Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Модуляция потенциал-управляемых натриевых каналов СА1 нейронов гиппокампа крыс кава пиронами

Національна Академія Наук України Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

РГ Б ОД На правах рукопису

МАГУРА Олена Ігорівна

МОДУЛЯЦІЯ ПОТЕНЦІАЛ-КЕРОВАНИХ НАТРІЄВИХ КАНАЛІВ СА! НЕЙРОНІВ ППОКАМПУ ЩУРІВ КАВА ПІРОНАМИ

14.03.03. - Нормальна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеню кандидата медичних наук

Київ - 1997

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі фїзикохімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України Олег Олександрович Кришталь академік НАН України Олексій Олексійович Мойбенко

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент Академії педагогічних наук Віктор Григорович Шевчук, кандидат біологічних наук Світлана Анатольївна Федулова.

Провідна установа: Інститут фармакології та токсикології АМН

України

Захист відбудеться «_ $» ґргуРгЗї&І** 199Рт>. на засіданні Спеціалізованої вченої рада Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою м. Київ вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім.

О.О.Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий «

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця

доктор біологічних наук З.О.Сорокша-Маріна

іктуальиість проблеми. Забезпечуючи генерацію потенціалів дії у нервових клітинах, чггеяціал-кероваш натрієві канали відіграють провідну роль у інтегративній діяльності іервової системи ( Eaholtz et al., 1994). Активність натрієвих каналів модулюється мінами мембранного потенціалу, G-білками, а також системою вторшших :осередшіків, які обумовлюють фосфорилювання або дефосфорилювання альфа убодиниці натрієвого каналу. У натрієвих каналах ідентифіковано шість рецепторних окусів для різноманітних токсичних сполук рослинного, тваринного та синтетичного ОХОДЖСНКЯ. Локуси ТОПОЛОГІЧНО ВІДОКрСМЛСКІ, 2ЛС KfтУ ними Існує ЧІТК.2 ЗЛОСТСрІІЧКЙ заємодія (Catterall, 1992). Для вивчення функціональних і топологічних характеристик :атрієвих каналів використовують специфічні для цих каналів токсини (Kuo and Baen, 994).

Особливу увагу приділяють вивченню механізмів дії потенціал-залежних локаторів натрієвих каналів (Теуїсг and Meldrum, 1995; Urenjak and Obrenovich, 1996). Ці полуки належать до місцевих анестетиків, протисудомних засобів та антиаритміків Catterall, 1992). В останні роки вивчають їх застосування як нейропротекторів при инекненні ішемії та гіпоксії мозку (Urenjak and Obrenovich, 1996). Цей напрямок осліджень відіграв значну роль у створенні, на підставі теорії алостеричного сгулювання активності ферментів, гіпотези модульованого рецептору (Hille, 1977). Вона адовільно пояснює залежність ефективності дії фармакологічних препаратів від стану жного каналу, і відіграла значну роль у з’ясуванні механізмів модуляції процесу івидкої інактивації натрієвих каналів під впливом потенціал-залежних блокаторів (Kuo ud Baen, 1994; Catterall, 1987, 1992).

На протязі багатьх років відома терапевтична дія фармакологічно активних омпонентів екстракту кореня рослини Piper methysticum Forst - кава екстракту.

Властивості кава екстракту обумовлені наявністю у ньому кава піронів (Klohs et al., 1959; Meyer and Kretzschmer, 1966; Capasso and Caligano,1988; Lebot et al., 1992; Singh, 1992). Кава пірони підсшпоють снодійний ефект барбітуратів, пригнічують судомну активність, викликану дією стріхніну та електрошоком (Kretzschmcr et al., 1969; Meyer, 1979), викликають аналгезію (Jamieson and Duffeld, 1990) та розсліблення м’язів (Meyer, 1979). Привертають до себе увагу можливості використання кава піронів у модельних дослідженнях на тваринах як нейропротекторних засобів під час ішемії мозку (BackhauG et al., 1992). Нещодавно було показано, що кава пірони, зокрема (±)-каваін, блокують підвищення внутрішньоклітинної концентрації натрію, викликаної вератрішжом (Gleitz et al., 1995, 1996).

Наші дослідження довели, що кава пірони (±)-каваін та (+)-метистицин мають властивості псттенціал-залежних блокаторів натрієвих каналів. Ефективність їх дії чітко залежить від стану натрієвого каналу.Отримані результати свідчать що про можливість використати кава піронів для вивчення властивостей воротних механізмів натрієвих каналів, зокрема тих, що забезпечують їх інактивацію. З’ясовано також особливості механізмів нейропротекторної дії кава піронів. Такі дослідження були виконані вперше.

Мста і завдання роботи. Мета роботи - вивчити характер дії кава піронів _(+)-каваіну та (+)-метистишшу на потенціал-керовані натрієві канали СА1 нейронів гіпокампу щурів.

для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1. Вивчити залежність ефективності дії (+)-каваіну та (+)-мстистицину від стану каналу.

2. Одержати інформацію щодо фізико-хімічних механізмів дії кава піронів що досліджуються.

Іаукова новизна роботи. 1. Вперше показана потенціалозалежність блокуючої дії кава ііронів (±)-каваіну та (+)-мстистипину на погенціал-керовані натрієві канали СА1 іпокампу щурів.

. Виявлена їх вибіркова дія на канали, що знаходяться в інактивованому стані.

. Отримана інформація щодо фізико-хімічних механізмів дії кава піронів (±)-каваіну та +)-метисгицину на потенціал-керовані натрієві канали СА1 гіпокампу щурів.

"дозбтачнб та ндзктнчнб значення роботи.. 3. Оігисано новий хлзс потенціалозалежких локаторів натрієвих каналів.

. Вперше отримані відомості щодо механізмів дії кава піронів (±)-каваіну та (+)-іетиститшну на потенціал-керовані натрієві канали САІ гіпокампу щурів.

. (±)-Каваін та (+)-метистицин можуть бути використані як інструмент для вивчення ластпвостей тих воротяих механізмів натрієвих каналів, що відповідають за швидку {активацію.

. Результати досліджень вказують на доцільність вивчення можливостей використання

і)-каваіну та (+)-метистицину як нейропротекторів при порушеннях мозкового ровообігу, гіпоксії та черепно-мозкових травмах.

лгообаиія поботи. Основні положення роботи доповідались і обговорювались: на Fifth ■nnual meeting of the Israel Society for Neuroscience (1-4 грудня, Ешіат, Ізраїль), на емінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАНУ (Київ, 1994, 1995, 1996). За итеріалами дисертації опубліковано 4 статті у міжнародних журналах.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводили на ізольованих нейронах гіпокампу щурів 12-14 денного віку. До цього періоді' У нкх завершується диференціювання пірамідних нейронів [Гамбарян, Коваль, 1977], а розвиток елементів сполучної тканини ще не заважає ферментативній ізоляції нейронів. Нейрони, що відносяться до різних зон гіпокампу морфологічно легко ідентифікувалися.

Після декапітацц тварини гипокамп швидко виділяли та переносили у розчин фосфатного буфера Дульбеко з додаванням 26 мМ NaHCCb, ЗО мМ глякози 40 мМ цукрози та 0,5 мМ MgClj, де тонким лезом під мікроскопічним контролем готували зрізи гіпокампу товщиною 300-400 мкм. Після препарування зрізи інкубували у зазначеному розчині на протязі ЗО хвилин, а потім переносили до розчину такого ж складу з додаванням протеолітичних ферментів з Aspergillus oiyzae у концентрації 2 мг/мл (Sigma, США). Ферментативна обробка проводилася при 33°С на протязі 30-45 хвилин. Після обробки зрізи переносили у той же розчин, без ферменту, з додаваням 0,5 мМ СаСІ2 • На протязі усієї процедури розчші постійно насичували карбогеном (95% О2 та 5% СО2 ), pH розчину був 7,4. Такі зрізи використовувалися для отримання ізольованих нейронів на протязі 8-10 годин. Ізольовані пірамідні нейрони зони СА1 ідентифікували за їх характерною формою. Нейрони зберігали невелику частину апікальних та базальних дендритів, мали діаметр 15-20 мкм та довжину тіла клітини 3050 мкм.

У дослідах був застосований метод внутрішньоклітинної перфузії [Kostyuk et al, 1984]. Скляні мікропіпетки заповнювалися розчином, що містять (у мМ): CsF 100, Трис-С140, рН=7.3. Опір піпетки не перевищував 0,7-2,5 МОм. Склад позаклітинного розчину (у мМ): NaCl 150, СаС12 2, MgCl2 1, HEPES-NaC>H-20, глюкоза - 10 (рН=7.4). Експерименти проводили при кімнатний температурі 20-23 С°. Зміну позаклітинних розчинів здійснювали методом фіксації концентрації (Krishtal et al., 1982).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

1. Вплив (±)-каваіну та (+)-метастицииу на амплітуду натрієвого струму.

Зовнішня аплікація (±)-каваіну у концентрації 10-400 мкМ та (+)-метнсппшну у знцентрації 1-400 мкМ викликала швидке та оборотне зменшення амплітуди ліку ітрієвого струму (Мал. 1а, б). Дія них речовин не викликала зміщення вольт-амперної ірактери стики натрієвого струму уздовж осі абсцис (потенціалів) (Мал. їв, г).

100 мкМ метистицин

V (мВ)

Іал. 1 Блокування натрієвого струму кава піроиами:

і- дія 330 мкМ (+)-каваіну на натрієвий струм; Б- дія 330 мкМ (±)-каваіну на вольт-мперну характеристику натрієвого струму; В - дія 100 мкМ (+)-метнстицину на атрієвий струм; Ґ- дія 100 мкМ (+)-метистицшіу на вольт-амперну характеристику атрієвого струму.

б

Максимум вольт-амперної характеристики як у контролі так і після аплікації (±)-каваіну та (+)-метистицнну припадав на -10 * -20 мВ. Нами було також виявлено, що (+)-метистицин не впливає на потенціалозалежність процесу активації натрієвих каналів. На малюнку 2 наведена залежність провідності натрієвих каналів (О) від мембранного потенціалу (V). Нормалізоване співвідношення в і V задовільно описували рівнянням Больцмана:

<?= 1/(1+схр[(У- Уь)/К1)

Середина кривої Больцмана (V/,) припадала на -21 мВ, фактор крутості (К ) складав 2,3 мВ. Подібні результати були отримані і для (±)-каваіну.

А Б

Мал. 2 Залежність провідності натрієвих каналів від мембранного потенціалу:

А- співвідношення Сг/У у контролі та у присутності 100 мкМ (+)-мегисгицину; Б-нормалізоване співвідношення Є/У

У зв’язку з тим, що дія багатьох відомих блокаторів натрієвих каналів, зокрема місцевих анестетиків та ангиконвульсантів, значною мірою залежить від підтримуваного потенціалу, були проведеш експерименти при різних значеннях підтримуваного потенціалу: -100, -90 та -80 мВ (Мал. За,б). Оіримані данні (п = 10 для кожної концентрації досліджуваних речовин) апроксимували за методом найменших квадратів до рівняння Хіла:

І/Ітах = <ІС50Г/(1СГ + (ІС50)”),

К Ітах - амплітуда піку натрієвого струму, що була виміряна у контролі, І - амплітуда піку натрієвого струму, що була виміряла після прикладення досліджуваної речовини, (С] - концентрація речовини, ІС;д - концентрація речовини, що викликала зменшення імплітуди струму на 50 %, п - коефіцієнт Хіта. Було виявлено, шо блокуюча дія як (+)-гаваіну так (+)-метистицину суттєво залежить від підтримуваного потенціалу. При іміщенні підтримуваного потенціалу у бік деполяризації на 20 мВ (від -100 до -80 мВ) ГС$о зменшувалась у 3,6 рази для (±)-каваіну та у 5,7 рази для (+)-метистицину.

Лал. З Залежність блокування натрієвого струму кава тронами від підтримуваного ютеяціалу:

і- крива доза-ефект для (+)-каваіну при підтримуваних потенціалах -100, -90 та -80 іВ; Б- крива доза-ефект для (+)-метиспшину при тих же підтримуваних потенціалах.

г результаті апроксимації отриманих данних до рівняння Хіла були отримані такі начення ІС$(і для (±)-каваіну 591,2 мкМ 374,8 мкМ та 162,9 мкМ для підтримуваних отенціалів -100, -90 та -80 мВ відповідно; для (+)-метистицину: 192,5 мкМ, 104,0 мкМ а 33,7 мкМ для підтримуваних потенціалів -100, -90 та -80 мВ відповідно. Коефіцієнт їла у всіх випадках складав 1.

ї

100

деваЬі ()од ккМ)

Ю

метистцин (Іод мкМ)

Потенціалозалежнісгь блокування натрієвих каналів властива також таким речовинам як фенітоін, карбамазепін та ряду сполук, що за своєю дією нагадують місцевий анестетик лідокаін. Дії цих речовин також притаманний “use-dependent” ефект (Teyior and Meldium, 1996). Для того, хцоб з’ясувати, чи характерний цей ефект для (±)-каваіну та (+)-метистицину, наші була проведена серія експериментів, де на протязі 10 с на клітину подавали тестуючі імпульси з частотою 10 Hz у контролі та при аплікації (+)-каваіну та (+)-метистицину. Інтервали між тестуючими імпульсами були достатніми для усунення інактивації, але закороткими для дисоціації комплексу речовина-канал. За літературними дашшми ця частота достатня для отримання “use-dependent” ефекту (Quan et al., 1996). Данні нормалізували відносно амплітуди піка струму при першому тестуючому імпульсі. Під час цих експериментів було виявлено, що блокуюча дія речовин, що досліджували не залежить від Частоти стимуляції (експерименти проведені на 10 клітинах для кожної речовиїш) (Мал. 4). Отримані данні свідчать про те, що (±)-каваін та (4-)-метистицин не мають “use-dependent” ефекту при використаній нами частоті стимуляції. Цей факт може бути пояснений їх нейтральною природою та доброю розчинністю у ліпідах, що надає їм змогу зв’язуватись з молекулою каналу без його відкривання, а також швидкою дисоціацією їх комплесу з каналом (Quan et al., 1996; Hille, 1977).

2. Вплив (+)-каваіпу та (+)-метистицину на шактивацінні характеристики иотсиціал-кероваоих натрієвих каналів.

Дослідження впливу (±)-каваіну та (+)-мегистицину на процеси інактивації виявило, що ці речовини суттєво змінюють механізми інактивації потенціал-керованого натрієвого каналу. Аплікація 330 мкМ (+)-каваіну викликало зміщення кривої стаціонарної інактивації (h®) у бік більш негативних значень мембранного

• контроль О ЭОО к&М каваїя

Іізмерн імпульсів

А

о

0.90-

0 8 о в

| К контроль |

0 10 20 30

Номери імпульсів

4ал. 4 Залежність блокуючої дії (±)-каааіну (А) та (+)-метасшдняу (Б) від частота тниулядії

о

090-

іотенціалу. При отриманні данних для інактивадійної характеристики клітини іпримували при різних значеннях підтримуваного потенцілу ( від -140 до -50 мВ) на ротязі ЗО секунд, після чого подавався тестуючий імпульс до рівня -20 мВ тривалістю 0 мс. Амплітуди натрієвого струму нормалізували відносно значень амплітуди при ідтримуваному потенціалі -140 мВ. Данні апроксимували до рівняння Больцмана:

>' = 1/(Нохр[(У-Уі/2)/К]),

де V - підтримуваний потенціал, Vj/2 - потенціал, при якому 50 % каналів знаходяться в інакгивованому стані, К - фактор крутості. У контролі Vj/2 складав -71,1 мВ, після аплікації (+)-каваіну Vj/2 « -85,4 мВ (її — 10 ). (±)-Каваін також викликав зміну потенціалозалежності стаціонарної інактивації: К складав у контролі 5,7 мВ: після прикладення (±)-каваіну 6,7 мВ (Мал. 5 а).

(+)-Мстистицин викликав більш значне негативне зсунення кривої стаціонарної інактивації уздовж осі потенціалів. У контролі Vj/2 складав -74,9 мВ, а після прикладення 330 мкМ (+)-метистицину Ущ ~ 99,5 мВ (п = 10). Під впливом (+)-метистицину також змінювалась потенціалозалежність стаціонарної інактивації: К у контролі був 5,5 мВ, а у присутносі (+)-метистицину - 2,8 мВ (Мал. 5 б). З мстою більш детального вивчення впливу (±)-каваіну та (+)-метистицину на інактиваційні характеристики наїрібвшо каналу ми досліджувшш кінетику Процесу щбіідкоі інактивації. Для цьго ми використовували деполяризуючий передімпульс, тривалість якого змінювали від 1 до 10 мс, що призводило до інактивації натрієвих каналів, не викликаючи їх помітної активації. Після передімпульсу подавали тестуючий Імпульс, що призводив до активації натрієвих каналів та візуалізації струму (Hodgkin and Huxley, 1952). Амплітуда передімпульсу та тестуючого імпульсу була підібрана виходячи з кривої стаціонарної інактивації та вольт-амперної характеристики досліджуваних струмів. Данні експериментів з різною довжиною передімпульсу були нормалізовані по відношенню до значення амплітуди піку струму, зареєстрованного при відсутності передімпульсу, та апроксимовані до рівняння:

У = У со- [O'.,- 1) exp (-t/th)], де у „ - ордината при t= оо, ц, - постійна часу інактивації.

А

Б

Мал. 5 Вплив кава тронів (±)-каваіну (А) та (+)-мстистнщшу (Б) на стаціонарну інактивацію натрієвих каналів.

А

Б

Мал. 6 Кінетика процесу швидкої інактивації у котр-олі та у присутності кава піронів (±)-каваіиу (А) та (+)-метнстицину (Б).

У ході цих експериментів було показано, що аплікація (±)-каваіну та (+)-метистицину призводила до прискорення розвитку швидкої інактивації при мембранному потенціалі -70 мВ: при аплікації 330 мкМ (±)-каваіну постійна часу інактивації зменшувалась у 1,8 рази (до 4,91 при контрольному значенні 9,05 мс); при аплікації 330 мкМ (+)-метистицину постійна часу інактивації зменшувалась у 2,0 рази (до 5,1 при контрольному значенні 10,09 мс). Експерименти проведені на 10 клітинах для кожної з речовин (Мал. б).

Ми також оцінювали швидкість інактивації за швидкістю спаду натрієвого струму при різних значеннях тестуючого потенціалу. Після досягнення пікового

значення натрієвий струм зменшувався за експоненціальним законом фактично до нульового рівня. Цей процес описується рівнянням:

у =А ехр(-і/т),

де А - амплітуда інактивіуючогося компоненту натрієвого струму, 1 - час, т - постійна часу інактивації. Визначення постійної часу інактивації при різних значеннях тестуючого потенціалу показало, що найбільш помітне зростання швидкості інактивації при дії (±)-каваіну відбувається при деполяризації мембрани до -40 мВ (підтримуваний потенціал складав -100 мВ). При більш позитивних зміщеннях мембранного потенціалу ефективність дії (±)-каваіну на швидкість інактивації зменшувалась. При мембранному потенціалі +30 мВ швидкість інактивації у контрольних вимірюваннях та у присутності 330 мкМ (±)-каваіну помітно не відрізнялась. Аналогічна закогіомірнісіь спостерігається ї при дп (т у-мсткстицину. Ці результати свідчать про те, що характер дії (±)-каваіну та (+)-метистицину на швидкість розвитку інактивації залежить від рівня мембранного потенціалу, що викликає активацію натрієвих каналів. У зв’язку з цим важко виключиш можливість того, що при різних значеннях мембранного потенціалу натрієві канали у ііігктивованому стані мають різні фармакологічні характеристики.

Крім того, було вивчено вшив (+)-каваіну та (+)-метистицину на процес виходу потенціал-керованих натрієвих каналів з інактивації. Натрієві канали інактивуваяи деполяризуючим зміщенням потенціалу до рівня -20 мВ на протязі 100 мс, після чого через різні проміжки часу подавався тестуючий імпульс -20 мВ тривалістю 10 мс. Процес виходу з інактивації відбувався при підтримуваному потенуіалі -100 мВ і описувався рівнянням:

ІДтах = НА єхр (-АГ/п) + В ЄХр(-йі/т2)],

де г/ та Т2 - постійні часу швидкого та повільного компоненту виходу з інактивації, А та В - фракції натрієвих каналів, що швидко та повільно виходять з інактивації (КІБкіп сі аі., 1993).

(±)-Каваін викликав уповільнення виходу з інактивації. У контролі постійна часу виходу з інактивації каналів що швидко виходять з інактивації (гі) складала 3,17 мс, а у присутності 330 мкМ (+)-каваіну г; = 11,7 мс. Постійна часу виходу з інактивації каналів що повільно виходять з інактивації (із) змінювалась таким чином: у контролі Т2 = 158,43 мс, у присутності 330 мкМ (±)-каваіну 500,01 мс. У контролі фракція швидко виходячих з інактивації каналів (А) складала 0,85 а у присутності 330 мкМ (±)-каваіну їх частка дещо зростала: А = 0,97. Щодо фракції повільно виходячих з інактивації каналів (В), то у контролі В = 0,15, а у присутності 330 мкМ (±)-каваіну 0,03. Таким чином можна сказати, що додавання (±)-каваіну до зовнішнього розчину призводило до уповільнення процесу виходу з інактивації за рахунок практично рівномірного уповільнення виходу з інактивації обох фракцій каналів: ті зростає у 3,6 рази, 12 - У 3,2 рази. Співвідношення двох фракцій каналів мало змінювалось під впливом (±)-каваіну (Мал- 6 а).

(+)-Метистицин викликав подібний ефект. У контролі ті = 10,7 мс, у присутності 100 мкМ (+)-метистицину ті — 39,5 мс, Т2 у контролі складала 500 мс, а у присутності 100 мкМ (+)-метистицину зростала 670 мс. Кількість швидко та повільно виходячих з інактивації каналів змінювалась таким чином: у контролі А 0,94; В - 0,06; у присутності 100 мкМ (+)-метистицину А = 0,97; В = 0,03. Підводячи підсумок дії (+)-метистицину на швидкість виходу натрієвих каналів з інактивації можно сказати, що уповільнення цього процесу (+)-метистицином відбувається,в основному, за рахунок впливу на канали що швидко виходять з інактивації (г/ зростає у 3,6 рази, Т2- у 1,34 рази), співвідношення двох фракцій каналів практично не змінювалось під впливом

(+)-метистицину. Експерименти були проведені на 10 клітинах для кожної із досліджуваній речовин (Мал. 6 б).

А

Б

Мал. 6 Вплив кава піроиів (±)-каваіпу (А) та (+)-метистнцину (Б) на прцес виходу натрієвих каналів з інактивації '

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Головним результатом наших досліджень було виявлення потекціалозалежного блокування натрієвих каналів (±)-каваіном та (+)-метистицином. Блокуюча дія (+)-метистицину була більш ефективною, ніж (±)-каваіну (ІС50 для (+)-метистицину майже у 4 рази нижче, ніж для (±)-каваіну при підтримуваному потенціалі -100 та -90 мВ та у 5 разів при підтримуваному потенціалі -80 мВ). Така потенціалозалежнісгь блокування була наслідком залежності дії кава тронів від стану натрієвих каналів і свідчить про вплив на процеси інактивації (Catterall, 1987). Вплив (+)-каваіну та (+)-метистицину на інактиваційні характеристики натрієвого каналу проявляється у зміщенні кривої стаціонарної інактивації у негативному напрямку вздовж осі потенціалів, зміні крутості кривої стаціонарної інактивації, прискоренні швидкої інактивації та уповільненні виходу з інактивації.

Розуміння механізмів процесу інактивації важливі для встановлення молекулярних механізмів функціонування іонних каналів та механізмів дії багатьох модуляторів натрієвих каналів, зокрема місцевих анестетиків, протисудомних засобів та деяких ангиаритміків. Для опису процесу інактивації найчастіше використовують модель Ходжкіна-Хакслі. Згідно із цією моделлю інактивація розглядається як самостійний воротний процес, що пов’язаний із переміщенням електрично заряджених інактивуючих частинок між двома позиціям. Одна з них - А відповідає стану каналу, при якому він може активуватись у відповідь на деполяризацію, інша - Б відповідає інактивованому стану каналу. Залежність ступеню інактивації від мембранного потенціалу задовільно пояснюють виходячи із принципу розподілення Больцмана (Hodgkin and Huxley, 1952; Noble and Tsien, 1969). Потенціалозалежнісгь констант швидкостей аь та Pi у моделі Ходжкіна-Хакслі для аксону кальмара узгоджується з тим, що ефективний заряд інактивуючої частинки складає 3,75 елементарного заряду.

Ця величина є добутком валентності інактивуючої частинки (z) та г| - тієї частиіш мембранного потенціалу, що впливає на позицію воротної частинки. Подальші дослідження, пов’язані із виміреігням воротних токів показали, що самому по собі процесу інактивації властива незначна потенпіалозаяежність, зазначена потенціалозалежність інактивації обумовлена зв’язком переміщення активаційних і інактиваційних воротних частинок (Armstrong and Bezanilla, 1977; Patlak, 1991).

У наших експериментах крива стаціонарної інактивації задовільно описувалась рівнянням Больцмана. З метою кількісної оцінки тих змін у механізмах інактивації, що були викликані (±)-каваіном та (+)-метистнцином, ми зробили деякі перетворення виразу

lu = 1/( 1 +ехр[ (V-У;/2)J -К,] (1).

rvu- iw = z'mC>'i/2-’0/'*\ (2)

К = kT/zer| (3),

де k - постійна Больцмана, Т - абсолютна температура, е - заряд злектрону.

h./(l- h,) = ah / ph = exp[(zen/ kT)( Vj/j-V)] (4), ln[h,/(l- h„)] = (Vj/2-Ю/ K (5)

У контролі Vj/2~ -71 мВ, K = 5,7 mB, zt\ = 4,3; у присутності 330 мхМ (±)-каваіну Vj/2

— -85,4 мВ, К= 6,7 мВ, гт] = 3,7. На підставі цих данних можно твердити, що механізм дії (+)-каваіну є таким, що викликає зміщення інактиваційної характеристики у негативному напрямку на 14,4 мВ та зниження чутливість h*, до зміни мембранного потенціалу внаслідок зменшення ефективної валентності воротних часток з якими пов’язаний процес інактивації. Під впливом 330 мкМ (+)-метистицину Vj/2 зміщується до -99,5 мВ при контрольному значенні -74,9 мВ, К зменшується до 2,8 мВ при контрольному значенні 5,5 мВ, zt| зростає до 8,8 при контрольному значенні 4,5. На підставі цього можно твердити, що фізико-хімічні механізми дії (+)-метистицину

пов’язані із зсувом інактиваційної характеристики у негативному напрямку на 24 мВ та збільшенням чутливісті її» до зміни мембранного потенціалу за рахунок збільшення ефективної валентності поротних частинок.

При співставленій результатів кількісної оцінки механізмів дії (±)-каваіну та (+)-метистицину на процеси інактивації слід відзначити, що фізико-хімічні механізми їх дії помітно відрізняються. Ця різниця проявляється у більш значному зміщенні (+)-метистицином кривої стаціонарної інактивації у бік більш негативних значень мембранного потенціалу, та у тому, що (±)-каваін та (+)-метистицин мають протилежно направлену дію на чутливість процесу інактивації до мембранного потенціалу.

Слід відзначити, що (±)-каваін та (+)-метистицин практично однаково прискорюють процес швидкої інактивації. їх вплив иа іішидк^сть інактивації має потенціал озалежний характер, що є наслідком властивостей механізму інактивації. Згідно моделі Куо та Біна інактивація натрієвих каналів подібна до зв’язування ліганда (інакгиваційних воріт) з рецептором. Спорідненість при зв’язуванні є функцією конформації каналу. Швидкість інактивації суттєво зростає при більш позитившіх значеннях мембранного потенціалу, шо активує канали. Можливо припустити, що при цьому одночасно відбувається поступове зменшення ефективності дії кава піронів на швидкість інактивації.

Що стосується впливу (±)-каваіну та (+)-метисгицину на процес виходу натрієвих каналів з інактивації, то можно сказати, що (±)-каваін у концентрації 330 мкМ уповільнює цей процес за рахунок практично рівномірного уповільнення виходу з інактивації як швидко так і повільно виходячих з інактивації каналів. (+)-Метистицин у концентрації 100 мкМ уповільнює вихід з інактивації швидко виходячих з інактивації каналів приблизно так же як каваін у концентрації 330 мкМ, але менше впливає на

канали, що повільно виходять з інактивації. Вихід з інактивації має велике фізіологічне та фармакологічне значення через те, що його кінетика значною мірою обумовлює здатність клітин ритмічно генерувати потенціали дії. Анестетики, антиковульсанти та антиаритміки, а також досліджувані нами кава пірони драматично змінюють хід цього процесу (Kuo and Bean, 1994).

Вплив (+)-каваіну та (+)-метистицину на процеси інактивації може бути обумовлений їх взаємодією із додатковими субодиниціями натрієвого каналу, зокрема

із Рі субодиницею. Ця субодиниця значно впливає на функціонування натрієвого каналу; збільшує амплітуду натрієвого струму, прискорює воротні процеси та змінює потенціалозалежність інактивації.

Куо та Він (1994а) використали кінетичну модель для пояснення потенціалозалежності зв'язування та блокування натрієвих каналів фешгошом. Фенітоін є високо ефективним протисудомним засобом. У присутності фенітоіну імовірність інактивації натрієвих каналів значно збільшується та відбувається при більш негативних значеннях мембранного потенціалу, ніж без фенітоіну. Фенітоін також уповільнює процес виходу натрієвих каналів з інактивації. Як інактивація так і блокування, викликане фенітоіном, перешкоджає відкриванню каналу. Обидва процеси мають ідентичну потенціалозалежність. Зв’язування фенітоіну відбувається переважно тоді, коли канал знаходиться у стані швидкої інактивації. Результати наших досліджень свідчать про можливість спільних молекулярних механізмів дії (±)-каваіну, (+)-метистицину, деяких місцевих анестетиків та фенітоіну. Слід також відзначити, що незначна різниця хімічної структури (±)-каваіну та (+)-метистицину призвела до помітної різниці у молекулярних механізмах дії цих сполук на натрієві канали.

Вхід натрію у клітину через потенціал-керовані натрієві канали відіграє ключову роль у розвитку процесів, що призводять до загибелі нервових клітин у зоні ішемії.

Отримані результати мають практичне значення через те, що селективна модуляція і блокування натрієвих каналів у зоні порушення кровообігу є одним з перспективних шляхів вирішення проблеми виживання нервових клітин

ВИСНОВКИ

1. При дії (±)-каваіну та (+)-метистицину у концентраціях відповідно 10-400 мкМ та 1400 мкМ на ізольовані нейрони гіпокампу щурів було виявлено блокування натрієвого струму, що тече через потенціал-керовані натрієві канали. Помітного зміщення воль-амперної характеристики уздовж осі потенціалів не відбувалось.

2. Подавляючи натрієвий струм (±)-каваін та (+)-метистицин не змінюють потенціалозалежність процесу активації.

3. Зміщення підтримуваного потенціалу від -100 до -90 та -80 мВ викликало ііідййЩсшія ефективності подавляючої дії (±)-каваіиу ІЦ ('г)-меіисшцину. Концентрація (±)-каваіну, що викликає 50 % блокування натрієвого струму (ІС50) при підтримуваних потенціалах -100, -90 та -80 мВ відповідно складали 591, 2 мкМ, 374,8 мкМ та 162,9 мкМ. ІС50 для (+)-метистицину при тих же підтримуваних потенціалах були відповідно 192,5 мкМ, 104,0 мкМ та 33,7 мкМ.

4. Для модулюючої дії {±)-каваіну та (+)-метистицину па натрієві канали характерна відсутність залежності ефекту від частоти стимуляції у межах від 1 до 10 Нг.

5. (±)-Каваін та (+)-метистицин викликають зміщення стаціонарної інактиваційної характеристики у напрямку більш негативних значень мембранного потенціалу з одночасним зміненням фактору крутизни. Як у контролі, так і у присутності речовин, що досліджувались, стаціонарні ілахтиваційні характеристики описуються рівнянням Больцмана. Зміщення Уір., викликане дією 330 мкМ (±)-каваіну складало приблизно

14 мВ. Фактор крутості у контролі складав 5,7 мВ, а у присутності 330 мхМ (±)-каваіну

- 6,7 мВ. Така зміна фактору крутості може бути наслідком зменшення ефективної

валентності гіпотетичної воротної частинки, що обумовлює інактивацію з 4,3 до 3,7. Зміщення \\р,, викликане дією 330 мкМ (+)-меггистицину складало приблизно 25 мВ. Фактор крутості у контролі складав 5,5 мВ, а у присутності 330 мкМ (+)-метистицину

- 2,8 мВ, що могло бути наслідком зростання ефективної валентності гіпотетичної воротної частинки, що обумовлює інактивацію, з 4,5 до 8,8.

6. (±)-Каваін та (+)-метистицин у концентрації 330 мкМ прискорював розвиток інактивації. Цей ефект мав потенціале залежний характер.

7. Вихід натрієвих каналів з інактивації характеризується наявністю двох процесів з різними постійними часу. (+)-Каваін та (+)-метистицин уповільнюють обидва процеси.

8. Результати досліджень вказують на вибірковий вплив (±)-каваіну та (+)-метистицину на воротні механізми, що обумовлюють інактивацію натрієвих каналів. Фізнко-хімічні прояви дії (±)-каВаіну га ("г)-мстйсткцкку дещо Відрізняїоться.

Переоблік робіт, опублікованих за матеріалами дисертації 1) Maksim V. Kopanitsa, Viktor A. Panchenko, Elena I. Magnra, Polina V. Lishko and Oleg A. Krishtal / Capsaicin blocks Ca2+ channels in isolated rat trigeminal and hyppocampal neurones // Neuroreport, (1995) v.6, p. 2338-2340.

2) Е.И. Магура, О.И. Островская, M.B. Копаница, О .А. Крыпггаль, Й. Гляйтц / Блокирование (+)-метистицином потешшалуправляемых натриевых каналов в нейрона? зоны СЛ1 гиппокампа крысы// Нейрофшиология/Neurophysiology, (1996) т. 28, № 4/5, 179185.

3) Е.И. Магура / Действие (±)-каваина на инактивацию потенциал управляемы) натриевых каналов // Нейрофшиаюгия/Neurophysiology, (1996) т. 28, N2 4/5, 218-224.

4) Е.И. Maiypa, М.В. Копаница, Й. Гляйтц, О.А. Крыюталь /Потенциалозависимосп

действия (±)-каваина на скорость развития инактивации натриевых каналов// Нейрофизиология/Neiirophysiology, (1996) т. 28, № 6, 312-315.

5) E.I. Magura, M.V. Kopanitsa, О.А. Krishtal, J. Gleitz and T. Peters // Kavain inhibits voltage-dependent Na+ -channels in rat CA1 hyppocampal neurones // Israel Jomal of Medico■ Science (Supplement), (1996) v.32, p. 40.

Магура Е.И. Модуляция потенциал-упранляемых натриевых каналов СА1 нейронов гиппокампа крыс каю пиропами. Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности

14.03.03. - Нормальная физиология, Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 1997.

Методом фиксации потенциала (“раїсії-сіаіпр”) исследовалось действие кава пиронов (±)-каваина и (+)-мегястишша на потенциал-управляемые натриевые каналы изолированных СА1 нейронов гиппокампа крыс. (+)-Каваин и (+)-метистицин в концентрациях 10-400 мкМ и 1-400 мкМ соответственно обратимо блокировали натриевый ток, текущий через потенциал-управляемые натриевые каналы, не вызывая заметного смещения вольт-амперной характеристики вдоль оси потенциалов. Подзвляя натриевый ток, (±)-каваин и (+)-метистицин не изменяли потенциалозависимоегь процесса активации натриевых каналов. Смещение поддерживаемого потенциала от -100 до -90 и -80 мВ приводило к повышению эффективности блокирующего действия исследуемых веществ. Для модулирующего действия (±)-каваинз и (+)-метистицина характерно отсутствие зависимости эффекта от частоты стимуляции в пределах от 1 до 10 Нг. (±)-Каваин и (+)-метистицин в концентрации 330 мкМ вызывали смещение стационарной инактивационной характеристики в направлении более отрицательных значений мембранного потенциала с одновременным изменением фактора крутизны и примерно в два раза увеличением скорость развития инактивации. (±)-Каваин и {+)-метистишш также замедляли процесс выхода натриевых каналов из инактивации.

Magura E.I. Modulation of the voltage-operated sodium channels of the rat CA1 hyppocampal neurones by lava pirones/ The dissertation (manuscript) is presented in accordance with requirement for the degree of candidate of medical sciences in speciality 14.03.03. - Normal physiology, A.A. Bogomoletz Institute of Physiology/ National Academy of Sciencec of Ukraine, Kiev, 1997.

The action of kava pirones (±)-Jcavain and (+)-methysticin on the isolated CA1 hyppocampal neurones has been studied usin the patch-clamp technique. (+)-Kavain and (+)-methysticin in concentrations 10-400 fiM and 1-400 fxM respectively caused reversible block of the sodium current. (±)-Kavain and (+)-methysticin had not significantly shifted I/V curve. (±)-Kavain and (+)-methysticin did not change the voltage dependency of the sodium channels activation process. Shifting of the holding potential from -100 to -90 and -80 mV increased the effectivenes of blocking. Modulatory action of the (+)-kavain and (+)-methysticin on the sodium channels was characterised by the absence of the use-dependent effect in the range of stimulation frequencies 1-10 Hz. (+)-Kavain and (+)-methysticii\ in concentetion 330 piM shifted the steady-state inactivation curve toward more negative potentials and changed the steepness of the voltage dependency of the inactivation. (±)-Kavain and (+)-methysticin also accelarated fast inactivation and slowed the recovery from inactivation.

Ключові слова: метод фіксації потенціалу (раїсії-сіатр), СА1 нейрони гіпокампу, кава пірони, (±)-каваін, (+)-метисшцин, потенціал-керовані натрієві канали.