Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Молекулярная диагностика и клинико-гематологическая характеристика важнейших структурных гемоглобинопатий в Азербайджане

Г. 7 °

- и I; '

РОССИЙСКАЯ ЛКЛДЕЛ1ИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ГЕЛитОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ГАДЖИ Е В ЭЛЬДАР ГУСЕЙН ОГЛЫ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА И КЛИНИКО-ГЕМАТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАЖНЕЙШИХ СТРУКТУРНЫХ ГЕМОГЛОБИНОПАТИИ В АЗЕРБАЙДЖАНЕ

14.00.29 — гематология и переливание крови

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1992

Работа выполнена в Гематологическом научном центре Российской Академии медицинских наук и в научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения Азербайджанской республики.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ю. Н. Токарев, доктор медицинских наук Р. Ш. Рустамов.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Р. Ф. Гарькавцева, кандидат химических наук А. П. Андреева.

Ведущая организация — Всесоюзный научный центр мо-лекулярно;: диагностики и лечения.

Защита диссертации состоится « . . . » . . . . 1992 г. в «... » часов на заседании специализированного совета Д 074.08.01 в Гематологическом научном центре Российской Академии медицинских наук (125167, Москва, Новозыковский проезд, д. 4-а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра.

Автореферат разослан « » . . . . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В. Д. Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

or. ' ! "

^—--Актуальность проблемы. Успехи в изучении наследственных полезней крови за последнее десятилетие были достигнуты благодаря развитию молекулярно-биологических исследований в области гематологии и медицинской генетики. Весомое место среди наследственных болезней крови занимает структурные гемоглобинопатии » т.е. генетически детерминированные нарушения первичной струк'тури гемоглобина (Нв). Структурные геиоглобинопати» встречаются-практически во всех странах мира. К настоящему времена удалось идеи-* тифициро.вать более 400 вариантов Нв человека ( бмп , Sfoigti-1936). Наиболее распространена ми, а также ваяны«» в клиническом относении среди них являоюя НвЗ , НвС, НвЕ, Нв-Г>, встречающиеся со значительной частотой в опрздедзнных географических зонах.

Исследования, проведенные по иэученио этой проблемы в Советском Соозе, установили широкую распространенность структурных гемоглобинопатии, а такие их значительнув генетическую гетерогенность в некоторых республиках Закавказья и Средней Азии СР.flapькавцева., 1976; С.В.НЬлодей с ооавт.,1976, 1979; Р.Ш.Рустамов о соавт., 1979, 1981 ; Э.М.Бобоходкаев, 1983; ■ Ю.Н.Токарев с соавт., 1985; И.А.Шамов с соавт., 1986).

Исследования, проведенные сравнительно недавно в Азербайджане, выявили относительно высокие частота НвЗ в некоторых районах республики (Р.И.^Стамов, 1986; Н.Т.ГЬибов, 1987). Что касается данных о других структурных аномалиях, то они носили предварительный и ориентировочный характер. Актуальность изучения структурных гемоглобинопатия в Азербайджане объясняется тем, что целенаправленных исследований такого рода в республике до настоящего времени не проводилось»

Сочетание аномальных На с одной из разновидностей талассе-мии довольно часто сопровождается вырагзнной клинической картиной. Что касается простых гетероз!1гат па структурным гемогло-бинопатиям, то во многих случаях они из йыевт явных гематологических и клинических проявлений и часто не диагностируются. Однако под воздействием факторов внешней сргды (низкое напряжение кислорода, инфекция, низкая температура и др.) у таких лиц vo-яет развиться выраженная ..клиническая картина. Это обосновывает

2ь-->зс.. лзучапая клинмко-гомагологкчосьпх ироявлиг.Й у reiepj-злг^тных носителей аномальных Нв.

' олекулярная диагностика аномальных Не, т.о. установление xaj '.кгсра и локализации дефекта-в первичной срукхуре белка, является ¡¡ообходимым этапом диагностики структурных гемоглобинопатии. Для практического здравоохранения Азербайджана использование истодов ¡.'слекулярном диагностики имеет весьма важное значение, так цйк на ого территории встречаются мутации, определяющие возникновение как различных форм, талассемий, так'и аномальных Нв, различные сочетания которых могут обуславливать широкий спектр клинико-гёматологических проявлений.

леходя и? изложенного, были сформулированы цель и задачи настогщего исследования. • '

ц-•.:;:> и задачи исследования. Целью настоящего исследования Ллшшссъ изучение распространения и клмнико-гематологических особенностей структурных гемоглобин спаш i; среди населения АзербайД-х;ска, а такке молекулярная диагностика выявленных аномальных Нв.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение распространения структурных гемоглобинопатии в-отдельных районах Азербайджана..

2. Изучение клинико-гематологических и биохимических проявлений у носителей структурных гемоглобинопатии.

3. Структурная идентификация выявленных аномальных Нв с использованием микрометодов, в том числе метода экспресс-диагностики НвС п КвЕ в качестве скринирующего^ теста.

Научная новизна работы. Проведено целенаправленное . исследование по выявлению и диагностике структурных гемоглобинопатии в Азербайджане с использованием молекулярных методов исследования . для определения первичной структуры аномальных Нв. В результате ^рсЕсдзиноЛ работы в азербайджанской популяции обнаружен и идентифицирован ранее повстречавшийся на территории Советского Cojq-за кгутантаый вариант НвС^бглу-> лиз; в азербайджанской популяции ■выявлен и идентифицирован другой ыутантный вариант НвjDPunjaí р 121 глу->глн.

Наряду с выявлением 23 гетерозиготных носителей редкого му-таптного гарланта HBj5efro¿¿ у двух лиц обнаружено ранее неиз-zr 'тное на земном шаре гомозиготное состояние по Не ^Detroit .

Порчены данные о распространении аномальных Нв в отдельных районах Азербайджана, обнаружены очаги эндемичные по генам НвС, НвЕ и оценены генные частоты этих структурных ано-

малий. Составлена карта распространения структурных гемоглобино-патий в Азербайджане. Представлена клинико-гематологическая характеристика носительства Нвб , НвС, НвЕ и у лиц азербайджанской популяции, а также клинико-гематологическая характеристика гетеро- и гомозиготного носительства Нвдэ^го^

Практическая значимость работы. Результаты исследований позволили провести диагностику структурных гемоглобинопатия у 274 носителей этого заболевания из 10.694 обследованных. Данные о распространении аномальных Нв в ряде районов Азербайджана существенны для организации практической медицинской помощи населению на местах.

В каждом конкретном случае гемоглобинопатии установление характера и локализации дефекта первичной структуры белка является необходимым Этапом постановки правильного диагноза, лечения и прогноза заболевания.

Разработанная модификация метода количественного определения фетального Нв позволяет быстро определять его в образцах из капиллярной крови, что в свою очередь может быть применена при массовом обследовании населения.

Диссертационная работа соответствует плану НИР Азерб.НИИ ГПК, является фрагментом темы "Популяционно-генетичеокие исследования важнейших гемоглобинопатий в Азербайджанской республике с организацией регистра", номер госрегистрации 01890002956.

. Внедрение в практику. По теме диссертации оформлено 2 рационализаторских, предложения: "Определение содержания фетального гемоглобина в.образцах капиллярной крови", "Изготовление гфобирок для микропроб из отходов контейнера "Компопласт - 300" (Азерб. НИИ гематологии и.переливания крови, рац.предложение № 17 от

12.04.1987г. и № 21 от 20.03.1988г.), которые внедрены по ходу выполнения работы в Азерб.НИИ гематологии и переливания крови и Республиканской детской клинической больнице.

В исследовательскую практику Азерб.НИИ гематологии и переливания крови были.внедрены:

'I

- комплексные методы диагностики и дифференциации аномаль-

лих Нв; • •

- ряд микрометодов по структурной идентификации аномальных Нв (микрометод получения суммарного глобина из гейолизата, мик-ропрепаративний электрофорез глобиновых цепей на ацетат-целлюлозной пленке, метод количественного выделения глобиновой цепи из ацетат-целлюлозной пленки, нетод протеолиза ыикроколичеств глобиновой цепи трипсином).

На защиту выносятся:

- данные о распространении структурных гемоглобинопатий в 13 районах Азербайджана, относящихся к различным климато-геогра-фическим зонам ;

- результаты молекулярной диагностики аномальных Нв,выявленных на территории Азербайджана ; ;

- результаты изучения клинико-гематолоГических проявлений у носителей структурных гемоглобинопатий.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на 2. Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (Львов, 1985), научно-практической конференции "Изобретательство и рационализация в здравоохранении Азербайджана" (Баку, 1968), 2 Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990), научно-практической конференции "Актуальные вопросы медицинской диагностики" (Баку,'1990), 2 съезде гематологов и трансфузиологов Азербайджана (Баку, 1990), 3 Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (Киров, 1991), заседании Ученого совета Азерб.НИИ гематологии и переливания крови (1990), заседании проблемной комиссии "Патология оритрона" ВГНЦ МЗ СССР (1991),на итоговых сессиях Азерб.НИИ ГП'К (1986.1987,1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, отражающих ее основное содержание.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена' на {^3. страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, библиографического указателя. Работа иллюстрирована 20 рисунками, II таблицами; Библиографический указатель содержит 228 источников.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики гематологических .заболёванийЧзаведующий - старший научн. сотр., доктор биол.наук В.А.Спивак) Всероссийского

гематологического научного центра Российской АМН и лаборатории популяционных исследований и регистра (зав. - старший научи.сотр., канд.мед.наук Т.А.Мамедова) Азербайджанского научно-исследовательского института гематологии и переливания крови.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ

Материалы и методы исследования. Материалы, представ.'- иные в настоящей работе получены в результате исследований, проведенных в клинических и экспедиционных условиях за период с 1984 по 1990 г.г.

Для изучения распространения структурных гемоглобинопатия на территории Азербайджана, в 13,районах, относящихся к различным клииато-географическим зонам республики, обследовано 4.518 школьников и учащихся профтехучилищ и техникумов в возрасте от 8 до 22 лет.

С цель» выявления аномальных Нв были также обследованы 5.523 лиц находящихся на амбулаторном и стац^огтрном лечении в Азерб.НИИ гематологии и переливания крови.

Для выполнения работ по изучению клинико-гематологических проявлений и генетической гетерогенности структурных гемоглобинопатия были проведены семейно-генетические исследования с обследованием 653 человек из 75 семей.

С целью выявления средних контрольных величин, а также для сравнения и правильной оценки результатов исследования обследовано 150 доноров крови и школьников азербайджанской национальности в возрасте от II до 45 лет.

В общей сложности в результате проведенных исследований было обследовано 10.694 человека. Среди обследованного контингента нами выявлено 274 носителей аномальных Нв. Каждый носитель мутант-ного варианта Нв подвергался тщательному клиническому исследове нию с применением гематологических и биохимических методов.

В процессе выполнения работы были использованы следующие методы исследования:

I. Определение уровня общего Нв,количества эритроцитов, ре-тикулоцитов, среднего содержания Нв в отдельном эритроците (ССГО), среднего объема эритроцитов (СОЗ), осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ), изучение морфологической картины крови

(.Е.А.Кост, 1975; Й. То дорой, 1986); '

2. Определение телец включений в эритроцитах , 1955 1 модификации А.С.Циркиной, 1974) ;

3. Электрофорез Нв на ацетат-целлюлозных пленках с количественным, определением его фракций (&Моге*ао - Howe » 1965);

4. Электрофорез Нв в геле агара (.oU Сгоне и соавт. ,1976) ;

5. Дифференциация аномальных Нв с использованием проб на "растворимость" и "серповидность" CEfc*<SaW, Ciisi'e , 1948;

!Ыно. 1954);

6. Определение содержания фетального Нв методом щелочной денатурации (A:zНе. и соавт., 1959 и модификация Э.Г.Гадаиева, Р.Е.Рустамова, 1988); 1

7. Клинико-генеалогический метод;

8. Аналитическое разделение глобиновых цепей на ацетат-целлюлозной пленке в денатурирующих условиях при двух значениях pH 8,9 и 6,5 (Йс^е^ег ,1974); . •

9. Количественное определение терм^яабильного Нв ^^¿f, 1964 в модификации Дидковского и соавт., 1971) ;

10. Изопропанольный тест (&». г г*«^, , 1972);

11. Определение содержания общего билирубина и его фракций -колориметрическим методом по диазореакции Сtfe/tc/iassii, 1936) ; ' (

12. Определение активности фермента' Г-6-ФДГ в гемолизате эритроцитов (. 3e-inHte.cn , 1962);

13. Определение сывороточного железа, общей железосвязываю-щей способности сыворотки стандартным набором Био-ЛА-Тест "Железо" и Био-.ЛА-Тест "Общая связывавшая способность " производство Лахе-MQ (Ч»Р).

Полученные йифровые данные обрабатывались методами вариационной статистики (В.Ю.Урбах, 1975; П.Ф.Рокицкий, 1978).

Методы молекулярной диагностики. Глобин выделяли по стандартной методике 1930) в микроварианте (Луценко H.H., Сиивак A.A., 1985). Для выделения аномальной цепи использовали микропрепаративний электрофорез глобиновых цепей на ацетат-целлюлозной пленке (Спивак S.A. и соав., I9S8), а также классический метод -7 препаративную колоночную ионообменную хроматографию UV'oy и соавт., 1966). Дляпротеолиза глобиновых цепей испольэовпли трипсин TRTPG'K {С^егуа , ФРГ). Триптические

гидролизати нормальных и аномальных цепей глобина разделяли методом пептидных карт в тонком слое микрокристаллической целлюлозы ■ в соответствии с работой (Спивак и соавт., 1980). Гидролиз лепте-' ' дов до аминокислот проводили в стандартных условиях. Аминокислотный анализ вели на автоматическом аминокислотном анализаторе' Д-500 СОаггит, США) наномольной чувствительности.

Исследования по молекулярной диагностике аномальных Нз 6;л'л проведены совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной диаг- " ностики гематологических заболеваний ВГНЦ Российской АМН (газ. доктор биол.ваук 8.А.Спивак). Начальные этапы структурного исслет дования, предшествующие выделение аномальных пептидов проведены с канд.биол.наук И.Н.Луценко, заключительные этапы структурного исследования с доктором биол.мук В.А.Спиваком и канд.биол.наук Е.А.Асеевой.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Молекулярная диагностика аномальных гемоглсбк;:оо. Все «утант-ные Нв были выявлены методом электрофореза при рН 8,9 по их' измененной подвижности, что свидетельствует об аминокислотных заменах, сопровождающихся изменением заряда на одну единицу в Нвй и НвдЭРигуаё и на две единицы - в НвЕ и НзС. Структурное исследование этих Нв включало выделение аномальных уУ -глобиновых цепей с последующим проведением гидролиза трипсином, разделения пептидов методом пептидных карт, выделения и аминокислотного анализа аномальных пептидов.

Молекулярная диагностика редкого мутамтного варианта Нв Ис±гоивключала все основные вышеперечисленные этапы, однако особенностью структурного исследования являлось то, что для получения пептидных карт использовались триптические гидролизаты аминоэта-лированных р - глобиновых цепей.

На рис.1 суммированы данные по локализации на пептидной карте аномальных пептидов идентифицированных в работе аномальных Нв с заменами в /Ь -цепи.

Нвй рб глу-> вал: анализ результатов разделения триптичес-кчх гидролизатов /5* -глобиновой цепи позволил констатировать отсутствие на пептидной карте пептида Т1 и наличие аномального пеп-

Рис.1. Обобщенная схема пептидных карт в тонком слое цел- ' дюлозЬ аномальных аминоатили-рованныхр -глобиновых 'цепей мутантных гемоглобинов,идентифицированных в работе (мес-тополоиения аномальных пептидов заштрихованы)

гида Ti'(рис.1). Результаты аминокислотного анализа позволили заключить, что Недействительно аномальный пептид, о характерной для Hbö заменой 6 глу-> вал.

НзС р б глу-> лиз: на пептидной карте обнаружено отсутствие пептида TI и.присутствие вместо него двух новых пятен, обозначенных Tía и TI6 (рис.1). После извлечения аномальных пептидов из тонкого слоя и последующего гидролиза раствором HCl был определен их аминокислотный состав, установивший замену 6 глу->лйз.

НвЕ р 26 глу-^лиз: анализ пептидной карты триптических гид-роли затов у2>?-гдобиновой цепи позволил обнаружить отсутствие пептида ТЗ и присутствие вместо него двух новых пятен 13а и ТЗб. Аминокислотный анализ пептидов ТЗа и ТЗб позволил уотановить.что г позиции 26 остаток глютаминовой кислоты замещен на остаток лизина. . .

НвДDPu-hja^ ß 121 глу->глн: на пептидной ка^те триптических гидролизатов ^>°-глобиновой цепи было четко видно отсутствие пептида Т13.и появление аномального пептида Т13а (рис.1). Неизменность аминокислотного состава, по данным анализа, в сочетании с изменившейся электрофоретической подвижностью, этого пептида по сравнению с нормой подтверждает замену 121 гду->глн.

Ui¡X)ciraCt лиз->асн: анализ пептидной карты аминоэти-

лированной цепи, позволил констатиновать отсутствие пептида TIO; изменение рисунка пептидной карт касалось также зоны нейтральных иептидов, где на нормальные пептида ТГ1 и TI3 лаложилось нойте пнтно (.рисЛ).Нераядолипшяяся зона трех" г птидов была элюиро-ьчнп из кирты и подвергнута аминокислотному анализ)'. Разностный

аминокислотный анализ позволил обнаружить а зоне аномальны!', пептид TIO с заменой остатка лизина на остаток аспаргиновой кислоты или аспарагина. Поскольку изменение электрофоретической под1:сж-.н'ости аномального пептида TIO соответствовало измеиению заряда • на одну единицу, был сделан вывод об аминокислотной замене лиз --> асн.

Таким образом, мутантный вариант был идентифицирован как HBjDe¿'r<jt¿ уз 95 лиз->асн.

Распространение аномальных Нв в Азербайджане. В основу наших исследований по изучению распространения аномальных гемоглобинов был положен выборочный географический подход. Работа проводилась среди выборочных групп ¿населения в 13 районах, относящихся в различным климато-географическим зонам республики. На основании полученных данных проведена оценка частоты аномальных Нв среди населения обследованных районов. Анализ результатов выборочных исследований показывает, что обследованное население хепактеризует-ся широким разнообразием мутантаых вариантов. Из 13 обследованных районов в 9 были выявлены аномальные Нв. По результатам внб роч-ных исследований у 36 (0,8© обследованных было выявлено носитель-ство аномальных Нв. Подавляющее большинство (16 человек), выявленные в 7 обследованных районах, являлись гетерозиготами по Нв S . Наиболее высокая.частота гетерозиготного носительства Нв$ отмечалась в одном из населенных пунктов ГЪбелинского района (*♦,5%; генная частота - 0,0227), а в целом по району она достигала 3% (генная частота - 0,0150)., к в остальных 6 районах частота серповидно-клеточного признака колебалась от 0,4 до 1,0$.

Вторым по распространению мутантным вариантом является НвЕ, который был обнаружен в трех оболедованных районах. Однако частота носительства в целом по трем районам не превышала 0,5%.

В результате исследований проведенных в Пекинском районе в одном из- населенных пунктов, (с.Кичик дахна) среди 384 обследованных жителей было обнаружено гетерозиготных носw. зля НвС (1,0$; генная частота - 0,0052), кроме того в отом же селении частота носительства Нв£ составляла 0,3$ (генная частота - 0,0013). В целом же по Шекинскому району частота НвС не превышала 0,3$.

Впоследствии в тех населенных пунктах где оыли выявле'ны аномальные Нв были проведены семейно-генетические исследования. Порченные данные свидетельствовали, о' том, что наряду с относительно

высокой частотой встречаемости Нвб на территории Азербайджана существуют очаги распространения НвЕ, НвС'и НвДЭР^'а^ , где в кода исследований было выявлено соответственно 38, 45 и 29 гетерозиготных носителя. ' .

Помимо вышепредставленных мутантних вариантов Нв проведенное выборочные исследования позволили выявить редкий мутантный . вариант НвХ^^го^с , При проведении семейно-генетических исследований наряду с 23 гетерозиготными носителями было выявлено и 2 гомозиготных носителя НвЛ.

Оценка частоты аномальных Нв была также проведена среди ■ больных, находящихся на амбулаторном и стационарном лечении в Азерб.Н/Ш гематологии и переливания крови. Из 5.523 обследованиях у 3% были обнаружены аномальные Нв, что относительно выше результатов выборочных исследований, проведенных в целом по республике.

Анализ результатов выборочных исследований проведенных в цело,-: по республике выявили важную особенность распространения аномальных Нв. Было установлено крайне неравномерное распределение частот аномальных Нв в обследованных районах. При.сопоставлении частоты генов был выявлен значительный размах колебаний от О до 0,0150. Результаты исследований показали, что наиболее высокие частоты аномальных Нв наблюдались в районах относящихся к низменной, пред- и низкогорной зонам республики, а в населенных пунктах относящихся к среднегорной и высокогорной зонам аномальных Нв выявлено не было.

Кликико-гематологическая характеристика структурных гемоглобинопатии . В зависимости от структурного варианта, а также от генотипа все носители аномальных Нв были разделены на 7 групп. 5 I группу было включено 128 гетерозиготных носителя Нв5 . Из ' них 83 мужчин и45 ненцин в возрасте от 16 до 52 лет. Все они выявленные при семейно-генетическом исследовании в.Шеки-Закаталь-окой (предгорной) зоне и Низменно-Иирванской (равнинной) зоне республики били представителями азербайджанской национальности. Практически все гетерозиготы по Нв5 считали себя здоровыми. Однако при клинико-гематологическом изучении были получены еле-", дующие результаты, представленные в таблице I. Исходя из содержа-ни Ке&, все гетерозиготы были разделены на три подгруппы: в первую подгруппу были включены 16 гетерозигот с Нв3<30#, во вторую

Таблица I

Сравнительная оценка гематологических показателей у гетерозиготных носителей в зависимости от количества Нв5

Группа обследованных Общий Нв, г/л СОЭ, фл ССГЭ, пг Гематокрит,' л/л Нв5 , % Ре тику ло-циты, %

Гетерозиготы по НвЗ 129.8 84.3 28.1 0.39 35.1 0.92

/> = 123 1 0.5 ¿0.4 ±0.2 - 0.002 ¿0.4 ¿0.03

I. Лица с. Нв 5 < ЗОЯ 118.1 76.8 25.1 0.36 28.3 1.23

Л =15 ± 0.9 ¿0.5 ¿0.2 ¿0.004 - ¿0.6 ±0.07 ,

2. Лица с Нв5 =30-382 135.3 84.5 ?8.3 0.40 35.3 0.80- 0

А =. 44 ¿ол ¿0.2 ±0.2 • ¿0,002 ¿0.2 ¿0.03 1

3. Лица с Нв5 > 38? 136.1 91.2 30.5 0,41 41.2 0.75

Л = 53 ¿0 .4 ¿0.3 ¿0.2 ¿0.002 ¿0.2 ¿0.03

Контрольная.группа ■ 140.1 91.8 30.3 0.43 0,73

Л = 40 10.5 ¿0.6 ¿0.2 ¿0.001 ¿О.ОЦ

г'-дгоуппу были включены 44 гетерозигот с Нв & = 30-38$, а в грчтыо - 63 гетсрозягот с Нвй>38$. Следует отметить, что всего сь'ла обнаружена 21 гетерозигота с уровнями Нвб5<30$. Однако у пктс носителей из этой подгруппи была обнаружена .сопутствующая ¡кслззодефицитнак анемия, вследствие чего они были исключены из дальнейшего исследования. При анализе гематологических показателе;5, представленных в таблице I установлено, что показатели сред: го-оодержния гемоглобина, ССГЭ и СОЭ в подгруппе I достоверно сн:;„:а;-::: (?< 0,01) при сравнении с таковыми во 2-й и 3-й под--р?ппг.х. При сопоставления показателей ССГЭ и СОЭ у лиц с

с ^коваки з контрольной группе достоверных различий ¡1. он-, .алось (?>0,05), однако было установлено достоверное с:-::;,ич:ке среднего содержания Нв.

Большой интерес представляют данные детального изучения фе-готпп .«ческах проявлений у гетерозиготных носителей Нв$ . Было ус:.?л.сглено, что существует прямая зависимость клинических и гама-тс;:оп:ческих проявлений от уровня Нь.^ . У" гетеро.зигот с НВ 5 < 30® !:а«ось'д:е выражены гематологические проявления, а у носителей с Нг\'7>35$ - клинические.

По итогам обследования двух климато-географических регионов наиболее часто, -в 51$ случаев, встречались носители с Нв3>38$, ¡.с наряду с ними было выявлено 16 лиц с Нв£< 30$. Содержание оы-юроточисго железа было у них г пределах нормы, что исключает ' гозчо;;:пость влияния его на содержание НвЛ . Однако наличие внутрг- ; «¡жгроиитасных включений в единичных клетках у большинства гете-розигот с Нв 3 < 30$. а также низкие уровни среднего содержания

ьОЭ и ССГЭ дают основание полагать о наличии сопутствующей о< -толассемии-1 в этой подгруппе гетерозигот. Следует отметит.,, тоже; что подавляющее большинство (13 чел овек) из этой подгруП-пь были представителями .Шеки-Закатальского региона. 3 этш. плане заслуживает внимания исследования, лров. ,енные за последние годы г. э■;">;■! регионе, которые позволили установить, что только в Габе-лнчском районе встречаемость гена Нвб рацна 3,4$ (Р.Ш.Г/стамов, 1?б5),- а частота рас -ространения генов ы. -талассемии в отом же р;:::опе составляет'14$, а в соседнем Шекинском - 9$ (Д.Г.Газиев, 19со). Кроме юго, результаты наших исследований были подтверк-

р-=.ооте.»!и по изучению структуры соответствующих с*-глобино-.'•::х к .тестеров у гетерозиготных носителей Нв5 ^■Ни1ъпшп} ^977;

Резюмируя вышеизложенные"данные, можно сделать вывод, что "высокая частота распространения гз :ов с< -тал^ссекии л Кв£> э • этом регионе приводит к больаой вариабельности содержания , что в свою очередь находит отражение а разнообразии стенотипических проявлений у гетерозиготных носителей.

' Во вторую группу были включены '+5 гетерозиготных носителя НвС в возрасте от 3 до 83 лет. Из них 29 му&чин и 16 лгенщик; все они были преАставителями азербайджанской наииональнос-тк.-Как показали результаты клинико-гематологического исследования, у гетерозиготных носителей НвС наряду с незначительными клин;;- • ческими проявлениями наиболее были гнракены гематологические проявления. Анализ гематологических данных пок.'_с ;л, -о наиболее характерным для носителей НвС было наличие в мазках периферической крови мишеневиднчх клеток. Кроме того, в 32 человек (71,1?') был обнаружен анизоцитоз, а у 25 (55*5$) - по.пмлоцитоз ; 0?3 была повышена у всрх гетерозигот по НвС. Пока за-эли среднего содержания Нв , ССГЭ и СОЭ у носителей НвС составляли соответственно 124,5 ¿1,0 г/л, 28,9 * 0,2 пг ч 88,1 £ 0,2 фл и при сравнении с таковыми в контрольной группе было установлено достоверное снижение (Р < 0,01). Процентное содержание НзС + У обследованных гетерозигот колебалось от 37 до 46 %, составляя в среднем . 41,5 * 0,3$. Обобщая полученные- результаты гетерозиготного носи-тельства НвС у азербайджанцев следует отметить, что в основном они согласуются с данными литературы ( £>ипп? -Л , 1966; НиЩтм, 1977).

При проведении структурных исследований НвС бил идентифицирован в трех случаях. Последующее проведение семейпо-генетичес-кого анализа в .каждом конкретном случае позволило выявить с целом в трех обследованных семьях 27 гетерозиготных носителя НвС _/&б глу->лиз. Следует отметить, что кроме трех обследованных семей НвС был обнаружен еще в двух семьях, где в общей сложности было выявлено 18 гетерозиготных носителя.. Структурное исследования в этих семьях не били проведены, тем не менее результаты ряда исследований,' проведенных - с цель.": дифференциации аномального гемоглобина дали основание считать, что данный м/-тантный вариант является НвС.

В третью группу было включено 38 гетерозиготных носителя НвЕ в 'возрасте от 8 до 53 лет. Все они были представителями азербайджанской национальности. Как показали результаты клинико-гематологичес кого обследования, несмотря на практически бессимптомное течение, у гетерозигот по НвЕ были обнаружены те или иные гематологические изменения, фенотипически напостнвющиа гетерозиготную форму ß> -талассеют. Анализ результатов гематологического исследования показал, что характерным для всех обследованных гетерозигот было наличие мишеневидных эритроцитов. Помимо этого, у 15 гетерозигот <39,5%) мы отмечали анизоцитоз, у б (15,3 %) - незначительный пойкилоцитоз. Показатели среднего содержания Нв , ССГЭ и СОЭ у гетерозигот по НвЕ составляли соответственно 126,6 - 1,1 т/л, 26,2 ~ 0,2'пг и 83,5 - 0,3 фл и при сравнении их с соответствующими показателями у здоровых лиц было установлено достоверное снижение (Р<0,01). Количество НвЕ + + Ар у гэтерозигот колебалось от 27 до составляя в среднем 30,3 i 0,3%. Результаты изопропанольного теста свидетельствовали о нестабильности этого мутантного варианта. Суммируя результаты гетерозиготного носительства НвЕ ^ азербайджанцев, а также сопоставляя их с данными литературы Х&гаеуег, I9Q2; SZuißinA?; и соввт., 1980), мы приили к заключению, что в основном они совпадают. ' .

Структурные исследования, подтвердившие наличие НвВ ^26 глу->ли^ были проведены в трех семьях,;где в целом по результатам семейно-генетичаского анализа было выявлено 15 гетерозиготных носителя. В остальных четырех семьях, где в общей сложности выявлено РЗ гетерозиготы, исследования по структурной идентификации не проводились. •

В ходе проведенных исследований у у человек ь возрасте от 6 до 28 лет было обнаружено двойное гетерозиготное состояние по генам НвЕ и Jb -талассемии, которые были включены в 4 группу. Все они были представителями азербайджанской национальности. Для клинической картины наиболее была характерна аномия сродней тяжести, увеличение селезенки, изменения костей черепа и четко выряженные морфологические изменения эритроцитов периферической kj-оеи (пиизо- и поЧкилоцктоз,' гипохромия, киаоневидность). В • тэблипе ? пролстгэвлсны гематологические и биохимические покэзп- -

Таблица 2

Средние гвиатологи^сгМ'о и биохимические показатели, у больных о оочвтатлп «осительством НзЕ^ -талэс-С9МИЯ и у здоровых

Показатели Больные Здоровые

Гемоглобин, г/л 89, £2,1 132,010,5

Эритроциты, хЮ^/л 3,58±0,И . . 4,4210,03

ССГЭ, пг 24,810,3 • 20; 510,2 •

СОЭ, фл 79,5Ю,9 93,2^0,2

Ретикулоциты, % 4,5*0,09 0,7010,03

Нормобласты, на 100 клеток 9,3-1,3

Шлирубин:

общий, мкмоль/л 56,514,3 0, 5Ю, 5

непрямой, мкмоль/л 48,3-3,2 5,5*0,5

НвР, % 25,511,5 0,9510,05

НвЕ + А2. % . 45,511,6 ■ -

тели обследованных больных с двойным гетерозиготным состоянием•

. Как видно из данных таблица показатели среднего содержания Нв, СОЭ и ССГЭ значительно снижены при сравнении с таковыми у здоровых людей.

Результаты электрофореза гвмолизатов на ацетат-целлюлозной пленке а такие препаративного разделения цепей

глобина ионообменной хроматогрзфивй «а КМ-целлвлозе свидетельствовали о сохранении выработки нормальных ^-цепей у всех 9 компаундов, что в свою очередь дает основание предполагать о присутствии у них ^-талассомического гена.

Анализируя полученные результаты и принимая во внимание исследования ряда авторов (ТЛа^егл^ ^ЧМ. ' 1960; /Ьи.»п, , 1986), следует отметить, что относитель-

но мягкое клиническоэ течение у компаундов , по

всей видимости, связано не только присутствием /> -талассоми-ческого гена, но а также о компенсаторным увеличением выработки у -цепе!.

'/з 9 больных у б наличие НвЕ 26 глу~>лиз было подтверждено результатами структурного исследования и данными семэйно-генетического анализа. В остальных 3 случаях сочетанного носи-тсльствэ НвЕ/структурные исследования не проводились. В пятую группу было включено 29 гетерозиготных носителя

в возрасте от 5 до 53 лет. Все они были представи-: тслями азербайджанской национальности. Гетерозиготные носители по результатам обследования имели нормальное физическое разви-■ тке, нормальные гематологические показатели, практически отсутствовала клиническая симптоматика. Однако при анализе мазков пору.^зрческоч крови у них были обнаружены изменения оо стороны уср^ологии эритроцитов (мишеневидность, анизоцитоз, пойкилоци-то-"). Количественная оценка фракции Нв показала, что процентное содержание Кв;0 £ в основном колебалось от 35 до составляя в среднем 38.8 - Характерным для гетерозигот по

НвдэР«"^ были нормальные уровни Нв А£ и НвР. Суммируя результаты проведенных исследований следует отметить, что в основном они совпадают'с донными литературы и соавт., 1973; сХеЬтсх. пп Слъгеее , 1У74).

В ходе структурных исследований НвХ> был идентифи-

цирован в двух случаях. Результаты структурной идентификации и секе^но-генетичеокого анализа позволили выявить в двух обследованных семьях 16 гетерозиготных носителя Нв^эР^-у-б /.721 глу-$> ~>гл.-?. Следует отметить, что НвХ>Ал<ул& был обнаружен еще в двух семьях, где в общей сложности было выявлено 13 гетерозигот-. них носителя, однако исследования по структурной идентификации 2 птих семьях не проводились.

Помимо аномальных Нв описанных выше, в ходе выполнения на-■стояще1* работы е двух случаях была проведена структурная иден-тугикзция редкого мутантного варианта \laZDetrozi ^95 лиз ->асн. ? последующем, при проведении семеЧно-генетических исследований в общая сложности было выявлено 23 гетерозиготных носителя' Нв Д^сы-ось , которые были включены в шестую группу . Из ?3 гетерозигот только четверо оыли представителями азербайджанской национальности, а остальные 19 - лезгины, представляющие этническую группу, проживающую, в северо-восточных районах Азербайджана, д гетерозиготных носителей было характерно нормальное физичес-

кое развитие, отсутствие клинической симптоматики, нормальные гематологические показатели. Проба из термостабильность и изо-пропанольный тест свидетельствовали о стабильности этого редкого цутантного варианта. Уровни налах гемоглобячовых фракций у всех обследованных гетерозигот были в пределах нормальных величин. Количественная оценка фракции Нв показала, что процентное содержание у гагерозигот колебалось в пределах от

49 до 53%, составляя в среднем 50, £0,3%. Из 73 выявленных гетерозигот у 19 наличие НвЛ^го^ уз95 лиз->асн'.было. подтверждено результатами структурных исследований и семечно-генетическо- • го анализа.

При семейно-генетическом исследовании наряду с гетерозиготными носителями мы обнаружили двух гомояиготных'носителя Нв . Выявлении предшествовало проведенное нами структур-

но е исследование позволившее идентифицировать у прсбэнда, женщины 36 лет, лезгинскоя национальности . Ц-вХ>^>-осс . Обследование родителей показало, что мутантныЯ вариант унаследован пробандом от мэтори. Пробанд замужем, брак кровнородственный (двоюродные брат и сестра). При обследовании мужа пробанда у него тагокз диагностировано гетерозиготное носительство НвХ5а£го1'£ . Большой интерес представляли результаты полученные в ходе обследования-детей пробанда. Так, из пяти обследованных детей у трех было диагностировано гэтерозиготное носительство НвТ)е~£го1£ , а у остальных двух дете'1, дочери и сына в возрасте 14 и 13 лет, при электрофоретическом исследовании гемолизатз крови обнаружена наряду с полным отсутствием НвА аномальная фракция мигрирующая в зоне Нви составляющая соответственно 95,1 и 95,3%. Уровни Нв А? » Нв Р у обоих были в пределах нормы. Данные клинического обследования свидетельствовали с нормальном физическом развитии и отсутствии каких-либо клинических проявления. Гематологические показатели были в пределах нормы, однако в мазках периферической крови у обоих были выявлены единичные мишзневидные эритроциты.

.' Таким образом, результаты комплексного исследования позволяют констатировать как у дочери, так и у сына пробанда наличие гомозиготного носительства Нв .Т~>е~£гос6

Подводя итоги, можно резюмировать, что в результате проведенной работы определен спектр цутантных вариантов Нв, встречающихся на территории Аздрбайджача, установлены клинико-гематоло-гические особенности носительства аномальных Нв, получены данные о распространении мутантных Нв в отдельных районах республики, оценены генные частоты этих структурных аномалий, что имеет .существенное значение для организации лечебно-профилактической помочи на местах.

ВЫВОДЫ

1. Проведена структурная идентификация аномальных гемогло-бинов, доказавиая наличие в Азербайджане НвС в глу-;>лиз, НвВ р 25 глу-> лиз, НвДЭР"^/«-^ ^/3121 глу->глн,

2. При обследовании 10.894 жителей 13 районов Азербайджана выявлено 128 случаев гетерозиготного носительства Нв£, 45 случаев гетерозиготного носительства НвС, 38 случаев - НвЕ, 29 случаев - , а также 9 случаев сочетанного носительства - НвЕ/jà-~£t>-. . • Проведена оценка частот встречаемости этих ге-моглобинов в исследованных районах.

3. Обнаружены очаги распространения НвС в Шекинском районе,

в Дивичинском районе, НвЕ г в Уджарском, Шекинском

и Нофтечалинском-районах.

4. Установлено, что гетерогенное распределение НвЗ • является непосредственной причиной выраженной вариабельности клинико-

'гематологических проявлений у гетерозиготных носителей.

5. Разработан и внедрен в практику метод определения относительного количества фатального гемоглобина в образцах из капиллярной крови, основанный на усовершенствовании метода Бетке.

6. Проведенные структурные исследования позволили идентифицировать 'в двух случаях J395 лиз-^асн и тем самым доказать наличие этого редкого мутантного варианта не только в азербайджанской, но и в лезгинской популяциях.

7«. При санайнс-генотических исследованиях в Агдашском, Геок-чайском и Габалинском районах выявлено 23 гетерозиготных носителя НвЛ^e-troli. , кроме того у ?,лиц диагностировано ранее неизвестное, на земном шаре гомозиготное состояние по Hb£>eiyoi-&.

8. Установлено, что гетерозиготное носительство HbJDiiroii не сопровождается клиническими и гематологическими проявлениями.

9. Установлено, что гомозиготное носительство Нвх>«!^г<"'г-наряду с нормальными гематологическими показателями и отсутствием каких-либо клинических проявлений сопровождается незначительными изменениями со стороны,'морфологии эритроцитов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Мамедова Н.С., Рустамов Р.И., Гаджиев Э.Г\, Алиев В.М. Первое описание гетерозиготного носительства гемоглобина С в азербайджанской популяция // В сб. "Гемолитичеокие анемии".

- 1983. - Баку. - C.I46-I53.

2. Рустамов Р.Ш., Мамедова Т.А., Ширинова Э.А., Гаджиев Э.Г. Гетерозиготное носительство аномальных гемоглобинов (б, С,Е;Д) в азербайджанской популяции //2 Всеооюзныч съезд гематологов и транофузиологов. - 1985. - Львов. - Тезисы. - С.360.

3. Рустамов P.M., Гаджиев Э.Г., Луценко Й.Н., Асеева E.H., Спи-вак В.А., Токарев Ю.Н. Две родственные семьи - носители НвС

/>бглу->лиз в азербайджанской« популяции //Гематол.транс-фузиол. - 1987. - № I. - С.55-57.

4. Гаджиев Э.Г., fycrsMOB Р.Ш. Определение содержания фатального гемоглобина в образцах из капиллярной крови //Лабораторное дело. - 1988. - № 8. - С.34-36.

5. 1^стамов Р.Ш., Гаджиев Э.Г. Экспресс-метод определения феталь-ного гемоглобина // Конф. "Изобретательство и рационализации

в здравоохранении Азербайджана". - 1988. - Баку. - Тезисы. -

- С.39-40.

6. Гаджиев Э.Г., Мамедова Т.А., Асадов Ч.Д. Применение молекулярных методов исследования для диагностики аномальных гемоглобинов в Азербайджане // Конф. "Актуальные вопросы медицинской, диагностики". - 1990. - Баку. - Тезисы. - С.132-133.

7. Гаджиев Э.Г., Асадов Ч.Д., Рустамов Р.Ш., Спивак В.А., Асеева Е.А., Луценко H.H. Молекулярная диагностика редкого аномального гемоглобина X^efroli (р 95 лиз->асн), обнаруженного в Азербайджане // 2 Всесоюзный съезд медицинских генетиков. -1990. - Алма-Ата. - Тезисы. - С.89.

8. Рустамов Р.Ш., Мамвдова Т.А., Гаибов Н.Т., Гаджиев У.Г., Абиль-гасанова M.lü., Кулиева Е.Д., Тагиев А.ф. Частота наследственных гемоглобинопатия и дефицита Г-6-ФДГ эритроцитов в ранее необследованных районах Азербайджана // 2 Всесоюзный съезд медицинских генетиков. - 1990. - Алма-Ата. - Тезисы. -

- С.378-379. |

9. Гаджиев 'J.T. Распространение и молекулярная диагностика структурных гемоглобинопатии в АзероаЯдаане // 2 съезд гематологоь и транофузиологов Азербайджана. - 1990. - Баку. - Тезисы. -

С.52-53.

10. Гаджиев У.Г., Асадов Ч.Д., РустамоЕ Р.Ш., Мамед'ова Т.А., Дэда-шова Т.О., Баширова Г.Б., Асеева Б.А'., Спивак В.А. Структурная идентификация гемоглобина И ß?^ глу->лиз, ассоциированного с ¡ь+ - таласоемиеК // 2 съезд гематологов и трансфу-зиологов Азербайджана. - 1У90. - Баку. - Тезис:,._- С.57-58.

11. Эфендиева З.Г., -Руатамов -Р.Ш'.",~Гвджи8Е Э.Г. Прокккуточнвя та-лассемия, обусловленная двочной гете|розиготностью по генам

ß> -талассемии и гвмоглоонка Е //2 съезд гематологов и транс-фузиологов Азероачджана. - 1990. - Бэку. - Тезисы. - С.58-69.

12. Гаджиев Э.Г., Рустамов Р.Ш., Асадов Ч.Д., Мамедова Т.А.,Джа-фаров Ф.М., Кулиева Е.Д. Гетерозиготное носительстЕО гемоглобина Й в Азербайджане. //Гематол. трансфузиол. - 1991. -

- * 7. - С. 15-18.

13. Гаджиев 2.Г., Токарев Р.Н., Асадов Ч.Д., Рустамов Р.Ш., Ыаме-дова Т.А. Гемоглобин С ^ббглу->лиз в азербайджанской популяции. //3 Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов. -

- 1991. - Киров. - Тезисы. - С.306-307. .

Подписано к печати II.U6.U2 г.. Гит-ах 100, 'зак. 4ljß ■ Типография Ä Fl»