Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Прогностическая значимость структуры локуса хромосомной транслокации t(9;22) при хроническом миелолейкозе

О 3 ФЕВ ^

На правах рукописи

Архипова Наталья Васильевна

Прогностическая значимость структуры локуса хромосомной транслокации ^9;22) при хроническом миелолейкозе

14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997г.

Работа выполнена в Гематологическом Научном Центре РАМН.

Научный руководитель: Доктор медицинских наук Н.Д.Хорошко

Научный консультант:

Доктор химических наук, профессор Н.И. Гринева.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук С.А. Маякова кандидат биологических наук А.Б. Судариков

Ведущее научное учреждение - Московский областной научно исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского

Защита состоится "..." .........................1997г..... в часов н;

заседании диссертационного совета Д 001.45.01 в Гематологического Научном Центре РАМН (Москва, 125167, Новозыковский проезд, д.4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН Автореферат разослан "....."...........1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

старший найчный сотрудник В.Д.Реук.

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования.

В последние десятилетия достигнуты несомненные успехи в понимании отдельных звеньев патогенеза и механизмов прогрессирования хронического миелолейкоза (ХМЛ), однако остается неразрешенной проблема излечения от этого заболевания.

Основная задача, поставленная перед современной терапией ХМЛ - добиться значительного удлинения хронической фазы болезни. В этой связи, большое значение имеет определение прогноза заболевания в момент установления диагноза, так как дифференцированный подход к лечению на ранних этапах развития лейкозного процесса может обеспечить продление жизни больных и улучшение ее качества. Поэтому, весьма актуальным является поиск и выявление новых прогностических критериев, основанных не только на комплексной оценке клинико-гематологических признаков, но и на современных молекулярно-биологических диагностических методах, кторые все шире применяются во многих областях медицины. Разрешающая диагностическая и прогностическая значимость этих методов на несколько порядков выше известных гистоморфологических, цитогенетических и культуральных методик. Внедрение их в клиническую практику открывает путь не только для понимания во многом неизвестных механизмов развития лейкемического процесса, но и позволит в дальнейшем приступить к генодиагностике, а затем и генотерапии.

Специфическим цитогенетнческим маркером ХМЛ является Филадельфийская хромосома (Rh1), возникающая в результате реципрокной транслокации t(9;22) [ Nowell P.C. с coas , 1960 Rowley J.D. с соавт., 1973 ]. Транслокация приводит к образованию химерного гена BCR/ABL на длинном плече 22 хромосомы. Выделяют два основных типа этой транслокации в зависимости от числа входящих в химерный ген экзонов. Тип транслокации 5' обусловливает транскрипцию Ь2-а2 тип мРНК BCR/ABL, определяемую разрывом 22-й хромосомы в точке, лежащей левее второго сайта узнавания рестриктазой Hindül. В результате разрыва 22-й хромосомы в точке, лежащей правее второго сайта узнавания рестриктазой Hindlil возникает З'-тип транслокации и образуется соответствующая ей Ь3-а2 тип мРНК BCR/ABL [ Shtivelrnan Е. с соавт., 1985].

В последние годы опубликованы данные о корреляции типа транслокации t(9;22) с клиническими параметрами ХМЛ [Mills К.!.с

лежащей правее второго сайта узнавания рестриктазой Hindll! возникает З'-тип транслокации и образуется соответствующая ей Ь3-а2 тип мРНК BCR/ABL [ Shtivelman Е. с соавт., 1985],

В последние годы опубликованы данные о корреляции типа транслокации t(9;22) с клиническими параметрами ХМЛ [Mills K.I.с соавт. ,1989, , Eisenberg А. с соавт., 1988, Ardern JC с соавт,1993 .Morris SW с соавт., 1990].

В нашем исследовании анализируется корреляция клинической эволюции заболевания вплоть до его исхода с типом транслокации 1(9; 22).

Целью настоящего исследования является определение клинического и прогностического значения двух различных типов хромосомной транслокации t(9;22) у больных хроническим миелолейкозом.

Задачи исследования:

1 .Определить тип хромосомной транслокации у больных хроническим миелолейкозом с помощью обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) или амплификацией кДНК, полученной обратной транскрипцией мРНК .

2. Охарактеризовать клинико-гематологические особенности ХМЛ у больных с различными типами транслокации.

3. Сравнить показатели выживаемости, длительность хронической фазы (ХФ) и фаз акселлерации (ФА) и бластного криза (БК) у больных с различными типами хромосомной транслокации.

4. Оценить прогностическую значимость типа хромосомной транслокации t(9;22) при ХМЛ.

Научная новизна.

На основе сопоставления клинико-гематологических параметров и выживаемости больных ХМЛ с различными типами транслокации t(9;22) выявлена прогностическая значимость определения типа хромосомной транслокации. Показано, что данные молекулярной диагностики в совокупности с другими неблагоприятными прогностическими факторами являются критерием для выделения группы больных с повышенным риском раннего наступления бластной трансформации.

Научно-практическое значение.

Молекуллрно-биологические исследования позволяют выделить группу больных с неблагоприятным прогнозом заболевания, которые нуждаются в применении более интенсивных программ лечения.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Апробация работы. Настоящее исследование является фрагментом темы, выполняемой по плану НИР ГНЦ РАМН 02.04. "Разработка эффективных режимов моно- и полихимиотерапии при лимфо- и ммелолролиферативных заболеваниях с использованием отечественных и зарубежных противоопухолевых препаратов и методов экстракорпорального очищения крови" ( N Госрегистрации 01900013963). Работа апробирована 11.06.96 на заседании

проблемной комиссии ГНЦ РАМН " Опухоли системы крови и неопухолевые заболевания белой крови, депрессии кроветворения, трансплантация костного мозга , гемоцитология ". Основные

положения диссертации доложены на 3 научных конференциях: Первом съезде медицинских генетиков( Москва, 1994г.); " Школах гематолога " ( г. Львов, 1995г.) , ( г. Москва,1996г.); на второй встрече Европейской гематологической ассоциации ( г.Париж .1996 г.).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 95 стр. Состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и указателя литературы. В работе 10 таблиц и 11 рисунков. Диссертация выполнена в отделении химиотерапии лейкозов и патологии эритрона ( зав.-доктор медицинских наук Н.Д.Хорошко) Гематологического Научного Центра РАМН ( директор-академик РАМН , профессор А.И.Воробьев), на базе 6-го гематологического отделения Московской городской клинической больницы им. С.П. Боткина. Молекулярно-биологические исследования проводились в лаборатории генной инженерии (зав. лаб -проф. Гринева Н.И.), блот-гибридизационный анализ осуществлял Домнинский Д.А..

Варианты БК устанавливались по результатам цитохимического и иммунолологического исследования. Иммунофенотипирование

бластных клеток производилось в лаборатории эксперементальной диагностики опухолей (зав. - проф. А.Ю Барышников) Онкологического научного центра РАМН. Цитохимическое исследование проводилось с.н.с. к.м.н. Дягилевой O.A. в лаборатории гемоцитология { зав.-проф. Козинец Г.И.). Цитогенетический анализ осуществлялся в лаборатории кариоцитологии с.н.с к.м.н. Захаровой A.B.

( зав.- к.м.н. Домрачева Е.В.). Статистическая обработка данных произведена совместно со с.н.с. Масловой E.H. (лаб. биостатистики • зав. к.т.н. Куликов С.П.)

Клиническое ведение больных ХМЛ осуществлялось совместно с с.н.с., к.м.н. Турки ной А. Г.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая характеристика больных

В настоящей работе исследованы 57 больных ХМЛ - 31 женщин и 20 мужчин, в возрасте от 17 до 69 лет, находившихся пo^ наблюдением клиники химиотерапии лейкозов и патологии эритрона е период с 1989 по 1995 годы. В анализ включены пациенты с типичной клинико-гематологической картиной ХМЛ. Хроническую фаз; диагносцировали на основании характерных клинико гематологических показателей - лейкоцитоза в периферической крови наличия незрелых гранулоцитов, в ряде случаев гипертромбоцитоза анемии, разрастания гранулоцитарного ростка в костном мозге i преобладанием миелоцитов, увеличения селезенки, низкого уровнз щелочной фосфатазы гранулоцитов, наличия Ph' хромосомы Ухудшение общего состояния, дальнейшее увеличение селезенки нарастание количества лейкоцитов в крови, анемия гипертромбоцитоз или тромбоцитопения, а также увеличена бластных клеток до 5-30% расценивали как фазу акселлерации. Пр| сочетании 4-5 вышеуказанных симптомов, повышении в крови и/или i костном мозге количества бластов более 30% состояни* квалифицировали как властный криз [ Silver R, 1990, Canellos GF 1988, Gold DW с соавт., 1985 ].

На основании ретроспективного анализа клинико гематологических характеристик в момент диагностики всем больныг была определена принадлежность к различным прогностически* категориям риска развития Б К. Перечень неблагоприятных признаков используемых нами в работе, представлены в табл.1.

Табл. 1. Неблагоприятные параметры, учитываемые при установлении категории риска больных ХМЛ о момент постановки

диагноза_____

Неблагоприятные Категория риска Количество

признаки неблагоприятных

признаков

1. Анемия ( Нв< 90 г/л ) I 1

( низкий риск)

2.Лейкоциты II 2-3

>200 х 10"/л (промежуточный

риск)

3. Б ласты - > 3 % в крови

4,Промиелоциты+

миелоциты > 20 % в

крови

5. Базофилы >10% III >3

в крови (высокий риск)

6.Тромбоциты >500 или

<100 х 109 /л

7. Селезенка >10 см ниже

реберной дуги

8. Печень >5см ниже

реберной дуги

Больным, не имеющим неблагоприятных признаков или имеющим 1 признак, устанавливалась категория низкого риска, при наличии 2-3 признаков -промежуточного риска, 3-х и более категория высокого риска. В целом категория риска была определена 51 больному. У шестерых больных исходные данные физикального и лабораторного обследования остались неизвестными (диагноз поставлен в другом лечебном учреждении).

В хронической фазе (ХФ) было обследовано 27 больных, в фазах акселерации (ФА) и бластного криза (БК) - по 16 пациентов. Двое больных были обследованы дважды - в фазе акселерации и бластного криза. К моменту обработки материала 41 больной умер.

У 33 человек диагноз подтвержден обнаружением Филадельфийской хромосомы, одна больная была РЬ'-негагивна.

Медиана возраста больных, включенных в анализ, составила 40

лет.

Методы исследования.

У 45 больных определение типа транслокации 1(9,22) быт произведено методом ОТ-ПЦР, у 12 больных локализацию точи разрыва устанавливали методом блот-гибридиэации [BJennerhassel G.T. с соавт.,1988, Milis K.l. с соавт.1989, Lee M-S.c соавт., 1988 Morgan G J.c соавт., 1990]

1. Выделение РНК из клеток крови и костного мозга [ МаниатисТ. соавт., 1984]

РНК выделяли из 10 мл крови или из 1 мл суспензии клеток костноп мозга, смешанных в соотношении 5:1 с раствором "глюгицира" дл предотвращения свертывания. Гемолиз эритроцитов проводили в 5-кратном избытке 0.8% раствора хлорида аммония в течение 20-2 минут при комнатной температуре. Ядерные клетки отмывали растворе STE (ЮОтМ NaCI, 10 тМ Tris HCl, pH 8.0, 1тМ EDTA) лизировали в буфере следующего состава: 4.5 М гуаниди изотиоцианата, 20 тМ ацетата натрия, 50 мМ трис-HCI, 1% лаури саркозила, 0.15 М 2-меркаптоэтанола. Лизат наслаивали н "подушку" (1,5-2,0 мл) 5.7 М хлорида цезия в 0.1М ЭДТА центрифугировали при 30 000 об/мин в течение 18 часов н ультроцентрифуге "Beckman L6" в роторе SW40. Осадок РН растворяли в стерильном буфере ТЕ с 0,5% додецилсульфата натри и осаждали тремя объемами 98% этилового спирта в присутствии 0. М NaCI и после промывки в 70% растворе этилового спирта хранил под спиртом при -20 С.

2. ОТ-ПЦР. [Mills K.l. с соавт., 1989 ] Для проведения ОТ-ПЦР использованием в качестве матрицы мРНК ( ОТ-ПЦР ) м применили вариант с двойной системой праймеров (В1+А1 и В2+А2). качестве контроля прохождения реакции использовали пару праймерс (А2+ A3) комплементарных к последовательности аЫ кДНК BCR/AB Размеры фрагментов: А2/АЗ - 137 п.н.; Ь2а2: А1/В2 - 124 п.н.; А2/Е - 253 п.н.; Ь3а2: А1/В2 - 199 п.н.; А2/В2 - 328 п.н. Нуклеотиднь последовательности праймеров: 81 f GAGCTGCAGATGCTGACCAAC-3' 22 н.; GC/AT=1,44; Td=70 С; В2 í TTCAGAAGCTTCTCCCTG-3' 18 н.; GC/AT=1,00; Td=54 С; А1 i TCAGACCCTGAGGCTCAAAGTC-3' 22 н.; GC/AT=1,20; Td=68 С; А2 í CTCCACTGGCCACAAAAT-3' 18 н.; GC/AT-1,00; Td=54 С; A3 í GCCAGTAGCATCTGACTT-3' 18 н.; GC/AT=1,00; Td=54 ( Центрифугировали 5-10 жг РНК из спиртовой взвеси, спи; декантировали и осадок РНК сушили под вакуумом при комнатнс

температуре. К осадку добавляли 2 мкл 10-кратного ОТ-буфера ( 0,5 M KCl, 0,2 M трис-HCI, рН=8.4, 25 m M хлорида магния и 1 мг/мл BSA), смесь dNTP ( по 1гпМ каждого ), 40 пМ ( примерно 0,4 мкг) праймера А2, РНКазин (до 1 ед/мкл) и воду до 19 мкл, растворяли осадок и проводили денатурацию РНК (4 мин при 90 С) с последующим быстрым охлаждением (лед). К смеси добавляли 1 мкл (20-30 ед.) ревертазы M-MuLV ("Сибэнзим) и проводили ревертазную реакцию ( 60 мин при 42 С). 5 мкл ОТ-смеси добавляли к 15 мкл, содержащим ПЦР-буфер, 40 пМ праймера В2, 30 пМ праймера А2, BSA (или желатин), 2-3 ед. Taq ДНК-полимеразы и проводили амплификацию на приборе DNA Thermal Cycler (фирмы "Perkin Elmer Cetus", США). Режим амплификации: 94 С, 1 мин / 48 С, 1 мин / 72 С, 1,5 мин ( 10-15 циклов ). Трифосфаты на этой стадии в реакционную смесь не добавляли, т.к. в ОТ-реакции концентрация dNTP в 5 раз больше, чем нужно для амплификации. К 19 мкл стандартной амплификационной смеси, содержащей праймеры А1 и В1 ( по 40 нМ каждого ) добавляли 1 мкл смеси от 1-ой реакции амплификации. Режим 2-ой амплификации: 94 С, 1 мин / 62 С, 1 мин I 72 С, 1,5 мин ( 25-30 циклов ). При этом первичные праймеры (А2 и В2) не работали из-за их низкой концентрации и высокой температуры отжига (62 С), которая выше температуры комплексообразования для них (Td=54 С). Вторая реакция позволяет отсекать все неспецифичные продукты амплификации, которые получались в первой реакции.

3. Электрофорез. Анализ продуктов полимеразной цепной реакции производили с помощью электрофореза в 5% полиакриламидном геле

[ Маниатис Т. с соавт., 1984 ].

4. Блот-гибридизация. Блот-гибридизация геномной ДНК проводилась по стандартной методике [ Маниатис Т. с соавт., 1984 ].

5. Статистическая обработка материала. Учитывая, что распределение изучаемых параметров не подчинено нормальным законам в работе использованы непараметрические критерии по программе " Сравнение медианы в группах с помощью непараметрического критерия Wilcoxon" ( использован пакет программ SAS). Значительность корреляций рассчитана с использованием непараметрического критерия Спирмена.

Результаты исследования и их обсуждение.

Большинству больных тип транспокации устанавливали с помощью ОТ-ПЦР и дальнейшего определения размера фрагмента кДНК при электрофорезе. Фрагмент длиной в 120 п.н соответствовал

5'типу разрыва, а фрагмент длиной 200 п.н - 3 ' типу. Двенадцате больным проведен блот-гибридизациоиный анализ геномной ДНК При блот-гибридизации тип транслокации определяли по наличии: дополнительных полос на электрофореграмме при гидролизе ДНЬ разными рестриктазами: 5' тип транслокации выявлялся в том случае если разрыв произошел между рестриктазами Sgl Iii и Sacl, а 3' тип если измененные фрагменты определялись только рестриктазой Bgl III В результате все больные были разделены на две группы - с 5 типом транслокации и с 3' типом. В таблице 2 представленс разделение больных ХМЛ по типам транслокации с учетом фазь заболевания.

Табл.2. Тип транслокации у больных ХМЛ, включенных i исследование

Фаза Число больных с различными Всего

заболевания типами транслокации больных

З'-тип 5'-тип

(% от общего (% от общего

числа больных) числа больных)

ХФ 12 (54,5%) 15 (42,9 %) 27

ФА 3 (13,7%) 12(34,2%) 15

БК 7(31,8%) 8 ( 22,9 %) 15

Общее число 22 35 57

больных

В группе с 3' типом транслокации в ХФ обследован 12 больных, в ФА трое и во время БК 7 пациентов. В группе с 5' типо! транслокации -15, 12 и 8 больных, соответственно.

По данным литературы такие параметры как пси возраст, уровень гемоглобина, количество лейкоцитов, тромбоцито! процент бластов в крови и/или в костном мозге , базофилов, размер печени и селезенки в момент диагностики имеют прогностическу; значимость [Bernard J. с соавт. 1977, Jacquillai CI. с соавт., 197. Волкова М.А., 1979, Хорошко Н.Д., 1992, Kantarjian Н.М. с соавт, 1993]. При сравнении некоторых из этих показателей у больных с 5' и типами транслокаций оказалось, что группы с этими типам транслокаций либо не различались вовсе, либо имели минимальны1 статистически недостоверные различия { табл. 3),

Табл.3. Клинико-гематологические показатели больных ХМ Л с различными типами транслокации в момент установления диагноза_ ______

Клинические параметры Тип транслокации

З'тил(медианэ) 5'-тип (медиана)

Гемоглобин г/л 120 120

Лейкоциты х109 /л 64 100

Тромбоциты хЮ9 /л 323 402

Базофилы % 2 3

Властные клетки % 2 1

Селезенка* 2 2

Печень* 0 0

*см из-под края реберной дуги

Все различия статистически недостоверны { Р>0,05)

Многие авторы выделяют количество тромбоцитов (500,0 х 10® /л) в качестве неблагоприятного симптома при ХМЛ. По данным ряда исследований,у больных с 3' типом транслокации средний уровень тромбоцитов больше, чем у пациентов в группе с типом транслокации 5' [1покисЫ К. с соавт., 1991, Агс!егп .Ю с соавт., 1993], но есть работы, авторы которых не находят взаимосвязи между локализацией точки разрыва и количеством тромбоцитов [Ора.'ка В с соавт., 1992( а); Ора!ка В с соавт., 1992 (Ь)].

В нашей работе медиана количества тромбоцитов крови з момент установления диагноза ХМЛ у больных сравниваемых групп достоверно не отличалась. В то же время частота встречаемости гипертромбоцитоза была выше в группе больных с 5' типом транслокации (у 58% больных с 5' типом транслокации по сравнению с 38% больных с 3' типом транслокации,).

Таким образом, в результате проведенных сопоставлений отдельных клинических и лабораторных проявлений ХМЛ с точками разрыва в локусе 1(9;22) по данным мопекулярно-биологического анализа каких-либо корреляций отметить не удалось. В обеих группах наблюдались приблизительно одинаковые среднестатистические параметры, оценивающие органомегалию или характеризующие степень продвину гости лейкемического процесса в момент установления диагноза.

Одна из основных задач нашей работы состояла е определении прогностической значимости типа транслокации у больных ХМЛ. В связи с этим особого внимания заслуживает изучение корреляции длительности фаз заболевания и выживаемости с типом транслокации при ХМЛ. Сравнительный анализ продолжительности каждой из фаз заболевания и выживаемости в целом между двумя группами больных показал, что медиана ХФ у больных с типом транслокации 5' составила 35 мес., с типом 3' - 22 мес.; продолжительность ФА - 8 и 2,5 мес. и БК - 4 и 6 мес., соответственно. Выживаемость больных в группе с 5' точкой разрыва была почти вдвое больше (56 мес.), чем у больных с локализацией точки разрыва в З'регионе (34 мес.). Все различия статистически достоверны ( Р<0,05). (Табл.4)

Табл.4. Продолжительность отдельных фаз заболевания и общей выживаемости у больных ХМЛ с различными типами транслокации

Фаза заболевания Медиана продолжительности фаз заболевания (мес.) Значение Р

З'-тип транслокации 5'-тип транслокации

ХФ 23 35 <0,05

ФА 2,5 8 <0,05

БК 8 4 >0,05

Общая выживаемость (медиана) 34 56 <0,05

На рис.1 представлены кривые выживаемости больных с 3' и 5' типами транслокации Анализируя эти данные можно полагать, что больные с 5' типом транслокации относятся к группе с более благоприятным прогнозом.

MEC.

Рис. 1 Кривые выживаемость больных с 3' и 5' типами транслокации.

Следует отметить, что наши данные согласуются с результатами большинства зарубежных исследователей, изучающих эту проблему [ Mills K.I.с соавт. ,1989, Mills K.I. с соавт. 1988, Eisenberg А. с соавт., 1988]. Однако встречаются работы, где авторы не находят корреляции типа транслокации с выживаемостью, а по результатам одного исследования больные с З'-типом транслокации имеют более длительную выживаемость [ Morris S.W. с соавт, 1990.,0palka В. с соавт., 1991].

Точка зрения по этому вопросу в настоящее время является спорной. Разница в полученных результатах может быть связана с рядом причин: характером терапии, в частности применением или неприменением интерферона, разнородностью обследуемых групп, а также в ряде случаев неверным определением типа транслокации [ Mills K.I. с соавт.,1991, Mills K.I. с соавт., 1992].

Работа над созданием прогностических систем при ХМЛ продолжается уже более двух десятилетий, что несомненно говорит об

актуальности данной проблемы [ Appelbaum F.R. с соавт., 1973, Brand L. с соавт., 1976, Bernard J. с соавт., 1977, Corvantes F. с соавт., 1982 Hagermeyer А. с соавт., 1979, Jacquillat CI. с соавт, 1978 , Kantarjiai Н.М.

с соавт., 1985 , Sakurai Н. с соавт., 1980 , Tura S. с соавт., 1981 ,Socs J.E. с соавт., 1988, Baccarini М. с соавт., 1989].

В последнее время за рубежом широко используетс; многокомпонентная прогностическая система, основанная на клинико гематологических критериях [Kantarjian Н.М. с соавт, 1993]. В наше! работе мы использовали доступный для широкой клинической практик! методологический подход, позволяющий определить принадлежност! больных к различным категориям ряска по количественному набор; неблагоприятных прогностических признаков (Табл.1).

Согласно этой системе в момент постановки диагноза больны ХМЛ разделяют по трем категориям риска - низкого, промежуточного i высокого. Группы низкого и промежуточного риска имеют боле продолжительный период клинической компенсации, требуют не стол интенсивных режимов программного лечения, хорошо отвечают н терапию альфа-интерфероном, имеют лучшие результаты пр трансплантации аутологичного и аллогенного костного мозга гемопоэтических клеток периферической крови.

В момент установления диагноза больные были разделены н категории риска на основании клинико-гематологических параметроЕ уровеня гемоглобина, количества лейкоцитов, тромбоцитов, процент бластов и базофилов, степени увеличения печени и селезенки. Пр анализе длительности ХФ у больных с разными категориями риска mi не выявили различий между больными с низким и промежуточны! риском. В тоже время длительность ХФ достоверно была короче больных с высоким риском ( Рис.2).

MEC,

Рис.2 Кривые длительности ХФ у больных ХМЛ с низкой (1), промежуточной (2) и высокой (3) категорией риска развития БК.

Различия в длительности ХФ между больными с низкой и промежуточной категориями риска недостоверны { Р>0,4).

Длительность ХФ больных с высокой категорией риска отличается от первых двух достоверно ( Р<0,001).

Далее больные с низким и промежуточным риском были перегруппированы с учетом только типа транслокации. При этом оказалось, что пациенты с 5'типом транслокации имеют более продолжительную ХФ по сравнению с больными с З'типом транслокации

{ Рис.3 ).

MEC.

Рис.3 Кривые длительности ХФ больных ХМЛ с низкой промежуточной категориями риска развития БК, разделенных с учето только типа транслокации t(9;22).

5'- кривая длительности ХФ больных с 5' типом транслокации, 3'- кривая длительности ХФ больных с 3' типом транслокации. Различия в длительности ХФ статистически достоверны (Р<0,005).

Таким образом, тип транслокации является важным критериег позволяющим более точно определить прогноз болезни в групг больных с низким и промежуточным риском развития бластного криз Это необходимо для дифференцированного подхода к лечени больных в прогностически благоприятных категориях риска, частности, если одним из предполагаемых методов лечения являете ТКМ.

Для лечения ХМЛ имеет значение и конечный эта лейкемического процесса - фаза бластного криза, и в первую очередь

основные его варианты, лимфоидный и нелимфоидный. Несмотря на фактически терминальный период, отличающийся почти полной резистентностью к известным цитостатическтим препаратам, при первом - лимфоидном варианте значительно чаще удается получить короткие ремиссии и продлить жизнь больного. В литературе имеются сообщения о том, что у больных с типом транслокации 3' бластный криз по лимфоидному типу развивается чаще, чем у больных с 5' типом транслокации [Morris SW с соавт., 1990]. В связи с этим представляло интерес провести сопоставления развития бластного криза по лимфоидному или миелоидному типу с изучаемыми типами транслокации t(9;22). Вариант бластного криза определен по поверхностным и цитоплазматическим маркерам у двадцати одного больного, девять из которых относились к группе с 3' типом транслокации, а двенадцать - к 5' (Таб.5).

Табл.5. Варианты бластного криза у больных ХМЛ с различными типами транслокации

Вариант бластного Число больных с различными

криза типами транслокации

З'-тип ( % от общего 5'-тип (% от общего

числа больных) числа больных)

Миелоидный 3 (33%) 9 (75%)

Лимфоидный 5 ( 56%) 2 ( 17%)

Недифференцирован 1 (11%) 1 ( 8%)

ныи

Из представленных а таблице данных видно, что среди больных первой группы у 56% ( 5 из 9 человек) диагностирован лимфоидный тип БК, в то время как только 17% ( 2 из 12 человек) из второй группы имели такой же тип БК. Миелоидный тип БК был диагносцирован у 33% больных из группы с З'-тилом транслокации и у 75%- с 5'- типом. Из-за небольшого количества наблюдений не представляется возможным статистически подтвердить преимущественное развитие лимфоидного варианта БК у больных с 3' - типом транслокации, однако тенденция к развитию этого варианта БК очевидна. Как было отмечено выше, медиана длительности БК у больных с 3' типом транслокации -составляет 6 мес., по сравнению с 4 мес. у больных с 5' типом транслокации. Это может быть связано с отмеченной наш тенденцией к развитию у 3' больных лимфоидного БК, который протекает несколько более благоприятно, чем миелоидный.

Эта находка может иметь клиническое применение, прежде всегс с точки зрения дифференцированного подхода к лечению БЬ например, включения препаратов лимфотропного действия в схем! полихимиотерапии. Кроме того, при небольшом количестве бластоЕ когда невозможны иммунологические и цитохимические метод! определения фенотипа властных клеток, принадлежность больных группе с 3' типом транслокации может указывать на возможност развития лимфоидного типа БК.

Использование в практической медицине методов молекулярнс биологического анализа не только дополняет общеклиническую оценк состояния больного в момент установления диагноза, но и позволяв выявить тех пациентов, к которым должно быть проявлено особо внимание в выборе программы лечения. Исходя из опухолево природы ХМЛ очевидна целесообразность усиления цитостатическо терапии уже на этапе индукционного лечения, поиска новых, боле эффективных и интенсивных программ. Среди современных методо индукционного лечения ХМЛ несомненная приоритетная рол принадлежит альфа-интерферону ( в комплексе с моно- ил полихимиотерапией [ Kantarjían Н.М. с соавт., 1993 J. Однако д настоящего времени нет убедительных сведений о том, насколько т или иные больные будут чувствительны к препаратам интерфероне Установлено лишь, что альфа-интерферон наиболее эффективен пр стабильной хронической фазе ХМЛ у больных прогностическ благоприятных групп. Помимо этого, эффективность препарато альфа-интерферона и их переносимость неодинаковы у больных ХМГ Поэтому необходимо изучать причины неэффективности альфг интерферона и по возможности выявлять заранее тех больных, которых не будет достигнут лечебный эффект на фоне препарато этого ряда. [The Italian Cooperative Study Group on Chronic Myelogenou Leukemia , 1981, Н.Д, Хорошко, 1996].

Опубликованные результаты противоречивы в отношени наличия взаимосвязи между типом транслокации и клинически! ответом на терапию альфа-интерфероном. По результатам одно группы исследователей на фоне лечения интерфероном ремисси достигается чаще у больных с 5'-типом транслокации [Elliot SL с соавт 1995;]. Другая группа, напротив, получила лучший эффект пр лечении препаратами альфа-интерферона у больных с 3' типо! транслокации [Inoue Т. с соавт., 1992 ].

Kantarjían Н.М. et al. отмечают, что достижение ремиссии завися от фазы заболевания, в которой проводится лечение альфа интерфероном, группы риска пациентов, доз и схемы введен« препарата [Kantarjían Н.М. с соавт., 1993]. Наилучших результате

добивались у пациентов, леченных в ранней хронической стадии (6080% больных), с низким риском развития Б К (80-30%) и в режиме ежедневного введения препарата по 5x10® /м2 (80%).

В целях выяснения действительно ли ответ на лечение альфа-интерфероном зависит от типа транслокации Ц9;22), проанализированы результаты лечения у 10 пациентов получавших препараты альфа-интерферона. Четверо из них имели тип транслокации 3' и шесть - 5', Все больные получали интрон А или реаферон в хронической фазе заболевания, относились к 1 или 2 категориям риска. Дозы вводимого препарата составляли в среднем 35 млн. ежедневно или через день, в зависимости от переносимости.

Оказалось, что из четырех больных с 3' типом транслокации только у одного (25%) достигнута полная клинико-гематологмческая ремиссия. В группе больных с типом транслокации 5' ремиссия достигнута у трех из шести (50%) больных. Цитогенетического ответа на терапию не было отмечено ни у одного больного ( Таб.6).

Табл. 6. Клинический ответ на терапию препаратами

альфа-интерферона у больных ХМЛ

Клинический эффект Число больных с различными типами

трпнслокации

3' тип 5' тип

Нет эффекта 3 2

Клинико- 1 3

гематологическая

ремиссия

Цитогенетическая 0 0

ремиссия

Всего больных 4 6

Таким образом, большинство наших больных, получавших альфа-интерферон с хорошим клиническим ответом, относятся к группе с 5' типом транслокации. Однако из-за небольшого числа пациентов невозможно статистически подтвердить тенденцию к более частому достижению ремиссии у больных группе с 5' типом транслокации. Тем не менее, целесообразно продолжать эти исследования, т.к. может оказаться, что определение типа транслокации позволит выявить тех пациентов, у которых лечение препаратами альфа- интерферона не будет иметь определяющего значения в противоопухолевой терапии.

Подводя итог проведенному исследованию можно сделат: вывод о том, что ХМЛ у больных с различными типами транслокацш имеет свои особенности. В первую очередь, это касается ХС заболевания и выживаемости. Следовательно, тип транслокацш при ХМЛ можно рассматривать в качестве дополнительной прогностического критерия, позволяющего более точш прогнозировать развитие клинической эволюции заболевания уже н; первых этапах наблюдения за больным, вносить коррективы в выбо| терапии индукции и составлять оптимальную программу лечени: каждого больного.

ВЫВОДЫ

1. У больных хроническим миелолейкозом с З'-типог транслокации хроническая фаза болезни и выживаемость боле< короткие, чем у больных с 5' типом транслокации. У этой группь больных имеется тенденция к более частому развитию бластноп криза по лимфоидному варианту.

2. У больных хроническим миелолейкозом с 5'-типол транслокации хроническая фаза болезни достоверн* продолжительнее, чем при З'-типе, показатели выживаемости выше, < властный криз развивается преимущественно по миелоидному типу.

3. В группах низкого и промежуточного риска хронической миелолейкоза определение типа хромосомной транслокации имее важное прогностическое значение. Несмотря на благоприятны! прогноз болезни по клиническим данным, выявление у больного С типа транслокации является значимым фактором неблагоприятной течения заболевания.

4. Принадлежность больных к группе с 3' типом транслокацш требует более интенсивных программ терапии хроническоп миелолейкоза.

5. Методы молекулярно - биологического анализа (обратна: транскрипционная полимеразная цепная реакция и блот гибридизация) целесообразно применять 8 качестве прогностически генодиагностикумов у больных хроническим миелолейкозом.

Список опубликованных работ по теме диссертация:

1.Барышников А.Ю., Туркина А.Г., Фролова Е.А., Моисеенкова I.H., Седяхина Н.П., Архипова Н.В., Хорош ко Н.Д., 1ммунофенотипирование бластных клеток у больных хроническим ¡иелолейкозом в стадии бластного криза и определение его ммунологических вариантов. Экспериментальная онкология,- 1994 г., .16, с.169-174.

2.Туркина А.Г., Домнинский Д.А., Покровская E.G., Бабушкина i.A., Моисеенкова H.H., Захарова A.B., Архипова H B., Гринева Н.И., [орошко Н.Д. " Оценка прогностической значимости структуры локуса ромосомной транслокации t(9;22) при хроническом миелолейкозе. ематология и трансфузиология. 1993 г. Стр. 8-11.

3. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д..Домнинский Д.А., Покровская Е.С., ¡арышников А.Ю., Архипова Н.В., Седяхина И.П., Гринева Н.И. 1рогностическая значимость структуры локуса хромосомной ранслокации t(9;22) при хроническом миелолейкозе. Первый 'оссийский съезд медицинских генетиков. Тезисы докладов, стр. 201, .1осква-1994г.

4. Archipova N.V., Turkina A.G., Domninski D.A., Baryshnicov A.Yu., Choroshko N.D." Clinical Significance of the type of t{9;22) Translocation in ;ML. p.200 British Journal of Haematoiogy, V 93, S2, 1996

5.Turkina A., Khoroshko N., Domninski , Baryshnikov A., Archipova 4., Grineva N. Analysis of breakpoints within BCRgene and clinical course if chronic myelogenous leukemia//GE!L94. Immunology and Leukemia.-Jancy, France, 26-27 April 1994.Ed. M.Ch.Bene, G.C.Faure. - Leukemia ind Lymphoma.- 1994.-V.13 Supplement 1.- P.120.

6.A.Turkina, N.Khoroshko, D.Domninski, E.Pokrovskaya, ^.Baryshnikov, N.Archipova, N.Sedyakhina, N.Grineva. Clinical and lematological significance the site of breakpoint within M-bcr in patients vith Ph' positive chronic myelogenous leukemia//Gerneinsarne lahrestagung der Deutschen und der Osterreichischen Gesellschaft fur Hernatologie und Onkologie. Wien, 9.-12.October 1994. P.155.