГСК составила 14,6 месяцев (2,9-109), для сравнения - в зарубежных исследованиях - медиана составила от 3,5 до 9 месяцев. Ни один пациент не получил ТГСК в статусе первого 110. Активность заболевания сохранялась па момент ТГСК у 66% пациентов. На основании

представленных данных, с целью улучшения результатов терапии, разработан алгоритм ведения пациентов с клиническим диагнозом ПГЛГ. (рис. 10) Наиболее принципиальной позицией является выполнение ТГСК на сроке не позднее 4 месяцев от установления диагноза. Указанный срок обоснован балансом между средним временем поиска неродственного донора (4 месяца) и медианой интервала до реактивации заболевания (3 месяца).

Алгоритм клинической и лабораторной диагностики ПГЛГ

---Гамофагоиитарнки"

динаром ?

триглицариды ф, феррмтмн ф, ЛДГ фибриноген I

гемофагоцито», отсутстаиа бластоаа плаоцмтоа, белок ф, гамофагоцитоа цитотоксичность |ЧКкл«го|1 ф, ||12>К 1*

ПаранчциЧ ?

Гамоуогоцитпр! ааУ синдром I

( "*рф «рин |

< >

1 1

57X11, МЦЫС1Я-2

Рисуиок 9. Алгоритм клинической и лабораторной диагностики ПГЛГ Ювспильиын мисломоноцитариый лейкоз

Клинико-лабораторная характеристика группы пациентов с ЮМ МЛ

Исходная общая и клинико-лабораторная характеристика 61 пациента с ЮММЛ представлена в табл. 9 и 10 Результаты молекулярно-геветического исследования Для молекулярно-генетического исследования были доступны 44 образца биоматериала, в 7 случаях амплификация целевых фрагментов была неэффективна, в 13 были выявлены мутации в гене РТРЫ11, в 5 - в гене С-СВЬ, в 5 - в гене МЯЛЯ, в 4 - в гене К ПАЗ, в 10 образцах изменения нуклеотидной последовательности не выявлены, из них в 3 случаях установлен клинический диагноз «пейрофиброматоз I типа». Распределение генетических вариантов в группе пациентов с ЮММЛ представлено на (рис. 11).

Рисунок 10.

Алгоритм диагностики и выбора терапии у пациентов с ПГЛГ

Таблица 9. Общая исходная характеристика пациентов с ЮММЛ

Данные доступны,п п %

Пол, м:ж 61 39:22 36:64

Гепатомегалия 61 61 100

Спленомегалия 61 61 100

Лимфаденопатия 60 57 95

Сыпь 60 36 60

Нейрофиброматоз 1 типа 61 6 10

ГМ-колонии 43 31 72

Нормобласты, кровь 60 36 60

Аномалии кариотипа 33 12 36

Терапия

13-ЯА (+АгаС) 61 32 (29) 52(47)

ВХТ 61 18 29

Без терапии 61 7 11

Другая 61 4 6

ТГСК 61 21 34

п медиана минимум максимум

Возраст манифестации, месяцев 61 12,2 0,5 97

Возраст диагноза, месяцев 61 20,3 1,1 102,5

Гепатомегалия, см 60 5 2 12

Спленомегалия, см 61 7 3 17

Лейкоциты, х109/л 61 32 4,2 132

Моноциты, х105/л 61 5,2 1,0 33,8

Тромбоциты, хЮ'/л 61 39 4 377

Бласты, кровь, % 61 2 0 50

Незрелые гранулоциты, кровь, % 60 9 0 42

Гемоглобин Р, % 48 9,5 0 87

ЛДГ, МЕ/л 52 498 120 1977

Бласты, к/м, % 61 6,2 0,8 20

Генетическая структура ЮММЛ (п = 37)

Рисунок 11. Генетическая структура ЮММЛ Детальная информация о выявленных мутациях представлена в табл. 11. Все выявленные мутации описаны при ЮММЛ и других опухолях гемопоэтического происхождения. При анализе линейного распределения выявленных мутаций показано, что мутации выявляются во всех исследованных линиях дифферспцировки миелоидных и лимфоидмых клеток, (рис. 12)

Клинико-геиетическое сопоставление

Результаты сравнения исходных клинических и лабораторных показателей в группах с различным

генетическим субвариантом ЮММЛ представлены в табл. 12 . Показано, что клинико-

лабораторная презентация различных генетических вариантов практически идентична.

Исключением являются возраст манифестации заболевания: медиана 24 месяца в группе PTPN11 в

сравнении с 6,7 месяцев в группе RAS, р = 0,0252, и содержание HbF: 21% в группе PTPN11 в

сравнении с 4,6%i в группе RAS, р = 0,0008, и 5,5% в группе C-CBL, р = 0,0059. Показано, что

30

возраст манифестации I год и содержание фсталыюго гемоглобина 10% могут быт!, использованы как пороговые значения для предсказания генетического варианта ЮММЛ (табл 13)

Таблица 11. Соматические мутации, выявленные у пациентов с ЮММЛ

образец ген экзон ДНК Белок

18.jmml.ll С-СВ1 8 Т1111С Туг371Н($

20.jmml.49 8 Т1111С Туг37Ш$

22.jmml.46 8 Т1111С Туг371Н|'5

33.jmml.50 8 61151А Су5384Туг

38.jmml.16 8 Т1111С Туг371Н|з

1.)тт1.31 Ш 2 С38А С1уХЗАзр

7^тт1.52 2 035 А 61у12А5р

52.jmml.44 2 С37Т 61у13Су5

43.)тт1.3 3 А182Т ^ибИеи

3^тт1.30 ЫЯАЭ 2 С38А &у13А5р

29.)тт1.9 2 635А б1у12А5р

49.jmml.36 2 Й38А С1у13АБр

53.jmml.24 2 636А С1у12А5р

59.jmml.33 2 в34Т 6|у12Су$

6.)тт1.2 РТРЫ11 3 Й226А &и761.у5

9.)тт1.7 3 6181Т А5р61Туг

13.)тт1.4 3 А2276 С1_и76С1у

15.jmml.17 13 61508С в1у503А1а

25.jmml.25 3 61811 АзрбИуг

28.jmml.19 13 61508Т ау503Уа1

31.]шш1.6 3 А227Т аи7бУа1

44.jmml.14 3 С218Т А1а73Уа|

45.jmml.13 3 А227в 61и76Уа1

46.jmml.15 3 А227С 61и76А1а

47.jmml.29 3 (3226С аи76С1п

58.jmml.51 3 6205А аибЭЬуь

60.jmml.18 13 С1508Т 61у503Уа1

Таблица 13.

Корреляция возраста, НЬИ и генетического варианта

Возраст НЬИ Группа Все, п Молекулярны Й анализ, п РТРЫ11 Д45 С-СВ1

<1 года <10% 1 16 11 0 6 (54%) 2

>10% 4 4 2 1 0

Нет данных 10 8 2 1 1

>1 года <10% 10 8 2 1 2

>10% 2 18 9 7 (77%) 0 0

Нет данных 3 0 0 0 0

Ш (%} 1 уэ. 2 Р = 0,0141

РТРШ1 (%) Р = 0,0005

консенсус 2005 год Цельная кровь 2010 год Цельная кровь ....САССТССТСТТССС.... : , : ^ ; ! ; Т . ; ;

С015+ ^/чЛЛЛааЛЛЛЛ/Х/

СЭЗ+ СБ34+ Л У47 VУ—Л V V V

С014+ )(vЛVW^/Vv^/w

буккальный эпителий .ЛАл/ХХ^УУ^ ю 1: 6 • 7 б [3 1 « I I е 6

мать, цельная кровь

отец, цельная кровь ^ЫкМ^ДууV

Рисунок 12.

Псрсистспция мутантного клона(Л7?/!ХС38А —»ОуПАвр) в основных фракциях лимфоцитов и миелоидиых клеток костного мозга

Таблица 12 ЮММЛ: клшшко-гснстическос сопоставление

PTPN11, п-13 C-CBL, п=5 RAS, п=9 PTPN1 PTPN1J C-CBL lvsC- vsRAS vsRAS CBL

медиана разброс медиана разброс медиана разброс Mann-Whitney P =

Возраст манифестации, мес 24 1-97 8,5 5,4-50 6,7 0,4-13 0.6331 0.0252 0.3856

Возраст диагноза, мес 35 2-102 13,4 11-57 10,7 1-19 0.5028 0.0033 0.1898

Гепатомегалия. см 5 4-8 4 3-12 6 3-9 0.2067 0.9999 0.5418

Спленомегалия, см 7,5 3-17 6 4-13 5 4-12 0.4249 0.4098 0.9999

Лейкоциты, хЮ'/л 42 11-107 25 6,9-41 29 4-100 0.0460 0.6164 0.6064

Моноциты, % 14 1-33 19 9-29 20 12-39 0.3486 0.0325 0.5045

Моноциты, х109/л 4,9 1-14 3,5 1,3-12 5,9 1.6-25 0.6218 0.5041 0.2398

Тромбоциты, хЮ'/л 32 4-116 37 22-150 39 22-197 0.3486 0.3850 0.9467

Бласты, кровь, % 3 0-8 1 0-18 0,5 0-2 0.3703 0.0146 0.5752

Незрелые гранулоциты. кровь, % 13 2-33 9 1-27 7,5 1-33 0.2355 0.3460 0.9414

НЬР,% 21 3-77 5,5 2-9 4,6 1,7-11 0.0059 0.0008 0.7337

Бласты, к/м, % 5,6 1-10 9,2 2,8-18 7 1-10 0.2175 0.9201 0.3163

Моноциты, к/м, %

ЛДГ, МЕ/л 811 230-1970 271 234-755 383 196-644 0.1377 0.1259 0.5273

Продолжительность жизни, месяцев 23 3-84 17 10-39 27 0,3-75 0.8490 0.1687 0.2222

п % п % п %

Пол, м:ж 10:3 77:23 2:3 40:60 S:4 56:44 0.2682 0.3762 1.00

Лимфаденопатия 12 92 4 80 9 100 0,4902 1,0 0,3571

Сыпь 9 69 2 40 3 33 0,3260 0,1920 1,0

Цитогенетика 0(6) 0 1(4) 25 1(3) 33 0,4000 0,3333 1.0

Нормобласты, кровь 10 77 2 40 6 66 0,2682 0,6550 0,5804

ГМ-колонии 8 73 1(3) 33 7(8) 87,5 0.5500 0,3359 0,1515

Бласты, кровь 11 85 3 60 5 . 55 0,5327 0,1778 1.0

Бласты, км, > 5% 8 62 4 80 4 44 0,6148 0,6656 0,3007

ДТ 8 62 4 80 6 66 0,6148 1.0 1,0

ВХТ 2 15 1 20 2 22 1,0 1.0 1.0

ТГСК 8 62 2 40 3 33 0,6078 0,3870 1,0

Результаты терапии

Дифферспцировочпая терапия. Тридцать два пациента получили ДТ в качестве терапии ncpuoii линии, 2 пациента были потеряны из-под наблюдения, 3 не подлежали оценке. Из 27 нацистов клинически значимый ответ был получен у 12 (44%) пациентов (ПО - 2, 40 - 10). У 11 пациентов, ответивших на ДТ, достигнутый ответ сохранился до окончания наблюдения (п = 8) или до выполнения ТГСК (п = 3). Трем пациентам, находящимся в статусе 40, была выполнена ТГСК от MUD (п = 2) или MSD (n = 1). У 1 пациента, находившегося в статусе ПО, через 8 лет от окончания ДТ развился Т-клеточпый острый лимфобластпын лейкоз. У I пациента, находившегося в статусе ПО, через 2 года от окончания ДТ развилась аутоиммунная TT1I. Пятнадцать пациентов не ответили на ДТ (СЗ - 8, ПЗ - 7), из них 6 в дальнейшем получили ВХТ и ТГСК, 2 - ТГСК, 4 - ВХТ, 3 - только ДТ. Исходные характеристики пациентов с разным ответом на ДТ представлены в таблице 14. Сравнение исходных характеристик показало, что в группе ДТ-

R (ответившие на ДТ) медиана возраста манифестации и содержания HbF достоверно ниже, чем в группе ДТ-NR (не ответившие на ДТ). Генетический анализ показал, что в группе ДТ-R относительно преобладают пациенты с дефектами C-CBL и RAS в сравнении с PTPNII. Всего в группе ДТ умерли 19 (59%) пациентов, 14 от прогрессии заболевания, 5 от осложнений ТГСК. Среди пациентов, но ответивших на ДТ, 11 умерли, 9 от прогрессии заболевания, 2 от осложнений ТГСК. Четыре (26%) живы, 2 из них после успешной ТГСК, 2 - в статусе СЗ получают ДТ. Среди пациентов, ответивших на ДТ, 3 умерли от токсичности ТГСК, 9 (75%) живы и находятся в статусе ПО (п - 2) или 40 (п - 7), из них 7 продолжают получать ДТ. 5-лстняя рОВ в группе ДТ составила ЗХ ±11%. 5-лстняя рОВ пациентов, ответивших на ДТ, составила 75±15% в сравнении с 5-лстнсй рОВ = 9±8% пациентов, не ответивших на ДТ, log-rank р = 0,0005. (рис. 13).

При молскулярно-генстичсском анализе пациентов с идентифицированным генетическим дефектом показано, что у пациентов, находящихся в статусе ПО, в динамике персистируст мутантпын клоп (рис. 12)

Высокодозная химиотерапия. Восемнадцать пациентов получили в качестве терапии первой липни ВХТ. Медиана числа курсов ВХТ составила 2,5 (1-5). Один пациент умер от сепсиса до оценки ответа па терапию. Из 17 пациентов у 9 (53%) был зарегистрирован ответ на терапию (ЧО - 6, ПО - 3), 8 (47%) пациентов не ответили иа терапию. Из 9 пациентов, ответивших на ВХТ, 3 пациента живы в ППР после ТГСК, 4 умерли, 2 потеряны из - под наблюдения. Из 8 пациентов, не ответивших па ВХТ, 1 жив после ТГСК, 7 умерли (2 после ТГСК). Десять пациентов получили ВХТ после неудачи ДТ, у 4 (40%) был достигнут ЧО, у 6 (60%) - ПЗ. Всем пациентам (п - 4) с ЧО выполнена ТГСК, 2 живы в ППР. Среди пациентов с ПЗ, 2 выполнена ТГСК, оба пациента умерли от прогрессии ЮММЛ. 5-лстняя рОВ в группе ВХТ составила 28±11%. (рис. 14)

Трансплантация гсмопоэтнчсских стволовых клеток. Первичное приживление достигнуто у 13 пациентов. Медиана восстановления иейтрофилов составила 16 (8-32) дней. Четырем пациентам с первичной недостаточностью трансплантата была выполнена вторая трансплантация. Медиана выполнения второй трансплантации составила 128 (54-292) дней. Приживление после второй ТГСК достигнуто у всех пациентов с медианой восстановления гемопоэза 13 (12-16) дней. Кумулятивная вероятность первичного приживления составила 76,5±10%, финального приживления - 100%.

Таблица 14. ЮММЛ: анализ ответа на днффсрснцнровочную тсрапшо 13-RA и АгаС

Д1-гехри>н1ег, n=12 ///-non-responder, n-15 Mann-Whitney, p

Медиана piiiópoc медиана рашрос

Возраст манифестации, месяцев 6,5 1-34 11,3 4,8-97 0,0299

Возраст диагноза, месяцев 12,8 2,9-34 19,6 7-102 11,0318

Интервал манифсстацпя-диагноз, мсс 3,9 0-9,7 3,5 048 «,»610

Моноциты, % 16,5 5-28 19 1049 0,0632

Власти, кровь, % 0,25 0-3,5 1 0-8 0,0474

HbF, % 6,8 1,7-15,3 15 2,0-48 0,0166

Власти, к/м, % 7 3,5-18 0,8-11,4 0,0256

рОВ, % ± SE 75±15 9±8 0,0005

n % n %

PTPN11 1 8 6 40 0,0914

RAS 4 33 1 6,6 0,139

C-CBL 3 25 1 6 0,2940

NF1 2 8 3 20 1.0

C-CBL+RAS 7 58 2 13 0,0369

ТГСК 2 16 8 53 0,1071

Острая РТПХ. Острая РТПХ II-IV степени развилась после первой трансплантации у 10 (58%) пациентов, III-IV степени - у 3-х (23%) пациентов. У двух пациентов оРТПХ стала основной причиной смерти. Химеризм. Систематический мониторинг гсмоноэтичсского химеризма проводился 13-и пациентам. У 4-х пациентов зарегистрирован смешанный химеризм па сроках 38 (16-116) дней. Во всех случаях была отменена профилактическая ИСТ и выполнена ипфузия пативных донорских лимфоцитов (DLI). В результате иммунологического вмешательства у 2-х пациентов зарегистрировано развитие клиники оРПТХ. У одного пациента произошло восстановление полного донорского химеризма, сохранение гематологической ремиссии и формирование экстенсивной хРТПХ. В одном случае достигнуто временное восстановление донорского химернзма и развитие развернутого рецидива через 180 дней от детекции смешанного химеризма. В двух случаях, несмотря на DLI, развился гематологический рецидив. Хроническая РТПХ. Диагноз хРТПХ установлен у 4 из 12 пациентов (33%). Экстенсивная форма хРТПХ у 3-х пациентов. У 1 пациента развитие хРТПХ сопровождало DLI. Среди пациентов в продолжающейся ремиссии доля пациентов с хРТПХ составила 57% (4 нз 7), среди пациентов с рецидивом - 0% (0 из 5), р = 0,08.

1 о

0.8

0.6

0.4

0.2

1 1. 1

1 1 5-летняя рОВ = 0.75Ю.15. п -12. живы - 9'

++■ * 1

1 «t-1 1

1 1 * 1

1 1 log-rank р = 0.0005

( 5-петняя рОВ = 0.09±0.08. п -15. живы - 4

12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

— ДТ-response

- - ДТ-non-tesponse

Длительность наблюдения, месяцы Рисунок 13.

Общая выживаемость пациентов с ЮММЛ в зависимости от ответа на диффсрсицировочную терапию

Рецидивы. Гематологический рецидив развился у 5 пациентов. Медиана развития рецидива ЮММЛ составила 49 (46-116) дней от даты первой трансплантации. Безрецидивная выживаемость (рБРВ) составила 66±12%. Три пациента в качестве терапии рецидива получили ТГСК от исходного (п=!) или альтернативного (п=2) донора. Два пациента получали химиотерапию и иммунотерапию ДОЫ и интсрлсйкии-2). Все рецидивировавшие пациенты умерли от прогрессии заболевания.

Вторая трансплантация. Шести пациентам была выполнена вторая трансплантация. Четырем пациентам в связи с первичным пеприживлением, двум пациентам в связи с рецидивом лейкоза. В 2 случаях трансплантация выполнена от исходного донора. В 4 случаях от альтернативного донора (2 - MUD, 2 - MMRD). В 5 случаях проведено мислоаблативнос кондиционирование. Приживление достигнуто у 4 пациентов. Четыре из 6 пациентов умерли от прогрессии заболевания, один от поздней (14 месяцев) ЦМВ-инфскции. Один пациент жив на сроке наблюдения 35 месяцев с экстенсивной хронической РТПХ.

Рисунок 14

Общая выживаемость пациентов с ЮММЛ в зависимости от инициальной терапии

Выживаемость и анализ летальности. На момент анализа данных живы и находятся в полно» клинико-гсматологической ремиссии 8 пациентов с медианой наблюдения 31 (3-82) месяц. Четыре пациента умерли от причин, связанных с трансплантацией (1-оРТПХ (день +32), 1-ЦМВ-инфскция/оРТПХ (день +118), 1-ДМВ-инфекция (день +429), 1-сепсис/полноргаштя недостаточность (день +16)). Трансплантационная смертность составила 28+12%. Пять пациентов умерли от прогрессии основного заболевания. рОВ составила 38+13%, рБСВ составила 40+12%.

Общий анализ результатов терапии

Медиана наблюдения 61 пациента с ЮММЛ составила 19,4 месяцев. На момент анализа результатов терапии были живы 20 пациентов, потеряны из - под наблюдения 5 пациентов. 5-летняя рОВ составила 28 ± 7%. (рис.15). Анализ выживаемости показал, что, парадоксальным образом, рОВ в группе пациентов, получивших ТГСК, не отличается от рОВ в группе пациентов, которым ТГСК ис была выполнена, (рис. 16). Детальный анализ группы пациентов, живущих в статусе ПО или 40 без ТГСК, показал, что эти пациенты относятся к группе ДТ-11. При исключении этих пациентов из анализа выживаемости очевидным становится преимущество ТГСК в обеспечении длительной выживаемости пациентов с ЮММЛ. (рис. 17)

Длительность наблюдения, месяцы

Рисунок 15. Общая выживаемость пациентов с ЮММЛ

Время наблюдения, месяцы Рисунок 16. Общая выживаемость пациентов с ЮММЛ в зависимости от выполнения ТГСК

Длительность наблюдения, месяцы

Рисунок 17.

Общая выживаемость пациентов с ЮММЛ в зависимости от выполнения ТГСК ,

исключая пациентов, ответивших на ДТ

Заключение

Представленные данные подтверждают, что соматические мутации в генах PTPN11, NRAS, C-CBL и KRAS, выявляются у 70% пациентов с ЮММЛ. Анализ клинических характеристик показал, что пациенты с мутациями PTPN11 достоверно старше пациентов с мутациями RAS, кроме того, у пациентов с мутациями NRAS, C-CBL и KRAS содержание фсталыюго гемоглобина существенно ниже в сравнении с группой PTPN11. Различия в прочих клинических и лабораторных характеристиках, даже при выявленной статистической достоверности, не имеют клинического значения. Таким образом, конкретный молекулярный механизм патологической активации сигнального пути, ассоциированного с RAS онкогеном, при ЮММЛ, возможно определяет некоторые биологические особенности и характеристики клинико-лабораторпои презентации заболевания. На основании проведенного исследования предложен алгоритм клшшко-лабораторной диагностики ЮММЛ. (рис. 18). Идентификация генетического субваршшта ЮММЛ позволяет верифицировать диагноз, использовать мутантный ген в качестве мишени для оценки динамики заболевания во время лечения, проводить клинические исследования в биологически гомогенной выборке.

Алгоритм клинической и лабораторной диагностики ЮММЛ

Гепатоспленомегалия Л ммфаде иолатия Лейкоцитоз/Моноцитоз Анемия/тромбоцигопения Незрелые гранулоциты/нормобласты

Миелограмма

Цитогенетика костного мозга Электрофорез На Культуральиое исследование

Бласты < 20%

Моносомия 7, другие аберрации НЬРТ

Спонтанный рост ГМ-колоний иэ ПК, гиперчувствительность к ГМ-КСФ

> 1 года НЬР > 10%

Синдром №>опап

л; |7_л ,_, _

I Ч^33 Н КП У™"*

РТРЫ11, СВ1. А/ЯД5,

|ЮММЛ |

IЮММЛ 1

Рисунок 18.

Алгоритм клшшко-лабораторной диагностики ЮММЛ

На ограниченном материале сделано наблюдение, что мутации в гене N№5 встречаются во всех исследованных фракциях миелоидных и лимфоидных клеток, что косвенно указывает на примитивные стволовые клетки как на вероятную мишень трансформирующего события при ЮММЛ. Другим важным наблюдением явилась демонстрация персистснции мутантного клона у пациентов, находящихся в статусе полного клииико-гсматологичсского ответа после прекращения ДТ. Это наблюдение косвенно свидетельствует о том, что мутации ЫКЛЗ не являются единственным событием, необходимым для реализации клинического фенотипа ЮММЛ, и что существуют, вероятно, дополнительные генетические и эпигенетические модифицирующие события. На примере двух пациентов показано, что псрсистенция мутантных клонов может стать основой развития отсроченных онкологических (Т-ОЛЛ) и аутоиммунных гематологических (ТТП) расстройств и, таким образом, ответ на ДТ не может считаться эквивалентом выздоровления, независимо от его продолжительности.

Алгоритм выбора терапии ЮММЛ

/- ■ • ■ ■ Возраст «Иода > 1 года ны <10* >1оч ^

Бал я 0 2 0 2

Генетический дефе« АГАМ КЛА5 ст, ы* 1, неустаиоален РТРНИ Моносомия 7

^ Бая я 0 О 1 г

Рисунок 19. Клиническая стратификация и алгоритм выбора терапии у пациентов с ЮММЛ.

При анализе пстрансплантационных подходов показано, что ДТ с использованием 13-11А и АгаС способна индуцировать длительные клииико-гсматологичсскне ответы у части пациентов. С ответом на ДТ коррелировал возраст манифестации заболевания и содержание фатального гемоглобина. Доля пациентов с мутациями С-СВЬ и КИА8 была достоверно выше среди

пациентов, ответивших на ДТ. Развитие поздних злокачественных и аутоиммунных заболеваний качественно отличает ремиссии после ТГСК и после ДТ, тем не менее, амбулаторный режим применения ДТ и высокое качество жизни пациентов позволяют рассматривать ДТ как ценную терапевтическую опцию для соответствующей подгруппы пациентов. Показано, что ВХТ может индуцировать лишь кратковременные клинико-гематологические ответы у части пациентов. Анализ долгосрочных результатов терапии показал, что единственным методом, позволяющим излечить пациентов с ЮММЛ, остается аллогенная ТГСК. Выполнение ТГСК в нашем исследовании было ассоциировано с относительно высоким риском трансплантационной смертности. Несмотря на использование интенсивных режимов кондиционирования, вероятность рецидива ЮММЛ после ТГСК составила 35%. Эффективность носттрансплаитацнонпон иммунотерапии на этапе развернутого рецидива ограничена, равно как и эффективность повторных ТГСК, в то время как опыт успешного иммунологического вмешательства у пациента с

нарастающим смешанным химеризмом в CD34+ фракции указывает на возможность упреждающей иммунотерапии. На основании проведенного анализа однозначно утверждать о преимуществе определенного состава кондиционирования и типа донора не представляется возможным, однако существует тренд в пользу MSD и MUD, в сравнении с MMRD и UCB. Применение Flu в качестве базового иммуносупрсссивного препарата не оказало негативного влияния на результаты ТГСК в сравнении со стандартным режимом, включающим Су. Общие результаты терапии пациентов с ЮММЛ не могут считаться удовлетворительными, очевидной необходимостью является внедрение новых лекарственных препаратов, обеспечивающих контроль мислопролиферации, и новых, более эффективных и безопасных методов ТГСК. В этой связи представляется этически оправданным включение всех пациентов с ЮММЛ в исследования Н-Ш фазы новых медикаментозных и немедикаментозных методов лечения. На основании проведенного анализа предложена новая стратификация на группы риска и алгоритм выбора терапии, (рис. 19).

Гистиоцитоз из клеток Лаигсрганса

Клинико-лабораторная характеристика группы пациентов с ГКЛ

В анализ результатов терапии включены 11 пациентов с МоноС, 7 пациентов с МСОР- и 30 пациентов с МСОР+. Исходная клинико-лабораторная характеристика 48 пациентов с ГКЛ, включенных в анализ результатов терапии, представлена в табл. 15 и 16.

Результаты молекулярио-генетнчсского исследования

Из 37 исследованных образцов в 9 (24,3%) была выявлена мутация V600E BRÄF. (рис. 20). Значимой корреляции между содержанием ПКЛ в образце и выявлением мутаитного аллсля ис наблюдалось. Доля мутаитного аллсля ни в одном из позитивных образцов не превышала 50%.

При сравнении методов детекции мутации V600E BRAF показано, что имеет место высокая копкордаптпость между результатами сэнгеровского ссквснирования и ПЦР в реальном времени с флуоресцентным зондом.

Клинико-гепстнческос сопоставление

Клиническая характеристика пациентов, включенных в молскулярно-гснетичсское исследование, представлена в табл.17. Существенной корреляции клинических характеристик и мутации V600E BRAF выявлено не было, за исключением тренда к большей частоте вовлечения гемоиотза у BRAF V600E + пациентов.

Таблица 15.

ГКЛ: исходная характеристика, п = 48 (анализ результатов терапии]

МСОР+ п = 30 МСОР-п = 7 МоноС п = 11

медиана разброс медиана разброс медиана разброс

Возраст манифестации, месяцев 8,5 0-16,7 лет 20 5-7лет 27 2-12 лег

Возраст диагноз, месяцев 20 2,8-17 лет 36 20-8,7 лет 33 12-12 лет

Интервал манифестация -диагноз, месяцев 4.7 0,2-30 8 1,5-30 4,8 1-11

Число пораженных органов, п 5 2-8 2 2-3

п % п % п %

Пол, м:ж 17:13 56:44 7:0 100:0 5:6 44

Скелет 12 40 6 85 10 91

Кожа 27 90 5 71 1 9

Лимфоузлы 9 30 - - - -

Несахарный диабет 3 10 4 57 - -

Наружный отит 12 40 - - - -

Печень 27 90 - - - -

Селезенка 27 90 - - - -

Легкие 15 50 - - - -

Кроветворение 22 73 - - - -

Щитовидная железа 1 3,3 - - - -

Слюнные железы 1 3,3 1 14 - -

ЦНС 2 6,6 - - - -

ЖКТ 3 10 - - - -

Таблица 16. Характеристика пациентов с МСОР+ ГКЛ, п = 30

Медиана Минимум Максимум

Гепатомегалия, см 6 2 10

Сплсиомсгалия, см 7 0,5 12

Лейкоциты, xl0% 5,3 0,7 16,2

Гранулоциты, х 10*/л 3,3 0,1 14,2

Гемоглобин, г/л 80 53 149

Тромбоциты, х 1О'/л 65 2,0 687

Альбумин, г/л 27 18 48

ЩФ, МЕ/л 286 40 3770

АЛТ, МЕ/л 25 4 251

ACT, МЕ/л 26 5 326

Билирубин, мкмоль/л 16 4 236

Фибриноген, г/л 2,7 1,15 4,7

АЧТВ, секунд 34 15 180

ПИ, % 87 28 96

Число вовлеченных органов, п 5 2 8

Возраст манифестации, месяцев 8,5 0,0 200,5

Возраст начала терапии, месяцев 19,9 3,4 206,2

Интервал манифестация-терапия, месяцев 4,6 0,1 30,2

Мслаиома

BRAFV600 Е positive

10 20 JO 40

Cyttet

BRAFV600E positive

10 20 30 40

TC TCG 1TG

Рисунок 20. Мутация У600Е В ВАР в образце пациента с ГКЛ.

Таблица 17.

Сравнение клинических характеристик в зависимости от наличия мутации ВЯАР У600Е.

BRAF V600E - (п -21) BRAF V600E+ (п-9) P

п % (1 %

МСОР+ 7 33 4 44 0,68

МСОР- 3 14 3 33 0,32

МоноС 11 52 2 22 0,23

скелет 11 52 3 33 0,44

кожа 7 33 4 33 1

л/у 5 24 4 33 0,39

печень 5 24 4 33 0,39

гемопоэз 2 10 4 33 0,049

легкие 3 14 2 22 0,62

селезенка 5 24 4 44 0,39

нд 2 10 0 0 1

жив 16 80 8 88 1

возраст манифестации, мес (медиана, разброс) 16,5 1-110 28 0-153 0,98

Результаты тсрашш

18-лстняя рОВ во веси группе пациентов с ГКЛ составила 82±5%. рБСВ во всей группе пациентов с ГКЛ составила 49±9%. (Рис.21)

15-лвтяя рОВ " 0,8210,06. п -48, и

л - 39, потеряны • в

72 96 12(3 144 16в 192 216 240 Длительность наблюдения, ыесяцы

96 120 144 1£8 т 216 Длительность наблюдения, месяцы

Рисунок 21. Общая выживаемость и бессобытипная выживаемость в группе пациентов с ГКЛ.

Терапия пациентов с моноснетечным заболеванием. Пациенты с МоноС ГКЛ получили локальную терапию (п = 3, унифокалыюе поражение скелета) и системную химиотерапию (п = 7) в соответствии с рекомендациями протоколов DAL-HX-90 (п = 3), LCH-1I (п = 4), LCH-III (п = 1). Один пациент с унифокальным поражением скелета оставался иод наблюдением без тсрашш. Локальная терапия была эффективна у всех пациентов, реактивации заболевания не было. Среди 7 пациентов, получивших ХТ, один потерян из-под наблюдения. У 4 пациентов достигнут ПО (п = 3) или ЧО (n = 1), у 2 пациентов заболевание прогрессировало. В терапии 2 линии у 1 пациента (№) использовали шесть курсов 2-CdA, 5 мг/м2 №3, был достигнут стойкий полный ответ. Реактиваций ГКЛ и перманентных осложнений в группе пациентов с МоноС ГКЛ не было. Девять пациентов живы и сохраняют статус ПО, два пациента потеряны из-под наблюдения. 5-летняя рОВ в данной группе составила 100%. 5-летняя рБСВ = 91 ±9%. (табл. 18).

Терапия пациентов с МСОР-

Пациенты с МСОР- получили ХТ в соответствии с рекомендациями протоколов LCH I (п = 1), LCH II (п = 5), LCH III (n = 1). Один пациент потерян из-под наблюдения до оценки ответа, У 6 пациентов достигнут ПО (п = 4) или ЧО (п = 2). У всех 6 пациентов с медианой 5 (3-10) месяцев от окончания терапии развилась реактивация заболевания. Терапия реактивации включала повторное назначение стандартной терапии согласно протоколу LCH-II (п = 4) и терапию 2CdA, 6 мг/м2 №5 х 6 курсов (п = 2).

Таблица 18. Результаты терапии первой линии пациентов с гистиоцитозом из клеток Лангсрганса.

Моно, п=7 МСОР-, п=7 МСОР+ Тест Fisher

Стандартная терапия, п=19 2-CdA+AraC, n=9 P

Ранний ответ (40 + ПО), п(%) 4(66) 6(100) 11(61)* 8 (1001t 0,0622

ПО на первую линию, п (%) 3(60) 4(66) 6(33,3)* 8(100)t 0, 0022

Рецидивы, п(%) 0 6(100) 1 (5,5) 0(0) 1,0

Необходимость второй линии, п 1%) 2(33) 6(100) 10 (55,5) 0(0) 0,0095

Перманентные последствия, п (%) 0 4(66) 7(63,6) t 0(0) 0,0147

Живы, п (%) 5(71) 6(85) 11(58) 8(88) 0,2011

Потеряны, п (%) 2(28) 1(15) 2(10) 0 1,0

р013,%(5Ё) 100 100 71(11) 88(91 Log-rank p = 0,35

рЕСВ, % (БЕ) 91(91 0(0) 40(11) 88(9) Log-rank p = 0,03

* 1 пациент потерян из-под наблюдения до оценки раннего отпета 1 1 пациент умер на 18 день от начала терапии Ф у 11 пациентов с полным продолжительным ответом

В одном случае с цслыо контроля ЦНС-поражсния пациент получил 4 в/в введения MTX в дозе 2 г/м2/24 часа и локальную лучевую терапию па область опухоли (СОД 8 Грей). У всех пациентов, получивших терапию второй линии, был получен ПО. Перманентные осложнения развились у 4 пациентов (песахарпый диабет (НД), п = 4, панпшопитуитаризм, n = 1). На момент завершения исследования вес пациенты живы с медианой наблюдения 111 (0-186) месяцев. 5-летняя рОВ в данной группе составила 100%. 5-летняя рБСВ = 0 ±0 %. (табл. 18)

Терапии пациентов с МСОР+

5-лстняя рОВ в группе пациентов с ГКЛ МСОР+ составила 70±8%. рБСВ в группе пациентов с ГКЛ МСРО+ составила 51 ±9%. (Рис.22). Исходные характеристики пациентов в группе стандартной и альтернативной терапии не отличались, (табл. 19)

24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 Длительность наблюдения, месяцы

24 48 72 % 120 144 168 192 216 240 Длительность наблюдения, месяцы

Рисунок 22

Общая выживаемость и бсссобытийная выживаемость в группе пациентов с МСОР+ ГКЛ

Стандартная терапия. Стандартную тсраншо первой линии получили 19 пациентов в соответствии с рекомендациями протоколов DAL-HX-90 (n = 1), LCH I (п = 4), LCH 11 (п = 9), LCH III (п = 5). Два пациента потеряны из-под наблюдения до оценки ответа. По завершении интенсивной фазы терапии ПО (п = 4) или ЧО (п = 4) па стандартную терапию достигну! у X (44%) пациентов, 7 из них продолжили терапию согласно протоколу, 1 получил 2-CdA, 6 мг/м2 №5 х 6 курсов, 1 - потерян из-под наблюдения. Все пациенты, ответившие на стандартную терапию, достигли статуса ПО с медианой 8,7 (1-16) месяцев. Реактивация заболевания развилась у одного пациента через 13,5 месяцев от окончания терапии. Все пациенты, ответившие па терапию, живы с медианой наблюдения 61 (23-215) месяц. Перманентные осложнения развились у 7 (87%) в виде НД (п = 4), иневмофнброза (п = 5) и фиброза печени (n = 1).

Терапия второй линии

Девять пациентов с ПЗ получили ХТ второй линии. У 3 пациентов курсы ВХТ не включали 2-CdA и АгаС, эти пациенты не ответили на терапию и умерли от прогрессии ГКЛ с интервалом 64, 180 и 342 дня от начала терапии. Шесть пациентов получили ВХТ с использованием комбинации 2-CdA + АгаС. У 5 пациентов достигнут ПО, 1 пациент умер от инвазнвного микоза при сохранении активности ГКЛ. Из 5 пациентов, ответивших на 2-CdA + АгаС, 4 живы н сохраняют статус ПО с медианой наблюдения 6 (3,7-7,3 лет). Один пациент умер в статусе ПО от кровотечения нз верхних отделов ЖКТ, развившегося вследствие цирроза печени. Медиана интервала достижения ПО составила 11,7 (2,2 - 16,6) месяцев. Медиана интервала от начала терапии первой линии до начала терапии 2-CdA + АгаС составила 60 (37 - 138) дней, 2 пациента с наибольшим интервалом (87 и 138 дней) умерли. Среди пациентов, ответивших па терапию 2-CdA + АгаС, реактиваций ГКЛ и формирования дополнительных перманентных осложнений не было. Таким образом, 5-летияя рОВ в группе стандартной терапии составила 71±11%, 5-летняя рБСВ составила 40±11%. 5-летняя рОВ пациентов, не ответивших па терапию первой липни, составила 44 ± 16%, а при терапии 2-CdA + АгаС 66 ±19 %. (рис. 23 и табл. 18)

Пилотное исследование

Девять пациентов получили терапию первой линии в соответствии с пилотным протоколом LCH-

MS. Один пациент умер от острого повреждения легких смешанной этиологии через 18 дней от

начала терапии. Восемь пациентов (89%) достигли ПО с медианой 9 (5,9 - 11,1) месяцев, медиана

достижения «функционального» ответа составила 5 (2,9 - 8,5) месяцев. У 6 из 7 пациентов с

дисфункцией гемопоэза показатели периферической крови восстановились после I курса ХТ. Все

пациенты, ответившие на терапию первой линии с использованием 2-CdA + АгаС, живы и

сохраняют статус ПО с медианой наблюдения 39 (20 - 65) месяцев. В этой группе не было

47

зарегистрировано случаев реактивации заболевания и развития перманентных осложнений. 5-лстпяя рОВ 11 рБСВ составили 88±10%. (Рис. 23 и табл. 18.)

Общий анализ результатов терапии Сравнение основных показателей эффективности терапии I линии показало, что частота достижения ПО достоверно выше в группе 2-Сс1А+АгаС, а частота развития перманентных осложнений, напротив, достоверно ниже. Достоверных различий в рОВ не получено, однако различия в рБСВ оказались достоверны. Отсутствие различия в показателе ОВ обусловлено эффективностью терапии второй линии и, таким образом, подтверждает более высокую активность комбинации 2-С<1А и АгаС в сравнении со стандартной терапией, (табл. 18)

Таблица 19. Исходные характеристики группы стандартной терапии и пилотного исследования

Стандартная терапия, п=19

2-CdA+AraC, п=9

Mann-Whitney

Возраст манифестации, месяцев

0.9

0,0222

Возраст диагноза, месяцев

4,9

206

0,1168

Интервал манифестация-диагноз, мес

5,0

одз

30

0,9385

Гепатомегалия, см

0,5

0,4930

Спленомегалия, см

10

0,3050

Лейкоциты, хЮ /л

6,8

0,7

16,2

3,5

1,5

13,5

0,4457

Гранулоциты, хЮ /л

4,3

0,1

14,2

1,»

0,4

10,5

0,5546

Гемоглобин, г/л

0,0489

Тромбоциты, хЮ /л

190

397

0,3774

Альбумин, г/л

19

0,0216

ЩФ, МЕ/л

40

0,9548

АЛТ, МЕ/л

251

25

0,2277

АСТ, МЕ/л

0,4753

Билирубин, мкмоль/л

0,2183

Фибриноген, г/л

2,8

4,7

1,8

1,1

4,1

0,4754

АЧТВ, секунд

0,3379

ПИ, %

0,2042

Число вовлеченных органов, п

0,0245

Пол, м;ж

0,6891

Скелет

0,9697

Кожа

1,0

Лимфоузлы

0,4074

Несахарный диабет

0,5302

Наружный отит

0,1139

Печень

1,0

Селезенка

1,0

Легкие

0,1145

Кроветворение

74

0,6296

Щитовидная железа

1,0

Слюнные железы

ЦНС_

ЖКТ

1,0 1,0

2-CdA ♦ AfiC 3-летняя pOB • 0,8510,09, n • 9, живы >8

С 7

О 9

О в

2-CdA * ЛгаС 3-летняя рБСВ • 0.&8ÎQ.09. n • 9. жиаы ■ ППО • в

0.6

0 О

Стандартная терапия 0 5 3-летняя р08 » 0,7110,11, n ■ 19, живы -12, потеряны • 2

о.э

03'

Стандартная терапия

Э-латмяя рБСВ ■ 0,4010,11, л ■ 19, жи»ы в ППО- б. потеряны • 2

0.2

log-rank ■ 0,35

oí

log-rank р « 0,037

О 24 46 72 86 120 144 168 192 216 240 Длительность наблюдения, месяцы

с'видарти«» нрзп»я 2-CdA ♦ АяС

24 48 72 96 120 Ш 168 192 216 240 Длительность наблюдения, месяцы

2 CilA ♦ АгаС стандарт

Рисунок 23.

Сравнительный анализ общей и бсссобытпйиой выживаемости в группе МСОР+ ГКЛ в зависимости от терапии первой линии.

Токсичность терапии с использованием 2-хлор-дезоксиадснознпа.

Всего 15 пациентов получили 36 курсов комбинированной терапии 2-CdA+AraC, 9 пациентов получили терапию I линии, 6 пациентов - II линии. Все курсы комбинированной терапии сопровождались развитием анемии, тромбоцитопешш и грапулоцитонешш IV степени по шкале токсичности NCI СТС. Медиана длительности грапулоцитонешш составила 12 (9-24) дней, медиана числа трансфузии тромбокоицентрата за весь период терапии составила 30 (13-52), медиана числа трансфузий эритроцитноп массы составила 15 (8-23). Инфекционные осложнения включали фебрильнуто нейтропению после 34 из 36 (94%) курсов. Микробиологически документированные инфекции включали 2 эпизода энтероколита с выявлением антигена С. difficile; 3 эпизода локальной реактивации BCG (M.bovis) с регионарным лимфаденитом; бактериемии с высевами: Sphingomonas pauzimobiUis у 2 пациентов, С. parapsilosis, С. guilîiermondii; инфекции мягких тканей с высевом С. parapsilosis, P. aeruginosas, A. baumanii, Staphylococcus spp, Enterococcus spp; респираторные вирусные инфекции с выявлением рнновируса, аденовируса, мстаииевмовируса и парагриппа. При проведении сравнительного анализа в группе пациентов, получивших терапию 2-CdA+AraC, была определена достоверно большая частота развития инфекционных эпизодов (ИЭ) (р=0,039). При анализе структуры ИЭ в группе пациентов с 2-CdA показано достоверно более частое развитие инфекций мягких тканей (р=0,044) и документированных вирусных инфекций (р=0,016). Четырнадцать пациентов получили 74 курса монотсрапии 2-CdA. Ни один курс монотсрапии 2-CdA не сопровождался

развитием нейтропешш > II степени, тромбоцитопеиии > II степени, анемии > II степени. Случаев развития значимой органной токсичности после применения 2-СёА не зарегистрировано.

Заключение

Этиология ГКЛ остается предметом активных исследований. После демонстрации

клональной природы патологических гистиоцитов в очагах ГКЛ (С.\УПтап, 1994) установилось

представление о ГКЛ как о клональном пролиферативном заболевании, гистогенетически

связанной с эпидермалыюй клеткой Лангсрганса. Попытки получить дополнительные

доказательства злокачественной природы ГКЛ не увенчались успехом: не были выявлены

повторяющиеся хромосомные аномалии, не удалось доказать инактивацию гснов-супрсссоров

опухоли, противоречивые данные получены относительно состояния механизмов апоптоза и

регуляции клеточного цикла. Сложность исследования патогенеза ГКЛ усугубляется отсутствием

клеточных линий и адекватной мышиной модели заболевания. О.Вас1а1уап-Уегу и соавт. в 2010 г.

выявили мутации У600Е ВКАУ в биообразцах пациентов с ГКЛ, эти данные стали первым за

долгое время указанием на возможную роль классических механизмов активации протоонкогенов

в развитии ГКЛ. Авторам исследования не удалось установить значимых клинических корреляций

с наличием мутации У600Е ВИАР. Данные нашего исследования подтверждают, что мутация

У600Е ВНЛР выявляется в клетках патологического инфильтрата у значительной части пациентов

с ГКЛ. Различия в доле ВЙЛЯ УбООЕ-позитивных образцов между нашим исследованием и

опубликованными данными обусловлены, возможно, недостаточной чувствительностью методики

для выявления небольшой популяции ПКЛ на фоне нормальных клеточных элементов. В терапии

пациентов с вовлечением «органов риска» результаты стандартной терапии первой линии,

основанной на комбинации УЫ с Ргп, неудовлетворительны. Вероятность рБСВ составила

40*11%. Более 50% пациентов нуждались в назначении терапии второй линии. Частота развития

перманентных осложнений составила 63,6 %. Пять пациентов (29%) умерли от прогрессии

заболевания. В работе показана высокая эффективность комбинированной ВХТ препаратами 2-

СёА и АгаС в лечении пациентов с ГКЛ, рефрактерных к стандартной терапии. Полный ответ был

достигнут у 5 из 6 нациептов с рефрактерным течением ГКЛ, 5-летняя рОВ составила 66±15%, что

является существенным профессом в сравнении с историческими данными, согласно которым

рОВ у пациентов, не ответивших на терапию первой линии, не превышает 20%. Результаты

пилотного исследования показали, что комбинация 2-Сс1А и АгаС является наиболее эффективной

медикаментозной терапией с точки зрения контроля ГКЛ. Полный продолжительный ответ был

достигнут у всех пациентов, подлежавших оценке. Помимо высокой частоты ответа обращает

внимание отсутствие случаев реактивации заболевания и перманентных осложнений, включая

такое частое, как НД. Токсичность терапии 2-С<1А+АгаС обусловлена миелосупрессией и

50

иммуносупрессисй, тяжесть которых диктует высокие требования к сопроводительной терапии, в первую очередь - к качеству трапсфузионной поддержки, профилактики и терапии инфекции. Этиологическая структура инфекций у пациентов, получивших терапию 2-CdA+AraC, отражает глубокий дефицит клеточного иммунитета и включает необычные для изолированной нейтроиении патогены, такие как M.bovis, респираторные вирусы и др. Таким образом, высоко эффективная терапия 2-CdA+AraC сопряжена с риском жизиеугрожающих осложнении. Окончательное место 2-CdA и АгаС в терапии ГКЛ еще предстоит установить. Безусловно, в лечении рефрактерных форм МСОР+ ГКЛ у детей данная комбинация должна стать стандартом терапии. Возможность более раннего применения данной терапии, вероятно, будет определяться по мере выявления надежных биологических маркеров, коррелирующих с тяжестью течения ГКЛ, и позволяющих на этапе диагностики идентифицировать подгруппу пациентов, нуждающихся в наиболее агрессивной терапии. В любом случае, безопасное проведение такой терапии возможно только в центрах, обладающих опытом сопроводительной терапии пациентов с ОМЛ и пациентов после ТГСК.

Выводы

1. В основе развития гиетиоцитарных пролиферативных заболеваний (гпстношггозов) лежат врожденные (ПГЛГ, ЮММЛ) либо приобретенные (ЮММЛ, ГКЛ) генетические дефекты, обусловливающие аномальную регуляцию пролиферации и функциональной активности гистиоцитов и их костномозговых предшественников. Идентификация молекулярных дефектов и выявление клинико-генетичсской корреляции необходимы для создания биологической классификации гнетиоцитозов, разработки современного алгоритма диагностики, дифференциальной диагностики и терапии гиетиоцитарных болезней.

2. Молекулярно-гснстичсскпй анализ генов PRF1, UNC13D, STX, STXBP, SH2D1A, XJAP и RAB27 показал, что доминирующее положение в генетической структуре ПГЛГ в репрезентативной выборке российских пациентов занимает FHL3 - вариант, обусловленный мутациями в гене UNC13D, Доля мутаций UNCI3D составила 54% от всех пациентов с ПГЛГ, PRFI и STX - по 3,5%. При анализе выявлены 9 новых и 4 ранее описанных мутации UNCI3D. Высокая частота данного генетического варианта частично обусловлена распространением в популяции российских пациентов двух мутации: c.2346_2349del н c.3037insG вследствие «эффекта основателя». Для выявления трех наиболее распространенных в России мутаций UNCI 3D, c,1828insA, c.2346_2349del и c.3037insG, составляющих 48% мутаций в гене UNCI3D, разработана тест-система на основе мультиплексной ПЦР-ПДАФ.

3. В исследовании ие выявлена значимая корреляция основных клинических и лабораторных характеристик ПГЛГ с гснтичсским вариантом FHL3 (мутации UNC13D), что не позволяет использовать исходную клиническую и лабораторную информацию для предсказания генетического варианта ПГЛГ и селекции мишеней для молекулярно-гспетичсского исследования.

4. Стандартная иммуносупрсссивиая терапия этопозидом, дсксаметазоном и циклоспорином Л позволяет установить временный контроль над патологической активацией иммунной системы у 78% пациентов, однако в отсутствие ТГСК не способна излечивать пациентов с Г1ГЛГ. Частота реактиваций заболевания составила 95%. 5-лстняя рОВ в группе ПГЛГ составляет 37±14 % при выполнении ТГСК, 0±0% при выполнении только ИСТ, log-rank р = 0,0005. Неудачи ТГСК обусловлены высокой трансплантационной смертностью, pTRM = 54±15%, вероятной причиной которой является длительный интервал до ТГСК (медиана -14,6 месяцев) и кумулятивная токсичность терапии и множественных реактиваций заболевания.

5. В группе пациентов с ЮММЛ наиболее распространенным соматическим генетическим дефектом являются мутации в rene PTPN11 (35%), с меньшей частотой встречаются мутации в генах NRAS( 14%), C-CBL (13%) и KRAS (11 %). Прямое секвснированис экзонов 3 и 13 PTPNU, 2 и 3 NRAS и KRAS, 8 и 9 C-CBL позволяет идентифицировать генетический дефект и верифицировать диагноз у 70% пациентов с ЮММЛ. Значимые отличия в клинико-лабораторпой презентации генетических субвариантов ЮММЛ выявлены у пациентов с мутациями RAS в сравнении с PTPNI1: возраст манифестации заболевания составил 6,7 (RAS) и 24 (PTPN11) месяца, р = 0.0252. Содержание HbF 4,6 % (RAS) и 21% (PTPNU), р = 0,0008.

6. Дпфферспцировочная терапия 13-RA + АгаС индуцирует клинически значимый ответ у части пациентов с ЮММЛ. Ответ на ДТ коррелирует с ранним возрастом манифестации, низким содержанием HbF и мутациями в генах RAS и C-CBL. Пациенты, ответившие на ДТ, составили группу с лучшим показателем общей выживаемости, рОВ = 75±15%, как в сравнении с пациентами, не ответившими на ДТ, рОВ = 9±8%, так и в сравнении с пациентами, получившими ТГСК, рОВ = 0,38±13%. Ответ на ДТ не является эквивалентом излечения ЮММЛ, так как в гсмопоэтичсском компартментс персистирует мутантпый клоп и сохраняется риск развития злокачественных (Т-ОЛЛ, п - 1) и аутоиммунных болезней крови (ТТП, п - 1). ВХТ способна индуцировать кратковременный клинически значимый ответ у 50% пациентов, но не обеспечивает долгосрочную выживаемость.

7. ТГСК является единственным методом терашш, способным излечивать ЮММЛ, При использовании мнелоаблативных режимов кондиционирования рОВ и рБСВ в группе пациентов, получивших ТГСК, составляет 38±13% и 40±12%. Неудачи ТГСК обусловлены высокой трансплантационной смертностью, рТКМ = 28±15%, ц высокой частотой рецидивов ЮММЛ, 34±12%. Аллогсниая ТГСК является терапией выбора для пациентов с ЮММЛ, не ответивших на ДТ, независимо от типа донора.

8. Мутация У600Е ВЯАР выявлена в патогистологических образцах 24% пациентов с ГКЛ. Значимой корреляции основных клинических и лабораторных показателей с мутационным статусом I.ШАР не выявлено. Мутация УбООЕ ВЯАИ является потенциальным маркером для диагностики и вероятной мишенью для терапии у части пациентов с ГКЛ.

9. Комбинированная химиотерапия 2-Сс1а и АгаС является эффективным методом лечения мультнеистемиого ГКЛ, резистентного к стандартной терапии, рОВ = 66±19%. Показано, что применение 2-С(1а и АгаС в терапии первой линии МСОР+ ГКЛ более эффективно в сравнении со стандартной терапией. Частота достижения полных ответов составила 100% уэ. 33%, бессобытийная выживаемость, рБС13 = 88±9% 40±11%, частота формирования перманентных осложнений, 0% 66%. Применение ВХТ 2-Сс)а + АгаС ассоциировано с выраженной миелосупрессией и иммуносупресспей и высоким риском развития тяжелых инфекционных осложнений.

Практические рекомендации

1) Для повышения эффективности лабораторной диагностики ПГЛГ в России необходимо этапное выполнение молекулярно-генетического анализа генов, ассоциированных с клиническим фенотипом ПГЛГ. На первом этапе целесообразно использовать тест-систему для выявления наиболее распространенных в российской популяции мутаций в гене UNC13D. Па втором этапе - прямое секвенирование всех экзонов и экзон-интронных соединений гена UNC13D. На третьем этапе - прямое секвенирование генов PRF!, STX11, STXBP, RAB27 и, у пациентов мужского пола, SH2D1A, XIAP. Внедрение методики проточной цнтомстрип в лабораторную диагностику ПГЛГ позволит существенно оптимизировать затраты на гепотипирование.

2) Клинический диагноз ПГЛГ является абсолютным показанием к началу иммуносупрессивной (химио)терапии дексаметазоном к этопозидом, независимо от молекулярно-генетическоп верификации диагноза. Поиск неродственного донора следует инициировать в момент начала ИСТ. Алло ТГСК должна быть выполнена всем пациентам с

верифицированным диагнозом ПГЛГ не позднее 4 месяцев от начала ИСТ. Выполнение ТГСК не должно быть ограничено наличием гистосовместимого донора и статусом ремиссии ГЛГ.

3) Прямое сехвенирование экзоиов 3 и 13 PTPNU, 2 и 3 NR4S и KRAS, 8 и 9 C-CBL необходимо включить в ряд базовых диагностических исследований у пациентов с клиническим диагнозом ЮММЛ. Эффективность исследования может быть повышена путем поэтапного анализа в зависимости от исходных клинических и лабораторных характеристик. В группе пациентов младше 1 года с содержанием HbF < 10% целесообразно на первом этапе исследовать гены NRAS и KRAS, у пациентов старше 1 года с содержанием HbF > 10% - ген PTPA'l I.

4) С целыо определения тактики терапии пациентов с ЮММЛ целесообразно использовать клиническую стратификацию в соответствии с предложенной балльной шкалой, на основании трех показателей: возраста манифестации, содержания HbF и генетического дефекта.

5) В группе пациентов младше 1 года с содержанием HbF < 10% и мутациями в генах NRAS» KRjiS наиболее эффективным и безопасным методом терапии является дифференцировочная терапия 13-RA и низкими дозами АгаС. ДТ индуцирует длительный клинико-гематологнческий ответ, у части пациентов - не требующий медикаментозной поддерживающей терапии. Пациенты, ответившие на ДТ, должны оставаться под наблюдением гематолога бессрочно в связи с риском развития поздних злокачественных и аутоиммунных болезней крови.

6) Всем пациентам группы высокого риска и пациентам группы низкого и промежуточного риска, не ответившим на ДТ, должна быть выполнена ТГСК не позднее 6 месяцев от установления диагноза. Приоритетным источником ГСК является родственный или неродственный совместимый донор. Выполнение ТГСК не должно быть ограничено наличием гистосовместимого донора. В качестве иммуносупрессивного компонента кондиционирования Flu может быть использован вместо Су. Целесообразно и оправдано этически включение всех пациентов с ЮММЛ, подлежащих ТГСК, в клинические исследования И-Ш фазы.

7) Необходимо продолжить исследование роли мутации V600E BRAF и иных вероятных механизмов активации сигнального пути ERK/MAPK в патогенезе ГКЛ с использованием методик микродпссекции и молекулярного анализа на уровне одной клетки. Клиническое значение данной молекулярной аномалии должно быть исследовано проспективно.

8) В терапии пациентов с ГКЛ, рефрактерных к стандартной ХТ, необходимо раннее (через <512 недель) использование комбинированной химиотерапии 2-Сс1А и АгаС. Комбинированная терапия 2-Сс1А и АгаС в терапии первой линии может применяться в рамках клинического исследования как .эффективная альтернативой стандартной терапии у пациентов с МСОР+ ГКЛ. Проведение данной терапии должно быть ограничено стационарами, обладающими опытом ведения пациентов с ОМЛ и безусловным доступом к современной сопроводительной терапии.

Список публикаций по теме диссертации

1) Пашанов Е.Д, Балашов Д.Н., Скоробогатова Е.В, Шипицына И.П., Трахтман П.Е.. Дышлевая З.М., Скворцова Ю.В., Благонравова О.Л., Масчаи М.Л., Курникова Е.Е., Персиянцева М.И., Митюшкина Т.А., Масчаи A.A., Румянцев А.Г. Характеристика инфекционных заболеваний у детей после трансплантации гемопоэтнческих стволовых клеток. Вопросы гематологии/ онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2005; 2: 68-81.

2) О.В.Горонкова, А.А.Масчан, Е.В.Суицова, Л.И. Жарикова, Г.Г.Солопова, Д.Д.Байдильдина, Л.А.Хачатрян, М.А.Масчан. Д.Н.Балашов, О.В.Макарова. «Эффективность и безопасность вориконазола в лечении инвазивных грибковых инфекций и эмпирической терапии фебрильной нейтропенни у детей с оикогематологическими заболеваниями». Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2005, том 4, №3: с.87-94

3) M.Maschan, G.Novichkova, E.Suntsova, L.Zharikova, O.Goronkova, D.Baidildina, L.Khachatryan, and A.Maschan 2-ChIordeoxyadenosme and intermediate-dose cytosine arabinoside combination therapy for high-risk langerhans cell histiocytosis Pediatric Blood & Cancer 2006.-V.46 .-Issue 3 . стр. 392-405.

4) Скоробогатова E.B., Балашов Д.Н., Дышлевая З.М., Трахтман П.Е., Шелихова Л.Н., Скворцова Ю.В., Шипицына И.П., Курникова Е.Е., Пашко Ю.В., Благонравова О.Л., Персианцева М.И., Масчаи М.А., Литвинов Д.В., Мякова Н.В., Болотов A.A., Масчан A.A., Румянцев А.Г.. Результаты трансплантации гемопоэтнческих стволовых клеток у детей. Опыт Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии на базе Российской детской клинической больницы. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2006, т 6, №4,29-38.

5) Новичкова Г.А., Минков М., Масчан М.А.. Чернов В.М. Гл. 45. Гистопоцитозы В кн. Клиническая онкогематология. Под ред. проф. М.А. Волковой. - М.: Медицина. - 2007. - С. 891-912.

6) Л.А.Хачатряи, Е.В.Самочатова, М.А.Масчан. Д.Д.Байдильдина, Г.Г.Солопова, А.А.Масчан. «Результаты терапии ювенильного миеломоноцитарного лейкоза у детей». Сборник материалов XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство»,Москва , 1418 апреля 2008: с.423

7) N.V.Poltavets, M.A.Masclian, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan Six new mutations in UNCI 3D gene in Russian patients with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL) // Europ. J. Hum. Genet.-2008. - V.16. - suppl 2. -p.247.

8) Л.Л.Хачатрян, М.А.Масчан, Е.В.Самочатова, М.М.Шнейдер, Д.Д. Байднльдина, Г.Г.Солопова, Е.В.Сунцова, Л.И.Жарикова, У.Н.Петрова, В.В.Сшшцына, Г.А.Новичкова, А.А.Масчан Диффсрсицнровочная терапия с использованием 13-цис-рстниосвой кислоты и низких доз цитознн-арабшюзида у детей с ювешшьиым миеломонодитариым лейкозом. Онкогсматология 2008, №1-2, стр. 34-38

9) N.V.Poltavets, M.A.Maschan, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan Mutations in UNÇ13D gene are the most frequent cause of FHL in a group of Russian patients. Pediatric Blood &Cancer \\ 2009,- V.53.- Issue 4. стр.685-697.

10) M.Masclian, G.Novichkova, D.Baidildina, L.Khachatryan, V.Sinizina, G.Solopova, U.Petrova, A.Maschan Up-front 2-Chlordeoxyadenosine-based combination chemotherapy in high-risk LCH: early results of pilot trial Pediatric Blood & Cancer 2009.-V. 53 .- Issue 4. стр. - 685-697.

11) N.V.Poltavets, M.A.Maschan, I.G.Sermyagina, A.V.Polyakov, l.V.Kondratenko, A.A.Maschan, G.A.Novichkova Four SH2D1A mutations on 7 chromosomes detected in Russian patients with X-linked lymphoproliferalive syndrome // Europ. J. Hum. Genet. - 2009. -V. 17. - suppl 2. - стр.347.

12) N.V.Poltavets, M.A.Maschan, I.G. Sermyagina, V.V. Zabnenkova, I.V.Kondratenko,G.A. Novlchkova, A.A.Maschan, A.V.Polyakov Five SII2D1A mutations on 7 chromosomes detected in russian patients with X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP) Сборник материалов 25-й конференции международной группы по изучению гистиоцитозов (The Histiocyte society), 2009 год, стр.43.

13) .M.A.Maschan, N.V. Poltavets, I.G. Sermyagina, V.V. Zabnenkova, l.V.Kondratenko, G.A. Novichkova, A.A.Maschan, A.V.Polyakov RAB27 mutations not detected in russian patients with familial heinophagocytic lymphohistiocytosis and X-linked lymphoproliferative syndrome. Сборник материалов 25-й конференции международной группы по изучению гистиоцитозов (The Histiocyte society), 2009 год, стр. 57.

14) G.Solopova, D.Baidildina, E.Suntsova, O.Goronkova, U.Petrova, I.Kalinina, L.Khachatryan, V.Sinizina, G.Novichkova, A.Maschan, M.Masclian Front-line therapy of high-risk Langerhans cell histiocytosis with 2-Chlordeoxyadenosine and cytosine arabinoside: an update of a single center experience Pediatric Blood & Cancer 2010.-V. 55 .- Issue 5. стр. 880.

15) N.V.Poltavets, M.A.Maschan. A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan STXBP2 mutations are not delected in group of Russian patients with Familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (Fill)//Europ. J. Hum. Genet-2010- V.18.-suppl. 1. -p.317.

16) Полтавец H,В., Масчаи М.А.. Поляков А.В., Масчан А.А., Новичкова Г.А. (2010) Исследование молекулярно-генетпческой природы семенного гемофагоцитарного

лимфогистиоцитоза (FIIL) в группе Российских больных // Молекулярная генетика - 2010 -№2.-стр.143.

17) М.А.Масчаи. Г.А.Новичкова Гемофагоцитарньш лимфогистиоцитоз Вопросы современной педиатрии 2009, том 8, №3, стр. 66-75

18) Г.Г. Солопова, Д.Д. Байдильдина, Л.И. Жарикова, И,И. Калинина, У.Н. Петрова, Е.В. Сунцова, О.В. Горонкова, Л.А. Хачатрян, В.В. Синицына, Г.А. Новичкова, А.А.Масчан, М.А.Масчаи Применение 2-хлордезоксиадепозина в терапии гистиоцитоза из клеток Лангерганса у детей Онкогематодогия 2010 год №3, стр. 8-15

19) Полтавец Н.В., Масчан М.А., Масчан А.А., Новичкова Г.А., Поляков А.В. (2010) Мутации в гене UNC13D - наиболее частая причина семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза в группе российских больных Медицинская генетика, 2010, ХаЗ, стр.26-33

20) Grunewald TG, Damke L, Maschan M, Petrova TJ, Surianinova O, Esipenko A, Konovalov D, Behrends U, Scliiessl J, Wortler K, Burdach S, von Luettichau 1. First report of effective and feasible treatment of multifocal lymphangiomatosis (Gorham-Stout) with bevacizumab in a child. Ann Oncol. 2010, 21(8):1733-4.

21) Feuchtinger T, Opherk K, Bethge WA, Topp MS, Schuster FR, Weissinger EM, Mohty M, Or R, Maschan M, Schumm M, Hamprecht K, Handgretinger R, Lang P, Einsele H. Adoptive transfer of pp65-specific T cells for the treatment of chemorefractory cytomegalovirus disease or reactivation after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation. Blood. 2010 Nov 18;116(20):4360-7.

22) Maschan AA, Khachatrian LA, Solopova GG, Ossipova EY, Baidun LV, Dmitrieva SV, Maschan MA, Resnik IB. Development of T-cell acute lymphoblastic leukemia in a patient in very long-lasting complete remission of juvenile myelomonocytic leukemia. J Pediatr Hematol Oncol. 2011 Jan;33(l): p. 32-4.

23) М.А.Масчаи, Н.В.Полтавец, Ю.В.Скворцова, Д.А.Шашелева, П.Е.Трахтман, Д.Н.Балашов, Е.В.Скоробогатова, Е.В.Сунцова, Г.А.Новичкова, А.А.Масчан Результаты трансплантации гемопоэтическнх стволовых клеток при первичном гсмофагоютариом лимфогистиоцитозе у детей. Вопросы гематологии/ онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2011, том 10, № 1, стр 6-14.

24) М.А.Масчаи, Л.А Хачатрян., Ю.В.Скворцова, Е.Е.Курникова, Д.А.Шашелева, В.О.Бобрьпшпа,, Д.И.Балашов, Е.В.Скоробогатова, Д.Д.Байдильдипа, Г.А.Новичкова, А.А.Масчан Трансплантация гемопоэтическнх стволовых клеток при ювенильном мнеломоноцитарном лейкозе: анализ опыта одного центра и обзор литературы Онкогематодогия 2011, №1, стр. 45-56.

25) М.Л.Масчан, H.В.Полтавец, Гемофагоцитарный синдром в неотложной и интенсивной педиатрии, Педиатрическая фармакология, 2011, том 8, № 2, стр 15-21.

26) Michael Masclian, Vlasta Bobrynina, Lili Khachatryan, Dina Baidildina, Julia Skvortsova, Elena Osipova, Dmitri Balashov, Elena Skorobogatova, Galina Novichkova, Alexei Maschan Juvenile myelomonoeytic leukemia: molecular genetic analysis and results of therapy, Cellular Therapy and Transplantation, 2012, Vol. 3, No. 12, p. 68

27) Michacl Masclian. Natalia Poltavets, Lili Khachatryan, Irina Kalinina, Dina Baidildina, Julia Skvortsova, Elena Suntsova, Pavel Trakhtman, Elena Skorobogatova, Galina Novichkova, Alexei Maschan Primary hemophagocytic lymphohistiocytosis: molecular genetic analysis and results of therapy, Cellular Therapy and Transplantation, 2012, Vol. 3, No. 12, p. 67

28) M. Masclian. 1. Demidova, D.Konovalov, V.Bobrynina, G.Solopova, 1. Kalinina, D.Baidildina, G.Bronin, G.Novichkova, A.Maschan BRAF V600E mutations in children with Langerhans cell histiocytosis p.58 Сборник материалов 27-й конференции международной группы по изучению гистиоцитозов (The Histiocyte society), 2012 год

Список сокращений

сокращение

13-RA

2-CdA

6-МП

AraC

Atg-F

Bu

CsA

Су

Dexa

DL1

DNR

FHL3

Flu

HbF

Ida

1FO

Mel

Mit

MM F

MMRD

MP

MSD

MTX

MUD

Pm

pTRM

рБСВ

pOB

sCD25 (SIL-2R)

Tacro

Thymo

расшифровка

13-цис-ретиносвая кислота

2-хлордезоксиаденозин

6-меркаптолурин

цитозпна арабинозид

антптимоцитарный глобулин Фрезениус

бусульфан

циклоспорин А

циклофосфамид

дексаметазон

инфузия донорских лимфоцитов (donor lymphocyte infusion) даунорубицин

генетический субвариант семейного гемофагоцитарного

лимфогистиоцитоза, обусловленный мутацией в гене UNC13D

флударабнн

фетальный гемоглобин

идарубицин

ифосфамид

мельфалан

митоксантрон

мофетила микофеполят

частично совместимый родственный донор

метшшреднизолон

совместимый родственный донор

метотрексат

совместимый неродственный донор преднизолон

вероятность трансплантационной смертности вероятность бессобытипной выживаемости вероятность общей выживаемости растворимая форма рецептора к интерлейкину 2 такролнмус тимоглобулин

Tico

TT

UCB

Vb!

Ver

VP-16

A3

AJ1T

ACT

АТГ

BXT

ГКЛ

ГЛГ

ГМ-колонии

ГМ-КСФ

ДТ

ДТ-NR

ДТ-R

ИСТ

KM

ЛДГ

MoiioC

МП

MC

MCOP-

MCOP+

НД

ОЛЛ

ОМЛ

oPTIIX

ПГЛГ

ПДАФ

ПЗ

треосульфан тиофосфамид

неродственная пуповинная кровь

вннбластин

винкристии

этопознд

активное заболевание

алашнговая амшютрансфераза

аспарагиновая аминотрапсфераза

антитимоцитарный глобулин

высокодозиая химиотерапия

гистиоцитоз из клеток Лангерганса

гемофагоцптарный лимфогистиошггоз

гранулоцитарно-макрофагальные колонии

гранулоцнтэрно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

дифференцировочная терапия

пациент, не ответивший на дифференцировочную терапию (non-responder)

пациент, ответивший на дифференцировочную терапию (responder)

нммуносупресснвная терапия

костный мозг

лактатдегндрогеназа

моносистемная форма ГКЛ

метилпреднизолон

мультисистемная форма ГКЛ

мультисистемкая форма ГКЛ без вовлечения "органов риска"

мультисистемная форма ГКЛ с вовлечением "органов риска"

несахарный диабет

острый лимфобдастный лейкоз

острый мнслобластнын лейкоз

острая реакция трапеплантат-против-хозяина

первичный гемофагоцптарный лимфогисгиоцитоз

полиморфизм длины амплнфикациошшх фрагментов

прогрессия заболевания

ПК пуповинная кровь

ПО полный ответ

ПТЛЗ посттрсшспяантащкмнюе лимфопролиферативное заболевание

ГЩР полимеразная цепная реакция

РДКБ российская детская клиническая больница

РЗ реактивация заболевания

РТПХ реакция трапсплаптат-протнв-хозянна

СЗ стабилизация заболевания

СКПК стволовые клетки периферической крови

СМЖ спинномозговая жидкость

СОД суммарная доза облучения

ТГСК трансплантация гемопоэтических стволовых клеток

ТТП тромботическая тромбоцитопеническая пурпура

УЗИ ультразвуковое исследование

федеральный научио-клшшческий центр детской гематологии,

ФНКЦДГОИ

онкологии и иммунологии

Х-ЛПС Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром

ХММЛ хронический миеломоноцптарный лейкоз

хРТПХ хроническая реакция трансплантат-протнв-хозяпиа

ХТ химиотерапия

ЦМВ цитомегаловпрус

40 частичный ответ

ЩФ щелочная фосфатаза

ЭБВ вирус Эпштейн-Барр

ЮММЛ ювенильный миеломоноцитарный лейкоз

Автор глубоко благодарен за неоценимый вклад в представленную работу

Власте Бобрьшшюй

Ирине Демидовой

Галине Солоповой

Наталье Полтавец

Лили Хачатрян

Актуальность проблемы

Гистиоцитарные пролиферативные расстройства, или гистиоцитозы, - группа редких заболеваний, морфологической основой которых является патологическая пролиферация клеток гистиоцитарного ряда: тканевых макрофагов, моноцитов, дендритных клеток и их предшественников. Согласно современной классификации гистиоцитарных заболеваний, выделяют гистиоцитозы с вариабельным клиническим течением, основными представителями которых являются гистиоцитоз из клеток Лангерганса (ГКЛ) и гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (ГЛГ), и злокачественные гистиоцитозы, к которым относят моноцитарные варианты острого миелобластного лейкоза, солидные опухоли из моноцитов и дендритных клеток и хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ) (современный термин -ювенильный миеломоноцитарный лейкоз (ЮММЛ)) [1]. Несмотря на различия в биологии этих заболеваний, рассмотрение гистиоцитозов как единой клинико-патологической группы обусловлено сходной клинической презентацией у детей раннего возраста, необходимостью дифференциальной диагностики и аналогией методов терапии. Настоящее исследование сосредоточено на принципиальных вопросах биологии, диагностики и терапии трех наиболее распространенных форм гистиоцитарных расстройств у детей: первичного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза (ПГЛГ), ЮММЛ и ГКЛ.

ПГЛГ - врожденное расстройство иммунорегуляции, обусловленное генетическим дефектом механизмов клеточной цитотоксичности. Идентифицировано четыре гена, PR.F1, 1ЖС130, БТХ и БТХВР (МиИС18-2), терминальные мутации которых ведут к 5 формированию клинического фенотипа ПГЛГ. Сходный клинический фенотип формируется у пациентов с Х-сцепленным лимфопролиферативным синдромом (X

ЛПС) I и II типа и синдромом Грисселли, в основе которых лежат мутации в генах

SH2D1A, XIAP и RAB27 соответственно. В отсутствие терапии ПГЛГ является смертельным заболеванием [2]. Современная терапия ПГЛГ, основанная на последовательном применении иммуносупрессивной терапии (ИСТ) и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), позволяет излечивать около 50% пациентов [3]. Своевременная верификация генетической природы

ПГЛГ позволяет подтвердить показания к ТГСК, выполнить генетическое консультирование и пренатальную диагностику. Исследование генетической эпидемиологии ПГЛГ в популяции российских пациентов, анализ эффективности терапии ПГЛГ и разработка алгоритма клинической и лабораторной диагностики необходимы для улучшения диагностики и результатов лечения этого заболевания

ЮММЛ - заболевание, сочетающее черты миелодисплазии и миелопролиферации. В основе заболевания лежат соматические (реже терминальные) мутации в генах PTPN11, NRAS, KRAS, C-CBL, NF1 [4]. Результатом является гиперпролиферация миелоидных и моноцитарных предшественников, дисфункция костномозгового кроветворения и патологическая инфильтрация органов. Единственным методом, позволяющим излечивать пациентов с ЮММЛ, считается ТГСК [5]. Выполнение ТГСК при ЮММЛ ассоциировано с 10-20% риском трансплантационной смертности и 30-40% риском рецидива заболевания [6].

Нерешенным остается вопрос о месте нетрансплантационных методов терапии, таких как дифференцировочная терапия (ДТ) 13-цис-ретиноевой кислотой (13-RA) и высокодозная химиотерапия (ВХТ). Разработка алгоритма молекулярно6 генетического анализа и клинико-генетическое сопоставление необходимы для диагностики, определения показаний к ТГСК, мониторинга минимальной остаточной болезни и тестирования новых методик терапии. Анализ результатов ТГСК и альтернативной терапии необходим для оптимизации технологии ТГСК и определения перспективной тактики мультимодальной терапии.

ГКЛ - заболевание, в основе которого лежит клональная пролиферация миелоидных дендритных клеток, фенотипически сходных с эпидермальными клетками Лангерганса. Манифестация ГКЛ варьирует от локализованных очагов остеолизиса до диссеминированных форм с неконтролируемым злокачественным течением [7]. Биологическая основа этих различий и природа ГКЛ в целом остаются нерасшифрованными [8]. Данные о роли мутации У600Е в гене ВЯАЕ в патогенезе ГКЛ стали новым фактом, свидетельствующим в пользу неопластической природы заболевания [9]. Подтверждение этого факта может открыть новый этап понимания биологии заболевания и новые перспективы терапии. Современным стандартом лечения ГКЛ у детей является комбинированная терапия винбластином (УЫ) и преднизолоном (Ргп) [10]. Одной из наиболее актуальных проблем является терапия пациентов группы «высокого риска» - пациентов с мультисистемным ГКЛ с вовлечением «органов риска» (МСОР+). Общая выживаемость (рОВ) в этой группе не превышает 70%, а в подгруппе пациентов, рефрактерных к стандартной терапии - 20% [11]. В лечении резистентных форм ГКЛ наиболее перспективным представляется опыт интенсивной химиотерапии (ХТ) с использованием 2-хлор-дезоксиаденозина (2-Сс1А) в комбинации с цитозина арабинозидом (АгаС) [12]. Таким образом, исследование молекулярного дефекта У600Е ВЯАР при ГКЛ, анализ результатов терапии мультисистемного ГКЛ и разработка альтернативных программ 7 терапии являются актуальным прикладным вопросом детской гематологии/онкологии и педиатрии.

Цель исследования

Разработка и внедрение современных принципов клинико-лабораторной и молекулярно-генетической диагностики и оптимизирующих программ терапии пациентов с первичным гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом, ювенильным миеломоноцитарным лейкозом и гистиоцитозом из клеток Лангерганса.

Задачи исследования

1. Выполнить молекулярно-генетический анализ генов PRF1, UNC13D, STX, STXBP, SH2D1A, XIAP, RAB27 в группе российских пациентов с клиническим диагнозом ПГЛГ. Изучить клиническую презентацию и корреляцию генотип-фенотип при генетически детерминированном ГЛГ.

2. Разработать алгоритм клинико-лабораторной диагностики, молекулярно-генетической верификации и дифференциальной диагностики первичного гемофагоцитарного синдрома и его генетических субвариантов.

3. Провести анализ результатов лечения пациентов с ПГЛГ с использованием стандартных режимов программной иммуносупрессивной химиотерапии и алло-ТГСК. Разработать практические рекомендации по выбору тактики терапии.

4. Выполнить молекулярно-биологический анализ генов PTPN11, NRAS, KRAS и -С-CBL в репрезентативной группе пациентов с ЮММЛ. Сопоставить клинические и лабораторные проявления с генетическими дефектами и разработать рациональную тактику генетической верификации диагноза и алгоритм клинико-лабораторной диагностики и дифференциальной диагностики ЮММЛ.

5. Провести анализ результатов алло-ТГСК, ВХТ и ДТ с использованием 13-RA в группе пациентов с ЮММЛ. Разработать клиническую стратификацию на основании анализа клинических и лабораторных факторов риска. Разработать стратегию выбора терапии ЮММЛ в соответствии с клинико-биологической стратификацией.

6. Исследовать мутацию V600E в гене BRAF в патогистологических образцах пациентов с гистиоцитозом из клеток Лангерганса. Оценить потенциальное место исследования мутационного статуса BRAF в диагностике, выборе и мониторинге терапии ГКЛ.

7. Изучить непосредственные и отдаленные результаты стандартной терапии пациентов с ГКЛ. Разработать альтернативный подход к лечению пациентов с мультисистемным заболеванием на основе использования комбинированной ХТ 2-CdA и АгаС. Провести сравнительный анализ результатов стандартной и альтернативной терапии. Разработать практические рекомендации по выбору терапии и тактике сопроводительной терапии ГКЛ в группе высокого риска.

Научная новизна

Впервые в репрезентативной выборке российских пациентов с ПГЛГ выполнено молекулярно-генетическое исследование всех известных генов (PRF1, UNC13D,

STX, STXBP, SH2D1A, XIAP, RAB27), ассоциированных с фенотипом ПГЛГ.

Выявлено уникальное распределение генетических вариантов ПГЛГ с преобладанием FHL3, отличное от популяций иного этнического состава. Показано, 9 что распространение в популяции мутаций с.23462349с1е1 и с.3037тз0 обусловлено эффектом основателя». Не выявлена значимая корреляция клинического фенотипа с генетическим вариантом ПГЛГ. В работе проведен первый в России анализ результатов терапии пациентов с ПГЛГ и убедительно продемонстрирована необходимость выполнения ТГСК всем пациентам с ПГЛГ. Показано, что основным препятствием к успеху ТГСК является высокая трансплантационная смертность (54 15%). Впервые в репрезентативной выборке российских пациентов с ЮММЛ выполнено молекулярно-генетическое исследование основных генов {РТРИ11,

ИРАБ, КРАБ и С-СВЬ), ассоциированных с развитием ЮММЛ. В работе подтверждено характерное распределение генетических вариантов ЮММЛ и впервые выявлена корреляция клинического фенотипа с генотипом заболевания.

Разработана программа лечения 13-ЯА и низкими дозами АгаС при ЮММЛ.

Продемонстрирован клинико-гематологический эффект ДТ и установлена корреляция исходных клинико-лабораторных показателей и генетического варианта

ЮММЛ с ответом на ДТ. Подробно описан феномен стойкого ответа на ДТ, выявлена персистенция мутантного клона у пациентов в статусе полного ответа

ПО) и описано развитие поздних злокачественных (острый лимфобластный лейкоз

ОЛЛ) и аутоиммунных (тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП)) заболеваний у пациентов с ПО на ДТ. Впервые в репрезентативной группе российских пациентов проведен анализ результатов ТГСК, 5-летняя общая выживаемость составила 38±13%, трансплантационная смертность - 28±12%, частота развития рецидива 31%. Выполнен анализ мутации У600Е ВРАГ у пациентов с ГКЛ и подтверждена вероятная роль данного соматического генетического дефекта в патогенезе ГКЛ у 24% пациентов. Разработана ю оригинальная программа терапии для группы пациентов «высокого риска» на основе использования комбинации 2-CdA и АгаС. Показана высокая эффективность терапии рефрактерных форм МСОР+ ГКЛ, рОВ = 66±15%. Показана высокая эффективность 2-CdA и АгаС в лечении МСОР+ ГКЛ, рОВ = 88±9%, частота развития инвалидизирующих перманентных последствий - 0%. Описан необычный спектр инфекционных осложнений, включающий инфекции вакцинальным штаммом М. bovis и тяжелые инфекции, вызванные респираторными вирусами.

Практическое значение

В работе на основании анализа генетической структуры ПГЛГ в группе российских пациентов разработан алгоритм клинико-лабораторной диагностики

ПГЛГ, алгоритм молекулярно-гентического анализа и методика выявления наиболее распространенных мутаций в гене UNC13D. На основании анализа результатов

ИСТ и ТГСК предложена стратегия выбора терапии, предусматривающая начало поиска донора в момент установления диагноза ПГЛГ и обязательное выполнение

ТГСК не позднее 4 месяцев от момента установления диагноза. Разработан алгоритм молекулярно-генетического исследования при диагностике пациентов с клиническим диагнозом ЮММЛ, позволяющий верифицировать диагноз, осуществить рациональный выбор терапии и мониторинг заболевания после ТГСК.

Разработан алгоритм выбора терапии в соответствии с клинико-биологической стратификацией пациентов. На основании анализа результатов ХТ и ТГСК предложена стратегия выбора терапии, предусматривающая начало поиска донора в момент установления диагноза ЮММЛ и обязательное выполнение ТГСК не

11 позднее 6 месяцев от момента установления диагноза в группе пациентов, не ответивших на ДТ. Молекулярно-генетический анализ мутации V600E BRAF у пациентов с ГКЛ показал, что данная генетическая аномалия потенциально является диагностическим маркером заболевания и терапевтической мишенью. Разработана и внедрена в клиническую практику эффективная программа ВХТ на основе комбинации 2-CdA и АгаС для лечения пациентов с рефрактерным течением ГКЛ МСОР+. Разработаны рекомендации по сопроводительной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гистиоцитарные пролиферативные расстройства - гистиоцитозы - группа фенотипически родственных заболеваний, в основе которых лежит спектр врожденных либо приобретенных молекулярных дефектов, ведущих к аномальной пролиферации и регуляции функциональной активности клеток гистиоцитарного ряда. Новые данные о биологии гистиоцитозов диктуют необходимость разработки комплексного алгоритма диагностики, дифференцированной тактики терапии и диспансерного наблюдения пациентов с гистиоцитозами.

2. Мутации в гене UNCI 3D являются наиболее распространенным генетическим дефектом в популяции российских пациентов с ПГЛГ. Частота выявления мутаций в гене UNCI 3D составила 54%. Распространенность этих мутаций в исследованной группе обусловлена «эффектом основателя» - персистенцией в популяции мутаций c.23462349del и c.3037insG. Исследование гена UNC13D рекомендуется в качестве первого этапа молекулярно-генетической диагностики ПГЛГ в России.

3. Единственным методом терапии, обеспечивающим долгосрочную выживаемость пациентов с ПГЛГ, является ТГСК. 5-летняя рОВ в группе ПГЛГ составляет 37±14 % при выполнении ТГСК, 0±0% при выполнении только ИСТ, р = 0,0005. Неудачи ТГСК обусловлены высокой трансплантационной смертностью, pTRM = 54±15%, Идентификация и выбор донора являются приоритетными задачами наравне с генетической верификацией диагноза и началом иммуносупрессивной терапии. ТГСК должна быть выполнена не позднее 4 месяцев от начала ИСТ, так как частота реактивации заболевания составляет 95%, медиана реактивации - 5 месяцев.

4. Молекулярно-генетическое исследование генов PTPN11, NRAS, KRAS и C-CBL позволяет верифицировать диагноз у 70% пациентов с ЮММЛ. Относительная частота различных генетических дефектов составляет: PTPN11 - 35%, NRAS - 14%, C-CBL - 13%, KRAS - 11%. Стратификация пациентов на основании генетического варианта ЮММЛ (мутации в генах RAS и C-CBL), возраста манифестации (< 1 года) и содержания фетального гемоглобина (HbF) (< 10%) позволяет выделить прогностически благоприятную группу, не нуждающуюся в выполнении ТГСК в первой линии терапии. Пациентам этой группы показано проведение ДТ 13-RA + АгаС, 5-летняя рОВ при проведении ДТ составляет 75±15%.

5. Пациенты группы высокого риска и пациенты, не ответившие на терапию 13-RA + АгаС, нуждаются в выполнении ТГСК по витальным показаниям не позднее 6 месяцев от установления диагноза, независимо от наличия полностью совместимого донора. 5-летняя рОВ при выполнении ТГСК составила 38±13%. Применение флударабина (Flu) в комбинации с бусульфаном (Bu) и мельфаланом (Mel) при подготовке к трансплантации обеспечивает эквивалентную частоту приживления трансплантата (90% и 60%, р = 0,24) и общую выживаемость (рОВ 47±19% и 33±19%, р = 0,72) в сравнении с стандартным режимом кондиционирования: циклофосфамид (Су) + Bu + Mel.

6. Мутация V600E BRAF выявляется у 24% пациентов с ГКЛ и, вероятно, принимает участие в патогенезе заболевания. Значимой корреляции статуса BRAF с клиническими и лабораторными проявлениями заболевания не выявлено. Мутация V600E BRAF потенциально является диагностическим маркером и терапевтической мишенью у пациентов с ГКЛ.

7. Комбинированная XT 2-Cda и АгаС является эффективным методом лечения мультисистемного ГКЛ, резистентного к стандартной терапии, рОВ = 66±19%. Применение 2-Cda и АгаС в терапии первой линии МСОР+ ГКЛ более эффективно в сравнении со стандартной терапией. Частота достижения полных ответов составила 100% vs. 33%, рБСВ = 88±9% vs 40±11%, частота формирования перманентных осложнений - 0% vs 66%. Достоверных различий рОВ не выявлено, что обусловлено высокой эффективностью терапии второй линии. Применение ВХТ 2-Cda + АгаС ассоциировано с выраженной миелосупрессией, иммуносупрессией, и высоким риском развития инфекционных осложнений. Характер иммуносупрессии определяет спектр инфекций, включающий вирусные инфекции и инфекции вакцинальным штаммом М. bovis.

Внедрение в практику

Результаты работы внедрены в практику молекулярной диагностики ПГЛГ в Медико-генетическом научном центре РАМН (зав. лабораторией профессор A.B. Поляков) и диагностики ЮММЛ в лаборатории молекулярной биологии ФНКЦ ДГОИ (зав. лабораторией к.м.н. Бобрынина В.О.). Алгоритмы диагностики и оптимизированные протоколы терапии используются в отделениях гематологии и трансплантации костного мозга РДКБ и в клинике ФНКЦ ДГОИ. Основные положения и выводы диссертации используются в курсе лекций и семинаров на кафедре детской гематологии, онкологии и иммунопатологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Апробация диссертации

Материалы диссертации представлены в докладах на национальных и международных конференциях, в частности на конференции международного общества по изучению гистиоцитозов (Histiocyte Society) в 2005, 2008, 2009, 2011 гг., международного общества детских онкологов (SIOP) в 2010 г., европейской ассоциации гематологии (ЕНА) в 2010 году, европейского общества генетики человека (ESHG) в 2008, 2009, 2010 гг., российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» в 2011 году. Основные положения и выводы диссертации используются в курсе лекций и семинаров по детской гематологии/онкологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Материалы диссертации опубликованы в составе 28 печатных работ, в том числе 10 в изданиях, рекоммендованых ВАК. Апробация диссертации состоялась 15 марта 2011 г. на научно-практической конференции ФНКЦ ДГОИ.

Структура и объем диссертации

Выводы

1. В основе развития гистиоцитарных пролиферативных заболеваний (гистиоцитозов) лежат врожденные (ПГЛГ, ЮММЛ) либо приобретенные (ЮММЛ, ГКЛ) генетические дефекты, обусловливающие аномальную регуляцию пролиферации и функциональной активности гистиоцитов и их костномозговых предшественников. Идентификация молекулярных дефектов и выявление клинико-генетической корреляции необходимы для создания биологической классификации гистиоцитозов, разработки современного алгоритма диагностики, дифференциальной диагностики и терапии гистиоцитарных болезней.

2. Молекулярно-генетический анализ генов PRF1, UNCI 3D, STX, STXBP, SH2D1A, XIAP и RAB27 показал, что доминирующее положение в генетической структуре ПГЛГ в репрезентативной выборке российских пациентов занимает FHL3 - вариант, обусловленный мутациями в гене UNCI 3D. Доля мутаций UNCI 3D составила 54% от всех пациентов с ПГЛГ, PRF1 и STX- по 3,5%. При анализе выявлены 9 новых и 4 ранее описанных мутации UNCI 3D. Высокая частота данного генетического варианта частично обусловлена распространением в популяции российских пациентов двух мутаций: c.23462349del и c.3037insG вследствие «эффекта основателя». Для выявления трех наиболее распространенных в России мутаций UNCI 3D, c.l828insA, c.23462349del и c.3037insG, составляющих 48% мутаций в гене UNCI 3D, разработана тест-система на основе мультиплексной ПЦР-ПДАФ.

3. В исследовании не выявлена значимая корреляция основных клинических и лабораторных характеристик ПГЛГ с гентическим вариантом FHL3 (мутации UNCI 3D), что не позволяет использовать исходную клиническую и лабораторную информацию для предсказания генетического варианта ПГЛГ и селекции мишеней для молекулярно-генетического исследования.

4. Стандартная иммуносупрессивная терапия этопозидом, дексаметазоном и циклоспорином А позволяет установить временный контроль над патологической активацией иммунной системы у 78% пациентов, однако в отсутствие ТГСК не способна излечивать пациентов с ПГЛГ. Частота реактиваций заболевания составила 95%. 5-летняя рОВ в группе ПГЛГ составляет 37±14 % при выполнении ТГСК, 0±0% при выполнении только ИСТ, log-rank р = 0,0005. Неудачи ТГСК обусловлены высокой трансплантационной смертностью, pTRM = 54±15%, вероятной причиной которой является длительный интервал до ТГСК (медиана - 14,6 месяцев) и кумулятивная токсичность терапии и множественных реактиваций заболевания.

5. В группе пациентов с ЮММЛ наиболее распространенным соматическим генетическим дефектом являются мутации в гене PTPN11 (35%), с меньшей частотой встречаются мутации в генах NRAS (14%), C-C-CBL (13%) и KRAS (11%). Прямое секвенирование экзонов 3 и 13 PTPN11, 2 и 3 NRAS и KRAS, 8 и 9 C-C-CBL позволяет идентифицировать генетический дефект и верифицировать диагноз у 70% пациентов с ЮММЛ. Значимые отличия в клинико-лабораторной презентации генетических субвариантов ЮММЛ выявлены у пациентов с мутациями RAS в сравнении с PTPN11: возраст манифестации заболевания составил 6,7 (RAS) и 24 (PTPN11) месяца, р = 0.0252. Содержание HbF 4,6 % (RAS) и 21% (PTPN11), р = 0,0008.

6. Дифференцировочная терапия 13-RA + АгаС индуцирует клинически значимый ответ у части пациентов с ЮММЛ. Ответ на ДТ коррелирует с ранним возрастом манифестации, низким содержанием HbF и мутациями в генах RAS и C-C-CBL. Пациенты, ответившие на ДТ, составили группу с лучшим показателем общей выживаемости, рОВ = 75±15%, как в сравнении с пациентами, не ответившими на ДТ, рОВ = 9±8%, так и в сравнении с пациентами, получившими ТГСК, рОВ = 0,38±13%. Ответ на ДТ не является эквивалентом излечения ЮММЛ, так как в гемопоэтическом компартменте персистирует мутантный клон и сохраняется риск развития злокачественных (Т-ОЛЛ, п - 1) и аутоиммунных болезней крови (ТТП, п - 1). ВХТ способна индуцировать кратковременный клинически значимый ответ у 50% пациентов, но не обеспечивает долгосрочную выживаемость.

7. ТГСК является единственным методом терапии, способным излечивать ЮММЛ. При использовании миелоаблативных режимов кондиционирования рОВ и рБСВ в группе пациентов, получивших ТГСК, составляет 38±13% и 40±12%. Неудачи ТГСК обусловлены высокой трансплантационной смертностью, рТЯМ = 28±15%, и высокой частотой рецидивов ЮММЛ, 34±12%. Аллогенная ТГСК является терапией выбора для пациентов с ЮММЛ, не ответивших на ДТ, независимо от типа донора.

8. Мутация У600Е В КАР выявлена в патогистологических образцах 24% пациентов с ГКЛ. Значимой корреляции основных клинических и лабораторных показателей с мутационным статусом ВИАГ не выявлено. Мутация У600Е ВЯАГ является потенциальным маркером для диагностики и вероятной мишенью для терапии у части пациентов с ГКЛ.

9. Комбинированная химиотерапия 2-Сёа и АгаС является эффективным методом лечения мультисистемного ГКЛ, резистентного к стандартной терапии, рОВ = 66±19%. Показано, что применение 2-Сс1а и АгаС в терапии первой линии МСОР+ ГКЛ более эффективно в сравнении со стандартной терапией. Частота достижения полных ответов составила 100% vs. 33%, бессобытийная выживаемость, рБСВ = 88±9% vs. 40±11%, частота формирования перманентных осложнений, 0% vs 66%. Применение ВХТ 2-Cda + АгаС ассоциировано с выраженной миелосупрессией и иммуносупрессией и высоким риском развития тяжелых инфекционных осложнений.

Практические рекомендации

1) Для повышения эффективности лабораторной диагностики ПГЛГ в России необходимо этапное выполнение молекулярно-генетического анализа генов, ассоциированных с клиническим фенотипом ПГЛГ. На первом этапе целесообразно использовать тест-систему для выявления наиболее распространенных в российской популяции мутаций в гене UNC13D. На втором этапе - прямое секвенирование всех экзонов и экзон-интронных соединений гена UNC13D. На третьем этапе - прямое секвенирование генов PRF1, STX11, STXBP, RAB27 и, у пациентов мужского пола, SH2D1A, XIAP. Внедрение методики проточной цитометрии в лабораторную диагностику ПГЛГ позволит существенно оптимизировать затраты на генотипирование.

2) Клинический диагноз ПГЛГ является абсолютным показанием к началу иммуносупрессивной (химио)терапии дексаметазоном и этопозидом, независимо от молекулярно-генетической верификации диагноза.

Поиск неродственного донора следует инициировать в момент начала ИСТ. Алло ТГСК должна быть выполнена всем пациентам с верифицированным диагнозом ПГЛГ не позднее 4 месяцев от начала ИСТ. Выполнение ТГСК не должно быть ограничено наличием гистосовместимого донора и статусом ремиссии ГЛГ.

3) Прямое секвенирование экзонов 3 и 13 РТРИ11, 2 и 3 ИЯА8 и ККА8, 8 и 9 С-С-СВЬ необходимо включить в ряд базовых диагностических исследований у пациентов с клиническим диагнозом ЮММЛ. Эффективность исследования может быть повышена путем поэтапного анализа в зависимости от исходных клинических и лабораторных характеристик. В группе пациентов младше 1 года с содержанием НЬБ < 10% целесообразно на первом этапе исследовать гены МЯАЗ и КЯАЗ, у пациентов старше 1 года с содержанием НЬБ > 10% - ген РТРИ11.

4) С целью определения тактики терапии пациентов с ЮММЛ целесообразно использовать клиническую стратификацию в соответствии с предложенной балльной шкалой, на основании трех показателей: возраста манифестации, содержания НЬБ и генетического дефекта.

5) В группе пациентов младше 1 года с содержанием НЬБ < 10% и мутациями в генах ИКАБ и КЛАБ наиболее эффективным и безопасным методом терапии является дифференцировочная терапия 13-ЯА и низкими дозами АгаС. ДТ индуцирует длительный клиникогематологический ответ, у части пациентов - не требующий медикаментозной поддерживающей терапии. Пациенты, ответившие на ДТ, должны оставаться под наблюдением гематолога бессрочно в связи с риском развития поздних злокачественных и аутоиммунных болезней крови.

6) Всем пациентам группы высокого риска и пациентам группы низкого и промежуточного риска, не ответившим на ДТ, должна быть выполнена ТГСК не позднее 6 месяцев от установления диагноза. Приоритетным источником ГСК является родственный или неродственный совместимый донор. Выполнение ТГСК не должно быть ограничено наличием гистосовместимого донора. В качестве иммуносупрессивного компонента кондиционирования Flu может быть использован вместо Су. Целесообразно и оправдано этически включение всех пациентов с ЮММЛ, подлежащих ТГСК, в клинические исследования II-III фазы.

7) Необходимо продолжить исследование роли мутации V600E BRAF и иных вероятных механизмов активации сигнального пути MAPK-ERK в патогенезе ГКЛ с использованием методик микродиссекции и молекулярного анализа на уровне одной клетки. Клиническое значение данной молекулярной аномалии должно быть исследовано проспективно.

8) В терапии пациентов с ГКЛ, рефрактерных к стандартной ХТ, необходимо раннее (через 6-12 недель) использование комбинированной химиотерапии 2-СёА и АгаС. Комбинированная терапия 2-СёА и АгаС в терапии первой линии может применяться в рамках клинического исследования как эффективная альтернативой стандартной терапии у пациентов с МСОР+ ГКЛ. Проведение данной терапии должно быть ограничено стационарами, обладающими опытом ведения пациентов с ОМЛ и безусловным доступом к современной сопроводительной терапии.

Список публикаций по теме диссертации

1) Пашанов Е.Д, Балашов Д.Н., Скоробогатова Е.В, Шипицына И.П., Трахтман П.Е., Дышлевая З.М., Скворцова Ю.В., Благонравова O.JL, Масчан М.А., Курникова Е.Е., Персиянцева М.И., Митюшкина Т.А., Масчан А.А., Румянцев А.Г. Характеристика инфекционных заболеваний у детей после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Вопросы гематологии/ онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2005; 2: 68-81.

2) О.В.Горонкова, А.А.Масчан, Е.В.Сунцова, Л.И. Жарикова, Г.Г.Солопова, Д.Д.Байдильдина, Л.А.Хачатрян, М.А.Масчан, Д.Н.Балашов, О.В.Макарова. «Эффективность и безопасность вориконазола в лечении инвазивных грибковых инфекций и эмпирической терапии фебрильной нейтропении у детей с онкогематологическими заболеваниями». Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2005, том 4, №3; с.87-94

3) M.Maschan, G.Novichkova, E.Suntsova, L.Zharikova, O.Goronkova, D.Baidildina, L.Khachatryan, and A.Maschan 2-Chlordeoxyadenosine and intermediate-dose cytosine arabinoside combination therapy for high-risk langerhans cell histiocytosis Pediatric Blood & Cancer 2006.-V.46 . - Issue 3. стр. 392- 405.

4) Скоробогатова Е.В., Балашов Д.Н., Дышлевая З.М., Трахтман П.Е., Шелихова JI.H., Скворцова Ю.В., Шипицына И.П., Курникова Е.Е., Пашко Ю.В., Благонравова O.JL, Персианцева М.И., Масчан М.А., Литвинов Д.В., Мякова Н.В., Болотов A.A., Масчан A.A., Румянцев А.Г. Результаты трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей. Опыт Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии на базе Российской детской клинической больницы. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2006, т 6, №4, 29-38.

5) Новичкова Г.А., Минков М., Масчан М.А., Чернов В.М. Гл. 45. Гистоиоцитозы В кн. Клиническая онкогематология. Под ред. проф. М.А. Волковой. - М.: Медицина. - 2007. - С. 891-912.

6) Л.А.Хачатрян, Е.В.Самочатова, М.А.Масчан, Д.Д.Байдильдина, Г.Г.Солопова, А.А.Масчан. «Результаты терапии ювенильного миеломоноцитарного лейкоза у детей». Сборник материалов XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство»,Москва , 14-18 апреля 2008: С.423

7) N.V.Poltavets, M.A.Maschan, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan Six new mutations in UNCI 3D gene in Russian patients with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL) // Europ. J. Hum. Genet.- 2008. - V.16. - suppl 2. - p.247.

8) Л.А.Хачатрян, М.А.Масчан, Е.В.Самочатова, М.М.Шнейдер, Д.Д. Байдильдина, Г.Г.Солопова, Е.В.Сунцова, Л.И.Жарикова, У.Н.Петрова, В.В.Синицына, Г.А.Новичкова, А.А.Масчан Дифференцировочная терапия с использованием 13-цис-ретиноевой кислоты и низких доз цитозин-арабинозида у детей с ювенильным миеломоноцитарным лейкозом. Онкогематология 2008, №1-2, стр. 34-38

9) N.V.Poltavets, M.A.Maschan, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan Mutations in UNCI 3D gene are the most frequent cause of FHL in a group of Russian patients. Pediatric Blood &Cancer \\ 2009.- V.53.-Issue 4. стр.685-697.

10) M.Maschan, G.Novichkova, D.Baidildina, L.Khachatryan, V.Sinizina, G.Solopova, U.Petrova, A.Maschan Up-front 2-Chlordeoxyadenosine-based combination chemotherapy in high-risk LCH: early results of pilot trial Pediatric Blood & Cancer 2009.-V. 53 .- Issue 4. стр. - 685-697.

11) N.V.Poltavets, M.A.Maschan, I.G.Sermyagina, A.V.Polyakov,

1.V.Kondratenko, A.A.Maschan, G.A.Novichkova Four SH2D1A mutations on 7 chromosomes detected in Russian patients with X-linked lymphoproliferative syndrome // Europ. J. Hum. Genet. - 2009. -V.17. - suppl

2. - стр.347.

12) N.V.Poltavets, M.A.Maschan, I.G. Sermyagina, V.V. Zabnenkova, I.V.Kondratenko,G.A. Novichkova, A.A.Maschan, A.V.Polyakov Five SH2D1A mutations on 7 chromosomes detected in russian patients with Xlinked lymphoproliferative syndrome (XLP) Сборник материалов 25-й конференции международной группы по изучению гистиоцитозов (The Histiocyte society), 2009 год, стр.43.

13) M.A.Maschan, N.V. Poltavets, I.G. Sermyagina, V.V. Zabnenkova, I.V.Kondratenko, G.A. Novichkova, A.A.Maschan, A.V.Polyakov RAB27 mutations not detected in russian patients with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis and X-linked lymphoproliferative syndrome. Сборник материалов 25-й конференции международной группы по изучению гистиоцитозов (The Histiocyte society), 2009 год, стр. 57.

14) G.Solopova, D.Baidildina, E.Suntsova, O.Goronkova, U.Petrova, I.Kalinina, L.Khachatryan, V.Sinizina, G.Novichkova, A.Maschan, M.Maschan Front-line therapy of high-risk Langerhans cell histiocytosis with 2-Chlordeoxyadenosine and cytosine arabinoside: an update of a single center experience Pediatric Blood & Cancer 2010.-V. 55 .- Issue 5. стр. 880.

15) N.V.Poltavets, M.A.Maschan, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan STXBP2 mutations are not detected in group of Russian patients with Familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL) // Europ. J. Hum. Genet.- 2010 - V. 18. - suppl. 1. - р.317.

16) Полтавец H.B., Масчан M.A., Поляков A.B., Масчан А.А., Новичкова Г. А. (2010) Исследование молекулярно-генетической природы семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза (FHL) в группе Российских больных // Молекулярная генетика - 2010 - № 2. - стр.143.

17) М.А.Масчан, Г.А.Новичкова Гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз Вопросы современной педиатрии 2009, том 8, №3, стр. 66-75

18) Г.Г. Солопова, Д.Д. Байдильдина, Л.И. Жарикова, И.И. Калинина, У.Н. Петрова, Е.В. Сунцова, О.В. Горонкова, Л.А. Хачатрян, В.В. Синицына, Г.А. Новичкова, А.А.Масчан, М.А.Масчан Применение 2-хлордезоксиаденозина в терапии гистиоцитоза из клеток Лангерганса у детей Онкогематология 2010 год №3, стр. 8-15

19) Полтавец Н.В., Масчан М.А., Масчан А.А., Новичкова Г.А., Поляков А.В. (2010) Мутации в гене UNCI 3D - наиболее частая причина семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза в группе российских больных Медицинская генетика, 2010, №3, стр.26-33

20) Grunewald TG, Damke L, Maschan M, Petrova U, Surianinova O, Esipenko A, Konovalov D, Behrends U, Schiessl J, Wortler K, Burdach S, von Luettichau I. First report of effective and feasible treatment of multifocal lymphangiomatosis (Gorham-Stout) with bevacizumab in a child. Ann Oncol. 2010, 21(8):1733-4.

21) Feuchtinger T, Opherk K, Bethge WA, Topp MS, Schuster FR, Weissinger EM, Mohty M, Or R, Maschan M, Schumm M, Hamprecht K, Handgretinger R, Lang P, Einsele H. Adoptive transfer of pp65-specific T cells for the treatment of chemorefractory cytomegalovirus disease or reactivation after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation. Blood. 2010 Nov 18;116(20):4360-7.

22) Maschan AA, Khachatrian LA, Solopova GG, Ossipova EY, Baidun LV, Dmitrieva SV, Maschan MA, Resnik IB. Development of T-cell acute lymphoblastic leukemia in a patient in very long-lasting complete remission of juvenile myelomonocytic leukemia. J Pediatr Hematol Oncol. 2011 Jan;33(l): p. 32-4.

23) М.А.Масчан, Н.В.Полтавец, Ю.В.Скворцова, Д.А.Шашелева, П.Е.Трахтман, Д.Н.Балашов, Е.В.Скоробогатова, Е.В.Сунцова, Г.А.Новичкова, А.А.Масчан Результаты трансплантации гемопоэтических стволовых клеток при первичном гемофагоцитарном лимфотистиоцитозе у детей. Вопросы гематологии/ онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2011, том 10, № 1, стр 6-14.

24) М.А.Масчан, JI.A Хачатрян., Ю.В.Скворцова, Е.Е.Курникова, Д.А.Шашелева, В.О.Бобрынина,, Д.Н.Балашов, Е.В.Скоробогатова, Д.Д.Байдильдина, Г.А.Новичкова, А.А.Масчан Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при ювенильном миеломоноцитарном лейкозе: анализ опыта одного центра и обзор литературы Онкогематология 2011, №1, стр. 45-56.

25) М.А.Масчан, Н.В.Полтавец, Гемофагоцитарный синдром в неотложной и интенсивной педиатрии, Педиатрическая фармакология, 2011, том 8, №2, стр 15-21.

26) Michael Maschan, Vlasta Bobrynina, Lili Khachatryan, Dina Baidildina, Julia Skvortsova, Elena Osipova, Dmitri Balashov, Elena Skorobogatova,

Galina Novichkova, Alexei Maschan Juvenile myelomonocytic leukemia: molecular genetic analysis and results of therapy, Cellular Therapy and Transplantation, 2012, Vol. 3, No. 12, p. 68

27) Michael Maschan, Natalia Poltavets, Lili Khachatryan, Irina Kalinina, Dina Baidildina, Julia Skvortsova, Elena Suntsova, Pavel Trakhtman, Elena Skorobogatova, Galina Novichkova, Alexei Maschan Primary hemophagocytic lymphohistiocytosis: molecular genetic analysis and results of therapy, Cellular Therapy and Transplantation, 2012, Vol. 3, No. 12, p. 67

28) M. Maschan, I. Demidova, D.Konovalov, V.Bobrynina, G.Solopova, I. Kalinina, D.Baidildina, G.Bronin, G.Novichkova, A.Maschan BRAF V600E mutations in children with Langerhans cell histiocytosis p.58 Сборник материалов 27-й конференции международной группы по изучению гистиоцитозов (The Histiocyte society), 2012 год