Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Моделирование направленной реактивности иммунного ответа веществами различного происхождения

На правах рукописи

Катлинский Антон Викентьевич

МОДЕЛИРОВАНИЕ НАПРАВЛЕННОЙ РЕАКТИВНОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА ВЕЩЕСТВАМИ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

14.00.36 - Аллергология и иммунология 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена, в ГНЦ - Институте иммунологии Федерального Управления медико-биологических и экстремальных проблем при Минздраве России («Медбиоэкстрем»).

Научный консультант: Академик РАН, РАМН,

Доктор медицинских наук, профессор

Рэм Викторович Петров

Официальные оппоненты: Академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Виталий Ильич Литвинов Доктор медицинских наук, профессор Людмила Ивановна Краснопрошина Академик РАМН,

доктор биологических наук, профессор Алексей Михайлович Егоров

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита состоится ь?_ 2004 года в 14.00 час. на заседании

Диссертационного совета Д. 001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, М.Казенный пер.,д.5А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИВС по адресу: 109064 Москва, М. Казенный пер., д.5А

Автореферат разослан

Л,

2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.В.Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иммунная система является уникальным регуляторным комплексом, контролирующим организм как в норме, так и патологии. Баланс клеточного и гуморального иммунных ответов является определяющим в этом равновесии. Изменение параметров равновесия в пользу одного из них вызывает необходимость внешней коррекции, выражающейся в специфическом моделировании активностей иммунной системы, протезирования иммунного ответа и управления им. Иммунный дисбаланс должен регулироваться направленно, и это можно достигнуть различными по своему происхождению веществами. Поэтому рассматривать иммунитет как объект моделирования биологических ответов, можно увидеть, что имеет место некая система, которую уместно охарактеризовать как моделирование направленной реактивности иммунных ответов (МНРИО). Использование подобных механизмов становится возможным с развитием современных средств медицинской науки, которая располагает большим арсеналом средств для разработки новых препаратов направленной активности.

Моделирование направленной реактивности иммунного ответа достигается многими средствами, часть из которых представлена готовыми фармакологическими формами, тогда как другая пока находится в стадиях различной степени изучения. Интенсивный поиск ведется среди антибиотиков с новыми активностями, традиционно - среди препаратов растительного происхождения, а также с учетом состояния развития мировой молекулярной медицины, наметилась четкая тенденция к разработке биоинженерных средств с иммуномодулирующими свойствами.

Серьезной проблемой всегда были и остаются лечение и профилактика опухолевых, аутоиммунных, инфекционных патологий. Большое количество различных препаратов, существующих на рынке, говорит по-видимому о том, что до сих пор не существует сколько-нибудь однозначного подхода для терапии вышеуказанных заболеваний. Кроме того, большинство из них обладает нежелательными побочными эффектами, коррекция которых представляет собой дополнительную проблему. С одной стороны, причиной этому является отсутствие селективности действия используемых лекарственных средств, а с другой, как это ни парадоксально, -трудности обоснованного выбора среди множества аналогичных средств. Все это диктует необходимость в разработке препаратов нового поколения, абсолютно разных по происхождению, метаболизм которых в организме может быть однозначно предсказуем, управляем, которые должны иметь минимум побочных эффектов. Организм млекопитающих представляет собой сложную многоклеточную систему, и нарушение его гомеостаза может повлечь за собой необратимые нарушения органов и

систем.

В этих условиях

I» ! ы х

иммуномодулирующих препаратов, селективно «узнающих» свои мишени in vivo среди множества других, являются фактором преимущественного качества и важным показателем надежности ожидаемого эффекта. Строго говоря, речь идет о работающей in vivo системе МНРИО Данный подход может быть положен в основу комплексной терапии заболеваний не только самой иммунной системы, но и всех остальных патологий, возникших на фоне иммунного дисбаланса.

Таким образом, типовые реакции мишеневых систем, в том числе ожидаемая активность, уровни регулирования иммунокомпетентных (мембранные, ядерные, цитоплазматические и др), достаточно полно описываются в терминах моделирования реактивности иммунного ответа.

Данная работа включает результаты, полученные в последние несколько лет при поиске новых классов антибиотических препаратов иммуносупрессивного действия, при разработке новых классов иммуномодуляторов пептидной природы, позволяющих их использовать для лечения вирусных и бактериальных инфекций, при создании новых систем избирательного направленного транспорта ряда цитостатиков и биологически активных соединений в опухолевые ткани.

Целью настоящей работы явилось исследование механизмов направленной реактивности иммунного ответа с помощью веществ различного происхождения, регуляции клеточного и гуморального типов иммунитета, а также подбор адекватных критериев использования МРНИО в практической медицине и медицинской биотехенологии. В связи с этим были сформулированы следующие задачи-

• Установление структур и описание основных свойств, анализ избирательных эффектов на функционирование иммунной системы иммуномодуляторов природного происхождения. компонентов антитибиотических комплексов, синтезируемых культурами Streptomyces sp. №182 и №162, а также свойств и механизмов действия иммуномодулятора растительного происхождения (ИРП)

• Анализ основных иммуномодулирующих и иммуноадъювантных свойств препарата «Гепон», являющегося природным полипептидом, его влияние на развитие неспецифического иммунного ответа при лечении различных инфекционных патологий.

• Анализ и описание клеточных ответов при использовании направленной системы доставки на основе конъюгатов, - лигандов к рецепторам клеток-мишеней в комплексе с лекарственным компонентом, исследование активности конъюгатов по сравнению с неконьюгированными антибиотиками и цитостатиками, а также на основе т.н. респекринов - иммунотоксинов нового поколения с высокой

избирательностью по отношению к клеткам-мишеням, несущим на своей поверхности целевой антиген.

• Разработка диагностикума на M. tuberculosis на основе рекомбинантных . белков ESAT-6 и CFP-10, как пример практического использования МРНИО.

Научная новизна. В рамках осуществления программы поиска природных антибиотиков, обладающих иммуносупрессивной активностью, изучены продуценты олигомицинов, относимых к виду Streptomyces sp., некоторые из них ранее описаны не были (напр., Streptomyces griseolus). В данной работе впервые установлены абсолютно новые антибиотические компоненты, синтезируемые культурами Streptomyces sp.№182 и №162. Установлено, что они принадлежат к олигомицинам А, В, С, SCII и обладают антифунгальными, противовирусными и иммуносупрессивными свойствами.

Впервые исследованы токсические свойства другого иммуномодулятора растительного происхождения (ИРП), в отношении опухолевых и нормальных клеток человека, его митогенная активность в отношении лимфоцитов периферической крови, способность индуцировать секрецию мононуклеарных лейкоцитов, цитотоксических факторов in vitro.

Впервые исследована активность иммуномодулятора Гепон на активацию неспецифического иммунитета больных различными инфекциями, проведена оценка иммунного контроля оппортунистических инфекций, исследовано влияние Гепона на гуморальный и клеточный иммунитет. Установлены его иммуноадъювантные свойства.

Впервые созданы конструкции, представляющие собой конъюгаты из лигандов (AFP, EGF) к рецепторам опухолевых клеток-мишеней разных типов и лекарственного начала, представленного цитолитическими и цитотоксическими веществами (доксорубицином, эсперамицином, 2,3,7,8-тетрахлордибензо-Р-диоксином). Изучены ковалентные и нековалентные конъюгаты «DR-AFP», «эсперамицин-AFP», «ТХДД-AFP», «EGF-DR».

Предложен абсолютно новый подход к разработке иммунотоксинов нового поколения - респекринов. Такой иммунотоксин гарантирует направленный транспорт токсинов или других биологически активных белков в клетку, независимо от того, является ли антиген экспонированным на ее поверхности, либо секретируемым во внеклеточное пространство. В связи с этим биологическое действие данного иммунотоксина селективно проявляется лишь в отношении целевых клеток, несущих на своей поверхности заданный антиген.

Впервые разработан и апробирован диагностикум на туберкулез. В основу тест-системы положена идентификация белков ESAT-6 и CFP-10, являющихся специфичными только для RD-региона генома М. tuberculosis.

Практическая ценность работы. Поиск и обнаружение новых антибиотиков макролидной структуры открывает новые возможности для практического здравоохранения. Обнаруженные нами антибиотические комплексы обладают антифунгальной и иммуносупрессивной активностями. Наличие охарактеризованных продуцентов, полная физико-химическая и структурная характеристика, а также актуальная биологическая активность является основой для создания серии лекарственных препаратов на основе обнаруженных комплексов.

Исследована эффективность профилактического применения ИРП для предупреждения образования опухолей. Полученные результаты позволяют заключить, что исследуемый препарат обладает мощными противоопухолевыми эффектами, причем его действие связано не только с непосредственным цитотоксическим действием на клетку опухоли, но и с активацией защитных сил организма, о чем свидетельствует очень высокая противоопухолевая эффективность профилактического введения ИРП. Именно эта особенность позволяет отнести его к разряду иммуномодуляторов. Низкая токсичность ИРП и его выраженная противоопухолевая активность позволяют рекомендовать ИРП для проведения 1-ой фазы доклинических испытаний для выяснения его эффективности в качестве средства сопутствующей терапии.

Препарат Гепон является синтетическим тетрадекапептидом, разрешен для применения в качестве иммуномодулятора для коррекции ослабленного иммунитета, лечения и профилактики оппортунистических инфекций. Иммуномодулятор Гепон успешно применяется при лечении острых и хронических инфекционно-воспалительных процессов различной этиологии и локализации. В данной работе исследована возможность усиления с помощью Гепона иммунного контроля оппортунистических инфекций. Установлено, что Гепон значительно повышает эффективность иммунного контроля. Гелон проявляет свойства истинного иммуномодулятора, активирующего слабую иммунную реакцию и ограничивающего слишком интенсивную, делая ее умеренной. Установлены иммуноадьювантные свойства Гепона, что позволяет использовать данный препарат не только для лечения заболеваний, но и совместно с некоторыми вакцинами.

Показано, что избирательность и цитолитическая активность конъюгатов «DR-AFP», «эсперамицин-AFP», «ТХДД-AFP», «EGF-DR» намного превосходит таковую у свободных антибиотиков и цитостатиков и позволяет повысить селективность их доставки в опухолевые клетки. Предложенная система доставки опробована на разных типах опухолевых клеток, в том числе и с лекарственной устойчивостью. Показано, что избирательность и эффективность воздействия конъюгатов на опухолевые клетки намного выше, чем на интактные. Это говорит о низкой токсичности предложенных

препаратов и избирательности их действия. Для выяснения возможности применения предложенных лекарственных препаратов в практической медицине требуется проведение соответствующих клинических испытаний.

Предложенный иммунотоксин респекрин содержит экранированный физиологически активный белковый фактор, способствующий антиген-зависимой активации при взаимодействии с мишенью. В предлагаемом подходе реализована принципиально новая идея целенаправленного транспорта в клзтки-мишени и целевой активации лекарственных средств, которая может быть использована как альтернативная система доставки лекарственного начала в опухоли.

Разработанный в рамках данной работы диагностический реагент для кожной пробы на основе двух белков ESAT-6 и CFP-10 показал в эксперименте высокую чувствительность и специфичность для диагностики туберкулезной инфекции и позволяет достоверно дифференцировать гиперчувствительность замедленного типа, обусловленную инфицированием М. tuberculosis, от реакций, связанных с вакцинальным иммунитетом (BCG) и инфекцией М. avium.

Таким образом, в работе предпринята попытка разработать систему подходов, связанных с целенаправленным моделированием реактивности иммунных ответов, что является важной составляющей при лечении заболеваний любого генеза, прямо или косвенно возникших на фоне иммунного дисбаланса. Одни из этих подходов уже используются в практическом здравоохранении, тогда как другие являются объектом приложения самого ближайшего будущего.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Моделирование направленной реактивности иммунного ответа (МНРИО) может быть реализовано с помощью веществ, созданных как природой, так и с помощью возможностей современных биотехнологических направлений. МНРИО создает основу для комплексной терапии заболеваний иммунной системы на уровне управления различных систем клетки, в том числе рецепторных (мембранных, ядерных), цитоплазматических, других органных систем.

2. Новый класс антибиотиков, относимых к олигомицинам, а также препараты на основе растительного сырья (ИРП) являются вновь открытыми природными объектами, на базе которых возможно создание новых биологически активных лекарственных средств, обладающих иммуносупрессивными, антифунгальными (антибиотики), иммуностимулирующими, противоопухолевыми (ИРП) свойствами.

3. Разработанные конъюгаты на основе AFP, EGF в комплексе с цитостатиками, а также иммунотоксины нового поколения, респекрины, обеспечивают направленный транспорт лекарственного вещества в' клетку, обладают низкой токсичностью и высокой избирательностью и могут служить основой для лечения опухолей любого генеза, на которых имеются возможности рецепторного узнавания вышеуказанными

лигандами. Эти вещества являются примером возможностей биотехнологического разнообразия приемов и методов, использование которых позволяет добиться получения субстанций с заданными свойствами.

4. Иммуномодулятор Гепон является эффективным препаратом, имеющим позитивные результаты в клинике при лечении больных с инфекционными патологиями, в том числе с оппортунистическими инфекциями.

5. Все вышеуказанные препараты являются представителями новых классов иммунобиологических лекарственных средств, перспективных для клинического использования в комплексной терапии заболеваний, связанных с иммунным дисбалансом организма, в том числе в терапии опухолей.

6. Диагностикум на туберкулез, выполненный на основе белков RD-региона M.tuberculosis ESAT-6 и CFP-10 и представляющий собой классический пример биотехнологической наработки рекомбинантных белков через создание штамма-продуцента, является примером практического применения МНРИО и позволяет с высокой достоверностью отличать инфицирование вышеуказанным патогеном от любого другого микобактериального заражения.

Внедрение результатов исследования.

Обсуждаемые в настоящей работе результаты исследования и направления имеют практическое внедрение. Предложен к использованию в практическом здравоохранении диагностикум на туберкулез, обладающий высокой чувствительностью по отношению к M.tuberculosis. На данный диагностикум подана заявка на патент (40). Кроме того, в ближайшее время будут внедрены в производство препараты на основе вновь открытых антибиотиков олигомицинового ряда, а также препараты на основе конъюгатоз. обладающих противоопухолевой активностью и диагностическая система для определения M.tuberculosis на основе рекомбинантных белков ESAT-6 и САЗ-10.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на 4 съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001), на Международной конференции «Биотехнология на рубеже 2-х тысячелетий» (Саранск, 2001), на 4 съезде дерматологов и венерологов республики Беларусь (Гомель, 2001), на 1 Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), на 2 международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), на 1 съезде микологов России (Москва, 2002), на 5 конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на 6 Конгрессе современных проблем аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии (С-Пб, 2003), на 1 Всероссийской Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 344 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список цитированной литературы, включающий 438 источников. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 46 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Биосинтез антибиотического комплекса. Штамм-продуцент Streptomyces griseolus №182 предварительно выращивали на агаризованной среде Гаузе 1 в течение 10-14 суток при температуре 28 "С. Биосинтез проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл со 100 мл питательной среды в течение 6 суток при 28"С на качалках с режимом перемешивания 4 с-1. Агаровым блоком с косяка инокулировали жидкую горохово-крахмальную среду (М 1) (Бибикова с соавт., 1981).

Образование антибиотического комплекса оценивали по активности ацетоновых экстрактов из мицелия продуцента в отношении Aspergillus niger 137а и по интенсивности пятен, полученных методом ТСХ на пластинках Silifol (Чехословакия) в системах бензол-ацетон (2:1); этилацетат; этилацетат-изопропанол (95:5). Наработка отдельных фракций антибиотического комплекса осуществлялась методом препаративной ВЭЖХ.

Изучение макроморфологических характеристик культуры Streptomyces SP №162. Культуру выращивали при 280С на агаризованных средах: минеральный агар Гаузе 1, среда Красильникова, среда Гаузе 2, глицерин-нитратная, крахмально-аммиачная, среда Чапека с глюкозой, мясо-пептонная среда, солодовый агар, овсяной агар. Учитывали диаметр (d) колонии, вид воздушного мицелия (ВМ), вид субстратного мицелия (СМ), наличие растворимого пигмента (РП) на 7 и 14 сутки роста.

Биосинтез антибиотического комплекса. Штамм-продуцент предварительно выращивали на агаризованной овсяной среде в течение 10-14 суток при температуре 28°С. Хранили при +4°С не более 2 месяцев. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл со 100 мл питательной среды в течение 4-6 суток при 28°С на качалках с режимом перемешивания 4с-1. Культуру высевали в питательную среду блоком со скошенной агаризованной среды. Для начальных стадий изучения синтезируемого продукта использовали среду М1. Посевной вегетативный материал выращивали на той же среде в течение 48 - 72 часов в тех же условиях. В процессе изучения вариантов с повышенной продуктивностью проводили разработку сред методом латинских прямоугольников.

Первичная иммунологическая оценка осуществлялась по влиянию на ФГА -индуцированную бласттрансформацию и пролиферацию лимфоцитов здоровых

доноров. Результаты реакции оценивали по включению радиоактивной метки НЗ -тимидина.

Определение митогенной активности препарата ИРП. Митогенную активность препарата определяли по его способности стимулировать пролиферацию лимфоцитов, оцениваемую по включению ЗН-тимидина.

Определение противоопухолевой активности препаратов ИРП на экспериментальных животных. Клетки перевиваемой миеломы мыши линии Sp2/0 поддерживали путем еженедельной в/б перевивки мышам линии Balb/c. Для индукции солидных опухолей клетки линии 5р2/0 вводили мышам линии ВаЬ/с подкожно в 0,1 мл физиологического раствора (ФР) в область спины. Начиная со 2-го дня мышам внутрижелудочно вводили препарат в объеме 0,04 мл 8 раз в сутки в течение эксперимента. Контрольным животным в/ж вводили ФР. Ежедневно контролировали выживаемость животных. Размер солидной опухоли измеряли 1 раз в 2 - 3 дня. Сравнительную противоопухолевую активность препаратов оценивали по увеличению средней продолжительности жизни (УСПЖ) экспериментальных животных относительно контрольных, а также по относительному увеличению объема солидной опухоли. УСПЖ рассчитывали по формуле: УСПЖ = 100 х (Т/С -1), где Т соответствует средней продолжительности жизни леченных животных в днях, а С - соответствует средней продолжительности жизни в днях для животных контрольной группы. Объем опухоли рассчитывали по формуле: V = 1/2LW2, где L - длинный, a W - короткий диаметр опухоли.

Количественное определение УРОВНЯ IgM- И lgG-антител к антигенам оппортунистических инфекций. Количественное определение уровня специфических антител классов IgG и IgM к возбудителям оппортунистических инфекций проводили с помощью коммерческих наборов по- протоколу фирм- производителей: к вирусу цитомегалии (IgG, IgM) - фирмы "Medac" (Германия), к вирусам простого герпеса 1 и 2 типов (IgG), Candida albicans (IgG), Aspergilus funigatus (IgG) - фирмы "Хема-медика" (Россия), к вирусам простого герпеса 1 и 2 типов (IgM), Toxoplasma gondii (IgG) - фирмы "Sentinel" (Италия). Результаты по определению антител класса IgM приведены в единицах оптической плотности. Уровень IgG антител к вирусам простого герпеса 1 и 2 типов, а также к вирусу цитомегалии у пациентов второй группы определяли в титрах как разведение сыворотки, дающее оптическую плотность, равную диагностическому порогу.

Изучение динамики основных субпопуляций лимфоидных клеток крови. Количественное определение основных популяций лимфоцитов проводили с помощью трехцветных наборов моноклональных антител CD3/CD4/CD45, CD3/CD8/CD45, CD3/CD19/CD45, CD3/CD16/56/CD45 (Becton Dickinson) в соответствии с протоколом фирмы-производителя.

Влияние на продукцию антител. В экспериментах использовали 1,5-2-месячных мышей (CBAxC57BI)F1, полученных из питомника РАМН "Столбовая". В качестве гетерологичного корпускулярного антигена для иммунизации мышей применяли эритроциты барана (ЭБ). В качестве растворимого гетерологичного антигена применяли яичный альбумин (ЯА) производства Calbiochem (кат. 32467) или ICN Biochemicals (кат. 191224). Интенсивность иммунного ответа определяли по уровню сывороточных lgG-антител, специфически связывающихся с ЯА.

Анализ активностей СТРУКТУРНЫХ фрагментов Гепона. Полипептид Гепона ТЕККККЕТУЕКЕКЕ и его структурные фрагменты, соответствующие а.к. 1-5 с N-конца (HP 1-5), а.к.1-9 (НР1-9), ах 1-11 (НР1-11), а.к.10-14 (НР10-14), а.к. 6-14 (НР6-14), а.к.4-14 (НР4-14), а.к. 4-11 (НР4-11) и а.к. 3-12 (НРЗ-12), синтезированы 000 «Иммафарма». Пептиды растворяли в физиологическом растворе Nad, вводили мышам внутрибрюшинно в диапазоне доз от 10 нг до 10 мкг за 60 минут до введения ЭБ или одновременно с ЯА.

Исследование ПРОТИВОВИРУСНОГО действия препаратов. Культуры клеток линий J-96 или L-41 в концентрации 200000 клеток в 1 мл высевались в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты в среде 199 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, 300 мкг/мл глутамина и 100 Ед/мл пенициллина. В планшеты с клетками J-96 и L-41 вносили раствор исследуемого пептида в концентрации 1 мг/мл и титровали с шагом 1:2 в 24 лунках, по 3 лунки на каждую концентрацию. Эксперименты повторяли 3 раза. Препараты вносили в культуры клеток за 24 часа до заражения ВЭМК. Противовирусный эффект оценивался по минимальной эффективной концентрации (максимальное эффективное разведение) препарата, защищающей 50% клеток от цитопатогенного действия 100 ТЦД50 ВЭМК в 1 мл.

Определение мРНК цитокинов. РНК выделяли из 4 вариантов культуры клеток J-96: 1) контрольные клетки, не подвергавшиеся воздействию ни препаратом, ни вирусом; 2) клетки, инкубированные в присутствии Гепона в течение 24 часов; 3) клетки, инкубированные без препарата в течение 20 часов, затем зараженные вирусом за 4 часа до выделения РНК; 4) клетки, инкубированные в присутствии препарата в течение 20 часов, затем зараженные вирусом за 4 часа до выделения РНК. Активность мРНК 11 цитокинов определяли методами обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

Очистка AFP. AFP получали из ретроплацентарной сыворотки крови рожениц. Исходное сырье предварительно тестировали на наличие HBS-антигена вируса гепатита и антител к вирусу HIV. Высокомолекулярные белки сыворотки осаждали 7% полиэтиленгликолем Mr = 6000. Осветленную сыворотку использовали для иммуноаффинной хроматографии на колонке с предварительно полученными

моноклональными антителами к AFP, иммобилизованными на BrCN-активированной сефарозе 4В. Концентрацию белка определяли по методу Лоури.

Получение конъюгата DR с AFP. Очистку конъюгата проводили на колонке с сефадексом G-25. Концентрацию свободного DR определяли спектрофотометрически по поглощению при 450 нм. Молярное соотношение белолкDR в синтезированных конъюгатах определяли с помощью калибровочной кривой, построенной с использованием смеси DR с AFP. Конечное соотношение AFP:DR в конъюгате составило 1:2.

Конъюгат AFP с эсперамицином синтезировали с помощью сукцинимидного эфира 3-(2-пиридилдитио)-пропионовой кислоты (SPDP).

Получение нековалентного комплекса ТХДД с AFP. ТХДД растворяли в диоксане и хранили в атмосфере азота при +4°С. К раствору AFP с концентрацией белка 1,5-2,0 мг/мл добавляли ТХДД с расчетом, чтобы конечная концентрация диоксана не превышала 5%. Образовавшийся комплекс AFP TXAU отделяли от низкомолекулярных примесей на колонке с Сефадекс G-25, содержащей 10% ацетонитрила.

Клеточные линии. В работе были использованы клетки Американской коллекции культур (АТСС). Клетки карциномы молочной железы человека МСР-7 и карциномы шейки матки HeLa культивировали в среде DMEM (Sigma) в присутствии 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, "Gibco") и 50 мкг/мл гентамицина. Клетки человека линий: HeLa (карцинома шейки матки) и В-клеточные линии Raji, MK, Namalva, 1M9 были получены из банка клеток ВНЦМДЛ.

Получение конъюгатов DR с EGF. Конъюгаты получали по модифицированному методу (Hurwitz et al., 1975). Конъюгаты EGF с DR получали путем смешивания EGF в соотношении 1:8.5 в 0.1 М бикарбонатном буфере, рН 8.5, последующего добавления раствора глутарового альдегида и инкубации реакционной смеси в течение 30 мин при +20"С. Конъюгаты очищали от продуктов реакции с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК (pTBD16) in vitro. Для приготовления вектора ДНК плазмиды рQЕ30 (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывали в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCI, рН 8,5, 10 мМ MgCI2, 100 мМ KCI, 0.1 мг/мл BSA) рестриктазой ВатН1, а затем -в 40 мкл буфера О (50 мМ трис-HCI, рН 7, 5. 10 мМ MgCI2, 100 мМ NaCI, 1 мМ DTT, 0,1 мг/мл В5А) рестриктазой Kpnt (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент величиной 3,7 т.п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле электрофоретически перемещали в слой DEAE-бумаги, затем элюируют 1М NaCI и осаждают ДНК из раствора этанолом. Аликвоту реакционной смеси использовали для трансформации компетентных клеток E.coli DLT1270. Трансформанты высевали на чашки с YT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Полученная рекомбинантная плазмида pOEcfp обрабатывалась рестриктазами BamHI

и Hindlll для клонирования в ней последовательности гена ESAT- 6. Ген esat-6 был амплифицирован из ДНК M.tuberculosis H37Rv с помощью праймероа ESAT-F и ESAT-R. Полученный синтетический фрагмент ДНК в количестве 2 пмоль прибавляли к 1 мкг описанного выше вектора pOEcfp и лигировали с помощью 10 ед.акт. Т-4-ДНК лигазы в течение 12 часов при 100С. Аликвоту реакционной смеси использовали для трансформации компетентных кислот DLT1270. В результате была получена плазмида PTBD16.

Выделение белка из экстракта биомассы, Супернатанты разбавляли в 2 раза буфером А, центрифугируют при 14000 об/мин (20 мин, +200С) на центрифуге "Eppendorf MiniSpin", осадок отбрасывали, супернатант использовали для получения белка CFP10-ESAT-6.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Выделение, установление структуры и изучение биологической активности антибиотических комплексов олигомицинового ряда.

1.1. Изучение антибиотического комплекса, синтезируемого культурой Streptomyces griseolus №182.

В процессе осуществления программы поиска природных антибиотиков, обладающих иммуносупрессивной активностью, нами был выделен, отнесенный к Streptomyces griseolus штамм (№182), продуцирующий комплекс антифунгальных антибиотиков. Изучение антибиотического комплекса показало, что он содержит структуры, соответствующие олигомицинам. Олигомицины, комплекс антибиотиков с антифунгальным и иммуносупрессивным действием, были впервые обнаружены в мицелии Streptomyces cliastrochromogenes (Nakakita et al., 1980). Олигомициновый комплекс, образуемый diastrochromogenes, состоит из трех близких в химическом отношении компонентов - олигомицина А, В и С. Механизм действия олигомицинов большинством авторов связывается с воздействием на fo f1 АТФазу. Содержание их в комплексе может варьировать в зависимости от штамма и условий культивирования. Позднее было обнаружено еще несколько олигомициновых структур (Kim et al., 1997; Laatschi et al., 1993). Изучаемый штамм является аэробом, оптимальная температура для роста 26-28 *С. Молоко пептонизирует, желатину разжижает слабо, крахмал гидролизует слабо, меланоидные пигменты на теразиновом агаре не образует. Рост наблюдается в интервале рН-4,5-9 (оптимум 6,5-7,5). Исследованы особенности и рост колоний в завистмости от присутствия в среде Сахаров. Полученные данные позволяют отнести штамм к виду Streptomyces griseolus.

риосинтез и выделение_антибиотического комплекса. Суммарный

олигомициновый комплекс нарабатывали в колбах на качалках. Ферментация продолжалась 6-7 суток. По окончании ферментации на среде М-1 получали культуральную жидкость с содержанием олигомицинового комплекса 200-250 мкг/мл.

После отделение биомассы центрифугированием культуральной жидкости (5 литров) раствор отбрасывали, а мицелий экстрагировали ацетоном. Аморфный препарат комплекса олигомицинов отделяли и высушивали в вакуумно-сушильном шкафу. В итоге получали около 1 г суммарного комплекса олигомицинов. Выход на данном этапе составил 90% от содержания олигомицинов в культуре. С помощью полупрепаративного ВЭЖХ были получены и охарактеризованы чистые компоненты (Табл.1).

Таблица 1. Физико-химические свойства олигомицинов А и В, продуцируемые штаммом Streptomyces gnseolus №182

1 Олигомицин А | Олигомицин В

{Внешний вид Порошок белого цвета I Порошок белого цвета

¡УФ- спектр в метаноле 218,225,232,242 1218,225,232,242

¡Молекулярная масса 791 (МН+) ¡805 (МН+)

ТХС на пластинках БиМо! в системах 1.бензол-ацетон (5:1) 2.гексан-ацетон(2:1) Н(=0,4 5 ЯГ =0,34 К/=0,45 ' IV = 0,34 I

Выделенный суммарный препарат очищали методом колоночной хроматографии. Разделение комплекса на индивидуальные компоненты проводились методом ВЭЖХ. Показано, что изучавшийся антибиотический комплекс состоит из трех компонентов в соотношении 80/15/5 (Грамматикова с соавт., 2003). Основные два компонента соответствовали фракциям 2 и 1.

Изучение Физико-химических свойств Для более точной метрологической характеристики антибиотиков фракций 1 и 2 использовали ВЭЖХ в градиентном режиме. При этих условиях количество теоретических тарелок для фракции 1 составляло -24000, а для фракции 2 -30000; ассиметрия пика для фракции 1 была равна - 0,914, а для фракции 2 - 0,940.

С целью получения гомогенных фракций для дальнейших физико-химических исследований был разработан на основе данных, полученных при аналитической хроматографии препаративный метод ВЖЭХ. В результате проведенного исследования были найдены оптимальные условия разделения основных компонентов комплекса (фракции 1 и 2). Используя этот метод, наработаны необходимые количества индивидуальных компонентов комплекса. Степень их гомогенности оценена методами ВЭЖХ в градиентном и изократическом режимах. Полученные данные были сопоставлены с физико-химическими характеристиками антибиотиков описанных в литературе. На основании анализа был сделан вывод о том, что антибиотик 182 фракция 2 может является олигомицином А.

Для более детального сравнения олигомицина А и компонента 2 было проведено исследование препаратов методами ВЖЭХ, ПМР, ИК-спектросколии и масс-спектрометрий. На основании данных ЯМР и масс-спектров определена химическая формула компонента 2 антибиотического комплекса. На основании сравнения химических формул компонента 2 (Рис.1) и олигомицина A (Laatschi et a!.. 1993) был сделан вывод о том, что изучаемый антибиотик является олигомицином А. Два других компонента антибиотического комплекса 182 являются олигомицинами В и С.

1.2. Изучение антибиотического комплекса, синтезируемого культурой Streptomyces sp.№162.

Изучение морфологических признаков культуры Streptomvces №162. Исходный штамм на твердой питательной среде образует плотные колонии, на большинстве исследованных средах - со скудным воздушным мицелием. Диаметр колоний варьировал от 1 до 9 мм. Форма колоний и вид воздушного мицелия зависели от среды культивирования.

Физиологические характеристики. Изучаемый штамм является грамположительным аэробом, оптимальная температура для роста 24-28вС. Молоко пептонизирует, желатину не разжижает, обладает каталазной активностью, крахмал гидролизует слабо, меланоидные пигменты на теразиновом агаре образует. Рост наблюдается в интервале рН-4,5-9 (оптимум 6,5 -7,5). На основании полученных признаков культура 162 предварительно отнесена к роду Streptomyces sp. (Гаузе с соавт., 1983).

Разработка метода биосинтеза антибиотического комплекса. Для разработки сбалансированной по всем компонентам питательной среды была проведена оптимизация состава среды с использованием математического метода планирования эксперимента - метода латинских прямоугольников. В результате серии экспериментов

Рисунок1. Химическая формула антибиотика 182 фракция-2

определили оптимальные условия биосинтеза для максимальной продуктивности штамма • культивирование при 28 С в 100 мл питательной среды в течение 5 суток. Вегетативный посевной материал культивировали при тех же условиях в течение 48 часов. Оптимальное количество вегетативного материала для проведения биосинтеза составляет 10% от объема питательной среды в колбе. В разработанных условиях продуктивность штамма достигала 250 мкг/мл. На основании проведенных изучений методом спектрального анализа ЯМР 13С и 1Н получены на ЯМР-спектрометре Bruker DRX 500 (500/125 МГЦ 1Н/13С) в CDCI3 при комнатной температуре, была рассчитана и составлена структурная формула антибиотика 1 антибиотического комплекса BSK-17.

На основании данных ЯМР определены брутто формула и молекулярная масса антибиотика: С44Н74011, Fw=779.0. Усредненная молекулярная масса - 778.

Антибиотик 1 (фракция 1) антибиотического комплекса относится к группе макролидных антибиотиков и по предварительным данным может являться олигомицином SC-II, о котором имеются ограниченные сведения в японском патенте на японском языке. Биологическая активность антибиотика не описана.

Исследования структуры антибиотика BSK-17 фракции 2 в настоящее время не закончено. Предполагается, что фракция 2 является антибиотиком олигомицином G, однако, образование антибиотика является минорным и для проведения полного объема исследований необходимы генетико-селекционные и физиологические работы с продуцентом.

Угнетение ФГА - индуцированной пролиферации лимфоцитов под воздействием BSK-17. По иммунологическому действию антибиотического комплекса BSK - 17 и выделенных фракций, отмечено снижение пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на ФГА в дозах 100-1 нг/мл. Эффект от влияния препаратов был дозозависимый. В концентрациях 100-1 нг/мл подавление составляло 98-77%, при снижении концентрации фракции 1 до 0.1 подавление сохранялось на уровне 84,2% и лишь в концентрации 0,01 нг/мл наблюдалось снижение эффекта до 28,8%. Влияние фракции 2 на пролиферативную активность лимфоцитов был несколько ниже в дозах 10 и 1 нг/мл по сравнению с действием фракции 1, а в дозе 0,1 нг/мл влияние фракции 2 в 3 раза снижено по сравнению с фракцией 1 (24,7 и 84,2 соответственно). Однако, из представленных данных видно, что оба препарата проявляют выраженную иммуносупрессивную активность.

Влияние фракции 1 антибиотического комплекса BSK-17 на апоптоз трансформированных клеток. При оценке влияния фракции 1 антибиотического комплекса BSK-17 в дозах 1-100 нг/мл на клетки лимфомы линии Yurcat выявлены следующие показатели. Препарат BSK-17 фракция 1 в концентрации 0,1-100 нг/мл вызывает апоптоз и одновременно усиливает некроз, что в целом характеризует его

активность на трансформированные лимфоидные клетки. При оценки влияния препарата на нетрансформированные клетки периферических лимфоцитов индуцированных активацией митогеном ФГА значительного влияния от действия BSK-17 не наблюдалось.

Изучение противовирусной активности антибиотического комплекса BSK-17. После предварительного изучения противовирусной активности и действующих доз антибиотического комплекса BSK-17, был поставлен следующий эксперимент. Во втором эксперименте BSK-17 в дозе 1 мкг/мл изучался в различных схемах воздействия на клетки: предварительная инкубация с препаратом до внесения вируса, одновременное внесение препарата и вируса и внесение препарата после предварительной инкубации с вирусом (Табл. 2).

При изучении профилактического действия BSK-17 в дозе 1 мкг/мл на лимфобластоидные клетки МТ-4 и предварительной инкубацией с антибиотическим комплексом выживаемость клеток увеличилась на 55% по сравнению с зараженными вирусом клетками без лечения. Одновременное внесение препарата и вируса вновь продемонстрировало выживаемость клеток на уровне контрольного препарата AZT При внесении BSK-17 после инкубации клеток с вирусом эффекта от действия препарата не наблюдалось. Таким образом, действие препарата BSK-17 при профилактической схеме (предварительная обработка клеток препаратом до внесения вируса) и при одновременном воздействии на клетку вируса и препарата, показало выраженный противовирусный эффект.

Таблица 2. Изучение противовирусной активности препарата BSK-17 нa модели лимфобластоидныхклетокМТ-4.

Препарат (конц.) Токсич. ! Предв. инкубация с преп. ! препаратом + V Одновременное j Предв. инкубация внесение ; с V + препарат

Жизие-способ. %. кол-во, млн\мл ИФА 5сут Жизне-способ. %. кол-во, млн\мл ИФА 5 сут Жизне-способ. %. кол-во, млн\мл ИФА 5 сут.

Ns 17(1) ¡78 Ю.23 63 ¡0,17 0,093 75 ¡0,20 0,088 ¡7 ¡0,03 1,218

AZT (0,5) ¡82 ¡0,30 ! 82 ¡0,3 0,241 | )

ACT (10) [64 ¡0.23 I ¡79 ¡0,37 ¡0.221 | |

КК ¡93 ¡0,43 i 0.046 | | I ||

кв ¡8 ,'0.03 I III II 1,325

Примечание: для ИФА была использована тест-система "GENSCREEN BIO-RAD", все образцы для ИФА разведены в соотношении 1:1000

2. Разработка конструкций для направленного транспорта противоопухолевых и антибактериальных препаратов.

2.1.Ковалентные и нековалентные конъюгаты белковых векторов с противоопухолевыми препаратами и антибиотиками

В проводимой работе разрабатывались различные приемы получения конструкций для направленной доставки противоопухолевых препаратов в живые клетки на основе белков-переносчиков - альфа-фетопротеина (AFP) и эпидермального фактора роста (EGF), путем рецептор-опосредованного эндоцитоза и проводилось изучение их действия на культурах опухолевых клеток и лабораторных животных. Исследование векторных возможностей AFP и EGF показало, что оба белка могут быть успешно использованы для рецептор-опосредованного транспорта в опухолевые клетки противоопухолевых антибиотиков и растительных алкалоидов. В качестве лекарственного начала были выбраны доксорубицин (DR), эсперамицин, а также 2,3,7,8-тетрахлордибензо -р-диоксин(ТХДД).

Ковалентный коньюгат «DR-AFP», Доксорубицин (DR) - антибиотик антрациклинового ряда, используемый в терапии онкологических заболеваний. Его цитотоксическое действие обусловлено прямой интеркаляцией в ДНК, генерированием активных форм кислорода, связыванием со специфическими ферментами и повреждением поверхности клетки. К существенным недостаткам доксорубицина относится его высокая аллергенность, токсичность и развивающаяся резистентность опухолевых клеток при курсовом терапевтическом применении препарата.. Сравнительное исследование ЦТА DR и синтезированных конъюгатов DR-AFP (молярное соотношение антибиотик: белок составило 1:3) проводили на опухолевых клетках человека линии SROV3, несущих рецепторы к AFP. Показано, что ЦТА конъюгата DR-AFP более чем в 4 раза превышала активность свободного DR. Дополнительная оценка ЦТА конъюгатов, проведенная в отношении опухолевых линий OQS и MCF-7 показала превышение ЦТА конъюгата DR-AFP в 3,7 раза. К 28 дню эксперимента средний размер опухолей у животных, получавших DR-AFP, был в 3 раза меньше, чем у мышей, получавших свободный DR и более чем в 8 раз меньше, чем в контрольной группе. В группе, получавшей DR-AFP, наблюдалось также наиболее значительное увеличение средней продолжительности жизни (УСПЖ).

Ковалентный коньюгат «эсперамицин-AFP». Эсперамицин - антибиотик, обладающий высокой токсичностью, обусловленной наличием десятичленного ендиинового цикла, перегруппировка которого приводит к образованию бирадикала, вызывающего одно- и двунитевые разрывы цепей ДНК. Для проверки противоопухолевой активности конъюгата in vitro использовали подкожную модель лейкоза Р388 на самках мышей линии DBA2. Препараты эсперамицина и конъюгата AFP-эсперамицин вводили подкожно. Введение конъюгата AFP с эсперамицином

вызывало эффективное торможение роста опухолей (ТРО), которое на 25 день достигало 99%. Столь эффективное ингибирование опухолевого роста приводило также к значительному увеличению продолжительности жизни (УПЖ) экспериментальных животных - до 120% по сравнению с контрольной группой. Отметим, что у 50% животных наблюдалась полная регрессия опухолей. Свободный эслерамицин значительно уступал конъюгату по обоим параметрам (ТРО-85%, УПЖ-26%) и не приводил к регрессии опухолей (Рис. 2)

Коотро» Эшц»- <V5) 0.00) (US)

ЫШ9Ш

Вющмм АтдаЛо-

Рисунок 2. Влияние эсперамицина и ковалвнтного коньюгата tAFP-эсперамицин» на развитие модельной опухоли Р388 (а) и продолжительности жизни (б) у мышей DBA. 1-Контроль, 2-эсперамицин, 3-«АРР-эслерамицин».

Показано, что использование конъюгата cAFP-зслерамицин» позволяет повысить селективность доставки этого антибиотика в опухолевые клетки и выяснение возможности его применения в практической медицине требует проведения клинических испытаний.

Нековалентный коньюгат "ТХДД-АFP." КОМПЛЕКС TXAA:AFP обладает выраженным противоопухолевым действием. При введении комплекса мышам с модельными подкожными опухолями Р388 и СА755 (гормон-зависимая линия) наблюдали эффективное торможение роста опухоли (до 99%) и максимальное увеличение средней продолжительности жизни до 140% (СА755).

Коньюгаты tEGF-DR». Нами была исследована возможность применения эпидермального фактора роста (EGF) в качестве векторных молекул для доставки OR в клетки-мишени. Синтезированы конъюгаты EGF с доксорубицином (DR) с использованием глутарового альдегида в качестве бифункционального сшивающего реагента. Цитотоксическая активность (ЦТА) конъюгатов EGF-DR в отношении клеток карциномы молочной железы человека линии MCF-7, как чувствительных, так и резистентных к доксорубицину, значительно превышала активность свободного DR. В отношении культур эндотелиальных клеток ЦТА конъюгатов существенно превышала активность свободного DR, причем пролиферирующий эндотелий оказался более чувствительным к действию конъюгатов по сравнению с конфлюэнтным. Конъюгаты также проявляли более высокую терапевтическую активность, чем свободный препарат, в отношении солидной мышиной меланомы В16 in vivo (Рис. 3).

day* after tauor transphaUtioa

Рисунок 3. Противоопухолевый эффект свободного доксорубицина (DR) и конъюгата с EGF (EGF-DR) на клетки опухоли В16 после трехкратного в/в введения (9.14 мг/кг) с интервалом в 4 дня. Контрольные животные не получали никаких препаратов.

ЦТА конъюгатов исследовали в отношении чувствительных (линия MCF-7wt) и резистентных к DR (линия MCF-7ADRR) опухолевых клеток, характеризующихся высоким уровнем экспрессии рецепторов EGF (Fitzpatrick et al., 1984).

Как видно из Табл. 3, ЦТА конъюгатов EGF-DR в отношении как чувствительных, так и резистентных клеток MCF-7 превышала активность свободного DR.

Таблица 3. Цитотоксическаяактивность доксорубицина и его конъюгатов с БОГ, полученныхс помощью глутарового альдегида, в отношении культур опухолевыхи эндотелиальныхклеток.

i Линия клеток IIC50, нМ

i | DR Iegf-dr

| MCF-7wt j 170 I 22

i MCF-7ADRR | 12 500 I 700

! HUVEC (покоящиеся) I 336 141

i HUVEC (пролиферирующие) ¡171 I 5

IB16 135 I

Конъюгаты оказались весьма эффективными в отношении пролиферирующего и конфлюэнтного эндотелия. Оба конъюгата проявили более высокую ЦТА по сравнению со свободным антибиотиком. Пролиферирующий эндотелий оказался заметно более чувствительным к действию конъюгатов в сравнении с конфлюэнтньм эндотелием, что, по-видимому, обусловлено различиями в уровнях экспрессии рецепторов EGF и скоростях рецептор-опосредованного эндоцитоза для активно делящихся и покоящихся эндотелиальных клеток. Поскольку эндотелий капилляров опухоли характеризуется высоким уровнем пролиферации и экспрессии рецепторов ряда факторов роста (Maciag, 1990), также вполне вероятна его повышенная уязвимость к действию цитотоксических конъюгатов. Комплексное воздействие конъюгатов, направленное как на подавление опухолевого ангиогенеза, так и на повреждение опухолевых клеток, представляется перспективным подходом для проведения успешной химиотерапии злокачественных новообразований.

Исследование противоопухолевой активности препаратов in vitro в отношении солидной мышиной меланомы В16 показало, что применение свободного DR не оказывало заметного терапевтического эффекта (Табл. 4).

Таблица 4. Эффективность противоопухолевого действия Ой и его конъюга тов с БвГ при внутривенном введении мышам линии С57В1/6 с привитыми солидными опухолями меланомы В16

¡Группа OPO, % от контроля СПЖ, дни УСПЖ, %

'животных

i ( 12-21 день 124-34 день

¡контроль 100 ¡100 31,4±7,8 -

jDR 66,3±30,8 |162,7±40,2 23,6±4,0 -24,8

¡EGF-DR 18,8±7,4 |41,4±6,5 45,8±6,8 46,0

Так, хотя введение свободного антибиотика и приводило первоначально (12-21 день) к некоторому ингибированию опухолевого роста, в дальнейшем у животных

наблюдалось заметное прогрессирование роста опухолей, достигавших в период с 24 по 34 день эксперимента 162,7% от размера опухолей у контрольных животных.

В отличие от свободного DR, введение конъюгата EGF-DR приводило к значительному торможению развития опухолей в течение всего периода наблюдения: так, к окончанию эксперимента ОРО составлял 41,4%. Кроме того, применение конъюгата приводило к 45,8%-ному увеличению средней продолжительности жизни экспериментальных животных, чего не наблюдалось в случае свободного DR. При терапевтическом применении смесей DR с векторными молекулами в эквивалентных конъюгатам дозах их действие в отношении роста опухолей и СПЖ существенно не отличалось от действия свободного DR (данные не приведены). Высокая противоопухолевая активность конъюгатов может быть связана как с избирательностью их действия в отношении клеток-мишеней (опухолевых и эндотелиальных клеток сосудов опухоли), обусловленной векторным транспортом химиопрепарата, так и с низкой скоростью выведения препаратов из организма животного.

Регуляция чувствительности опухолевых клеток с помощью антисмысловых клеток с помощью антисмысловых олигонуклеотидов к гену BCL-2. В работе изучалась возможность блокирования гена Ь^2 с помощью антисмысловых олигонуклеотидов при использовании для внутриклеточной доставки нового липосомообразующего агента Unifedm - М. Предварительно были изучены колебания уровня экспрессии гена Ь^2 в клетках различных типов злокачественных опухолей ЖКТ человека и исследовано влияние гиперэкспрессии этого гена на чувствительность клеток различных опухолевых линий к цитотоксическим препаратам. Для получения опухолевых клеток с высоким уровнем экспрессии гена Ь^2 проводили трансфекцию интересующих клеточных линий геном Ь^2. Показано, что в опухолях ЖКТ обнаружено повышение и абсолютного уровня экспрессии белка Вс1-2, и соотношения Bd-2/Bax, а стабильная трансфекция опухолевых клеток геном Ь^2 приводила к повышению их резистентности и замедлению скорости пролиферации. Подавление активности гена Ь^2 с помощью АСОН к этому гену, доставляемых в клетку с помощью липосомообразующего агента Unifectin-M, приводила к снижению резистентности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам.

2.2.Антибактериальные и противоопухолевые препараты на основе респекриновых комплексов

Ряд разрабатываемых систем доставки лекарственных средств имеет существенные недостатки: мишени для лигандов могут находиться на других клетках, что снижает избирательность их действия и взаимодействие «антиген-антитело» или «лиганд-рецептор», необходимое для эндоцитоза, не приводит к транслокации комплекса. В данной работе сделана попытка оценить ряд опубликованных

экспериментальных и теоретических обобщений по разработке иммунотоксинов, биологическое действие которых селективно проявляется лишь в отношении целевых клеток, несущих на своей поверхности заданный антиген (Himmelweit et al., 1960; Wetta et at., 1985). Основной структурной единицей предложенной в данной работе является респекрин (receptor-specific screened toxin), который гарантирует направленный транспорт токсинов или других биологически активных белков в клетку, независимо от того, является ли антиген экспонированным на ее поверхности, либо секретируемым во внеклеточное пространство.

В работе в качестве объектов исследования выбраны Т- и В-клетки лимфом человека разных линий, а также изучена активация Т-клеток под воздействием конъюгата стафилококкового знтеротоксина А с иммуноглобулином класса G. Моделью респекрина служит иммунокомплекс изолированных р-цепей IgM человека с соответствующими ФИТС-меченными антителами. Gi клетки представляют собой эпитоп-содержащий фрагмент целевого антигена, вторые - экранирующее начало.

Описанный нами респекриновый комплекс содержит экранированный физиологически активный белковый фактор, способствующий антиген-зависимой активации при взаимодействии с мишенью. В предлагаемом подходе реализована принципиально новая идея целенаправленного транспорта в клетки-мишени и целевой активации лекарственных средств.

3. Изучение активностей иммуномодуляторов

3.1. Иммуномодулятор растительного происхождения.

Целью данной части работы является исследование механизмов противоопухолевой активности препарата растительного происхождения (ИРП), выделенного из растений. По предварительным данным фирмы, он обладает противоопухолевой активностью при различных формах рака у человека. Известно, что противоопухолевая активность может быть обусловлена как наличием цитотоксической активности и ее прямым действием на опухолевые клетки, так и активацией противоопухолевой цитотоксической активности иммунокомпетентных клеток организма.

Биологические свойства ИРП. Для характеристики ИРП исследовали его токсические свойства в отношении опухолевых и нормальных клеток человека in vitro, митогенную активность в отношении лимфоцитов периферической крови человека in vitro, способность индуцировать секрецию МЛ цитотоксических факторов и его способность влиять на противоопухолевую ЦТА мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека in vitro. Показано что ИРП обладает неспецифической ЦТА в отношении пролиферирующих клеток человека, т.к. она одинакова как в отношении различных линий опухолевых клеток, так и нормальных пролиферирующих

лимфоцитов периферической крови Цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам проявляют различные клетки-эффекторы, циркулирующие в периферической крови: это цитотоксические Т-лимфоциты, природные киллеры (NK-клетки), моноциты-макрофаги, нейтрофилы. Поэтому было исследовано влияние ИРП на ЦТА различных клеток- эффекторов. Показано, что ИРП повышает ЦТА лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов (данные не приведены).

Для оценки активации нейтрофилов используют НСТ-тест. Поэтому исследовали способность ИРП активировать нейтрофилы в НСТ-тесте. Полученные результаты в сравнении с активацией нейтрофилов зимозаном представлены в Таблице 5, из которой следует, что ИРП активирует нейтрофилы в такой же степени, как классический активатор нейтрофилов in vitro зимозан, и с такой активацией может быть связано усиление ЦТА нейтрофилов.

Исследовали влияние препарата ИРП на чувствительность опухолевых клеток

линии SKOV3 и SKVLB к антрациклиновому антибиотику доксорубицину. Из

полученных нами данных следует, что ИРП не влияет на чувствительность клеток

резистентной линии SKVLB (резистентность обусловлена гиперэкспрессией mdr1) и

чувствительной линии SKOV3 к доксорубицину, т.е. препарат ИРП не влияет на

противоопухолевую активность доксорубицина. Эти данные позволяют полагать, что

ИРП может быть использован в сочетании с химиотерапевтическими препаратами

Таблица 5. Активация нейтрофилов периферической крови человека ИРП (НСТ-тест)

(Препарат ¡Активность нейтрофилов, %

Исследование противоопухолевой активности ИРП. До исследования противоопухолевой активности ИРП модели перевиваемых опухолей мышей была изучена острая токсичность этого препарата для животных при в/б введении. Для этого ИРП вводили в/б в различных дозах и оценивали выживаемость животных через 24 часа после введения препарата. Полученные результаты представлены в Таблице 6.

Таблица 6. Острая токсичность ИРП для мышей линии Balb/c при однократном в/б введении

[Доза, мл/кг [Объем/мышь, мл [Выживаемость, %

Для исследования противоопухолевого действия ИРП его вводили внутрижелудочно (в/ж) мышам линии Batb/c через 24 часа после прививки суспензии опухолевых клеток миеломы мышей линии Sp2/0 (0,5 млн клеток в 0,1 мл физиологического раствора) в область спины. ИРП в этом эксперименте вводили в/ж ежедневно, постоянно, 4 раза в день по 0,04 мл, что составляло 0,16 мл на мышь весом 20 г или 8 мл/кг.

Полученные результаты позволили заключить, что исследуемый препарат обладает противоопухолевым действием в экспериментах на мышах. Поэтому был поставлен эксперимент по лечению мышей с развившимися опухолями. Для этого мышам линии Balb/c прививали п/к в область спины опухолевые клетки линии Sp2/0 как описано выше, после развития опухолей контрольной группе животных вводили физиологический раствор, а опытной - ИРП в/ж 8 раз в день по 0,1 мл (40 мл/кг), т.е. доза ИРП была существенно увеличена. При этом частота появления опухолей в течение 1 месяца в контрольной группе составила 91%, тогда как в группе, получавшей ИРП -20%.

В Таблице 7 представлены данные о частоте появления опухолей, частоте случаев излечения, СПЖ и УСПЖ мышей с развившимися опухолями при различных режимах и дозах введения ИРП.

Таблица 7. Противоопухолевая активность ИРП при различных дозах и схемах его введения

1 1 1 Схема и доза введения | Частота {образования 'опухолей через 1 месяц, % Частота случаев излечения,% СПЖ, сут. УСПЖ, %

| 1.0,04 мл, 4 раза/сутки 30 20 67.1 61,3

| 2.0,1 мл, 8 раз/сутки 30 20 56,7 36,6

| 3.0,2 мл, 8 раз/сутки 14 сут., 'затем 0,05 мл, 8 раз/сутки 10 40 72,7 74,6

|4,- 90 0 41.6 -

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при повышении дозы ИРП существенно возрастает его противоопухолевая активность.

Исследование эффективности профилактического применения ИРП для предупреждения образования опухолей. ИРП течение 3 недель вводили ежедневно, в/ж, 8 раз в день по 0,05 мл. После этого введение ИРП прекращали. Затем контрольным и опытным животным линии Balb/c вводили суспензию опухолевых клеток линий Sp2/0, подкожно, в область спины (0,5 млн в 0,1 мл). За развитием опухолей наблюдали в течение 90 суток и за этот период опухоли не развились.

Полученные результаты свидетельствуют об очень высокой эффективности профилактического введения ИРП для противоопухолевой защиты организма.

3.2. Исследование противовирусной и иммуномодулирующей активностей препарата Гепон

В данной работе исследована возможность усиления с помощью Гепона иммунного контроля оппортунистических инфекций. Гепон усиливал продукцию ^-антител к оппортунистическим инфекциям у 50-100% пациентов, не влияя при этом на синтез ^-антител. Под влиянием Гепона возрастал умеренный по интенсивности синтез антител. Напротив, слишком интенсивная (патологически повышенная) продукция антител к инфекционным агентам снижалась, приближаясь к значениям, характерным для эффективного иммунного контроля при персистенции, но не болезни. Следовательно, Гепон проявлял свойства истинного иммуномодулятора, активирующего слабую иммунную реакцию и ограничивающего слишком интенсивную, делая ее умеренной.

Активация образования антител к антигенам ВИЧ ПРИ лечении больных ВИЧ-инфекцией. У 8 пациентов, инфицированных ВИЧ, исследовали влияние курсового лечения иммуномодулятором Гепон на интенсивность продукции антител к антигенам ВИЧ. У всех исследованных в крови обнаружены антитела к антигенам ВИЧ-1, но не ВИЧ-2. Установлено, что у 5 из 8 пациентов под влиянием лечения Гепоном происходило усиление продукций антител к антигенам ВИЧ-1. Чаще наблюдалось усиление выработки антител, специфичных к р31, sgp120 и р24, реже - к р17 и др41. На рисунке 4 представлены типичные результаты исследования методом иммуноблота сыворотки крови ВИЧ-инфицированного пациента (№1). Интенсивность (класс) ответа на каждый антиген ВИЧ определялся денситометрически путем сравнения с интенсивностью калибровочных полос 1-3 методом сканирования и анализа денситограммы с помощью программы Scionlmage.

Рисунок 4. Детекция антител к белкам ВИЧ1/ВИЧ2 методом иммунобпота INNO-UA HIV Confirmation (Innogenetics). А — вид тест-полоски для определения антител к белкам ВИЧ. Б - денситометрическая обработка результата с помощью пакета Scionlmage. 0,1,2,3-калибровочные линии, для определения класса реакции: 0 - негативный контроль, 1-уровень +/-, 2 - уровень 1+, 3-уровень 3*.

Лечение Гепоном стимулировало продукцию антител у 5 (62,5%) из 8 исследованных пациентов. Наибольшие эффекты касались продукции р24 и р17, хотя в ряде случаев стимулировалась и продукция антител к spg120, gp41 и р31. Так, после лечения Гепоном содержание антител к р24 возросло в 8 и 3,8 раз у пациентов №6 и №4, соответственно. У пациентов №6 и №7 после лечения Гепоном в 5 и 2,45 раза, соответственно, увеличилось содержание антител к р17. Уровень антител к др41 возрос в 2,7 раза у пациента №6, а уровень антител к др 120 - в 2,16 раза у пациента №2. Приведенные данные свидетельствуют об иммуномодулирующем влиянии Гепона у пациентов, инфицированных ВИЧ. Это хорошо согласуется с описанным ранее усилением продукции антител у экспериментальных животных, иммунизированных чужеродным антигеном в сочетании с оральным или парентеральным введением Гепона (Атауллаханов с соавт., 2002). В случае лечения Гепоном ВИЧ-инфицированных пациентов получен аналогичный эффект усиления продукции антител.

Изучение динамики основных субпопуляций лимфоидных клеток КРОВИ. Курсовое лечение Гепоном способствовало постепенному увеличению содержания CD4+ Т-клеток в крови ВИЧ-инфицированных пациентов. В процессе и после 4-недельного лечения Гепоном явно проявлялась тенденция к нарастанию содержания CD4+ Т-клеток, но прирост был небольшим и статистически недостоверным. Напротив, в фуппе пациентов, получавших Гепон в течение 12 недель, среднее значение содержания CD4+ Т-клеток достоверно возросло в процессе лечения до 113% от исходного уровня (р-0,039) (Табл. 8). По-видимому, для заметного восстановления истощенной субпопуляции Т-клеток необходимо время порядка 3 или более месяцев.

Таблица 8. Относительные изменения основных субпопуляций лимфоцитов у ВИЧ-инфицированныхпациентовпри терапии Гзпоном

| | Первая группа, курс Гепона 4 недели

1 ! Во время терапии | После терапии

{Показатель ¡Меал (во !Р ¡Меап |Й) !Р

[СйЗ, % ¡104% ¡3% 10,002* ¡102% ¡4% ¡0,157

|СОЗ, клЛакп (109% ¡22% ¡0,239 ¡97% 126% ¡0,777

]СГМ.% |104% |12% ¡0,294 ¡105% |10% |0,120

¡С04, кл./мкл • |108% ¡18% ¡0,206 ¡101% |30% ¡0,882

|С08, % |10Э% ¡7% ¡0,240 ¡99% ¡7% ¡0,641

!СЭ8, кл./мкл ¡108% ¡25% ¡0,356 ¡94% |27% : 0,539

¡С04/С08 [103% |17% 10,628 |108% [14% ,0.122

¡В-кпетки, % ¡106% ¡29% ¡0,556 ¡127% |54% ¡0,155

|'В-клетки, кл/мкл ¡108% ¡26% ¡0,357 ¡117% |44% ¡0,275

¡ПК-клетки, % ¡95% ¡36% 10,653 |86% ¡33% ¡0.217

¡ЫК-кл, кл/мкл 1101% ¡47% ¡0,973 ¡84% ¡46% ¡0,324

Вторая группа, курс Гепона 12 недель

I Во время терапии | После терапии

|Показатель ¡Меап (БО 1Р ¡Меап ¡во 1Р

|соз, % ¡96% ¡8% |0,113 ¡93% [10% ¡0,058

|С03, клУмкл ¡88% ¡16% 10,039* ¡83% |16% ¡0,005*

¡С04,% ¡113% ¡17% ¡0,039* ¡113% ¡27% ¡0,174

[СЕМ, кл /мкл 1104% ¡20% ¡0,560 ¡103% |32% ¡0,811

|Сй8, % ¡96% ¡7% ¡0,109 ¡90% ¡10% ¡0,007*

|СР8, кл./мкл ¡89% ¡17% ¡0,065 ¡80% ¡16% ¡0,002*

|ССМ/С08 ¡120% ¡21% ¡0,010* ¡126% [21% ¡0,003*

¡В-кпетки, % ¡103% ¡25% ¡0,752 ¡95% ¡35% ¡0,665

¡В-клетки, кп/мкп ¡98% ¡27% ¡0.813 ¡88% ¡34% ¡0,303

| ЫК-клетки, % ¡103% ¡31% ¡0,743 ¡94% ¡26% ¡0,461

1Щ-кп, кл7мкл ¡117% ¡42% ¡0.246 ¡106% ¡41% ! 0,672

Примечание 1. Данные для каждого пациента выражены в процентах от значений до начала лечения. 2. Приведены средние значения и стандартные отклонения по группе. 3. Значком(*) отмечены достоверные отличия ср<0,05

В цепом, по результатам проведенного исследования можно заключить, что применение Гепона в течение 4-12 недель приводит к положительным изменениям показателей иммунограммы у больных ВИЧ-инфекцией. Среди наиболее значимых следует отметить: умеренное нарастание количества CD4+ Т- клеток, значительное снижение числа CD8+ Т-клеток, значительное нарастание иммунорегуляторного коэффициента. Эти положительные изменения иммунограммы проявляются не сразу, а через 1 месяц после окончания 4-12-недельного курса терапии Гепоном Вероятно, в процессе и после терапии Гепоном в состоянии иммунной системы пациентов наступают позитивные изменения, которые и приводят к положительной динамике популяций лимфоидных клеток в отдаленный период

Влияние на продукцию антител Изучалась оптимальная концентрация Гепона, при которой он оказывал иммуноадьювантное действие Исследовалась первичная продукция ^-антител к корпускулярному антигену, вторичная продукция гемолизиов и гемагглютининов, вторичная продукция ^-антител к водорастворимому белковому антигену. Получены следующие данные.

1. Введение Гепона лабораторным мышам способствует повышению интенсивности иммунных реакций, индуцированных корпускулярным (ЭБ) и растворимым (НА) гетерологичными сТ-зависимыми» антигенами.

2.Гепон усиливает антителообразование при инъекционном применении (дозы 0,01-1 мкг) в смеси с антигеном, при предварительной инъекции (дозы 0,01-10 мкг) за 60 минут до введения антигена, и при продолжительном курсовом оральном (доза 0,5 мг) применении перед иммунизацией антигеном

3. Инъекционное введение Гепона при первичной иммунизации корпускулярным антигеном приводило к накоплению в селезенке мышей в среднем в 2,5 раза большего числа АОК, секретирующих IgM- антитела, специфичные к использованному антигену.

4. Ежедневный прием Гепона per os в течение 20 дней до проведения двукратной иммунизации приводил к накоплению в сыворотке крови мышей в 2 раза большей концентрации агглютининов и в 3 раза большей концентрации гемолизинов, специфических к использованному антигену (ЭБ).

5. Инъекционное введение Гепона в смеси с водорастворимым белковым антигеном приводило к накоплению в крови мышей в 2-7 раз большей концентрации специфических к антигену lgG-антител в ходе вторичной иммунной реакции.

Изучение зависимости иммуноадьювантного действия Гепона от его пептидной СТРУКТУРЫ. Проводился поиск оптимальной длины полипептидной цепи Гепона, которая обладает всеми свойствами полной молекулы Гепона. Для этого исследовались пептиды различной длины, иммуноадьювантные свойства N- и С-концевых фрагментов, а также центральной части Гепона.

Иммуноадъювантные свойства центральной части молекулы Гепона. Центральная часть молекулы Гепона была представлена двумя пептидами. Пептид НРЗ-12 соответствовал структуре Гепона, укороченной на 2 аминокислотных остатка с N-конца и 2 аминокислотных остатка с С-конца. Пептид НР4-11 соответствовал структуре Гепона, укороченной на 3 аминокислотных остатка с N-конца и 3 аминокислотных остатка с С-конца. Введение НРЗ-12 за 60 мин до иммунизации ЭБ приводило к усилению продукции АОК в 2,76 раза, а введение НР4-11 - в 1,67 раза.

Иммуноадъювантные свойства N-концевых пептидов Гепона. В модели иммунной реакции на антигены ЭБ пептиды НР1-5, НР1-9 и НР1-11, имитирующие N-конец Гепона, усиливали первичную продукцию lgM-секретирующих АОК в 2,01, 1,77 и 1,63 раза, соответственно. В модели вторичной иммунной реакции на ЯА титры lgG-антител под влиянием НР1 -5, НР1 -9 и НР1 -11 повышались в 5,7,1,8 и 1,6 раза, соответственно. То есть короткая (5 аминокислотных остатков) копия N-конца Гепона оказалась вполне сравнимой по иммуноадъювантной активности с целой молекулой Гепона. Более длинные (9 и 11 аминокислотных остатков) копии N-конца Гепона тоже обладали иммуноадъювантной активностью, хотя и уступали Гепону.

Иммуноадъювантная активность С-концевых пептидов Гепона. В модели первичной иммунной реакции на антигены ЭБ гомологи С-конца Гепона НР10-14, НР6-14 и НР4-14 усиливали продукцию lgM-секретирующих АОК в 3,25, 2,6 и 2,65 раза, соответственно. Следовательно, пептидные копии С-концевой структуры Гелона обладают иммуноадъювантной активностью. Как и в случае с N-концевыми пептидами, короткий (5 аминокислот) гомолог С-концевой части Гепона НР10-14 оказался наиболее активным из исследованных С-концевых пептидов. Иммуноадъювантная

активность НР10-14 была сравнима с активностью Гепона и заметно превышала активность более длинных С-концевых фрагментов Гепона НР6-14 и НР4-14. В целом, полученные данные свидетельствуют об особом значении N и С-концевых аминокислотных остатков для иммуномодулирующей активности Гепона. Укорочение тетрадекапептидной структуры Гепона более, чем на 2 аминокислотных остатка с N и С-концов приводит к существенному ослаблению его иммуноадъювантных свойств.

Изучение транскрипции генов цитокинов в перевиваемых клетках человека. В клетках J-96, инкубированных в течение 24 часов в присутствии Гепока, дополнительно включался синтез а продукция и

^-4 прекращалась. Следовательно, Гепон оказывал регуляторное влияние на экспрессию генов цитокинов в клетках J-96. В ответ на инфекцию ВЭМК в клетках J-96 начиналась транскрипция Напротив, синтез

и ТЫЯ-а останавливался. Т р а н см1?Н£ 1к-2п11^,и11-^,о1--с2ти41-в8а л а с ь без изменения. То есть в инфицированных ВЭМК клетках происходило значительное изменение программы синтеза мРНК цитокинов. Это изменение совпадало с неспособностью клеток противостоять вирусной инфекции. В случае изменения программы синтеза цитокинов под влиянием Гепона можно предполагать, что защита клеток J-96 от ВЭМК происходит в результате аутокринного или паракринного влияния цитокинов.

Противовирусное действие гомологов центральной части молекулы Гепона. Пептиды НРЗ-12 и НР4-11 представляли центральную часть молекулы Гепона. Оба пептида эффективно подавляли инфекцию ВЭМК в культурах клеток J-96 и Ь-41. Минимальная эффективная противовирусная концентрация пептида НРЗ-12 оказалась равной 3,3±0,8 мкг/мл как в культуре клеток J-96, так и в культуре клеток L-41. Пептид НР4-11 оказывал эффективное противовирусное действие в культурах клеток J-96 и L-41 в концентрациях 1,1 ±0,7 мкг/мл и 1,5±0,6 мкг/мл, соответственно. Т.е. укорочение молекулы Гепона на 2 или 3 аминокислотных остатка с обоих концов полипептидной цепи не нарушало его противовирусных свойств.

Противовирусная активность гомологов ^концевой части молекулы Гепона. В модели инфекции ВЭМК в культуре клеток J-96 пептиды НР1-5, НР1-9 и НР1-11, копирующие вконец Гепона, обладали высокой противовирусной активностью. Минимальные эффективные концентрации пептидов НР1 -5, НР1 -9 и НР1-11 составили 1±0,2 мкг/мл, 15±5 мкг/мл и 1,3±0,6 мкг/мл, соответственно. Следовательно, исследованные ^концевые пептиды не уступали Гепону по противовирусной активности. Даже НР1-5, довольно короткий фрагмент ^концевой части Гепона, в полной мере проявлял противовирусную активность.

Противовирусная активность гомологов С-кониевой части Гепона. В модели противовирусного действия в культурах клеток J-96 и Ь-41 гомологи С-концевой части

молекулы Гепона НР10-14, НР6-14 и НР4-14 эффективно защищали клетки человека от цитопатогенного действия ВЭМК.В культуре клеток J-96 минимальные эффективные концентрации НР10-14, НР6-14 и НР4-14 составили 1 ±0,2 мкг/мл, 2,1±0,4 мкг/мл и 2,9±1,1 мкг/мл, -соответственно. В культуре клеток L-41 те же пептиды оказывали противовирусное действие при концентрациях не меньше 5 мкг/мл, 2,11:1,5 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно.

4. Разработка тест-системы для диагностики туберкулеза на основе антигенов М. tuberculosis

В настоящей работе разработаны методики продукции, выделения и очистки рекомбинантных белков, CFP10 и ESAT6, - антигенов М. tuberculosis, для использования их в качестве ранней диагностики туберкулезной инфекции.

Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК (pTBD16), кодирующая синтез гибридного белка CFP10 - ESAT6 из М. tuberculosis, состоящая из фрагмента ДНК векторной ппазмиды pQE3O, содержащей репликон ColE, гена ß-лакгамазы определяющей устойчивость к ампициллину, lac промотора, и фрагмента ДНК, кодирующего синтез белков CFP-10 и ESAT6, начинающегося с инициирующего кодона АТС, последовательности из шести гистидиновых остатков, фланкированного сайтами для рестриктаз ВзтН1 и Крп1, содержащий между генами CFP-10 и ESAT-6 последовательность нуклеотидов, кодирующую сайт гидролиза энтерокиназой.

Метод получения гибридного белка CFP10 - ESAT6 состоит в культивировании штамма DLT1270 E.coli, имеющего 1ас1 ген в хромосоме, трансформированного рекомбинантной плазмидной ДНК (pTBD16), кодирующей гибридный белок CFP10 -ESAT6, разрушения культивируемых клеток в буферном растворе ультразвуком, последующего выделения гибридного белка из очищенных телец включения и промывок телец включения методом лигакдообменной хроматографии.

Тестирование диагностического реагента на основе белков ESAT-6 и CFP-10 для определения гиперчувствительности замедленного типа к М. tuberculosis. Диагностика туберкулезной инфекции на основе предлагаемого метода состоит в индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа и заключается в подкожном введении пациенту водного раствора гибридного белка CFP10 - ESAT6 из М. tuberculosis в эффективной дозе, после чего (по истечении 12-48 часов) оценку туберкулезного процесса осуществляют визуально: диаметр эритемы в 10-15мм говорит о положительном результате. В качестве модели использовали морских свинок, которых внутрикожно сенсибилизировали живыми М. bovis BCG, M. avium и М. tuberculosis H37RA в количестве 107 микробных клеток в 0,2 мл фосфатного буфера (PBS) рН 7,2.

На шестой неделе после сенсибилизации в выбритый участок кожи экспериментальным животным вводили внутрикожно по 2 мкг антигенов в 0,1 PBS и по 10 ед

туберкулина, полученного из штаммов М. bovis BCG, M. avium и М. tuberculosis. Через 24 часа оценивали диаметр эритемы, образовавшийся в месте инъекции (Табл. 9).

Таблица 9. Оценка гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок с помощью кожного теста с реагентом, содержащим рекомбинантные белки ESAT-6 и CFP-10 M. tuberculosis.

Антиген Диаметр кожной реакции у морских свинок, иммунизированных

М. bovis |М. avium М. tuberculosis

Туберкулин (очищенный дериват белка М. Tuberculosis) 8,9 ±1,3 ¡8,0 ±1,4 I 12,9 ±1,2

Туберкулин (очищенный дериват белка M.bovis) 12,1 ± 1,3 9.5 ±1,5 9.8 ±1,5

Туберкулин (очищенный дериват белка M.avium 8,8 ±1,5 12,6 ±1,4 9.2 ±1.3

Hsp70 6,5 ±1,3 7.2 ±1,4 10,1 ±1.4

ESAT-6+ CFP-10 0,5 ±1,0 0,6 ±1,0 11,2 ±1,3

Как следует из приведенных результатов, диагностический реагент для кожной пробы на основе двух белков ESAT-6 и CFP-10 позволяет достоверно дифференцировать гиперчувствительность замедленного типа, обусловленную инфицированием М. tuberculosis, от реакций, связанных с вакцинальным иммунитетом (BCG) и инфекцией М. avium.

выводы

1. Разработаны принципы нового направления в медицинской биотехнологии, суть которого - моделирование направленной реактивности иммунного ответа (МНРИО), реализуемого с помощью веществ различного происхождения. МНРИО создает основу для комплексной терапии заболеваний иммунной системы на уровне управления различных функциональных систем клетки, что создает предпосылки для направленной регуляции клеточных ответов, таких как стимуляция, ингибирование, активация пролиферации, индукция либо блокирование апоптоза.

2. Установлена структура основного компонента изучаемых антибиотических комплексов культур Streptomyces sp.№182 и №162. Показано, что они являются природными антибиотиками и принадлежат к олигомицинам А, В, С, а также к олигомицину SCII.

3. Цитотоксическая активность конъюгатов антибиотиков и ТХДД с AFP и EGF более чем в 4 раза превышает активность свободных антибиотиков в отношении роста опухолей, а также вызывает эффективное (более 90%) торможение роста опухолевых клеток-мишеней, что достигается селективностью действия данных препаратов. Данные препараты представляют

30

новый класс биотехнологических соединений с эффективной противоопухолевой активностью.

4. Разработана биотехнологическая концепция получения нового класса иммунотоксинов - рецептор-специфических экранированных токсинов (респекринов), обладающих избирательной токсичностью в отношении специфических клеток. Разэкранирование и избирательная активность респекрина наблюдается при взаимодействии с клеткой-мишенью, несущей на своей поверхности специфический для данного респекрина рецептор.

5. ИРП обладает способностью повышать цитотоксическую активность лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов периферической крови человека в отношении опухолевых клеток-мишеней in vitro и спленоцитов мышей при его введении in vivo, снижает частоту образования опухолей, увеличивает среднюю продолжительность жизни животных-опухоленосителей при его использовании в высоких дозах, ингибирует рост опухолей и оказывает профилактический противоопухолевый эффект.

6. Гепон значительно повышает эффективность иммунного контроля оппортунистических инфекций, стимулирует усиление продукции антител к конкретному инфекционному агенту, достоверно повышает иммунорегуляторный коэффициент и является сильным иммуноадъювантом.

7. Диагностический реагент для кожной пробы на основе рекомбинантных белков - антигенов М. tuberculosis ESAT-6 и CFP-10 позволяет достоверно дифференцировать гиперчувствительность замедленного типа, обусловленную инфицированием М. tuberculosis, от реакций, связанных с вакцинальным иммунитетом от BCG и инфекцией М. avium.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Атауллаханов Р. И., Катлинский А. В., Холмс Р. Д., Мастернак Т. Б., Ларин А. С, Малкина Е. Ю., Шишкова Н. М. Усиление образования антител под влиянием иммуномодулятора «Гепона» // Иммунология. -2003. -№1. -С.9-12.

2. Атауллаханов Р. И., Холмс Р. Д., Катлинский А. В., Дерябин П. Г., Наровлянский А. Н., Мезенцева М. В., Ершов Ф. И. Иммуномодулятор "Гепон" подавляет репликацию вируса гепатита С в культуре клеток человека in vitro //Антибиотики и химиотерапия. - 2002. -Т.40. -№.8.

3. Атауллаханов Р.И., Холмс Р.Д., Катлинский А.В., Пичугин А.В., Папуашвили М.Н., Шишкова Н.М.. Лечение иммуномодулятором «Гепон» повышает эффективность иммунного контроля оппортунистических инфекций у больных ВИЧ-инфекцией // Аллергия, астма и клиническая иммунология. -2002. -№.10. -С.3-11.

4. Атауллаханов Р.И., Холмс Р.Д., Наровлянский А.Н., Катлинский А.В., Мезенцева М.В., Щербенко В.Э., Фарфаровский B.C., Ершов Ф.И. Изменение транскрипции генов цитокинов в перевиваемых клетках человека под влиянием иммуномодулятора «Гепон» // Аллергия, астма и клиническая иммунология. -2002. -№.9. С.17-23.

5. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Кабанов А.Е., Сазыкин Ю.О., Катлинский А.В. Механизм биологической активности макролидных антибиотиков -ингибиторов F0F1 - АТФазы //Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - № 12. С.ЗЗ-39.

6. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Кабанов А.Е., Орехов С.Н., Катлинский А.В. Макролидные антибиотики - ингибиторы F^-АТФазы: продуценты, структура, биологическая активность // Тезисы доклада II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». -Москва. -2003. -С.85.

7. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Спиридонова И А, Кабанов А.Е., Катлинский А.В. БСК-14-антибиотик с антигрибной и иммуносупрессивной активностью // Тезисы 1-го Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. -2002, с.37

8. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Спиридонова И.А., Кабанов А.Е., Даниленко А.Н., Катлинский А.В. Антигрибные и иммуносупрессивные свойства антибиотика БСК-17. // Материалы 2-го Всероссийского конгресса по медицинской микологии «Успехи медицинской микологии», -Москва. -2004, т.З, с.46-48.

9. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Чмель Я.В., Катлинский А.В. К вопросу о специфике антигрибного действия антибиотика БСК-14 // Материалы 1 Всероссийского конгресса «Успехи медицинской микологии», - Москыва. -2003, т. 1, гл.6,с. 233.

Ю.Бибикова М.В., Кабанов А.Е., Иванов В.П., Сазыкин Ю.О., Катлинский А.В. Новые иммуносупрессоры микробного происхождения // Тезисы 1-го Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. -2002, с.37.

11. Бибикова М.В., Спиридонова И А, Грамматикова Н.Э., Катлинский А.В. Новый природный иммуносупрессор ВСК-14, обладающий антидерматофитным действием // IV съезд иммунологов и аллергологов СНГ. - Москва. - 2001.

12. Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Спиридонова И А, Катлинский А.В. Новый антидерматофитный препарат микробного происхождения // Тезисы международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий». - Саранск. - 2001, с. 176.

13. Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Спиридонова И.А., Кабанов А.Е., Катлинский А.В. Новый продуцент антибиотиков олигомициновой структуры Streptomyces griseolus № 182 // Антибиотики и химиотерапия. -2003. -Т. 48. -№ б. -С.11-15.

14. Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Спиридонова И.А., Кабанов А.В., Катлинский А.В., Изучение условий биосинтеза антибиотика БСК-14 // Тезисы 1-го Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». -Москва. -2002.С.223.

15. Дмитриев ГА, Грамматикова Н.Э., Бибикова MB., НаволоцкаяТ.И., Катлинский А.В. Изучение воздействия in vitro препарата БСК-14 на дрожжеподобные грибы, обнаруживаемые в перхоти // Тезисы доклада. Первый съезд микологов России. - Москва. -2002, с.226.

16. Дмитриев ГА, Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Наволоцкая Т.И., Катлинский А.В. Микробиологические исследования действия нового антидерматофитного препарата микробного происхождения // Вестник дерматологии и венерологии. -2002. - №2. -С.7-9.

17. Дмитриев ГА, Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Наволоцкая Т.И., Катлинский А.В. Первые результаты исследования нового антидерматофитного препарата микробного происхождения на культуре Malassezia (Pityrosporum) // Тезисы IV съезда дерматологов и венерологов Республики Беларусь. -Гомель. -2001, с.219

18. Кабанов А.Е., Даниленко А.Н., Спиридонова ИА, Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Орехов С.Н., Катлинский АВ. Определение структуры основного компонента антибиотического комплекса, образуемого Sfrepfomyces griseutos 182//Антибиотики и химиотерапия. -2003. -Т. 48. -№ 10. -С.16-20.

19. Катлинский А. В., Атауллаханов Р. И., Холмс Р. Д., Пичугин А. В., Мастернак Т. Б., Малкина Е. Ю., Шишкова Н. М. Иммуноадъювантное действие структурных гомологов иммуномодулятора Гепона // Иммунология. -2003. -№1. -С.12-15.

20. Катлинский А. В., Родина А. В., Фельдман Н. Б., Москалева Е. Ю., Пена Фриас, Зыкова И. Е., Северин С. Е. Изучение иммуномодулирующэй и противоопухолевой активности растительного препарата in vitro и in vivo // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2003. -№ 4. -С. 32-39.

21. Катлинский А.В. Биотехнология и гуманизм // Тезисы доклада II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. - 2003. -С.284.

22. Катлинский АВ. Лекарственные препараты направленного действия: история создания и механизмы действия // М., «ДимитрейдГеафикГрупп». -2003.228с.

23. Катлинский А.В., Атауллаханов Р.И., Холмс Р.Д., Наровлянский А.Н., Мезенцева М.В., Щербенко В.Э., Ершов Ф.И. «Гепон» и его структурные гомологи оказывают противовирусное действие в культуре клеток человека, инфицированных вирусом энцефаломиокардита. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. -2002. -№.9. -С.23-26

24. Катлинский А.В., Атауллаханов Р.И., Холмс РД., Пичугин А.В., Мастернак Т.Б., Малкина Е.Ю., Шишкова Н.М. Иммуноадъювантное действие структурных гомологов иммуномодулятора «Гепон» // Тезисы доклада. 5-й Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - Москва. -2002.

25. Катлинский А.В., Бахус ПО., Ильинская А.Н. Влияние препарата ВСК-14 на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови человека // Тезисы доклада. 5-й Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - Москва. -2002.

26. Катлинский А.В., Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э. Сазыкин Ю.О. Иммуносупрессоры микробного происхождения // Антибиотики и химиотерапия. -2003. -Т.48. - № 5. -С.25-32.

27. Катлинский А.В., Климова СВ., Пичугина Л.В. Влияние препарата ВСК-14 на продукцию интерферона-гамма мононуклеарами периферической крови человека // Тезисы доклада. 5-й Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». -Москва. -2002.

28. Катлинский А.В., Сазыкин Ю.О., Бибикова М.В., Орехов С.Н. Антифунгальные агенты. Новые предпосылки их создания и новые трудности // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. -Т.48. -№ 9. -С.20-27.

29. Катлинский А. В., Сазыкин Ю.О., Бибикова М.В., Орехов С.Н. Биотехнологические основы создания антифунгальных препаратов // Тезисы доклада II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - 2003. -С.86.

30. Катлинский А.В., Северин ЕС, Пальцев МА Роль фармации в развитии молекулярной медицины // Вестник НИИ молекулярной медицины. -2003. -№ 3. -С.5-10.

31. Катлинский А.В., Харченко Т.Ю., Ярилин А.А. Исследование иммуномодулирующего действия препарата ВСК-14 в опытах in vivo II Тезисы доклада. 5-й Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - Москва. -2002.

32. Катлинский А.В., Бибикова М.В., Грамматика Н.Э., Тертое В.В., Пинегин Б.В., Чмель Я.В. Отбор природных иммуносупрессоров по способности к

модификации синтеза стеролов клетками гепатоцитов // Антибиотики и химиотерапия. -2003. -Т. 48. -№ 8. -С.3-6.

33. Киселев В. И., Ляшенко А. А., Катлинский А. В., Северин Е. С. Структура, функции,- биологическая активность белка теплового шока HSP70 // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2003. -№4. -С.3-11.

34. Луценко С. В., Заболотнев Д. В., Фельдман Н. Б., Северин С. Е., Катлинский А.

B., Северин Е. С, Пальцев М. А. Новые подходы к противоопухолевой терапии: применение препаратов направленного действия и антиангиогенных агентов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2003. -№2. -С. 19-24.

35. Москалева Е.Ю., Сладкова Л.В., Обухова В.В., Белушкина Н.Н., Посыпанова ГА, Харнас С.С., Самохвалов В.Т., Северин Е.С., Катлинский А.В., Пальцев МА Регуляция чувствительности опухолевых клеток с помощью ангисмысловых олигонуклеотидов к гену bd-2. // Молекулярная медицина. -2003.-№1 .-6.45-52.

36. Петров Р.В., Хаитов P.M., Катлинский А.В., Москалева Е.Ю., Северин Е.С., Сотниченко А. И., Северин СЕ. Направленный транспорт противоопухолевых и антибактериальных препаратов // Аллергология и иммунология. -2003. -Т.4. -

C.91-96.

37. Сазыкин Ю.О., Бибикова М.В., Иванов В.П., Кабанов А.Е., Катлинский А.В. Технология скрининга вторичных микробных метаболитов: к эволюции методологии // Антибиотики и химиотерапия. - 2002. - № 10. - Стр. 25-31.

38. Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И., Швец А.В., Катлинский А.В. Инновации в биотехнологии и ее обновление как учебной дисциплины // Тезисы доклада II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». -Москва. -2003. -С.282.

39. Холмс РД, Катлинский А.В., Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Мастернак Т.Б., Малкина Е.Ю., Шишкова Н.М. Иммуноадъювантные свойства синтетических пептидов шарнирной области эзрина //Аллергия, астма и клиническая иммунология. -2002. -№.9. -С. 13-17.

40. Катлинский А.В., Киселев В.И., Пальцев МА, Перельман М.И., Северин Е.С. Способ диагностики туберкулезной инфекции, рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез гибридного белка CFP10-ESAT6 M.Tuberculosis, и способ получения // Заявка на патент № 2003123134 от 29 июля 2003 г.

Список сокращений, используемых в автореферате

AFP - альфа-фетопротеин

BCG - Bacillus Calmette Guenn

CFP-10 - белок RD-региона М tuberculosis

EGF - эпидермальный фактор роста

EGF-DR - конъюгат эпидермального фактора роста с доксорубицином

ESAT-6 - белок RD-региона М tuberculosis

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ИРП - иммуномодулятор растительного происхождения

МНРИО - моделирование направленной реактивности иммунных ответов

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция полимеразной цепной реакции

ТХДД - 2,3,7,8-тетрахлордибензо-Р-диоксин

ТРО - торможение роста опухолей

УСПЖ - увеличение средней продолжительности жизни

ЦТА - цитотоксическая активность

Принято к исполнению 16/04/2004 Исполнено 17/04/2004

Заказ № 136 Тираж: 150 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

- Я 1 2 б

Иммунная система является уникальным регуляторным органом, контролирующим организм как в норме, так и при различных патологических состояниях. Суть выздоровления, в общем случае, - это стремление организма как единой системы к некоему состоянию равновесия, дестабилизируемого болезнью. Баланс клеточного и гуморального иммунных ответов является определяющим в этом равновесии. Смещение активности в пользу одного из них вызывает необходимость внешней коррекции, выражающейся в специфическом моделировании активностей иммунной системы, прогнозирования иммунных ответов и управления ими. Подобные манипуляции возможны с развитием современных средств медицинской науки, которая располагает большим арсеналом средств для разработки новых препаратов направленной реактивности.

Моделирование иммунных ответов достигается многими средствами, часть из которых представлена готовыми фармакологическими формами, тогда как другая пока находится в стадиях различной степени изучения. Иммунный дисбаланс должен регулироваться направленно, и это достигается различными по своему происхождению веществами. Интенсивный поиск ведется среди антибиотиков с новыми активностями, традиционно - среди препаратов растительного происхождения, и, с учетом состояния развития мировой молекулярной медицины, наметилась четкая

• тенденция к разработке биоинженерных средств с иммунобиологическими и иммуномодулирующими свойствами. Поэтому, если рассматривать иммунную систему в частности, и организм в целом, как объекты моделирования биологических ответов, можно увидеть, что имеет место некая система, которую уместно охарактеризовать как моделирование направленной реактивности иммунных ответов (МНРИО).

Огромной проблемой всегда были и остаются лечение и профилактика опухолевых, аутоиммунных, инфекционных патологий. Большое количество различных препаратов, существующих на рынке, говорит только о том, что до сих пор не существует сколь-нибудь однозначного подхода для терапии вышеуказанных заболеваний. Кроме того, большинство из них обладает нежелательными побочными эффектами, коррекция которых выливается порой в дополнительную проблему. С одной стороны, причиной этому является отсутствие селективности действия используемых лекарственных средств, а с другой, как это ни парадоксально, - отсутствие грамотного выбора среди множества аналогичных средств. Все это диктует необходимость в разработке препаратов нового поколения, метаболизм которых в организме может быть однозначно предсказуем, которые могут быть управляемы и которые должны иметь минимум побочных эффектов или, в идеале, не иметь их вовсе. Организм млекопитающих представляет собой сложную многоклеточную систему, и нарушение его гомеостаза влечет необратимые нарушения органов и систем. Интеллектуальные «возможности» новых иммуномодулирующих препаратов, селективно «узнающих» свои мишени in vivo среди множества других, являются фактором неоспоримого качества и важным показателем их надежности. Строго говоря, речь идет о работающей in vivo системе МНРИО. Данный подход может быть положен в основу комплексной терапии заболеваний не только самой иммунной системы, но и всех остальных патологий, возникших на фоне иммунного дисбаланса.

Развитие современной медицины немыслимо без участия и совместного «сотрудничества» многих смежных дисциплин. Для разработки надежных диагностических тест-систем, направленного транспорта лекарств, вакцин нового поколения необходимо использовать наукоемкие технологии с учетом современных достижений медицины. Разработка новых лекарственных препаратов подразумевает знания о молекулярной основе заболевания для управления меж- и внутриклеточными сигнальными процессами на уровне клеток, вовлеченных в патологический процесс. Более полное понимание специфики функционирования вне- и внутриклеточных медиаторов стало доступным в последние годы, поэтому анализ и применение огромной базы накопленных знаний породили развитие принципиально новых подходов в создании биологически активных соединений. Изучение многообразия типов клеток, особенностей организации сигнальных каскадов, белок-белковых (лиганд-рецепторных) взаимодействий, способов активации и проведения сигналов внутри клеток-мишеней являются, таким образом, составляющими системы управления клеточными ответами, что является важнейшим достижением современной молекулярной биологии, биохимии, медицины.

Исследование биологических активностей различных факторов на клетку позволило по-новому взглянуть на способы лечения многих болезней человека, которые обычным, традиционным способом излечиваются не полностью, либо относятся к неизлечимым. По сути, современная молекулярная медицина призвана решать эти задачи. Это одна из «ветвей» медицинской науки, которую можно назвать как самой молодой, так и самой древней.

Моделирование направленной реактивности иммунного ответа (МНРИО) может быть реализовано с помощью веществ, созданных как природой, так и с помощью возможностей современных биотехнологических направлений. МНРИО создает основу для комплексной терапии заболеваний иммунной системы на уровне управления различных систем клетки, в том числе рецепторных (мембранных, ядерных), цитоплазматических, других органных систем.

Новый класс антибиотиков, относимых к олигомицинам, а также препараты на основе растительного сырья (ИРП) являются вновь открытыми природными объектами, на базе которых возможно создание новых биологически активных лекарственных средств, обладающих иммуносупрессивными, антифунгальными антибиотики), иммуностимулирующими, противоопухолевыми (ИРП) свойствами.

Разработанные конъюгаты на основе AFP, EGF в комплексе с цитостатиками, а также иммунотоксины нового поколения, респекрины, обеспечивают направленный транспорт лекарственного вещества в клетку, обладают низкой токсичностью и высокой избирательностью и могут служить основой для лечения опухолей любого генеза, на которых имеются возможности рецепторного узнавания вышеуказанными лигандами. Эти вещества являются примером возможностей биотехнологического разнообразия приемов и методов, использование которых позволяет добиться получения субстанций с заданными свойствами.

Иммуномодулятор Гепон является эффективным препаратом, имеющим позитивные результаты в клинике при лечении больных с инфекционными патологиями, в том числе с оппортунистическими инфекциями.

Все вышеуказанные препараты являются представителями новых классов иммунобиологических лекарственных средств, перспективных для клинического использования в комплексной терапии заболеваний, связанных с иммунным дисбалансом организма, в том числе в терапии опухолей.

Диагностикум на туберкулез, выполненный на основе белков RD-региона М.tuberculosis ESAT-6 и CFP-10 и представляющий собой классический пример биотехнологической наработки рекомбинантных белков через создание штамма-продуцента, является примером практического применения МНРИО и позволяет с высокой достоверностью отличать инфицирование вышеуказанным патогеном от любого другого микобактериального заражения.

Целью настоящей диссертационной работы явилось исследование механизмов направленной реактивности иммунного ответа с помощью веществ различного происхождения, регуляции клеточного и гуморального типов иммунитета, а также подбор адекватных критериев использования МРНИО в практической медицине и медицинской биотехенологии.

Довольно быстрый прогресс в исследовании молекулярного взаимодействия клеточных медиаторов и их рецепторов наметился в последние 10-15 лет. Современные технологии по клонированию рекомбинантных ДНК позволили детально проанализировать многие аспекты белок-белковых взаимодействий с участием цитокинов, клеточных антигенов, факторов роста, установить особенности экспрессии данных белков, а также . получить возможность беотехнологической наработки чистых белков для использования их как объектов для молекулярной коррекции нарушенных клеточных функций при той или иной патологии.

Раздел фармации, изучающей изготовление фармакологических средств, в настоящее время имеет целью достижение оптимальности использования тех лекарственных форм, которые приводят к решению задач современной молекулярной медицины, обеспечивая быструю и точную доставку действующего агента к его мишени. Это направление часто объединяется исследователями в единую проблему создания системы доставки лекарственных препаратов (drug delivery systems, DDS). Для каждого препарата разрабатывается, как правило, своя одна или несколько систем. В их названиях нет единообразия. Одни DDS называются по пути доставки (пероральная, трансдермальная и др.), другие - по способу доставки, напр. липосомальные. Часть названий представляют собой комбинацию первого и второго подхода. В любом случае имеется в виду узкоспециализированная система транспорта конкретного БАС. Для оценки перспективности подобных разработок необходимо последовательное рассмотрение преимуществ отдельных способов и путей доставки БАС в различных комбинациях с учетом физико-химических свойств конкретного вещества.

Таким образом, в настоящее время в развитых странах ведется активное изучение путей и способов направленной доставки биологически активных соединений (БАС). В процессе создания современных систем доставки препаратов объединяются ученые различных специальностей.

При разработке фармакологических средств нового поколения, соответствующих уровню развития цивилизации XXI века, в совокупности решается ряд вопросов:

-проникновение через различные барьеры с изучением и использованием как механизмов активного транспорта молекул, так и диффузии;

-повышение результативности действия фармакологических препаратов;

-достижение стабильности его положительного результата; -снижение до минимума побочного или токсического действия; -экономичность и снижение стоимости лечения при сохранении его эффективности.

В зависимости от степени изученности механизмов заболевания, можно определить, на каком уровне происходит реакция взаимодействия. Медицина, использующая в своих целях знания и технологии, относящиеся к геному человека, получила название генной медицины. При этом мишенью терапевтического воздействия становится хромосома, ее участок, ген или какая-то его часть или одна молекула. Все многообразие представителей разных рас человечества, бесчисленные комбинации фенотипических признаков, в том числе молекулярные основы многих заболеваний, обуславливаются геномом человека. Вместе с тем, сохранение видового постоянства, стабильность организации работы систем жизнеобеспечения и их согласованность также обеспечивается геномом.

Процессы транскрипции, процессинга и трансляции сопровождаются рядом ферментативных реакций, изменения в которых могут быть критическими для организма. Использование знаний, полученных в процессе реализации проекта «Геном человека», развитие биотехнологии и компьютерных систем позволяет создавать новые лекарственные препараты на их основе. Для воздействия на геном могут быть использованы как дополнение гена, так и супрессия гена.

При помощи методов генной инженерии возможно создание препаратов, действующих на уровне РНК и ДНК, при этом они могут обладать малыми размерами и поэтому способны легко проникать через клеточные мембраны. Для успешной реализации задачи помимо правильно выбранного действующего начала важен оптимальный путь доставки генетического материала в клетку. Для этого могут использоваться физические и биологические средства доставки. Для создания эффективно действующих препаратов на основе достижений генной инженерии могут быть использованы различные механизмы.

При любых методических предпочтениях путь доставки специфической ДНК в клетки-мишени" станет основным способом создания БАС. В качестве наиболее перспективных обсуждаются БАС, регулирующие внутриклеточную передачу сигнала, клеточный цикл, а также синтез соединений, несущих генетическую информацию суицидального характера.

Другим способом доставки лекарственных препаратов в клетку является использование естественного для организма человека механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Рецептор-опосредованный эндоцитоз является механизмом, используемым клетками для выборочной интернализации белков цитоплазматической мембраны (Jentschr et al., 1998). Таким образом, этот процесс служит механизмом захвата необходимых клетке макромолекул и осуществляет связь окружающей среды с отдельными компартментами клетки. Механизм рецептор-опосредованного эндоцитоза может также использоваться для доставки ДНК в рецептор-экспрессирующие клетки.

Рецептор-опосредованный эндоцитоз представляет собой лишь один из многочисленных механизмов, при помощи которых осуществляются биохимические реакции в организме, происходит транспорт разнообразных веществ, работают рецепторные системы и т. д. Тщательное изучение этих механизмов позволит создавать лекарственные препараты направленного действия и совершенствовать средства их доставки.

Таким образом, принципы моделирования направленной реактивности иммунных ответов вложены в механизм действия всех известных иммуномодуляторов, охватывают многие мишени на уровне клеток (мембранные, ядерные, цитоплазматические компоненты ), обладают направленной активностью, регулируют силу разных типов иммунных ответов. Задача исследователей и врачей в этом плане - объединить свои усилия и обозначить максимум специфики и силы взаимодействия лекарственного начала, которое установит нарушенное равновесие в организме больного.

Данная работа включает результаты, полученные в последние несколько лет при поиске новых классов антибиотических препаратов, оказывающих избирательные эффекты на функционирование иммунной системы и некоторые важные пути регуляции метаболизма, при разработке новых классов иммуномодуляторов пептидной природы, позволяющих их использовать для лечения вирусных и бактериальных инфекций, при создании новых систем избирательного направленного транспорта ряда цитостатиков и биологически активных соединений в опухолевые ткани. Кроме того, в данной работе положено начало для создания диагностикума на туберкулез на основе белков -антигенов М. tuberculosis ESAT-6 и CFP-10.

Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий 438 ссылок.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диссертационная работа состоит из четырех частей. Первая часть посвящена выделению, установлению структуры и изучению биологической активности антибиотических комплексов. Охарактеризованы таксономическая характеристика штаммов, выделение и очистка, физико-химические и морфологические характеристики антибиотических комплексов. На основании данных ЯМР и масс-спектров определены химические формулы компонентов антибиотических комплексов. Показано, что они принадлежат к группе олигомицинов и являются олигомицинами А, В, С. Кроме того, обнаружен абсолютно новый по своим свойствам антибиотический комплекс, который отнесен к классу макролидных соединений и идентифицирован как олигомицин SC II.

Вторая часть посвящена разработке базисных конструкций для направленной доставки лекарств в опухолевые и бактериальные клетки. Проблема направленной доставки лекарственного вещества в клетку является как сложной, так и интересной одновременно. В арсенале современной молекулярной медицины имеется множество подходов для поиска соответствующих решений, реализованных самыми различными способами. Последние несколько лет позволили однозначно сориентироваться и вычленить наиболее эффективные стратегии и перспективные направления, среди которых своеобразную популярность получили рецептор-опосредованный эндоцитоз, пассивная интернализация, взаимодействие «антиген-антитело». Каждый из этих подходов имеет свои преимущества и недостатки, однако можно с уверенностью утверждать, что эти попытки являются довольно успешными и могут составлять достойную альтернативу традиционно применяемым цитолитическим и цитотоксическим препаратам. Препараты нового поколения, целенаправленно уничтожающие клетки-мишени, являются эффективным оружием против клеток, подвергшихся опухолевой трансформации, либо вирусному или бактериальному заражению.

В качестве носителей лекарств предложены альфа-фетопротеин и эпидермальный фактор роста. Выбор, сделанный в пользу этих белков, был не случаен: рецепторы к AFP экспрессируются как на пролиферирующих (фетальных) клетках, так и на опухолевых, а усиление экспрессии рецепторов к EGF является признаком пролиферации и роста опухолей эпидермального (эпителиального) происхождения. Поэтому лиганды AFP и EGF обладают определенным уровнем специфичности, необходимой и достаточной для проявления цитотоксического потенциала препаратов, образующих с ними комплексы, в отношении клеток-мишеней. На роль лекарственного начала в этих комплексах были выбраны доксорубицин, эсперамицин, 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин. Активность конъюгатов DR-AFP и DR-EGF исследовалась на опухолевых клетках человека линии SROV3, несущих рецепторы к AFP и EGF, а также опухолевых линий OQS и MCF-7.

Третья часть посвящена изучению биологической эффективности и целесообразности применения иммуномодулирующих препаратов нового поколения: иммуномодулятора растительного происхождения(ИРП)и препарата Гепон. Проанализированы наиболее важные аспекты, отражающие особенности биологических активностей этих препаратов.

Для характеристики ИРП исследованы его токсические свойства в отношении опухолевых и нормальных клеток человека in vitro, его митогенная активность в отношении лимфоцитов периферической крови человека in vitro, способность индуцировать секрецию мононуклеарных лейкоцитов, цитотоксических факторов, а также его способность влиять на противоопухолевую ЦТА мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека in vitro. Исследована эффективность профилактического применения ИРП для предупреждения образования опухолей.

Полученные результаты позволяют заключить, что исследуемый препарат обладает противоопухолевой эффективностью, причем его действие связано не только с непосредственным цитотоксическим или цитостатическим действием на клетку опухоли, но и с активацией защитных сил организма, о чем свидетельствует очень высокая противоопухолевая эффективность профилактического введения ИРП. Именно эта особенность позволяет отнести его к разряду иммуномодуляторов. Кроме того, высокая противоопухолевая эффективность профилактического в/ж введения ИРП, обнаруженная при использовании модели перевиваемых опухолей мышей, позволяет считать целесообразным исследование противоопухолевой эффективности ИРП в отношении радиационно-индуцированных (радиогенных) опухолей и опухолей, индуцируемых химическими канцерогенами и др. факторами окружающей среды. В случае его эффективности в отношении профилактики опухолей, индуцируемых перечисленными факторами, ИРП крайне актуален для лиц, составляющих группу риска в отношении возможности развития злокачественных новообразований. Низкая токсичность ИРП и его выраженная противоопухолевая активность позволяют рекомендовать ИРП для проведения 1-ой фазы доклинических испытаний для выяснения его эффективности в качестве средства сопутствующей терапии.

Под влиянием другого иммуномодулятора, Гепона, проведена оценка иммунного контроля у больных оппортунистических инфекций?у больных ВИЧ-инфекцией, проанализирована активация образования антител к антигенам ВИЧ при лечении больных ВИЧ-инфекцией. Кроме того, оценена динамика роста основных субпопуляций лимфоидных клеток крови, влияние Гепона на продукцию антител. Проведено изучение зависимости иммуноадъювантного действия Гепона от его пептидной структуры.

Изучена динамика транскрипции генов цитокинов под действием Гепона в перевиваемых клетках человека. Показано их влияние на активацию неспецифического иммунитета у больных различными инфекционными заболеваниями. Доказано их вовлечение в активацию Т-хелперов, NK-клеток, макрофагов. Данные получены как in vitro, так и in vivo. Получены статистически значимые различия между контрольной и опытной группой больных, получавших лечение этими препаратами.

Изучена связь между структурой и иммуномодулирующими свойствами препарата Гепон. Описано иммуноадъювантное действие структурных фрагментов Гепона у лабораторных мышей в моделях первичного синтеза lgM-антител к антигенам гетерологичных эритроцитов и вторичного синтеза lgG-антител к растворимому гетерологичному белковому антигену. Установлено, что синтетические фрагменты, копирующие N-конец (НР1-5, НР1-9, НР1-11), С-конец (НР10-14, НР6-14, НР4-14), а также центральную часть (НР4-11 и НРЗ-12) молекулы Гепона, обладают иммуноадъювантным действием. Укорочение тетрадекапептида Гепона на 2 аминокислотных остатка с N-конца и 2 аминокислотных остатка с С-конца не нарушает иммуноадъювантной активности пептида. Укорочение тетрадекапептида Гепона на 3 аминокислотных остатка с каждого из концов полипептидной цепи приводит к существенному ослаблению его иммуноадъювантных свойств. Пентапептиды, копирующие N- и С-концы полипептидной цепи Гепона, обладают иммуноадъювантной активностью, сравнимой с Гепоном

На сегодняшний день препарат Гепон успешно применяется как самостоятельный иммуномодулятор, но, учитывая его мощные иммуностимулирующие свойства, может быть использован в качестве адъюванта при вакцинировании.

Последняя часть работы посвящена разработке диагностикума на туберкулез, созданного на базе рекомбинантных белков -антигенов ESAT-6 и CFP-10 М М.tuberculosis, которые могут стать реальной альтернативой малоинформативной реакции Манту.

Разработанный в рамках данной работы диагностический препарат на основе двух рекомбинантных белков М.tuberculosis в эксперименте показал высокую чувствительность и специфичность для диагностики туберкулезной инфекции. Внедрение разработанного диагностикума в практику здравоохранения позволит решить следующие задачи:

• Получить достоверные сведения о распространенности туберкулезной инфекции среди населения Российской Федерации;

• Организовать серийный выпуск высокостандартизованного диагностического препарата нового поколения, позволяющего дифференцировать иммунные реакции, обусловленные инфекцией М.tuberculosis, поствакцинальный иммунитет и неспецифические реакции, возникающие при инфицировании непатогенными микобактериями;

• Уменьшить бюджетные ассигнования на проведение флюорографических обследований, микроскопических и бактериальных исследований;

• Значительно оптимизировать расходы бюджетных средств за счет точной постановки диагноза и избежать необоснованных лечебных мероприятий;

• Уменьшить риск распространения полирезистентных штаммов М.tuberculosis, возникающий при необоснованном назначении антибиотиков.

Таким образом, в настоящей работе реализованы современные молекулярно-биологические подходы, с помощью которых возможна модуляция иммунитета при всех заболеваниях опухолевого, вирусного, бактериального происхождения, а также во всех других случаях, где требуется управление и контроль иммунного статуса пациента. Продемонстрировано, что моделирование направленной реактивности иммунного ответа (МНРИО) достигается с помощью абсолютно разных по своему происхождению веществ. С одной стороны, это вещества, созданные самой природой - обсуждаемые здесь новые классы антибиотиков, а также иммуномодулятор растительного происхождения (ИРП). Иммуномодулятор Гепон является пептидом внутриклеточного происхождения, конъюгаты на основе факторов роста - основы для направленного транспорта лекарственного начала в клетку. И наконец, разработка диагностикумов МНРИО на М. tuberculosis на базе специфических антигенов М. tuberculosis ESAT-6 и CFP-10, являющейся примером практического применения принципов моделирования направленной реактивности иммунного ответа. Одни из этих подходов уже используются в практическом здравоохранении, тогда как другие являются объектом приложения наукоемких и практических ресурсов самого ближайшего будущего.