Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Молекулярно-биологические факторы инвазивного роста и метастазирования рака при морфологическом исследовании

На правах рукописи

оозовтзе!

ЗАВАЛИШИНА ЛАРИСА ЭДУАРДОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ИНВАЗИВНОГО РОСТА И МЕТАСТАЗИРОВАНИЯРАКА ПРИ МОРФОЛОГ ИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ

•

14.00.14 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2006

003067261

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А.Герцена Росздрава»

Научный копсультапт:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук доктор медицинских наук, профессор

Георгий Авраамович Франк

Раиса Ивановна Якубовская Татьяна Николаевна Заботина Василий Иванович Борисов

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования "Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова"

Защита состоится ¿9. РЗ 2007г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 208.047.01 при ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Росздрава» по адресу: 125284, г. Москва, 2-ой Боткинский проезд, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «МНИОИ им. П.А.Герцена Росздрава»

Автореферат разослан « а » февраля 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

С. А.Седьи

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

Одной из важных задач современной онкологии является поиск признаков и свойств опухолей, на основе которых можно было бы прогнозировать течение заболевания и определять адекватную терапию. Важнейшими характеристиками злокачественного новообразования помимо клинической стадии является его гистологический вариант, степень дифференцировки и биологическая агрессивность. В последние годы усилия морфологов и онкологов направлены на выявление дополнительных прогностических признаков, которые позволят выяснить причины различного поведения опухолей при одинаковой клинической стадии и степени дифференцировки Хорошо известно, что течение болезни, опухолевая профессия, ответ на определенные виды лечения у пациентов с одной и той же клинической стадией и морфологической формой рака часто бывает различен. Кроме того, желательно именно на ранних стадиях заболевания определить те характеристики опухоли, которые могут указывать на ее биологическую агрессивность и, исходя из этого, планировать необходимость того или иного метода лечения. Благодаря успехам современной молекулярной биологии становятся ясными новые ключевые точки канцерогенеза и параметры опухолевых клеток, влияющие на течение болезни и ответ на терапию. Как известно, оценить биологическую агрессивность первичной опухоли можно, исследуя показатели ее пролиферативной активности , активности апоптоза , состояние ряда основных регуляторных рецепторов и систем. Для этого, различными современными молекулярно-биологическими методами (иммуногисто- и иммуноцитохимия, гибридизация in situ, полимеразная цепная

реакция, лазерная микродиссекция, секвенирование, микрочиповые технологии и т.д.), исследуются белки - регуляторы клеточного цикла, гены-супрессоры опухолей и их продукты, белки, регулирующие запрограммированную клеточную гибель, многочисленные факторы роста и их рецепторы, интерлейкины, цитокины и многие другие регуляторные системы клетки. Помимо вышеперечисленного, биологическая агрессивность опухолей проявляется в инвазивном росте и метастазировании. Эти качества опухолевых клеток связаны с изменением их адгезивных свойств, появлением способности проникать в лимфатические и кровеносные сосуды, продуцируя повышенное количество протеаз и разрушая внеклеточный матрикс, влияя на паренхиматозно-стромальные взаимоотношения. Значительные успехи исследований в области клеточной биологии показывают ключевую роль взаимодействия опухолевых клеток и стромы в процессе метастазирования и опухолевой прогрессии. Современные данные молекулярно-биологического изучения опухолей указывают на целый ряд факторов, влияющих на поведение опухоли, но многие из них исследованы или на клеточных культурах или на незначительных выборках с учетом морфологических и клинических данных. В большинстве исследований изучены и сопоставлены с гистологической формой и клиническими данными характеристики, отражающие лишь один из параметров, связанных с биологической агрессивностью новообразования, например, только пролиферативная активность или состояние молекул адгезии, или активность некоторых ферментов, участвующих в деградации клеточного матрикса и т.д До настоящего времени количество работ, в которых был бы изучен широкий спектр маркеров, отражающих различные проявления биологической агрессивности опухоли, незначительно. Кроме того, в настоящее

время не определена панель иммуногистохимических маркеров, характеризующих биологическую агрессивность опухоли, которая была бы необходима и достаточна для проведения стандартного исследования биопсийного или операционного материала как для научного, так и для практического диагностического изучения характеристик конкретной опухоли

Изучение способности опухолевых клеток к инвазии и метастазированию особенно на ранних стадиях имеет не только теоретический интерес, но и может дать возможность для прогноза течения болезни и корректировки лечения, а также указать направления создания новых препаратов для быстро развивающейся таргетной терапии. Цель исследования

Изучение комплекса параметров, определяющих биологическую агрессивность опухоли и создание алгоритма исследования, определяющего инвазивный и метастатический потенциал эпителиальных неоплазий, на примере карцином разных локализаций и разного гистогенеза: рака легкого (плоскоклеточного и железистого), аденогенного протокового рака молочной железы, переходноклеточного рака мочевого пузыря, светлоклеточного рака почки, плоскоклеточного рака шейки матки. Задачи исследования

1 изучить экспрессию показателей пролиферативной активности, маркеров апоптоза, генов-супрессоров в материале первичной опухоли в раках нескольких локализаций и разных гистологических форм, в группах опухолей с метастазами и без метастазов,

2 изучить экспрессию ряда металлопротеиназ и их ингибиторов в тех же группах;

3. изучить экспрессию молекул адгезии в тех же группах;

4. на основе сравнительного анализа экспрессии изученных групп маркеров определить наиболее значимые из них для карцином разного гистогенеза и локализаций;

5. провести многофакторный анализ исследованных молекулярно-биологических маркеров и провести корреляции между выявленными значимыми маркерами;

6. сформировать алгоритм определения метастатической активности карцином изученных локализаций для применения в практических диагностических исследованиях;

7. провести исследование новых потенциальных маркеров биологической агрессивности опухоли.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение широкого спектра иммуногистохимических маркеров, отражающих различные аспекты биологической агрессивности эпителиальных опухолей разных локализаций (молочная железа, легкое, мочевой пузырь, почка, шейка матки) с учетом гистологического строения (плоскоклеточный рак, аденогенный рак, переходнокпеточный рак), т.е. с учетом основных морфологических типов.

Впервые на раках различных локализаций и гистологических типов проведено сопоставление показателей метастатической активности опухолей (состояние молекул адгезии, металлопротениназ и их ингибиторов) с показателями пролиферативной активности опухолей, маркерами апоптоза, активностью некоторых генов-супрессоров, рецепторов семейства

эпидермального фактора роста в группах рака разной локализации с наличием или отсутствием метастазов.

Проведены корреляции между пролиферативным потенциалом опухолей и наличием метастазов, между показателями метастатической активности карцином и метастазами в регионарные лимфатические узлы.

Впервые разработан оригинальный объективный автоматизированный метод оценки количества тенасцина в гистологических срезах при иммуногистохимическом окрашивании

На основе проведенного многофакторного анализа впервые выделены наиболее значимые иммуногистохимические маркеры для определения пролиферативного и метастатического потенциала эпителиальных опухолей На основе этого анализа впервые создан оригинальный алгоритм проведения уточняющей диагностики метастатической активности эпителиальных новообразований, включающий исследование экспрессии матриксных металлопротеиназ 1, 2, 9, тканевых ингибиторов метаплопротеиназ 1 и 2, Е-кадгерина, бета-катенина, С044, коллагена IV типа, тенасцина. Практическая значимость

Сформирован алгоритм исследования биологической агресивности и метастатического потенциала карцином различных локализаций и гистологических форм, что создает основу для выработки индивидуального прогноза течения заболевания и позволит разрабатывать адекватные схемы терапии Определение предлагаемых показателей рекомендуется проводить в крупных региональных онкологических научно-практических центрах.

Выявленные новые аспекты определения метастатического потенциала опухолей, особенно на ранних стадиях, позволят в будущем не только

определять прогноз течения болезни и корректировать соответствующую терапию, но и указывают возможные направления для создания препаратов таргетной терапии.

Обнаруженные корреляции между экспрессией матриксных металлопротеиназ, молекул адгезии и наличием метастазов карцином разных локализаций и гистологических типов вносят значительный вклад в исследование механизмов канцерогенеза.

Созданная новая методика автоматизированного определения количества тенасцина в гистологических срезах при проведении иммуногистохимического исследования позволяет объективно определять количественное содержание одного из ключевых маркеров метастазирования. Методика рекомендуется для применения в патологоанатомических отделениях онкологических центров и научно-исследовательских институтов.

Апробация работы

Основные результаты исследований доложены на ряде всероссийских и международных конференций и съездов: I Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность ", Россия, Москва, 2004г., II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность ", Россия, Москва, 2005г., Съездах онкологов СНГ - Белоруссия, Минск, 2004г., Азербайджан, Баку, 2006г., IV Всероссийском съезде онкологов, Россия, Ростов-на -Дону, 2005г., Всероссийской научно-практической конференции "Высокие медицинские технологии", Россия, Москва, 2006г., 20 Европейском конгрессе патологии, Франция, Париж, 2005г., XXV Международном конгрессе Международной академии патологии, Австралия, Брисбен, 2004г, XXVI

Международном конгрессе Международной академии патологии, Канада,

Монреаль, 2006г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 60 печатных работ, их них - 1 книга, 1 глава в Руководстве, 4 пособия для врачей, 2 статьи в зарубежных сборниках и 11 статей в зарубежных журналах Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 292 страницах машинописного текста и состоит из Введения, главы 1 «Обзор литературы», главы 2 «Материалы и методы», главы 3 «Результаты собственных исследований», главы 4 «Обсуждение результатов» и Выводов. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 207 рисунками. Библиографический указатель включает 377 источников (20 отечественных и 357 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужил операционный материал пациентов, проходивших лечение в МНИОИ им.ПАГерцена. Исследование проводилось на карциномах 5 локализаций - молочная железа, легкое, мочевой пузырь, почка, шейка матки Материал был разделен по группам с учетом гистологической формы рака, клинической стадии, степени дифференцировки, наличия (Ы+) или отсутствия (N0) метастазов в регионарные лимфатические узлы при раке молочной железы, раке легкого и раке мочевого пузыря или отдаленных метастазов для рака почки. Всего было исследовано 218 образцов, разделенных на группы (Таблицы 1 - 5)

Таблица 1.Опухоли молочной железы (64 случая).

Гистологическа я форма Стади я Степень злокачествен ности N0

Аденогенный протоковый рак 2А,2Б II (6-7) баллов 32 32

Таблица 2 Опухоли мочевого пузыря (42 случая).

Гистологическая форма Степень дифференцировк и N0

в2 вз

Переходноклеточны й рак Т2, ТЗ 22 8 12 17 25

Таблица 3. Опухоли легкого стадии 2В (60 случаев).

Степень

Гистологическая форма дифференцировк и N+ N0

в/д у/д н/д

Плоскоклеточный рак 24 4 15 5 12 12

Аденоллоскоклеточный 6 8 с 10 10

рак 20

Аденокарцинома 16 6 5 5 8 8

Таблица 4. Опухоли почки IV стадии (22 случаев)

Гистологическая форма дифс| Степень зеренци эовки м+ МО

в/д у/д н/д

Светлоклеточный рак 12 10 11 11

Таблица 5. Опухоли шейки матки 1В стадии (30 случаев).

Гистологическая форма дифс) Степень >еренци ровки N+ N0

в/д н/д cis

Плоскоклеточный рак 10 10 10 10 20

Метод иммуногистохимического исследования

Для иммуногистохимического исследования были использованы 23 коммерческих моно- и поликлональных антитела и 3 некоммерческих новых антитела, предоставленных разработчиками, разделенные на группы по фнкциональной значимости-

- маркеры пролиферативной активности - РСМД, «¡67, циклин 01, рецепторы эпидермального фактора роста НЕЯ2/пеи, ЕСЯ!}, рецепторы стероидных гормонов - эстрогеновые ЕЯ и прогестероновые РдЯ,

- маркеры апоптоза Вс12, Вс1Х, С095,

- супрессоры опухолевого роста - р53, р16,

- матриксные металлопротеиназы ММР-1, ММР-2, ММР-9 и их тканевые ингибиторы Т1МР-1 и Т1МР-2,

- молекулы адгезии - Е-кадгерин, бета-катенин, С044,

- компоненты внеклеточного матрикса - тенасцин, коллаген IV типа, ламинин,

- новые маркеры опухолувого роста - протимозин альфа, протеинкиназа МАК\//Н11ЫК, танкираза 2.

Условия проведения реакций (метод восстановления антигенной активности и использованные разведения антител) представлены в таблице (Таблица 6).

Таблица 6. Использованные антитела.

Наименование Фирма производитель Разведение Условия демаскировки

ЕЯ моноклональные Оако 1:35 121°,рН 6 0 цитратный буфер

РдЯ моноклональные Оако 1:50 121°,рН 6 0 цитратный буфер

РСМД моноклональные Оако 1:200 121°,рН 6.0 цитратный буфер

Ki-67(MIB.1) моноклональные Dako 1:40 121°,рН 6.0 цитратный буфер

P53(D07) моноклональные Dako 1:70 121°,рН 6.0 цитратный буфер

Bcl2 моноклональные Dako 1 40 121°,рН 6.0 цитратный буфер

Екадгерин моноклональные Dako 1:100 121°,рН 6 0 цитратный буфер

В-катенин моноклональные Dako 1:200 121°,рН 6 0 цитратный буфер

Тенасцин поликлональные Dako 1.30 Протеиназа К

EGFR моноклональные Dako RTU Протеиназа К

Коллаген IV моноклональные Dako RTU Протеиназа К

CD44 моноклональные Dako 1:50 121°,рН 6.0 цитратный буфер

Р16 моноклональные Dako RTU 121°,рН 6 0 цитратный буфер

сегЬВ2 поликлональные Dako 1:200 121°,рН 6.0 цитратный буфер

Ламинин поликлональные Dako 1.30 121°,рН 6.0 цитратный буфер

Циклин D1 моноклональные Pick Cell Laboratories 1:200 121°,рН 6.0 цитратный буфер

BclX моноклональные NovoCastra 1:50 Протеиназа К

ММР1 моноклональные NovoCastra 1-5 121°,рН 6 0 цитратный буфер

ММР2 моноклональные NovoCastra 1-40 121°,рН 6.0 цитратный буфер

ММР9 моноклональные NovoCastra 1:20 Без обработки

TIMP1 моноклональные NovoCastra 1.20 121°, рН8.0 ЭДТА буфер

TIMP2 моноклональные NovoCastra 1.30 121°, рН8.0 ЭДТА буфер

CD95 моноклональные NovoCastra 1:10 121°, рН8.0 ЭДТА буфер

Протимозин а моноклональные н Ин-т им. Белозерского МГУ 1-150 Без обработки

Протеинкиназа MAKV/HANK моноклональные Институт биологии гена 50нг/мл Без обработки

Танкираза 2 Моноклональные Ин-т им Белозерского МГУ 1 50 рНбО

Материал для исследования методами иммуногистохимии и гибридизации in situ фиксировали 10% нейтральным формалином в течение 24 ч., заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 18 часов. Восстановление антигенной активности проводили в миниавтоклаве «21 OORetrieval» («Pick Cell») при температуре 121°С в течение 20 мин. и последующим остывании 90 мин. Восстановление проводили в цитратном буфере pH 6,0 или в ЭДТА-буфере pH 8,0, для некоторых антител использовалась протеазная обработка (Таблица 6). В качестве детекционной системы применяли систему «EnVision» («Dako»), в качестве хромогена -диаминобензидин и АЕС. Для получения результатов пригодных для количественной обработки реакции проводили с помощью автоматического иммуногистостейнера «Avtosteiner Dako».

Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме ( ММР, TIMP) и на мембранах клеток (молекулы адгезии) оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3 с помощью анализатора изображения «Leica Q550», учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 -отсутствие реакции, 1 - слабая реакция, 2 - умеренная реакция, 3 - сильная реакция При оценке реакции с антителами к HER2/neu и EGFR использовали общепринятую для фармакодиагностики шкалу оценки от 0 до 3+ (Jacobs T.W et al., 1999).

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki67, р53, bcl2, рецепторы эстрогенов и прогестеронов и др.) оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения и

выражая полученные результаты в процентах. Маркеры пролиферативной активности расценивались на основе наиболее часто употребляющегося способа оценки пролиферативной активности:

1) 0% - 20% - низкая пролиферативная активность,

2) 21% - 50% - умеренная пролиферативная активность,

3) 51% -100% - высокая пролиферативная активность

Для количественной оценки площади ткани опухоли, содержащей тенасцин, нами была разработана методика с использованием анализатора изображения и модифицированной компьютерной программы

Всего было оценено более 5000 препаратов с иммуногистохимическими реакциями

Метод in situ гибридизации

Были использованы два варианта метода гибридизации in situ -флуоресцентная и хромогенная in situ гибридизация на парафиновых срезах.

Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) применялся для определения амплификации гена HER2/neu при исследовании рака молочной железы и уротелиального рака. Срезы получали с тех же парафиновых блоков, которые использовались для иммуногистохимического исследования, и перед проведением исследования высушивали при температуре 560С в течение 18 часов. Если при оценке экспрессии белка HER2/neu получали результат 2+ по трехбалльной шкале, то с помощью наборов для флуоресцентной гибридизации фирм «Dako» и «Vysis (Abbott)» и использованием автоматического гибридайзера «Hybridazer Dako» определяли наличие амплификации гена HER2/neu. После соответствующих операций по подготовке срезов денатурацию проводили при температуре 82°С («Dako») или 95°С

(«Vysis»), гибридизацию - при 45°C(«Dako») или 37°C(«Vysis») в течение 20 часов. Результаты оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioscop 40» («Zeiss») с телекамерой «Axiocam» с использованием двойного фильтра для красителей FITC и Texas Red: подсчитывали количество зеленых меток, связанных с центромерным участком 17 хромосомы и количество красных меток, связанных с геном HER2/neu. Наличие или отсутствие амплификации определяли по соотношению к расных ( ген HER2) и зеленых сигналов (центромерный участок), амплификация считалась обнаруженной при соотношении больше чем 2,2.

Метод хромогенной гибридизации in situ (CISH) использовали для определения наличия ДНК вируса папилломы человека в клетках плоскоклеточного рака шейки матки и уротелиального рака. Использовали детекционные наборы «Микровирус ВПЧ» (Экспериментальное медико-биологическое производство Кардиологического научно-производственного центра. Россия) и «Rembrandt HPV»(PathPan, Нидерланды). Исследование проводили так же с использованием автоматического гибридайзера. После ферментативной предобработки парафиновых срезов раствором пепсина или протеиназы К и нанесения зондов к ВПЧ разных типов (общему, 6,11, 16,18, 31, 33) денатурацию ДНК проводили при 95°С, а гибридизацию - при 37°С в течение 16-18 часов. В качестве хромогена использовали краситель АЕС Реакцию оценивали с помощью анализатора изображения «Leica Q550IW».

Метод автоматизированной количественной оценки экспрессии тенасцина.

Интенсивность экспрессии тенасцина оценивали путем измерения площади среза, занятой положительной реакцией с антителами к тенасцину

Материал фиксировали 10% формалином в течение 24 часов и заливали в парафин ИГХ исследования проводили на срезах толщиной 4 мкм, используя антитела к тенасцину (DAKO) и детектирующую систему EnVision Реакцию проводили в стандартных условиях в иммуногистостейнере Avtostainer DAKO. Полученные препараты докрашивали гематоксилином

Для получения цветного изображения использовали световой микроскоп LEICA DMRB, сопряженный с телекамерой ProgRes 3012 и компьютером.

Изображения захватывались при увеличении х100, что соответствовало размеру поля зрения 1,28x0,98 мм2 при разрешении 1440x1100 пикселей С каждого микропрепарата захватывалось по 3 наиболее репрезентативных поля зрения Все изображения захватывались с одинаковыми настройками микроскопа, телекамеры и балансировки белого цвета, что позволяет проводить последующее сравнение изображений Цветовые и контрастные расхождения между компьютерным изображением и визуальной картиной участка микропрепарата были минимальными.

Перед определением площадей, занимаемыми элементами изображения необходимо искусственно провести между ними четкие границы. Это было сделано с использованием инструментов программы Adobe Photoshop 7,0 с последующей ручной корректировкой. Для этого изображение открывалось в программе A dobe Р hotoshop и дублировалось в дополнительный слой . Все дальнейшие процедуры п роводились на дополнительных слоях Результаты каждого ш ara обработки сохранялись в своем слое, что позволяло вносить корректировку в сложных случаях. Исходное изображение (слой «Bakground») служило для визуальной оценки правильности последующей разметки

препарата. Далее осуществлялись следующие последовательные шаги обработки изображения

1. регулировка яркостно-контрастных параметров, позволяющая визуализировать слабую реакцию и, по возможности, удалить фон,

2. сдвиг цветов изображения для повышения цветового контраста изображения и облегчения визуального выделения участков со слабой окраской белка,

3. размывание изображения для получения более равномерной окраски участков ткани, содержащих тенасцин,

4. использование маски нерезкости для подчеркивания гр аниц между различно окрашенными участками опухоли,

5. выделение всех участков изображения без реакции,

6. инвертация выделения: выделенными оказываются структуры, содержащие тенасцин,

7. контроль точности выделения на исходном изображении (слой Background).

8. сохранение окончательного выделения в а-канале,

9 создание пустого слоя: инструментом Edit\Fill закрашиваем выделение красным цветом, инвертируем выделение и инструментом Edit/Fill закрашиваем его голубым цветом.

Таким образом, получено изображение, где все структуры, содержащие тенасцин, закрашены красным цветом, не содержащие - голубым; при этом отсутствует оптическая гетерогенность внутри соответствующих областей изображения. Граница между структурами четкая, структуры однозначно определяются программами анализа изображений. Правильность выделения

компонентов изображения проверяется визуально по исходному изображению при изменении в панели "Layers" прозрачности (Opacity) рабочего слоя, либо после добавления выделения из а-канала

Результирующий файл содержит всю информацию о процессе обработки изображения, что позволяет оперативно возвращаться к любому этапу для эффективной корректировки

С использованием этого метода была определена площадь с положительной реакцией к тенасцину во всех группах опухолей молочной железы и легкого.

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ проводили с использованием программы Excel с пакетом анализа данных по методам, описанным в книге «Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel» (Лапач С.Н., Чубенко А В., Бабич П Н, 2000г). Применяли также корреляционный анализ по Пирсону При анализе корреляции метастазирования с экспрессией антигенов считали ее незначимой при значении модуля коэфиициента корреляции от 0 до 0,3; значимой - от 0,3 до 0,75 и высокой - выше 0,75.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение панели иммуногистохимических маркеров в раках легкого трех гистологических типов - плоскоклеточного, аденоплоскокпеточного и аденогенного выявило, что при плоскоклеточном раке (Рис.1) в группе с метастазами отмечается достоверное увеличение пролиферативной

¡Экспрессия антигена в _ % исследованных опухолей]

* РСНАЙТ»

■ Т1МР2 «--рвЗ !

Т1МР1

т /■.....

/i--.fi,; ммрв £ г;—г--.

ИЧГЧ/ -

ММР2

Ч'

Ж

ММР1 еет

Щтшп РСМА8гф5зд

Циклин 01 ЦМР1 V

л т ш

Циклин 01

ММР2

ММР1

§»- гС-егЬВ-2 дагж

Ш:

Ы+

М-

Рис. 1 Экспрессия антигенов в плоскоклеточном раке легкого в группах с метастазами и без метастазов.

активности:экспрессия РСЫА в среднем составляет 68%, №-67 - 46,5%, в тоже время в группе N0 эти значения существенно ниже - РСМД - 55% и «¡-67 - 28%. Более половины образцов группы Ы+ имели значения РСМ выше 50%. Значительно усиливалась экспрессия циклина 01: с 9 до 21,8%. Образцы с экспрессией р53 отмечены в обеих группах, но в группе с метастазами она увеличена до 42%. Экспрессия р16 в обеих группах имела неоднородный характер, хотя число образцов с положительной реакцией в группе Ы+ возрастало. Ингибитор апоптоза Ьс!2 имел низкую экспрессию в обеих

группах.Экспрессия рецепторов эпидермального фактора роста (ЕвРР,

ре™3™01' ЕШ 0/1 + Ш 2 +

13+

Е-кадгерин

МТЭ +

МТв-

мтв+

100%

100%

Рис.2 Экспрессия молекул адгезии в плоскоклеточном раке легкого в группах с метастазами и без метастазов

Интенсивность ГГ.^Г] 0/1 + реакции [¿¡¿£1и

ЕМ?

Реакция в клетках опухоли

|з+

СБ 44

-г;;;-:; или

4:>\ ~7Р ШКХИ .

, . ...итГ''"' г" • .ии.-М* »;»,л»

100%

Реакция во внеклеточном матриксе

Рис. 3 Экспрессия молекул адгезии в плоскоклеточном раке легкого в группах с метастазами и без метастазов. Реакция в клетках опухоли и внеклеточном матриксе.

НЕЯ2/пеи) также была низкой в обеих группах Наиболее резкие отличия по

Рис.4.Количественная оценка экспрессии тенасцина в опухолях легкого с метастазами и без метастазов

иммуногистохимическому профилю выявлены в экспрессии ММР-2 и ММР-9. в фуппе с метастазами их интенсивная экспрессия отмечена в большинстве образцов. Экспрессия TIMP-2 достоверно снижается в группе N+. В группе без метастазов были отмечены случаи высокой экспрессией одной или нескольких исследуемых протеаз. Надо отметить, что во многих случаях наиболее интенсивная реакция с ММР наблюдалась по периферии опухолевого комплекса, что указывает на выход протеаз из клеток опухоли в внеклеточный матрикс, что ведет к его деградации и метастазированию опухоли. Экспрессия ММР1 и TIMP1 в обеих группах практически не отличается.

Экспрессия основных молекул адгезии Е-кадгерина и бета-катенина в группе с метастазами значительно снижена и не имеет интенсивной экспрессии (3+) на мембранах клеток. В этой группе отмечено появление цитоплазматической и ядерной реакции с бета-катенином, что указывает на нарушения в \Л/п1-сигнальном пути В то же время на рис.2 хорошо видно, что если группа с метастазами довольно однородна, то в группе без метастазов отмечены образцы со значительным снижением экспрессии Е-кадгерина и бета-катенина (Рис 2). В части этих образцов отмечена и усиленная экспрессия ММР2 и ММР9. В тоже время экспрессия неспецифической молекулы адгезии СД44 в клетках метастазирующих опухолей увеличивается, при сохранении ее уровня во внеклеточном матриксе (Рис.3). Определение количества тенасцина в образцах опухолей показало его достоверное увеличение в группе с

(экспрессия антигена в ||| % исследованных опухслей|

г--- РСНАМЛЯ'

¡75- Т1МР2 8^1)53

Циклин 01

ММР9 I ММР2

ш

ММР1

Щ. ЕвРЙ

Ьс12;12 ,р<гЬВ-2 ;|!д

Ьс12ЙЯ

ММР1»г» ж»С-егЬВ-2.»эта

ы-

Рис. 5 Экспрессия антигенов в аденоплоскоклеточном раке легкого в группах с метастазами и без метастазов.

метастазами (Рис.4) Анализируя эту панель антител в аденоплоскоклеточном и аденогенном раках можно отметить, как сходные тенденции, так и различия (Рис.5) Показатель пролиферативной активности РСЫА, как и для плоскокпеточного рака увеличивается в группе с метастазами, еще более

Интенсивность реакции

А, 3» .ц-1

0/1+ Н2+ Нз+

Е-кадгерин

МТЭ+

мтэ-

МТ8 +

МТБ*

иврйРЯ

гл* ч>.чг у Иг <•

0%

В-катенин юо%

■« --1 »*„■>.«>••»-.* л к».«-»„

О;

.,1

о%

100%

Рис. б.Экспрессия молекул адгезии в аденоплоскоклеточном раке легкого в группах с метастазами и без метастазов.

существенной становится разница по экспрессии цикпина Д1 и появляется увеличение положительных случаев с экспрессией р16. Значимым параметром для аденоплоскоклеточного рака становится экспрессия ЕвР^ что связано с появлением аденогенной диференцировки. Для экспрессии молекул адгезии можно отметить изменения сходные с группой плоскоклеточного рака -снижение экспрессии Е-кадгерина и бета-катенина в группе с метастазами (Рис.6, 7) Уровень ММР2 и ММР9 в группе с метастазами также увеличивается.

Интенсивность реакции

110/1+ ЕЦ2+ Из+

Реакция в клетках опухоли

СБ 44

мтв+

рЖЖШЩрЩР!^

0%

Реакция во внеклеточном мэтриксе

чг

100%

МТЗ+

щаш&ш

пт^.-.т'гг-;7*Г:!??-тГИТГТчТГ^—г-;:-;-™-;"*«—■ р: , .л; «"«м

о%

100%

Рис. 7 Экспрессия молекул адгезии в аденоплоскокпеточном раке легкого в фуппах с метастазами и без метастазов. Реакция в клетках опухоли и внеклеточном матриксе

.(Рис.5) В аденогенном раке усиливаются тенденции, отмеченные для

¡■БМР2 -- -рбЗ Ш,

тидач

Цикпин СИ Т1МР1

Р

! Экспрессия антигена в % иоспедованных опухолей I

ЙТ1МР2 «Ц,

-

/ -V л

£\ \

I 41; Щ§ 1 I

/ г\ У \

!клин 01

цикл

р16

ез 47

ЬсйЧТЗГ

ы-

Рис 8 Экспрессия антигенов в аденогенном раке легкого в группах с метастазами и без метастазов

аденоплоскоклеточного рака: значительное увеличение уровня ММР-1, экспрессии ЕбЯВ и циклина 01 в группе с метастазами мы. (Рис.8) Изменения молекул адгезии имеют характер, схоный с плоскоклеточным и аденоплоскоклеточным раком. Ддля этих гистологических типов рака легкого в группе без метастазов отмечены случаи с ИГХ профилем исследуемых антител, сходным с группой с метастазами. Проведенный корреляционный анализ показал, что наиболее высокие коэффициенты корреляций с наличием метастазов для немелкоклеточного рака легкого в целом дают следующие маркеры - р 53, РС М, «¡67, циклин Д 1, ММР 2, ММР 9, ММР 1, тенасцин , Е -кадгерин, бета-катенин, СЭ44, но наиболее высокие они для металлопротеиназ и молекул адгезии (Рис.9).

р53 РСМД Ю 67 Сус1т 01 ММР 1 ММР 2 ММР 9 Т1МР 1 Т1МР 2 Теп Е-кад В-кат СО 44

0 2 0 4 0.6 0.8 1

модуль коэффициента корреляции

Рис. 9 . Коэффициенты корреляции между уровнем экспрессии антигенов в опухолях легкого и наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы

Исследование характеристик аденогенного протокового рака молочной железы, показало, что независимо от локализации для аденогенного рака (легкое и молочная железа) в опухолях с метастазами отмечается усиление активности исследованных металлопротеиназ и снижение уровня ингибиторов (Т1МР1 и Т1МР2). Наиболее значительное увеличение уровня экспрессии отмечено для ММР2 и ММР9, ММР1 увеличивается несколько слабее (Рис.10). Экспрессия Е-кадгерина и бета-катенина в группах с метастазами значительно снижена, а С044 увеличена аналогично раку легкого, надо отметить, что не

Опухоли с метастазами

Экспрессия антигена в % исследованных опухолей'

Опухоли без метастазов «ШР,Ц Рак молочной железы ММР1Ш

Е-сай

Рак легкого

лмраСК] Т1МР1

Рис 10. Сравнительная экспрессия антигенов в опухолях легкого и молочной железы с метастазами и без метастазов.

найдено достоверных отличий внутри групп с метастазами и без метастазов с

0/1 +

!2 +

13 +

Е-кадгерин

100%

Рис 11.. Экспрессия молекул адгезии в раке молочной железы в группах с метастазами и без метастазов.

реакции*И°СТЬ SH0/1+ ЦП 2+ НЗ + Реакция в клетках опухоли

CD 44

0%

100%

Рис. 12. Экспрессия СО 44 в раке молочной железы в группах с метастазами и без метастазов. Реакция в клетках Опухоли и внеклеточном матриксе.

гиперэкспрессией НЕИ2/пеи (Рис 11, 12). Однако, в группе без метастазов при

Рис. 13 Количественная оценка экспрессии тенасцина в опухолях молочной железы с метастазами и без метастазов.

р53 РСЫА ИЗ 67 Нет 2 ММР1 ММР2 ММР9 Т1МР1 Т1МР2 Е-кад В-кат СР44

О 0.2 04 06 08 1

мод/ль коэффициента корреляции

Рис. 14. Коэффициенты корреляции между уровнем экспрессии антигенов в опухолях молочной железы и наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы.

наличии гиперэкспрессии НЕЙ2/пеи наблюдаются случаи по своему иммуногистохимическому профилю сходные с показателями группы с метастазами. Количественное определение тенасцина выявило его существенное (практически в 2 раза) увеличение в образцах опухолей с метастазами, что показывает на универсальность этого критерия независимо от гистологической формы рака и его локализации (Рис.13). Корреляционный анализ, показал, что наибольшие коэффициенты с наличием метастазов получены для молекул адгезии, ММР2, ММР9 (Рис 14). Интересно отметить, что уровни экспрессии р53 и РСМД имеют незначимые коэффициенты корреляций, лишь для К|67 этот коэффициент попадает в группу значимых, но не высоких. Это показывает, что высокая пролиферативная активность является лишь одной из характеристик биологической агрессивности опухоли, и в целом, поведение опухоли определяется многими параметрами. Различий в экспрессии маркеров апоптоза в группах и N0 найдено не было. Исследование иммуногистохимических характеристик переходноклеточного рака мочевого пузыря показало, что несмотря на то, что опухоль происходит из другого типа эпителия - переходноклеточного, в опухолях метастазами отмечены те же изменения биологических свойств, связанных с метастатической активностью, что и для плоскоклеточного и железистого рака других локализаций - происходит увеличение среднего значения экспрессии маркеров пролиферативной активности, генов-супрессоров р53 и р16. Но наиболее значительно увеличивается экспрессия ММР2 и ММР9, экспрессия ММР1 меняется незначительно, экспрессия ингибиторов практически не изменяется. Гиперэкспрессия рецепторов эпидермального фактора роста

отмечена в группах, как с метастазами, так и без метастазов (Рис.15). Корреляционный анализ показал, что показатели пролиферативной активности и р53 имеют значимые, но низкие коэффициенты корреляций с наличием метастазов, тоже относится и к ММР1 Наиболее значимые показатели характерны для ММР2, ММР9, Е-кадгерина и бета-катенина, СЭ44. (Рис.16)

Рис. 15. Экспрессия антигенов в раке мочевого пузыря в группах с метастазами и без метастазов.

N4-

I Экспрессия антигена в р} % исследованных опухолей

Е-сай&В-кгй

ш РСМАш

ММР2&ММР9

ш

ММР1

,EGFR

{те' ,

С-егЬВ-2 Й*

т

Е-сас1&В-ка1

Ш

ММР2&ММРЭ

Циклин 01

^ Ж

т

ММР1

ЕвРИ

С-егЬВ-2?14. ■нншйак

Изучение взаимосвязи исследуемой панели антител в переходнокпеточном раке мочевого пузыря разной степени дифференцировки показало, что более высокая экспрессия металлопротеиназ отмечается в

СусНп

ММР 1 ММР2 ММР 9 Т1МР 1 Т1МР2

Е-кад В-кат СО 44

р53 РСМ К| 67

Теп

О

02

0.4

Рис 16. Коэффициенты корреляции между уровнем экспрессии антигенов в опухолях мочевого пузыря и наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы

низкодифференцированных карциномах с высокой пролиферативной активность и низкой экспрессией Ьс12 (Рис. 17) В этих же случаях отмечено снижение экспрессии Е-кадгерина и бета-катенина.

Для подтверждения роли металлопротеиназ и их ингибиторов, как важнейших маркеров метастатической активности эпителиальных опухолей независимо от типа эпителия и локализации опухоли, экспрессия металлопротеиназ и их ингибиторов была изучена также в плоскоклеточном раке шейки матки и светлоклеточном почечноклеточном раке Полученные результаты также

Рис. 17. Экспрессия антигенов в раке мочевого пузыря разной степени дифференци-ровки

¡Экспрессия антигена в % исследованных опухолей] Инвазивные карциномы, Н/Д

Т1МР1

ММР1.

р16

4Н?

Циклин 0'\

___\

л-, Ь с 12^1%

Ш Ь01х||1 #

Инвазивные карциномы, У/Д

ПЛ Ы А С

РСЫА&уЬ

Т1МР2

II

Т1МР1

ММР9

¡33 •

ММР1

Циклин 01

х а®

'с» ЕП Ьс12«>

Инвазивные карциномы, В/Д

РСМД

Т1МР2 р16

ММР1,

Циклин 01

л щ

Ьс!х|

ЕЗО»

показывают увеличение уровня экспрессии металлопротеиназ и снижение уровня их ингибиторов в группах с метастазами. В светлоклеточном раке почки выявлена высокая экспрессия всех трех изученных типов ММР при значительном снижении уровня Т1МР1 (Рис.18). При этом уровень Т1МР2

метастазов

практически не меняется, что, возможно, связано с многофункциональной ролью этого ингибитора. При плоскоклеточном раке шейки матки также отмечено значительное усиление активности ММР2 и ММР9 - в 70%, а ММР1 экспрессируется в 40% случаев. Анализ связи активности ММР и степени дифференцировки опухоли показал, что в низкодифференцированных раках в группе без метастазов наблюдается более высокий уровень протеаз, в том числе и ММР1. Возможно это указывает на более раннюю активацию ММР1, которая в свою очередь может активировать другие протеазы.

Сравнение результатов полученных для карцином разных гистологических типов и локализаций однотипных по индексу Т, но различающихся между собой наличием метастазов показало наличие общих закономерностей- в группах с метастазами повышается экспрессия ММР2 и ММР9, а в раке легкого, молочной железы и почки - и уровень ММР1, экспрессия Т1МР1 снижается. Во всех локализациях и гистологических типах рака происходит значительное снижение или потеря экспрессии Е-кадгерина и бета-катенина при одновременном увеличении экспрессии С044. В группах с метастазами отмечается увеличение пролиферативной активности клеток, но взаимосвязь этого параметра с наличием метастазов довольно слабая (коэффициент корреляции около 0,3), экспрессия маркеров апоптоза также снижается, но не всегда достоверно. Наличие метастазов коррелирует также с увеличением количества тенасцина в строме опухоли и эта характеристика опухоли так же не связана с гистологическим типом рака и его локализацией. Все эти результаты говорят об общих механизмах инвазии и метастазирования для эпителиальных опухолей. Но ни один из этих параметров не в состоянии отдельно прогнозировать биологические свойства рака и наиболее достоверным показателем является комплекс характеристик - сумма из 10 показателей дает наиболее высокий коэффициент корреляции (близкий к 1 - 0,86) с наличием метастазов (Рис.19) Перекрывающиеся зоны этого графика, вероятно, отражают разнородность группы без метастазов - в каяодой локализации в этой группе были отмечены случаи по своему ИГХ профилю сходные с группой метастазами и поиск дополнительных характеристик для группы с метастазами По-

Рис. 19..Распределение опухолей молочной железы с метастазами и без метастазов в зависимости от суммарного показателя по 10 антителам.

видимому, опухоли без метастазов с характеристиками сходными с группой с метастазами обладают более высоким метастатическим потенциалом, но еще не реализованным к моменту исследования Таким образом, предложенная иммуногистохимическая панель антител может позволить на ранней стадии выделять опухоли с более высокой метастатической активностью, хотя наличие различий по значимости некоторых маркеров показывает, что и эта панель не является окончательной.

Выводы

1 Пролиферативная активность имеет четкую связь со степенью дифференцировки опухоли, однако отмечен относительно невысокий коэффициент корреляции (до 0,6) с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы независимо от локализации рака (молочная железа, легкое, мочевой пузырь) и гистологического типа (плоскоклеточный, аденогенный, переходноклеточный).

2. Уровень экспрессии генов-супрессоров р53 и р16 прямо коррелирует с метастатической активностью опухолей легкого и мочевого пузыря Для рака молочной железы подобной корреляции не обнаружено.

3. Установлено, что уровень маркеров апоптоза является низким как в Фуппах без метастазов, так и в группах с метастазами всех изученных локализаций, то есть не связан с метастатическим потенциалом опухолей

4. Экспрессия основных факторов инвазии - матриксных металлопротеиназ (ММР-2 и ММР-9), играет важную роль в процессе метастазирования при плоскоклеточном раке легкого и шейки матки, аденогенном раке легкого и молочной железы, переходноклеточном раке мочевого пузыря, светлоклеточном раке почки, т.к выявлена высокая степень корреляции (0,7-0,8) с наличием регионарных и отдаленных метастазов Экспрессия ММР-1 является значимой для метастазирования аденогенного рака (легкое и молочная железа) и светлоклеточного рака почки, в то время как для плоскоклеточного рака (легкое и шейка матки) и переходноклеточного рака (мочевой пузырь) подобной закономерности не обнаружено. Экспрессия тканевого ингибитора металлопротеиназ Т1МР-1 имеет высокую отрицательную связь с наличием отдаленных метастазов

при светлоклеточном раке почки. Значимые корреляции для других изученных локализаций между уровнем экспрессии Т1МР-1 и Т1МР-2 и метастазированием не обнаружены.

5. Мембранная э кспрессия молекул адгезии Е -кадгерина и бета -катенина имеет отрицательную корреляцию (0,7 - 0,8) с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы независимо от гистологического типа и локализации рака. Наличие метастазов ассоциировано с отсутствием мембранной реакции и увеличенным аномальным накоплением бета-катенина в цитоплазме и ядрах опухолевых клеток Экспрессия молекулы адгезии СР44 также увеличена в клетках опухолей с метастазами и остается неизменной во внеклеточном матриксе.

6 Состояние внеклеточного матрикса, оцениваемое по экспрессии компонентов базальных мембран (коллаген IV типа и ламинин) и антиадгезивного гликопротеида тенасцина коррелирует с наличием метастазов независимо от гистологической формы и локализации эпителиальной опухоли: экспрессия коллагена IV типа и ламинина уменьшается, а количество тенасцина увеличивается в 1,5 - 2 раза.

7. Разработанный оригинальный автоматизированный метод оценки количества тенасцина в эпителиальных опухолях позволяет уточнить метастатический потенциал карцином.

8 Наиболее значимыми показателями инвазивного и метастатического потенциала эпителиальных опухолей служат матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы, молекулы адгезии и составляющие внеклеточного матрикса. Основные маркеры инвазивного и метастатического потенциала являются общими для рака разной локализации и лишь частично связаны с его гистологическим типом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты проведенных исследований выявили существенные различия между эпителиальными опухолями с наличием регионарных и отдаленных метастазов и опухолями без метастазов. Основные различия проявляются в экспрессии показателей межклеточной адгезии и компонентов внеклеточного матрикса, а также пролиферативной активности. Эти различия не связаны с локализацией рака и лишь частично связаны с его гистологическим типом Полученные результаты позволяют сформулировать следующие практические рекомендации:

1. Включить методику уточняющей диагностики инвазивного и метастатического потенциала рака в гистологическое исследование опухолей на ранних стадиях онкологического заболевания

2. Уточняющую диагностику биологической агрессивности рака проводить иммуногистохимическим методом с использованием следующей панели монокпональных антител антитела к матриксным металлопротеиназам (ММР-1, ММР -2, ММР -9), тканевым ингибиторам металлопротеиназ 1 и 2 типа, Е-кадгерину, бета-катенину, С044, коллагену IV типа, тенасцину, «¡67.

3. Применение методики уточняющей диагностики должно проводиться на стандартизованном гистологическом материале. При оценке результатов иммуногистихимического исследования необходимо использовать бальную шкалу оценки экспрессии исследуемых маркеров

4 Определение количества тенасцина проводить с помощью предложенного

оригинального метода 5. Полученные биологические характеристики опухоли необходимо учитывать для определения вероятностного индивидуального прогноза течения заболевания и выработки плана лечения

публикации по теме диссертации.

1. Frank G.A , Zavalishina L.E , Manykin A A.UItrastructural investigation of cervical cancer- attempt to find viruses by electron microscopy and in situ hybridizations methods.//9 International congress of virology , Yerusalem, Israel, 1996 p

2 Симонова T.B., Маныкин A.A., Завалишина Л.Э, Франк Г.А., Минкина Г.Н , Определение пролиферативной активности эпителиальных клеток шейки матки и ее корреляция с вирусом папилломы человека (ВПЧ) 16,18 типов.//Русский журнал ВИЧ./СПИД и родственные прблемы, 1997, т.1, №1, с.265

3. Литвинова Л В., Завалишина Л Э. Методика, улучшающая прикрепление парафиновых срезов к предметным стеклам//Архив патологии, 1997,№4, с 63-65.

4. Волченко Н.Н„ Завалишина Л Э., Шимберева И.Б., Франк Г.А. Ядерный белок пролиферирующих клеток (PCNA) и онкопротеин C-erb В-2 в инвазивном раке молочной железы.//Российский Онкологический журнал, 1998, №6, с. 47-49.

5. Маныкин А А., Завалишина Л.Э , Лисицын Ф.В., Ефремова Е В , Раагоз-Риайя М. Использование ПЦР, гибридизации is situ и электронной микроскопии для индикации ВПЧ в материале от больных с дисплазией шейки матки.//Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 1998 т 2, №2, с 55.

6. Manykin А.А, Zavalishina L.E., Lysitcin F.V, Guchina E.A., Korogodin D.V, Efremova E.V., Raygoza-Rraja M.UItrastructural changes in intercellular conjunction of cervical dysplasia tissue.//ICEM-14, 31aug -4sept., Cancun (Mexico) Electron Microscopy-98, v. IV, p.587-588.

7. Manykin A.A., Zavalishina L.E., Sharapova E.I., Lysitcin F.V, Efremova EV, Guchina E.A., Detection of HPV 16 and 18 in cervical smears by PCR.//Cytopatology, 1998, v.9 Sapl.1,P-10, p 39

8. Волченко H.H., Завалишина Л.Э, Шимберева И.Б. Рецепторы эстрогенов в инвазивном раке молочной железы//Российский онкологический журнал, №3,1998, с. 10-11.

9 Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю , Маныкин А А, Франк Г.А, Лисицын Ф.В , Ефремова Е.В , Петров А.Н. Выявление ДНК вируса папилломы человека в шейке матки и гортани методом гибридизации in situV/Российский онкологический журнал, №5,1999, с.25-28

10. Волченко Н.Н , Завалишина Л.Э., Петров А.Н., Лебедев Э А Сосуды стромы в инвазивном протоковом раке молочной железы//Архив патологии, 1999 , №3, с. 35 - 38

11 Завалишина Л Э., Андреева Ю Ю , Маныкин А А , Франк Г.А., Лисицын Ф.В., Ефремова Е.В., Петров А.Н Идентификация типов вируса папилломы человека в биопсиях шейки матки и гортани методами гибридизации in situ и ПЦР.//Русский журнал ВИЧ./СПИД и родственные проблемы, 1999 т.З, №1,с 88.

12. Frank G.A., Manykin А А , Zavalishina L.E., Andreeva Y.Y., Efremova E.V. et al. Detection of human papilloma virus DNA (HPV 16/18, 6/11 types) by in situ hybritization and polymerase chain reaction in biopsies of cervix and laryngs// Symposium of Society for Histochemistry, Gargellen/Montafon, Austria, 1999, Sept 22-25

13. Manykin A.A , Zavalishina L.E , Frank G.A., Andreeva Y.Y , Efremova E.V.. Lisitcyn F.V, Petrov A.N. Polymerase chain reaction and in situ hybridization investigation of cervix and larings biopsies infected by human papilloma virus.//Journal of Microbiological Methods, 1999, v.38, №3, p.240.

14. Завалишина Л.Э , Франк Г А., Маныкин А.А , Андреева Ю.Ю., Ефремова Е.В., Лисицын Ф В., Петров А.Н Выявление вируса папилломы человека (16/18 и 6/11 типов) в биопсиях шейки матки и гортани методом гибридизации in situ и ПЦР /Яезисы 2-го съезда Международного союза патологоанатомов, Москва, 1999, декабрь 7-10, с 316-317.

15 Frank G.A,, Zavalishina L.E, Andreeva Y.Y, Adenocarcinoma of the cervix.//Virchows Archiv, 1999, v.435, №3, p.232.

16. Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э., Петров A.H., Франк Г.А. Иммуногистохимическое выявление циклина Д1 в аденокарциноме шейки матки.//Архив патологии,1999,№2,с.31-33.

17. Франк Г.А., Белоус Т А, Волченко H.H., Завалишина Л Э. Комплексная морфологическая характеристика рака желудка и молочной железы с применением иммуноморфологических маркеров //Пособие для врачей, Москва, 1999.

18. Андреева Ю.Ю, Завалишина Л.Э., ГАФранк, А А Маныкин и др. Неплоскоклеточный рак шейки матки; исследование методами гибридизации in situ и иммуногистохимии.//Русский журнал ВИЧ\СПИД и родственные проблемы, 2000, т4, №1, с 94-95.

19. Завалишина Л.Э., Ю.Ю.Андреева, ААМаныкин, ГАФранк и др .Типирование папиллома вирусов в биоптатах гортани человека методами ПЦР и in situ гибридизации.//Русский журнал ВИЧ\СПИД и родственные проблемы, 2000, т.4, №1, с 97-98.

20. .Белоус Т.А, Франк Г.А., Волченко H.H., Завалишина Л Э., Петров А Н. Клиническая морфология рака желудка и молочной железы на основе комплексного морфологического исследования.//Пособие для врачей, Москва, 2001.

21. Завалишина Л.Э, Маныкин А А., Андреева Ю.Ю, Франк Г.А. и др Выявление ДНК вируса папилломы человека при переходноклеточном раке мочевого пузыря.//Русский журнал ВИЧ\СПИД, 2001, т 5, №1, с.23

22. Frank G., Zavalishina L., Andreeva Yu. Immunohistochemical study of highgrade inthraurotelial neoplasia and early carcinoma of bladder.//Virchows Archiv, 2001, v.439, №3, p 397.

23 Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э., Франк Г.А, Киселев Ф.Н. и др..Экспрессия белкового маркера р16 в клетках злокачественных опухолей шейки матки//Архив патологии, 2002, т.64, №1, с.22-24

24. Франк Г.А., Волгарева Г.М, Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю.и др .Экспрессия белка р16 при раке шейки матки//Материалы V ежегодной Российской онкологической конференции. 2002, с 172

25 Франк Г.А., Завалишина Л Э., Андреева Ю.Ю. Иммуногистохимическая характеристика и степень дифференцировки рака мочевого пузыря.//Архив патологии, 2002, т.64, №6, с

26. Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э, Андреева Ю.Ю., Франк Г.А. и др Экспрессия белкового маркера р16 в диспластически измененном эпителии и карциноме шейки матки.//Русский журнал ВИЧХСПИД, 2002, тб, №1, .C.43.

27. Франк Г.А., Андреева Ю Ю , Завалишина Л.Э. Клиническая морфология и морфогенез неплоскоклеточного рака шейки матки.//Пособие для врачей, Москва, 2002.

28 Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Изучение прогностически значимых иммуногистохимических характеристик рака мочевого пузыря./ГАктуальные вопросы онкологии" Материалы международной научно-практической конференции. Иркутск, 2003, с. 162-164.

29. Frank G., Zavalishina L, Andreeva Ju. Immunohistochemical study of sqamous and adenosqamous cancer of lungs.//Virchows Archiv, Vol. 443, № 3, 2003, Sept, p 334.

30. Маныкин A A , Завалишина Л Э., Франк Г.А и др. Детекция ДНК вируса папилломы человека методом гибридизации in situ в тканях шейки матки, гортани и мочевого пузыря с различной патологией этих органов//Молекулярная медицина, 2003, №1, с 1-8.

31 Франк ГА., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Изучение морфологических факторов прогноза рака мочевого пузыря.//Материалы съезда онкологов СНГ, Минск, 2004, с. 78.

32. Коробко И.В., Завалишина Л.Э, Киселев С Л, Франк Г.А и др. Продукция протеинкиназы MAK-V/Hunk как возможный диагностический и прогностический маркер рака молочной железы человека//Архив патологии, 2004, N3, с 20-24.

33. Волгарева Г.М., Завалишина ЛЭ, Головина ДА. и др. Экспрессия белка р16 в клетках некоторых распространенных форм карцином.//Архив патологии,2004,N5,с 8-13.

34. Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Маныкин А А. Выявление вирусов папилломы человека при опухолях эпителиальной природы.//Пособие для врачей, Москва, 2004.

35. Frank G , Zavalishina L., Andreeva Ju. Morphologycal prognostic factors of the bladder cancer, immunohistochemical study.//Pathology internanional, 2004, vol.54,№2,p 142

36 Volgareva G., Frank G„ Zavalishina L. et al. Protein p16 as varker of dysplastic and neoplastic alterations in cervical epithelial cells.//Cancer open Access Research.,2004, sept, p.35

37. Завалишина Л Э, Франк Г.А Гибридизация и полимеразная цепная реакцияш situ в морфологической диагностике предопухолевых и опухолевых заболеваний.//Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека., 2005,Казань.Титул, с.329-336.

38. Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Состояние внеклеточного матрикса и маркеры адгезии в уротелиальном раке мочевого пузыря.//Архив патологии, 2005,Т.67. №3, с.11-14.

39. Frank G., Zavalishina L., Andreeva Ju Immunohistochevical prognostic factors of urothelial carcinoma /А/irchows Archiv, 2005, Vol 447, №2, p 348

40. Франк Г.А., Завалишина Л Э., Андреева Ю.Ю., Актуальные аспекты современной классификации эпителиальных опухолей мочевого пузыря.//Практическое пособие, Москва, 2005.

41. Франк Г.А, Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Иммуногистохимические факторы прогноза рака мочевого пузыря и легкого.//Материалы IV Всероссийского съезда онкологов, 2005, г.Ростов-на-Дону, с.174-175.

42. Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Молекулы адгезии и состояние внеклеточного матрикса как прогностические факторы при раке.//Материалы II Международной конференции «Молекулярная медицина и безопасность», Москва, 2005, с 134.

43 Завалишина Л.З., Андреева Ю.Ю, Франк Г.А. Прогностическое значение молекул адгезии и внеклеточного матрикса в уротелиальной карциноме мочевого пузыря.//Российский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2005, том.9, №1, с.72

44. Снарская Е.С., Молочков В.А., Завалишина Л.Э, Франк Г.А. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы при базальноклеточном и метатипическом раке.//Архив патологии,2005,Т.67, N3,с. 14-18.

45 Завалишина Л.Э., Петров А.Н , Андреева Ю.Ю Количественная оценка результатов иммуногистохимического исследования тенасцина в протоковом раке молочной железы //Архив патологии, 2005,Т.67 №6,с.21-24

46. Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Гибридизация и ПЦР in situ в детекции вирусных поражений как фактора высокого риска развития рака.Шолекулярная медицина, 2005, №1, с.8-13.

47. Франк ГА, Белоус ТА, Завалишина Л.Э. Сравнительная характеристика морфогенеза и основных гистологических форм рака желудка и толстой кишки.//Пракгическое пособие, Москва, 2005.

48. Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Морфологическое исследование HER2-статуса. Методика и атлас.//Москва, Media Medica, 2006, 98 с

49. Sidorova N., Zavalishina L., Frank G., Kuimov A. et al. Immunohistochemical detection of tankyrase 2 in human breast tumors and normal renal tissue.//Cell and Tissue Research, 2006. V. 323, №1, P 137-145.

50. Франк Г.А., Андреева Ю.Ю , Завалишина Л Э. Иммуногистохимическое исследование прогностических факторов при уротелиальной карциноме.// Материалы конференции «Актуальные вопросы морфологической, иммуногистохимической и цитологической диагностики злокачественных новообразований», 2006 Томск, электронная версия.

51. Frank G., Zavalishina L., Andreeva Yu.lmmunohisnochemical study of urothelial carcinoma in patients with different tumor progression risk.//Modern pathology, 2006, V.19, Suppl.3, p.115.

52. Завалишина Л.Э., Франк Г.А, Андреева Ю.Ю.Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы при уротелиальном раке мочевого пузыря и светлоклеточном раке почки.//Материалы съезда онкологов СНГ, Баку, 26-28 сентября, 2006, с. 58

53. Volgareva G.M., Zavalishina L, Andreeva Yu. et al.The protein p16INK4a as a reliable indicator of the HPV-induced carcinogenesis.//New Research on Cervical Cancer (rolland GZ, ed). Nova Science Publishers,2006.

54. Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А. Уточняющая диагностика при раках некоторых локализаций с использованием иммуногистохимических маркеров.//Практическое пособие, Москва, 2006.

55. Андреева Ю.Ю.,Завалишина Л.Э., Франк Г.А. . Классификация эпителиальных опухолей мочевого пузыря //Архив патологии, 2006 т. 68, №5, с. 46 - 53.

56 Андреева Ю Ю„ Завалишина Л.Э., Франк Г.А Молекулярно-биологические факторы прогноза уротелиальной карциномы мочевого пузыря//Межрегиональный сборник научных трудов под ред Е.П. Куликова, Рязань: Узорочье, 2006, с.14-16.

57. Volgareva G.M., Zavalishina L, Andreeva Yu et al. In search of bladder cancer markers' are human papillomaviruses and cellular INK4a expression associated? //New Research on Tumor Markers (Sinise GA, ed) Nova Science Publishers,2006

58. Завалишина Л Э., Франк Г.А. Морфологическое тестирование Нег2-статуса при раке молочной железы.//Русский медицинский журнал, 2006, том 14, №24(276), стр. 1737-1739.

59. Завалишина Л Э, Франк Г.А. Современные методы молекулярной биологии в онкоморфологи и.//Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Высокие технологии в медицине", 2006, с.35-36.

60. Немцова М.В, Землякова В.В., Кузнецова Е.В., Завалишина Л Э. и др. Анализ корреляции генетических и иммуногистохимических маркеров

(генорегуляторы клеточного цикла РЫ, р16 и р53) при спорадическом раке молочной железы.//Архив патологии, 2007, т. 69, №2. В печати

Принято к исполнению 01/02/2007 Исполнено 02/02/2007

Заказ № 67 Тираж: 120кз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 \у\у\у.аи1оге£ега1 ги

Актуальность проблемы

Одной из важных задач современной онкологии является поиск признаков и свойств опухолей, на основе которых можно было бы прогнозировать течение заболевания и определять адекватную терапию. Важнейшими характеристиками злокачественного новообразования помимо клинической стадии является его гистологический вариант, степень дифференцировки и биологическая агрессивность. В последние годы усилия морфологов и онкологов направлены на выявление дополнительных прогностических признаков, которые позволят выяснить причины различного поведения опухолей при одинаковой клинической стадии и степени дифференцировки. Хорошо известно, что течение болезни, опухолевая прогрессия, ответ на определенные виды лечения у пациентов с одной и той же клинической стадией и морфологической формой рака часто бывает различен. Кроме того, желательно именно на ранних стадиях заболевания определить те характеристики опухоли, которые могли бы указывать на ее биологическую агрессивность и, исходя из этого, планировать необходимость того или иного метода лечения. Поиск маркеров, отражающих биологическую агрессивность конкретной опухоли - актуальная задача онкоморфологии. Благодаря успехам современной молекулярной биологии становятся ясными новые ключевые точки канцерогенеза и параметры опухолевых клеток, влияющие на течение болезни и ответ на терапию. Как известно, оценить биологическую агрессивность первичной опухоли можно, исследуя показатели ее пролиферативной активности, активности апоптоза, состояние ряда основных регуляторных рецепторов и систем. Для этого, различными современными молекулярно-биологическими методами (иммуногисто- и иммуноцитохимия, гибридизация in situ, полимеразная цепная реакция, лазерная микродиссекция, секвенирование, микрочиповые технологии и т.д.), исследуются белки -регуляторы клеточного цикла, гены-супрессоры опухолей и их продукты, белки, регулирующие запрограммированную клеточную гибель, многочисленные факторы роста и их рецепторы, интерлейкины, цитокины и многие другие регуляторные системы клетки. Помимо вышеперечисленного биологическая агрессивность опухолей проявляется в инвазивном росте и метастазировании. Эти качества опухолевых клеток связаны с изменением их адгезивных свойств, появлением способности проникать в лимфатические и кровеносные сосуды, продуцируя повышенное количество протеаз и разрушая внеклеточный матрикс, влияя на паренхиматозно-стромальные взаимоотношения. Значительные успехи исследований в области клеточной биологии показывают ключевую роль взаимодействия опухолевых клеток и стромы в процессе метастазирования и опухолевой прогрессии. Современные данные молекулярно-биологического изучения опухолей указывают на целый ряд факторов, влияющих на поведение опухоли, но многие из них исследованы или на клеточных культурах или на незначительных выборках с учетом морфологических и клинических данных. В большинстве исследований изучены и сопоставлены с гистологической формой и клиническими данными характеристики, отражающие лишь один из параметров, связанных с биологической агрессивностью новообразования, например, только пролиферативная активность или состояние молекул адгезии, или активность некоторых ферментов, участвующих в деградации клеточного матрикса и т.д. До настоящего времени количество работ, в которых был бы изучен широкий спектр маркеров, отражающих различные проявления биологической агрессивности опухоли, незначительно. Кроме того, в настоящее время не определена панель иммуногистохимических маркеров, характеризующих биологическую агрессивность опухоли, которая была бы необходима и достаточна для проведения стандартного исследования биопсийного или операционного материала как для научного, так и для практического диагностического изучения характеристик конкретной опухоли.

Изучение способности опухолевых клеток к инвазии и метастазированию особенно на ранних стадиях имеет не только теоретический интерес, но и может дать возможность для прогноза течения болезни и корректировки лечения, а также указать направления создания новых препаратов для быстро развивающейся таргетной терапии.

Цели и задачи исследования

Исходя из актуальности выше изложенных проблем, целью настоящего исследования явилось изучение комплекса параметров, определяющих биологическую агрессивность опухоли и создание алгоритма исследования, определяющего инвазивный и метастатический потенциал эпителиальных неоплазий, на примере карцином разных локализаций и разного гистогенеза: рака легкого (плоскоклеточного и железистого), аденогенного протокового рака молочной железы, переходноклеточного рака мочевого пузыря, светлоклеточного рака почки, плоскоклеточного рака шейки матки.

Поставленная цель исследования предполагает решение следующих задач:

1. изучить экспрессию показателей пролиферативной активности, маркеров апоптоза, генов-супрессоров в материале первичной опухоли в раках нескольких локализаций и разных гистологических форм, в группах опухолей с метастазами и без метастазов;

2. изучить экспрессию ряда металлопротеиназ и их ингибиторов в тех же группах;

3. изучить экспрессию молекул адгезии в тех же группах;

4. на основе сравнительного анализа экспрессии изученных групп маркеров определить наиболее значимые из них для карцином разного гистогенеза и локализаций;

5. провести многофакторный анализ исследованных молекулярно-биологических маркеров и провести корреляции между выявленными значимыми маркерами;

6. сформировать алгоритм определения метастатической активности карцином изученных локализаций для применения в практических диагностических исследованиях;

7. провести исследование новых потенциальных маркеров биологической агрессивности опухоли.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение широкого спектра иммуногистохимических маркеров, отражающих различные аспекты биологической агрессивности эпителиальных опухолей разных локализаций (молочная железа, легкое, мочевой пузырь, почка, шейка матки) с учетом гистологического строения (плоскоклеточный рак, аденогенный рак, переходноклеточный рак), т.е. с учетом основных морфологических типов.

Проведено сопоставление показателей метастатической активности опухолей (состояние молекул адгезии, металлопротениназ и их ингибиторов) с показателями пролиферативной активности опухолей, маркерами апоптоза, активностью некоторых генов-супрессоров, рецепторов семейства эпидермального фактора роста в группах рака разной локализации с наличием или отсутствием метастазов.

Проведены корреляции между пролиферативным потенциалом опухолей и наличием метастазов, между показателями метастатической активности карцином и метастазами в регионарные лимфатические узлы.

Впервые разработан оригинальный объективный автоматизированный метод оценки количества тенасцина в гистологических срезах при иммуногистохимическом окрашивании.

Проведенный многофакторный анализ позволил впервые выделить наиболее значимые иммуногистохимические маркеры для определения пролиферативного и метастатического потенциала эпителиальных опухолей. На основе этого анализа впервые создан оригинальный алгоритм проведения уточняющей диагностики метастатической активности эпителиальных новообразований, включающий исследование экспрессии металлопротеиназ 1, 2, 9, тканевых ингибиторов металлопротеиназ 1 и 2, Е-кадгерина, бета-катенина, CD44, коллагена IV типа, тенасцина.

Научно-практическая значимость.

Сформирован алгоритм исследования биологической агресивности и метастатического потенциала карцином различных локализаций и гистологических форм, что создает основу для выработки индивидуального морфологического прогноза течения заболевания и позволит разрабатывать адекватные схемы терапии. Определение предлагаемых показателей рекомендуется проводить в крупных региональных онкологических научно-практических центрах.

Выявленные новые аспекты определения метастатического потенциала опухолей, особенно на ранних стадиях, позволят в будущем не только определять прогноз течения болезни и корректировать соответствующую терапию, но и указывают возможные направления для создания препаратов таргетной терапии.

Обнаруженные корреляции между экспрессией матриксных металлопротеиназ, молекул адгезии и наличием метастазов карцином разных локализаций и гистологических типов вносят значительный вклад в исследование механизмов канцерогенеза.

Созданная новая методика автоматизированного определения количества тенасцина в гистологических срезах при проведении иммуногистохимического исследования позволяет объективно определять количественное содержание одного из ключевых маркеров метастазирования. Методика рекомендуется для применения в патологоанатомических отделениях онкологических центров и научно-исследовательских институтов.

Апробация работы

Материалы исследования были доложены на ряде всероссийских и международных конференций и съездов: I Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность ", Россия, Москва, 2004г., II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность ", Россия, Москва, 2005г., Съездах онкологов СНГ - Белоруссия, Минск, 2004г., Азербайджан, Баку, 2006г., IV Всероссийском съезде онкологов, Россия, Ростов-на -Дону, 2005г., Всероссийской научно-практической конференции "Высокие медицинские технологии", Россия, Москва, 2006г., 20 Европейском конгрессе патологии, Франция, Париж, 2005г., XXV Международном конгрессе Международной академии патологии, Австралия, Брисбен, 2004г., XXVI Международном конгрессе Международной академии патологии, Канада, Монреаль, 2006г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 60 печатных работ, их них - 1 книга, 1 глава в Руководстве, 4 пособия для врачей, 2 статьи в зарубежных сборниках и 11 статей в зарубежных журналах.

ВЫВОДЫ

1. Пролиферативная активность имеет четкую связь со степенью дифференцировки опухоли, однако отмечен относительно невысокий коэффициент корреляции (до 0,6) с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы независимо от локализации рака (молочная железа, легкое, мочевой пузырь) и гистологического типа (плоскоклеточный, аденогенный, переходноклеточный).

2. Уровень экспрессии генов-супрессоров р53 и р16 прямо коррелирует с метастатической активностью опухолей легкого и мочевого пузыря. Для рака молочной железы подобной корреляции не обнаружено.

3. Установлено, что уровень маркеров апоптоза является низким как в группах без метастазов, так и в группах с метастазами всех изученных локализаций, то есть не связан с метастатическим потенциалом опухолей.

4. Экспрессия основных факторов инвазии - матриксных металлопротеиназ (ММР-2 и ММР-9), играет важную роль в процессе метастазирования при плоскоклеточном раке легкого и шейки матки, аденогенном раке легкого и молочной железы, переходноклеточном раке мочевого пузыря, светлоклеточном раке почки, т.к. выявлена высокая степень корреляции (0,70,8) с наличием регионарных и отдаленных метастазов. Экспрессия ММР-1 является значимой для метастазирования аденогенного рака (легкое и молочная железа) и светлоклеточного рака почки, в то время как для плоскоклеточного рака (легкое и шейка матки) и переходноклеточного рака (мочевой пузырь) подобной закономерности не обнаружено. Экспрессия тканевого ингибитора металлопротеиназ TIMP-1 имеет высокую отрицательную связь с наличием отдаленных метастазов при светлоклеточном раке почки.

Значимые корреляции для других изученных локализаций между уровнем экспрессии TIMP-1 и TIMP-2 и метастазированием не обнаружены.

5. Мембранная экспрессия молекул адгезии Е-кадгерина и бета-катенина имеет отрицательную корреляцию (0,7 - 0,8) с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы независимо от гистологического типа и локализации рака. Наличие метастазов ассоциировано с отсутствием мембранной реакции и увеличенным аномальным накоплением бета-катенина в цитоплазме и ядрах опухолевых клеток. Экспрессия молекулы адгезии CD44 также увеличена в клетках опухолей с метастазами и остается неизменной во внеклеточном матриксе.

6. Состояние внеклеточного матрикса, оцениваемое по экспрессии компонентов базальных мембран (коллаген IV типа и ламинин) и антиадгезивного гликопротеида тенасцина коррелирует с наличием метастазов независимо от гистологической формы и локализации эпителиальной опухоли: экспрессия коллагена IV типа и ламинина уменьшается, а количество тенасцина увеличивается в 1,5 - 2 раза.

7. Разработанный оригинальный автоматизированный метод оценки количества тенасцина в эпителиальных опухолях позволяет уточнить метастатический потенциал карцином.

8. Наиболее значимыми показателями инвазивного и метастатического потенциала эпителиальных опухолей служат матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы, молекулы адгезии и составляющие внеклеточного матрикса. Основные маркеры инвазивного и метастатического потенциала являются общими для рака разной локализации и лишь частично связаны с его гистологическим типом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты проведенных исследований выявили существенные различия меоду эпителиальными опухолями с наличием регионарных и отдаленных метастазов и опухолями без метастазов. Основные различия проявляются в экспрессии показателей межклеточной адгезии и компонентов внеклеточного матрикса, а также пролиферативной активности. Эти различия не связаны с локализацией рака и лишь частично связаны с его гистологическим типом. Полученные результаты позволяют сформулировать следующие практические рекомендации:

1. Включить методику уточняющей диагностики инвазивного и метастатического потенциала рака в гистологическое исследование опухолей на ранних стадиях онкологического заболевания.

2. Уточняющую диагностику биологической агрессивности рака проводить иммуногистохимическим методом с использованием следующей панели моноклональных антител: антитела к матриксным металлопротеиназам (ММР-1, ММР-2, ММР-9), тканевым ингибиторам металлопротеиназ 1 и 2 типа, Е-кадгерину, бета-катенину, CD44, коллагену IV типа, тенасцину, Ki67.

3. Применение методики уточняющей диагностики должно проводиться на стандартизованном гистологическом материале. При оценке результатов иммуногистихимического исследования необходимо использовать бальную шкалу оценки экспрессии исследуемых маркеров.

4. Определение количества тенасцина проводить с помощью предложенного оригинального метода.

5. Полученные биологические характеристики опухоли необходимо учитывать для определения вероятностного индивидуального прогноза течения заболевания и выработки плана лечения.