Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Молекулярная диагностика и медико-генетический прогноз спинальной и бульбарной амиотрофии Кеннеди у детей и подростков

Г 1

,) V •">

Министерство здравоохранения Российской Федерации Научно-исследовательский институт детской гематологии

на правах рукописи

Петрухин Антон Андреевич

"Молекулярная диагностика и медико-гепетическпй прогноз сшшальпой и бульбарнол ампотрофни Пеппедп у детей и подростков"

14.00.09. Педиатрия 03.00.15. Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в лабораториях цитогенегики и молекулярной генетики НИИ детской гематологии Министерства здравоохранения РФ и ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Академик РАЕН,

доктор медицинских наук, профессор

А. Г. Румянцев

Доктор биологических наук О.В. Евграфов

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Н.С. Кисляк

Доктор биологических наук , Д-В. Залетаев

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится "26" декабря 1996г. в_часов на заседании

специализированного совета Д. 084.61.06. НИИ Детской гематологии Министерства Здравоохранения РФ по адресу г. Москва, 117513,Ленинский пр-т 117

С диссертацией можно ознакомится библиотеке НИИ Детской гематологии.

Автореферат разослан " " ноября 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный врач России

А.Е. Бухны

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Спинальная и бульварная амиогрофия (СБМА) - редкая форма наследственной нервно-мышечной патологии, впервые описанная W. R. Kennedy в 1968 году. Она наследуется по Х-сцепленному рецессивному типу. СБМА характеризуется поздним дебютом на 3м - 4й десятилетии жизни, проявляющимся распространенными фасцикуляциями с постепенным развитием мышечной слабости и атрофий приемущественно проксимальных отделов конечностей. Через 10-20 лет от начала заболевания возникают контрактуры в суставах кистей рук и появляются бульварные симптомы (дисфагия, дисфония). Причиной СБМА Кеннеди является специфическая мутация в гене андрогенового рецептора (АР), картированного в области Xqll-12, характеризующаяся увеличением количества тринуклеогидных повторов (CAG) в начале гена, которую возможно эффективно детектировать, используя только молекулярно-генетические методы. Точной постановке диагноза придается особое значение не только из-за трудностей клинической диагностики СБМА, но также в связи с тем, что при других тяжелых нервно-мышечных заболеваниях (прежде всего при боковом амиотрофическом склерозе) могут наблюдаться сходные фенотипические проявления. Важное значение приобретает доклиническая диагностика носительства этого заболевания среди детей и подростков.

Данное заболевание в России остается относительно малоизученным. Широкий круг педиатров, специалистов-неврологов и генетиков недостаточно знаком с особенностями клинического течения и диагностики СБМА. В России описаны не более 10 клинически верифицированных семейных случаев данного заболевания [Бадалян и др., 1987]. Эффективных методов лечения этого заболевания в настоящее время не существует. В связи с этим важное значение приобретает его профилактика, которая в настоящее время невозможна без медико-генетического консультирования семей с использованием ДНК диагностики. Особый интерес с точки зрения оценки рекуррентного риска представляет выявление гетерозиготного носительства мутации в гене АР у женщин. Методы молекулярно-генетической диагностики в принципе позволяют осуществлять пренатальную диагностику СБМА, в этом случае выявления мутации и своевременное прерывании беременности может предотвратить рождение больного ребенка.

Обнаружение и исследование генов, мутации в которых приводят к развитию наследственных заболеваний человека, позволяет не только понять патогенетические механизмы возникновения этих заболеваний на молекулярно-генетическом уровне, но и разработать эффективные методы пренатальной диагностики, дифференциальной диагностики, медико-генетического прогноза и профилактики, в перспективе подойти к проблеме лечения.

Цель и задачи исследования. Цель работы - разработать и предложить для практического применения комплексную программу диагностики, медико-генетического прогноза и профилактики СБМА у детей и подростков на основе молекулярных методик исследования ДНК в сочетании с клиническими, биохимическими, ЭМГ и ЭНМГ методами исследования в семьях больных СБМА. При этом ставились следующие задачи:

1. Разработать методы ДНК-диагностики СБМА на основе известных методик определения количества САС повторов в 1°" экзоие гена андрогенового рецептора. Определить значимость молекулярно-генетических методов диагностики по отношению к традиционным клинико-генеологическим, бихимическим, ЭМГ и ЭНМГ методикам исследования СБМА.

2. Основываясь на результатах дифференциальной и пресимптоматической ДНК-диагностики, проанализировать ранние клинические и аддитивно-функциональные проявления СБМА.

3. Провести диагностику гетерозиготного носительства мутации в гене андрогенового рецептора у женщин, являющихся родственницами больных СБМА. Провести углубленное клиническо-генеалогическое, биохимическое, ЭМГ и ЭНМГ исследования гетерозиготных носительниц патологического гена для обнаружения возможных фенотапически-функциональных проявлений СБМА.

4. Уточнить критерии дифференциальной диагностики СБМА с учетом молекулярно-генетических данных.

5. Разработать и внедрить в практику медико-генетическое консультирование семейных случаев СБМА. Исследовать морально-этические аспекты, связанные с пренатальной и доклинической диагностикой, профилактикой этого заболевания.

Научная новизна. Впервые разработан оригинальный метод, позволяющий точно определять количество САС повторов в 1°м экзоне гена АР без использования сложных методик сиквенирующего определения нуклеотидной последовательности. При помощи данного метода выявлено явление мейогической нестабильности в пределах одной семьи с СБМА, характеризующееся патологическим накоплением САС повторов в 1ом экзоне андрогенового рецептора при передаче патологического гена от матери к сыну и уменьшением их при передаче дочери.

Впервые в отношении СБМА при клиническом исследовании был обнаружен синдром "бепокойных ног" у женщины. При помощи молекулярно-генетических методов установлено, что она является гетерозиготной носительницей мутации в 1ом экзоне гена АР. Используя дополнительные молекулярно-генетаческие методы исследования, было установлено, что возможным механизмом развития этого и других неврологических нарушении у женщин, являющихся гетерозиготными носителями мутации в 1ом экзоне гена АР, может служить несбалансированная лайонизация.

Практическая значимость. В ходе настоящей работы разработаны и внедрены в клиническую практику эффективные молекулярно-генетаческие методы, позволяющие проводить прямую диагностику в 100% случаев, пресимптоматическую диагностику, диагностику гетерозиготного носительства, дифференциальную диагностику и в принципе осуществлять пренатальную диагностику СБМА. Впервые разработаны и внедрены в практическое здравоохранение основные принципы медико-генетического консультирования семей с этой формой заболевания, основанные на результатах полученных при помощи молекулярно-генетических методик исследования ДНК.

Разработаны и внедрены в практику дополнительные молекулярно-генетаческие методы исследования ДНК женщин, позволяющие определять лайонизацию. Результаты, полученные при помощи данных методов, являются информативными в отношении

гетерозиготных носительниц мутации в гене АР, позволяют устанавливать причину развития денервационньк нарушении, выявляемых только специальными ЭМГ и ЭНМГ исследованиями.

Положения выдвигаемые на защиту. В данной работе показано:

• Молекулярно-генетические методы анализа ДНК, основанные на амплификации участка ДНК 5' области 1го экзона андрогенового рецептора позволяют максимально эффективно осуществлять диагностику СБМА (включая пресимптоматическую и преиатальную диагностику), диагностику гетерозиготного носительства заболевания у женщин, дифференциальную диагностику и эффективную профилактику СБМА, эффективно осуществлять медико-генетическое консультирование семей с этим заболеванием.

• Молекулярный анализ С АС - повторов фрагмента 1го экзона гена АР позволяет точно дифференцировать СБМА от других нервно-мышечных заболеваний, имеющих сходные фенотипические проявления, проводить пресимптоматическую диагностику, выявлять статус гетерозиготного носительства мутации в гене АР у женщин, а также в принципе осуществлять преиатальную диапгестику этого заболевания.

• При помощи разработанного оригинального молекулярно-генетического метода количественного определения полиморфных САС повторов установлено, что фрагмент ДНК гена АР 1го экзона содержит 20-26 тринуклеотидных повторов у здоровых лиц, 46-51 у больных СБМА. Впервые показано увеличение количества САС повторов в одной семье при передаче гена от матери к сыну и уменьшение -при передачи от матери к дочери. Этот факт мейотической нестабильности позволяет предположить, что при СБМА также может наблюдаться явление антиципации, наблюдаемое при других наследственных заболеваниях, характеризующихся сходным типом мутации (болезни накопления тринуклеотидных повторов).

• Методы ЭНМГ и ЭМГ-детекции электрических потенциалов поперечно-полосатой мускулатуры позволяет диагностировать состояние гетерозиготного носительства СБМА у женщин и являются информативными при диагностики наиболее ранних доклинических стадий развития денервационных нарушений, присущих СБМА, у потенциально больных.

• При клиническом обследовании гетерозиготных носительниц мутации СБМА нами был обнаружен симптом "беспокойных ног" (Виттмака-Экбона), ранее не описанный в отношении СБМА. Преимущественная инактивация Х-хромосом не несущих мутации в гене АР у данной больной позволяет предполагать, что гетерозиготное носительство мутации при несбалансированной ланонизации Х-хромосом может быть причиной выявляемых нами клинических и функциональных нарушений.

• Разработана комплексная профамма обследования пациентов и диагностика СБМА основанная на молекулярно-генетических, клинико-генеалогических, биохимических, ЭМГ и ЭНМГ методах исследования. Молекулярно-генетические методы диагностики СБМА являются высоко эффективными и определяющими при проведении медико-генетического консультирования семейных случаев СБМА. В случае невозможности проведения ДНК диагностики могут быть рекомендованы электромиографические методы исследований.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 5ом рабочем совещании неврологов России и Германии (Санкт-Петербург, май 1995), кафедре ш-гтанъге болезней педиатрического факультета РГМУ (Москва, май 1996), кафедре клинической генетики ФУВ РГМУ (Москва, октябрь 1996), совместной научно-цитогенетической конференции НИИ детской гематологии, МГНЦ РАМН, РДКБ Министерства здравоохранения РФ (ноябрь 1996).

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов клинико-генеалогического обследования, результатов молекулярно-генетических исследований, результатов биохимических исследований в семьях с спинальной и бульбарной амитрофией, результатов электромиографических исследований, заключения и выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 27 рисунков; библиографический указатель содержит 143 источников, из них 12 отечественных и 131 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Подбор больных. Критериями для исследования пробандов и/или членов их семей служило наличие по крайней мере 2" фенотипических признаков, характерных для СБМА, которые подробно изложены в каталоге моногенных заболеваний под редакцией

McKusick [Victor A. McKusick: OMIM Feb 1 23:55:56. 1995]:

1. позднее начало на 3™ - 4°" десятилетиях жизни

2. развитие распроспространенных фасцикуляций с постепенным развитием мышечной слабости и атрофии преимущественно в проксимальных отделах конечностей

3. наличие бульварных симптомов (дисфагия и дисфония)

4. эндокринных нарушений (гинекомастия, снижение фертильности).

Клиническое обследование. Больные СБМА и члены их семей поступали для обследования на кафедру нервных болезней педиатрического факультета РГМУ (клиническая база 63 городской больницы Москвы). На основании вышеперечисленных клинических диагностических критериев нами в процессе настоящей работы была разработана подробная карта обследования больного с СБМА Кеннеди. Молекулярно-генетические методы исследований. Анализ ДНК проводили в лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН и в лаборатории циго генетики и молекулярной генетики НИИ детской гематологии Министерства здравоохранения РФ.

Забор венозной крови. Для получения ДНК использовали венозную кровь пациентов и членов их семей. Забор периферической венозной крови в количестве 5 мл. осуществляли в стандартные пробирки фирмы "VACUTAINER", содержащие в качестве консерванта 84 Jll 15% раствора ЭДТА К3, и тщательно перемешивали.

Выделение геномной ДНК. Для получения ДНК необходимой степени очистки и достаточного молекулярного. веса использовали стандартный метод выделения ДНК из крови, основанный иа фенол-хлороформной экстракции (Lindblom, Holmlunc!, 1988).

Метод ЦПР (амплификации) фрагмента ДНК 1го экзона гена АР. Для ПЦР использовали праймеры HUM - F 5'- tccagaatctgttccagagcgtgc-3' и HUM - R 5'-

gctgtgaaggttgctgttcctcat-3' [Cutler Allen et al„ 1992]. Для ПЦР использовали Taq полимеразу производства СП "БиоМастер" (г. Москва), олигонуклеотидные прайиеры были синтезированы в Институте биоорганической химии (г. Москва). ПЦР проводили в 50 мкл буфера следующего состава: 1,5 mM MgC^; 16,6 мМ (NH4)2S04; 67 мМ трис-HCl pH 8,4; 0,01 % tween-20, 200 икМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 0,1 мкМ каждого олигопраймера я 0,1-0,5 икг геномной ДНК. Полученную смесь прогревали 5 мин. при 94 °С; добавляли 1,5 единицы термостабильной ДНК-полимеразы; 40-60 мкл вазелинового масла. ПЦР проводили в течение 32 циклов с параметрами 94° С 45 с; 60° С 45 с; 70° С 45 с. Электрофозез проводили в 8% полиакриламидном геле в течении Зх ч. при 240 В с последущим окрашиванием бромистым этидием. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага X, обработанную Pstl.

Метод селективной амплификация. Рестрикцию энзиматическим ферментом Hha I (чувствительным к метилированию) проводили в течении 16 часов при 37"С, затем рестрикционную смесь в количестве 5 |jl (0,1 - 0,5 мкг) амплифицировали с праймерами HUM - R и HUM - F как было описано выше, конечная концентрация MgCl2 в амолифицируемой смеси составляла 1,5 шМ. Электрофорез проводили в 8% полиакриламидном геле в течении Зх ч. при 240 В. Полную инактивацию одной X-хромосомы (отцовской или материнской) детектировали в том случае, есля на электрофореграмме визуально отсутствовал фрагмент одного из аллелей, а частичную или несбалонсированную лайонизацию, если один из аллелей был меньшей интенсивности.

Рестрикционный анализ ПЦР-фрагментов 1го экзона гена андрогенового рецептора. Для определения количества полиморфных (CAG)n повторов в аллеле, несущем мутацию в 10м экзоне гена АР был предложен и использован рестрикционный анализ ПЦР-фрагментов при помощи фермента Mnl I ("Ферментас" г. Вильнюс).

Рестрикцию проводили в течении 16 часов при 37"С при условиях, рекомендуемых производителем. Количественное определение вариабельного фрагмента ДНК 1го экзона гена АР, содержащего полиморфный CAG повтор, осуществляли в 8% полиакриламидном геле в течении 6 ч. при 240 В (соотношение акриламида и бисакриламида 21:1,3). В качестве контрольной использовали ДНК, в которой определена нуклеотидная последовательность и, соответственно, количество CAG повторов, полученные при помощи сиквенса.

Анализ нуклеотидной последовательности. С целью точного количественного определения тринуклеотидных повторов и последовательности амплификационного фрагмента одного из больных СБМА, использовали стандартную методику и набор реактивов для нерадиоактивного определения (с помощью окрашивания серебром) нуклеотидной последовательности ДНК производства "PROMECA". Электроииографические методы обследования. Электромиографические (ЭМГ) и электронейромиографические (ЭНМГ) исследования осуществляли по стандартной методике [DeLisa et al., 1987] с использованием 2" канального электромиографа LBM 4Е фирмы "Neuro Diagnostics" (США) в лаборатории исследования мозга НИИ Педиатрии и детской хирургии МЗРФ. Анализировали параметры глобальной электромиограммы (ЭМГ) путем накожного отведения биопотенциалов с двигательных точек скелетных мышц конечностей в покое, при тонической и гипервентиляционной

пробе, а также при активном мышечном напряжении. Оценивали: характер суммарной (интерференционной) кривой, степень ее редукции по амплитуде и степень разрежения, склонность к группировке осцилляции, наличие денервациоиных и полифазных потенциалов. Стимулящюнные методы включали анализ параметров вызванных потенциалов мьшщ: лагенции, длительности, формы и количества фаз М-ответов, латенции, скорости, амплитуды и процента выпадений р-волн. Высчитывали скорости проведения импульса (СПИ) по эфферентным (моторным) волокнам срединных и большеберцовых нервов.

Биохимическое обследование. Для биохимического анализа сыворотки периферической крови забор венозной крови в количестве 5 т1 осуществляли в стандартные пробирки фирмы "УАСиТА1ЫЕК", " не содержащие среды. Затем после образования сгустка его центрифугировали для образования сыворотки при 1000g в течение 10 мин. Развернутый биохимический анализ сыворотки периферической крови был проведен в лаборатории клинической биохимии на базе РДКБ, при помощи автоматического биохимического анализатора "Весктап" и набора стандартных реактивов (китов). В комплекс обязательного исследования были включены определение КФК, ЛДГ, липопротеинов (триглицервдов и холестерина).

РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-ГЕНЕОЛОГИЧЕСКИХ ОБСЛЕДОВАНИЙ

Всего обследовано 26 человек в возрасте от 2* до 70™ лет (9 мужчин и 17 женщин) из 4" семей с симптомами, характерными для СБМА (см. критерии отбора больных).

Клинико - генеалогическое обследование было проведено в 3" семьях, в которых ранее на основании неврологического обследования были диагностированы случаи СБМА у мужчин, находившихся в возрасте старше 50 лет. Следует отметить, что один из семейных случаев СБМА ранее расценивался и был описан в литературе как изолированный [Бадалян и др., 1987]. Родословные семей приводятся ниже на рис.1,2,3.

Клинически и нейрофизиологически нами был подтвержден диагноз СБМА у больного И.Б.М. из семьи И, при развернутом клинико-гениологическом обследование его родственников проявления СБМА были выявлены у племянника (сына родной сестры) пробанда И.Б.М., что соответствовало наследованию СБМА по Х-сцепленному рецессивному типу.

При обследовании родственниц больных из этой семьи 1-2 (70-ти лет), П-1 (52-х лет), Ш-1 (13-ти лет), 111-2 (13-та лет) и 111-3 (16-ти лет) (см. рис. 1) не было выявлено каких-либо клинических отклонений, все они оказались практически здоровыми. Таким образом, проведенное нами обследование семьи пациента И.Б.М. продемонстрировало семейный характер заболевания СБМА с Х-сцепленныи рецессивным типом наследования. С данным выводом согласуется отсутствие клинических симптомов СБМА у обследованных женщин, что не исключает возможного наличия у некоторых из них состояния гетерозиготного носигельства СБМА.

Рис. 1. Родословная семьи И.

I

II

III ^

27 31

Обозначения:

О - здоровые лица мужского пола О - здоровые лица женскою пола ПЭ - больные лица м)жского пола 1 " лично обслелоиая

В семье Р. описание СБМА у трех родных братьев было опубликовано Л.О.Бадаляном и соавторами в 1987 году. Общими клиническими симптомами у этих больных были: дебют заболевания после 50 лет, появление генерализованных фасцикулляций, постепенное развитие мышечной слабости, атрофии мышц конечностей и

Рис. 2. Родословная семьи Р.

3 1 41

О 6 ¿□□00

3!

III

4!

5 6 7!

8!

5!

10!

0 5бЬшок идо

1 2! 31415! 6! 7| 81 /9М0

8I '9 МО

Обозначения:

I I - здоровые лица мужского пола 13 " больные липа мужского попа [ - лично обследовал

<5Ь-

о - здоровые лкиа женского паи X - умершие

с5Ъ - однояйцевые близнецы

разнояйцевые близнецы

языка, псевдогипертроия икроножных мышц, бульварные симптомы, проявляющиеся дисфонией и дисфагией, эндокринные нарушения в виде истинной гинекомастии, медленное прогрессировать заболевания. К моменту настоящего обследования двое из этих больных умерли. Нами был обследован повторно пробанд Р.К.Н. Выявленные нами клинические нарушения в целом были характерными для СБМА. Кроме того, при обследовании родной сестры пробанда (рис. 2, 1-5) нами был обнаружен синдром "беспокойных ног", ранее не описанный при СБМА, характеризующийся болями в

нижних конечностях беспокоивших пациентку преимущественно по ночам, мышечной утомляемостью при ходьбе и подъеме по лестнице.

При обследовании других родственников больных (в родословной , II-2 (40а лет),

1II-2 (12™ лет), III-3 (7ми лет), III-4 (1ми лет), II-3 (38"» лет), III-5 (13™ лет), II-4 (38м" лет), Ш-6 (12™ лег), III-7 (12™ лет), II-7 (27™ лет), III-8 (2» лег), II-8 (25™ лет) см. рис. 2) не было выявлено каких-либо клинических симптомов, все они были практически здоровы.

При клиническом обследовании пробанда 1-1 (см. Рис. 3) из семьи Д. обнаруживались нарушения характерные для СБМА Кеннеди. При обследовании других родственниц пробанда (в родословной , II-1 (28мн лет), Ш-1 (5" лет) (см. рис. 3) не было выявлено каких-либо клинических отклонений, все они были практически здоровы.

Рис. 3. Родословная семьи Д.

i ОтО

1!

QrO

III

1!

О

1 !

Обозначения:

I 1 - адоровые л ид л мужского пала (3 - Здоровые лкца женского пола

□ - больные лица мужского пола ! - лично обследовал

Отмечавшиеся у больных клинические симптомы были типичными для СБМА Кеннеди. Типичным также был Х-сцепленный тип наследования. Характерными были поздний дебют заболевания (четвертое десятилетие жизни) и первые его проявления (генерализованные фасцикулляции мышц). Активные жалобы больных на изменение походки, быструю утомляемость при ходьбе, затруднения при подъеме по лестнице появившиеся у большинства больных к 50 годам, то есть спустя 10 лет после возникновения фасцикулляций. Первоначально амиотрофии локализовались в проксимальных группах мышц конечностей, а примерно через 10 лет распространялись на мышцы бульбарной группы, что сопровождалось развитием дисфагии, дисфонии и дизартрии, атрофии и фибрилляциями мышц языка. В четырех наблюдавшихся нами случаях СБМА течение заболевания имело относительно доброкачественный характер: инвалидизация в виде ограничения двигательных возможностей больных наступила лишь спустя 20-30 лет от начала заболевания (возникновение генерализованных фасцикуляций). Согласно полученным нами данным генеалогического и клинического изучения трех случаев СБМА, два из них были семейными (в семье Р. СБМА страдали три родных брата, а в семье И. - пробанд и его племянник, сын его родной сестры, что подтверждало Х-сцепленный рецессивный тип наследования заболеания). Один случай СБМА был расценен как изолированный, однако диагноз не вызывал

I

сомнений и подтверждался своеобразием клинической картины, а также ее соответствие описанному в литературе характерному симптомокомплексу СБМА.

В обследованных нами семьях обращало на себя внимание наличие у 2х мужчин, страдавших СБМА, не только гинекомастии, но также мастопатии. У одного из больных из семьи Р. развился рак молочной железы, послуживший причиной его смерти в возрасте 60 лет, несмотря на то, что в возрасте 50 лет ему была произведена радикальная мастэктомия слева. В последние годы обсуждается вопрос о том, что при СБМА в результате первичного дефекта гена АР, проявляющегося резистентностью тканей-мишеней к андрогенам, вторично могут развиваться как дисгормональные гиперплазии, так и рак молочной железы. Данное предположение было подтверждено в работе J.M. Lobaccaro et al. (1994), в которой с помощью молекулярно-генетических методов были обследованы две различные группы больных страдающих СБМА и раком молочной железы.

Результаты молекулярно-генетических исследований Подтверждающая и дифференциальная ДНК-диагностика. За основу ДНК-диагностики был выбран метод амплификации (ПЦР) фрагмента ДНК 1го экзона гена АР с использованием праймеров, предложенных Cutler Allen et al. [Cutler Allen et al., 1992]. Нормальные аллели 1™ экзона гена АР содержат от 17 до 26 повторов CAG, что соответствует амплифицируемому фрагменту длиной от 273 до 300 н.п., а патологический аллель при СБМА содержит от 40 до 52 тринуклеотидных повторов, в этом случае амплифицируемый фрагмент имеет длину от 342 до 378 н.п. В качестве маркера молекулярной массы нами была выбрана ДНК фага X подвергнутая расщеплению рестриктазой Pstl. Один из фрагментов длиной 339 н.п. соответствует 39 повторам CAG, что фактически соответствует минимальному количеству CAG повторов при СБМА. Это позволяет разделять на электрофорезе патологические и нормальные аллели. При обнаружении нами аллеля более 339 н.п. у лиц мужского пола можно диагностировать СБМА, в том случае, если у лиц женского пола один из аллелей имел длину более 339 н.п. диагностировался статус гетерозиготного носительства этого заболевания. Результаты ДНК-диагностики в семьях приведены на рис. 4, 5, 6. Обозначения электрофоретических дорожек соответствуют обозначениям в родословных, которые изабражены выше (см рис. 1, 2, 3). ДНК-диагностика СБМА была проведена 8 лицам мужского из трех семей с СБМА.

Семья И - пробанд И.Б.М., 70™ лег. При молекулярном анализе ДНК пробанда И.Б.М. амплифицировался фрагмент соответствующий патологическому аллелюю (рис. 4, дорожка 1-2). Как было описано ранее, клиническое обследование родственников И.Б.М. по линии матери позволило выявить симптомы СБМА Кеннеди также у С.Г.Л. 49 лет (рис. 1, II-2) - племянника И. Молекулярно-генетическое исследование свидетельствовало о подтверждении диагноза СБМА. (см. рис. 4, дорожка 11-2).

Семья Р - больной пробанд Р.К.Н., 65 лег. При молекулярно-генетическом анализе ДНК пробанда Р.К.Н. также амплифицировался фрагмент ДНК, соответствующий патологическому аллелю (рис. 5 дорожка 1-5).

В семье Д. у больного пробанда Д.В.Н. 65 лет. Результаты ДНК диагностики свидетельствовали о обнаружении патологического аллеля У области 1го экзона гена АР (рис. 6, дорожка 1-1).

Кроме того, нами была проведена ДНК диагностика у двух мужчин в возрасте 40 и 42 лет, имеющих сходные с СБМА клинические проявления в виде сочетания нервно-мышечных и бульварных нарушений. Возраст дебюта заболевания (после 35 лет) также не позволял исключить у них проявление СБМА. При помощи ПЦР 5' области 1го экзош гена АР, было установлено, что амплифицируемьш фрагмент ДНК обследуемых имеет размер, значительно меньший 339 н.п., что позволяет исключить диагноз СБМА у этих больных.

Рис. 4. Электрофореграмма семьи И.

II 1-2 11-1 Ш-1 И-2

Обозначения: Х/Р$(1 - маркер молекулярного веса 339-длинав н.п.

обозначетм дорожек аналогичные родословным

111-2

-514 -468

-339

■264 -247

Ш-3 хуря!

11.2 111-2 Ш-3 Ш-4 11-3 111-5 11-4 111-6 111-7 11-7 111-8 11-Ь 1-4 1-5 11-10 *ЛР.Ч

Обозначения: - маркер молекулярного Вес! 339 - длина в в,п.

обозначен ни дорожек аналогичные родословным

Таким образом, использование метода ПЦР фрагмента ДНК 5' области 1го экзона гена позволяют однозначно подтверждении или исключать диагноз СБМА и проводить

диагностику СБМА в начальной стадии заболевания. Подтверждающая ДНК-диагностика СБМА создает основу для проведения медико-генетического консультирования в этих семьях. Этот подход к диагностике столь редкого заболевания

Рис. 6. Электрофореграмма семьи Д.

468_

339_

264_

Х\Р«1 1-1 II-1 III-1

Обозначения: X/Pstl - ыаркгриолеаулирного веса

339 - длина 1 и п.

обозначения дорожек аналогичные родословным

может быть полезен врачам отдаленных регионов в тех случаях, когда у них диагностика с использованием традиционных подходов вызывает затруднения, а больной по каким-либо причинам не может быть консультирован специалистами в этой области. Диагностика и медико-генетический прогноз у детей. В семье Р при клиническом и биохимическом обследовании внуков пробанда 1-4 (Ш-5 13 лет, Ш-7 13 лет ) (см. рис. 2) нами не было выявлено каких-либо патологии выявляемой клинически и биохимически каким-либо образом свидетельствующей о наличии СБМА. Однако, результаты ДНК-диагностики свидетельствовали о носительсгве патологического аллеля в 1ом экзоне гена АР (рис. 5). Кроме того, методой ПЦР был исключен диагноз СБМА Кеннеди у племянника пробанда (в родословной 1-4) - К.А. II-10 23 лет и внука П.Ю. 2 лет (в родословной III-8) - во всех случаях амплифицировался фрагмент ДНК аллеля 1го экзона гена АР соответствующий нормальному (см. рис 5, дорожки 11-10 и III-8). Результаты, полученные при анализе ДНК 1-10 и III-8, свидетельствуют о том, что метод амплификации позволяет исключать СБМА независимо от возраста обследуемых, внося тем самым ясность в определение реккурентного риска СБМА в этих семьях. В тех случаях, когда длина амплифицируемого фрагмент ДНК соответствовала патологической, можно было говорить о пресимптоматической или доклинической стадии течения СБМА. Диагностика гетерозиготного носительства. Диагностика гетерозиготного носительства является одной из наиболее важных задач для медико-генетического консультирования, квалифицированного решения сложных проблем, связанных с планированием семьи, деторождением, психологической и социальной адаптацией и т. д. Учитывая го, что по данным литературы других методов, позволяющих однозначно проводить диагностику гетерозиготного носительства у женщин в семьях с СБМА не существует, метод ПЦР 5' области 1го экзона гена АР принципиально позволяет решить эту непростую задачу. Ниже приводятся результаты ДНК-диагностики, полученные при исследовании области

ДНК 1го экзона гена АР у 17 лиц женского пола из 3х семей, все они являются родственницами больных СБМА. Во всех случаях был использован тот же метод ПЦР.

В семье И. при обследовании пяти родственниц больных СБМА (рис. 1) 1-2 (70-ти лет), П-1 (52-х лет), Ш-1 (13-ги лет), Ш-2 (13-та лет) и Ш-З (16™ лет), как отмечалось вьппе, не было выявлено каких-либо клинических и биохимических отклонений, все они были практически здоровы. Однако, результаты молекулярно-генетического анализа ДНК методом ПЦР свидетельствовали, что все пять лиц женского пола этой семьи являются гетерозиготными носительницами патологического аллеля, несущего мутацию в 1°" экзоне гена АР; амплификационный фрагмент одного из аллелей имел длину больше 339 н.п. и совпадал с аллелем обнаруженным у больного И.Б.М. и С.Г.Л. (рис. 5, дорожки 1-2; И-1; Ш-1; Ш-2; Ш-З), другой аллель имел

нормальную длину.

В семье Р. как было описано ранее, клиническое обследование родной сестры пробанда Р.К.Н. - К.Н.Н. 40 лет (в родословной 1-5, рис. 2) позволило нам выявить у нее симптом "беспокойных ног". Молекулярно-генетический анализ ДНК 5' области 1го экзона гена АР позволил установить у нее гетерозиготное носительство мутации: амплификационный фрагмент одного из аллелей имел патологический вес и соответствовал амплификационному фрагменту полученному у пробанда Р.К.Н., а амплификационный фрагмент ее другого аллеля соответствовал норме (см. рис. 5; дорожка 1-5). Однако, факт выявления гетерозиготного носительства мутации в начале гена АР не может объяснить те клинические проявления заболевания, которые мы наблюдали у К.Н.Н. Методом ПЦР анализа фрагмента ДНК гена АР показано, что все женщины из семьи Р (11 -2; 11-3; 11-4; 11-7; 11-8; Ш-2; 111-3; Ш-4; Ш-6 см. рис. 5) являются гетерозиготными носительницами мутации в гене СБМА, хотя они не имели каких-либо клинических проявлений СБМА. Следует отметить, что при детальном рассмотрении продуктов амплификации ДНК всех членов семьи Р. обнаруживалась вариабельность молекулярной массы - практически все амплифицируемые патологические аллели имели различную электрофоретаческую подвижность ПААГ. Точная оценка молекулярной массы и, соответственно, количественное определение избыточной экспансии тринуклеотидных повторов в этих патологических аллелях осуществляли с помощью специально разработанной молекулярно-генетического методики с использованием энзима МпЛ (см. ниже).

В семье Д., молекулярно-генетический анализ 5' области 1го экзона гена АР позволил установить гетерозиготное носительство мутации в гене АР у дочери Д.В.Н. -(в родословной И-1): амплификационный фрагмент одного из аллелей имел патологическую молекулярную массу, соответствующую тому амплифицируемому патологическому аллелю, который был у пробанда Д.В.Н., а амплификационный фрагмент другого аллеля у П-1 соответствовал норме (см. рис. 3; дорожка Н-1). При анализе ДНК внучки Т.А. (см. рис. 3; дорожка Ш-1) пробанда амплифицировался фрагмент ДНК, соответствующий нормальному молекулярному весу.

Таким образом, тот же метод амплификации 5' области ДНК 1го экзона гена АР позволяет точно устанавливать или исключать статус гетерозиготного носительства мутации, характерной только для СБМА в гене АР применительно к женщинам. В тех случаях, когда статус гетерозиготного носительства установлен, этим женщинам при

положительном принятии решения о дальнейшем деторождении сообщалось о возможности проведения препаталыюй ДНК-диагностики. Полученные результаты являются мощной основой для решения актуальной задачи медико-генетического консультирования семей с СБМА, т.к. информация о гетерозиготном носительстве заболевания несомненно может повлиять на реккурентный риск СБМА в этих семьях. Другими известными до настоящего времени способами (клиническое обследование, биохимическое определение КФК и др.) однозначно разрешить эту проблему не удавалось.

Количественное определение экспансии тринуклеотидных повторов CAG. В последние годы значительно вырос интерес к изучению нестабильности количества тринуклеотидных повторов в патологических аллелях в ряду поколений и связанного с ним явления антиципации (утяжеление клинических проявлений заболевания в последовательных поколениях отдельно взятой семьи) при таких заболеваниях, как хорея Гентингтона, миотоническая дистрофия, синдром фрагильной Х-хромосомы, спино-церебеллярной атаксии I типа, болезни Мачадо-Джоэефа и некоторых других. В отношении семейных форм СБМА убедительных данных, достоверно указывающих на явление антиципации, в литературе не имеется. Явление антиципации является клинической характеристикой, определяющей нарастание тяжести проявлений наследственной патологии в поколениях одной и той же семьи. Согласно данным литературы, известно, что в количественном отношении накопление CAG повторов влияет на уровень экспрессии гена АР, и следовательно, может определять тяжесть клинических проявлений СБМА. В связи с этим нами было предпринято развернутое молекулярно-генетическое исследование всех семей, которое позволило бы количественно определить уровень экспансии тринуклеотидных повторов в области 1го экзона гена АР и исследовать взаимосвязь между выраженностью клинических, биохимических, электромиографических проявлений СБМА с одной стороны, а с другой - молекулярно-генетических коррелятов СБМА с учетом результатов подсчета и анализа CAG повторов.

При использовании выбранных нами для детекции повторов CAG праймеров HUM-F и HUM-R длины аплифицируеых фрагентов ДНК варьировали в пределах от 270 н.п. (норма) до более чем 339 н.п. (патология), что не позволяло точно определять длину амшшфицироваяного фрагмента в ПААГ. Для уменьшения длины этого фрагмента была проанализирована рестрикционная карта нуклеотидной последовательности амплифицируемых фрагментов ДНК таким образом, чтобы один из продуктов энзимагического расщепления содержал определяемый полиморфный CAG повтор. Нами был выбран фермент рестрикции МпП. Согласно анализу последовательности фрагмента ДНК 1го экзона гена АР, после расщепления амплнфиката по сайтам рестрикции ферментом Mnll, в смеси содержались 4 константных (50 н.п., 36 н.п., 29 н.п. и 28 н.п.) и 1 вариабельный (содержащий полиморфный CAG повтор) фрагменты ДНК. Таким образом, в результате энзиматического расщепления амплнфиката рестриктазой Mnll длины разделяемых электрофорезом фрагентов ДНК, содержащих полиморфный CAG-повтор в области 1го экзона гена АР, были соответственно уменьшены до 90 - 105 нп в случае отсутствия мутации и до 168 - 204 н.п. при патологии.

Нами было проведено точное определение нуклеотидной последовательности амплификационного фрагмента ДНК одного из больных (Ш-6) при помощи нерадиоактивного сиквенирования и было установлено, что количество САв повторов данного образца Ш-6 в Iе*1 экзоне гена АР составляет 49. Этот фрагмент ДНК использовали в качестве контрольного. Точность определения вариабельного рестрикциошюго фрагмента ДНК при таком подходе в 8% ПААГ составляла 1 тринуклеотидный повтор (3 ни).

Ниже приводятся результаты определения количества микросателитных повторов САС в области вариабельного фрагмента ДНК в семьях с СБМА, полученного путем рестрикции ферментом Мп11 (см. таб. 2).

Таблица 2. Результаты количественного определения САС повторов 1го экзона гена

АР в СБМА семьях.

Кол -во

Обслед.пац. в род. Длина Длина полиморфных САС повторов

аллеля а аллеля Ь вариабельного фрагмента

в нп. в нп. в аллеле а в аллеле Ь

Семья И.

И.Б.М. 1-1. 192 - 48 -

С.Р.М. 1-2. 192 111 48 28

С.М.Л. Н-2. 192 87-90 48 20-21

С.С. Ш-1. 192 102 48 25

С.Г.Л. Н-2. 192 - 48 -

С.А. Ш-2. 192 108-111 48 27-28

СМ. Ш-2. 192 96 48 23

Ссыья Р.

Р.К.Н. 1-4 192 - 48 -

К.Н.Н. 1-5 192 105 48 26

Ч.Н.А. Н-2 195 102-111 49 25-28

Ч.Л. Ш-2 195 93 49 22

Ч.К. Ш-3 192 93 48 22

Ч.С. Ш-4 192 93 48 22

А.Т.Ю. И-З 195 105-108 49 26.27

А.Б. Ш-5 ~ 195 - 49 -

Ю.Н.Ю. 11-4 195 93 49 22

Ю.В. Ш-6 192 90 48 21

ЮЛ. Ш-7 198 - 50 -

П.Е.Ю. Н-7 192 105-108 48 26-27

К.С.Ю. П-в 198 102-111 50 25-28

Сеыья Д.

Д.В.Н. 11 177-180 - 50-51 -

Т.Т.В. Н-1 177-180 126-129 50-51 33-34

Т.А- Ш-1 117-120 120-123 30-31 29-30

Обозначения: --отсутствие полосы на электрофорезе.

аллель а - нормальный аллель, аллель Ь - патологический аллель. Прим.: В качестве контрольного был использован образец Ш-6, который по данным сиквенса аыплификата содержал 49 повторов САС.

Результаты, полученные при помощи данного метода, свидетельствуют о том, что тринуклеогидный повтор САС, содержащийся в I0" экзоне гена АР, является высокополиморфным - гетерозиготность в исследуемой выборке (37 женщин из контрольной группы) составляет 96%. Эти результаты практически соответствуют данным литературы (98%).

Как видно из таблицы 2, обследовав три семьи с СБМА, только в одной наблюдалась мейотическая вариабельность. Проанализировав 11 возможных мейотических трансмиссий наблюдалось 3 изменения количества САС повторов, все от матери, всего 1 увеличение, 2 уменьшения. Дополнительную информацию можно получить из анализа мейотических событий у умерших членов семьи, анализируя ДНК их живых потомков. В этом случае, однако, существует вероятность недооценки количества трансмиссии с изменением длины тракта повторов. В этом случае из 22 мейотических трансмиссий изменение количества повторов происходило по крайней мере в 7 мейозах, в том числе 5 случаев увеличения количества повторов (4 по отцовской линии и 1 по материнской) и 2 уменьшения (при передаче по материнской линии). Полученные данные не противоречат представлениям об импринтинге в случаях мутаций, обусловленных избыточной экспансией тринуклеотидных повторов. Необходимо отметить, что нами впервые наблюдалось в одной семье уменьшение количества повторов при передаче патологического аллеля от матери к дочери и увеличение при передаче к сыну. В целом данные по нестабильности тринуклеотидных повторов при СБМА соответствуют результатам, полученным ранее Внпсакпа е1 а!., (1992) хотя в наших исследованиях частота изменения САС повторов при мейотических трансмиссиях оказалась несколько ниже.

Определение инактивации Х-хромосом у женщин-гетерозиготных носительниц мутации в гене андрогенового рецептора. В исследованиях последних лет учеными при помощи молекулярно-генетических методов была установлен, что одной из общих причин возникновения различных Х-сцепленных заболеваний у женщин-гетерозиготных носителей является несбалонсированная инактивация одной из Х-хромосом женского организма. В случае Х-сцепленных заболеваний этот механизм может являться причиной некомпенсированного действия патологического гена на организм в целом. При СБМА эти исследования не проводились.

Как было описано ранее, что результаты полученные при помощи молекулярно-генетических методик свидетельствующие о гетерозиготном носительстве мутации в начале гена АР у К.Н.Н из семьи Р не могли объяснить те клинические проявления заболевания, которые мы наблюдали. Нами был проведен анализ инактивации X-хромосом у всех лиц женского пола, являющихся гетерозиготными носительницами мутации гена СБМА. В качестве простого метода мы использовали селективную амплификацию. В случае случайной лайонизации Х-хромосом на фореограмме у женщины, являющейся гетерозиготой по гену АР, детектировались два аллеля. При полной несбалансированной инактивации проявлялась только одна электрофоретическая полоса. В том случае, когда при полной инактивации одной из Х-хромосом детектировали аллель, соответствующий нормальному, можно было судить о том, что другой является активным и его продукт не компенсируется белком-продуктом

1:срш1Лыюп> гена. В таб. 9 приводится результаты инактивационного анализа Х-хромосом у гетерозиготных носительниц мутации в гене АР.

Таб. 3. Результаты инактивационного анализа Х-хромосомы у гетерозиготных носительниц мутации в гене АР. _

Обсмд. гещиеиты. Аллель а. Аллель Ь. Заключение.

Семья И. С.РЛ1. 1-2. + НР

CMJV- 11-2. ± + 4P

С.С. 1П-1. - + НР

С.А. Ш-2. - + НР

СМ ffl-3i + + Р

Семья Р. К-Н.Н- 1-5. ± + 4P

4HJV. II-2. - + НР

Ч-Л. Ш-2. + + Р

Ч.К. Ш-3. + + р

Ч.С. Ш-4. + + Р

A-TJO. II-3. - + НР

Ю.Н.Ю. II-4. - НР

Ю.В. Ш-6. ± + 4P

П.Е.Ю. П-7. - + НР

K.CJO. II-S. + р

Семья Д. Т.Т.В. П-1. + + р

Обозначения: аллель а - аллель несущий нутацию в гене АР.

аллель Ь - аллель не несущки нутации в гене АР. + - аыплификат рестрихта имеет одинаковую интенсивность окрашивания по отношению к контрольному.

+ - амплнфикат рестрикта имеет меньшую интенсивность окрашивания по отношению к контрольному.

— - отсутствие продукта амплификации в пробе по отношению к контролю. Р - рандомизированная (слушиная) инактивация одной из Х-хромосом. НР - не рандомизированная (избирательная) инактивация одной из Х-хромосом. НР - частично рандомизированная инактивация одной из Х-хромосом.

Таким образом установлено, что у женщины (семья Р. 1-5), страдающей синдромом "беспокойных ног", наблюдалась неслучайная инактивация Х-хромосом, что могло являться причиной наблюдаемых нами нарушений. Как видно из таблицы 3, мы обнаружили 7 женщин с ярко выраженной нерандомизированной инактивацией X-хромосом, 3 с частично рандомизированной, 6 с рандомизированной инактивацией X-хроиосомы. Важно отметать, что во всех случаях выраженной нерандомизированной и частично рандомизированной инактивации Х-хромосом, функционально активной являлась несущая мутацию. Отсутствие каких-либо жалоб у этих женщин, может быть связано с их возрастом (преимущественно до 40 лет), а так же тем, что на развитие признаков - заболевания могут влиять внешние и другие факторы (генетические). Однако при проведении ЭМГ исследований у них отмечались более грубые нарушения (см. ЭНМГ исследования).

Анализ полученных нами дашгых позволил обнаружить необычно высокую частоту передачи патологического аллеля от поколения к поколению (из 11 возможных случаев в 8 произошла передача патологической Х-хромосомы), во всех случаях передачи его по материнской линии отмечалась ярко выраженная нерандомизированная инактивация X-хромосомы не несущей мутацию. К сожалению, количество проведенных нами наблюдении не позволяет сделать определенные выводы в отношении связи передачи патологического гена и инактивацией Х-хромосом. Дальнейшие исследования в этой области могут пролить свет на эту проблему.

Результаты биохимических исследований в семьях с спинальной и бульбарной

амиотрофией.

Согласно литературным данным, исследование КФК и ЛДГ в сыворотке крови играет определенную роль в диагностике СБМА. Однако, значимое увеличение содержания КФК и ЛДГ, как правило, наблюдается и при других заболеваниях. При других типах СМА шперферментемия выражена меньше. Результаты биохимического определения ферментов в сыворотке крови при Х-сцепленных нервно-мышечных заболеваниях могут свидетельствовать как о проявлении заболевания у лиц мужского пола, так и о носительстве мутации у женщин, являющихся гетерозиготными по этому признаку.

Согласно литературным данным, у больных СБМА Кеннеди нередко встречаются нарушения Р-липопротеидного обмена.

Нами было проведено биохимическое исследование КФК, ЛДГ, 11", ХОЛ в сыворотке периферической крови 25 лицам из семей, страдающих СБМА- 8 лицах мужского пола, в том числе 6 пациентам с клиническими проявлениями СБМА, а также 17 лицам женского пола. Увеличение активности КФК и ЛДГ главным образом у мужчин, страдающих СБМА, однако выраженность гиперферментемии при СБМА оказалась незначительной. Учитывая, что изменение показателей ЛДГ и КФК может встречаться при целом ряде других заболеваний, результаты биохимических исследований могут играть лишь вспомогательную роль в диагностике этого заболевания.

Результаты элестронейромиографических исследований в семьях больных спинальной и бульбарной амиотрофией.

Результаты анализа электромиографических (ЭМГ) и электронейоомиогрзфических (ЭНМГ) показателей в семье И. Больной пробанд И.Б.М., 75 лет (в родословной 1-1, см. Рис. 1). Результаты анализа ЭМГ и ЭНМГ показателей описаны ранее [Бадалян и др., 1987]. ЭМГ: непостоянна в покое. При пробах на синергию и тонических реакциях выявлялись сниженная биоэлектрическая активность в виде синхронизированных потенциалов амплитуды 350-380 мкв. При произвольном сокращении - смешанный тип кривой: на фоне интерференции регистрировались высокоамплитудные потенциалы фасцикуляций. Амплитуда суммарной кривой была снижена до 400-500 мкв. При исследовании ЭНМГ показателей определялось снижение функционирующих единиц в мышцах кистей и стоп до 120-150.

Другим больным из семьи И. - ЭМГ и ЭНМГ не проводились из-за отказа пациентов от этих исследований.

Результаты анализа электромиографическях (ЭМГ) и электронейромиографических (ЭНМГ) показателей в семье Р. Результаты анализа электромиографических (ЭМГ) и

электронейромиографических (ЭНМГ) показателей у грех больных мужчин-сибсов, страдающих спинальнон и бульварной амиотрофией Кеннеди (СБМА) из семьи Р. были описаны Л-О.Бадаляном и соавт. в 1987 году. Общими изменениями для этих пациентов были: значительное уменьшение амплитуд максимальных вызванных мышечных ответов (М-ответов) при электростимуляпии срединных и болыпеберцовых нервов, сокращение числа функционирующих двигательных единиц (ДЕ), умеренная редукция амплитуды интерференционной части кривой. Таким образом, были выявлены признаки поражения нейро-моторного псреднерогового аппарата спинного мозга по типу нейронально-аксоналыюй дегенерации. Кроме того, в одном случае определялось существенное снижение скорости проведения импульса (СПИ) по нерву, что свидетельствовало о вторичной сегментарной демиелннизации.

ЭНМГ-исследоваяие проведено нами у 10 клинически здоровых родственников из последующих поколений семьи Р., у которых на основании результатов молекулярно-генетических исследований подтверждено гетерозиготное носительство СБМА (8 женщин) и найдена мутация в гене АР, свидетельствующая о возможности развития клинических проявлений СБМА в будущем (2 мальчика) (см. результаты молекулярно-генетических исследований).

Глобальная ЭМГ напряжения у большинства обследованных женщин гетерозиготных носительниц СБМА выявила значительное снижение амплитуды интерференционной кривой до 100 - 200 мкв при четком ее разрежении. На этом фоне регистрировалось большое количество денервационных осцилляции повышенной амплитуды (до 1200 - 1500 мкв). Указанные изменения доминировали в'мышцах голеней (перонеальная группа), нежели в мышцах рук. Спонтанной активности мышц в состоянии произвольного расслабления не было выявлено ни в одном случае. Степень выраженности изменений глобальной ЭМГ была прямо пропорциональна возрасту обследованных гетерозиготных носителей.

У потенциально бального мальчика Ю.А. 12 лет в состоянии произвольного расслабления икроножной мышцы при проведении гипервентиляции и тонической пробы зарегистрирована спонтанная активность в виде фасцикуляции до 15-16 Гц, имеющих тенденцию к синхронизации. Необходимо отметить, что при неврологическом осмотре фасцикуляции не определялись.

Общими изменениями для всех обследованных (как женщин-гетерозиготных носительниц, так и мальчиков с мутацией СБМА) оказались существенное снижение амплитуд максимальных М-ответов с мышц подошвы при стимуляции болыпеберцовых нервов, изменение формы ответов и тенденция к укорочению их длительности.

Указанные отклонения могли свидетельствовать о значительном уменьшении числа функционирующих ДЕ в иннервируемых мышцах, десинхронизации процесса возбуждения в различных группах ДЕ. Величины СПИ по двигательным волокнам больше берцовых нервов варьировали в диапазоне нормальных возрастных значений. Выраженные изменения показателей Р-воля при стимуляции болыпеберцовых нервов в области медиальной лодыжки, наблюдаемые в большинстве случаев, в виде практически полного отсутствия вторичных мышечных ответов, снижения амплитуды Р-волн и повышения процента их выпадений до 40-50 (при норме до 20-30 %), вероятно, определялись нарушением нормального функционирования сегментарного нейро-моторного

спикального аппарата. При исследовании М-ответов с мышц те кара при стимуляции срединных нервов выявлено повышение их амплитуд, в ряде случаев в 3-4 раза превышающих норму, которая составляет 5-6 мВ. Длительности М-отаетов, величины СПИ и показатели Р-волн соответствовали нормальным возрастным значениям. Однако, определялось некоторое относительное уменьшение скоростей Р-ответов по сравнению с СПИ по проксимальным сегментам срединных нервов, что указывало на "задержку" сюштгического переключения импульса на уровне переднерогового аппарата спинного мозга.

Таким образом, у потенциально больных СБМА мальчиков, а также женщин -гетерозиготных носителей патологического гена, при ЭМГ и ЭНМГ диагностике обнаружены изменения функционального состояния сегментарного переднерогового уровня нейро-моторного аппарата при отсутствии клинических симптомов СБМА. Результаты проведенного исследования определяют реальную возможность диагностики наиболее ранних доклинических стадий развития денервационных нарушений, присущих СБМА, у потенциально больных. Полученные данные, свидетельствующие в пользу наличия характерных доклинических изменений у подростков препубертатного возраста, могут опровергать традиционные представления о том, что СБМА характеризуется поздним возрастным дебютом. Не исключено, что в ряде случаев можно говорить лишь о поздней клиническо-фенотипической манифестации СБМА.

Наличие субклинических ЭМГ и ЭНМГ-изменений у фенотипически здоровых гетерозиготных носительниц СБМА свидетельствует о возможной экспрессии патологического гена, которая зависит от несбалансированной инактивации нормального или патологического аллеля Х-хромосомы в различных клеточных популяциях. Мутация в гене АР приводит к морфо-функциональным изменениям АР рецепторов спинальных и стволовых мотонейронов у гетерозиготных носителей СБМА, которые могут быть выявлены молекулярно-генетическими методами (см. результаты молекулярно-генегических исследований). Таким образом, электрофизиологические характеристики полученные при помощи ЭМГ и ЭНМГ исследованиях в семьях с СБМА являются высоко информативными как при диагностике СБМА на клинической стадии, так и на ранней доклинической стадии, а также позволяют выявлять гетерозиготных носительниц этого заболевания. Электрофизиологические методы могут быть предложены для практического применения, могут быть определяющими в том случае, когда проведение ДНК диагностики невозможно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема диагностики, дифференциальной диагностики (включая пренатальную и пресимптоматическую) и разработка мер профилактики, основанное на поиске мутации в генах, становится все более актуальной задачей. Хотя ДНК-диагностика основана на весьмя сложных, трудоемких и дорогостоящих исследованиях, она имеет ряд преимуществ перед другими традиционными методами диагностики. Исследование проводится на ДНК, которая, как правило, остается неизменной на протяжении всей жизни организма и одинакова во всех ядерных клетках. Это позволяет с помощью анализа ДНК решать задачи, которые не удается решить другими методами. Как было показано в настоящей работе в отношении СБМА, определяющим при диагностике этого заболевания является обнаружение мутации в гене АР при помощи молекулярно-генетических методов.

Наиболее важным является то, что с помощью ДНК-диагностики можно обнаружить поврежденный ген как на доклинической стадии, так и в пренатальном периоде. Кроме того, пресимптоматическая ДНК-диагностика для мужчин, имеющих высокий риск наследования гена, ответственного за возникновение этого заболевания, получение информации о наличии или отсутствии патологического гена имеет большое морально-психологическое значение. Для мужчин и женщин, имеющих высокий риск наследования мутации СБМА, результаты тестирования имеют большое значения для планирования семьи и деторождения. Другим важным фактором, определяющим необходимость ДНК-диагностики, является возможность определения гетерозиготного носительства патологичного гена СБМА у женщин. Другими используемыми в настоящее время методами однозначно диагностировать гетерозиготное носительство нам не. удалось. Необходимо отметить, что в настоящее время аффективных методов лечения наследственных заболеваний не существует, единственным способом является их профилактика. В случае диагностики гетерозиготного носительстба мутации в гене АР, нами была рекомендована пре катальная диагностика.

Результаты проведенных нами исследовании явились основой создания комплексной программы обследования, диагностики (включая доклиническую у детей и пренатальную диагностики) и профилактики, дифференциальной диагностики СБМА. В основу этой програмы положены методы ДНК-диагностики, а также клинико-генеалогические, биохимические, ЭМГ и ЭНМГ исследования.

Выводы.

1.Разработанные методики ДНК-диагностики мутации при СБМА, основанные на количественном анализе САС-повгоров фрагмента 1го экзона гена АР, позволяют эффективно проводить диагностику в 100% случаев СБМА, включая пресимптоматическую диагностику у детей и подростков, дифференцировать СБМА от других нервно-мышечных заболеваний, имеющих сходные фенотипические проявления и выявлять статус гетерозиготного носительства мутации в гене АР у женщин и, при необходимости, осуществлять пренатальную диагностику этого заболевания.

2.При помощи разработанного нами оригинального молекулярно-генетического метода количественного определения полиморфных САС повторов, установлено, что фрагмент ДНК гена АР 1го экзона содержит 20-26 тринуклеотидных повторов у здоровых лиц, 48-51 у больных СБМА. Впервые показано увеличение количества САС повторов в одной семье при передаче гена от матери к сыну и уменьшение - при передачи от матери к дочери. Этот факт позволяет предположить, что при СБМА также может наблюдаться явление антиципации, наблюдаемое при других наследственных заболеваниях, характеризующихся сходным типом мутации (болезни накопления тринуклеотидных повторов).

3.Результаты электромиографических исследований, проведенных у больных СБМА однозначно свидетельствуют о заинтересованности в патологическом процессе периферических мотонейронов переднерогового аппарата спинного мозга. Метод ЭМГ-детекции электрических потенциалов поперечно-полосатой мускулатуры позволяет диагностировать наиболее ранние доклинические стадии развития денервационных нарушений, диагностировать состояние гетерозиготного носительства СБМА у девочек и женщин.

4.При клиническом обследовании гетерозиготных носительниц мутации СБМА нами был обнаружен симптом "беспокойных ног" (Виттмака-Экбона), ранее не описанный в отношении СБМА. Преимущественная инактивация Х-хромосом не несущих мутации в гене АР у данной больной позволяет предположить, что гетерозиготное носительство мутации при несбалансированной лайонизации Х-хромосом может быть причиной наблюдаемых клинических и функциональных нервно-мышечных нарушений.

5.Биохимические методы определения ферментов (КФК и АДГ) и Р липопротеидов обнаруживают нарушения не у всех больных СБМА и не позволяют однозначно диагностировать состояние гетерозиготного носительства этого заболевания у женщин. Таким образом, биохимические показатели ферментов и обмена fi липопротеидов могут играть лишь вспомогательную роль при диагностике СБМА.

6.Клиническая картина СБМА у наблюдаемых нами пациентов в целом соответствует описанной в отечественной и зарубежной литературе. Выявление случая рака молочной железы и фибромы у двух мужчин-сибсов позволяют предполагать, что в дополнение к имеющимся представлениям о клинической картине СБМА, предрасположенность к дисгормональным гнперплазиям и онкологическим заболеваниям молочной железы может быть характерной чертой эволюции генетических расстройств при СБМА.

7.Молекулярно-генетические методы диагностики СБМА являются незаменимым звеном при медико-генетическом консультировании семейных случаев СБМА и являются определяющими для доклинической диагностики и медико-генетического прогноза этого заболевания у детей и подростков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. А.А. PetrukKin, I.A. Shagina, I.V. Mersijanova, A.L. Chuhrova, A.N. Petrm, A.S. Petrukhin, N.N. Zvadenko, O.V. Evgrafov. "DNA analysis in early diagnosis and prevention of hereditary neuromuscular diseases". Abstracts, the mediterranean meeting of child neurology, Portoroz, Slovenia, 1995, p77.

2. A.A. Petrukhin, A.S. Petrukhin, N.N. Zvadenko, O.V. Evgrafov. "DNA analysis of Kennedy spinal and bulbar muscular atrophy in Russia." Abstracts, the mediterranean meeting of child neurology, Portoroz, Slovenia, 1995, pl06.

3. Petrukhin A. A., Petrukhin A. S., Zavadenko N. N., Evgrafov О. V. "Analysis of trinucleotide repeat expansion in patients with spinal and bulbar muscular atrophy." Abstracts of the 28th meeting of the ESHG, London, 1996, p.60.

4. Petrukhin A.A., Petrukhin A.S., Zvadenko N.N., Dunaevskaya G.N., Evgrafov О. V. "DNA analysis of Kennedy spinal and bulbar muscular atrophy" Abstracts of 5th asian and Oceanian congress of child neurology, Turkey, Istanbul, 1996, p.58.

5. Мальберг C.A., Заваденко H.H., Пегрухин A.A, Евграфов О.В., Маслова О.И. "Нейрофизиологические исследования в семье больных спинальной и бульварной амиотрофией Кеннеди: диагностика доклинических стадий заболевания у детей." В печати в журнале "Педиатрия".

6. А. С. Петрухин, Н. Н. Заваденко, А. А. Петрухин, О. В. Евграфов. "ДНК-диагностика семейного случая спинальной и бульварной амиотрофии Кеннеди." В печати в журнале "Невропатологии и психиатрии имени С.С.Корсакова."