Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Мелатонин как биологический маркер опухолевых и нейродегенеративных заболеваний в пожилом и старческом возрасте

На правах рукописи

КВЕТНАЯ Татьяна Викторовна

МЕЛАТОНИН КАК БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАРКЕР ОПУХОЛЕВЫХ И НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В ПОЖИЛОМ И СТАРЧЕСКОМ ВОЗРАСТЕ

14.00.53 - геронтология и гериатрия 14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2003

Работа выполнена в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения РАМН, Медицинском радиологическом научном центре РАМН

Научные консультанты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Хавинсон Владимир Хацкелевич

доктор медицинских наук,

профессор Анисимов Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Ноздрачев Александр Данилович

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Аничков Николай Мильевич

доктор медицинских наук, профессор Александров Валерий Анатольевич Ведущая организация:

Российский научно-исследовательский институт геронтологии Минздрава РФ

Защита состоится 2003 г. в ^ часов на заседании

диссертационного Совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д.З.)

Автореферат разослан _

Ученый секретарь .

диссертационного Совета ^ '

кандидат биологических наук \У /\

Козина Л.С.

a^-A 1tsfö

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Мелатонин (МТ) - гормон, играющий важную роль в регуляции гомеостаза организма, впервые обнаружен в 1958 году в пинеальной железе - эпифизе (Lemer А., et al., 1958). Основным метаболитом МТ является 6-сульфатоксимелатонин (6-СОМТ), по концентрации которого в моче можно косвенно судить о продукции МТ эпифизом (Arendt J., 1995; Бондаренко JI.A., 1997).

За прошедшие сорок пять лет после его открытия было доказано, что МТ является ключевым регулятором биологических ритмов (Анисимов В.Н. и др., 2000; Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2000; Reiter R., 1991; Arendt J., 1995) и участвует в обеспечении многих жизненно важных физиологических процессов: созревание и развитие половых органов, пигментный обмен, метаболизм свободных радикалов, иммунный ответ, регуляция настроения и сна, пролиферация и дифференцировка клеток (Reiter R., 1980, 1991; Maestroni G„ 1993; Skene D., Swaab D., 2003).

В настоящее время твердо установлено, что пинеальная железа не является исключительным органом, способным синтезировать МТ. Многочисленными исследованиями показано, что экстрапинеальный МТ широко распространен в организме человека и животных. Клетки, продуцирующие МТ, обнаружены в желудочно-кишечном тракте, дыхательных путях, поджелудочной железе, надпочечниках, щитовидной железе, тимусе, мозжечке, мочеполовой системе, плаценте и других органах (Райхлин Н.Т., Кветной И.М., 1974; Kvetnoy I. et al., 1997; Kvetnoy I., 2002). Более того, выявлен активный синтез МТ в неэндокринных клетках - тучных клетках, естественных киллерах, эозшюфильных лейкоцитах, тромбоцитах, эндотелиоцитах (Kvetnoy I., Yuzhakov V., 1993, 1999).

Такое широкое распространение МТ в организме отражает его ключевую роль как межклеточного нейроэндокринного регулятора и координатора многих сложных и взаимосвязанных биологических процессов.

При старении происходит инволюция пинеальной железы и, как следствие этого, снижается концентрация МТ в организме (Анисимов В.Н. и др., 2000). Это, в свою очередь, приводит к возрастным изменениям ряда метаболических процессов и негативно огражаегся на функции многих органов и систем. Однако, сведения об изменении уровней секреции экстрапинеального МТ при старении отсутствуют, что ограничивает понимание роли и значения экстрапинеальных источников си льствует о

необходимости исследований в этом направлении

Одним из наиболее важных биологических свойств МТ является его способность контролировать клеточное деление. МТ способен ингибировать митоз клеток, вызывая задержку на стадии метафазы (Райхлин Н.Т. и др., 1993; Baneijee S., Margulis L., 1973). Опубликованы сообщения, касающиеся ингибирующего действия МТ на рост клеток, зависимых or половых ^ггероидных гормонов (Bartsch С. et al., 1992), а также на развитие злокачественных опухолей в условиях in vivo и in vitro (Blask D., Hill S., 1988; Blask D. et al., 1994). На этом основании было выдвинуто предположение о том, что МТ является природным онкостатическим гормоном, способным предотвращать неопластический рост (Blask D., 1984; Blask D. et al., 2002).

Подобное обстоятельство определяет актуальность проведения исследований по определению секреции МТ у онкологических больных. Это может иметь не только фундаментальное теоретическое значение для более глубокого понимания эндогенных механизмов неопластической трансформации, но и явиться основой для разработки новых диагностических и прогностических маркеров при опухолевых заболеваниях.

Нейродегенеративные заболевания, в частности болезнь Альцгеймера, являются патологическими процессами, ассоциированными с возрастом (Schneck М. et al, 1982). Их прижизненная диагностика чрезвычайно трудна, но крайне необходима для выбора оптимального патогенетически обусловленного варианта лечения. В механизме развития болезни Альцгеймера важное место занимает нейротоксическое действие свободных радикалов (Price D., 1999). МТ является мощным эндогенным антиоксидантом и играет важную роль в защите нейронов от окислительного стресса (Reiter R. et al., 1993,1999).

В этой связи, проведение исследований по Изучению взаимоотношений экстрапинеального МТ с ключевыми молекулами, вовлеченными в патогенез болезни Альцгеймера - ß-амилоидом и тау-протеином, может быть важным для разработки прижизненных маркеров нейродегенеративных заболеваний. Это, несомненно, является актуальной проблемой геронтологии и общей патологии.

Опухолевый рост и нейродегенеративные заболевания являются значимыми патологическими процессами ассоциированными с возрастом (Liu R.-Y. et al., 1999). В связи с вышеизложенным, актуальной и необходимой научно-практической задачей является проведение специальных исследований По изучению МТ, как возможного биологического маркера этих патологических процессов, с целью оптимизации диагностики, оценки прогноза и лечения заболеваний.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение МТ как биологического маркера опухолевых и нейродегенеративных заболеваний у лиц пожилого и старческого возраста.

В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать унифицированный протокол клинических данных для объективной интерпретации результатов определения экскреции б-СОМТ у человека.

2. Изучить динамику секреции МТ в организме человека при старении.

3. Изучить показатели экскреции 6-СОМТ у больных с опухолями различной локализации и провести корреляционный анализ этих показателей с пролиферативной активностью опухолей.

4. Изучить секрецию МТ у пациентов с болезнью Альцгеймера.

5. Верифицировать возможную внемозговую экспрессию ключевых молекул, участвующих в патогенезе болезни Альцгеймера - р-амилоида и тау-протеина, для разработки метода прижизненной диагностики этого заболевания.

6. Оценить эффективность использования МТ как биологического маркера при диагностике и прогнозе течения онкологических й нейродегенеративных заболеваний у лиц пожилого и старческого возраста.

Научная новизна работы

Установлено изменение динамики секреции МТ в процессе старения организма. При этом впервые выявлено, что если уровень пинеального МТ прогрессивно снижается с возрастом, то секреция экстрапинеального МТ остается стабильной до 60 лет, после чего тоже начинает снижаться, но медленнее, чем уровень пинеального МТ. Это позволяет поддерживать регуляцию тропных к МТ физиологических процессов на достаточно стабильном уровне в пожилом возрасте.

Обнаружено, что при опухолевых процессах секреция МТ изменяется. Эти изменения носят разноплановый характер и зависят как от органной локализации опухоли, так и от степени ее дифференцировки и прогрессии. Уровень экскреции 6-СОМТ прогрессивно снижается при увеличении размеров опухоли и метастазировании. Установлено, что оперативное удаление опухоли у больных раком молочной железы приводит к восстановлению нормального уровня экскреции 6-СОМТ.

Впервые зарегистрированы достоверные корреляции между величиной экскреции 6-СОМТ и показателями опухолевого гомеостаза: положительная корреляция между

уровнем экскреции 6-СОМТ и пролиферативной активностью опухолевых клеток;

> ........... , ,

отрицательная корреляция между показателями экскреции 6-СОМТ и внутриопухолевым содержанием МТ;' отрицательная корреляция между пролиферативной активностью

I

клеток и секрецией МТ в опухолевой ткани.

У пациентов с болезнью Альцгеймера установлено достоверное снижение экскреции б-СОМТ. Впервые обнаружена экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера и показано отсутствие иммунореактивности к тау-протеину лимфоцитов крови в контрольной группе.

Вьивлено значительное снижение синтеза белка Ьс1-х и уровня МТ в крови при болезни Альцгеймера как за счет уменьшения количества лимфоцитов, продуцирующих эти факторы, так и за счет снижения уровня секреции веществ даже в тех клетках, которые сохранили способность продуцировать белок Ьс1-х и МТ.

Впервые обнаружена экспрессия Р-амилоида и тау-протеина в цитоплазме тучных клеток слизистой оболочки желудка и кожи у пациентов с болезнью Альцгеймера, что подтверждает правомочность взглядов на болезнь Альцгеймера как на системное заболевание.

Впервые показана выраженная отрицательная связь между продукцией МТ и экспрессией Р-амилоида и тау-протеина в слизистой оболочке желудка, что свидетельствует о протекторной роли экстрапинеального МТ как эндогенного фактора противодействия развитию нейродегенеративных процессов.

Практическая ценность работы

На основании исследования секреции МТ у людей разных возрастных групп разработан унифицированный протокол клинических данных, позволяющий объективизировать интерпретацию полученных результатов при определении экскреции 6-СОМТ у человека.

Обнаружение достоверных корреляций между экскрецией 6-СОМТ и показателями опухолевого гомеостаза позволяет оценить 6-СОМТ как новый перспективный маркер для его применения в онкологической практике в целях оптимизации диагностики и оценки прогноза развития опухоли.

Выявленное снижение экскреции 6-СОМТ у пациентов с болезнью Альцгеймера и установленные корреляции ее показателей со степенью клинической выраженности деменции позволяют расценивать 6-СОМТ как информативный критерий тяжести и прогноза заболевания.

Впервые обнаруженная экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера и отсутствие иммунореактивности к тау-протеину у пациентов

контрольной' груптшпоадоляют рассматривать тау-протеин как перспективный маркер, а лимфоциты кровит ■ как удобный объект для прижизненной диагностики болезни Альцгеймера. зЦто*

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о высокой ценности МТ как биологического маркера при диагностике, оценке прогноза течения и эффективности лечения патологических процессов, ассоциированных с возрастом, в частности нейродегенеративных и онкологических заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан унифицированный протокол клинических данных, позволяющий объективизировать интерпретацию полученных результатов при определении экскреции 6-СОМТ у человека.

2. Секреция МТ с возрастом прогрессивно снижается. Однако, динамика эгого процесса неодинакова для пинеального и экстрапинеальпого МТ. Стабильная выработка МТ в желудочно-кишечном тракте до 60 лет и ее более медленное снижение по сравнению с пинеапьным МТ в старческом возрасте обеспечивает регуляцию физиологических процессов на достаточном уровне.

3. Достоверные корреляции между Экскрецией б-СОМТ и показателями опухолевого гомеостаза позволяют оценить МТ как новый перспективный неинвазивный маркер для оптимизации диагностики и оценки прогноза развития опухоли.

4. Обнаружение экспрессии тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера позволяет рассматривать этот белок как информативный маркер, а лимфоциты крови как 'удобный объект для прижизненной диагностики болезни Альцгеймера.

5. Резкое снижение выработки аптиапоптозного фактора Ьс1-х и МТ, обладающего сильными антиоксидантными свойствами, в лимфоцитах крови у пациентов с болезнью Альцгеймера свидетельствует о непосредственном участии продуктов окислительного стресса в апоптотической гибели нейронов при нейродегенеративных процессах.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Международном симпозиуме «Мелатонин: общебиологические и онкорадиологические аспекты» (Обнинск, Россия, 1992); I Международной конференции по нейроиммуноэндокринологии (Локарно, Швейцария, 1993); научном семинаре Отдела

гистологии и микроскопической анатомии Академического центра Университета Антверпена (Антверпен, Бельгия, 1993); 1-ом конгрессе Международной Ассоциации патологоанатомов (Москва, Россия, 1995); Международной конференции CYTO-95 (Саутхэмптон, Великобритания, 1995); 1-ом Онкологическом конгрессе СНГ (Москва, Россия 1996); научном семинаре Центра биомедицинских исследований университета Тюбингена (Тюбинген, Германия, 1996); XIV Международном конгрессе по гистохимии и цитохимии (Киото, Япония, 1996); конференции Норвежского общества гастроэнтерологов (Трондхейм, Норвегия, 1997); Международной конференции CYTO-97 (Йорк, Великобритания, 1997); 3-й Международной конференции «Пипеальная железа и рак» (Блауберин, Германия, 1997); научной сессии Израильского общества гистохимии (Тель-Авив, Израиль, 1999); 2-ом Европейском конгрессе по биогеронтологии (Санкт-Петербург, Россия, 2000); научном семинаре Института цитологических исследований (Валенсия, Испания, 2000); научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 2001» (Санкт-Петербург, Россия, 2001); научном семинаре Института анатомии II Университета Гете (Франкфурт-на-Майне, Германия, 2001); научном семинаре Лаборатории по изучению биологических ритмов Университета Пастсра (Страсбург, Франция, 2001); Международном симпозиуме «Мелатонин: клиническое значение и терапевтическое применение» (Поляница-Здрой, Польша, 2001); Международном геронтологическом Форуме (Валенсия, Испания, 2002); научном семинаре Нидерландского Института мозга (Амстердам, Голландия, 2002); научной конференции «Биологическая, медицинская и ветеринарно-медицинская наука и новейшие технологии на благо человека и человечества» (Санкт-Петербург, Россия, 2003); 6-ом Европейском конгрессе по микроскопии (Пула, Хорватия, 2003); Международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, Россия, 2003).

Реализация результатов исследования

Результаты исследований используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Медицинского радиологического научного центра РАМН, Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН, НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова Минздрава РФ, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербургской государственной медицинской академии последипломного образования Минздрава РФ, Санкт-Петербургской клинической больницы РАН, Центра биомедицинских исследований Тюбингенского университета (Германия), Института цитологических исследований (Валенсия, Испания).

Публикации

По теме диссертации опубликована 41 работа, в том числе 1 монография.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 201 странице, содержит 12 таблиц и иллюстрирован 22 рисунками. Указатель литературы содержит 384 источника, из которых отечественных - 83, зарубежных - 301.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Разработка протокола для определения экскреции 6-СОМТ

Синтез МТ имеет четко выраженный циркадианный ритм и реагирует не только на световые импульсы, но и на воздействие определенных химических препаратов. Поэтому при изучении МТ и его метаболитов в качестве потенциально возможных биологических маркеров патологических процессов у человека, следует строго унифицировать временные интервалы и протокол сбора образцов биологических жидкостей (кровь, моча, спиномозговая жидкость, слюна) для последующего радиоиммунологического или иммуноферментного анализа.

Учитывая эти обстоятельства, основной методологической задачей исследования явилась тщательная разработка протокола определения основного метаболита МТ - 6-СОМТ в моче обследуемых людей.

Выбор 6-СОМТ в качестве маркера базировался на том, что при определении МТ в сыворотке крови забор проб необходимо проводить в 2 часа ночи, а это предопределяет нахождение пациента в стационаре и связано с неудобствами и беспокойством для больных. Поэтому, гораздо более широкое распространение получил метод фиксированного наблюдения, связанный с определением ночной экскреции основного метаболита МТ - 6-СОМТ. Пробы мочи для анализа 6-СОМТ забираются у пациентов в 8 часов утра. Это позволяет не тревожить больных в течение ночи и представляет собой простой неинвазивный метод, удобный как для скриннинговых, так и для мониторинговых исследований.

Экскреция 6-СОМТ с мочой, измеренная в 8 часов утра, отражает ночное содержание МТ в крови, измеренное в 2 часа ночи (Arendt J., 1995). Таким образом, определение 6-СОМТ в утренних образцах мочи адекватно отражает ночной синтез МТ и представляет собой простой и достоверный метод для определения уровней секреции МТ у здоровых и больных людей. При этом следует подчеркнуть, что этот метод не нарушает сон, а очевидно, что нарушения сна могут изменить физиологическую секрецию МТ и, тем самым, отразиться на показателях его определения.

Поскольку синтез МТ зависит от освещенности, при назначении анализа на определение 6-СОМТ пациенты были предупреждены о недопустимости включения источников света в течение ночи, предшествующей утреннему забору проб.

Нами учитывалось, что важное значение для достоверного определения МТ и его метаболитов имеет запрещение использования определенных лекарственных препаратов в предшествующие 5-7 дней и в день забора образцов мочи для исследования. В первую очередь, это касается а- или р-блокаторов, так как секреция МТ пинеальной железой контролируется симпагической первпой системой через ряд внутриклеточных процессов, вовлекающих аденилатциклазу, цАМФ, протеинкиназы в активацию ключевого фермента синтеза МТ - Ы-ацетилтрансферазы. Применение успокоительных средств, также как и инсулина, угнетает секрецию МТ. Повышение уровней МТ происходит под действием многих лекарственных препаратов, действующих на центральную нервную систему. Список лекарств, воздействующих на синтез МТ, постоянно расширяется, свидетельствуя о том, что секреция МТ может изменяться в связи с применением многих фармакологических препаратов. Это требует серьезного подхода к назначению и ограничению лекарственной терапии в период изучения у больного динамики синтеза и секреции МТ.

При разработке протокола учитывалось, что не только секреция МТ изменяется под воздействием экзогенных факторов, таких как свет и лекарства, но и тот факт, что пинеальная железа, как интегральная часть нейроиммуноэндокринной системы, также находится под влиянием гормональных и иммунных эндогенных факторов. Поэтому в протокол вошли вопросы о наличии эндокринных и иммунных заболеваний у обследуемого пациента.

Таким образом, учитывая вышеизложенное, нами был разработан унифицированный протокол данных, заполняемый при клиническом определении экскреции 6-СОМТ у человека, который приведен ниже.

При строгом унифицировании и соблюдении протокола определение экскреции 6-СОМТ дает четкую оценку изменений синтеза и секреции МТ у пациентов с различными заболеваниями. Это может внести весомый вклад в улучшение диагностики и лечения многих патологических состояний.

Протокол определения экскреции 6-сульфатоксимслатоиипа (6-СОМТ) в моче Questionare for patients and their controls to study 6-sulphatoxymelatonin urine excretion

Фамилия, H.oySurname______________________

Пол/Sex_

Дата и время взятия проб/Date and tune of collection______

Нарушения CHa/Was the sleep disturbed? _______Да/нет Yes/no

Дата рождения /Date of birth_:______

Национальность/Nationality___

Bec/Weightofbody_ Рост/Size_

Количество беременностей/Number of pregnancies__

Менструации/шепагсЬе, их описание /menstrual history_

MeHonay3a/menopause - да/нет yes/no; продолжительность Menonayabi/length of menopause Клинический диашоз/с11шса1 diagnosis _

Патогистологический диагноз и описание/pathological diagnosis and picture_

Наличие сопутствующих заболеваний/other diseases

• Эндокринная патология/endocrine pathology__

• Заболевания почек/kidney' pathology_

• Заболевания печени/liver pathology_______

• Церебральный склероз/сегеЬта1 sclerosis_

• Психиагрические болезни/psychiatric diseases_

• Инфекции/infections__

• Другие заболевания/others____________

Лечение в течение сбора проб/Treatment in time of collection

• Onepamui/operations_

• Радиотерапия/гайоШегару_

• Химиотерапия/chemotherapy_

• Гормонотерапия/hormone therapy_

• Седативные npenapaiu/sedatfves___

• Гипотензивные средства/hypotensive drugs__

• Другие препараты/others___

Описание проб мочи/urine collection

Период за который собрана моча/time period 23.00 - 8.00 Объем/vohime/ml_

I

12

Характеристика групп обследуемы* пациентов

Изучение возрастных особенностей секреции МТ

Для изучения возрастных особенностей секреции МТ было проведено изучение экскреции 6-СОМТ у 148 пациентов, не страдающих онкологическими или нейродегенеративными заболеваниями. Так как ранее было показано отсутствие статистически достоверных половых различий в секреции МТ, в исследуемые группы сравнения включались как мужчины, так и женщины соответствующего возраста. Распределение пациентов по возрасту с указанием сопутствующих заболеваний представлено в табл. 1.

Таблица 1

Возрастной состав пациентов для изучения экскреции 6-СОМТ

Возраст (годы) Количество обследованных Сопутствующая патология

20-30 19 практически здоровы

21-40 23 практически здоровы

41-50 17 практически здоровы (12); хронический гастрит (5)

51-60 26 практически здоровы (7); хронический гастрит (14); ишемическая болезнь сердца-ИБС (5)

61-70 28 ИБС

71-80 18 ИБС

старше 80 17 ИБС

Учитывая, что значительное количество МТ вырабатывается экстрапинеальными источниками его синтеза, основными из которых являются энтерохромаффинные клетки (ЕС-клетки) желудка, нами были изучены возрастные особенности экспрессии МТ. Исследования проводились в гастробиоптатах у 113 пациентов этой же группы, не страдающих хроническим гастритом и давших согласие на проведение диагностической гастроскопии. 16 пациентов (6 человек в возрасте 51-60 лет, 4 человека в возрасте 71-80 лет и 6 человек в возрасте старше 80 лет) отказались от диагностической гастробиопсии.

Исключение из обследования 19 пациентов с хроническим гастритом связано с возможностью вовлечения гастроинтестинальпого МТ в патогенез желудочно-кишечпых расстройств.

Изучение секреции МТу онкологических больных Изучение секреции МТ, оцениваемой по показателям экскреции 6-СОМТ, проведено у 952 больных (473 мужчин и 479 женщин) с раком гортани, легких, желудка, толстой и прямой кишки, щитовидной железы, молочной железы, яичников и мочевого пузыря, госпитализированных в 1991-1999 голах в Медицинский радиологический научный центр РАМН (г. Обнинск) и Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН (г. Москва). Возраст больных находился в пределах от 54 до 68 лет.

Таблица 2

Характеристика пациентов с онкологическими заболеваниями и групп соответствующего контроля

Клиническая группа Число случаев (п) Средний возраст (М±т) ' Стадии опухолевого роста (TNM)

МУЖЧИНЫ (всего) 611 62±5 -

без онкопатологии 138 66±4 -

из них - хронический язвенный колит 32 58±4 _

рак толстой и прямой кишки 87 63±4 T^N^M«

рак гортани 69 56±2 T2_,NmMo.I

рак легких 108 58±1 TuH, эМо-i

рак желудка 146 65±3 - T3JlNx 2М„

рак мочевого пузыря 63 58±4 T2j1Nx,Mo

ЖЕНЩИНЫ (всего) 561 58±4 -

без онкопатологии 82 63±4 -

тиреоидный зоб 101 60±4 -

аденома щитовидной железы 34 51 ±2 -

тиреодит Хашимото И 55±4 -

рак щитовидной железы 123 62±4 Tj^No^Mo |

аденома молочной железы 74 52±5 -

рак молочной железы 93 58±4 Т2чЫо.3Мо-|

кистома яичников 20 59±5 -

рак яичников 23 61±4 T2.4N0.1M1M

Контрольную группу составили 220 человек того же возрастного периода без онкологических заболевапий. Внутри этой группы были выделены 4 подгруппы, в которые входили больные хроническим язвенньм колитом (32 человека), пациенты с доброкачественными заболеваниями щитовидной железы (146 человек), больные с аденомой молочной железы (74 человека), пациенты с кистомами яичников (20). Данные подгруппы были сформированы для сравнения с течением злокачественных заболеваний соответствующей локализации, а именно с опухолями толстой и прямой кишки, щитовидной железы, молочной железы, яичников.

Для обеспечения корректности сравнения между различными группами пациентов больные аналогичного возраста присутствовали в каждой группе (табл. 2).

Пациентов обследовали до хирургического удаления первичной опухоли и воздействия химиотерапии, радиотерапии или других видов лечения, которые могли бы повлиять на синтез и секрецию МТ. В группах больных раком молочной железы и раком щитовидной железы проводили повторный анализ экскреции 6-СОМТ на 6-8 сутки после операции.

Изучение секреции МТ у больных нейродегенеративными заболеваниями

Изучение секреции МТ, оцениваемой по показателям экскреции 6-СОМТ, проведено у 89 пациентов с клиническим диагнозом болезни Альцгеймера, находившихся на лечении в 1999-2002 годах в Центре клинической психоневрологии (г. Валенсия, Испания).

Всем больным при обследовании, согласно общепринятым неврологическим критериям, был поставлен диагноз болезни Альцгеймера. Из 89 пациентов, возраст которых находился в пределах 67-98 лет, 57 были мужчины и 32 - женщины. Продолжительность болезни составляла в среднем 3,4±1,6 года. Клиническая выраженность деменции (КВД) была следующей: 12 пациентов имели 1-ю степень КВД (слабая деменция), 52 пациента имели 2-ю степень КВД (умеренная деменция) и 25 пациентов имели 3-ю степень КВД (сильная деменция).

Пробы мочи от 28 добровольцев без психоневрологической патологии (возраст 65-78 лет, 15 мужчин и 13 женщин) были использованы в качестве контроля. Каждый пациент (или его попечитель), а также добровольцы дали свое согласие на проведение данного исследования.

Методы исследования

Радиоиммунологическое исследование экскреции 6-СОМТ

Мочу собирали в отдельную емкость у каждого пациента (включая группы контроля) в течение ночи в интервале между 23.00 и 8.00 часами. После измерения общего объема выделенной за ночь мочи, отбирали 3 пробы по 1 мл в капсулы Эппендорфа, замораживали их и хранили до лиофилизации при -20°С. После лиофилизации пробы транспортировали в Центр биомедицинских исследований Тюбингенского университета (Германия), где проводили радиоиммунологический анализ экскреции 6-СОМТ.

Радиоиммуноло1ическое определение 6-СОМТ проводилось в трех аликвотах мочи с использованием специфических антител к 6-СОМТ, стандарюв и радиоактивной метки по йоду, входящих в наборы Stockgrand Ltd. (Guilford, Surrey, UK) по инструкции, прилагающейся к набору. Метод основан на принципе связывания антигена 6-СОМТ с антителом, меченом радиоактивным изотопом (1251). Радиометрию проводили на автоматическом гамма-счетчике LKB-Wallac (модель 1181). Расчет содержания 6-СОМТ (нг/час) в исследуемых утренних пробах мочи (за период 23.00 - 8.00) проводился при помощи лицензионной компьютерной программы Radiomarker. Коэффициент вариабельности между разными определениями составлял не более 7%; внутри одного определения - 4%.

Иммуногистохимическое и морфометрическое исследование опухолей и гастробиоптатов

Кусочки ткани из разных участков опухолей выделяли во время операции и немедленно фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине (рН=7.2). После обезвоживания проводили заливку кусочков ткани в парафин и из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином - эозином. При гистопатологическом диагнозе опухолей, осуществленном сотрудниками патологоанатомических отделений МРНЦ РАМН И РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, использовались стандартные классификации ВОЗ.

Иммуногистохимические исследования проводили на 116 опухолях легких (32), желудка (54), толстой и прямой кишки (30) с использованием мышиных моноклональных антител к ядерному антигену пролиферирующих клеток (proliferative cell nuclear antigen -PCNA, клон РС-10, Dako, 1:250) и специфической кроличьей поликлональной антисыворотки к МТ (ultraspecific rabbit melatonin antiserum - URMA, CIDtech Research Inc.). В качестве вторых антител использовали биотинилированный анти-мышиный IgG

(для РС-10) или биотинилнрованиый анти-кроличьий IgG (для URMA). Визуализацию окрасок проводили с применением авкдина, конъюгированного с пероксидазой или стрептавидина, конъюгированного со щелочной фосфатазой, при этом соответственно диаминобензидин или диэтилкарбазол использовали в качестве хромогенов (все реагенты для визуализации фирмы Dako). Иммуногистохимическое исследование экспрессии МТ проведено также в гастробиоптатах 113 здоровых пациентов.

Количественную оценку PCNA-иммунопозитивных ядер и МТ-иммунопозитивных клеток проводили с помощью компьютерной системы анализа изображений (Imstar S.A.) с применением программ Morphostar и Colquant-2. PCNA-иммунопозитивные ядра опухолевых клеток и МТ-иммунопозитивные клетки подсчитывали в 50 рандомизированных пблях зрения (0.785 мм2 каждое) при увеличении х200. Подсчет проводили не менее чем на 5 срезах от каждой опухоли или гастробиоптата. Результаты выражали как среднее значение количества ядер или клеток на 1 мм2. Индекс PCNA (%) вычисляли по отношению числа PCNA-позитивных ядер к общему числу ядер опухолевых клеток х 100.

Иммуногистохимическое и морфометрическое исследование экспрессии ' тау-протеина, белка bcl+x и МТ в лимфоцитах крови

Образцы крови для выделения лимфоцитов были получены от 16 пациентов геронтопсихиатрического отделения Санкт-Петербургского городского гериатрического центра, которым был поставлен клинический диагноз болезни Альцгеймера (возраст больных находился в пределах 68-87 лет, 9 женщин и 7 мужчин, продолжительность болезни составляла в среднем 2,9+1,2 года). Все больные имели 2-ю степень КВД (умеренная деменция).

Также для выделения лимфоцитов были получены образцы крови у 89 пациентов с болезнью Альцгеймера, находившихся на лечении в Центре клинической психоневрологии (Валенсия, Испания). Клиническая характеристика этой группы больных изложена выше. Пробы крови от 22 добровольцев без психоневрологической патологии (возраст 65-78 лет, 15 мужчин и 7 женщин) были использованы в качестве контроля. Каждый пациент (или его попечитель), а также добровольцы дали свое согласие на проведение данного исследования.

Дефибринированная кровь (каждый образец) бьша разбавлена сбалансированным солевым раствором Хенкса (1:1), а затем наслаивалась на поверхность смеси Ficoll-Paque (Amersham). Лимфоциты выделяли путем центрифугирования в градиенте Ficolt-Paque при комнатной температуре (61.077, 500g, 40 мин.). Фагоциты были удалены путем

связывания карбонильным железом (Fluka) после градиентного центрифугирования. Осадок мононуклеарных клеток был трижды промыт при комнатной температуре фосфатным буфером (рН=7.2). При микроскопическом и морфометрическом анализе мазков, приготовленных из осадка и окрашенных по Май-Гргонвальду, было установлено, что изучаемая фракция содержала 97 % лимфоцитов, 2 % моноцитов и 1 % базофилов.

Для фиксации лимфоциты были дважды ресуспензированы в 10 мл фиксирующего раствора (4% раствор формальдегида и 0,1% раствор глютаральдегида, 1:1) в течение 10 мин. После фиксации клеточная суспензия была немедленно разведена фосфатным буфером, отцентрифугирована, промыта дважды фосфатным буфером и в целях пермеабилизации обработана 0,03% раствором Тритона Х-100 (Sigma) в течение 20 мин при 4°С с последующей двойной промывкой суспензированных клеток в фосфатном буфере. После этого на предметных стеклах, предварительно обработанных L-поли-лизином (Sigma) были приготовлены мазки из суспензии лимфоцитов для проведения иммуноцитохимической реакции.

Для выявления экспрессии тау-протеина мазки лимфоцитов были инкубированы с моноклональными антителами к тау-протеину (clone TAU-2, 1CN, 1:500) при комнатной температуре в течение 2 часов с последующим трехкратным отмыванием фосфатным буфером. Эти антитела реагирует в основном (87%) с фосфорилированным тау-протеином.

Для выявления экспрессии антиапоптозного фактора протеина bcl-x мазки лимфоцитов были инкубированы по той же схеме с антителами к bcl-x (Dako, 1:1000).

Экспрессию МТ в лимфоцитах выявляли с применением специфической кроличьей поликлонапьной антисыворотки к МТ (URMA, CIDtech Research Inc., 1:250).

Таблетки диаминобензидина с никелевым ускорителем (DAB with Metal Enhancer Tablets, Sigma) использовали для приготовления раствора субстрата хромогена. Все последующие этапы проводили с использованием универсального иммуноокрашивающего набора IMMU-MARK Universal Kit (ICN).

Согласно общепринятым правилам, срезы аутопсийного материала (кора мозга пациентов с болезнью Альцгеймера с подтвержденным гистологическим диагнозом) использовали как положительный контроль, а мазки клеток от обеих исследуемых групп (контроль и пациенты с болезнью Альцгеймера) без обработки первичными антителами к тау-протеину использовались как отрицательный контроль. В качестве положительного контроля при исследовании экспрессии bcl-x и МТ использовали гастробиоптаты пациентов без психоневрологической патологии.

Морфометрический анализ мазков после иммуноокрашивания проводили с помо1цыо микроскопа Axiophot-2 (Zeiss) и программного обеспечения SPOT для компьютерного анализа изображений.

Иммуногистохимическое и морфометрическое исследование экспрессии Р-амилоида, тау-протеина и МТ в биоптатах желудка и кожи

Биоптаты желудка и кожи были получены от 26 пациентов с болезнью Альцгеймера, находившихся на лечении в Центре клинической психоневрологии (Валенсия, Испания) и имевших в качестве сопутствующих заболеваний различные формы гасфита и гастродуоденита (18 больных) или экземы и псориаза (8 больных). Клиническая выраженность деменции (КВД) была следующей: 9 пациентов имели 1-ю степень КВД (слабая деменция), 17 пациентов имели 2-ю степень КВД (умеренная деменция). Каждый пациент или его попечитель дали согласие на проведение данного исследования.

Биоптаты слизистой оболочки желудка и кожи фиксировались в кислой жидкости Буэна. Обзорную окраску проводили гематоксилином и эозином. Метод окраски толуидиновым синим после гидролиза соляной кислотой (реакцию "скрытой" метахромазии) использовали для выявления тучных клеток.

Для выявления экспрессии Р-амилоида и тау-протеина срезы были инкубированы с моноклональными мышиными антителами к Р-амилоиду (клон 6F/3D, Dako, титр 1:500) или с моноклональными мышиными антителами к фосфорилированному тау-протеину (клон TAU-2, ICN, титр 1:500) при комнатной температуре в течение 2 часов. Экспрессию МТ выявляли с применепием специфической кроличьей поликлональной антисыворотки к МТ (URMA, CIDtech Research Inc., 1:250).

Для приготовления раствора субстрата хромогена использовали таблетки диаминобензидина с никелевым ускорителем (DAB with Metal Enhancer Tablets, Sigma). Все последующие этапы визуализации иммуноцитохимических реакций проводили с использованием набора IMMU-MARK Universal Kit (ICN).

Срезы аутопсийного материала (кора мозга 5 пациентов с болезнью Альцгеймера с подтвержденным гистологическим диагнозом) использовали как положительный контроль, а срезы из биоптатов слизистой оболочки желудка и кожи от исследуемых пациентов с БА без обработки первичными антителами к р-амилоиду и тау-протеину использовались как отрицательный контроль.

Г ' !' I

Изучение срезов после иммуноокрашивания проводили с применением микроскопа Axiophot-2 (Zeiss) и программного обеспечения SPOT для компьютерного анализа изображений.

Для типирования иммунопозитивных клеток проводили иммуноцитохимическую реакцию с антителами к тау-протеину и р-амилоиду на полутонких срезах и после прицельной заточки блока готовили ультратонкие срезы на ультратоме LKB-7A, которые контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Электронно-микроскопическое исследование проводили в электронном микроскопе JEM-100S (Jeol).

Статистическая обработка результатов

Результаты проведенных радиоиммунологических и морфометрических исследований анализировали с помощью компьютерных программ STATISTIKA 5.0 и ANOVA. При анализе взаимоотношений сравниваемых показателей использовали корреляционный тест Спирмена.

Выполнение исследований в рамках отдельных научных проектов поддерживалось грантами Российского фонда фундаментальных исследований (98-04-48763 и 01-0448238), Немецкого исследовательского общества (436ЯШ17/129/1995) и Научного совета Норвегии (110220/730).

Фрагменты работы выполнялись в Центре биомедицинских исследований Тюбингенского университета (Германия), Отделе гистологии и микроскопической анатомии академического центра Университета Антверпена (Бельгия), Отделе физиологии Университета Трондхейма (Норвегия), Лаборатории клеточной организации Института цитологических исследований (Валенсия, Испания) и Институте анатомии II Университета Гете (Франкфурт-Майн, Германия) во время долгосрочных научных командировок по стипендиям Немецкого исследовательского общества (1991, 1995 г.г.), Министерства здравоохранения Бельгии (1992 г.), Научного совета Норвегии (1996 г.), Испанского национального отделения Научного совета НАТО (2000 г.), Немецкого общества академических обменов (2002 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Возрастные особенности секреции МТ

Экскреция 6-СОМТ с мочой в различных возрастных группах. При исследовании экскреции основного метаболита МТ - 6-СОМТ у 148 лиц различного возраста (группу составили как практически здоровые люди, так и пациенты не страдающие онкологическими, пейропсихическими и гастроэнтерологическими заболеваниями) установлено, что уже начиная с 41 года, показатели экскреции 6-СОМТ статистически достоверно снижаются и к 60 годам уровень секреции МТ в два раза ниже, чем в период 20-40 лет (табл. 3).

За последующие 20 лет жизни уровень секреции МТ снижается еще в 2 раза и у лиц старше 80 лет значения экскреции 6-СОМТ с мочой ниже показателей у молодых людей (20-30 лет) более, чем в 5 раз (табл. 3).

Таблица 3

Экскреция 6-СОМТ у людей разного возраста

Возраст (годы) Количество обследованных (в) Экскреция 6-СОМТ (нг/час) (М±ш)

20-30 19 2136±198

31-40 23 2095±167

41-50 17 1564±172"

51-60 26 1006±152'

61-70 28 735±116*

71 -80 18 505-494"

старше 80 17 398±65"

* - р<0.05 по сравнению с показателем в группе 20-30 лет.

Экспрессия МТ в слизистой оболочке желудка при старении. Анализ результатов изучения экспрессии МТ в слизистой оболочке желудка у 113 человек разных возрастных групп показал, что количество МТ-иммунопозитивных ЕС-клеток сохраняется стабильным до 60 лет, и только у более старых людей их количество достоверно снижается (табл. 4).

Морфометричсский анализ показал, что оптическая плотность МТ-иммунопозитивных ЕС-клеток не меняется с возрастом, оставаясь стабильным показателем, что свидетельствует о снижении выработки МТ в слизистой оболочке желудка у лиц старше 60 лет за счет численного уменьшения популяции ЕС-клеток, а не за счет ослабления его синтеза в самих ЕС-клетках.

Таблица 4

Экспрессия МТ в слизистой оболочке желудка у людей разпого возраста

Возраст (годы) Количество обследуемых <■) Количество МТ-иммунопозитивньпс ЕС-клеток на 1 мм2 площади слизистой оболочки (М±ш) Оптическая плотность (ОрОЕС,у.е.)

20-30 19 172±27 0.241±0.005

31-40 23 167±24 0.263±0.003

41-50 17 169±14 0.258±0.012

51 -60 20 166±18 0.233±0.007

61-70 28 142±15' 0.245±0.010

71-80 14 119±12" 0.2б1±0.015

старше 80 11 105±12" 0.254±0.004

* - р<0.05 по сравнению с показателем в группе 20-30 лет.

Секреция МТ у онкологических больных

Экскреция 6-СОМТ при опухолях щитовидной железы. У пациенток с крупной первичной карциномой щитовидной железы при обследовании до операции обнаружено значительное снижение ночной экскреции 6-СОМТ (539±104 нг/час) по сравнению с пациентками контрольной группы соответствующего возраста, не имеющими заболеваний

щитовидной железы (1223±176 нг/час). У пациенток контрольной группы с различными типами доброкачественных тиреоидных заболеваний (простой зоб и аденома, тиреоидит Хашимото) обнаружено достоверное снижение 6-СОМТ (492±89 нг/час; р<0.05) по сравнению с пациентками контрольной группы, не имеющими заболеваний щитовидной железы. Через 6-8 дней после оперативного удаления злокачественной опухоли щитовидной железы (субтотальная резекция или тиреоидэктомия) ночная экскреция 6-СОМТ снижалась с 539±104 до 348±83 нг/час (р<0.01).

Экскреция 6-СОМТ при опухолях молочной железы. У пациенток с фиброаденомой молочной железы уровень экскреции 6-СОМТ (989±135 нг/час) практически не отличается от контрольных показателей (1187±213 нг/час), тогда как у больных с первичной аденокарциномой экскреция 6-СОМТ снижается более чем в два раза (434±82 нг/час, р<0.05). Хирургическое удаление злокачественной опухоли уже на 7-8 сутки после операции приводит к восстановлению нормального уровня секреции М'Г - экскреция 6-СОМТ составляет 867±112 нг/час (р<0.01).

Экскреция 6-СОМТ при опухолях яичников. У женщин с серозными (п=13) и эндометриоидными (п=7) кистомами яичников уровень экскреции 6-СОМТ (1389±175 нг/час) был несколько выше, чем в контроле (1187±213 нг/час), хотя статистический анализ не показал достоверности отличий показателей в группах сравнения. В то же время было зарегистрировано двукратное повышение уровня экскреции 6-СОМТ у больных с первичной папиллярной аденокарциномой яичников по сравнению с контролем и кистомами (2477±210 нг/час, р<0.05).

Экскреция 6-СОМТ при раке гортани. У пациентов с первичным раком гортани, гистологически охарактеризованным как плоскоклеточная карцинома степени (31-3 различных клинических стадий (Т2-4МО-2МО-1), не обнаружено изменений средней ночной экскреции 6-СОМТ (1126±191 нг/час) по сравнению с контролем (1004±146 нг/час).

Однако, ранжирование группы больных раком гортани в соответствии с размерами первичной опухоли выявило, что у больных с относительно небольшими опухолями стадии Т2 имеется повышение 6-СОМТ (2262±690 нг/час) по сравнению с контролем на 125%, тогда как у больных с опухолями Т4 было обнаружено снижение уровня 6-СОМТ на 62% (386±132 нг/час, р<0.05). В то же время, у больных с опухолями ТЗ экскреция 6-СОМТ была близка к уровню контроля (1007±183 нг/час).

Так как средний возраст пациентов в подгруппах с разными размерами опухолей варьировал в очень небольшом диапазоне, представляется вероятным, что длительность роста первичной карциномы гортани оказывает модулирующее действие на ночную выработку МТ. При наличии небольших опухолей (Т2) выработка МТ повышена, в то время как крупные опухоли (Т4), по-видимому, приводят к снижению синтеза МТ.

Распределение группы больных в соответствии с гистологической зрелостью опухоли показало, что экскреция 6-СОМТ • повышена при наличии высокодифференцированных 01 опухолей, будучи в среднем на 52% (1524±405 нг/час) выше, чем в контроле, тогда как у больных с недифференцированными ОЗ опухолями этот показатель был экстремально низким (246±74 нг/час, р<0.01). У больных со слабо дифференцированными 02 опухолями экскреция 6-СОМТ имела средние значения, практически неотличимые от контрольных (996±195 нг/ч).

Экскреция 6-СОМТ при раке легкого. Средняя величина ночной экскреции 6-СОМТ у пациентов с первичным неоперированным раком легкого была значительно снижепа - на 59% (408±63 нг/час; р<0.01) по сравнению с этим показателем у пациентов группы неопухолевого контроля соответствующего возраста (995+153 нг/час).

У онкологических больных были выявлены опухоли, соответствующие клиническим стадиям Т1-4М)-ЗМ0-1, гистологически характеризующиеся как плоскоклсточные карциномы или аденокарциномы.

Ранжирование пациентов на подгруппы в соответствии с величиной первичных опухолей показало прогрессивное снижение йоказателей по мере увеличения размеров опухолей (при Т2 -50Ш41 нг/час; при ТЗ - 378±91 нг/час; при Т4 - 362±29 нг/час).

Экскреция 6-СОМТ при раке желудка. У больных с первичным неоперированным раком желудка обнаружено существенное снижение ночной экскреции 6-СОМТ по сравнению с контролем на 59% (410±75 нг/час; р<0.01). У этих больных были крупные опухоли без отдаленных метастазов (ТЗ-4М0-2М0), гистологически типированные как аденокарциномы.

Экскреция 6-СОМТ при раке толстой и прямой кишки. У обследоваппых пациентов преобладали крупные опухоли стадий ТЗ и Т4; у некоторых были явно выраженные инфильтраты в лимфоузлы (N2-4), а в немногих случаях - отдаленные метастазы. Гистологически опухоли были отнесены к аденокарциномам.

Среднее значение ночной экскреции 6-СОМТ с мочой составляло 1449+309 йг/час, что было на 44% выше, чем у пациентов соответствующего возраста без опухолевых и других заболеваний толстой кишки (р<0.05). Уровень ночной экскреции 6-СОМТ с мочой был также высок у пациентов соответствующего возраста, страдающих хроническим язйенным колитом (1909±553 нг/час, р<0.05).

Экскреция 6-СОМТ при раке мочевого пузыря. У обследованных мужчин с первичным неоперированным раком мочевого пузыря средний уровень ночной экскреции 6-СОМТ с мочой составлял 858±132 нг/час, что на 15% меньше по сравнению с пациентами группы неопухолевого контроля соответствующего возраста (1009±176, р<0.05).

Опухоли у больных, в основном, были крупными (ТЗ-4), но локализованными и без отдаленных метастазов. Гистологическое исследование показало, что 47 из них представляли собой переходно-клеточные карциномы различных стадий дифферснцировки, 16 - аденокарциномы.

МТ и пролиферация опухолевых клеток: иммуноцитохимические корреляции

Корреляционный анализ между ядерной экспрессией РСИА, количеством МТ-иммунопозитивных клеток и соответствующим уровнем ночной экскреции 6-СОМТ с мочой был проведен у 116 пациентов с раком желудка (54), легких (32), толстой и прямой кишки (30) без отдаленных метастазов.

Корреляции между уровнем экскреции 6-СОМТ и экспрессией РСЫА в опухолевой ткани. В настоящее время установлено, что основным фактором, определяющим прогрессию новообразований, является пролиферативная активность опухолевых клеток. Изучению пролиферативной активности клеток в опухолях придается особое значение в связи с использованием этого параметра для прогнозирования реакции злокачественных опухолей на лучевую и лекарственную терапию.

В клинической практике и при экспериментальных исследованиях, как правило, для этих целей определяют митотический индекс. Однако известно, что опухоли с одинаковым митотическим индексом могут обладать разной скоростью роста. Многие исследователи подчеркивают, что прямая связь между митотической активностью и скоростью роста новообразований отсутствует (Райхлин Н.Т. и др., 1983; Осадчук М.А. и др., 1996; 1л$зош Р. е1 а1., 1997).

Отмечено, что у онкологических' больных" положительная корреляция между снижением пролиферативной активности опухолевЬк клеток и клинической реакцией наблюдается не всегда при использовании химиотерапии и лучевой терапии. ;

Поэтому в настоящее время для оценки пролиферативного статуса опухолевых клеток применяют иммуногистохимическое выявление ядерных белков (циклинов), принимающих участие в подготовке клеточного деления. К числу таких надежных маркеров относится ядерный антиген пролиферирующих клеток - РСЫА. Установлено, что РСИА синтезируется только в клетках с последующим удвоением ДНК. Этот протеин, комплиментарный к 5-полимеразе ДНК, появляется в ядрах делящихся клеток в середине О, периода; максимальная экспрессия его происходит в 8 фазе и постепенно снижается к концу периода в?. Фактически, индекс РСЫА отражает фракцию пролиферирующих клеток.

У всех обследованных пациентов была обнаружена достоверная положительная корреляция между уровнем экскреции 6-СОМТ и индексом РСИА в опухолевой ткани (в тесте Спирмена г5 = +0.915; р<0.0001, табл. 5).

Распределение пациентов на подгруппы в соответствии с локализацией опухолей также выявило строгую положительную корреляцию (г5 = + 0.736-1.000; р<0.01-0.001), особенно у больных раком толстой кишки, у которых индекс РСИА был в два раза выше (64±9%), по сравнению с больными раком желудка (36±5%) или легкого (39±5%).

Таблица 5

Показатели экскреции 6-СОМТ и пролиферативной активности опухолевых клеток при раковых опухолях различной локализации

Группа Экскреция 6-СОМТ (нг/час) Индекс РС^ <%)

Рак желудка 410±75 36±5

Рак легкого 408±63 39±5

Колоректальный рак 1449±309 64±9

Корреляции между уровнем экскреции 6-СОМТ и экспрессией МТ в опухолевой ткани. Анализ уровня экскреции 6-СОМТ выявил отчетливую огрицательную корреляцию этого показателя с внутриопухолевым содержанием МТ (табл. 6) не только у пациентов объединенной группы из всех 116 больных (г5 = -0.846; р<0.0001'), но также у

пациентов в трех подгруппах: больных раком желудка (п-54; г, ■= -0.905; р<0.0025), легких (п=32; и = -0.735; р<0.01) и толстой и прямой кишки (п=30; г5 = -0.928; р<0.01).

Таблица б

Показатели экскреции 6-СОМТ и экспрессии МТ в опухолевых клеток при злокачественных новообразованиях различпой локализации

Группа Экскреция 6-СОМТ (нг/час) Количество МТ-иммунореактивпых клеток в опухолях (на 1 мм2)

Рак желудка 410±75 191±37

Рак легкого 408±63 174±28

Колоректальный рак 1449±309 123±19

Среднее количество МТ-иммунопозитивных опухолевых клеток у больных раком толстой кишки было ниже (123±19), чем при раке желудка (191±37) или легких (174±28). Это указывает на то, что в быстро пролиферирующих опухолях уровень экспрессии МТ снижается.

Корреляции между уровнями экспрессии РС1УЛ и МТ в опухолевой ткани.

Среднее количество МТ-иммунопозитивных опухолевых клеток при раке толстой кишки было ниже, чем при раке желудка или легких при высокой пролиферативной активности, оцениваемой по критерию'РОГА. Этому соответствует отрицательная корреляция между индивидуальными значениями РСИА и МТ в различных опухолях (табл. 7).

Таблица 7

Показатели экспрессии РСКА и МТ в опухолевой ткани

Группа Индекс РС^ (%) Количество МТ-иммунореактивных клеток в опухолях (на 1 мм2)

Рак желудка 36±5 191±37

Рак легкого 39±5 174±28

Колоректальный рак 64±9 123±19

Эта закономерность прослеживается как в группе исследованных больных в целом (п=116 г8 = +0.924; р<0.001), так и в подгруппах с различными типами опухолей (г5 = +0.886; р<0.001).

Секреция МТ при болезни Альцгеймера

Экскреция 6-СОМТ у пациентов с болезнью Альцгеймера при различной клинической выраженности деменции. Изучение экскреции 6-СОМТ у пациентов с болезнью Альцгеймера показало сташстически достоверное снижение ее показателей при увеличении степени выраженности КВД. При КВД 1-й степени экскреция 6-СОМТ составляла 93±12 нг/час, при КВД 2-й степени - 69±9 нг/час, при КВД 3-й степени ее значения снижались до 52+9 нг/час (р<0.05).

Более того, между КВД и показателями экскреции 6-СОМТ существует строгая огрицагельная корреляция - чем сильнее выражена КВД, тем ниже уровни экспрессии 6-СОМТ. Показатели экскреции 6-СОМТ у пациентов с болезнью Альцгеймера при КВД 3-й степени снижаются по сравнению с контролем в 2.5 раза.

МТ и маркеры нейродегенеративных заболеваний: иммуноцитохимические корреляции

Экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера. Проведенные иммуноцитохимические исследования показали, что у абсолютного большинства пациентов с болезнью Альцгеймера в лимфоцитах крови содержится тау-протеин: выраженная положительная реакция была зарегистрирована в 49 из 53 исследуемых случаев. В 4 случаях болезни Альцгеймера реакция лимфоцитов с антителами к тау-протеину была слабо положительной.

Напротив, в конгроле у 26 из 28 добровольцев в лимфоцитах крови не обнаружено иммунореактивности к тау-протеину. Только в 2 случаях у здоровых людей единичные лимфоциты демонстрировали слабую положительную реакцию с антителами к тау-протеину.

Таким образом, применение иммуноцитохимического метода позволило впервые обнаружить тау-протеин в цитоплазме лимфоцитов крови у пациентов с болезнью Альцгеймера. Явное различие в иммуноцитохимической локализации тау-протеина между здоровыми и больными людьми свидетельствует о том, что этот белок может рассматриваться в качестве перспективного маркера для прижизненной диагностики

болезни Альцгеймера, а лимфоциты крови - как удобный объект для прижизненной диагностики этого заболевания.

Корреляции между экспрессией тау-протеина, белка Ьс1-х и МТ в лимфоцитах крови при болезни Альцгеймера. Обнаружение выраженной экспрессии тау-протеина в лимфоцитах крови и резкого снижения секреции МТ при болезни Альцгеймера обусловило интерес изучения возможной продукции МТ в лимфоцитах. При верификации экспрессии МТ в лимфоцитах крови актуальным представляется изучение корреляций между экспрессией тау-протеина, антиапоптозного фактора Ьс1-х и МТ. Это может явиться перспективным направлением для разработки критериев прогноза течения нейродегенеративных заболеваний.

' Таблица 8

Количественные показатели степени экспрессии тау-протеина, МТ и белка Ьс1-х в лимфоцитах крови при болезни Альцгеймера

Изучаемые маркеры Контрольная группа Пациенты с болезнью Альцгеймера

Количество иммуно-позитивных клеток на 1 мм2 (М±ю) Оптическая плотность (усл. ед.) Количество иммуно-позитивных клеток на 1 мм2 (М±т) Оптическая плотность (ycib ед.)

Окраска по Май-Грюнвальду 7680X315 0.24±0.01, 7250±820 0.26±0.01

Тау-протеин 69±12 0.32±0.02 6870±960* 0.68±0.02*

МТ 1250±270 0.54±0.03 187±29* 0.12±0.01*

Вс1-х 7100±564 ' 0.92±0.07 214±21* 0.26±0.01*

*р<0.05 по сравнению с показателями в контрольной группе.

Применение иммуноцитохимического метода позволило выявить экспрессию МТ и белка Ьс1-х в лимфоцитах, крови как -у здоровых добровольцев, так и у пациентов с

болезнью Альцгеймера. Компьютерный анализ микроскопических изображений дал возможность количественно оценить степень экспрессии изучаемых маркеров (табл. 8). Было установлено, что при окраске по Май-Грюнвальду общее количество лимфоцшов в мазках крови при болезни Альцгеймера практически не отличается от контроля. Применение иммуноцитохимических методов верификации молекул показало, что при болезни Альцгеймера в лимфоцитах крови человека происходит резкое снижение синтеза белка Ьс1-х и МТ, причем как за счет уменьшения количества лимфоцитов, продуцирующих эти факторы, так и за счет снижения уровня секреции веществ даже в тех клетках, которые сохранили способность продуцировать белок Ьс1-х и МТ.

Учитывая присущие МТ антиоксидантные свойства, полученные нами данные о существенном снижении выработки антиапоптозного фактора Ьс1-х и МТ в лимфоцитах крови у пациентов с болезнью Альцгеймера могут свидетельствовать как об усилении гибели нейронов путем апоптоза, так и об участии продуктов окислительного стресса в патогенезе болезни Альцгеймера.

Экспрессия МТ, р-амилоида и тау-протеина в желудке и козке при болезни

Альцгеймера. Проведенные иммуноцитохимические исследования показали, что во всех исследуемых случаях (как в контроле, так и при болезни Альцгеймера) в слизистой оболочке желудка и в коже выявляются клетки, дающие выраженную иммунопозитивную реакцию с антителами к МТ, р-амилоиду и тау-протеину. Экспрессия МТ обнаружена как в ЕС-клетках слизистой оболочки, так и вне желез в тучных клетках. В коже экспрессия МТ также обнаруживается в тучных клетках. Иммунореактивность к р-амилоиду и тау-протеину также обнаружена в тучных клетках слизистой оболочки желудка и в коже.

Таким образом, применение иммуноцитохимического метода позволило впервые обнаружить экспрессию р-амилоида и тау-протеина в цитоплазме тучных клеток у пациентов с болезнью Альцгеймера, что подтверждает правомочность взглядов на болезнь Альцгеймера как на системное заболевание.

Компьютерный анализ микроскопических изображений позволил установить количественные параметры секреции изученных веществ в биопсиях желудка и кожи при болезни Альцгеймера. Было обнаружено, что при болезни Альцгеймера изменения экспрессии МТ касаются только МТ, продуцируемого тучными клетками, в то время как показатели экспрессии МТ в ЕС-клетках (как по количеству иммунопозитивных клеток, так и по оптической плотности) практически не изменяются.

Протективное действие экстрапинеального МТ по отношению к нейроДегеИеративным процессам подтверждается выраженной отрицательной связью

между его экспрессией и экспрессией р-амилоида и тау-протеина в слизистой оболочке желудка. Показать наличие подобной корреляции для кожи при болезни Альцгеймера не представилось возможным, так как мы не располагали биоптатами кожи у лиц пожилого и старческого возраста без нейродегенеративных заболеваний.

Представленные данные свидетельствуют о важной роли МТ, одного из гормонов диффузной нейроэндокринной системы, в регуляции физиологических и патологических процессов в живом организме. В течение многих лет МТ рассматривался только как гормон пинеальной железы (эпифиза). Появление высокочувствительных антител к индолилалкиламинам позволило идентифицировать МТ не только в пинеальной железе, но также и в экстрапинеальных тканях. Экстрапинеальный МТ был обнаружен в сетчатке, мозжечке, слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, печени, почках, надпочечниках, тимусе, щитовидной железе, поджелудочной железе, яичниках, каротидном теле, плаценте, эндометрии. Также экспрессия МТ верифицирована в тучных клетках, естественных киллерах, эозинофилытых лейкоцитах, тромбоцитах, эндотелиаггьных клетках.

Установлено, что функционально МТ-продуцирующие клетки являются неотъемлемой частью диффузной нейроэндокринной системы как универсальной системы адаптации, контроля и защиты организма. Принимая во внимание большое количество МТ-продуцирующих клеток во многих органах, широкий спектр биологической активности МТ (особенно его главное свойство - универсального регулятора биологических ритмов), представляется возможным рассматривать МТ в качестве ключевой сигнальной молекулы для локальной координации клеточных функций.

Ранее в ходе экспериментов было установлено, что пинеалэктомия стимулирует рост экспериментальных опухолей, в то время как водные экстракты эпифиза и МТ ингибируют этот процесс. В последние годы в ряде наблюдений и наших собственных исследованиях у пациентов с различными злокачественными новообразованиями продемонстрированы четкие изменения уровня экскреции 6-СОМТ с мочой, направленность которых зависела как от гистологического типа опухоли, так и от стадии заболевания.

Механизмы этого явления пока не вполне ясны. Вероятно, они включают и центральные, и периферические компоненты. Такая точка зрения подтверждается тем фактом, что, несмотря на различия в уровне ночной экскреции 6-СОМТ у больных с различными локализациями опухолей (например, рак желудка, легкого, толстой и прямой кишки), продемонстрированы позитивные сравнимые корреляции значений 6-СОМТ со степенью пролиферации опухолевых клеток' Очевидао, что более глубокий анализ

механизмов этих процессов будет способствовать лучшему пониманию сложных взаимоотношений между опухолью и организмом, складывающихся в условиях злокачественного роста и явится новым направлением в разработке диагностических и прогностических маркеров опухолевых заболеваний.

Одним из наиболее серьезных патологических процессов среди нейродегенеративных заболеваний, являегся болезнь Альцгеймера. Болезнь Альцгеймера характеризуется прогрессирующей потерей памяти, приводящей к деменции и смерти. Ею в настоящее время страдают более 20 миллионов человек в мире, и ожидается, что в ближайшие 30 лет это число может удвоиться (Kvetnoy I. et al., 2000).

Имеется достаточно доказательств того, что мозг при болезни Альцгеймера имеет выраженные признаки усиленного окислительного стресса (Kiechle F., Malinski Т., 1993). Снижение уровней МТ при нейродегенеративных заболеваниях выявлено во многих исследованиях (Merill J., Jonakait G., 1995; Kripke D. et al., 2003). Установлено, что МТ является мощным поглотителем гидроксильных радикалов и при некоторых обстоятельствах защищает от свободпых радикалов более эффективно, чем хорошо известный эндогенный антноксидант - глютатион ( Reiter R. et al., 1993,1995).

Важность изучения роли МТ в патогенезе болезни Альцгеймера иллюстрируется данными о том, что растворимые формы длинпоцепочечною ß-амилоидного предшественника Aß-пептида (АРР) были обнаружены в секреторных гранулах хромаффинных клеток, где также синтезируются МТ и допамин. Кроме того, было показано, что стимуляция секреции АРР протекает параллельно стимуляции секреции катехоламинов и хромогранина А, что указывает на опосредование секреции АРР хромаффинными гранулами (Efthimiopoulos S. et al., 1996). Поскольку секреция АРР хромаффишшми клетками зависит от времени суток, можно прелположить, что МТ оказывает непосредственный эффект на этот процесс.

На наш взгляд, верификация экспрессии двух ключевых белков, участвующих в патогенезе болезни Альцгеймера, - тау-протеина и ß-амилоида вне мозга в образцах тканей, доступных для биопсии, позволяет рассматривать эти белки в качестве перспективных маркеров. Лимфоциты крови и тучные клетки могут являться удобными объектами для прижизненной диагностики нейродегенеративных заболеваний.

Проведенные исследования подтверждают существование тесных связей между нарушением синтеза МТ и старением. Проявлением этого служит вовлечение МТ в патогенез заболеваний, ассоциированных с возрастом, наиболее значимыми из которых являются неопластические и нейродегенеративные процессы.

выводы

1. Разработанный унифицированный протокол клинических данных позволяет объективизировать интерпретацию результатов при определении экскреции 6-СОМТ у человека.

2. Динамика секреции пинеального МТ в процессе старения организма человека достоверно изменяется. Показатели экскреции 6-СОМТ снижаются к 60 годам в два раза, а после 80 лет значения экскреции 6-СОМТ ниже показателей 20-30-летних более, чем в 5 раз.

3. Количество экстрапинеальных МТ-иммунопозитивных ЕС-клеток в слизистой оболочке желудка сохраняется практически до 60 лет, в более старом возрасте оно достоверно снижается. Оптическая плотность МТ-иммунопозитивных ЕС-клеток

, не меняется с возрастом, оставаясь стабильным показателем. Это свидетельствует о снижении выработки МТ в слизистой оболочке желудка у старых людей за счет численного уменьшения популяции ЕС-клеток, а не за счет ослабления его синтеза в самих ЕС-клетках. , , ,

4. При опухолевых процессах секреция МТ достоверно меняется. Изменения носят разноплановый характер и зависят как от органной локализации опухоли, так и от степени ее дифференцировки и прогрессии. Уровень экскреции 6-СОМТ прогрессивно снижается при увеличении размеров опухоли и метастазировании. При раке молочной железы операция приводит к восстановлению нормального уровня экскреции 6-СОМТ.

5. Обнаружена достоверная положительная корреляция между уровнем экскреции 6-СОМТ и индексом РСИА в опухолевой ткани. Отчетливая отрицательная корреляция зарегистрирована между показателями экскреции 6-СОМТ и внутриопухолевым содержанием МТ. Достоверная отрицательная корреляция выявлена также между индивидуальными значениями РСКА и экспрессией МТ в опухолевой ткани.

6. Наличие достоверных корреляций между экскрецией 6-СОМТ и показателями опухолевого гомеостаза позволяют характеризовать 6-СОМТ как новый перспективный маркер для его применения в онкологической практике в целях оптимизации диагностики, оценки прогноза и качества лечения.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА С. Петербург ]

7. У пациентов с болезнью Альцгеймера обнаружено достоверное снижение экскреции 6-СОМТ пропорциональное степени клинической выраженности деменции.

8. Обнаружена экспрессия тау-протсина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера, тогда как в контроле лимфоциты крови не проявляют иммунореактивности к тау-протеину. Таким образом, тау-протеин может рассматриваться как перспективный маркер, а лимфоциты крови как удобный объект для прижизненной диагностики болезни Альцгеймера.

9. При болезни Альцгеймера в лимфоцитах крови происходит значительное снижение синтеза белка Ьс1-х и МТ, что может свидетельствовать как об усилении гибели нейронов путем апоптоза, так и об участии продуктов окислительного стресса в патогенезе заболевания.

10. Обнаружена экспрессия Р-амилоида и тау-протеина в тучных клетках слизистой оболочки желудка и кожи у пациентов с болезнью Альцгеймера, что свидетельствует о системном характере данной патологии.

И. Экстрапинеальный МТ может рассматриваться как эндогенный фактор противодействия развитию нейродегенеративных процессов, что подтверждается достоверной отрицательной связью между его продукцией и экспрессией Р-амилоида и тау-протеина в слизистой оболочке желудка.

12. Результаты исследования свидетельствуют о перспективности использования МТ как биологического маркера, позволяющего оптимизировать диагностику и прогноз при патологических процессах, ассоциированных с возрастом -онкологических и нейродегенеративных заболеваниях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Анализ экскреции 6-СОМТ рекомендуется проводить в пожилом и старческом возрасте с целью оптимизации диагностики, оценки прогноза и эффективности лечения онкологических и нейродегенсративных заболеваний.

2. При анализе экскреции 6-СОМТ у больных, онкологическими, нейродегенеративными и другими заболеваниями рекомендуется использовать разработанный протокол, который позволяет объективизировать клиническую интерпретацию результатов исследования.

3. Для определения прогноза развития новообразований рекомендуется при патогистологическом исследовании проводить иммуногистохимическую реакцию для выявления МТ-иммунореактивных клеток в ткани опухоли.

4. Для подтверждения этиопатогенеза деменции, связанной с болезнью Альцгеймера, рекомендуется проводить иммуноцгегохимическое исследование лимфоцитов крови пациентов для выявления экспрессии тау-протеина.

5. При исследовании биоптатов слизистой оболочки желудка и кожи у больных пожилого и старческого возраста, имеющих в качестве сопутствующего заболевания деменцию различной выраженности, рекомендуется проводить иммуногистохимическое исследование для выявления экспрессии р-амилоида или тау-протеина как маркеров болезни Альцгеймера.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Диагностическое значение иммуноцитохимической идентификации тау-протеина в лимфоцитах крови человека при болезни Альцгеймера / И.М. Кветной, X. Эрнандес-Яго, Т.В. Кветная, В.Х. Хавинсон, В.В. Малинин, А.А. Ярилин, Н.И. Шарова, Х-Р. Блеса, В.Н. Анисимов, Л.В. Ленская, С.Ф. Случевская, С.И. Чекалина, О.Ю. Токарев, В.В. Южаков // Иммунология. - 2001. - Т. 2. - С. 46-48.

2. Иммуногистохимическая верификация тау-протеина в тучных клетках при болезни Альцгеймера / И.М. Кветной, Т.В. Кветная, И.Ю. Ряднова, Б.Б. Фурсов, X. Эрнандес-Яго, Х.-Р. Блеса // Архив патол. - 2003. - Т. 1. - С. 67-75.

3. Кветная Т.В. б-сульфатоксимелатонин у больных раком: диагностические и прогностические аспекты / Т.В. Кветная, К. Бартш, X. Бартш // Сборник науч. трудов «Эндокринологическая хирургия». - Уфа, 1995.-С. 189-193.

4. Кветная Т.В. Диагностическая ценность 6-сульфатоксимелатонина как биологического маркера опухолевого роста / Т.В. Кветная, И.М. Кветной // Сборник науч. трудов «Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике». - Чита, 2002. - С. 59-60.

5. Кветная Т.В. Мелатонин в диагностике и оценке прогноза злокачественных опухолей у пожилых людей//Успехи геронтол.-2003.-Т. 12.-С. 132-142.

6. Кветная Т.В. Мелатонин как новый биологический маркер гериатрической патологии - опухолевого роста / Т.В. Кветная, И.М. Кветной // Сб. научн. трудов «Актуальные проблемы гериатрии», посвященный 15-летию кафедры гериатрии СПб МАЛО.-СПб МАПО, 2001,- С. 144-145.

7. Кветная Т.В. Мелатонин: роль и значение в диагностике возрастной патологии / Т.В. Кветная, И.В. Князькин. - СИб: ВМедА, 2003. - 92 с.

8. Кветная T.B. Патоморфологические и радиобиологические аспекты изучения

* ' / , N . 'II ''

модифицирующих свойств мслатонина при действии ионизирующей радиации на культуру клеюк асцитной карциномы Эрлиха // Сборник научн. трудов «Регуляторные пептиды и биогенные амины: радиобиологические и онкорадиологические аспекты». - Обнинск, 1992. - С. 152-155. ..

9. Кветной И.М. Болезнь Альцгеймера - новые технологии в прижизненной диагностике / И.М. Кветной, Т.В. Кветная // Материалы научн. конф. «Биологическая, медицинская и ветеринарно-медицинская наука и новейшие технологии на благо человека и человечества». Санкт-Петербург, 2003, С. 23-24.

10. Кветной И.М. Внеэпифизарный синтез мелатонипа / И.М. Кветной, Н.Т. Райхлин, Т.В. Кветная // В книге: APUD-система (общепатологические и онкологические аспекты) Том 2. / И.М. Кветной, Н.Т. Райхлин, М.А. Осадчук. - Обнинск, 1993. - С. 38-48.

П.Мелатонин и серотонин при воспалительных заболеваниях и раке толстой и прямой кишки / И.В. Козлова, М.А. Осадчук, И.М. Кветной, Т.В. Кветная, В.В. Попучиев // Клин. мед. - 2000. - Т. 78, № 6. - С. 32-35.

12. Мелатонин, апоптоз и пролиферативная активность опухолей человека / Н.Т. Райхлин, К. Бартш, X. Бартш, Т. В. Кветная // Труды 1-го Онкол. Конгр. СНГ. -Москва, 1996.-С. 173.

П.Мелатонин: итоги и перспективы изучения в онкологии / И.М. Кветной, Т.В. Кветная, К. Бартш, X. Бартш II Сборник научн. трудов «Регуляторные пептиды и биогенные амины: радиобиологические и онкорадиологические аспекты». -Обнинск, 1992.-С. 29-34.

14. Экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови человека: возможности прижизненной диагностики болезни Альцгеймера / И.М. Кветной, Т.В. Кветная, В.Х. Хавинсон, A.A. Ярилин, Н.И. Шарова // Материалы V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001». -Медицинская иммунология. - 2001. - Том 3, № 2. - С. 205.

15. Южаков В.В. Функциональная морфология эндокринных и тучных клеток при опухолевом росте / В.В. Южаков, Т.В. Кветная, Э.С. Курилец // Труды 1-го Конгр. Межд. ассоциации патологов. - Москва, 1995. - С. 190-191.

16. Яковлева Н.Д. Эндокринные клетки в неэндокринных опухолях желудка / Н.Д. Яковлева, Н.А. Погудипа, Т.В. Кветная // Сборник научн. трудов «Эндокринологическая хирургия». - Уфа, 1995. - С. 218-221.

17. Яковлева Н.Д. Эндокринные клетки желудка: диагностическое значение у больных раком / Н.Д. Яковлева, Р.А. Бродский, Т.В. Кветная // Труды 1-го Конгр. Межд. ассоциации патологов. - Москва, 1995. - С. 192.

18. Changes of nocturnal excretion of 6-sulphatoxymelaton in patients with lung and stomach malignant tumors after operation / V.N. Medvedev, P.I. Garbuzov, T.V. Kvetnaia, C. Bartsch, II. Bartsch, N.T. Raikhlin, A.G. Perevoschikov, M.I. Davydov, I.S. Stilidi, Y.M. Timofeev // In: Melatonin: general biological and oncological aspects / Kvetnoy I.M., Reiter R.J. eds. - Obninsk: MRRC Press, 1994. - P. 77-78.

19. Diffuse neuroendocrine system and mitochondrial diseases: molecular and cellular bases of pathogenesis, new approaches to diagnosis and therapy / I.M. Kvetnoy, J. Ilemandez-Yago, J.M. Hernandez, T.V. Kvetnaia, R.J. Reiter, V. Kh. Khavinson // Neuroendocrinol. Lett. - 2000. - Vol. 21. - P. 85-101.

20. Endogenous serotonin and apoptosis of tumour cells / V.V. Yuzhakov, I.M. Kvetnoy, E.S. Kurilets, T.V. Kvetnaia // Proc. Roy. Microsc. Soc. -1995. - Vol. 30, N 2. - P. 123.

21. Experimental and clinical study of diagnostic usefiilness of melatonin determination in cancer patients / G.A. Petrova, A.N. Dedenkov, I.M. Kvetnoy, V.V. Yuzhakov, A.G. Konopljannikov, T.V. Kvetnaia, P.I. Garbuzov, I.M. Levin // In: Melatonin: general biological and oncological aspects / I.M. Kvetnoy, R.J. Reiter eds. - Obninsk: MRRC Press, 1994.-P. 72-74.

22. Extrapineal melatonin in the natural killer cells, eosinophilic leukocytes and must cells: possible significance in oncology / I.M. Kvetnoy,.T.V. Kvetnaia, E.S. Kurilets, V.V. Yuzhakov // Abstracts of the 1st Intern. Meet, on Neuroimmunoendocrinology. - Locarno (Switzerland), 1993. - P. 21.

23. Gastrointestinal melatonin: cellular identification and biological role / I.M. Kvetnoy, I.E. Ingel, T.V. Kvetnaia, N.K. Malinovskaya, S.I. Rapoport, N.T. Raikhlin, A.V. Trofimov, V.V. Yuzhakov // Neuroendocrinol. Lett. - 2002. - Vol. 23, N 2. - P. 121-132.

24. Gut neuroendocrine cells: relationship to the proliferative activity and apoptosis of mucous epitheliocytes in aging / I.M. Kvetnoy, L.N. Mikhina, V.N.Anisimov, C. Franceschi, L. Piantanelli, T.V. Kvetnaia // Neuroendocrinol. Lett. - 2001. -Vol. 22. - P. 337-341.

25. Kvetnaia T.V. Melatonin in human cancer patients: new promising marker for tumor diagnosis and prognosis // Neuroendocrinol. Lett. - 2001. - Vol. 22, N 4. - P. 287-288.

26. Kvetnaia T.V. Melatonin as possible biological modifier of tumor radiosensitivity // Cancer Biotherapy and Radiopharm. - 1997. - Vol. 12, N 6. - P. 424-425.

27. Kvetnaia T.V. Melatonin as a new promising marker for tumor diagnosis and prognosis //Abstracts of Intern. Symposium "Melatonin: clinical significance and therapeutic application". - Polanica Zdroj (Poland), 2001. - P. 48-49.

28. Kvetnaia T.V. Melatonin in old human cancer patients: new promising marker for tumor diagnosis and prognosis / T.V. Kvetnaia, J. Hernandez-Yago // Abstracts of Valencia Forum. - Valencia (Spain), 2002. - P. 33-34.

29. Kvetnaia T.V. Prognostic value of melatonin secretion in women with ovary and breast cancer / T.V. Kvetnaia, I.Yu. Kogan, I.M. Kvetnoy // Proc. of the Intcm. Ecologic Forum: Environment and Human Health, St. Petersburg (Russia), 2003. - P. 399-400.

30. Kvetnoy I.M. Role of extrapineal melatonin and related APUD-series peptides in malignancy / I.M. Kvetnoy, T.V. Kvetnaia, V.V. Yuzhakov // In: The Pineal Gland and Cancer: Neuroimmunoendocrine Mechanisms in Malignancy / C. Bartsch, H. Bartsch, D.E. Blask, D. Cardinali, W. Hrushesky, D. Mecke eds. - Heidelberg: Springer, 2000. -P. 259-274.

31. Melatonin and colon carcinogenesis. II. Intestinal melatonin-containing cells and scrum melatonin level in rats with 1,2-dimethylhydrazine-induced colon tumors / V.N. Anisimov, I.M. Kvetnoy, N.K. Chumakova, T.V. Kvetnaia, A.O. Molotkov, N.A. Pogudina, I.G. Popovich, V.V. Popuchiev, M.A. Zabezhinsky, H. Bartsch, C. Bartsch // Exp. Toxic. Pathol. - 1999. - Vol. 51. - P. 47-52.

32. Melatonin and proliferative activity of tumors: successful combination of immunohistochemical and radioimmunological methods for definition of prognosis in humans / I.M. Kvetnoy, C. Bartsch, H. Bartsch, T.V. Kvetnaia, N.T. Raihklin // Abstracts of the XIV Intern. Congr. on Histochemistry and Cytochemistry, Kyoto (Japan). Acta Histochemica et Cytochemica. - 1996. - Suppl. 29. -P. 304-305.

33. Melatonin and proliferative activity of tumour cells / T.V. Kvetnaia, I.M. Kvetnoy, C. Bartsch, H. Bartsch, N.T. Raikhlin // Proc. Roy. Micr. Soc. - 1997. - Vol. 32, N 2i. - P. 50.

34. Melatonin and tumour growth: from experiments to clinical application / I.M. Kvetnoy, T.V. Kvetnaia, A.G. Koiiopljannikov, A.F. Ts>yb, V.V. Yuzhakov //' In: Melatonin: general biological and oncological aspects / Kvetnoy I.M., Reiter R.J. eds. - Obninsk: MRRC Press, 1994.-P. 17-23.

35. Melatonin in patients with cancer of extra-reproductive location / Kvetnaia T.V., Kvetnoy I.M., Bartsch H., Bartsch C., Mecke D. // In: The Pineal Gland and Cancer: Neuroimmunoendocrine Mechanisms in Malignancy / Bartsch H., Bartsch C., D.E. Blask, D. Cardinali, W. Hrushesky, Mecke p. eds. - Heidelberg: Springer, 2000. - P. 177-196.

36. Neuroimmunoendocrinology: microscopical advances for new discipline / l.M. Kvetnoy, T.V. Kvetnaia, I.V. Knyazkin, S.S. Konovalov //Abstracts of the 6lh Multinat. Congress on Microscopy - Pula (Croatia), 2003. - P. 126-127.

37. Nocturnal 6-sulphatoxymclatonin secretion in patients with benign and malignant tumours of the thyroid gland and non-tumour controls / B.J. Drozdovsky, P.l. Garbuzov, T.V. Kvetnaia, C. Bartsch, H. Bartsch // In: Melatonin: general biological and oncological aspects / l.M. Kvetnoy, R.J. Reiter eds. - Obninsk: MRRC Press, 1994. - P. 47-48.

38. Nocturnal urinary 6-sulfatoxymelatonin excretion in patients with gastrointestinal and lung cancer shows positive correlations with proliferating cell nuclear antigen (PCNA) -immunopositive tumor cells / C. Bartsch, l.M. Kvetnoy, T.V. Kvetnaia, H. Bartsch, H. Franz, N.T. Raikhlin, D. Mecke, A.O. Molotkov // J. Pineal. Res. - 1997. - Vol. 23. - P. 90-96.

39. Potential role of melatonin in the control of non-endocrine human and experimental tumors cancer / l.M. Kvetnoy, V.V. Yuzhakov, C. Bartsch, H. Bartsch, T.V. Kvetnaia // Biotherapy and Radiopharm. -1997,-Vol. 12,N 6.-P. 425.

40. Tau-protein expression in human blood lymphocytes: possible implications for diagnosis of Alzheimer's disease / l.M. Kvetnoy, T.V. Kvetnaia, J. Hermandez-Yago, V.Kh. Khavinson, V.V. Malinin, L.V. Lenskaia, S.F. Sluchevskaia // Abstracts of the 2nd European Congr. on Biogerontology, St. Petersburg (Russia). Advances in Gerontol. -2000.-Vol. 5-P. 24.

41. Tau-protein expression in human blood lymphocytes: promising marker and suitable sample for life-time diagnosis of Alzheimer's disease / l.M. Kvetnoy, J. Hernandez-Yago, T.V. Kvetnaia, V. Kh. Khavinson, V.V. Malinin, V.N. Anisimov, L.V. Lenskaia, S.F. Sluchevskaia //Neuroendocrinol. Lett. - 2000. - Vol. 21.-P. 313-318.

КВЕТНАЯ Т.В. Мелатонин как биологический маркер опухолевых и нейродегенеративяых заболеваний в пожилом и старческом возрасте // Автореф. дис....док. биол. наук: 14.00.53,14.00.14 - СПб., 2003. - 40 с.

Формат 60x84 1/8. Объем 2,0 усл. п.л. Тираж 150 экз. Заказ . Бесплатно. Подписано к печати 22.05.2003. Отпечатано с готового оригинал-макета ЧП Свид. № 104090 ИТД-13 от 19.07.98

Р 1 4 5 4 Ô

Актуальность проблемы

Мелатонин (МТ) - гормон, играющий важную роль в регуляции гомеостаза организма, впервые обнаружен в 1958 году в пинеальной железе (эпифизе) [241]. Основным метаболитом МТ является 6-сульфатоксимелатонин (6-СОМТ). По концентрации 6-СОМТ в моче можно косвенно судить о продукции МТ эпифизом (94).

За прошедшие сорок пять лет после его открытия было доказано, что МТ является ключевым регулятором биологических ритмов [11, 14, 313]. Данный гормон участвует в обеспечении многих жизненно важных физиологических процессов, таких, как созревание и развитие половых органов; пигментный обмен; метаболизм свободных радикалов; иммунный ответ; регуляция настроения и сна; пролиферация и дифференцировка клеток [5-10, 13, 29, 74, 257].

В настоящее время твердо установлено, что пинеальная железа не является исключительным органом, способным синтезировать МТ [130, 164].

Многочисленными исследованиями показано, что экстрапинеальный МТ широко распространен в организме человека и животных. Клетки, продуцирующие МТ, обнаружены в желудочно-кишечном тракте, дыхательных путях, поджелудочной железе, надпочечниках, щитовидной железе, тимусе, мозжечке, мочеполовой системе, плаценте и других органах [132, 305,225].

Более того, обнаружен активный синтез МТ в неэндокринных клетках -тучных клетках, естественных киллерах, эозинофильных лейкоцитах, тромбоцитах, эндотелиоцитах [226, 227].

Такое широкое распространение МТ в организме отражает его ключевую роль как межклеточного нейроэндокринного регулятора и координатора многих сложных и взаимосвязанных биологических процессов [315, 318].

При старении происходит инволюция пинеальной железы [74], и, как следствие этого, снижается концентрация МТ в организме [11]. Это, в свою очередь, приводит к возрастным изменениям ряда метаболических процессов и негативно отражается на функции многих органов и систем. Однако при этом сведения об изменении уровней секреции экстрапинеального МТ при старении отсутствуют, что ограничивает понимание роли и значения экстрапинеальных источников синтеза этого важного гормона и свидетельствует о необходимости исследований в этом направлении.

Одним из наиболее важных биологических свойств МТ является его способность контролировать клеточное деление [98]. МТ способен ингибировать митоз клеток, вызывая задержку на стадии метафазы. Были опубликованы сообщения, касающиеся ингибирующего действия МТ на рост клеток, зависимых от половых стероидных гормонов [105, 110], а также на развитие экспериментальных злокачественных опухолей в условиях in vivo и in vitro [102, 111, 123, 124]. На этом основании было выдвинуто предположение о том, что МТ является природным онкостатическим гормоном, способным предотвращать неопластический рост [122].

Подобное обстоятельство определяет актуальность проведения исследований по определению секреции МТ у онкологических больных. Это может иметь не только фундаментальное теоретическое значение для более глубокого понимания эндогенных механизмов, участвующих в процессах неопластической трансформации, но и явиться основой для разработки новых диагностических и прогностических маркеров при опухолевых заболеваниях.

Нейродегенеративные заболевания, в частности болезнь Альцгеймера, являются патологическими процессами, ассоциированными с возрастом [39, 73]. Их прижизненная диагностика чрезвычайно трудна, но крайне необходима для выбора оптимального патогенетически обусловленного варианта лечения. Известно, что в механизме развития болезни Альцгеймера важное место занимает нейротоксическое действие свободных радикалов [315]. В последние годы установлено, что МТ, как сильный эндогенный поглотитель свободных радикалов, играет важную роль в защите нейронов от окислительного стресса [322, 323].

В этой связи, проведение исследований по изучению взаимоотношений экстрапинеального МТ с ключевыми молекулами, вовлеченными в патогенез болезни Альцгеймера - р-амилоидом и тау-протеином, может иметь важное значение для разработки прижизненных маркеров нейродегенеративных заболеваний.

Опухолевый рост и нейродегенеративные заболевания являются наиболее значимыми патологическими процессами, ассоциированными с возрастом [73, 75, 202, 203]. Поэтому, в связи с вышеизложенными обстоятельствами, актуальной и необходимой научно-практической задачей является проведение исследований по оценке МТ в качестве возможного биологического маркера этих патологических процессов с целью оптимизации диагностики, оценки прогноза и лечения заболеваний.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение МТ как биологического маркера опухолевых и нейродегенеративных заболеваний у лиц пожилого и старческого возраста.

В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать унифицированный протокол клинических данных для объективной интерпретации результатов определения экскреции 6-СОМТ у человека.

2. Изучить динамику секреции МТ в организме человека при старении.

3. Изучить показатели экскреции 6-СОМТ у больных с опухолями различной локализации и провести корреляционный анализ этих показателей с пролиферативной активностью опухолей.

4. Изучить секрецию МТ у пациентов с болезнью Альцгеймера.

5. Верифицировать возможную внемозговую экспрессию ключевых молекул, участвующих в патогенезе болезни Альцгеймера - Р-амилоида и тау-протеина, для разработки метода прижизненной диагностики этого заболевания.

6. Оценить эффективность использования МТ как биологического маркера при диагностике и прогнозе течения онкологических и нейродегенеративных заболеваний у лиц пожилого и старческого возраста.

Научная новизна работы

Установлено изменение динамики секреции МТ в процессе старения организма. При этом впервые выявлено, что если уровень пинеального МТ прогрессивно снижается с возрастом, то секреция экстрапинеального МТ остается стабильной до 60 лет. После 60 лет выработка экстрапинеального МТ начинает снижаться, но медленнее, чем уровень пинеального МТ. Это позволяет поддерживать регуляцию тропных к МТ физиологических процессов на достаточно стабильном уровне в пожилом возрасте.

Обнаружено, что при опухолевых процессах секреция МТ изменяется. Эти изменения носят разноплановый характер и зависят как от органной локализации опухоли, так и от степени ее дифференцировки и прогрессии. Уровень экскреции 6-СОМТ прогрессивно снижается при увеличении размеров опухоли и метастазировании.

Установлено, что оперативное удаление опухоли у больных раком молочной железы приводит к восстановлению нормального уровня экскреции 6-СОМТ.

Впервые зарегистрированы достоверные корреляции между величиной экскреции 6-СОМТ и показателями опухолевого гомеостаза: положительная корреляция между уровнем экскреции 6-СОМТ и пролиферативной активностью опухолевых клеток; отрицательная корреляция между показателями экскреции 6-СОМТ и внутриопухолевым содержанием МТ; отрицательная корреляция между пролиферативной активностью клеток и экспрессией МТ в опухолевой ткани.

У пациентов с болезнью Альцгеймера установлено достоверное снижение экскреции 6-СОМТ. Впервые обнаружена экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера и показано отсутствие иммунореактивности к тау-протеину лимфоцитов крови в контрольной группе.

Выявлено значительное снижение синтеза белка bcl-x и уровня МТ в крови при болезни Альцгеймера как за счет уменьшения количества лимфоцитов, продуцирующих эти факторы, так и за счет снижения уровня секреции веществ даже в тех клетках, которые сохранили способность продуцировать bcl-x и МТ.

Впервые обнаружена экспрессия Р-амилоида и тау-протеина в цитоплазме тучных клеток слизистой оболочки желудка и кожи у пациентов с болезнью Альцгеймера, что подтверждает правомочность взглядов на болезнь Альцгеймера как на системное заболевание.

Впервые показана выраженная отрицательная связь между продукцией МТ и экспрессией р-амилоида и тау-протеина в слизистой оболочке желудка, что свидетельствует о протекторной роли экстрапинеального МТ как эндогенного фактора противодействия развитию нейродегенеративных процессов.

Практическая ценность работы

На основании исследования секреции МТ у людей разных возрастных групп разработан унифицированный протокол клинических данных, позволяющий объективизировать интерпретацию полученных результатов при определении экскреции 6-СОМТ у человека.

Обнаружение достоверных корреляций между экскрецией 6-СОМТ и показателями опухолевого гомеостаза позволяет оценить 6-СОМТ как новый перспективный маркер для его применения в онкологической практике в целях оптимизации диагностики и оценки прогноза развития опухоли.

Выявленное снижение экскреции 6-СОМТ у пациентов с болезнью Альцгеймера и установленные корреляции ее показателей со степенью клинической выраженности деменции позволяют расценивать 6-СОМТ как информативный критерий тяжести и прогноза заболевания.

Впервые обнаруженная экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера и отсутствие иммунореактивности к тау-протеину у пациентов контрольной группы позволяют рассматривать тау-протеин как перспективный маркер, а лимфоциты крови как удобный объект для прижизненной диагностики болезни Альцгеймера.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о высокой ценности МТ как биологического маркера при диагностике, оценке прогноза течения и эффективности лечения патологических процессов, ассоциированных с возрастом, в частности нейродегенеративных и онкологических заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан унифицированный протокол клинических данных, позволяющий объективизировать интерпретацию полученных результатов при определении экскреции 6-СОМТ у человека.

2. Секреция МТ с возрастом прогрессивно снижается, однако, динамика этого процесса неодинакова для пинеального и экстрапинеального МТ. Стабильная выработка МТ в желудочно-кишечном тракте до 60 лет и ее более медленное снижение по сравнению с пинеальным МТ в старческом возрасте обеспечивает регуляцию физиологических процессов на достаточном уровне.

3. Достоверные корреляции между экскрецией 6-СОМТ и показателями опухолевого гомеостаза позволяют оценить МТ как новый перспективный неинвазивный маркер для оптимизации диагностики и оценки прогноза развития опухоли.

4. Обнаружение экспрессии тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера позволяет рассматривать этот белок как перспективный маркер, а лимфоциты крови как удобный объект для прижизненной диагностики болезни Альцгеймера.

5. Резкое снижение выработки антиапоптозного фактора bcl-x и МТ, обладающего сильными антиоксидантными свойствами, в лимфоцитах крови у пациентов с болезнью Альцгеймера свидетельствует о непосредственном участии продуктов окислительного стресса в апоптотической гибели нейронов при нейродегенеративных процессах.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Международном симпозиуме «Мелатонин: общебиологические и онкорадиологические аспекты» (Обнинск, Россия, 1992); I Международной конференции по нейроиммуноэндокринологии (Локарно, Швейцария, 1993); научном семинаре Отдела гистологии и микроскопической анатомии Академического центра Университета Антверпена (Антверпен, Бельгия, 1993); 1-ом конгрессе Международной Ассоциации патологоанатомов (Москва, Россия, 1995); Международной конференции CYTO-95 (Саутхэмптон, Великобритания, 1995); 1-ом Онкологическом конгрессе СНГ (Москва, Россия 1996); научном семинаре Центра биомедицинских исследований университета Тюбингена (Тюбинген, Германия, 1996); XIV Международном конгрессе по гистохимии и цитохимии (Киото, Япония, 1996); конференции Норвежского общества гастроэнтерологов (Трондхейм, Норвегия, 1997); Международной конференции CYTO-97 (Йорк, Великобритания, 1997); 3-й Международной конференции «Пинеальная железа и рак» (Блауберин, Германия, 1997); научной сессии Израильского общества гистохимии (Тель-Авив, Израиль, 1999); 2-ом Европейском конгрессе по биогеронтологии (Санкт-Петербург, Россия, 2000); научном семинаре Института цитологических исследований (Валенсия, Испания, 2000); научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 2001» (Санкт-Петербург, Россия, 2001); научном семинаре Института анатомии II Университета Гете (Франкфурт-на-Майне, Германия, 2001); научном семинаре Лаборатории по изучению биологических ритмов Университета Пастера (Страсбург, Франция, 2001); Международном симпозиуме «Мелатонин: клиническое значение и терапевтическое применение» (Поляница-Здрой, Польша, 2001); Международном геронтологическом Форуме (Валенсия, Испания, 2002); научном семинаре Нидерландского Института мозга (Амстердам, Голландия, 2002); научной конференции «Биологическая, медицинская и ветеринарно-медицинская наука и новейшие технологии на благо человека и человечества» (Санкт-Петербург, Россия, 2003); 6-ом Европейском конгрессе по микроскопии (Пула, Хорватия, 2003); Международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, Россия, 2003).

Реализация результатов исследования

Результаты исследований используются в научной, педагогической и практической деятельности Медицинского радиологического научного центра РАМН, Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Минздрава РФ, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербургской государственной медицинской академии последипломного образования Минздрава РФ, Санкт-Петербургской клинической больницы РАН, Центра биомедицинских исследований Тюбингенского университета (Германия), Института цитологических исследований (Валенсия, Испания).

Публикации

По теме диссертации опубликована 41 работа, в том числе 1 монография.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа являлась научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 201 странице содержит 12 таблиц и иллюстрирован 20 рисунками. Указатель литературы содержит 384 источника, из которых отечественных - 83, зарубежных - 301.

12.Результаты исследования свидетельствуют о перспективности использования МТ как биологического маркера, позволяющего оптимизировать диагностику и прогноз при патологических процессах, ассоциированных с возрастом - онкологических и нейродегенеративных заболеваниях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Анализ экскреции 6-СОМТ рекомендуется проводить в пожилом и старческом возрасте с целью оптимизации диагностики, оценки прогноза и эфективности лечения онкологических и нейродегенеративных заболеваний.

2. При анализе экскреции 6-СОМТ у больных онкологическими, нейродегенеративными и другими заболеваниями рекомендуется использовать разработанный протокол, который позволяет объективизировать клиническую интерпретацию результатов исследования.

3. Для определения прогноза развития новообразований рекомендуется при патогистологическом исследовании проводить иммуногистохимическую реакцию для выявления МТ-иммунореактивных клеток в ткани опухоли.

4. Для подтверждения этиопатогенеза деменции, связанной с болезнью Альцгеймера, рекомендуется проводить иммуноцитохимическое исследование лимфоцитов крови пациентов для выявления экспрессии тау-протеина.

5. При исследовании биоптатов слизистой оболочки желудка и кожи у больных пожилого и старческого возраста, имеющих в качестве сопутствующего заболевания деменцию различной выраженности, рекомендуется проводить иммуногистохимическое исследование для выявления экспрессии [3-амилоида или тау-протеина, как маркеров болезни Альцгеймера.