Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Многопараметрический анализ сывороточных онкомаркеров с помощью суспензионных систем на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами

На прав

БРАЖНИК КРИСТИНА ИВАНОВНА

МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СЫВОРОТОЧНЫХ ОНКОМАРКЕРОВ С ПОМОЩЬЮ СУСПЕНЗИОННЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МИКРОСФЕР, КОДИРОВАННЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ НАНОКРИСТ АЛЛАМИ

14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических паук

005558833

МОСКВА 2014

005558833

Работа выполнена в Федеральном государственном автономной образовательном учреждении высшего профессионального образования «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ» (НИЯУ МИФИ)

Официальные оппоненты:

Зайцев Сергей Юрьевич, доктор биологических наук, доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Голенков Анатолий Константинович, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический инсгитуг имени М.Ф. Владимирского»

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена -филиал Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр имени П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «¿5» JUUapJi2Q 15 г. в I*? часов на заседании диссертационного совета Д.001.017.01 Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» (ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина») по адресу 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» (115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24) и на сайте www.ronc.ru.

Автореферат разослан «И>» 014 г.

Научный руководитель:

Суханова Алена Владимировна, кандидат биологических наук

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Онкологические заболевания по-прежнему остаются одной из ведущих причин смертности в мире. Ежегодно «рак» диагностируется у не менее чем 13 миллионов пациентов (данные за 2008 г.) и с каждым годом эти показатели увеличиваются (Ferlay J., 2010). Ключевым условием для обеспечения своевременного и эффективного лечения является систематический скрининг населения и ранняя диагностика онкологических заболеваний. Известно, что уровень содержания ряда утвержденных онкомаркеров в биологических жидкостях организма (например, в сыворотке крови) напрямую коррелирует с определенной стацией развития раковой опухоли (Diamandis Е.Р., 2002; Sturgeon С., 2002; Bensalah К., 2007). Одновременное определение профиля онкомаркеров существенно повышает эффективность диагностики у пациентов с ранней стадией онкологического процесса (Maruvada Р., 2005; Powers A.D., 2012).

По сравнению с традиционным иммуноферментным анализом (ИФА), предназначенным для определения одного маркера за один цикл, одновременный многопрофильный анализ помогает значительно экономить биологический материал и реагенты, сокращает время и стоимость анализа. Многопараметрический анализ на белковых микрочипах позволяет определять профиль маркеров, в частности онкомаркеров (Xiao G.G., 2008; Осипова Т.В., 2006), однако свойства неподвижного планарного носителя серьезно ограничивают выбор анализируемых параметров, производительность, чувствительность, эффективность, и скорость детекции (Ellington А.А., 2010).

В последнее время большие надежды связывают с многопараметрическими суспензионными системами на основе оптически кодированных микрочастиц с иммобилизованными на их поверхности биологическими зондами (Nolan J.P., 2002). Такие пространственные системы детекции имеют значительные преимущества перед твердофазными диагностическими системами, а именно: характеризуются эффективной кинетикой связывания; обладают расширенным линейным диапазоном определяемых концентраций; позволяют с высокой чувствительностью, точностью и скоростью измерять уровень нескольких маркеров одновременно в одном биологическом образце (Elshal M.F., 2006; Sukhanova А„ 2008).

Принцип работы многопараметрической суспензионной системы заключается в специфической визуализации и количественном определении каждого из анализируемых маркеров в составе иммунного комплекса на поверхности оптически кодированных микрочастиц с помощью проточной цитометрии. Каждому маркеру присваивается индивидуальный оптический код популяции микросфер, который помогает количественно

дифференцировать его в тестируемом биологическом образце. При смешивании нескольких популяций флуоресцентных микросфер, оптические коды которых присвоены различным биомолекулам, реализуется возможность многопараметрического количественного определения профиля специфических маркеров в одном образце (Kellar K..L., 2002; Sukhanova А., 2007).

Традиционно для оптического кодирования микрочастиц используют классические органические флуорофоры. Существующие суспензионные системы на основе флуоресцентных микросфер, разработанные компанией Luminex, имеют ряд ограничений, связанных с несовершенными оптическими свойствами органических флуорофоров: доступность ограниченного числа уникальных спектральных кодов микросфер для многопараметрического анализа; необходимость в специализированном аналитическом оборудовании; низкая фотостабильность и яркость флуоресцентных микрочастиц и т.д. (Sukhanova А., 2008).

По сравнению с классическими органическими флуорофорами, флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки, КТ) обладают уникальными оптическими свойствами (Resch-Genger U., 2008). Важнейшие из них — это высокие коэффициенты экстинкции и, как следствие, яркость излучения; узкий симметричный пик флуоресценции; прямая зависимость значения длины волны максимума.флуоресценции от размера нанокристаллов, позволяющая задавать оптические свойства нанокристалла в процессе синтеза; широкие спектры поглощения, позволяющие использовать один источник излучения для возбуждения КТ с различными оптическими свойствами; высокая фотостабильность и т.д. (Sukhanova А., 2008; Kellar K.L., 2002). Использование КТ для оптического кодирования микрочастиц позволяет одновременно выявлять несколько маркеров, повысить фотостабильность и чувствительность диагностической системы, использовать более простое декодирующее оборудование (стандартная комплектация проточного цитометра) и значительно сократить время и стоимость анализа (Nabiev I., 2008).

Применение в лабораторной клинической диагностике суспензионных микрочипов имеет важное медицинское значение, т.к. подобные системы для многопараметрического анализа образцов биологических жидкостей являются экономичной и эффективной альтернативой традиционным монопараметрическим ИФА-системам (Осипова Т.В., 2006; Sukhanova А., 2007). Диагностические суспензионные системы на основе микросфер, кодированных КТ, способны во многом превзойти возможности существующих клинико-лабораторных методов как для количественной детекции отдельных растворимых онкомаркеров, так и для сравнительного анализа их профиля и, в конечном счете, для эффективной диагностики онкологических заболеваний.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является разработка диагностической суспензионной системы нового поколения на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами, для многопараметрической количественной детекции онкомаркеров в сыворотке крови человека.

В соответствии с целью исследования поставлены следующие задачи:

1. Создать панель стабильных в биологических жидкостях флуоресцентных микросфер различных диаметров, кодированных КТ с различными оптическими свойствами и применимых для многопараметрической детекции сывороточных онкомаркеров.

2. Оптимизировать условия иммуноанализа на микрочастице для количественной детекции двух (две формы простатического специфического антигена (ПСА)) или трех (СА 15-3; раковоэмбриональный антиген (РЭА); СА 125) специфических сывороточных онкомаркеров.

3. Сформировать коллекцию образцов сыворотки крови пациентов и здоровых доноров и проанализировать их с помощью разработанной многопараметрической суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер в сравнении со стандартным иммуноферментным методом индивидуальной детекции маркеров (Fujirebio Diagnostics).

4. Оценить диагностическую эффективность и преимущества разработанной многопараметрической суспензионной системы.

5. Определить аналитические характеристики разработанной многопараметрической суспензионной системы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны принципы создания и применения суспензионной системы на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами, для многопараметрической лабораторной диагностики онкологических заболеваний.

2. Продемонстрированы возможности одновременной количественной детекции двух или трех специфических онкомаркеров в сыворотке крови с помощью разработанной многопараметрической суспензионной системы.

3. Диагностическая эффективность разработанной суспензионной системы по каждому определяемому онкомаркеру в многопараметрической схеме анализа эквивалентна эффективности стандартного монопараметрического иммуноферментного метода.

4. Аналитические характеристики разработанной суспензионной системы сопоставимы с характеристиками стандартного иммуноферментного метода.

Научная новизна

В настоящем исследовании разработаны принципы создания и применения диагностической суспензионной системы нового поколения на основе микросфер,

5

кодированных флуоресцентными нанокристаллами, для высокоточной

многопараметрической одновременной детекции панели онкомаркеров в сыворотке крови. Разработанная система протестирована с помощью достаточного количества клинического материала

Данная работа представляется актуальной, поскольку является первым в России научным трудом, в котором продемонстрированы и обоснованы принципы синтеза и преимущества применения диагностических суспензионных систем на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами, для многопараметрического анализа профиля онкомаркеров в формате «лаборатория-на-частице» перед традиционными твердофазными иммунометрическими системами для индивидуальной детекции онкомаркеров (ИФА):

1. одновременное определение панели онкомаркеров в одном образце;

2. достижение высокой чувствительности и эффективности количественной детекции маркеров в формате многопараметрического анализа;

3. возможность расширения диапазона определяемых концентраций без предварительных разведений образцов;

4. сокращение времени иммуноанализа, количеств образца и реагентов для определения количественного содержания нескольких маркеров;

5. анализ с помощью стандартного лабораторного оборудования (минимальная комплектация проточного цитометра);

6. принципиальная возможность оперативного увеличения количества одновременно определяемых маркеров, свидетельствующая об универсальности системы.

Практическая значимость

Информативность разработанной многопараметрической системы превосходит возможности стандартных иммуноферментных систем и в перспективе позволит улучшить высокоточную диагностику онкологических заболеваний в лабораторной клинической практике.

Данные, полученные в настоящем исследовании, могут быть использованы в качестве практического обоснования преимуществ клинико-лабораторного использования диагностических суспензионных систем на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами, для многопараметрического анализа профиля специфических онкомаркеров в биологических жидкостях пациентов. Разработка и применение такого высокоэффективного анализа для адресного скрининга населения будет способствовать своевременной ранней диагностике и рациональному выбору подходов к лечению.

Апробацпя работы

Апробация диссертационной работы состоялась 26 июля 2014 года на совместном научном заседании межкафедральной лаборатории нано-биоинженерии и кафедры № 81 «Физика микро- и наносистем» НИЯУ МИФИ, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей и лаборатории медицинской биотехнологии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина». Результаты работы были представлены на международном конгрессе «SPIE Photonics Europe 2014» (14-17 апреля 2014 г., Брюссель, Бельгия) в формате приглашенного устного доклада и 1-й международной школе и конференции «Saint-Petersburg OPEN 2014» (25-27 марта 2014 г., Санкт-Петербург, Россия). Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации, и 2 тезиса конференций. Связь работы с научными программами

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (контракт № 11.G34.31.0050) и Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» (контракт № 14.578.21.0054). Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 рисунками и 11 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 7 отечественных и 158 зарубежных источников.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Материалы и научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 - «онкология», а именно пункту 3.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследования Коллекция образцов сыворотки крови человека

Образцы сыворотки крови пациентов, имеющих злокачественные и доброкачественные опухоли, а также здоровых доноров были любезно предоставлены отделением урологии и отделом клинической иммунологии (заболевания предстательной железы) и хирургическим отделением № 5 (заболевания молочной железы) НИИ клинической онкологии ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина».

Для валидации разработанной суспензионной системы для количественной детекции двух форм специфического маркера рака предстательной железы (РПЖ) (свободный и общий ПСА) было собрано и проанализировано 68 образцов сыворотки крови. Для количественной детекции двух онкомаркеров, определяемых при раке молочной железы (РМЖ) (СА 15-3, РЭА), и маркера рака яичников (РЯ) (СА 125) было собрано 120 образцов сыворотки крови. В таблицах 1 и 2 представлены данные об исследуемых выборках, группах пациентов и здоровых доноров, а также их численности.

Табл. 1. Образцы сыворотки крови для количественной детекции свободного и общего ПСА.

№ п/п Исследуемые группы Средний возраст (лет) Муж. (чел.) Кол-во образцов сыворотки

1 Здоровые доноры 30,0 6 6

2 Больные с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ) 66,0 33 33

3 Больные РПЖ 67,0 29 29

ВСЕГО 68

Табл. 2. Образцы сыворотки крови для количественной детекции СА 15-3, РЭА и СА 125.

№ п/п Исследуемые группы Средний возраст (лет) Жен. (чел.) Кол-во образцов сыворотки

1 Здоровые доноры 47,4 40 40

2 Больные с доброкачественными заболеваниями молочной железы 48,8 6 6

3 Больные РМЖ 55,0 72 72

4 Больные РМЖ (carcinoma in situ) 55,8 2 2

ВСЕГО 120

Анализ образцов сыворотки крови с помощью традиционного метода ИФА

Концентрации онкомаркеров в исследуемых образцах сыворотки крови измеряли методом ИФА с использованием диагностических наборов фирмы Fujirebio Diagnostics (Швеция) для свободного (кат. № 350-10) и общего (кат. № 340-10) ПСА, РЭА (кат. № 40110), СА 15-3 (кат. № 200-10) и СА 125 (кат. № 400-10) согласно прилагающимся к наборам инструкциям. Концентрации онкомаркеров в исследуемых образцах сыворотки крови, измеренные с помощью разработанной суспензионной системы флуоресцентных микросфер, кодированных КТ, сравнивались с концентрациями, измеренными методом ИФА.

Автор глубоко благодарен сотрудникам лаборатории экспериментальной диагностики и биотерашш опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ

«РОНЦ им. H.H. Блохина» к.м.н. З А. Соколовой и к.фарм.н. М.А. Барышниковой за помощь в проведении экспериментов по определению концентраций онкомаркеров в исследуемых образцах сыворотки крови методом ИФА.

Получение стабильных водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов

KT, состоящие из фотолюминесцентного полупроводникового ядра селенида кадмия (CdSe), оболочки сульфида цинка (ZnS), дополнительно покрытые органической оболочкой триоктилфосфиноксида (TOPO) и имеющие максимумы флуоресценции на 513, 515, 581, 585, 630, 640 им, были получены методом высокотемпературного металлоорганического синтеза (коллоидный метод) в соответствии с описанными ранее протоколами (Sukhanova А., 2004), охарактеризованы и любезно предоставлены сотрудниками группы нанохимии лаборатории нано-биоинженерии НИЯУ МИФИ к.х.н. ПС. Самохваловым и П.А. Линьковым.

Для получения стабильных водорастворимых KT проводили двухстадийную процедуру замещения компонентов органической оболочки TOPO на DL-цистеин (Sigma-Aldrich) и последующего замещения цистеиновой оболочки низкомолекулярным производным полиэтиленгликоля (ПЭГ), содержащим концевые тиольную и карбоксильную группы (carboxy-PEGi2-thiol, Thermo Fisher Scientific) (Sukhanova А., 2012). Оптическое кодирование микросфер флуоресцентными нанокристаллами

Для создания оптически кодированных флуоресцентных микросфер была адаптирована технология формирования плотной 10-16-слойной оболочки из чередующихся положительно (полиаллиламин гидрохлорид, 15 кДа, Sigma-Aldrich) и отрицательно (полистиролсульфонат натрия, 70 кДа, Sigma-Aldrich) заряженных органических полимеров на поверхности карбоксилированных латексных микросфер разного диаметра (4,08 мкм; 6,1 мкм; 8,24 мкм, microParticles GmbH) (Caruso F., 2001). Различные варианты одноцветных оптических кодов были получены путем включения в состав полимерной оболочки микросфер индивидуальных популяций водорастворимых нанокристаллов с различными максимумами флуоресценции (513, 515, 581, 585, 630 или 640 нм) и/или различными концентрациями их стоковых растворов. Непосредственно перед процедурой химической конъюгации с моноклональными антителами (AT) флуоресцентные микросферы покрывали дополнительным полимерным слоем полиакрилата натрия (15 кДа, Sigma-Aldrich) для получения поверхности микрочастиц с экспонированными карбоксильными группами, необходимыми для эффективного связывания с биомолекулами.

Микросферы, оптически кодированные флуоресцентными нанокристаллами, были использованы для создания суспензионных диагностических систем нового поколения для многопараметрической детекции специфических сывороточных онкомаркеров (антигенов, АГ), определяемых при РПЖ, РМЖ и РЯ.

Характеризация микросфер, кодированных флуоресцентными

нанокристаллами

Спектральные и структурные свойства флуоресцентных микросфер были охарактеризованы с помощью эпифлуоресцентной микроскопии (Nicon Eclipse TE2000-S), конфокальной микроскопии (AlRsi Spectral Imaging Confocal System), сканирующей зондовой нанотомографии (scanning probe nanotomography, SPNT) (Mochalov K.E., 2013).

Анализ суспензионной системы флуоресцентных микросфер для детекции сывороточных онкомаркеров осуществлялся с помощью проточной цитометрии (FACSCantoII, Becton Dickinson). Возбуждение флуоресценции KT, определяющих оптический код популяций микросфер, и вторичной флуоресцентной метки, используемой для определения количества связавшегося АГ, обеспечивал аргонный лазер с длиной волны излучения 488 им. Флуоресцентный код популяций микросфер детектировался в стандартных каналах проточного цитометра: FITC (fluorescein) (микросферы, кодированные KT 513 или 515 нм), PE (phycoerythrin) (микросферы, кодированные KT 581 или 585 нм) или PE-Cy5 (phycoerythrin-cyanine 5) (микросферы, кодированные KT 630 или 640 нм). Флуоресценция вторичной метки, используемой для визуализации иммунного комплекса, детектировалась в канале PE-Cy5 (Tri-COLOR, 670 нм). Данные анализа системы записывались до значения 5000-20000 детектируемых событий на образец и обрабатывались с помощью программного обеспечения FACSDiva, Becton Dickinson.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам лаборатории UFIP FRE CNRS-3478 Университета г. Нант (Франция), лаборатории бионанотехнологии ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России и ООО "СНОТРА", Биомед, Сколково за неоценимую помощь в проведении экспериментов по характеризации флуоресцентных микросфер с помощью микроскопических методов исследования.

Конъюгация распознающих моноклональных антител с поверхностью флуоресцентных микросфер

Ковалентное связывание распознающих моноклональных AT, обладающих высокой специфичностью к индивидуальным онкомаркерам, с поверхностью кодированных микросфер осуществлялось с помощью стандартного карбодиимидного метода химической конъюгации. Выбор популяции микросфер для связывания с АГ-специфическими AT определял оптический код, присваиваемый анализируемому онкомаркеру. В таблице 3 приведено соответствие оптических кодов флуоресцентных микросфер анализируемому онкомаркеру и специфическим компонентам иммунодиагносгического комплекса.

Табл. 3 Оптические коды флуоресцентных микросфер и состав специфических иммунных комплексов на микрочастице для многопараметрической детекции онкомаркеров.

Популяция микросфер Анализируемый онкомаркер Распознающие АГ-специфические AT (Fujirebio Diagnostics, Швеция) Детекторные АГ-специфические AT (Fujirebio Diagnostics, Швеция)

4,08 мкм, KT 515 нм Свободный ПСА PSA30 (кат. №333-01) PSA66 (кат. №310-10)

4,08 мкм, KT 581 нм Общий ПСА PSA 10 (кат. №304-01) PSA66 (кат. №310-01)

4,08 мкм, KT 585 нм CA 15-3 Ма695 (кат. №204-01) Ма552 (кат. №209-01)

6,1 мкм, KT 585 нм РЭА 12-140-10 (кат. № 402-01) 12-140-1 (кат. №401-01)

8,24 мкм, KT 585 нм CA 125 Ovl97 (кат. №212-01) Ovl85 (кат. №203-01)

Биотиннлирование детекторных моноклональных антител

Для эффективной визуализации иммунодиагностических комплексов на микрочастице детекторные моноклональные AT против двух форм ПСА, CA 15-3, РЭА, CA 125 были модифицированы путем введения в структуру молекулы активных групп биотина с использованием реагента Sulfo-NHS-LC-biotin (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с рекомендуемым протоколом производителя.

Многопараметрическнй иммуиоанализ образцов сыворотки крови с помощью флуоресцентных микросфер в суспензии

Количественная детекция специфических онкомаркеров с помощью разработанной суспензионной системы микросфер, кодированных KT, основывалась на анализе сформировавшихся на поверхности микросфер иммунодиагностических комплексов, состоящих из (1) специфического AT, конъюгированного с поверхностью микросферы и распознающего определенный АГ из образца сыворотки крови (2) детектируемого АГ (онкомаркера); (3) биотинилированного детекторного АГ-специфического AT; (4) визуализирующего конъюгата стрептавидина с органическим флуоресцентным красителем (Tri-COLOR, ТС) (рис. 1).

Ф:>\<)ресисиi!иa KI

Распознающее AT I

Мнкросфера, колированная KTW

Слренгавмднн-

Tii-COLOR

I ,

' Флуорпненимя

nt/ I" l'lf'VIflllf"

iiimi «ни. !üj>im,<miue

детекторное AT

Флуоресцентные АГ-

специфические микросферы

последовательно инкубировалась со всеми компонентами

иммунодиагностического комплекса. Все АГ-специфические популяции микросфер были откалиброваны с

Рис. 1. Схема иммунодиагностического комплекса на микрочастице.

помощью коммерческих наборов стандартов, содержащих известные концентрации соответствующего АГ (Fujirebio Diagnostics), на основании этих данных были построены калибровочные кривые для определения концентрации каждого онкомаркера в сыворотке крови.

Для одновременной количественной детекции двух форм специфического маркера заболеваний предстательной железы АГ-специфические флуоресцентные микросферы с диаметром 4,08 мкм, кодированные КТ с максимумами флуоресценции на 515 нм (свободный ПСА) и 581 нм (общий ПСА), смешивали в эквивалентных количествах.

Для одновременной количественной детекции трех онкомаркеров, определяемых при заболеваниях женской репродуктивной системы, АГ-специфические флуоресцентные микросферы с диаметрами 4,08 мкм (СА 15-3), 6,1 мкм (РЭА) и 8,24 мкм (СА 125), кодированные КТ с максимумом флуоресценции на 585 нм, смешивали в рассчитанных количествах, эквивалентных по эффективной площади поверхности микросфер.

Суспензионные смеси микросфер инкубировали с 50 мкл образца сыворотки крови, затем с биотинилированными детекторными AT, и визуализировали иммунные комплексы с помощью флуоресцентного конъюгата стрептавидин-Tri-COLOR. Полученные образцы анализировали с помощью проточной цитометрии.

Определение аналитических характеристик суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер

Для определения аналитических характеристик разработанной суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер для количественной детекции свободного и общего ПСА в сыворотке крови провели ряд тестов, общепринятых для валидации иммуноаналитических систем: изучение стабильности (воспроизводимости) данных, определение аналитической (предельной) чувствительности, проведение специальных тестов на достоверность, надежность и точность определения маркера (тесты на «открытие» и линейность).

Статистическая обработка результатов количественной детекции онкомаркеров в образцах сыворотки крови с помощью разработанной суспензионной системы микросфер, кодированных КТ, и стандартного иммуноферментного метода (Fujirebio Diagnostics) была проведена с использованием пакетов программ Microsoft Excel 2010 и OriginPro (версия 8.5 SRI).

Точность и воспроизводимость анализа оценивали по значениям стандартного отклонения (СО) и коэффициента вариации (KB), равного отношению СО к средней величине, выраженному в процентах. Для установления связи между результатами измерений уровней онкомаркеров в образцах сыворотки крови с помощью двух диагностических систем применяли регрессионный анализ и коэффициент корреляции.

12

Основные результаты и их обсуждение

Синтез и характеризация микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами

С помощью разработанной процедуры формирования многослойной полимерной оболочки с включением в ее состав водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов была получена панель популяций стабильных ярких флуоресцентных микросфер различных диаметров, кодированных КТ с различными оптическими свойствами и применимых для использования в многопараметрической детекции растворимых маркеров, а именно:

1. Микросферы с диаметром 4,08 мкм, кодированные КТ с максимумами флуоресценции на 515, 581, 585, 630 нм;

2. Микросферы с диаметром 6,1 мкм, кодированные КТ с максимумами флуоресценции на 513, 585, 630 нм;

3. Микросферы с диаметром 8,24 мкм, кодированные КТ с максимумами флуоресценции на 513, 585, 640 нм.

Различные комбинации

оптически кодированных микросфер были использованы для создания суспензионных диагностических систем нового поколения для многопараметрической детекции сывороточных онкомаркеров,

определяемых при РПЖ, РМЖ и РЯ.

Полученные образцы

флуоресцентных микросфер обладали усовершенствованными спектральными свойствами,

характеризовались высокой

стабильностью и устойчивостью к деградации при хранении в течение

Рис. 2. Спектральные и структурные характеристики микросфер, кодированных квантовыми точками (КТ). (А) Эпифлуоресцентная и (Б) конфокальная микроскопия микросфер диаметром 4,08 мкм, кодированных КТ с максимумом флуоресценции на 515 и 630 нм с приблизительной оценкой распределения КТ в поверхностной области с помощью позиционного сканирования интенсивности флуоресценции по всему диаметру сферы. (В) Сканирующая зондовая нанотомография микросфер, показывающая структуру «ядро/оболочка».

длительного периода времени при 4°С.

Данные анализа методом эпифлуоресцентной микроскопии свидетельствуют о том, что индивидуальные популяции одноцветных микросфер обладали интенсивной флуоресценцией и были гомогенны (рис. 2 А). Оптические коды индивидуальных популяций микросфер, кодированных КТ с различными оптическими свойствами, были визуально различимы в смеси образцов.

Позиционное сканирование интенсивности флуоресценции по всему диаметру сферы показало, что максимум флуоресценции КТ приходится на внешние 25% радиуса микросферы (рис. 2 Б). Это свидетельствует в пользу того, что флуоресцентные нанокристаллы распределены в поверхностной области микросферы, а именно внутри сформированной на поверхности микросферы полимерной оболочки.

Результаты исследования образцов с помощью сканирующей зондовой нанотомографии свидетельствуют о том, что созданные флуоресцентные микросферы представляют собой структуры, состоящие из ядра и плотной полимерной оболочки, в которой распределены КТ (рис. 2 В). Таким образом, полученные результаты подтверждают данные исследования с помощью конфокальной микроскопии.

Количественная детекция свободного и общего ПСА в образцах сыворотки крови с помощью флуоресцентных микросфер

А ^ Калибровочные кривые, построенные по

результатам анализа коммерческих стандартов (в диапазоне сывороточных концентраций 0 -10 нг/мл для свободного ПСА и 0 - 60 нг/мл для общего ПСА), имели вид линейной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации АГ в пробе (рис. 3 А, Б) и использовались для вычисления точных

Б

2 Л 6

Свободный ПСА, нг/мл

ю

концентраций свободного и общего ПСА в образцах сыворотки крови.

Рис. 3. Калибровочные кривые для количественного определения свободного (А) и общего (Б) ПСА. Результаты анализа в трех повторах внутри одного эксперимента.

о

10 20 30 40

Общий ПСА, нг/мл

50

60

Цитометрический анализ образцов сыворотки крови с помощью разработанной диагностической суспензионной системы осуществлялся в формате одновременного

определения количественного содержания двух форм ПСА при смешивании соответствующих АГ-специфических популяций микросфер.

Иммунодиагностические комплексы, связывающие

свободный и общий ПСА на поверхности микросфер

диаметром 4,08 мкм,

кодированных КТ с максимумами флуоресценции на 515 нм и 581 нм, соответственно,

визуализировались с помощью общего детекторного

биотинилированного AT и конъюгата стрептавидин-Tri-COLOR.

При анализе образцов с помощью проточной цитометрии каждая популяция микросфер сначала была дифференцирована по оптическому коду (рис. 4 А), а затем по измеренным значениям средней интенсивности

флуоресценции вторичной метки, визуализирующей иммунные комплексы s каждой популяции

OD <15 ran : PSA fn-.r (ncK.,iivr>

—B+afr-OD Ml nm : PSA towl In-ailv^

4.08 мкм/ 4.08 мкм/

КТ 515 нм КТ 581нм

Ш .............

Пациенты с промежуточным уровнем ПСА в сыворотке

I

оптический код

Popular,, fW

-- PSA free nrgntbT PSA if r putllhT

—— IZZt Zll

Л

Л

ПЛ IDI.,1 Jm.tlivi.

___

флуоресценция визуализирующей метки

Рис. 4. Данные проточной цитометрии смеси микросфер диаметром 4,08 мкм, кодированных КТ 515 и 581 нм, для детекции свободного и общего ПСА, соответственно, в образцах сыворотки крови. (А) Размер и оптические коды популяций флуоресцентных микросфер. (Б) Анализ сыворотки крови здорового донора женского пола и пациента с высоким содержанием ПСА. (В) Анализ двух экспериментальных образцов сыворотки крови с промежуточным содержанием ПСА. (Г) Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции визуализирующей метки, отражающие количество детектированного свободного или общего ПСА, в четырех образцах (Б) и (В).

а4п 1

Свободный ПСА

>=0.832\ + 0.147

микросфер (рис. 4 Б, В, Г), были определены сывороточные концентрации детектируемых онкомаркеров. Отрицательный контроль включал инкубацию микросфер с сывороткой крови здорового донора женского пола (рис. 4 Б), а положительный контроль - с сывороткой крови пациента с установленным высоким содержанием ПСА (рис. 4 В). С помощью разработанной диагностической суспензионной системы микросфер, кодированных КТ, было проанализировано 68 образцов сыворотки крови пациентов мужского пола с установленными диагнозами ДГПЖ, РПЖ, а также здоровых доноров (табл. 1) и определены уровни содержания свободного и общего ПСА.

Диагностические характеристики

суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер:

регрессионный анализ

Диагностические характеристики

суспензионной системы, предназначенной для одновременной количественной детекции свободного и общего ПСА, сравнивались с характеристиками стандартного клинико-лабораторного метода индивидуальной детекции маркеров (ИФА, Fujirebio Diagnostics) с использованием образцов сыворотки крови различных исследуемых групп.

По данным многочисленных

исследований, показатели содержания свободного и общего ПСА в сыворотке крови, 25 определенные с помощью различных диагностических систем, могут значительно различаться. По этой причине дня информативного и эффективного мониторинга и дифференциальной диагностики РПЖ и ДГПЖ пациентам рекомендуется проходить

• -

п = 63. г = 0.9.11 Р < 0.0001

ИФА «Fujirebio Diagnostics» (нг/мл}

Общий ПСА

у = 0.996* + 0.382 г = 0.899

п - (1-1. г = 0.948 К 0.0001

В

£40

|з5

^ 20 I10

ИФА «Fujirebio Diagnostics» (нг/мл)

% свободного ПСА

v = 1.103*+0.932

п = 54. г = 0.927 Р< 0.0001

10 15 20 25 30 35 40 ИФА «Fujirebio Diagnostics» (%)

Рис. 5. Линии регрессии уровней свободного ПСА (А), общего ПСА (Б) и рассчитанного процентного содержания ПСА (В), измеренных с помощью суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер и ИФА-наборов, Fujirebio Diagnostics.

повторные обследования с помощью одной диагностической системы. Тем не менее, в данном исследовании на клиническом материале (68 образцов сыворотки крови) показана высокая степень корреляции данных, полученных с помощью разработанной многопараметрической суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер и стандартного монопараметрического ИФА (рис. 5 А, Б).

Коэффициенты корреляции г составляли 0,941 для свободного и 0,948 для общего ПСА. Уровень значимости корреляции был высоким, Р<0,0001. На основании данных определения сывороточных концентраций ПСА с помощью двух диагностических методов были построены линии регрессии, свидетельствующие об их близкой эквивалентности. Средние значения KB для 68 образцов, проанализированных в трех повторах в одном эксперименте, составили 2,3% для свободного и 2,7% для общего ПСА, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости и высокой эффективности анализа.

Для эффективной дифференциальной диагностики РПЖ и ДГПЖ обычно оценивают процентное содержание свободного ПСА. Изменение этого показателя зачастую свидетельствует о развитии патологического процесса (доброкачественного или злокачественного). Продемонстрировано, что показатели процентного содержания свободного ПСА, рассчитанные по значениям концентраций свободного и общего ПСА, определенных с помощью двух диагностических методов, также имели высокую степень корреляции (г=0,927, Р<0,0001) (рис. 5 В).

Следовательно, разработанная диагностическая суспензионная система на основе микросфер, кодированных КТ, позволяет одновременно проводить количественные измерения двух форм ПСА и получать результаты, сопоставимые с данными анализа с помощью стандартных ИФА тест-систем Fujirebio Diagnostics, предназначенных для индивидуального определения каждого онкомаркера.

Аналитические характеристики суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер

Воспроизводимость калибровочных кривых оценивали по значениям СО и KB внутри одного эксперимента, а также в серии независимых экспериментов на микросферах, конъюгированных с новыми порциями АГ-специфических AT. Воспроизводимость калибровочных кривых в линейном диапазоне определяемых концентраций 0-10 нг/мл для свободного и 0 - 60 нг/мл для общего ПСА, а также данных по количественной детекции этих онкомаркеров в сыворотке крови, полученных внутри одного эксперимента в двух или трех повторах, была высокой: значения KB были в интервале 0 - 9%. В серии трех независимых экспериментов на микросферах, конъюгированных с новыми порциями АГ-специфических AT, воспроизводимость калибровочных кривых оказалась ниже: KB значений флуоресценции для каждой точки калибровочной кривой имели значения 3-31%

17

г гв

О

р Свободный ПСА, нг/мл

в 10 20 30 40 50 60

Общий ПСА, нг/мл

Рис. 6. Калибровочные кривые для количественного определения свободного (А) и общего (Б) ПСА. Результаты анализа в серии трех независимых экспериментов на микросферах, конъюгированных с новыми порциями АГ-специфических АТ.

(рис. 6 А, Б). Это объяснялось различиями в количестве эффективно конъюгированных АГ-специфических АТ на поверхности микросфер и в количестве микросфер, взятых для анализа одного образца. Тем не менее, в каждом независимом эксперименте по анализу образцов сыворотки крови микросферы,

конъюгированные с новыми порциями АТ, калибровались заново с помощью стандартов, и сывороточные концентрации двух форм ПСА определялись с помощью соответствующих реконструированных калибровочных кривых. Несмотря на то, что измеренные абсолютные значения концентраций сывороточных онкомаркеров могли статистически отличаться в некоторых независимых экспериментах (КВ имели широкий разброс 2,6 - 36,9% для свободного и 5,4 - 32,3% для общего ПСА), наиболее информативный показатель рассчитанного процентного содержания свободного ПСА относительно общего уровня всегда оставался практически неизменным со средним значением КВ не более 10% (табл. 4).

Табл. 4. Воспроизводимость данных анализа образцов сыворотки крови в трех независимых экспериментах с микросферами, конъюгированными с новыми порциями АГ-специфических АТ и откалиброванными для каждого индивидуального теста._

Образец сыворотки Свободный ПСА, нг/мл Общий ПСА, нг/мл Свободный ПСА, %

Среднее СО КВ, % Среднее СО КВ, % Среднее СО КВ, %

А 16,17 1,44 8,9 1,20 0,06 5,2 12,6 0,84 6,6

Б 3,25 0,84 25,9 0,58 0,21 36,9 15,8 1,07 6,8

Аналитическая чувствительность определяется как наименьшее количество вещества, которое можно достоверно определить с помощью диагностического метода, и рассчитывается как концентрация, соответствующая среднему значению флуоресценции многократно измеренной нулевой калибровочной пробы плюс два стандартных отклонения. Предельные нижние значения концентраций сывороточных онкомаркеров, определяемых с помощью разработанной суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер в

формате многопараметрического анализа, составили 0,067 нг/мл для свободного и 0,12 нг/мл для общего ПСА, что сопоставимо с чувствительностью стандартных монопараметрических иммуноферментных систем.

Линейный диапазон определяемых концентраций и качество анализа с помощью разработанной суспензионной системы на всех участках калибровочной кривой для использованных коммерческих наборов калибровочных стандартов оценивались в эксперименте с серией последовательных двукратных разведений образцов сыворотки крови (тест на линейность).

Предварительно неразведенные образцы сыворотки крови с известными высокими концентрациями общего ПСА (239,4 и 309,7 нг/мл, данные получены методом ИФА), превышающими максимальную концентрацию онкомаркера в калибровочной пробе, были проанализированы с помощью разработанной суспензионной системы. Согласно результатам анализа при измерении сывороточных концентраций ПСА, в 4-5 раз превышающих пороговую концентрацию использованных стандартов, сигналы флуоресценции визуализирующей метки оказались значительно выше такового для максимального стандарта. Этот факт свидетельствует о том, что с помощью изменения количества детектирующих микросфер, взятых дтя анализа, или количества АТ, конъюгируемых с поверхностью микросфер, разработанная суспензионная система может быть успешно

адаптирована для анализа образцов, содержащих патологически высокие концентрации ПСА, без предварительных процедур разведения.

Образцы сыворотки крови с высокими концентрациями общего ПСА (239,4 и 309,7 нг/мл, данные получены методом ИФА) вводили в линейный диапазон определяемых концентраций (для использованных коммерческих наборов калибровочных стандартов) с помощью предварительных разведений а затем готовили двукратные серийные разведения образцов (в диапазоне от 1:4 до 1:500) и анализировали с помощью разработанной суспензионной системы на

Свободный ПСА

г «н

£ м-

1 50 104 154 200 254 300 350 400 454 504 550

Разведение сыворотки крови (сгт 4 до 500 раз)

Общий ПСА

50 100 150 204 250 304 350 440 454 540 55С

Разведение сыворотки крови (от 4 до 500 раз)

Рис. 7. Оценка качества определения уровней свободного (А) и общего (Б) ПСА в серии разведений образцов сыворотки крови.

основе флуоресцентных микросфер.

Конечную концентрацию каждого маркера оценивали путем умножения концентрации, измеренной в разведенном образце, на разведение и выражали в процентах относительно исходного образца (рис. 7 А, Б). Поскольку концентрации свободного и общего ПСА в неразведенных образцах в 4-5 раз превышали максимальную концентрацию онкомаркера в стандартной калибровочной пробе и не могли быть установлены по калибровочной кривой, за исходные концентрации были приняты значения, полученные при разведении образцов в 4-5 раз (100%). При одновременном определении концентраций свободного и общего ПСА в приготовленных образцах наблюдалась достоверная линейная корреляция между измеренным и расчетными значениями, не отличавшимися более чем на 15% в динамических диапазонах 0,07 - 10 нг/мл для свободного и 0,5 - 60 нг/мл для общего ПСА (разведение от 4 до 500 раз).

Достоверность определения концентрации онкомаркеров в смешанных образцах сыворотки (тест на «открытие»)

Два образца сыворотки крови с предварительно установленными уровнями свободного и общего ПСА смешивались в равных пропорциях, и эта смесь также анализировалась с

помощью разработанной суспензионной системы.

Сравнительный анализ показал, что различие расчетных и измеренных значений концентраций онкомаркеров в смеси образов сыворотки крови составляло не более 11% для свободного и 7,9% для общего ПСА (табл. 5), что удовлетворяет требованиям для стандартных

диагностических систем. Таким образом, исходя из полученных данных,

разработанная

диагностическая система позволяет с высокой точностью, аккуратностью и достоверностью одновременно определять количественное содержание двух форм ПСА в образцах сыворотки крови.

Табл. 5. Оценка достоверности определения уровня двух форм ПСА в смешанных образцах сыворотки крови в двух независимых экспериментах с микросферами, конъюгированными с новыми порциями АТ.

Образец сыворотки Эксперимент 1 Эксперимент 2

Свободный ПСА, нг/мл Общий ПСА, нг/мл Свободный ПСА, нг/мл Общий ПСА, нг/мл

В 1,152 15,15 1,24 9,39

Г 0,473 3,84 0,44 2,65

Смесь (В+Г) (измеренная) 0,74 8,8 0,73 5,5

Смесь (В+Г) (расчетная) 0,8125 9,495 0,84 6,02

Показатель восстановления, % 91,1 92,7 86,9 91,4

Показатель восстановления, %

Эксп. 1 Эксп. 2 Среднее, %

Свободный ПСА 91,1 86,9 89,0

Общий ПСА 92,7 91,4 92,1

СА 15-3, Ед/мл

Принципы количественной детекции СА 15-3, РЭА и СА 125 в образцах сыворотки крови с помощью флуоресцентных микросфер

АГ-специфические флуоресцентные микросферы с диаметрами 4,08 мкм, 6,1 мкм и 8,24 мкм, кодированные КТ с максимумами флуоресценции на 585 нм, были откалиброваны с помощью коммерческих наборов калибровочных стандартов в диапазонах определяемых концентраций 0 - 250 Ед/мл для СА 15-3; 0-75 мкг/л для РЭА; 0 - 500 Ед/мл для СА 125, ' соответственно.

Калибровочные кривые, построенные по результатам анализа стандартов, имели вид линейной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации АГ в пробе (рис. 8) и использовались для вычисления точных концентраций трех онкомаркеров, определяемых при различных злокачественных и доброкачественных заболеваниях женской репродуктивной системы, в клинических образцах сыворотки крови.

Анализ образцов сыворотки крови с помощью разработанной диагностической суспензионной системы осуществлялся в формате одновременного определения СА 153, РЭА и СА 125 при смешивании трех соответствующих АГ-специфических

популяций флуоресцентных микросфер. Иммунодиагностические комплексы на поверхности микросфер визуализировались с помощью смеси АГ-специфических биотинилированных детекторных АТ и конъюгата стрептавидин-Тп-СОЬ(Ж.

При анализе образцов с помощью проточной цитометрии каждая популяция микросфер сначала была дифференцирована в смеси по размеру и/или оптическому коду (рис. 9 А).

РЭА, мкг/л

Рис.

дтя

СА 125, Ед/мл

8. Калибровочные кривые количественного определения СА 15-3 (А), РЭА (Б) и СА 125 (В). Результаты анализа в трех повторах внутри одного эксперимента.

По измеренным значениям средней интенсивности флуоресценции вторичной метки, визуализирующей иммунные комплексы на поверхности каждой АГ-специфической

популяции микросфер (рис. 9 Б, В), можно было определить

сывороточные концентрации СА 153, РЭА, СА 125 с помощью соответствующих калибровочных кривых.

Таким образом, в

предварительных экспериментах на небольшом наборе образцов сыворотки крови были

продемонстрированы возможности применения суспензионной системы на основе микросфер, кодированных КТ, для многопараметрической диагностики заболеваний женской репродуктивной системы в формате одновременного определения

количественного содержания трех специфических сывороточных

онкомаркеров, определяемых при РМЖ и РЯ. Полученные результаты свидетельствуют об

универсальности применения

микросфер, кодированных КТ, для многопараметрической количественной детекции

различных растворимых маркеров.

флуоресценция визуализирующей метки

Рис. 9. Данные проточной цитометрии смеси микросфер с диаметрами 4,08; 6,1; 8,24 мкм, кодированных КТ 585 нм, для детекции СА 15-3, РЭА (СБА) и СА 125, соответственно, в образцах сыворотки крови. (А) Размеры и оптические коды популяций флуоресцентных микросфер. (Б) Анализ трех экспериментальных образцов сыворотки с разным содержанием онкомаркеров. (В) Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции визуализирующей метки, отражающие количество детектированных онкомаркеров, в трех образцах.

Выводы:

1. Создана панель популяций стабильных ярких одноцветных микросфер разного диаметра (4,08; 6,1; 8,24 мкм), кодированных флуоресцентными нанокристаллами с различными оптическими свойствами (максимумы флуоресценции на 513; 515; 581; 585; 630; 640 нм) и применимых для многопараметрической детекции сывороточных онкомаркеров.

2. Разработаны принципы одновременной количественной детекции двух (две формы ПСА) или трех (CA 15-3, РЭА, CA 125) сывороточных онкомаркеров с помощью иммунодиагностических комплексов на поверхности микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами.

3. Показана высокая степень корреляции уровней свободного (/=0,941; Р<0,0001) и общего (г=0,948; Р<0,0001) ПСА, измеренных в клинических образцах сыворотки крови пациентов и здоровых доноров (68 образцов) с помощью разработанной многопараметрической суспензионной системы и стандартного иммуноферментного метода (Fujirebio Diagnostics).

4. Аналитические характеристики разработанной суспензионной системы в формате многопараметрического анализа сопоставимы с характеристиками стандартного иммуноферментного метода (Fujirebio Diagnostics). Аналитическая чувствительность составляет 0,067 нг/мл для свободного и 0,12 нг/мл для общего ПСА. Воспроизводимость результатов внутри каждого эксперимента высокая, с KB <10%. Динамические линейные диапазоны определяемых концентраций составляют 0,07 - 10 нг/мл для свободного и 0,5 - 60 нг/мл для общего ПСА. Достоверность количественной детекции составляет 89% для свободного и 92,1% для общего ПСА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бражник, К.И. Разработка суспензионных микрочипов на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами, и принципы их использования для многопараметрической диагностики онкологических заболеваний / К.И. Бражник, ЗА. Соколова, М.А. Барышникова, P.C. Билан, И.Р. Набиев, A.B. Суханова // Российский биотерапевтический журнал. -2014. - Т. 13. -№4. - С. 3-10.

2. Билан, P.C. Ориентированные конъюгаты однодоменных антител и флуоресцентных нанокристаллов: новое поколение диагностических нанометок для высокопроизводительной детекции онкомаркеров / P.C. Билан, K.II. Бражник, П. Шамс, Д. Бати, И.Р. Набиев, A.B. Суханова// Российский биотерапевтический журнал. — 2014.— Т. 13,-№4.-С. 11-16.

3. Brazhnik, К. Development and potential applications of microarrays based on fluorescent nanocrystal-encoded beads for multiplexed cancer diagnostics / K. Brazhnik, R. Grinevich, A. Efimov, I. Nabiev, A. Sukhanova // Proceedings of SPIE. Biophotonics: Photonic Solutions for Better Health Care IV. - 2014. - V. 9129. - Article 91292C.

4. Brazhnik, К. Advanced procedure for oriented conjugation of full-size antibodies with quantum dots / K. Brazhnik, I. Nabiev, A. Sukhanova // In: Quantum Dots: Applications in Biology, Methods in Molecular Biology. Springer Science+Business Media NY, 2014. - V. 1199.-P. 55-66.

5. Brazhnik, K. Oriented conjugation of single-domain antibodies and quantum dots / K. Brazhnik, I. Nabiev, A. Sukhanova // In: Quantum Dots: Applications in Biology, Methods in Molecular Biology. Springer Science+Business Media NY, 2014. - V. 1199. - P. 129-140.

6. Krivenkov, V.A. Photoinduced modification of quantum dot optical properties affects bacteriorhodopsin photocycle in a (quantum dot)- bacteriorhodopsin hybrid material / V.A. Krivenkov, D.O. Solovyeva, P.S. Samokhvalov, K.I. Brazhnik, G.E. Kotkovskiy, A.A. Chistyakov, E.P. Lukashev, I.R. Nabiev // Journal of Physics: Conference Series - 2014. - V. 541.-Article 012045.

7. Бражник, К.И. Новые направления в исследовании и ранней диагностике рака с применением детекционных систем на основе флуоресцентных нанокристаллов / К.И. Бражник, М.А. Барышникова, З А. Соколова, И.Р. Набиев, А.В. Суханова // Российский биотерапевтический журнал.-2013.-Т. 12.-№3.-С. 11-24.

Тезисы докладов

1. Brazhnik, К. Development and potential applications of microarrays based on fluorescent nanocrystal-encoded beads for multiplexed cancer diagnostics / K. Brazhnik, R. Grinevich, A. Efimov, I.R. Nabiev, A. Sukhanova// SPIE Photonics Europe, Brussels, Belgium, 14-17 March 2014. Abstract 9129-86. - P. 146-147. - Invited paper.

2. Krivenkov, V.A. Photoinduced modification of quantum dot optica] properties affects bacteriorhodopsin photocycle in a (quantum dot)-bacteriorhodopsin hybrid material / V.A. Krivenkov, D.O. Solovyeva, P.S. Samokhvalov, K.I. Brazhnik, G.E. Kotkovskii, E.P. Lukashev, A.A. Chistyakov, I.R. Nabiev // 1st International School and Conference "Saint-Petersburg OPEN 2014", Saint-Petersburg, Russia, 25-27 March 2014. Book of abstracts. - P. 182-184.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген AT - антитело

ДГПЖ - доброкачественная гиперплазия предстательной железы ИФА- иммуноферментный анализ KB - коэффициент вариации КТ - квантовые точки

ПСА - простатический специфический антиген

РМЖ - рак молочной железы

РПЖ - рак предстательной железы

РЭА - раковоэмбриональный антиген

РЯ - рак яичников

СО - стандартное отклонение

Подписано в печать:

11.12.2014

Заказ № 10410 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru