Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Молекулярная диагностика диффузной B-крупноклеточной лимфомы с первичным вовлечением лимфатических узлов средостения и первичной медиастинальной B-крупноклеточной лимфомы

На правах рукописи

Мангасарова Яна Константиновна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ДИФФУЗНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМЫ С ПЕРВИЧНЫМ ВОВЛЕЧЕНИЕМ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ СРЕДОСТЕНИЯ И ПЕРВИЧНОЙ МЕДИАСТИНАЛЬНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМЫ

14.01.21 — гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 ш ш

Москва — 2012

00501654О

005016545

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители: д.м.н. Магомедова А.У.

к.б.н. Мисюрин A.B.

Официальные оппоненты:

д.б.н. Ковригина A.M. Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующая патологоанатомическим отделением

д.м.н., профессор Румянцев С.А. Федеральное государственное бюджетное учреждение Федеральный научно-кинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева, заведующий отделом молекулярной и экспериментальной медицины

Ведущее научное учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение Онкологический научный центр им. H.H. Блохина Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится / ^ 12 года в-часов на

заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Гематологического научного центра Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Автореферат разослан «___»___2012 года

Ученный секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Зыбунова Е.Е.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

bulky disease — опухоль больше 7,5 см; ECOG — Eastern Cooperative Oncology Group

(Восточная Кооперативная Онкологическая группа); JAK2 — Janus Kinase 2;

MAL — Maturation Associated protein Lymphocyte; PDL1 — Programmed Death Ligand 1 ; PDL2 — Programmed Death Ligand 2; TRAF1 — TNF Receptor Associated Factor

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Лимфомы средостения составляют 20% всех опухолей с вовлечением медиастинальных структур. В-крупноклеточные лимфопролиферативные заболевания (ЛПЗ) с первичным вовлечением переднего средостения представлены первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомой (ПМБКЛ) и диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДБККЛ). Несмотря на то, что ПМБКЛ является одним из вариантов ДБККЛ, они имеют разное происхождение и, как следствие, разные иммунологические, молекулярно-генетические характеристики и ответ на терапию.

Основываясь на одинаковой рентгенологической (первичное вовлечение лимфатические узлов средостения и смежных структур) и клинической картине (одышка, кашель, синдром сдавления верхней полой вены), схожих иммунологических характеристиках ДБККЛ с первичным вовлечением лимфатических узлов (л/у) средостения, как правило, относят к ПМБКЛ, что является ошибочным, поскольку терапевтическая тактика и прогноз в отношении ДБККЛ и ПМБКЛ разные.

Анатомическая локализация, иммунофенотипические и биологические признаки свидетельствуют о происхождении ПМБКЛ из В-лимфоцитов тимуса. В отличие от ПМБКЛ, ДБККЛ происходит из В-клеток зародышевого центра лимфатических узлов или активированных В-клеток периферической крови, и вовлекают в процесс в начале медиастинальные лимфатические узлы и в дальнейшем смежные структуры средостения.

По данным гистологического исследования при ПМБКЛ в отличие от ДБККЛ выявляются островки эпителия тимуса, на фоне основного субстрата опухоли, что отражает происхождение опухоли из В-клеток тимуса. Однако, данная гистологическая картина встречается не более чем в 25% случаев и соответственно не может служить основным дифференциально-диагностическим критерием ДБККЛ и ПМБКЛ. Наиболее важными иммуногистохимическими (ИГХ) маркерами используемыми в диагностике ДБККЛ и ПМБКЛ являются CD23, CD30 и поверхностный иммуноглобулин М (slgM). Однако их информативность является недостаточной, что приводит к формированию группы пациентов в пределах 25-50% случаев с перекрестным иммунофенотипом.

Появление новых данных о различии профилей экспрессии генов при ПМБКЛ и ДБККЛ создало предпосылку для использования молекулярных методов в дифференциальной диагностике В-крупноклеточных лимфом с первичным вовлечением передне-верхнего средостения.

Отдельных работ, посвященных лечению ДБККЛ с первичным вовлечением средостения нет. Главным образом, это связано с тем, что пациентам устанавливается диагноз ПМБКЛ с учетом клинической картины, а не ДБККЛ. Прогноз для жизни у больных ДБККЛ со II стадией и размером опухоли более 7,5 см (bulky disease) в дебюте заболевания и у пациентов с генерализованной формой ДБККЛ (III—IV ст.) одинаковый,

общая пятилетняя выживаемость на СНОР-подобных схемах химиотерапии не превышает 50% по данным South West Oncology Group. Улучшить результаты лечения в данной группе позволяет использование высокодозной полихимиотерапии (ПХТ). В отличие от ДБККЛ, использование СНОР-подобных программ химиотерапии у пациентов с диагнозом ПМБКЛ позволяет достигнуть 70% общей пятилетней выживаемости. Стоит отметить, что все клинические исследования по оценки эффективности различных схем ПХТ у пациентов ПМБКЛ имели важную особенность: из данной группы не были выделены пациенты ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения.

Цель исследования. Определить молекулярно-диагностические критерии ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ и оценить эффективность высокодозной полихимиотерапии при данных нозологических формах.

Задачи:

1. Изучить экспрессию генов JAK2, PDL1, PDL2, MAL, TRAF1 у больных ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ.

2. Определить основные дифференциальные молекулярные критерии ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ.

3. Определить эффективность ПХТ по программе m-NHL-BFM-90 у больных ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ.

4. Оценить токсичность и возможные осложнения лечения по программе m-NHL-BFM-90 у пациентов ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ.

Научная новизна

Впервые определена частота гиперэкспрессии генов JAK2, PDLl, PDL2, MAL, TRAF1 у больных ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ.

Установлена возможность использования показателей экспрессии генов JAK2, PDLl, PDL2, MAL, TRAF1 в дифференциальной диагностике ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ.

Определено, что для проведения дифференциальной диагностики ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ необходима гиперэксспрессия двух и более исследуемых генов.

Показано, что эффективность высокодозной полихимиотерапии у пациентов ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения выше, чем у больных ПМБКЛ.

Научно-практическая ценность работы

Разработаны методы количественной оценки экспрессии генов JAK2, PDLl, PDL2, MAL, TRAF1 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.

Показана целесообразность использования показателей экспрессии генов JAK2, PDLl, PDL2, MAL, TRAF1 в качестве дифференциально-

диагностических критериев ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ.

Определена эффективность высокодозной ПХТ по программе m-NHL-BFM-90 у пациентов ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ.

Оценена токсичность m-NHL-BFM-90 у пациентов ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ.

Положения, выносимые на защиту

1. Гены JAK2, PDL1, PDL2, MAL, TRAF1 должны использоваться в качестве дифференциально-диагностических критериев ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ.

2. Гиперэкснрессия двух и более исследуемых генов выявлена в 100% случаев у пациентов ПМБКЛ и ни в одном наблюдении в группе пациентов ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения.

3. Эффективность высокодозной ПХТ по программе m-NHL-BFM-90 выше у пациентов ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения (ОВ — 95%, 4-летняя БСВ — 89%), чем у больных ПМБКЛ (ОВ — 82%, 4-летняя БСВ — 74%).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 6 в журналах рекомендованных ВАК.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались в отделении химиотерапии и интенсивной терапии гематологических заболеваний (оХиИТГЗ) ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ, использовались в лекциях для клинических ординаторов и практических врачей, проходивших стажировку в ГНЦ.

Результаты работы доложены на Гематологическом декаднике (Москва 2009-2011 гг.), международных конференциях: 16 congress of Evropean hematology association (Лондон, июнь 9-12, 2011), American Society of Hematology (Сан-Диего, декабрь 10-13,2011).

Апробация диссертации состоялась на проблемной комиссии ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ «Опухоли лимфатической системы, патология красной крови и порфирии» 20 февраля 2012 г. (Протокол №2).

Объем и структура диссертации: диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав собственных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 10 отечественных и 157 иностранных источников. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 28 рисунками.

Диссертация выполнена в оХиИТГЗ (заведующий отделением к.м.н., доцент Кравченко С.К.) ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ (директор - академик РАМН Савченко В.Г.)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Из 309 больных нодальной В-крупноклеточной лимфомой наблюдавшихся в оХиИТГЗ ФГБУ ГНЦ МСРЗ РФ с 2004 по 2011 год первичное вовлечение передне-верхнего средостения выявлено у 42 (14%) пациентов в возрасте от 18 до 70 лет (медиана возраста 31 год): 16 мужчин, 26 женщин. Группа из 42 пациентов с первичным вовлечением средостения и гистологическим диагнозом «Первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома» была включена в данное исследование.

Распространенность опухолевого процесса на момент выявления заболевания и при контрольных обследованиях в процессе лечения оценивали по классификации An. Arbor (1971 г.)

Молекулярный анализ проведен у 33/42 (78,5%) пациентов.

У всех 42 пациентов включенных в исследование оценена эффективность и токсичность m-NHL-BFM-90.

Молекулярное исследование

Молекулярное исследование выполнено 33 пациентам в возрасте от 18 до 72 лет (медиана 32 года) с вовлечением л/у средостения. С целью формирования групп контроля были получены лимфоциты крови от 12 здоровых добровольцев в возрасте от 19 до 50 лет (медиана 27 лет), опухолевые клетки из биоптата лимфатического узла 12 больных в возрасте от 20 до 68 лет (медиана 45 лет) с установленным диагнозом ДБККЛ III - IV стадия (без вовлечения медиастинальных лимфоузлов) и популяция лимфоцитов из 5 образцов нормальных лимфоузлов.

Таким образом, молекулярное исследование проведено в 62 случаях.

Для всех пациентов и доноров определялся уровень экспрессии мРНК генов JAK2, MAL, PDL1, PDL2, TRAF1.

Уровень экспрессии генов определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Особенностью данного исследования, отличающей его от обычной ПЦР, является возможность количественного измерения ПЦР-продукта во время экспоненциальной фазы процесса амплификации.

Выделение РНК. К парафиновым срезам (толщиной 3 микрона) добавляли 1000 мкл ксилола, тщательно встряхивали на вортексе затем выдерживали их при комнатной температуре в течение 2 минут. Парафин при этом растворялся. Затем пробирку центрифугировали в течение 5 мин/10 тыс. оборотов в минуту, осадок сохраняли, а супернатант удаляли. Данную процедуру повторяли 2 раза до полного удаления парафина, затем добавляли к осадку 1 мл 96% спирта, встряхивали и центрифугировали в течение 5 мин/10 тыс. оборотов в минуту. Данную процедуру повторяли 2 раза. Ткань лимфоузла лизировали в 500-600 мкл буфера следующего состава: 4,5 M гуанидин изотиоцианата, 25 шМ цитрата натрия, 0,5% лаурил саркозила, 0,1 M 2-меркаптоэтанола.

В пробу добавляли фенол (рН 5,2) в объеме, равном объему лизирующего буфера (1:1), затем хлорофорй объема фенола и ацетат натрия 2 М (рН 4,5) 1/10 от общего объема раствора. Смешивали раствор на вортексе и затем центрифугировали в течение 10 мин/10 тыс. оборотов в минуту. Отбирали верхнюю водную РНК-содержащую фазу и добавляли равный ей по объему изопропанол. Затем выдерживали при температуре -70°С в течение минимум 2 часов. После этого пробу центрифугировали в течение 5 минут при 12 тыс. оборотов в минуту, осадок дважды промывали 200 мкл 70% этанола и центрифугировали в течение 5 минут при 12 тыс. оборотов в минуту. После промывания этанолом осадок РНК высушивали, растворяли в 15-20 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, и с целью определения концентрации РНК проводили спектрофотометрию. Для последующей реакции обратной транскрипции использовали 1 гамму РНК.

Реакция обратной транскрипции. При реакции обратной транскрипции к раствору РНК 1 мкг добавляли 6 мкл гексамеров (концентрация 50 нМ) и проводили отжиг 30 сек. при 95°С с последующим быстрым охлаждением. Далее добавляли реакционную смесь 14 мкл, содержащую 75 шМ КС1, 50 шМ Трис, 10 mM DTT, 3 мМ MgC12, 1 шМ каждого дезоксирибонуклеотида, 20 ед. рназина-ингибитора РНКаз, 100 ед. обратной транскриптазы M-MLV и инкубировали в течение 1-1,5 часов при 37°С.

ПЦР в реальном времени. Для проведения ПЦР в реальном времени использовался прибор АВ 7500 (Applied Biosystems) и технология TaqMan. Прибор для проведения ПЦР в реальном времени состоит из амплификатора, блока анализа флуоресценции и компьютерного блока со специальным программным обеспечением, с помощью которого можно проанализировать полученный результат и выразить количество определяемого транскрипта, как в абсолютном количестве молекул, так и по отношению к уровню экспрессии контрольного гена.

TaqMan ПЦР основана на 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. ДНК-зонд, имеющий флуоресцентный краситель на 54 -конце и гаситель флуоресценции на 3" -конце, комплементарен участку амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу. При отжиге зонд количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь

ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с зондом, начинает расщеплять его за счет 5'-экзонуклеазной активности.

В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может быть детектировано. Увеличение флуоресценции будет прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта. Количество ПЦР-продукта увеличивается с каждым циклом реакции вдвое. Поэтому зависимость количества продукта ПЦР от количества циклов выражается экспонентой.

Пороговая линия для исследуемых генов устанавливалась на уровне 50 для всех экспериментов, что позволило анализировать и сравнивать полученные в разных экспериментах данные. Наклон стандартной кривой теоретически должен быть равен -3,3, что соответствует эффективности амплификации 100%, тем не менее, наклон в интервале от -3,0 до -3,9 является приемлемым, так же как и коэффициент корреляции >0,95. Для коррекции стандартной кривой из анализа исключали точки (дубликаты) с большой разницей Ct в каждой тройке образцов.

Для каждой тройки образцов рассчитывалась средняя концентрация. Разница Ct не более чем в 1 цикл была допустима в каждой тройке повторов на ранних циклах (до 30). Допускалась разница Ct до 1,5 на более поздних циклах. Если значение Ct одного из повторов значительно отличалось от других, этот повтор исключался из анализа.

Контрольным геном выбран ABL (вирусолог ABELSON), т.к. он определяется во всех тканях организма на примерно одинаковом уровне. Образцы, в которых экспрессия гена ABL оказывалась меньше, чем 105 копий, исключались из анализа, как имеющие неудовлетворительное количество к-ДНК.

Для проведения амплификации были синтезированы оригинальные пары праймеров с местами посадки в разных, экзонах генов JAK2, MAL, PDL1, PDL2 и TRAF1. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов представлены ниже. Праймер:

JAK2 OF — AATAGCCAAAGAAAACGATC JAK2 QR — GCTCGAATACATTTTGGTAAGA MAL QF — GTACATAATTGGAGCCCACG MAL QR — AGGTAAAAGAGGGCAGCGGT PDL1 QF — TGCCGAACTACAAGCGAATTA PDL1 QR — TCCACAACCAAAATTCTTTG PDL2 QF — CTGGACTACAAGTACCTGA PDL2 QR -— CCTTTAGGATGTGAGTGTTT TRAF1 QF —AAGCCCAGGAAGCCGTCTTC TRAF1 QR — GCACCCAATTCCAGCCTCAG Зонд:

JAK2 — FAM-TGTCTTGTAGCTGATAGAGTTATAGATGGC-BHQ1 MAL — FAM-AAAATACAACATCACAGAGGAAGTAGAC-BHQ1 PDL1 — F AM-TGTGAAAGTCAATGCCCC ATACAACAA-BHQ1 PDL2 — FAM-TCTGAAAGTCAAAGCTTCCTACAGGAAA-BHQ1 TRAF1 — FAM-ACTCAGGAGAAGGCTCACCCCGAGGT-BHQ1 Во всех зондах содержался краситель FAM490.

Условия для проведения циклов количественной реакции ПЦР были следующие: 95°С — 10 мин, затем 50 циклов: 95°С — 15 сек, 60°С — 60 сек.

Для каждого образца ПЦР-реакция проводилась одновременно в трех лунках (трипликаты). Соотношение матрицы и реагентов было следующим: 5 мкл кДНК и 20 мкл реакционной смеси. Состав реакционной смеси на 1 пробу:

1. Н20 3 мкл

2. буфер 12,5 мкл

3. Rox 2,5 мкл

4. праймеры 1 мкл

5. зонд 1 мкл

6. Taq pol 0,2 мкл

Окончательный результат относительной экспрессии генов выражался в виде нормированных процентов по формуле:

Число копий генов (JAK2/ MAL/ PDL1/ PDL2/ TRAF1) , nnn/

-!-- X100%

Числокопий ABL

Полихимиотерапия больных

Все пациенты получили лечение по протоколу m-NHL-BFM-90 в ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ с ноября 2004 по сентябрь 2011 гг.

При наличии остаточного образования после завершения ПХТ, всем пациентам выполнялась лучевая терапия в суммарной дозе 36 Грей.

Оценка эффективности терапии проводилась согласно критериям Международной Рабочей Группы (International Working Group (IWG)) 2007 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты молекулярного исследования

Молекулярное исследование выполнено на опухолевой ткани 45 пациентов (33 пациента с первичным вовлечением средостения и 12 больных с генерализованнай формой ДБККЛ без вовлечения медиастинальных лимфоузлов), популяции лимфоцитов периферической крови от 12 здоровых добровольцев и на 5 образцах нормальной лимфоидной ткани. Пороговым значением, определяющим гиперэкспрессию гена, было выбрано наивысшее значение экспрессии, определенное у доноров.

Гиперэкспрессии исследуемых генов в нормальной лимфоидный ткани выявлено не было.

В контрольной группе у пациентов ДБККЛ III-TV ст. без вовлечения медиастинальных лимфоузлов (п=12) гиперэкспресиия гена JAK2 определялась в 1 (8,3%) случае, а гена TRAF] — в 2 (16%). Уровень

экспрессии генов MAL, PDL1, PDL2 был в пределах нормы. Ни в одном случае сочетанная экспрессия исследуемых генов не выявлялась.

У 20 (61%) из 33 пациентов с первичным вовлечением средостения определялась повышенная экспрессия вышеуказанных генов, что позволило подтвердить диагноз ПМБКЛ, а именно в 16 (78%) из 20 случаев выявлялась гиперэкспрессия гена TRAF1, в 3 (15%) из 20 гена PDL1, в 8 (40%) из 20 гена PDL2, в 19 (95%) из 20 гена JAK2, в 12 (60%) из 20 гена MAL. Во всех случаях определялась сочетанная экспрессия 2 и более генов. Данные представлены в таблице 1.

При анализе группы пациентов с гистологическим диагнозом ПМБКЛ у 13 (39%) из 33 больных отмечалось совпадение молекулярных маркеров с контрольной группой пациентов с диагнозом ДБККЛ III-IV ст. без вовлечения медиастинальных лимфоузлов. При этом отсутствовала гиперэкспрессия 2 и более исследуемых генов (JAK2, MAL, PDL1, PDL2, TRAF1), только в 1 (8%) наблюдении отмечалась гиперэкспрессия гена TRAF1.

Таблица 1

Частота выявления гиперэкспрессии генов JAK2, MAL, TRAF1, PDLI и PDL2 у пациентов ПМБКЛ и ДБККЛ с и без вовлечения медиастинальных

лимфоузлов

Группа пациентов TRAF1 MAL JAK2 PDL2 PDLI

ДБККЛ с вовлечением медиастинальных лимфоузлов 8% 0% 0% 0% 0%

ДБККЛ без вовлечением медиастинальных лимфоузлов 16% 0% 8,3% 0% 0%

Первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома 78% 60% 60% 40% 15%

Таким образом, у 13 (39%) из 33 пациентов диагноз ПМБКЛ был пересмотрен в пользу ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения. Выявлено, что уровень экспрессии генов JAK2, MAL, TRAF1, PDLI и PDL2 у пациентов ПМБКЛ по сравнению с ДБККЛ без поражения л/у средостения и ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения статистически значимо выше (р = 0,05) (рис. 2-3).

_____M IL fl g .J

2 3 4 5

ген

б)

Рисунок 2. Распределение величины экспрессии генов (1 — TRAF1, 2 — PDL1, 3-PDL2, 4 —JAK2, 5 — MAL). ДБККЛ без вовлечения /у средостения (рис. а). ДБККЛ с поражением л/у средостения (рис. б)

m m

6500 6000 5500 5000 4500

ООО 500 ООО 500 000 500 0

Рисунок 3. ПМБКЛ. Распределение величины экспрессии генов (1 — TRAF1, 2 — PDL1, 3- PDL2, 4 — JAK2, 5 — MAL)

Учитывая, что в патогенезе ПМБКЛ участвует несколько ключевых нарушений, отличающих этот вариант лимфомы от ДБККЛ, предполагается, что для верификации диагноза ПМБКЛ необходима констатация гиперэкспрессии не менее двух вышеуказанных генов. Использование такого строгого критерия позволит избежать диагностических ошибок, связанных с возможностью активации отдельных генов у больных ДБККЛ. Так, в рассмотренной контрольной группе больных ДБККЛ III-IV ст. (без вовлечения медиастинальных лимфоузлов) гиперэкспрессия гена JA К2 определялась только у 1 (8,3%) из 12 пациентов, TRAF1 — у 2 (16%) из 12. Однако, гиперэкспрессия 2 и более генов не выявлялось ни в одном случае у пациентов с диагнозом ДБККЛ (с и без вовлечения лимфоузлов средостения) и определялась у всех 20 (100%) пациентов с диагнозом ПМБКЛ.

Разброс величины экспрессии гена JAK2 в группе пациентов ПМБКЛ колебался в пределах от 1000% до 10124%, в то время как в группе ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения и без вовлечения медиастинальных л/у от 28% до 1000% и от 18% до 743%, соответственно. При этом медиана экспрессии гена JAK2 у больных ПМБКЛ составила 1824%, что в 5 раз выше этого показателя в контрольной группе ДБККЛ без вовлечения л/у средостения и в 17 раз — в группе пациентов ДБККЛ с вовлечением медиастинальных лимфоузлов. Данные представлены в табл. 2.

Таблица 2

Количественная характеристика экспрессии исследуемых генов

Диагноз TRAF1 медиана (диапазон) % PDLI медиана (диапазон) % PDL2 медиана (диапазон) % ; • JAK2 медиана (диапазон) % MAL медиана (диапазон) %

ДБККЛ без вовлечения л/у средостения (контроль) (п=12) 108 (14-360) 10,5 (10-340) 15 (14 -140) 379 (28-1000) 75 (20-469)

ДБККЛ с первичным вовлечением медиастинальных лимфоузлов (п-13) 100 (10-1451) 15 (11-45) 15 (11-43) 105 (18-743) 60 (20-290)

ПМБКЛ (п=20) 408 (18212564) 21.5 (17-704) 68 (20-1359) 1824 (100010124) 502 (205-4069)

Медиана величины экспрессии гена ТИ4Р1 в группе пациентов ПМБКЛ составила 408%, при диапазоне значений от 182% до 12564%, что в 4 раза превысило уровень экспрессии в двух других группах больных ДБККЛ (с и без вовлечения медиастинальных лимфоузлов). Медиана величины экспрессии при ДБККЛ с вовлечением л/у средостения составила 100% (101451%), в группе ДБККЛ без вовлечения л/у средостения — 108% (14360%).

Разброс значений экспрессии гена РВЫ в группе ПМБКЛ от 17% до 704%, медиана составила 21,5%, что в 1,4 и в 2 раза выше, чем в группе пациентов ДБККЛ с и без вовлечения лимфоузлов средостения. Разброс значений в группе пациентов ДБККЛ с первичным вовлечением

медиастинальных лимфоузлов составил 11-45%, в группе ДБККЛ без вовлечения медиастинальных л/у 10-340%.

Уровень экспрессии гена PDL2 у пациентов ПМБКЛ находился в диапазоне 20-1359%, медиана оставила 1824% и превышала в 4,5 раза медиану экспрессии в группе ДБККЛ (с и без вовлечения л/у средостения). Разброс значений в группе пациентов ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения составил 11-43%, в группе ДБККЛ без вовлечения медиастинальных л/у средостения — 14-140%.

Значение экспрессии гена MAL в группе пациентов ПМБКЛ колебалось от 205% до 4069%, в то время как в группе ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения и без вовлечения медиастинальных л/у — от 20% до 290% и от 20% до 469% соответственно. При этом медиана экспрессии гена MAL у больных ПМБКЛ составила 502%, что в 7 раз выше этого показателя в контрольной группе ДБККЛ без вовлечения л/у средостения и в 16 раз — в группе пациентов ДБККЛ с вовлечением медиастинальных лимфоузлов (табл. 2).

Статистическая значимость сдвига распределения величины экспрессии для каждого из изучаемых генов при разных формах крупноклеточной лимфомы оценивалась с помощью U-критерия суммы рангов Манна—Уитни.

Результаты считались статистически значимыми при р< 0,05. Данные представлены в виде медианы (и размаха), среднего арифметического ± стандартное отклонение и абсолютных чисел (проценты).

Таким образом, проведенный молекулярный анализ позволил подтвердить наши предположения о том, что первичные В-крупноклегочные лимфомы средостения представлены не только первичной медиастинальной (тимической) В-крупноклеточной лимфомой, но и диффузной В-крупноклеточной лимфомой с первичным вовлечением лимфоузлов средостения. В последующем в группе пациентов ПМБКЛ и ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения проведен сравнительный анализ клинических проявлений, гистологических и иммуношстохимических данных, а также эффективности терапии.

Клинические проявления

Из 42 пациентов с диагнозом В-крупноклеточная лимфома включенных в исследование диагноз ПМБКЛ установлен 24 больным в возрасте от 18 до 60 лет (медиана 31 год): 8 мужчин, 16 женщин. Диагноз ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения верифицирован у 18 пациентов в возрасте от 21 до 70 лет (медиана 31 год): 8 мужчин, 10 женщин.

В группе пациентов с диагнозом ДБККЛ с первичным вовлечением лимфатических узлов средостения и ПМБКЛ 1П и IV стадия заболевания не диагностирована ни в одном случае. II стадия констатирована у 5 (21%)

пациентов с диагнозом ПМБКЛ и у 3 (17%) — ДБККЛ, НЕ — у 19 (79%) больных ПМБКЛ и 15 (83%) — ДБККЛ.

Клинические проявления в группе пациентов ДБККЛ с первичным вовлечением медиастинальных лимфатических узлов и ПМБКЛ схожие и определялись объемом поражения структур средостения (рис. 1).

Рисунок 1. КТ органов грудной клетки с большой массой опухоли (bulky disease) у пациентов ПМБКЛ (а) и ДБККЛ с первичным вовлечением медиастинальных лимфоузлов (б)

На представленных компьютерных томограммах рентгенологические признаки ДБККЛ и ПМБКЛ одинаковые — опухоль представлена мягкотканым компонентом более 7,5 см и признаками прорастания в смежные структуры.

У 20 (83%) из 24 пациентов ПМБКЛ и у 15 (83%) из 18 больных с диагнозом ДБККЛ размеры опухоли превышали 7,5 см, при этом инфильтрация смежных структур: легких и плевры отмечалась у 18 (75%) и 15 (83%) больных соответственно; перикарда — у 15 (62,5%) и у 11 (61 %) соответственно; мягких тканей — у 3 (12,5%) и у 2 (11%). В 21 (87,5%) из 24 случаев ПМБКЛ и в 16 (89%) из 18 ДБККЛ отмечалось сдавление или прорастание опухоли в верхнюю полую вену, что сопровождалось появлением синдрома верхней полой вены: цианозом и отеком верхней половины туловища, усилением венозного рисунка передней стенки грудной клетки.

Периферическая лимфаденопатия (шейная, надключичная, подмышечная) наблюдалась у 10 (41%) из 24 пациентов ПМБКЛ и у 4 (22%) из 18 ДБККЛ. Стоит отметить, что ни в одном случае периферические л/у не превышали 7,5 см и во всех случаях основная масса опухоли была представлена увеличенными медиастинальными лимфатическими узлами.

При ПМБКЛ в 2 (8%) случаях выявлялось вовлечением молочных желез (1 — изолированное, 1 — по протяжению (рис. 5)). В одном случае у пациентки отмечалось первично резистентное течение, в другом констатирован ранний рецидив. В обоих наблюдениях продолжительность жизни не превысила 12 месяцев.

Симптомы интоксикации присутствовали у 18 (75%) пациентов при ПМБКЛ и у И (61%) — при ДБККЛ. Повышение концентрации ЛДГ выявлено у 22 (92%) и у 15 (83%), соответственно.

Вовлечение костного мозга, печени, почек, кишечника, ЦНС в дебюте при ПМБКЛ и ДБККЛ с первичным вовлечением лимфатических узлов средостения не отмечалось ни в одном случае.

Таким образом, клинические и рентгенологические проявления ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения и ПМБКЛ схожие, обусловлены вовлечением медиастинальных лимфоузлов и смежных структур и, как следствие, синдромом сдавления верхней полой вены. В большинстве случаев как при ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения, так и при ПМБКЛ отмечались признаки прорастания в смежные структуры. Учитывая одинаковое клиническое течение двух форм В-крупноклеточной лимфомы сформировать дифференциально-диагностические критерии, опираясь на клиническую картину нельзя.

Гистологическая картина ПМБКЛ и ДБККЛ

Опухолевые клетки ПМБКЛ расположены диффузно среди тонких прослоек и тяжей фиброзной ткани (различной степени выраженности) с коллагенозом, формирующим ячеистый рисунок. В большинстве случаев (67%) ПМБКЛ отмечалась выраженная степень фиброза.

Гистологическая картина ДБККЛ с первичным вовлечением медиастинальных л/у была вариабельной. В части случаев отмечалась диффузная пролиферация лимфоидных клеток крупных размеров. В части случаев, так же как и при ПМБКЛ, присутствовал фиброз, однако степень выраженности была меньше. Выраженный фиброз визуализировался только в 5 (28%) из 18 наблюдений.

Опухолевые клетки как при ПМБКЛ, так и при ДБККЛ преимущественно представлены мономорфной популяцией лимфоидных клеток средних и крупных размеров с округло-овальными или неправильными ядрами, тонкодисперсным хроматином, одиночным крупным или несколькими отчетливыми ядрышками с умеренно выраженной светлой цитоплазмой, иногда с очень широкой цитоплазмой.

Таким образом, гистологическая картина ПМБКЛ и ДБККЛ не имеет четких дифференциально-диагностических критериев, и в том и в другом случае опухолевый субстрат представлен ростом крупных лимфоидных клеток. Обращает на себя внимание более выраженная степень фиброза при ПМБКЛ, однако схожая картина может наблюдаться и при ДБККЛ. Морфологический вариант опухоли, как правило, был центробластным, в редких случаях — анаплазированным и ни в одном наблюдении — иммунобластным.

Иммунологическая характеристика ДБККЛ и ПМБКЛ

Во всех случаях при ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ опухолевые клетки экспрессировали С020, СБ79 а.

В 12 (52%) из 23 наблюдений ПМБКЛ опухолевые клетки экспрессировали активационный антиген СБ23, а при ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения — в 1 (6%) из 17 случаев. В 10 (43%) из 23 случаев ПМБКЛ и в 5 (29%) из 17 ДБККЛ отмечалась экспрессия активационного антигена СГЭ30 (экспрессия определялась только в части клеток с неравномерной слабой интенсивностью).

Экспрессия ВСЬ2 определялась в 8 (36%) из 22 случаев при ПМБКЛ и в 6 (43%) из 14 ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения. Несколько реже отмечалась экспрессия ВСЬб как при ПМБКЛ, так и при ДБККЛ в 2 (14%) из 14 и в 4 (23%) из 17 случаев, соответственно. У пациентов ДБККЛ СБ 10 антиген в опухолевых клетках определялся в 2 (11%) из 18, и ни в одном случаи при ПМБКЛ.

Уровень К1-67 более 60% определялся в 18 (75%) из 24 у больных ПМБКЛ и в 14 (78%) из 18 при ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения. Опухолевые клетки экспрессировали МЛМ1 в 18 (82%) из 22 случаев ПМБКЛ и в 9 (64%) из 14 наблюдений ДБККЛ.

Экспрессия 1§М выявлялась в 15 (83%) из 17 ДБККЛ с вовлечением л/у средостения.

В 2 (8%) из 24 случаев ПМБКЛ (и ни в одном случае при ДБККЛ) по данным гистологического исследовании визуализировались остатки предсуществующих эпителиальных островков тимуса, экспрессирующих панцитокератин.

Таким образом провести дифференциальную диагностику ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения и ПМБКЛ на основании гистологического исследования и иммунофенотипических данных не всегда возможно. Основываясь на гистологической картине, верификацию диагноза в пользу ПМБКЛ можно провести при наличии эпителия тимуса на фоне основного субстрата опухоли. Однако, встречаемость данного феномена невысокая и по нашим данным составляет 8%. Выраженный фиброз более характерен для ПМБКЛ, но также наблюдается и в 25% случаев при ДБККЛ, и, соответственно, не может являться критерием дифференциальной диагностики.

Иммунофенотипическое исследование позволяет выделить пациентов с экспрессией В-клеточных маркеров и ^М на опухолевых клетках и тем самым установить диагноз ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения. В случае отсутствия экспрессии 1дМ группа будет включать пациентов ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения и ПМБКЛ. Дополнительными ИГХ-маркерами, позволяющими на основании косвенных признаков установить диагноз ПМБКЛ, являются СБ23 и СОЗО. Однако данные маркеры являются неспецифичными и также могут экспрессироваться на опухолевых клетках ДБККЛ.

На основании ИГХ и гистологических данных в 17 из 42 (40%) случаев установлен диагноз: ПМБКЛ в 2 (12%) из 17, а ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения в 15 (88%). Восьми больным из указанных 17 дополнительно выполнено молекулярное исследование с целью контроля, в результате которого гистологический диагноз был подтвержден.

В остальных 25 (60%) из 42 случаев дифференциальную диагностику на основании гистологических и ИГХ исследований провести не удалось (по данным гистологического исследования отсутствовали островки тимуса, данные иммунофенотипического анализа попадали в «серую» зону). У пациентов данной группы диагноз был уточнен с учетом данных ПЦР в реальном времени.

Результаты лечения больных ДБККЛ и ПМБКЛ

Эффективность

Полная/частичная ремиссия достигнута у 5 (29,5%) / 12 (70,5%) пациентов с диагнозом ДБККЛ и у 9 (37,5%) / 12 (50%) с диагнозом ПМБКЛ.

Первично резистентными к проводимому лечению оказались 3 (12,5%) пациента с диагнозом ПМБКЛ. В группе пациентов с диагнозом ДБККЛ рефрактерных пациентов не было.

Ранний рецидив констатирован у 1 (5,8%) пациента с ДБККЛ и у 5 (20,8%) больных с диагнозом ПМБКЛ, Один больной с диагнозом ДБККЛ погиб от осложнений химиотерапии (легочное кровотечение).

Общая 4-летняя выживаемость при ДБККЛ и ПМБКЛ равна 94% и 82%, соответственно (рис. 4а).

По бессобытийной выживаемости исследуемые группы различаются статистически значимо (р = 0,05); 4-летняя БСВ в группе с ДБККЛ с первичным вовлечением медиастинальных л/у равна 89%, в группе с ПМБКЛ — 74% (рис. 46).

100%-Ц—........ ~

^-ц......... ДБККЛ

75%" ПМБКЛ

50%-25%-

12 24 36 48 60 72 84 0 12 24 36 48 60 72 84

Время (мес.) вРемя (нес>

а) б)

Рисунок 4. Общая выживаемость больных (рис. а) и бессобытийная выживаемость больных (рис. б)

юо%-г

75%-П - ДБККЛ

ПМБКЛ 50%-

25%т

р = 0.05

0%-^-1-г--1-1-г

Полученные данные показывают, что т-МНЬ-ВРМ-90 является эффективной программой ПХТ для лечения больных с диагнозом ДБККЛ с первичным вовлечением л/у средостения. Обращает на себя внимание, что количество рецидивов и первично резистентного течения на программе ш-ШЬ-ВРМ-90 выше в группе пациентов ПМБКЛ, что еще раз демонстрирует необходимость дифференциальной диагностики.

Остаточное образование после проведенного лечения определялось в 92% (22/24) случаев у больных ПМБКЛ и 89% (16/18) при ДБККЛ. ПЭТ

выполнено у 16 (67%) из 24 пациентов ПМБКЛ и у 11 (61%) _ из 18

ДБККЛ с первичным вовлечением медиастинальных лимфатических узлов рис. 23-24).

Накопление |8Р-ФДГ в проекции остаточного образования наблюдалось в 12 (75%) из 16 случаев ПМБКЛ и в 10 (91%) из 11 при ДБККЛ с первичным вовлечением медиастинальных лимфоузлов. Всем пациентам у кого отмечалось накопление |8Р-ФДГ в проекции остаточного образования, выполнялась контрольная КТ органов грудной клетки и в 2 из 12 (17%) случаях ПМБКЛ выявлен рост остаточного образования в средостении. У одного пациента ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения был констатирован ранний рецидив заболевания с изолированным поражением головного мозга, при этом образование в средостении регрессировало. Во всех остальных наблюдениях как у пациентов ПМБКЛ, так и ДБККЛ при ПЭТ-положительном результате отмечалась дальнейшая регрессия остаточного образования по данным КТ и отсутствие новых увеличенных лимфоузлов.

По представленным данным, при ПЭТ ложноотрицательных результатов в обеих группах не получено. Ложноположительные результаты у пациентов составили 83% (10 из 12) в группе больных ПМБКЛ и 90% (9 из 11) при ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения при медиане наблюдения 23 месяца при ПМБКЛ и 27,5 мес. при ДБККЛ.

Токсичность

Все курсы ПХТ А и С сопровождались развитием миелотоксического агранулоцитоза, средний период которого составил 4 дня (от 1 до 29 дней) после блока А и 6 дней (от 1 до 23 дней) после блока С. В 11% случаев после блока В миелотоксический агранулоцитоз зафиксирован не был. Стоит отметить, что наибольшая гематологическая токсичность наблюдалась после 1 курса ПХТ, что вероятно связано с проведением предфазы в течение 5 дней, большой массой опухоли и началом ПХТ, в ряде случаев, по витальным показаниям сразу после выполнения экстренной диагностической операции в условиях реанимационного отделения.

Геморрагические осложнения в виде носовых, десневых, маточных кровотечений, петехей, экхимозов наблюдались в 30% случаев и требовали проведения заместительной терапии тромбоконцентратом. Наибольшая

потребность в тромбоконцентрате отмечалась после блока С, в среднем 16 доз (после блока А — 10 доз, после блока В — 4 дозы).

Тяжелые инфекционные осложнения (сепсис, пневмония) в результате проведения ш-ЫНЬ-ВРМ-90 отмечались не более чем в 12% случаев. Летальнось от осложнений составила 2,4%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПМБКЛ является одним из вариантов гетерогенной группы диффузных В-крупноклеточных лимфом, который выделен благодаря клиническим, морфологическим и молекулярно-биологическим особенностям в REAL-классификации 1994 года и затем в ВОЗ классификации 2001, 2008 года. ПМБКЛ в отличие от ДБККЛ происходит из B-клеток тимуса, что подтверждается: наличием островков тимуса в субстрате опухоли, иммунофенотипом B-клеток тимуса CD79x+, slg~, CD23+", CD30+~, CD10", профилем экспрессии генов. Дифференциальная диагностика ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ сложна. При наличии ткани тимуса по данным гистологического исследования диагноз ПМБКЛ очевиден. Однако данная гистологическая картина наблюдается только в 25% случаев, что, соответственно, не может являться основным критерием диагностики. По результатам иммуногистохимического исследования опухолевые клетки ПМБКЛ имеют определенный иммунофенотип, однако в 25-50% случаев происходит «перекрест» иммунофенотипа ДБККЛ и ПМБКЛ, что затрудняет диагностику.

Предпосылкой для использования молекулярного метода в диагностике В-крупноклеточных лимфом с первичным вовлечением передне-верхнего средостения стал анализ экспрессии генов, который позволил выделить несколько вариантов ДБККЛ.

Одной из задач нашей работы стало исследование экспрессии генов JAK2, MAL, PDLl, PDL2, TRAF1 у больных ДБККЛ с первичным вовлечением медиастинальных лимфоузлов, ПМБКЛ и использование детекции гиперэкспресии данных генов с дифференциально-диагностической целью.

Оценка экспрессии генов проводилась с использованием метода ПЦР в реальном времени. Уровень экспрессии генов выражался в нормализованных процентах относительно уровня экспрессии гена ABL.

Молекулярный анализ указанных генов проведен 33 пациентам с гистологическим диагнозом ПМБКЛ, 17 добровольцам и 12 пациентам с диагнозом ДБККЛ без вовлечения медиастинальных лимфоузлов.

У 13 (39%) из 33 больных обнаруживалось совпадение молекулярных маркеров с контрольной группой ДБККЛ без вовлечения медиастинальных лимфоузлов, а именно отсутствовала гиперэкспрессия 2 и более исследуемых генов (JAK2, MAL, PDLl, PDL2, TRAF1), только в 1 (из 33) (8%) наблюдении отмечалась гиперэкспрессия гена TRAF1.

Учитывая, что в патогенезе ПМБКЛ участвует несколько ключевых нарушений, отличающих этот вариант лимфомы от ДБККЛ, мы полагаем, что для верификации диагноза ПМБКЛ необходима гиперэкспрессия не менее двух вышеуказанных генов. Использование такого строгого критерия позволит избежать диагностических ошибок, связанных с возможностью активации отдельных генов у больных ДБККЛ. Так, в контрольной группе у пациентов с диагнозом ДБККЛ без вовлечения медиастинальных лимфоузлов гиперэкспресиия гена JAK2 определялась в 1 (8,3%) из 12 случаев и TRAF1 в 2 (16%) из 12, при этом ни в одном наблюдении сочетанной экспрессии исследуемых генов не выявлялось.

У 20 (61%) из 33 пациентов определялась гиперэкспрессия 2 и более исследуемых генов, что позволило подтвердить гистологический диагноз ПМБКЛ. В 16 (78%>) случаях выявлялась гиперэкспрессия гена TRAF1, в 3 (15%) — гена PDL1, в 8 (40%) — PDL2, в 19 (95%) — гена JAK2, в 12 (60%) — гена MAL.

Несмотря на то, что ДБККЛ и ПМБКЛ имеют одинаковую клиническую картину, схожие иммунологические данные в нашем исследовании было показано, что молекулярные характеристики у них различные. Уровень экспрессии генов JAK2, MAL, TRAF1, PDL1 и PDL2 у пациентов ПМБКЛ по сравнению с ДБККЛ (без и с первичным вовлечением л/у средостения) статистически значимо выше (р = 0,05). У 13 (39%) из 33 пациентов диагноз ПМБКЛ был пересмотрен в пользу ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения, а у 20 (61%) из 33 пациентов подтвержден гистологический диагноз ПМБКЛ.

Также нашей задачей являлась оценка эффективности программы (m-NHL-BFM-90) у 42 больных В-крупноклеточной лимфомой средостения.

При оценке эффективности высокодозной IIXT у пациентов ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ было показано отличие в 4-летней БСВ (89% против 74%) и OB (94% против 82%), соответственно.

Гематологическая токсичность соответствовала III-IV степени. Тяжелые инфекционные осложнения (сепсис, пневмония) в результате проведения m-NHL-BFM-90 отмечены в 12% случаев. Летальность от осложнений ПХТ составила 2,4%.

Таким образом, эффективность высокодозной ПХТ в группе пациентов ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ различна, несмотря на однотипную клиническую картину, схожие эпидемиологические характеристики и наличие одинаковых факторов неблагоприятного прогноза в дебюте заболевания. Вероятно, это связано с различным уровнем экспрессии генов в опухолевых клетках ДБККЛ и ПМБКЛ, определяющим фенотип и в целом чувствительность к проводимой терапии.

Одной из проблем в лечение лимфом, является наличие остаточных образований, верификация природы которых достаточна сложна.

Выполнение ПЭТ позволяет в некоторых случаях дать точный ответ — представлено остаточное образование фиброзной тканью или опухолью. По нашим данным при отсутствии признаков повышенного накопления l8F-ФДГ в проекции остаточного образования ни в одном случае данных за прогрессию/рецидив заболевание не получено. В других случаях, возникает вопрос: как поступить в ситуации, когда по данным КТ органов грудной клетки отмечается сокращение остаточного образования, а по данным ПЭТ выявлено повышенное накопление 18Р-ФДГ в проекции остаточного образования, но отсутствуют другие признаки активности опухоли? Происходит ли накопление радиофармпрепарата в зоне некрозов опухоли, за счет макрофагальной реакции, при полной ремиссии заболевания? Или это повышенный метаболизм глюкозы в опухолевой ткани? Мы считаем, что решающими являются данные повторного исследования КТ. Если по результатам КТ через 1,5-2 месяца после завершения лечения отмечается дальнейшая положительная динамика в виде сокращения размеров остаточного образования, даже несмотря на положительный результат ПЭТ, пациент не нуждается в дальнейшем химиотерапевтическом лечении. Во всех наблюдениях, когда констатирован рецидив/прогрессирование заболевания отмечался синергизм результатов КТ и ПЭТ. По данным КТ отмечается рост опухоли, а по ПЭТ — повышенное накопление препарата.

Таким образом, первичные В-крупноклеточные лимфомы средостения представлены не только ПМБКЛ, но и ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения. Диагностика ПМБКЛ и ДБККЛ должна быть комплексной и обязательно включать гистологическое, иммуногистохимическое и молекулярное исследование. Интенсивная терапия больных ДБККЛ и ПМБКЛ позволяет достигнуть 4-летнюю БСВ 89% против 74% и 4-летнюю ОВ 94% против 82%, соответственно.

ВЫВОДЫ:

1. Выявлено, что оценка уровня экспрессии генов JAK2, PDL1, PDL2, MAL, TRAF1 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, позволяет использовать данные гены в дифференциальной диагностике ПМБКЛ и ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения.

2. Показано, что дифференциально-диагностическое значение имеет выявление гиперэкспрессии двух и более указанных генов, что встречается в 100% случаях при ПМБКЛ и ни в одном случае при ДБККЛ с первичным вовлечением лимфоузлов средостения.

3. Высокодозная полихимиотерапия по программе m-NHL-BFM-90 позволяет достигнуть 4-летнюю бессобытийную выживаемость 89% и 74%, общую 4-летнюю выживаемость 95% и 82% у пациентов ДБККЛ с первичным поражением лимфоузлов средостения и ПМБКЛ, соответственно.

4. Отмечено, что гематологическая токсичность модифицированной программы ЫНЬ-ВРМ-90 соответствует Ш-1У степени; наибольшее количество осложнений наблюдается после 1 курса ПХТ; летальность составила 2,4%.

5. Обнаружено, что при наличии исходно опухоли более 7,5 см, остаточное образование после лечения определяется как у пациентов ПМБКЛ, так и ДБККЛ в 90% и 88% случаев, соответственно. По данным позитронно-эмиссионной томографии ложноотрицательных результатов не было, а ложноположительные составили 83% и 90% для ПМБКЛ и ДБККЛ, соответственно.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Я.К.Мангасарова, А.В.Мисюрин, А.У.Магомедова, С.К.Кравченко, А.М.Кременецкая, А.И.Воробьев. Молекулярная диагностика первичной медиастинальной В-клеточной лимфомы и диффузной В-крупноклеточной лимфомы с первичным вовлечением лимфоузлов средостения. Клиническая онкогематология. 2011; 2, с.142-145.

2. J.Mangasarova, A.Misuyrin, A.Magomedova. Molecular differential diagnosis distinguishes between primary mediastinal B-cell lymphoma and other types of diffuse large B-cell lymphoma. 16 congress of Evropean hematology association, London, june 9-12, 2011. Haematologica J. vol.96, suppl.2, june, 2011, abstr.N1385, pp556.

3. J.Mangasarova, A.Magomedova, S.Kravchenko, E.Zvonkov, V.Vorobiev, D.Maryin. Intensive therapy of the patients with diffuse large B-cell lymphoma with primary involvement of mediastinal lymph nodes and primary mediastinal B-cell lymphoma efficacy and toxicity. 16 congress of Evropean hematology association, London, june 9-12, 2011. Haematologica J. vol.96, suppl.2, june, 2011, abstr.N1410, pp564.

4. Я.К.Мангасарова, А.У.Магомедова, С.К.Кравченко, Е.Е.Звонков, А.М.Кременецкая, В.И.Воробьев, ДС.Марьин, А.В.Губкин, Н.И.Скидан, И.Б.Капланская, И.А.Воробьев, Р.С.Самойлова, А.И.Воробьев. Диффузная В-крупноклеточная лимфома с первичным вовлечением лимфоузлов средостения: диагностика и лечение. Терапевтический архив, 2010, №7, с.61-65.

5. Я.К.Мангасарова, А.У.Магомедова, С.К.Кравченко, Р.Г.Шмаков. Диффузные В-крупноклеточные лимфосаркомы и беременность: терапевтическая тактика. Гематология и трансфузиология, 2011, №2, с. 18-20

6. Я.К.Волкова (Мангасарова), А.У.Магомедова. Е.Е.Звонков, С.К.Кравченко. Диагностика и высокодозная терапия диффузной В-крупноклеточной лимфосаркомы с поражением медиастинальных лимфатических узлов. Гематология и трансфузиология, 2009, №3, с.6-8.

7. В.С.Шавлохов, Т.Н.Моисеева, Б.Т.Джумабаева, С.Р.Карагюлян, Л.Н.Готман, И.В.Ефимов, И.Б.Капланская, Г.М.Галстян, У.Л.Джулакян, Я.К.Волкова (Мангасарова). Хирургическое лечение опухолей средостения у больных лимфогранулематозом и лимфосаркомой. Гематология и трансфузиология, 2009, №3, с.41-47.

8. А.У.Магомедова, С.К.Кравченко, А.М.Кременецкая, Е.Е.Звонков, Е.А.Барях, Я.К.Мангасарова, И.Б.Капланская, Р.С.Самойлова, И.А.Воробьев, Т.Н.Обухова, С.Р.Карагюлян, Е.М.Шулутко, Г.М.Галстян, Д.С.Марьин, Н.Г.Габеева, А.И.Воробьев. Девятилетний опыт лечения больных диффузной В-крупноклеточной лимфосаркомой. Терапевтический архив. 2011; 7: 5-10.

9. J.Mangasarova, A.Misuyrin, A.Magomedova, S.Kravchenko. Molecular signature distinguishes between primary mediastinal B-cell lymphoma and other types of diffuse large B-cell lymphoma B-cell lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma involvement of mediastinal lymph nodes. ASH, San Diego, California, 10-13 december, 2011. Blood. Vol. 118, number 21, abstr.2654, pp 250.