Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Межклеточные взаимодействия и локомоторная активность трансформированных эпителиоцитов

ЖИТНЯК Ирина Юрьевна

МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И ЛОКОМОТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЭПЙТЕЛИОЦИТОВ

Специальность 14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

1 л ДПР 2011

4843900

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени H.H. Блохина РАМН (директор - академик PAHYi РАМН, профессор М.И. Давыдов).

Научный руководитель:'- доктор биологических наук 1 H.A. ГЛУШАНКОВА'

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Н.Л. ЛАЗАРЕВИЧ

доктор биологических наук И.Б. АЛИЕВА

Ведущая организация: Российский кардиологический научно-производственный * комплекс Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится « ^^» ¡/Л-Сс^х 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН по адресу 115478 Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан « »___ 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор . Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из основных задач современной онкологии является изучение наиболее опасного свойства злокачественных опухолей - способности к инвазии и метастазированию. Разрушение стабильной межклеточной адгезии и приобретение способности к миграции играет существенную роль в развитии иивазивлого потенциала трансформированных эпителиоцитов. В настоящее время общепринятой точкой зрения является представление о том, что программа эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), при которой дифференцированные эпителиальные клетки превращаются в фибробластоподобные клетки, способные к миграции, является основным механизмом эволюции клеток карцином. Угнетение экспрессии Е-кадхерина и связанное с этим разрушение межклеточной адгезии часто рассматривается как пусковой механизм инвазии и диссеминации опухолевых клеток. Вместе с тем хорошо известно, что ряд карцином человека, в частности, протоковые карциномы молочной железы, карциномы толстой кишки, меланомы могут сохранять экспрессию Е-кадхерина (Gillett et al., 2001, Hegerfeldt et al., 2002). Показано также, что опухолевые клетки способны к миграции и инвазии и в отсутствие ЭМП (Tarin et al., 2005, Wicki et al., 2006, Wolf et al., 2007), что свидетельствует о возможности существования механизмов запуска инвазии, не связанных с угнетением экспрессии и аккумуляции на мембране Е-кадхерина. Несмотря на то, что значительное количество исследований посвящено изучению Е-кадхерина как опухолевого супрессора, до сих пор остается недостаточно исследованным вклад межклеточных адгезионных контактов (АК), образованных Е-кадхерином, в реализацию миграционной активности трансформированных эпителиоцитов. В настоящее время появились новые возможности видеомикроскопических исследований живых клеток, позволяющие детально изучить изменения межклеточных взаимодействий при неопластической трансформации.

Также весьма важным представляется изучение функциональной роли структур актинового цитоскелета, которые, как известно, в значительной степени определяют морфологию, локомоторные и адгезивные характеристики клеток. Хорошо известно, что неопластическая трансформация может приводить к кардинальным изменениям актинового цитоскелета. Детальное исследование перестроек актинового цитоскелета в трансформированных эпителиальных клетках позволит прояснить их вклад в разрушение стабильной межклеточной адгезии и появление у эпителиальных клеток способности перемещаться на значительные расстояния. Сравнительные исследования перестроек актинового цитоскелета, АК, характера межклеточных взаимодействий при трансформации эпителиальных клеток помогут прояснить основные закономерности ранних этапов опухолевой прогрессии.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было сравнительное исследование особенностей фенотипических изменений, закономерностей межклеточных взаимодействий и миграционной активности эпителиоцитов линий IAR, сохранивших или утративших экспрессию Е-кадхерина в результате трансформации.

Задачи исследования:

1. Исследовать особенности морфологических изменений Ras-трансформированных производных эпителиоцитов линии IAR-2, как сохранивших,

3

V,

так и утративших экспр.ессик) Е-кадхерина, а также эпителиоцитов IAR после трансформации химическими канцерогенами либо претерпевших спонтанную трансформацию.

2. Изучить перестройки актинового цитоскелета в трансформированных эпителиоцитах IAR.

3. Изучить изменения спектра экспрессируемых кадхеринов, исследовать организацию межклеточные адгезионных контактов и их связь со структурами актинового цитоскелета в трансформированных эпителиоцитах IAR.

4. Провести сравнительные видеомикроскопические исследования псевдоподиальной активности' при межклеточных взаимодействиях в культурах нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR.

5. Исследовать изменения плотных контактов при трансформации эпителиоцитов IAR. .

6. Исследовать локомотррную активность трансформированных эпителиоцитов IAR на двумерном субстрату и миграционную активность в миграционных камерах.

7. Оценить влияние экспрессии экзогенного Е-кадхерина на морфологию, адгезионные характеристики и локомоторную активность трансформированных эпителиоцитов IAR.

Научная новизна и практическая значимость работы

В представленной работе при исследовании культур эпителиоцитов линий IAR, трансформированных мутантным онкогеном RAS и химическими канцерогенами, было показано, что неопластическая трансформация вызывает два типа морфологических изменений: 1) классический ЭМП, при котором эпителиальные клетки приобретают фибробластоподобный фенотип и утрачивают экспрессию Е-кадхерииа; 2) морфологическую трансформацию, при которой клетки частично сохраняют эпителиальные характеристики, растут в культуре в виде монослоя и формируют Е-кадхерин-содержащие АК.

Впервые обнаружено, что исчезновение типичного для эпителиоцитов краевого актинового пучка в трансформированных эпителиоцитах изменяет характер межклеточных взаимодействий, вызывая угнетение контактного паралича псевдоподиальной активности и разрушая стабильную межклеточную адгезию.

Впервые обнаружены изменения пространственной организации Е-кадхерин-содержащих АК эпителиоцитов IAR-6-1 и IAR1170 в результате трансформации: непрерывные тангенциальные АК, характерные для нетрансформированных эпителиоцитов, замещаются точечными и радиальными контактами, ассоциированными с прямыми актиновыми пучками. Впервые обнаружена реорганизация плотных контактов в трансформированных эпителиоцитах IAR.

Впервые установлено,- что присутствие Е-кадхерина в АК трансформированных эпителиоцитов влияет на характер их миграции: клетки IAR1170 и IAR-6-1, сохранившие Е-кадхерин в АК, могут мигрировать как индивидуально, так и коллективно, тогда как клетки IAR1162, утратившие экспрессию Е-кадхерина, способны лишь к индивидуальной миграции. Показано, что экспрессия экзогенного Е-кадхерина в клетках IARÍ162 частично восстанавливала эпителиальный фенотип, а также способствовала появлению у клеток способности к коллективной миграции.

Изучение механизмов функциональной взаимосвязи реорганизации актинового цитоскелета и АК при неопластической трансформации эпителиоцитов, изменяющей межклеточные взаимодействия и приводящей к разрушению стабильной

межклеточной адгезии и миграционной активности, расширяет наши представления о закономерных измениях, происходящих в трансформированных клетках на ранних этапах инвазии и метастазирования. Флуоресцентно-микроскопическое исследование пространственной организации АК в клетках опухолей может помочь в выявлении первых признаков их злокачественного перерождения.

Апробация работы

Диссертация апробирована на совместной научной конференции лаборатории механизмов канцерогенеза, лаборатории генетики опухолевых клеток и лаборатории механизмов химического канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохипа РАМН 30 сентября 2010 г.

Материалы диссертационной работы были представлены на конференциях «Петровские чтения 2008» (Санкт-Петербург, 2008); II московской региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2009); 13-й международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009); школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала (Санкт-Петербург, 2009); международном симпозиуме "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies" (Пущино, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 127 страницах, содержит 46 рисунков и 3 таблицы и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы», который включает 285 цитируемых источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры

В работе была использована постоянная линия нетрансформированных иммортализованных эпителиоцитов IAR-2, полученная из эксплантата печени крысы (Montesano et al., 1975). Линии эпителиальных клеток IAR1162 и IAR1170, трансформированные онкогеном N-A^S, были получены после введения кДНК мутантного гена человека N-RASV12 (Stromskaya et al., 1995) в составе вириона ретровируса (pPS/hygro) в клетки исходной линии IAR-2 (Gloushankova et al., 1994). Клетки клонов 1162СЗ и 1162D3 были трансфицированы плазмидой BlEcwt (Chitaev and Troyanovsky, 1998), несущей кДНК гена CDHI (Е-кадхерин). В результате клонирования и отбора трансформантов были получены клоны, экспрессирующие экзогенный Е-кадхерин. Также в работе были использованы линии эпителиоцитов IAR-2-31, IAR-6-1, трансформированных химическими канцерогенами, и спонтанно трансформированная линия IAR-6-7 (Montesano et al., 1975).

Фиксация клеток

Для флуоресцентного окрашивания актиновых филаментов клетки фиксировали 3,7% раствором параформальдегида. Для иммунофлуоресцентного окрашивания белков межклеточных контактов (Е-, N-кадхерина, окклюдина) применяли фиксацию метанол-ацетоном (1:1). Для двойного флуоресцентного окрашивания Е-кадхерина и актиновых филаментов клетки фиксировали 1% раствором параформальдегида на среде L-15 (Sigma-Aldrich, США).

Микроскопия

Клетки исследовали с помощью микроскопов Axioplan (Zeiss, Германия) или Nikon Eclipse Ti (Nikon, Япония). Фотосъемку и видеосъемку осуществляли с помощью цифровых камер Olympus DP70 с программным обеспечением DP Controller (Olympus, Япония) и Hamamatsu с программным обеспечением NIS-Elements AR (Nikon, Япония) или Wasabi 1.5 (Hamamatsu, Япония).

Морфометрия

Изображения одиночных клеток использовали для морфометрического анализа. Контуры клеток были проанализированы с помощью программы TRACER VI. 10, при этом определяли площадь, дисперсию, элонгацию, периметр клеток (Dunn and Brown, 1986).

Анализ изображений

Локомоторную активность клеток исследовали с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной (DIC) видеомикроскопии. Измерения скоростей протрузий и ретракций производили с помощью кимограмм (Hinz et al., 1998), построенных в программе ImageJ (Национальный институт здоровья, США). Для определения перемещений, и скоростей индивидуальных клеток в культуре на последовательностях видеокадров, полученных каждые 15 мин в течение 6 ч, в программе ImageJ строили треки движения клеток. Параметр направленности вычисляли как отношение перемещения клеток к пройденному пути.

Миграционная активность

Миграционную активность клеток исследовали в миграционных камерах BD Bio-Coat (Becton Dickinson, США) с порами в фильтрах диаметром 8 мкм через 20 ч после рассева. Фильтры фиксировали 100% метанолом и окрашивали DAPI (Sigma-Aldrich, США), после чего нижнюю поверхность фильтров исследовали микроскопически с использованием 20х объектива.

Иммуноблоттинг

Вестерн-блот анализ проводили с использованием ячейки Mini-Protean 3 Cell (Bio-Rad, США). В качестве лизирующего буфера использовали буфер RIPA с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (Sigma-Aldrich, США). Перенос осуществляли на PVDF мембраны (GE Healthcare, США). Детекцию белка проводили с помощью ECL Plus kit (GE Healthcare, США). Хемшпоминесцентные изображения были получены с помощью 'прибора Chemi-Smart 2000 (Vilber Lourmat, Франция) и программного обеспечения Chemi Capt (Vilber Lourmat, Франция).

Анализ туморогепности

Для оценки туморогенности трансформированных клеток использовали бестимусных голых мышей. Динамику роста опухолей оценивали каждые 7 дней. Через 3 недели для 1162F4 и через 4 недели для остальных линий животных забивали и взвешивали выросшие опухоли.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морфологическая трансформация эпителиальных клеток.

^трансформированные клетки линии IAR-2 имеют типичную для эпителиоцитов дискоидную форму (Рис. 1А). Главной структурой актинового цитоскелета ^трансформированных эпителиоцитов IAR-2 является краевой пучок микрофиламентов, расположенный вдоль свободного края клетки (Рис. IA, Б), в клетках также имеются прямые пучки, расположенные в цитоплазме случайным образом, и периферические актиновые пучки (junctional actin), ассоциированные с АК (Рис. 1Б). Подобная организация актинового цитоскелета характерна для многих нормальных и иммортализованных (нетрансформированных) клеток эпителиального происхождения.

Рис. 1. Нетрансформированные эпителиоциты 1АЯ-2. А - одиночная клетка, краевой (кольцевой) пучок актиновых микрофиламентов (указан стрелкой). Окрашивание на филаментный (Е-) актин. Б - редкая культура, краевой пучок (указан стрелкой), периферические актиновые пучки (указаны флажком), ассоциированные с АК. Окрашивание на Е-актин. В - АК (указаны стрелкой) содержат Е-кадхерин и представляют собой тонкие линейные структуры вдоль межклеточной границы. Окрашивание на Е-кадхерин. Е - в АК И-кадхерин не выявляется (стрелкой указана граница контактирующих клеток). Окрашивание на И-кадхерин. Флуоресцентная микроскопия. Шкапа 10 мкм.

Эпителиоциты 1АЛ-2 формируют АК эпителиального типа (тонкие линейные контакты, расположенные вдоль границы двух клеток) - тангенциальные контакты, образованные Е-кадхерином (Рис. 1В). >1-кадхерин в АК эпителиоцитов 1АЯ-2 не выявляется (Рис. 1Г)-

1.1. Изменения морфологии эпителиальных клеток 1А11 в результате

трансформации.

Культуры, полученные из линии 1АЯ-2 в результате ретровирусной трансформации экзогенным активированным онкогеном М-КАЭУ12, были клонированы. С помощью иммунофлуоресцентной микроскопии было отобрано 5 клонов ГАИ. 1170, в клетках которых сохранялась аккумуляция Е-кадхерина на межклеточных границах (117006, 1170Ш1, 1170Р9, И70Н5, 1170Ш2). Клетки клонов 1А111170 имели полигональную или близкую к дискоидной форму (Рис. 2), в густой культуре формировали монослой.

Из смешанной культуры эпителиоцитов 1АК-2, трансформированных онкогеном М-КА8У12, также были отобраны 4 клона IАК 1162, не образующие Е-кадхерип-содержащих АК: 1162СЗ, 116203, 1162Е5, 1162Р4. Форма клеток клонов 1АШ162 была сильно изменена в сторону фибробластоподобной - клетки имели

веретеновидный фенотип (Рис. 2). В густой культуре клетки 1АЯ1162 часто подползали друг под друга, образуя многослойную культуру.

Как показал морфометрический анализ, в результате трансформации резко уменьшалась площадь распластывания эпителиальных клеток на субстрате. Средние значения площади клеток для Лаз-трансформированных клонов оказались в 2-4 раза ниже, чем для эпителиоцитов 1АЯ-2 (Табл. 1). В свою очередь, средние значения элонгации, характеризующей вытянутость клеток, для трансформантов 1АШ170 были в 2-3 раза, а для 1АШ162 - в 5-8 раз выше, в сравнении с эпителиоцитами 1АЯ-2, что подтверждает влияние трансформации на форму клеток. Средние значения дисперсии, показывающей изрезанность клеточного края, также увеличились.

Таблица 1. Морфометрические параметры нетрансформированных _и трансформированных эпителиоцитов IAR._

Линия Площадь, мкм Элонгация Дисперсия Периметр, мкм

1AR-2 (контроль) 2028±120 0,17±0,02 0,01±0,001 168±5

IAR1170

1170D6 642±71 0,57±0,08 0,13±0,03 112±7

1170D11 583±58 0,31±0,04 0,08±0,02 106±6

1170F9 863±74 0,33±0,04 0,05±0,01 118±5

1170Н5 804±87 0,38±0,05 0,19±0,05 13 9±9

1170D12 691±59 0,41±0,06 0,14±0,04 126±6

IAR1162

1162СЗ 291±37 0,65±0,10 0,33±0,08 91±10

1162D3 576±47 0,86±0,11 0,25±0,06 122±8

1162Е5 999±90 1,08±0,14 0,35±0,06 184±11

1162F4 533±40 1,36±0,13 0,39±0,04 137±6

Трансформация химическими канцерогенами

IAR-2-31 149±9 0,30±0,05 0,04±0,01 47±2

IAR-6-1 558±38 0,37±0,07 0,04±0,01 100±5

Спонтанная трансформация

IAR-6-7 335±26 0,28±0,04 0,03±0,01 Г71±3

Средние значения площадей для трансформированных химическими канцерогенами и спонтанно трансформированных эпителиоцитов IAR также снижались, а элонгация и дисперсия увеличивались. Таким образом, трансформация химическими канцерогенами, онкогенная и спонтанная трансформация вызывают сходные изменения морфологии эпителиальных клеток.

1.2. Реорганизация актинового цитоскелета при трансформации эпителиоцитов IAR онкогеном RAS или химическими канцерогенами.

Неопластическая трансформация изменяет общую организацию актинового цитоскелета эпителиальных клеток. Актиновый цитоскелет клеток IAR1170 был представлен прямыми пучками, краевые пучки, типичные для нетрансформированных эпителиоцитов 1AR-2, не обнаруживались (Рис. 2, ср. рис. 1). В области контакта двух клеток прямые пучки часто располагались перпендикулярно межклеточной границе, утолщаясь в зоне контактирования клеток. Кроме прямых пучков на границах между клетками можно было наблюдать аккумуляцию

(сгущения) Р-актина. В густых культурах иногда были видны фрагментарные периферические пучки актина (Рис. 2).

В цитоплазме трансформированных эпителиоцитов IАЛ 1162 были видны немногочисленные тонкие прямые пучки, направленные вдоль длинной оси клетки (Рис. 2). Краевые актиновые пучки на свободных краях клеток не выявлялись. Периферические актиновые пучки на межклеточных границах клеток 1АШ162 не обнаруживались. В зонах контактов между клетками были видны обширные перехлесты ламелл.

Рис. 2. Актиновый цитоскелет трансформироваин ых эпителиоцитов 1АЯ1170 (клоп 1170Н5), 1АМ162 (клон 11621-4)

и 1АЯ-6-1. Стрелками указаны прямые пучки актина, флажками указаны периферические актиновые пучки, галочками указаны места аккумуляции У7-актина на межклеточных границах, звездочками указаны перехлесты ламелл. Окрашивание на Р-актин. Флуоресцентная микроскопия. Шкала ¡0 мкм.

Клетки линии 1А11-6-1, трансформированные диметилнитрозамином, и спонтанно трансформированные эпителиоциты 1АЯ-6-7 также утратили краевые актиновые пучки. Клетки 1А11-6-1 имели прямые пучки, беспорядочно расположенные в цитоплазме. В зоне межклеточных взаимодействий прямые пучки были ориентированы перпендикулярно границе клеток, кроме того, на границах контактирующих клеток выявлялись сгущения Р-актина, а также фрагменты периферических пучков. В зоне контакта клеток 1АК-6-1 выявлялись перехлесты ламелл (Рис. 2).

Таким образом, флуоресцентно-микроскопические исследования показали, что в трансформированных эпителиоцитах 1АЯ наблюдалось исчезновение типичного для эпителиальных клеток краевого пучка актиновых микрофиламентов. Актиновый цитоскелет трансформированных эпителиоцитов был представлен прямыми пучками. В результате трансформации частично или полностью исчезали периферические пучки, в зоне контакта двух трансформированных клеток выявлялись прямые пучки, часто ориентированные перпендикулярно межклеточной границе, а также сгущения Р-актина, иногда обнаруживались фрагменты периферических пучков.

1.3. Изменения организации межклеточных адгезионных контактов при

трансформации эпителиальных клеток ГАИ.

С помощью иммуноблоттинга было выявлено отсутствие экспрессии Е-кадхерина в клетках клонов 1АШ162 и некоторое снижение экспрессии Е-кадхерина в клетках клонов 1АЮ170 (Рис. 3). При этом уровень экспрессии мутантного

ШЧЯ ИЩ , ч - .

и т

ри ШйЯ

экзогенного онкогена RAS в клетках IAR1162 был выше, чем в клетках IAR1170 (Рис. 3).

Ras

N-кадхерин Е-кадхерин а-тубулин

(N f¿

ЧО

Q о

Q о

о

Г-

О

с

О

(N vO

■ч-ix. <N ЧО

Рис. 3. Иммуноблоттинг Ras-трансформированных эпителиоцитов IAR.

Окрашивание на Ras, N-кадхерин, Е-кадхерин, а-тубулин (маркер).

В результате Ras-тpaнcфopмaции в эпителиоцитах изменялся спектр экспрессируемых кадхеринов. В Ras-тpaнcфopмиpoвaнныx эпителиоцитах IAR наблюдалась экспрессия мезенхимального И-кадхврина (Рис. 3, 4), причем, как в фибробластоподобных клетках ЬАКЛ162, так и в клетках IAR1170 со слабо измененной морфологией.

Как показали флуоресцентно-микроскопические исследования, АК клеток IAR1170 содержали Е- и Ы-кадхерин, при этом наблюдалась колокализация этих двух типов кадхеринов (Рис. 4). АК клеток 1AR1162 были образованы М-кадхерином. Окраска культуры IAR-6-l на Ы-кадхерин была мозаичной: Е-кадхерин-содержащие АК некоторых клеток также окрашивались на 1Ч-кадхерин, АК других клеток окрашивались только на Е-кадхерин и не содержали М-кадхерин (Рис. 4).

Рис. 4. АК трансформированных эпителиоцитов IAR1170 (117006), 1АЯ1162 (116203) и ГАЯ-6-1. Стрелки указывают на АК. Окрашивание на Е- и Ы-кадхерин. Иммунофлуоресцентная микроскопия. Шкала 10 мкм.

Е-кадхерин

N-кадхерин

При иммунофлуоресцентном исследовании мы обнаружили существенные изменения пространственной организации АК, обусловленные трансформацией. В отличие от нетрансформированных эпителиальных клеток 1АЯ-2, формирующих тонкий непрерывный тангенциальный контакт вдоль границы контактирующих клеток (рис. 1В, 5), трансформированные клетки формировали точечные контакты или короткие штриховые контакты (индивидуальные кластеры) (Рис. 4, 5), сходные с АК фибробластов.

Двойное флуоресцентное окрашивание на Е-кадхерин и Е-акгин показало, что в трансформированных эпителиоцитах 1АЯ1170 и 1АЯ-6-1 кластеры АК колокализуются с прямыми актиновыми пучками в зоне контакта (Рис. 5).

Рис. 5. Лктиновый цитоскелет и АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов 1АЛ. Тангенциальные АК нетрансформированных эпителиоцитов 1АЯ.-2 колокализуются с периферическими пучками актина. В трансформированных эпителиоцитах 1АЮ170 (117006) и 1АЯ-6-1 кластеры АК колокализуются с прямыми актиновыми пучками. В нижнем ряду - врезки из верхнего ряда. Окрашивание на Г-актин и Е-кадхерин. Иммунофлуоресцентная микроскопия. Шкала 10 мкм.

Таким образом, при сохранении экспрессии Е-кадхерина в трансформированных эпителиоцитах 1АЯ изменяется пространственная организация образованных Е-кадхерином АК: непрерывные тангенциальные АК, характерные для

Е-кадхерии

Актин

^трансформированных эпителиоцитов, замещаются точечными или радиальными кластерами контактов, ассоциированными с прямыми актиновыми пучками.

1.4. Изменения организации плотных контактов трансформированных эпителиальных клеток'IAR.

Хорошо известно, что АК, наряду с актиновым цитоскелетом, участвуют в формировании и механическом* поддержании организации плотных контактов (tight junctions) (Hartsock and Nelson, 2007), которые, в свою очередь, обеспечивают барьерную функцию эпителия и физически разделяют мембрану поляризованных эпителиоцитов на апикальный й базолатеральный домены. В серии экспериментов мы исследовали организацию плотных контактов в трансформированных эпителиальных клетках IAR. Как показало иммунофлуоресцентное окрашивание на белок плотных контактов окклюдин, нетрансформированные эпителиоциты IAR-2 формировали плотные контакты, представляющие собой тонкие непрерывные линии, расположенные вдоль границ контактирующих клеток. Наблюдалась колокализация плотных контактов с АК (Рис. 6).

В трансформированных эпителиоцитах IAR1170 была разрушена целостная структура плотных контактов: плотные контакты представляли собой точечные или радиальные структуры, расположенные на границах контактирующих клеток. В клетках 1AR1162 окклюдин не выявлялся. Эпителиоциты IAR-6-1 формировали плотные контакты в виде точечных кластеров на границах контактирующих клеток (Рис. 6).

Е-кадхерин

Окклюдин

ч< /_ V Ш -

Е-кадхерин

Окклюдин

Рис. 6. Влияние трансформации на организацию плотных контактов. Тонкие непрерывные линии плотных' контактов нетрансформированных эпителиоцитов 1АЯ-2. Кластеры точечнътх, штриховых контактов на границах между трансформированными эпителиогщтами 1АЯ1170 (клон \170F9). Лоу-трансформированные эпителиоциты 1АЯ1162 (клон 116203) не формируют плотные контакты. Эпителиоциты ГАЯ-б-1 формируют плотные контакты в виде точечных кластеров. Стрелками указаны межклеточные контакты. Окрашивание на Е-кадхерин и окклюдин. Иммунофлуоресцентная микроскопия. Шкала 10 мкм.

Таким образом, проведенные исследования показали, что разрушение пространственной организации Е-кадхерин-содержащих АК и реорганизация актинового цитоскелета в результате неопластической трансформации сопровождается дезорганизацией целостной структуры плотных контактов,

функциональным последствием которой может быть нарушение барьерных свойств эпителиального пласта.

1.5. Влняние экзогенной экспрессии гена Е-кадхсрипа на фенотнп

трансформированных эпителиальных клеток ЬШ.

Ранее (см. главы 1.1-1.3) мы показали, что угнетение экспрессии Е-кадхерина при неопластической трансформации изменяет морфологию, актиновый цитоскелет и АК эпителиальных клеток 1АЯ. Для исследования возможного влияния экспрессии экзогенного Е-кадхерина на фенотип Яаз-трансформированных эпителиоцитов была произведена трансфекция конструкцией с геном Е-кадхерина клеток клонов 1АШ 162 (клоны 1162СЗ и 116203), утративших экспрессию Е-кадхерина в результате трансформации. Были получены клоны: 1162СЗ-ЕН4, 1162СЗ-ЕА7, 116203-ЕМ5, 116203-ЕК2, 116203-Е17, 116203-Е17, 116203-ЕР8, экспрессирующие экзогенный Е-кадхерин.

Экспрессия экзогенного Е-кадхерина привела к частичной реверсии эпителиального фенотипа клеток клонов 1АШ162. Одиночные клетки приобрели полигональную или близкую к дискоидной форму, иногда с отростками. В редкой культуре такие клетки формировали островки с широкими ламеллами на свободных краях клеток. В густой культуре клетки росли в виде монослоя. Как показал морфометрический анализ, по сравнению с исходными клетками ГЛИ1162, средние значения площади Пав-трансформированных клеток, экспрессирующих экзогенный Е-кадхерин, увеличились в 1,6-2,8 раза (Табл. 2). Значения элонгации, по сравнению с исходными клетками 1А1Ш62, уменьшились в 1,2-2,5 раза, значения дисперсии - в 1,5-8 раз, кроме клона 116203-ЕК2, среднее значение дисперсии которого увеличилось в 2 раза, по сравнению с исходной линией 116203.

Таблица 2. Морфометрические параметры Йаз-трансформироваппых _эпителиоцитов, экспрессирующих экзогенный Е-кадхерип._

Линия Площадь, мкм"! Элонгация Дисперсия Периметр, мкм

116203 (контроль) 576±47 0,86±0,И 0,25±0,06 122±8

1162СЗ (контроль) 291±37 0,65±0,10 0,33±0,08 91±10

И6203-ЕМ5 928±98 0,49±0,08 0,15±0,04 131±7

116203-ЕК2 962±96 0,70±0,12 0,49±0,08 204±20

116203-ЕЛ 1004±76 0,66±0,09 0,17±0,03 156±9

116203-Е17 1613±223 0,48±0,08 0,16±0,03 181±12

116203-ЕР8 1353±199 0,65±0,11 0,12±0,04 164±14

1162СЗ-ЕА7 1147±66 0,35±0,05 0,06±0,01 138±4

1162СЗ-ЕН4 1189±67 0,35±0,06 0,03±0,01 134±5

Экспрессия экзогенного Е-кадхерина не меняла существенным образом организацию актинового цитоскелета трансформированных эпителиоцитов. Флуоресцентно-микроскопические исследования показали, что актиновый цитоскелет НаБ-трансформированных эпителиоцитов, экспрессирующих экзогенный Е-кадхерин, был представлен прямыми пучками, которые в зоне межклеточных взаимодействий были ориентированы перпендикулярно границе контактирующих ламелл. Также на межклеточных границах наблюдалась аккумуляция филаментного актина, который в густой культуре мог быть организован во фрагментарные периферические пучки. В

АК клеток, экспрессирующих экзогенный Е-кадхерин, помимо Е-кадхерина присутствовал Ы-кадхерин. АК представляли собой точечные кластеры, расположенные вдоль границы контактирующих клеток.

Таким образом, проведенные исследования показали, что трансформация онкогеном Л45, химическими канцерогенами, а также спонтанная трансформация вызывали два типа морфологических изменений клеток 1АЯ: 1) классический ЭМП, при котором эпителиальные клетки приобретали фибробластоподобный фенотип, утрачивали экспрессию Е-кадхерина и окклюдина (линии 1АШ162); 2) морфологическую трансформацию, при которой клетки частично сохраняли эпителиальные характеристики и аккумуляцию Е-кадхерина в АК (линии 1А1Ш70, 1АК-6-1 и 1А11-6-7). В результате трансформации уменьшалась степень распластывания эпителиоцитов на поверхности субстрата. В трансформированных эпителиоцитах изменялся спектр экспрессируемых кадхеринов: начинал экспрессироваться мезенхимальный И-кадхврин. Менялась пространственная организация АК: контакты превращались в точечные или короткие радиальные кластеры, расположенные на границах контактирующих клеток, ассоциированные с прямыми актиновыми пучками.

Угнетение экспрессии Е-кадхерина в ходе ЭМП при трансформации оказывает существенное влияние на фенотип эпителиальных клеток 1АЯ. Экспрессия в Каэ-трансформированных клетках, утративших экспрессию эндогенного Е-кадхерина, конструкции с геном экзогенного Е-кадхерина приводила к частичному восстанавлению их эпителиального фенотипа: изменению формы клеток из веретеновидной на полигональную или дискоидную, увеличению площади клеток, восстановлению способности клеток формировать в густой культуре монослой.

2. Динамика межклеточных взаимодействий в системе узкой раны.

В литературе имеются данные о реорганизации актинового цитоскелета и разрушении периферического актинового пучка при трансформации эпителиальных клеток (ЬесЬг а1 а1, 2002, \Vicki е! а1., 2006). Вместе с тем до настоящего времени не проводилось детальных видеомикроскопических исследований области межклеточных взаимодействий трансформированных эпителиальных клеток с целью выяснения возможных механизмов разрушения стабильной межклеточной адгезии при неопластической трансформации. Мы предполагаем, что исчезновение краевого актинового пучка, но не угнетение экспрессии Е-кадхерина может играть ключевую роль в разрушении стабильной межклеточной адгезии и возникновении у трансформированных эпителиоцитов локомоторных характеристик.

Для детального исследования поведения клеток при установлении контакта между ними, мы использовании систему узкой раны. В клеточном монослое при помощи инъекционной иглы делали рану около 100 мкм шириной и через 2-4 ч с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной (01С) видеомикроскопии исследовали псевдоподиальную активность, формирование новых межклеточных контактов и поведение клеток после установления контакта. Измерения скоростей протрузий и ретракций клеточного края производили с помощью метода кимограмм, позволяющего отслеживать движение конкретной заданной точки клеточного края. В этих экспериментах были использованы ^трансформированные эпителиоциты 1АЯ-2 и трансформированные эпителиоциты 1АЯ-б-1, экспрессирующие Е-кадхерин и формирующие Е-кадхерин-содержащие АК. В связи с тем, что имеются данные об участии мезенхимального М-кадхерина в

активации миграционной активности опухолевых клеток (Hazan et.al., 2000; Theisen et al., 2007; Wheelock et.al., 2008), для своих исследований путем клонирования мы отобрали клоны клеток IAR-6-1, не экспрессирующие N-кадхерин

2.1. Феномен контактного паралича нетрансформнровапнмх эпителиоцитов

IAR-2.

В узкой ране в результате движения двух пластов навстречу друг другу происходило взаимодействие клеток IAR-2 и формирование между ними новых межклеточных контактов (Рис. 7А). До установления контакта клетки активно формировали псевдоподии. Анализ кимограмм показал, что скорость образования протрузий в зоне контакта составляла 5,01±0,40 мкм/мин, ретракций - 2,14±0,15 мкм/мин. Однако, уже через 15 мин после начала формирования контакта наблюдалось значительное угнетение псевдоподиальной активности в зоне контакта (контактный паралич): скорость образования протрузий снижалась до 0,99±0,23 мкм/мин, ретракций - до 0,47±0,11 мкм/мин (Рис. 7Б).

АРис. 7. Псевдоподиальшш

активность

нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2 в зоне формирования контакта. А -

Кадры из видеосъемки, DIC микроскопия. 0'00" соответствует моменту контактирования двух ламелл. Стрелки указывают на псевдоподии, формирующиеся до образования контакта; флажок указывает на сформированный рубец тангенциального контакта. Звездочки указывают на свободные края клеток, прилежащие к зоне конакта. Шкапа 10 мкм. Б - угнетение псевдоподиальной активности (контактный паралич) нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2 в зоне формирующегося контакта. Слева - кимограмма движения клеточных краев в зоне контакта; справа - диаграмма изменения скоростей протрузий и ретракций входе становления контакта. * - р<0,001, ** -р<0,005, п=30. t-meem.

При контакте клеток IAR-2 значительного перекрывания ламелл не наблюдалось, сформированный контакт выглядел как тонкий рубец. При флуоресцентно-микроскопическом исследовании в зоне формирующегося контакта выявлялась аккумуляция Е-кадхерина в виде тангенциальной линии, расположенной вдоль межклеточной границы. Формирование тангенциального контакта нетрансформированными эпителиоцитами сопровождалось разрушением краевого актинового пучка в зоне контакта и образованием актиновых арок из его остатков на свободных краях контактирующих клеток.

Механизм контактного паралича был предложен в предыдущих работах нашей лаборатории (Gloushankova et al., 1997) и заключается в перераспределении вектора натяжения после образования контакта, связанном с реорганизацией краевых актиновых пучков в зоне контакта. Нетрансформированные эпителиоциты имеют краевой пучок актиновых филаментов, вдоль которого распределяется натяжение, при

этом вектор суммарного натяжения направлен от периферии к центру. В зоне контакта двух ^трансформированных эпителиоцитов происходит разрушение краевого пучка, остатки краевых пучков контактирующих клеток смыкаются, формируя аркоподобные структуры («арки»), миозин-зависимая контрактильность которых приводит к изменению суммарного вектора натяжения. Тангенциальное натяжение вдоль границы контакта между эпителиальными клетками угнетает образование псевдоподий, способствует латеральному расширению контакта и выстраивает формирующиеся в зоне контакта актиновые филаменты в периферический актиновый пучок, стабилизирующий АК.

2.2. Отсутствие контактного паралича у трансформированных

эпителиальных клеток 1АЯ.

Характер взаимодействий трансформированных эпителиоцитов 1АЯ-6-1 в узкой ране был совсем другим. Трансформированные клетки в узкой ране, образуя псевдоподии на свободном крае, перемещались на свободную поверхность подложки, часто оставаясь прикрепленными друг к другу. В зоне контакта клеток продолжалось образование псевдоподий (Рис. 8, ср. рис. 7). До формирования контакта скорость образования протрузий клетками 1АК.-6-1 составляла 2,98±0,35 мкм/мип, ретракций -1,47±0,19 мкм/мин. Через 15 мин после образования контакта угнетения псевдоподиальной активности в зоне контакта не наблюдалось: скорость образования протрузий составляла 2,67±0,75 мкм/мин, ретракций - 1,05±0,18 мкм/мин (Рис. 8Б). В культуре 1АЯ-6-1 отсутствовал контактный паралич. На свободном крае контактирующих клеток продолжали формироваться протрузии, возникали крупные боковые ламеллы.

а , - 1x5 ч 4 ЕЕЭК'Г "" ЗЕй Рис. 8. Отсутствие

контактного паралича у трансформированных эпителиальных клеток 1АЯ-6-1. А - кадры из видеосъемки, 01С микроскопия. О'00" соответствует моменту контактирования двух ламелл. " » ¿.„„¿и, 15~Стрелки указывают на

формирующуюся боковую ламеллу на свободном крае контактирующей клетки, флажок указывает назону перекрывания ламелл. Шкала 10 мкм. Б - псевдоподиальная активность эпителиоцитов 1АЯ-6-1 в зоне межклеточных взаимодействий. Слева - кимограмма движения клеточных краев в зоне контакта, справа - диаграмма изменения скоростей протрузий и ретракций в зоне взаимодействия клеток. п=8.

При взаимодействии трансформированных эпителиоцитов 1А11-6-1 происходило значительное перекрывание ведущих ламелл. Через 15 мин после начала взаимодействия площадь перехлестов ламелл клеток 1АК-6-1 в среднем составляла 60 ± 11 мкм2, тогда как площадь рубца нетрансформированных эпителиоцитов 1АЯ-2 не превышала 18 ± 3 мкм2. При флуоресцентно-микроскопическом исследовании в зоне межклеточного взаимодействия клеток 1А11-6-1 выявлялась аккумуляция Е-кадхерина

в радиальных кластерах АК, ориентированных перпендикулярно межклеточной границе.

Мы предполагаем, что, несмотря на возможность образования Е-кадхерин-содержащих АК, различия в актиновом цитоскелете нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов определяют Их поведение при контакте двух клеток. Отсутствие краевых актиновых пучков в трансформированных клетках приводит к дефициту тангенциального натяжения в зоне межклеточного взаимодействия, в результате этого не происходит угнетение псевдоподиальной активности, не развивается контактный паралич и не формируется стабильный контакт.

2.3. Влияние ингибитора ROCK Y-27632 на развитие контактного паралича

нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2.

Как известно, ROCK фосфорилирует и инактивирует фосфатазу миозина, а также фосфорилирует легкие цепи миозина, что приводит к их активации, связыванию с актиновыми филаментами и усилению контрактильности актина-миозина. Ингибирование активности ROCK при действии его специфического ингибитора Y-27632 приводит к исчезновению актиновых пучков и снижению контрактильности. При взаимодействии в узкой ране клеток IAR-2, обработанных 30 мкМ Y-27632, мы не наблюдали полного подавления образования псевдоподий. В зоне контакта обнаруживались обширные перехлесты ламелл, тангенциальный рубец межклеточного контакта не формировался (Рис. 9А). Анализ кимограмм показал, что в присутствии Y-27632 скорость образования протрузий клетками IAR-2 до формирования контакта составляла 5,66±0,59 мкм/мин, ретракций - 3,08±0,37 мкм/мин. После образования контакта наблюдалось некоторое снижение псевдоподиальной активности в зоне контакта: скорость образования протрузий составляла 2,17±0,30 мкм/мин, ретракций - 1,27±0,25 мкм/мин, однако, полного контактного паралича не наблюдалось (Рис, 9Б ср. рис. 7Б).

■ Н псевдоподиальную активность

эпителиальных клеток IAR-2. А

б щлм^вшнщ | ■ - кадры из видеосъемки, DIC

^^^И I * I микроскопия. 0 '00"

л' 3 Вэт I Qpen»«uw * ■

Hp | г ■ Ц L, |, ■ | . соответствует моменту

Я^Иттавт! ЖтМШ а ° контактирования двух ламелл.

^ВТКл^^^КЫ^^^^Р^Н -5 о 5 10 15 20

Я^жН^мшрЗХШМ Bp«™.«™ Стрелки указывают на

формирующуюся боковую ламеллу на свободном клеточном крае, флажки указывают на зоны перекрывания ламелл. Шкала 10 мкм. Б - псевдоподиалъная активность эпителиоцитов 1AR-2 в зоне контакта в присутствии Y-27632. Слева - кимограмма; справа - диаграмма изменения скоростей протрузий и ретракций в зоне взаимодействия клеток. п=12.

Таким образом, в результате воздействия У-27632, разрушающего актиновые пучки, на нетрансформированные эпителиальные клетки происходила отмена контактного паралича. Клетки в процессе формирования контакта продолжали

образовывать протрузии, хотя их скорость была несколько снижена. В зоне контакта наблюдались значительные перехлесты ламелл, на свободных краях контактирующих клеток формировались боковые ламеллы.

Полученные данные указывают на то, что различия в актиновом цитоскелете между ^трансформированными и трансформированными эпителиоцитами, в частности, наличие либо отсутствие краевого пучка, могут определять поведение клеток во время формирования межклеточного контакта. При взаимодействии нетрансформированных клеток развивается контактный паралич псевдоподиальной активности. Разрушение краевого актинового пучка в результате трансформации или действия ингибитора сократимости У-27632 отменяет контактный паралич и разрушает стабильную межклеточную адгезию эпителиальных клеток.

3. Изменение подвижности эпителиальных клеток в результате трансформации.

3.1. Поведение нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клеток 1АЛ в редкой культуре.

Мы исследовали поведение нетрансформированных и трансформированных эпителиоциов 1АЯ в редкой культуре с использованием Б1С микроскопии в течение 3-6 ч. На протяжении всего видеонаблюдения межклеточные контакты нетрансформированных эпителиоцитов 1АЯ-2 оставались стабильными (Рис. 10). Характерной особенностью трансформированных эпителиоцитов, напротив, являлась нестабильность контактов между клетками. Трансформированные эпителиоциты 1АШ170 и 1А11-6-1, несмотря на формирование Е-кадхерин-содержащих АК, могли легко разрывать межклеточные связи с соседними клетками (Рис. 10).

I ШШи трансф°рмир°ваннь1х

кшнрчш "¡Е^^ИТ**4®** эпителиоцитов 1АЯ в

формируют островки плотно сцепленных клеток, контакты между клетками стабильны на протяжении всего времени наблюдения. Межклеточные контакты трансформированных эпителиоцитов 1170Н5 нестабильны. Стрелки указывают на места разрывов контактов, флажки указывают на вновь образовавшиеся контакты. Кадры из видеомикроскопического наблюдения. П1С микроскопия. Шкала 20 мкм.

При длительном видеомикроскопическом исследовании мы также обнаружили, что клетки 1АЯ1170 и 1АК-6-1, приобрели способность мигрировать по поверхности подложки (Рис. 11).

Для трансформированных эпителиоцитов была характерна асимметрия распределения псевдоподиальной активности на свободном крае, что отличает их от нетрансформированных эпителиоцитов 1АЯ-2. Клетки 1АШ170 и 1АЯ-6-1 в ходе наблюдения постоянно меняли области преимущественного образования псевдоподий, часто объединялись в островки, однако, межклеточные контакты

трансформированных эпителиоцитов были нестабильными. Клетки 1АШ 170 и 1АК-6-1 могли разрывать контакты с соседними клетками, могли менять положение в группе клеток, образующих островок, перемещаясь друг относительно друга, могли мигрировать по субстрату, как в составе группы клеток (коллективная миграция), так и индивидуально, образуя при встрече с другими клетками новые контакты (Рис. 11).

- перемещаются по подложке, устанавливая и разрывая контакты с соседними клетками. Стрелки указывают на вновь образовавшиеся контакты, флажки указывают на разрывы контактов, звездочка указывает на клетку, меняющую направление движения. Шкапа 20 мкм.

3.2. Анализ параметров подвижности нетрансформнрованных и трансформированных эпителиальных клеток 1АЯ.

Длительные видеомикроскопические исследования выявили существенные различия в поведении нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клеток. В серии экспериментов, анализируя положение клеток каждые 15 мин на протяжении 6-часовой съемки, мы ' исследовали характер межклеточных взаимодействий и траектории перемещений по субстрату трансформированных эпителиоцитов, экспрессирующих и неэкспрессирующих Е-кадхерин. Проведенный анализ позволил оценить количественные характеристики движения клеток: скорость, пройденный путь и перемещение за 6 ч, а также направленность движения клетки, вычисляемую как отношение перемещения к пройденному пути.

На протяжении 6 ч одиночные нетрансформированные эпителиоциты 1А11-2, сохраняя дискоидную форму, формировали псевдоподии по всему краю, при этом смещение клеток было незначительным. Часть эпителиоцитов 1АЯ-2 была объединена в островки, межклеточные контакты в которых оставались стабильными в течение всего времени наблюдения (Рис. 12).

Трансформированные эпителиоциты 1АЯ1170 и 1АЯ-6-1 в редкой культуре были способны двигаться индивидуально и в составе групп - коллективно (Рис. 12). Коллективная миграция может быть более эффективным способом перемещения трансформированных клеток. Так, несмотря на более высокую скорость движения одиночных клеток 1А11-6-1, в сравнении со скоростью клеток в составе групп (Рис. 13А), направленность движения клеток в группе, была существенно выше, чем направленность одиночных клеток (Рис. 13В). Направленность коллективного движения клеток 1АШ170 в составе групп также была выше по сравнению с направленностью движения одиночных клеток.

Видеомикроскопические исследования показали, что фибробластоподобные трансформированные эпителиоциты 1АШ162, утратившие экспрессию Е-кадхерина, также способны перемещаться по двумерному субстрату. Клетки 1АЮ162 могли

мигрировать по подложке индивидуально, а также могли зацепляться друг за друга и образовывать островки (Рис. 12). Клетки в составе островков довольно легко разрывали межклеточные контакты, могли двигаться друг относительно друга и выходить из островков. Вместе с тем, в культурах 1АК1162 мы не наблюдали направленных перемещений групп контактирующих клеток по субстрату (коллективной миграции).

360' и 33-ЕК2 ¡¡¡1 яяиИ ¡pa «1 Г 1

/ СМ-,; " V:>, ' 10 a J/,4

6 Y й ш É11 ......... ^И1 ВРЯ вШЩщШшт I. ^

■ V ... ,; (D k ' ' Ct >7 < ; ■ ^ 1 1 41 3 Л • v -М i „ „ а' &

Рис. 12. Поведение нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR в редкой культуре. Фрагменты кадров из видеомикроскопического наблюдения, справа - траектории перемещений отдельных клеток, обозначенных цифрами (кружком обозначено конечное положение клетки после 6 ч наблюдения). Увеличение х10. Нетрансформированные эпителиоциты IAR-2 объединяются в островки. Контакты между клетками IAR-2 в островках стабильны, перемещения клеток незначительны. Трансформированные эпителиоциты приобрели локомоторную активность. Межклеточные контакты трансформированных эпителиог/итов нестабильны. Эпителиоциты 1170F9 могут мигрировать индивидуально (клетки 1, 2, 5), то есть, клетки, находившиеся в контакте, могут разрывать контакты и двигаться независимо друг от друга; и в составе групп - коллективно (клетки 6, 7, 8). Эпителиоциты 1162D3 мигрируют индивидуально и могут менять положение в островке, перемещаясь друг относительно друга (клетки 1, 2, 3, 4), коллективной миграции не наблюдается. Клетки 1162D3-EK2 с высоким уровнем экзогенной экспрессии Е-кадхерина могут мигрировать индивидуально (клетка 5) и способны двигаться по подложке, оставаясь связанными друг с другом, коллективно (клетки 2, 3, 4). Клетки 1162D3-ЕР8, экспрессирующие низкий уровень экзогенного Е-кадхерина, двигаются индивидуально. Клетки IAR-6-1 мигрируют индивидуально (клетки 6, 5, 7) и коллективно (клетки 1, 2, 3).

Экспрессия экзогенного Е-кадхерина изменяла миграционные характеристики трансформированных эпителиоцитов IAR1162, утративших в результате трансфекции онкогена RAS эндогенный Е-кадхерин. Эти изменения затрагивали, главным образом, подвижность клеток, находящихся в контакте с другими клетками. Эпителиоциты 1162D3-EK2 приобрели способность к перемещению в составе групп клеток

(коллективная миграция) (Рис. 12). Вместе с тем, высокий уровень экспрессии экзогенного Е-кадхерина в клетках клона 1162ВЗ-ЕК2 приводил к снижению скорости миграции (Рис. 13А), связанному, по-видимому, с усилением межклеточной адгезии. Эпителиоциты 1162ЭЗ-ЕР8, находясь в контакте друг с другом, в отличие от одиночных клеток, перемещались на большие расстояния, то есть, движение клеток в группах было более направленным (Рис. 12, 13).

0,7 0.6

х

I 0,5 I 0.4

i0-3 |"0.2

О

0,1

□ Контактирующие клетки ■ Одиночные клетки J

Б Я 80

аШМ

§ 20 §•10

П Контактирующие клики И Одиночные клетки

в' 0,7

4 ¿

á

Рис. 13. Оценка локомоторной активности нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клеток IAR в редкой культуре. А -скорость движения клеток, Б - перемещение клеток за 6 ч (расстояние между начальной и конечной точками пути). В - направленность движения (отношение перемещения клетки к пройденному пути). Для контактирующих клеток п=20, для одиночных-п=10. **-р<0,01, * -р<0,05, t-meem.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансформация мутантным онкогеном Ras и химическими канцерогенами приводит к появлению у эпителиальных клеток 1AR способности к перемещению на двумерном субстрате. Трансформированные эпителиоциты IAR1170 и IAR-6-1, сохранившие Е-кадхерин, могут мигрировать по подложке, как индивидуально, так и коллективно. Напротив, клетки IAR1162, утратившие экспрессию Е-кадхерина при трансформации, способны лишь к индивидуальной миграции.

Видеомикроскопические исследования показали, что в результате трансформации, даже при сохранении экспрессии Е-кадхерина, может разрушаться стабильная межклеточная адгезия, и клетки могут приобретать способность к направленному движению. Как показали исследования Д.В. Айолло в нашей лаборатории, Е-кадхерин-содержащие АК трансформированных эпителиоцитов являются динамичными структурами и, в отличие от стабильных АК нетрансформированных эпителиоцитов, претерпевают постоянный ремоделинг. Пластичность Е-кадхерин-содержащих АК, с одной стороны, позволяет трансформированным клеткам реализовать свою способность к индивидуальной миграции, с другой стороны, необходима для их эффективной коллективной миграции.

4. Миграционная активность нетрансформированных и

трансформированных эпителиальных клеток IAR.

Наряду с исследованиями миграции клеток на двумерном субстрате, в серии экспериментов были проведены сравнительные исследования миграционной активности нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR в камерах с фильтрами, имеющими поры диаметром 8 мкм (миграционных камерах).

При подсчете количества клеток, проползших через поры на нижнюю поверхность фильтров, были обнаружены принципиальные различия в поведении нетрансформированных и трансформированных эпигелиоцитов: количество мигрировавших трансформированных клеток было существенно выше по сравнению с количеством нетрансформированных эпителиоцитов 1АК-2 (Рис. 14). Самая высокая миграционная активность была характерна для трансформированных эпителиоцитов 1А11-6-1. Также выделялись линии эпителиоцитов 1170Р9, 117СЮ6 и 1170Н5, экспрессирующих Е-кадхерин, миграционная активность которых значительно превышала показатель контрольных нетрансформированных эпителиоцитов 1АЯ-2 (Рис. 14).

Миграционная активность клеток 1АШ162, утративших в результате трансформации Е-кадхерин, была существенно ниже. Число мигрировавших клеток 1АЯ1162 было достоверно ниже числа мигрировавших клеток 1АШ170 (Рис. 14), но при этом также достоверно выше контрольного уровня. Экспрессия экзогенного Е-кадхерина приводила к увеличению количества клеток, мигрировавших через поры фильтров: трансфектанты 1АК1162 (116203-ЕМ5, 116203-ЕК2, 116203-Е17), экспрессирующие высокий уровень экзогенного Е-кадхерина, более эффективно мигрировали через поры, нежели клетки исходного клона 116203, утратившего в результате трансформации экспрессию Е-кадхерина (Рис. 14).

400

1 360 о.

| 150

I 100

5

о

5 50 ¿г

о

Рис. 14. Миграционная активность

нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клеток 1АЯ.

Концентрация клеток - 2 х 105 кл/мл, время инкубации 20 ч. п=45 (15 полей зрения в трех повторах), *** -р<0,001, ¡-тест.

Таким образом, трансформация способствует приобретению клетками способности к миграции не только на плоском субстрате, но и через поры в фильтрах. Трансформированные клетки, экспрессирующие Е-кадхерин, мигрируют через поры лучше, чем клетки, утратившие Е-кадхерин в результате трансформации. Можно предположить, что коллективная миграция через узкие поры клеток, связанных Е-кадхерином в цепочки, более эффективна, нежели миграция одиночных разобщенных клеток.

5. Туморогснность Яа8-трансформнрованных эпителиальных клеток 1АИ.

Для оценки туморогенности трансформированных клеток были использованы бестимусные голые мыши. Для данного эксперимента были выбраны клоны 1170Н5 (клетки, экспрессирующие Е-кадхерин), 1162Р4 (клетки, прошедшие ЭМП и утратившие экспрессию Е-кадхерина), 1162СЗ-ЕА7 (трансфектант, экспрессирующий

экзогенный Е-кадхерин) и ^трансформированные эпителиоциты IAR-2 в качестве контроля.

Для оценки динамики роста опухолей каждые 7 дней после инъекции производили замер объема опухолей (Рис. 15А), а через 3 недели для 1162F4 и через 4 недели для остальных линий производили забой животных и взвешивали выросшие опухоли (Рис. 15Б). Результаты показали, что все три исследованные линии трансформированных эпителиоцитов при прививке бестимусным мышам давали опухоли, которые, в зависимости от линии клеток, отличались по скорости роста и массе (Рис. 15). Оказалось, что для клона 1162F4 характерна высокая скорость роста in vivo, а также большая масса опухолей, при этом мыши, которым были введены эти клетки, не доживали до четвертой недели наблюдения. Клон 1170Н5 показал значительно меньшую скорость роста и массу опухолей. Двойные трансфектанты 1162СЗ-2А7 показали промежуточные значения скорости роста и массы полученных опухолей.

Рис. 15. Динамика роста опухолей после прививки бестимусным мышам эпителиальных клеток IAR, имеющих различную степень морфологической трансформации. А - изменение объема опухолей; Б-масса опухолей; п=8-10.

Таким образом, Ras-трансформированные эпителиоциты, имевшие разную степень морфологической трансформации: как сохранившие экспрессию Е-кадхерина, так и утратившие экспрессию Е-кадхерина и прошедшие ЭМП, способны вызывать рост опухолей в организме бестимусных мышей. Исследование динамики роста опухоли показало, что наличие Е-кадхерина в трансформированных клетках замедляет рост и уменьшает массу опухоли, свидетельствуя о функциональном значении Е-кадхерина как опухолевого супрессора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследования эпителиоцитов IAR, трансформированных мутантным онкогеном RAS и химическими канцерогенами, нами были получены данные, указывающие на возможность реализации при трансформации эпителиальных клеток двух направлений изменения морфологии, приводящих к одному и тому же результату, критическому для опухолевой прогрессии -возникновению миграционного фенотипа у неподвижных, плотно сцепленных между собой эпителиальных клеток.

Первый тип морфологической трансформации представляет собой классический ЭМП, в ходе которого эпителиальные клетки утрачивают экспрессию Е-кадхерина, теряют способность формировать плотные контакты, приобретают фибробластоподобный фенотип и миграционную активность. Такие клетки при высокой плотности популяции растут как многослойная культура, что характерно для

А 2С00 -- Б

Время, сут

трансформированных линий. В нашей работе подобные изменения были характерны для клеток IAR1162.

Второй тип морфологической трансформации, напротив, характеризуется незначительными фенотипическими изменениями - в результате трансформации форма эпителиальных клеток меняется несущественно: клетки приобретают полигональную форму, АК таких клеток содержат Е-кадхерин, клетки формируют плотные контакты и в густой культуре растут в виде монослоя. Примером таких изменений в нашей работе служат изменения в клетках IAR1170 и IAR-6-1.

Мы предполагаем, что исчезновение краевого актинового пучка в результате трансформации является ключевым моментом, который существенным образом меняет межклеточные взаимодействия, угнетает контактный паралич, приводит к реорганизации АК и разрушению стабильной межклеточной адгезии. Мы обнаружили, что сохранение Е-кадхерин-содержащих АК в трансформированных эпителиоцитах IAR1170 и IAR-6-1 не является препятствием для приобретения клетками локомоторной активности и играет важную роль в их коллективной миграции.

ВЫВОДЫ

1. Исследование культур эпителиоцитов IAR, трансформированных мутантным онкогеном RAS и химическими канцерогенами, а также спонтанно трансформированных эпителиоцитов IAR показало, что неопластическая трансформация вызывает два типа морфологических изменений: 1) классический ЭМП, при котором эпителиальные клетки приобретают фибробластоподобный фенотип и утрачивают экспрессию Е-кадхерина (линии IAR1162); 2) морфологическую трансформацию, при которой клетки частично сохраняют эпителиальные характеристики и аккумуляцию Е-кадхерина в межклеточных адгезионных контактах (линии IAR1170, IAR-6-1 и IAR-6-7).

2. При неопластической трансформации эпителиоцитов IAR исчезновение краевого актинового пучка, типичного для эпителиальных клеток, дезорганизация периферического актинового пучка и появление прямых актиновых пучков в зоне межклеточных контактов сопровождается угнетением контактного паралича псевдоподиапьной активности и разрушением стабильной межклеточной адгезии.

3. В трансформированных эпителиоцитах IAR1170 и IAR-6-1 изменяется пространственная организация межклеточных адгезионных контактов, образованных Е-кадхерином: непрерывные тангенциальные адгезионные контакты, характерные для нетрансформированных эпителиоцитов, замещаются радиальными контактами, ассоциированными с прямыми актиновыми пучками.

4. При неопластической трансформации эпителиоцитов IAR происходит разрушение непрерывной структуры плотных контактов, либо их исчезновение.

5. В результате неопластической трансформации эпителиоциты IAR-6-1, IAR1170 и IAR1162 приобретают локомоторную активность, как на двумерном субстрате, так и в миграционных камерах, при этом экспрессия Е-кадхерина способствует коллективной миграции трансформированных эпителиальных клеток.

6. Экспрессия экзогенного Е-кадхерина в трансформированных эпителиальных клетках IAR1162, утративших в результате трансформации Е-кадхерин, приводит к частичной реверсии эпителиального фенотипа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Rearrangements of the Actin Cytoskeleton and E-Cadherin-Based Adherens Junctions Caused by Neoplasic Transformation Change Cell-Cell Interactions / D.V. Ayollo, I.Y. Zhitnyak, J.M. Vasiliev, N.A. Gloushankova// PLoS ONE. - 2009. - V. 4, №11. - P. 1-17.

2. Житняк, ИЛО. Изменения ' актинового цитоскелета и межклеточных адгезионных контактов при эпителиально-мезенхимальн'ом переходе / ИЛО. Житник, Ю.М. Васильев, Н.А. Глушанкова//Тезисы конференции «Петровские чтения 2008». -Санкт-Петербург. - Вопросы онкологии. - 2008. - Т.54; №2. - С. 10.

3. Житняк, II.IO. Морфологические изменения эпителиальных клеток на этапах онкогенной трансформации / ИЛО. Житняк, Ю.М. Васильев, Н.А. Глушанкова // Материалы II московской региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - Москва, 2009. - С. 32-34.

4. Житняк, ИЛО. Изменения организации актинового цитоскелета и межклеточных контактов на разных стадиях морфологической трансформации эпителиальных клеток / ИЛО. Житняк, Ю.М. Васильев, Н.А. Глушанкова // Сборник тезисов 13-й международной путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2009. - С. 102.

5. Житняк, ИЛО. Изменения межклеточных контактов при морфологической трансформации эпителиальных клеток / ИЛО. Житняк, Н.А. Глушанкова // Тезисы школы-семинара по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала. - Санкт-Петербург, 2009. — Цитология. - 2010. -Т. 52, №3,-С. 259-260.

6. Gloushankova, N.A. Rearrangements of the actin cytoskeleton and E-cadherin-based adherens junctions disrupt cell-cell adhesion of transformed epithelial cells / N.A. Gloushankova, D.V. Ayollo, I.Y. Zhitnyak // Thesis of International Symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies". - Pushchino. -Synchrobook. - 2010. - P. 96-97.

Подписано в печать:

28.03.2011

Заказ № 5238 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы

Одной из основных задач современной онкологии является изучение наиболее опасного свойства злокачественных опухолей — способности к инвазии и метастазированию. Разрушение стабильной межклеточной адгезии и приобретение способности к миграции играет существенную роль в развитии- инвазивного потенциала трансформированных эпителиоцитов. В настоящее время общепринятой точкой зрения является представление о том, что программа эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), при которой дифференцированные эпителиальные клетки превращаются в фибробластоподобные клетки, способные к миграции, является основным механизмом эволюции клеток карцином. Угнетение экспрессии Е-кадхерина и связанное с этим разрушение межклеточной адгезии часто рассматривается как пусковой механизм инвазии и диссеминации опухолевых клеток. Вместе с тем хорошо известно, что ряд карцином человека, в частности, протоковые карциномы молочной железы, карциномы толстой кишки, меланомы могут сохранять экспрессию Е-кадхерина (Gillett et al., 2001, Hegerfeldt et al., 2002). Показано также, чю опухолевые клетки способны к миграции и инвазии и в отсутствие ЭМП (Tarin et al., 2005, Wicki et al., 2006, Wolf et al., 2007), что свидетельствует о возможности существования механизмов запуска инвазии, не связанных с угнетением экспрессии и аккумуляции на мембране Е-кадхерина. Несмотря на то, что значительное число исследований посвящено изучению Е-кадхерина как опухолевого супрессора, до сих пор остается недостаточно исследованным вклад межклеточных адгезионных контактов- (АК), образованных Е-кадхерином, в реализацию миграционной активности трансформированных эпителиоцитов. В настоящее время появились новые возможности видеомикроскопических исследований живых клеток, позволяющие детально изучить изменения межклеточных взаимодействий при неопластической трансформации.

Также весьма важным представляется изучение функциональной роли структур актинового цитоскелета, которые, как известно, в значительной степени определяют морфологию, локомоторные и адгезивные характеристики клеток. Хорошо известно, что неопластическая трансформация может приводить к кардинальным изменениям актинового цитоскелета. Детальное исследование перестроек актинового цитоскелета в трансформированных эпителиальных клетках позволит прояснить их вклад в разрушение стабильной межклеточной адгезии и появление у эпителиальных клеток способности перемещаться на значительные расстояния. Сравнительные исследования пересгроек актинового цитоскелета, АК, характера межклеточных взаимодействий при трансформации эпителиальных клеток помогут прояснить основные закономерности ранних этапов опухолевой прогрессии.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было сравнительное исследование особенностей фенотипических изменений, закономерностей межклеточных взаимодействий и миграционной активности эпителиоцитов линий IAR, сохранивших или утративших экспрессию Е-кадхерина в результате трансформации.

Задачи исследования:

1. Исследовать особенности морфологических изменений Ras-трансформированных производных эпителиоцитов линии IAR-2, как сохранивших, так и утративших экспрессию Е-кадхерина, а также эпителиоцитов IAR после трансформации химическими канцерогенами либо претерпевших спонтанную трансформацию.

2. Изучить перестройки актинового цитоскелета в трансформированных эпителиоцитах IAR.

3. Изучить изменения спектра экспрессируемых кадхеринов, исследовать организацию межклеточных адгезионных контактов и их связь со структурами актинового цитоскелета в трансформированных эпителиоцитах IAR.

4. Провести сравнительные видеомикроскопические исследования псевдоподиальной активности при межклеточных взаимодействиях в культурах нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR.

5. Исследовать изменения плотных контактов при трансформации эпителиоцитов

IAR.

6. Исследовать локомоторную активность трансформированных эпителиоцитов IAR на двумерном субстрате и миграционную активность в миграционных камерах.

7. Оценить влияние экспрессии экзогенного Е-кадхерина на морфологию, адгезионные характеристики и локомоторную активность трансформированных эпителиоцитов IAR.

Научная новизна и практическая значимость работы

В представленной работе при исследовании культур эпителиоцитов линий IAR, трансформированных мутантным онкогеном RAS и химическими канцерогенами, было показано, что неопластическая трансформация вызывает два типа морфологических изменений: 1) классический ЭМП, при котором эпителиальные клетки приобретают фибробластоподобный фенотип и утрачивают экспрессию Е-кадхерина; 2) морфологическую трансформацию, при которой клетки частично сохраняют эпителиальные характеристики, растут в культуре в виде монослоя и формируют Е-кадхерин-содержащие АК.

Впервые обнаружено, что исчезновение типичного для эпителиоцитов краевого актинового пучка в трансформированных эпителиоцитах изменяет характер межклеточных взаимодействий, вызывая угнетение контактного паралича псевдоподиальной активности и разрушая стабильную межклеточную адгезию.

Впервые обнаружены изменения пространственной организации Е-кадхерин-содержащих АК эпителиоцитов 1АК-6-1 и 1АШ170 в результате трансформации: непрерывные тангенциальные АК, характерные для ^трансформированных эпителиоцитов, замещаются точечными и радиальными контактами, ассоциированными с прямыми актиновыми пучками. Впервые обнаружена реорганизация плотных контактов в трансформированных эпителиоцитах 1АЯ.

Впервые установлено, что присутствие Е-кадхерина в АК трансформированных эпителиоцитов влияет на характер их миграции: клетки 1АШ170 и 1АГ1-6-1. сохранившие экспрессию Е-кадхерина, могут мигрировать как индивидуально, так и коллективно, тогда как клетки 1АШ162, утратившие экспрессию Е-кадхерина способны лишь к индивидуальной миграции. Показано, что экспрессия экзогенного Е-кадхерина в клетках 1АШ162 частично восстанавливала эпителиальный фенотип, а также способствовала появлению у клеток способности к коллективной миграции.

Изучение механизмов функциональной взаимосвязи реорганизации актинового цитоскелета и АК при неопластической трансформации эпителиоцитов, изменяющей межклеточные взаимодействия и приводящей' к разрушению стабильной межклеточной адгезии и миграционной активности, расширяет наши представления о закономерных измениях в трансформированных клетках на ранних этапах инвазии и метастазирования. Флуоресцентно-микроскопическое исследование пространственной организации АК в клетках опухолей может помочь в выявлении первых признаков их злокачественного перерождения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Исследование культур эпителиоцитов IAR, трансформированных мутантным онкогеном RAS и химическими канцерогенами, а также спонтанно трансформированных эпителиоцитов IAR показало, что неопластическая трансформация вызывает два типа морфологических изменений: 1) классический ЭМП, при котором эпителиальные клетки приобретают фибробластоподобньш фенотип и утрачивают экспрессию Е-кадхерина (линии IAR1162); 2) морфологическую трансформацию, при которой клетки частично сохраняют эпителиальные характеристики и аккумуляцию Е-кадхерина в межклеточных адгезионных контактах (линии IAR1170, IAR-6-1 и IAR-6-7).

2. При неопластической трансформации эпителиоцитов IAR исчезновение краевого актинового пучка, типичного для эпителиальных клеток, дезорганизация периферического актинового пучка и появление прямых актиновых пучков в зоне межклеточных контактов сопровождается угнетением контактного паралича псевдоподиальной активности и разрушением стабильной межклеточной адгезии.

3. В трансформированных эпителиоцитах IAR1170 и IAR-6-1 изменяется пространственная организация межклеточных адгезионных контактов, образованных Е-кадхерином- непрерывные тангенциальные адгезионные контакты, характерные для нетрансформированных эпителиоцитов, замещаются радиальными контактами, ассоциированными с прямыми актиновыми пучками

4. При неопластической трансформации эпителиоцитов IAR происходит разрушение непрерывной структуры плотных контактов, либо их исчезновение.

5. В результате неопластической трансформации эпителиоциты IAR-6-1, IAR1170 и IAR1162 приобретают локомоторную активность, как на двумерном субстрате, так и в миграционных камерах, при этом экспрессия Е-кадхерина способствует коллективной миграции трансформированных эпителиальных клеток.

6. Экспрессия экзогенного Е-кадхерина в трансформированных эпителиальных клетках IAR1162, утративших в результате трансформации Е-кадхерин, приводит к частичной реверсии эпителиального фенотипа.