Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Минимальная резидуальная болезнь у детей с острым лимфобластным лейкозом В-клеточной линии (PRE-PRE-B, COMMON-ALL)



.'На правах рукописи

X

КЛЫКОВА

Екатерина Павловна

МИНИМАЛЬНАЯ РЕЗИДУАЛЬНАЯ БОЛЕЗНЬ У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ В-КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ (PRE-PRE-B, COMMON-ALL)

14.00.09 - Педиатрия 14.00.29 - Гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА -1996

Работа выполнена в ордена Ленина и ордена Трудово Красного Знамени Научно-исследовательском институ педиатрии Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор И.В. Кошель, доктор медицинских наук, профессор H.A. Торубарова.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.И. Курмашов, доктор медицинских наук, профессор В.Г. Савченко.

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

часов на заседании диссертационного сов< К001.24.01 в НИИ педиатрии РАМН по адре 117963, Москва, Ломоносовский проспект, д. 2/62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиот НИИ педиатрии РАМН.

Защита состоится

г. в 13

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

О.П.Фомина

последние годы на первый план в эеменной лейкозологии вышла проблема минимальной резидуальной езни.

Линимальной резидуальной болезнью (Minimal residual disease -D) называют минимальное количество лейкемических клеток в гном мозге и в периферической крови больных лейкозом в период иссии, выявляемое методами, превышающими чувствительность адартных морфоцитологических исследований.

Тредпосылкой для развития исследований по MRD было одно из овных положений лейкозологии о том. что более точное определе-общего объема лейкемических клеток в организме до и на фоне гния может повысить эффективность терапии, так как дает возмо'ж'-ть постоянного надзора за клоном. При этом особое внимание пялось развитию резистентности бластных клеток к лекарственным паратам, возникающей в процессе мутаций, количество которых, в ю очередь зависит от объема опухолевой массы. 1ейкемические клетки больных острым лейкозом в период лечения земиссии могут быть определены несколькими методами, которые ичаются по чувствительности. Наиболее чувствительными из них яются иммунофенотипирование и полимеразная цепная реакция, орые позволяют выявлять лейкемические клетки в концентрации

Методом иммунофенотипирования определяются специфические жеры на мембране клеток. Данный метод позволяет распределить !% острых лейкозов по их диагностическим линиям, так как осно-5ается на точной и биологически обоснованной классификации 1езни. В союзе с цитогенетикой и молекулярной биологией иммуно-гатипирование позволило выявить биологические и клинические различия в большой диагностической группе острых ÍK030B, что было существенным для мониторирования групп риска в

терапевтических исследованиях. Кроме того, выявление вариант атипичной экспрессии антигенов может быть использовано для поис минимальной резидуальной болезни.

Современные исследования по MRD направлены на решение nj блемы возможности предсказания рецидива болезни и обоснования i тенсификации терапии в позитивных по MRD случаях. К настояще моменту существует немало описаний клинических исследований пациентов с MRD (Drach et al, 1993; van Dongen et al, 1993; Camp; et al, 1995; reseach of St. Jude Children's Hospital. 1995; Scbrabbe et 1996). Согласно им, можно предсказать развитие рецидива у болы-с остаточным лейкемнческнм клоном за 1 - 7 месяцев до него. Бо того, отмечается гораздо более частое развитие рецидива у пациент позитивных по MRD. нежели у больных с негативными результате определения остаточного клона. Наряду с этим, существует rpyi пациентов с MRD, у которых рецидив не возникает никогда и эра кация всех лейкемических клеток не является необходимой. В э случаях развитие остаточного клона, по-видимому, контролиру« мало изученными механизмами клеточного взаимодействия на Teppi рии костного мозга.

Таким образом, диагностика MRD становится ключом к контр< за состоянием опухолевого клона, клинической эволюцией болезн] основанием для коррекции терапии.

Цель исследования. Выявить критерии диагностики минималь резидуальной болезни при остром лимфобластном лейкозе (OJIJI) клеточной линии и определить возможность их применения в кор ции курса лечения болезни и в прогнозировании рецидива.

Задачи исследования.

1) Проанализировать иммунофенотип костномозговых лимфобласт больных с OJIJI В-клеточной линии в острый период заболевания период рецидива по двум характеристикам: коэкспрессии антигенов

:мбране бластных клеток и интенсивности экспрессии мембранных экеров разных стадий клеточной дифференцировки. Определить возможность диагностики минимальной резидуальной 1езни на основе критериев, полученных при изучении особенностей лбран лейкемических клеток в острый период и в период рецидива. Выявить возможную связь между критериями риска ОЛЛ. объемом эводимой терапии, осложнениями, возникающими в ходе лечения и тичием в дальнейшем минимальной резидуальной болезни. Охарактеризовать супрессорно-иитотоксическую активность лимфо-тов костного мозга у детей с МЯО и без МЯО для оценки их роли поддержании ремиссии.

Научная новизна. Впервые для диагностики минимальной резиду-ьной болезни при ОЛЛ у детей был применен метод иммунофено-пирования лейкемических клеток с определением двух параметров: 1) ело клеток'со! специфическими антигенами на мембране и 2)-интен-вность экспрессии этих антигенов. Было показано, что характерной обенностью лейкемических клеток является асинхронность экспрессии новных В-клеточных. антигенов СОЮ и СО 19 с преобладанием спрессии СО 19.

Был сформулирован комплекс критериев для диагностики мини-шьной резидуальной болезни при В-линейном остром лимфобластном :йкозе , включающий следующие параметры:!) В анамнезе ОЛЛ В-[еточной линии: 2) В костном мозге количество С010+/С019+ геток превышает 5% на всю популяцию; 3) Асинхронность экспрессии ггигенов СОЮ/СО 19 с преобладанием антигена СО 19. Впервые с помощью предлагаемых критериев остаточные лейкемиче-ские клетки были выявлены в костном мозге детей в период ак-гавного лечения, после окончания поддерживающей терапии и в различные сроки ремиссии. Анализ клинических особенностей течения >ЛЛ и исходных параметров, характеризующих лейкемическую популя-

цию позволили нам впервые выявить зависимость между величин' фактора риска в момент диагностики ОЛЛ и наличием в дальнейш минимальной резидуальной болезни.

Практическая значимость. Своевременная диагностика минимальн резидуальной болезни позволяет мониторировать остаточный ленкеч ческий клон. Проведенные исследования позволили определг

наиболее значимые периоды исследования минимальной резидуальн болезни:

1) окончание индукции ремиссии ("33 день" протоколов ВРМ- 90 95).

2) конец 1-го года лечения.

3) период после завершения поддерживающей терапии. Выявление резидуальных клеток в период активного лечения 1

на этапе поддерживающей терапии требует коррекции тактики тераг в виде ее интенсификации или продления срока лечения.

Метод диагностики минимальной резидуальной болезни с исполь ванием иммунофенотипирования на проточном цитофлюориме внедрен в отделении гематологии и лаборатории цитохимии и яу ностических исследований НИИ педиатрии РАМН и рекомендуется , использования в гематологических отделениях научно-исследовательс институтов и стационаров.

Результаты работы доложены на конференции молодых уча НИИ педиатрии РАМН (1996), на симпозиуме "Человек и лекарст (1996).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 115 стр. махш писного текста. Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, ук; теля литературы, включившего 23 отечественных и 158 иностран: источников. Иллюстрирована 15 таблицами и 7 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Работа проводилась на базе отделения гематологии (руководитель [иники д.м.н., проф. И.В. Кошель) и лаборатории цитохимии и агностических исследований (руководитель д.м.н., проф. Р.П. арциссов) НИИ педиатрии РАМН.

Всего было обследовано 90 детей с острым лимфобластным лейком. Из них в острый период заболевания иммунологическое типиро-ние костномозговых лимфобластов было произведено у 56 больных, период рецидива у 19 пациентов. В период ремиссии различной про->лжительности было обследовано 28 детей, причем на 1-ом году юлюдения 9 человек (12 исследований), на 2-ом году - 6 детей (7 следований), на 3-ем году наблюдения - 6 пациентов (8 исследова-ш), на Фом году - 5 детей (7 иммунофенотипирований) и на 5-8 дах наблюдения - 8 пациентов (13 исследований). Части пациентов юводились повторные иммунофенотипирования. Кроме того, было >следовано 7 пациентов группы сравнения, в которую вошли дети с юнической тромбоцитопенической пурпурой, железодефицитной и 12-дефицитной анемиями, хроническим вирусным гепатитом В.

Клинический анализ проводился только у тех детей, которые в льнейшем были исследованы в различные периоды ремиссии на >едмет наличия МЯО. Это была группа из 28 пациентов с В-линей->1м острым лимфобластным лейкозом: больные с сошшоп-АЬЬ и рге-е-В-А1Х; из них 14 девочек (50%) и 14 мальчиков (50%). Возраст де-й варьировал от 1,5 лет до 14, средний возраст 5,63 года.

Общая группа пациентов подразделялась на 3 подгруппы, в соответствии с общепринятыми критериями риска протокола ВРМ-95. огласно этом критериям, в группу стандартного риска вошли дети в

возрасте от 1 до 6 лет, с количеством лейкоцитов в периферичеа крови <20x109/л и с хорошим ответом на лечение преднизолоно* первые 8 дней терапии. Группу среднего риска составили пациенть возрасте менее 1 года и более 6 лет, либо дети с количеством лей цитов периферической крови выше 20х10^/л и с хорошим ответом 8-дневный курс преднизолона. В группу высокого риска вошли бс ные с плохим ответом на недельный курс преднизолона и налич цитогенетических аномалий.

Группу стандартного риска (SRG) в нашем исследовании состав 17 детей, из них 9 девочек и 8 мальчиков в возрасте от 1,5 до 5 (средний возраст - 3,2 года). 11 пациентов этой группы получ терапию по программе BFM-90, 2 - по программе BFM-83, 1 ребе лечился курсами "синхронизирующей" терапии и 3 - по индивиду; ным курсам.

Группу со средним фактором риска (MRG) составили 6 п; ентов, 2 девочки и 4 мальчика в возрасте от 5 до 14 лет. 4 дете этой группы лечились по программе BFM-90, среди них 1 пащ получил 5 блоков терапии высокого риска, 2 лечи ."синхронизирующими" курсами.

В настоящий момент все дети группы стандартного и сред риска (23 пациента) находятся в полной ремиссии длительностью < года до 8 лет; согласно морфологическим исследованиям ни у од] из них за период наблюдения не отмечалось рецидива.

В группу высокого риска (HRG) в нашем исследовании вошл деггей, 3 девочки и 2 мальчика, в возрасте от 1,5 до 10. 4 из этих д были первичными больными, один пациент поступил в кпинш рецидивом заболевания. Все дети лечились по программе BFM-90, получили по 9 блоков терапии высокого риска, 1 ребенок получ! и еще 1 - 7 блоков. Один ребенок погиб после проведения 9-го 6j на фоне развившихся острого гепатита В и индуцированной ranoi

кроветворения. У одного ребенка в дальнейшем отмечалось реци-нрование процесса. 3 в настоящий момент находятся в полной нической ремиссии длительностью от 1 года до 4 лет.

Для обследования пациентов применялись общепринятые клини-сие и лабораторные методы исследования. Для мониторинга лейке-[еской популяции основным был метод определения дифференциро-ных антигенов клеток с помощью проточной цитофлюорометрии с иной меткой на аппарате FACStrak фирмы Becton Dickinson. Для ;ирования костномозговых клеток применялась широкая панель юклональных антител, включающая Т- и В-клеточные, а также .'лоидные маркеры (табл. 1).

При первичном поступлении ребенка в стационар проводилось диаг-гтическое исследование костного мозга. Контрольные исследования ггного мозга проводились на "33" день I протокола программы М-83 и 90, перед II протоколом, затем через 3 месяца, после начала здерживающей терапии и далее каждые полгода. У пациентов, пучавших терапию по индивидуальным протоколам исследование ггного мозга проводилось по мере необходимости.

Ранние T- и В-лимфоцитыСОЮ I___

CD34 j__

■ HLA-DR ^Антиген В-клеток всех стадий дифференцироак

Т-лимфоциты ■ СОЗ ¡Зрелые Т-лимфоциты_;

С04 ГГ-хелперы_______

' CD8 iT-супрессоры__

CD5 ¡Антиген всех стадий Т-дифференцировки___

CD7 'Антиген всех стадий Т-дифференцировки_.

1__

Б-лимфоциты CD19 ^Антиген всех стадий В-дифференцировюд

CD20 Антиген более зрелых В-клеток _

CQ22 'Антиген всех стадий В-дифференцировки_

Гранулоциты и моноциты С033 Антиген всех стадий дифференцировки

' CD13 Антиген всех стадий дифференцировки

табл.1

Костномозговые клетки, полученные путем аспирации при пункции грудины (или переднего крыла подвздошной кости) лизпровались, а

затем осаждались с помощью центрифугирования. К полученном субстрату добавляли моноклонапьные антитела, меченые зеленой (Fit и красной (Phicoeritrin) меткой. После инкубации полученную су пензию исследовали с помощью проточной цитофлюорометрии » аппарате FACStrak фирмы Becton Dickinson, применяя програм\ Simulset. Количество исследуемых лимфоцитов варьировало от 3000 ; 15000 и выше.

Ш19 HI

О.

л Г"» S к ..ЩШу

«Г ~ О

¿ о сою

юо 10" 102

FL1\CD3 Leu4—> рис Л

Лимфоцитарное окно устанавливалось вручную, согласно типично» расположению популяции лимфоцитов, выявляемой при помощи тес LeucoGATE (CD45/CD14).

При изучении MRD количество клеток, позитивных по тому hj иному антигену пересчитывали на всю костномозговую популяцию.

Полученные данные по количественному анализу лимфоцитарных популяций костного мозга в дальнейшем анализировали качественно помощью графического редактора - программы LYSYS-II, когда изме рялась интенсивность экспрессии антигенов. Исследуя необходимый нам регион, на гистограмме по горизонтальной шкале отмечалась интенсивность экспрессии, а по вертикальной устанавливалась частот событий с той или иной экспрессией. Таким образом, используя прс граммы Simulset и LYSYS-II можно было оценить 2 основных пара метра: количественный (процентное содержание позитивных по том;

[ли иному антигену клеток) и качественного (интенсивность спрессии маркеров) (рис. 1 и 2).

Иммуноцитологическое исследование костномозговых лимфобластов остром периоде заболевания было произведено у 56 больных. В ависимости от иммунофенотипа мы выделили 3 основные группы ¡ацнентов: с pre-pre-B-ALL - 11 человек, с common-ALL - 33 ребенка, с "-ALL - 12 детей.

Иммуноцитологическое типирование костномозговых лимфобластов i период рецидива было произведено у 19 больных. 20 исследований.

Также были выделены 3 иммунологические подгруппы: рге-рге-В-4LL - 3 ребенка. connmoii-ALL - 13 пациентов. T-ALL-2 человека.

Проведенные исследования показали, что в нашем наблюдении ^отношение вариантов ОЛЛ при диагностике соответствовало стан-1артному распределению: pre-pre-B-ALL - 19.64%. common-ALL - 58.93V Г-ALL - 21.43%.

Нами были обнаружены следующие необычные клоны: при common-ALL наблюдалась коэкспрсссия Т-клеточных маркеров (CD3: CD5: CD7)

и миелоидных антигенов CD33 и CD 13. Варианты с козксирессией common-ALL с миелоидными маркерами (CD10+/CD19+/CD33+/CD13+)

рнс.2

относились • к бифенотипическим вариантам, неоднократ! описываемым в литературе.

Нами найдены случаи ко-экспрессии c-ALLA при T-AL (популяция CD7+/CD10+ - 87%). Принадлежность к T-ALL у данш пациентов сомнения не вызывала, т.к. имелась клиническая картина клеточного лейкоза, а при иммунофенотипировании на мембра лимфобластов выявлялись Т-клеточные маркеры разных стадий диф<| ренцировки в подавляющем проценте, количество же HLA-D антигена было невелико.

У одного ребенка с T-ALL была обнаружена популяция клеток иммунофенотипом CD7+/CD13+ - 25%.

При исследовании пациентов в рецидиве ОЛЛ мы выявляли ат пичные сочетания антигенов, аналогичные острому периоду заболе: ния.

Исследование иммунофенотипа 9 больных с ОЛЛ в остр периоде и в период рецидива показали, что у больных в остр периоде с наличием дифференцировки клеток по pre-B (HL DR+/Sig+) или Т-клегочному (ОК.Т6+) типу при рецидиве на бласп определялись только антигены клеток-предшественников, т.е. 6oj "молодой" вариант.

У пациентов с pre-pre-В- вариантом заболевания лимфобласты период рецидива ОЛЛ приобретали большую зрелость, когда мембране определялся c-ALLA.

У больных с common-ALL изменений фенотипа бластов не наб; дали.

Известно, что основой определения иммунофенотипа являются данные об антигенах, экспрессирующихся на мембране при нормал ной клеточной дифференцировке. Лейкемические клетки несут на cei те же антигены, что и нормальные гемопоэтические предшественнш поэтому для диагностики MRD в различные периоды ремиссии мы

логли опираться только на определенный набор антигенов на клеточ-эй мембране. Так как мы исследовали на предмет наличия или гсутствия МЯО в период ремиссии только пациентов с В-линейным :йкозом, то нас прежде всего интересовала экспрессия основных аркеров-СОЮ и СЭ19. По данным литературы увеличение популя-ии ранних предшественников В-клеток. несущих маркеры С0Ю/С019 ожет наблюдаться в различных ситуациях, когда нет лимфопролифе-ативного заболевания. Так. работами РагаЬа!. БапсИшиэ было пока-1но. что ' верхним пределом для популяции С010+/С019+ для регене-ирующего костного мозга был уровень 5% от всей костномозговой опуляции клеток. При этом интенсивность экспрессии антигенов на доровых клетках изменяется по мере дифференцировки: для СОЮ в орме она должна уменьшаться, а для СО 19. напротив, возрастать.

Чтобы найти критерии для диагностики МЯО необходимо было не олько исследовать иммунофенотип, но и определить интенсивность кспрессии маркеров СОЮ и С019 в остром периоде, при рецидиви-ювании процесса, на различных этапах лечения и во время ремиссии. Выяснилось, что в остром периоде болезни интенсивность свечения маркера СОЮ на лейкемических клетках была всегда высокой, в среднем 1060 (от 600 до 2000) (рис.3). Экспрессия маркера СЭ19 в этот период была еще более интенсивной - в среднем 2600 (от 1000 до ¡000). Мы обнаружили 3 сочетания интенсивности экспрессии в острый период: С0Ю>С019; С010=С019; С010<С019. В наших исследованиях только в первом варианте интенсивность экспрессии была закономерной - на молодой популяции С010+/С019+- экспрессия СОЮ была ниже. В других же случаях мы видели обратную картину. Таким эбразом, было установлено, что имелся дисбаланс экспрессии маркеров на мембране лейкемических клеток в остром периоде болезни. При

этом, во всех случаях свечение антигена СО 19 было чрезвычайно высоким (>500). Таким образом, была выявлена качественная особен-

ность фенотипа общего подварианта ОЛЛ - дисбаланс интенсивное] экспрессии антигенов.

ИНТЕНСИВНОСТЬ ЭКСПРЕССИИ

в различнее периоды ОЛЛ

3000

2500:---

2000 г !

1500 г'

100

50

острый п-х рецидив Акт. лен. ПТ Ш СРЮ ГЦ С

С019

МИО без МЯО контр, труп. 3 С034

В период рецидива нам также удалось проанализировать интено ность экспрессии антигенов. Свечение при рецидивировании заболе! ния отличалось от острого периода. Экспрессия СОЮ на лейкеми' ских клетках была низкой - 100. экспрессия СО 19 оставалась очень в сокой высокой - от 500 до 1000. что также свидетельствовало о дис( лансе экспрессии.

Таким образом, хтя диагностики минимальной резидуальной ( лезни у больных с В-линейным ОЛЛ и. в частности, с соттоп-АЫ. рге-рге-В-А1Х были использованы 2 показателя: наличие антига СЭ10 и С019 на мембране в количестве >5% и неравномерность экспрессии в пользу антигена С019.

Нами было обследовано 28 пациентов в различные периоды рем сии. Анализ проводился в период активного лечения, на этапе и держиваюшей терапии и после ее отмены.

Кроме того, была обследована группа сравнения, описанная выи: В группе сравнения средний объем популяции С010+/СЭ19+ был 4,37%. у 3 из 7 пациентов отмечалась большая (>5%) популяция

'D10+/CD19+ клеток - до 14,26% в одном исследовании, количество : CD34+ лимфоцитов не .было высоким - 1.31%. Эти данные были алогичны результатам исследований L.M. Sandhaus et al, 1993; id well et al. 1992.

У больных с ОЛЛ на этапе активного лечения и поддерживающей рапии объем популяции CD10+/CD19+ был невелик: 0.32% и 1,3% ответственно. Представляло интерес и количество ранних стволовых [еток CD34, оно в этот период было также небольшим: 0.6% и 39%.

Пациенты после отмены поддерживающего лечения разделились I 2 группы.

В первой группе - с чистом CD10+/CD19+ клеток <5% {без "MRD") (5 щиентов, 7 иммунофенотипирований) отмечалось понижение клеточ->сти костного мозга - 77.775/мм-\ процент лимфоцитов костного мозга .ш высок: 19,88%, бластных клеток выявлялось, согласно морфологи-:ским исследованиям, немного - 1,14%. В этой группе средний объем шуляции CD10+/CD19+ составлял в среднем 1,52%, количество D34+ лимфоцитов было 1,2%.

Во второй группе детей (10 пациентов, 16 иммунофенотипирований) ; увеличенной популяцией CD10+/CD19+ (с "MRD"), как и в первой гмечалась пониженная клеточность костного мозга - 96.718/мм^, увели-:нное количество лимфоцитов - 25,79% и небольшой процент бластных 1еток - 1,2%. Однако, рассматривая популяцию В-лимфоцитов, мы 1ходили необычайно высокий процент популяции CD10+/CD19+ ),38% в среднем (до 22% в отдельных исследованиях).. Достаточно .1СОКИМ было и количество CD34+ лимфоцитов: 4,56% (26,04% в ihom из исследований).

Мы имеем данные динамики количества CD10+/CD19+ клеток во

время поддерживающей терапии и после ее отмены у 4 больных в этой группе. Было отчетливо видно резкое увеличение содержания в

косгном мозге лимфоцитов с ранними B-клеточными маркерами посл( отмены поддерживающей терапии.

После отмены поддерживающей терапии мы также смогли просле дить динамику увеличения CD10+/CD19+ популяции в группе < "MRD" у 4 больных. У одного пациента отмечалось уменьшена количества этих клеток, у троих, напротив, объем этой популяции i костном мозге наростал.

Анализируя данные нашей работы, выяснилось, что после отмен* поддерживающей терапии наблюдалось резкое увеличение количеств; исследований с популяцией CD10/CDI9>5% и дисбалансом экспресси: этих маркеров (рис. 4). Это особенно выявлялось на 4-8 годах наблго дения, когда костный мозг наших пациентов уже не мог считатьс регенерирующим. Таких исследований отмечалось 14 из 24.

Суммируя полученные результаты, мы пришли к заключению, чт о MRD при B-линейном лейкозе можно думать при сочетании еле дующих факторов:

1) в анамнезе BCP-ALL;

2) в костном мозге количество CD 10+/CDI9+- клеток превышает 5% н всю популяцию;

3) высокий уровень экспрессии антигена CD 19 на лимфоцитах (>50( разным уровнем экспрессии CD 10 ;

4) увеличение содержания в костном мозге CD34+лимфоцитов;

5) обнаружение атипичной экспрессии, не встречающейся на нор мал] ных предшественниках.

Проведя анализ клинических данных и особенностей лечения групп: из 10 детей с признаками наличия минимальной резидуальной болезн: выяснилось, что 1 пациент из группы SR лечился по индивидуально! программе, значительно редуцированной по сравнению с программой BFM-90 и явно получил недостаточную цитосгатическую нагрузку, 1 ребенок из группы VIR получал лечение "синхронизирующими" кур-

ами, т.е. более мягкими по сравнению с современным лечением, 1 ре-)'енок из SRG лечился по программе BFM-83 без каких-либо значительных осложнений. Остальные семеро детей лечились по программе 3FM-90. причем 4 из них входили в группу SR (лишь у одного паци-:нта отмечались значительные осложнения на фоне лечения), а 3 - в -руппу высокого риска.

Таким образом, в группах стандартного и среднего риска не удаюсь выявить четкой зависимости между уровнем риска у пациентов, осложнениями в ходе терапии, объемом лечения и наличием в дальнейшем MRD. В группе высокого риска такая зависимость была отчетливой.

Ведущим в наших исследованиях явился вопрос о сроках монитори-рования. качестве и объеме иммунофенотнпирования и возможности контроля за остаточным клоном у всех обследуемых больных. Как показывают данные литературы по этому вопросу и наши собственные исследования, наиболее важны следующие периоды острого лейкоза для мониторирования MRD:

1) конец индукции ремиссии, когда начинают появляться лекарствен-норезистентные клетки ( в протоколе BFM-90 и 95 это соответствует 33 дню терапии).

2) конец 1-го года лечения - период наиболее частого возникновения ранних рецидивов.

3) после прекращения поддерживающей терапии, когда бластные клетки могут появиться вновь.

Для пациентов с длительной ремиссией позитивные по минимальной резидуалъной болезни исследования имеют больше научное значение, так как рост неопластического клона сдерживается, по-видимому, пока мало изученными механизмами.

По данным Drach et al, 1993, van Dongen et al, 1993, Campana et al, 1995 в позитивных по MRD исследованиях предсказать развитие

рецидива возможно за 1-7 месяцев до него. Известно также, чт гораздо чаще рецидивирование ОЛЛ происходит у пациентов с р зидуальным клоном. Однако, рецидив часто не развивается, несмот]: на наличие минимальной лейкемической популяции. Возможно, » росту препятствует клеточное микроокружение на территории костно! мозга, включающее Т-лимфоциты, макрофаги, клетки стромы, межкл точные субстанции.

В нашей работе мы проанализировали состояние супрессорн цитотоксических субпопуляций в костном мозге больных ОЛЛ в ра личные периоды заболевания. Пациенты рассматривались в перис поддерживающей терапии и после ее отмены.

Во время поддерживающего лечения выявились четкие закономерн сти: если на 1-ом году отмечалось выраженное снижение количесг: зрелых Т-лимфоцитов (26,8%) как за счет хелперов (10,4%), так и счет супрессоров (17,8%), то к окончанию поддерживающей тераш мы видели нормализацию числа зрелых Т-лимфоцитов (48,4%) п] остающихся ниже нормы Т-хелперах (16,6%) и повышенном количесг Т-супрессоров (31%). В целом, состояние активности Т-клеток в кон поддерживающей терапии характеризовалось увеличением фракций лимфоцитов, обладающих супрессорной и цитотоксической функции суммарная популяция С08+/С016+56+ составила 54%.

После отмены поддерживающей терапии пациенты разделялись на подгруппы: "с МЯО" и "без МЯО". Анализируя период окончан поддерживающего лечения и окончания наблюдения за больными (: годы) в группе "с МЯО" выяснилось, что показатели Т-субпопуляц приблизительно равны в эти периоды (СОЗ+-41,2%, СОЗ+НЬА-ОИ.-8,5%, С04+ - 21%, С08+- 27,25%, СО 16+56 - 23,7%). В группе же МИХ)" в конце наблюдения было меньше зрелых Т-лимфоцитов натуральных киллеров (СОЗ+ - 32%, СОЗ+НЬА-ОЯ+ - 7,25%, С04-18,17%, С08+ - 28,85%, С016+56 - 15,4°

Кроме' того, после отмены поддерживающей терапии у всех детей -мечалась чрезвычайно интенсивная экспрессия антигена CD8 на :мбране клеток(2450 в группе "с MRD" и 2580 в группе "без MRD", дксимально в обеих группах до 5000). Столь высокая экспрессия олекул давала возможность предположить связь данных с цитотокси-;ской и супрессорной функцией лимфоцитов.

Анализ популяций лимфоцитов в различные периоды ремиссии эзволяет сделать следующие предположения: основными популяциями, зменяющимися в период поддержания длительной ремиссии являются зелые СОЗ+-лимфоциты, CD8+ лимфоциты (супрессоры) и CDI6+56+ нмфоциты (естественные киллеры). У детей, находящихся в длитель-ой ремиссии, количественный состав субпопуляций Т-лимфоцитов риближается к норме. Отличием является высокий процент естествен-ых киллеров и интенсивная экспрессия антигена CD8. свидетель-гвующая о высокой активности этих клеток. Можно предположить, то именно эти две популяции Т-клеток участвуют вместе с другими легочными группами на территории костного мозга в механизме тановления и поддержания ремиссии.

ВЫВОДЫ:

. Распределение вариантов ОЛЛ по иммунофенотипу в проведенных ^следованиях соответствует стандартному. Обнаруживаются варианты [типичной ко-экспрессии маркеров. При common-ALL встречаются (кспрессия Т-клеточных антигенов - CD3. CD5 и CD7. а также миело-щных антигенов - CD 13 и CD33. При Т-ОЛЛ была найдена ко-экс-трессия с-ALLA и CD 13. В рецидиве ОЛЛ коэкспрессия маркеров шалогична острому периоду заболевания.

Î. Для характеристики лейкемического клона при иммунофенотипиро-зании с помощью проточной цитофлюоромегрии может быть использован качественный показатель - интенсивность экспрессии мембранных

антигенов. Для неопластических клеток характерна асинхронная эк! прессия антигенов CD10/CD19 с преобладанием CD19, что может бьп применено для характеристики резидуальных клеток в период реми сии.

3. Для диагностики MR.D при common-ALL должны быть использ( ваны 2 показателя: содержание в костном мозге популяш' CD10+/CDI9+ >5% в сочетании с дисбалансом экспрессии CD10/CD! (С D19>750) на мембране лимфоцитов.

4. В группе "высокого риска" выявляется зависимость между крит риями риска при диагностике заболевания и наличием впоследств! MRD. В группах "стандартного" и "среднего" риска корреляции меж; величиной фактора риска, объемом проведенной терапии, осложн ниями. возникающими в ходе лечения и присутствием в дальнейшс MRD выявить не удалось.

5. Клиническое значение диагностики MRD определяется возмо: ностью мониторинга интенсивности и длительности проводимой тер пии: выявление MRD в период интенсивного лечения свидетельству о наличии лекарственной резистентности неопластического клоь позитивное по MRD исследование в период поддерживающей терап! является показанием к ее удлинению; диагностика MRD в отдаленн] периоды ремиссии требует повторного мониторинга.

6. Наблюдение за детьми с длительной ремиссией и MRD не выяви; к настоящему моменту наличия рецидива. Анализ популяций лимфой

тов костного мозга этих больных позволяет сделать предположение что высокий процент естественных киллеров и интенсивная экспресс! рецептора CD8 свидетельствуют о высокой активности этих клеток ; возможно, участии их вместе с другими клеточными группами на территории костного мозга в механизме поддержания ремиссии.

-19В клинической практике для выявления остаточных лейкемических еток целесообразно использовать метод иммунофенотипирования с [ределением числа клеток со специфическими маркерами и оценкой ггенсивности их экспрессии на мембране.

. Наиболее важны следующие периоды для исследования минималь-)й резидуальной болезни:

окончание индукции ремиссии ("33 день" протоколов BFM - 90 и >); 2) конец первого года лечения; 3) период после завершения полеживающей терапии.

При обнаружении в период активного лечения ("33 день" прото-эла) резидуальных лейкемических клеток пациент должен быть перевеян в группу высокого риска с использованием протоколов лечения пя этой группы риска. Обнаружение минимальной резидуальной олезни на этапе поддерживающей терапии требует продления сроков ечения с последующим контрольным исследованием костного мозга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

. Результаты лечения острого лимфобластного лейкоза у детей по рограмме BFM-90 (1991-1995 гг.)// "От науки к практике": Российская онференция по детской гематологии: программа и сборник тезисов -Занкт-Петербург, октябрь 1995. - С. 127. (Соавт. И.В. Кошель, О.А. 1олякова, Н.А. Торубарова и др.).

2. Контроль за лейкемическими клонами в различные периоды острого ¡ейкоза у детей, леченных по программам BMF (1991-1995)// "Человек i лекарства": программа и сборник тезисов. - Москва, апрель 1996. --.144. (Соавт. Кошель И.В., Торубарова Н.А., Полякова О.А.).

3. Immunophenotype of bone marrow lymphocytes: pre-B-cells of patients •vith and without leukemia.//Médical and Pédiatrie Oncology: International

Society of Pediatric Oncology. - Vienna, Austria, October 1996. - P. 35"? (co-author Semikina E., TorubarovaN., Koshel I.).

4. The result of acute lymphoblastic leucemia treatment in accordance wit! BFM-90 protocol (1991-1995). II Medical and Pediatric Oncolog) International Society of Pediatric Oncology. - Vienna, Austria, Octobe 1996.-P,357. (co-author Koshel 1., Polyakova O.. Torubarova N.).