Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы изменения фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли

ии3400633 На правах рукописи

А,у/ /'" /

АЛЕКСЕЕВА Наталья Сергеевна

МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ ОСТРОЙ ВИСЦЕРАЛЬНОЙ БОЛИ (экспериментальное исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

2 2 ОН")

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О Т

Ростов-на-Дону - 2009 г.

003480633

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы

Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Овсянников Виктор Григорьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Дроботя Наталья Викторовна

Заслуженный работник высшей школы Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Брин Вадим Борисович

Ведущая организация: ГУ НИИ общей патологии и

патофизиологии РАМН

Защита состоится « /¿¿'са/и}' 2009 года в /£ часов минут на заседании диссертационного совета Д 208.082.03 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022, город Ростов-на-Дону, переулок Нахичеванский, дом 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «//» ''/(иг 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.м.н.

Л. А. Хаишева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Боль как патологический процесс формировался на ранних этапах эволюционного развития и стал самым сложным у теплокровных животных и человека. В повседневной жизни люди нередко сталкиваются с кратковременной соматической болью, с пароксизмами висцеральной боли, эпизоды которых ограничены в рамках времени.

В литературе накоплен обширный материал, свидетельствующий о вовлечении органов и систем организма в алгогенный процесс. Даже кратковременное болевое раздражение способно иметь определенный шлейф последствий для организма (Amit Z., Galina H.Z., 1986; Anand K.J., Craig F.D., 1997-1998).

На сегодняшний день достаточно изучен морфологический субстрат боли, ее тригерные механизмы, ее особенности при различной патологии, разработаны принципы этиотропной и патогенетической терапии (Крыжановский Г.Н, 1997, 1999, 2000; Игнатов Ю.Д., 1982, 1986, 1990; Кукушкин М.Л., 2004; Овсянников В.Г., 1990, 2003; Jones A.R.P. et al„ 2003).

Исследования посвящены «ядру» боли, а вот ее влияние на организм в целом, на отдельные системы, ткани и органы удостоено меньшего внимания.

Исследование острой висцеральной боли является актуальным, т.к. она сопровождает множество заболеваний внутренних органов и является сигналом о неблагополучии в организме человека. К сожалению, изучение влияния острой кратковременной висцеральной боли, не подкрепленной микробным фактором, на жизнедеятельность организма, на систему иммунной защиты, в частности, на неспецифическую резистентность организма, остается за рамками исследуемых проблем. Среди десятков тысяч источников в литературе лишь отдельные посвящены влиянию боли на неспецифическую резистентность организма, в частности на фагоцитоз (Филин В.И., 1996; Вейн A.M., Авруцкий М.А., 1997; Новиков Г.А., 1998; Машфорт МЛ., 2004; Штрибель Х.В., 2005; Прощаев К.И., 2006; Алексеев В.В., 2008; Кутузова A.A., 2009).

Специфическая резистентность при боли удостоена значительно большего внимания. По мнению Мазурина A.B. и Воронцова И.М. (2000) логичнее начинать с доиммунных процессов, только такой путь наиболее рационален с позиций логики познания. Поэтому настоящее исследование посвящено изучению механизмов изменения фагоцитарной активности лейкоцитов при висцеральной боли. Если к этому добавить, что в литературе весьма ограничена информация об изменениях фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли, то это придает актуальность данному исследованию.

Имеет ли изменение фагоцитарной активности лейкоцитов свои особенности, мобилизует или растрачивает организм фагоцитарные резервы при острой висцеральной боли? На эти вопросы в доступной литературе достаточно ясный ответ найти мы не смогли. Вместе с тем, практика скорой медицинской

помощи свидетельствует, что в стационар доставляются больные отнюдь не всегда с болью как признаком воспаления, когда роль и участие фагоцитов предполагается, как очевидное. В больницу доставляются больные с эпизодами острой висцеральной боли, вызванной обтурацией мочеточников или желчных протоков, персистирующим фолликулом и т.д., когда воспаления в его полноценном выражении еще нет и тем более нет присоединившейся инфекции. Все это определяет актуальность исследования фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является изучение механизмов изменения фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли.

Для достижения поставленной цели были определены следующие конкретные задачи:

1. Изучить изменения количества лейкоцитов, лейкоцитарной формулы и лейкоцитарного профиля у крыс при острой висцеральной боли.

2. Определить изменения морфологической картины костного мозга как продуцента и динамичного депо фагоцитов.

3. Оценить поглотительную способность фагоцитов в динамике острой висцеральной боли.

4. Исследовать кислородзависимые и кислороднезависимые механизмы бактерицидности лейкоцитов в динамике острой висцеральной боли.

5. На основе сравнительного анализа всех полученных показателей составить комплексное представление об особенностях и механизме изменения фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Острая висцеральная боль вовлекает в алгогенный процесс систему лейкона.

2. На ранних этапах острой висцеральной боли фагоцитарная активность нейтрофилов снижается.

3. Ранняя реакция на острую висцеральную боль характеризуется повышением микробицидного потенциала нейтрофилов.

4. При острой висцеральной боли происходит увеличение активности кислородзависимых механизмов микробицидности нейтрофилов.

5. Вовлечение фагоцитов в алгогенный процесс является энергозависимым и энергозатратным.

Научная новизна работы.

Впервые дается комплексная оценка и аналитическое сопоставление результатов изменения содержания лейкоцитов в периферической крови, лейкоцитарной формулы и лейкоцитарного профиля; параметров, характеризующих поглотительную способность лейкоцитов (фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, фагоцитарный пул, фагоцитарная емкость, моноцитарно-нейтрофильное соотношение); параметров, характеризующих кислородзависимые (НСТ-тест, продукция оксида азота, активность миелопероксидазы) и кислороднезависимые механизмы (активность щелочной

фосфатазы) обеспечения фагоцитарной активности лейкоцитов в динамике острой висцеральной боли.

Установлено, что реакция белой крови на острую висцеральную боль вначале манифестируется лейкопенией, превалированием в периферической крови гес!ох-видов нейтрофилов, в которых уже в первый час наблюдается метаболическая трансформация в сторону увеличения потенциала кислородзависимой микробицидности, подкрепляемого к третьему часу развития процесса активацией механизмов кислороднезависимой микробицидности нейтрофилов.

Отмечено, что в костном мозге при острой висцеральной боли отмечается сдвиг в сторону зрелых форм лейкоцитов, умеренная потеря зрелых форм и накопление резерва реактогенных форм нейтрофилов.

Выявлена фазная динамика энергетической зависимости активации микробицидности лейкоцитов и их способность к быстрому восполнению энергонесущего материала.

На основании анализа собственных результатов экспериментальных исследований и данных литературы предложен алгоритм поэтапной активации механизмов резистентности (фагоцитоза) в динамике формирования неспецифического ответа на острую интенсивную кратковременную висцеральную боль.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретически значимым является экспериментально доказанный феномен фазной реакции белой крови на острую висцеральную боль, заключающийся в динамичном изменении лейкоцитарной реакции от лейкопении до умеренного лейкоцитоза, от нейтропении до выраженного нейтрофилеза с гипорегенеративным сдвигом влево.

Значимость для теории боли обретает временная характеристика и степень выраженности вступления в процесс поглотительного и переваривающего потенциала фагоцитирующих клеток.

Как с теоретической, так и с практической точек зрения существенным представляется выявленная последовательность и интенсивность процессов киллинга и деградации микроорганизмов: снижение фагоцитарной активности лейкоцитов сменяется ее повышением, активация кислородзависимой микробицидности переходит в умеренное повышение кислороднезависимых механизмов и интенсивное расходование энергетического материала с быстрым его восстановлением.

В работе предложены критерии оценки мобилизационной готовности нейтрофилов к участию в механизмах фагоцитоза на начальных этапах развития патологических состояний, сопровождающихся острой интенсивной висцеральной болью. Они могут быть использованы в практической деятельности врачей широкого профиля с целью прогнозирования и коррекции возможных осложнений, связанных с истощением механизмов неспецифической резистентности организма.

Предложенная и апробированная в различных сериях исследований экспериментальная модель острой интенсивной кратковременной висцеральной

боли может быть использована в дальнейшем при изучении патофизиологических механизмов данного процесса.

Работа может быть полезна для студентов, преподавателей патологической физиологии и практических врачей при изучении таких разделов, как «Боль», «Нарушение неспецифических механизмов защиты», «Патология крови», т.к. позволит расширить представление о патогенезе висцеральной боли как типового патологического процесса.

Апробация результатов исследования.

Основные результаты исследования были доложены на 61-й итоговой научной конференции молодых ученых и специалистов Рост ГМУ (Ростов-на-Дону, 2007), на 63-й итоговой научной конференции молодых ученых и специалистов Рост ГМУ (Ростов-на-Дону, 2009), на межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009), на Российском симпозиуме с международным участием «Патофизиология и клиника экстремальных и терминальных состояний» (Уфа, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Из них 1 статья напечатана в ведущем рецензируемом научном журнале, рекомендованном ВАК.

Объем и струюура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц, иллюстрирована 45 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Указатель литературы включает 260 работ, из них 200 - отечественных и 60 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 180 половозрелых нелинейных белых крысах-самцах.

В соответствии с задачами, поставленными в работе, выполнено 5 серий исследований, посвященных изучению структурно-функциональных особенностей системы белой крови в норме и при острой висцеральной боли.

I серия посвящена изучению особенностей системы белой крови у интактных крыс.

II серия посвящена изучению структурно-функциональных особенностей лейкоцитарной реакции системы белой крови у крыс при ОВБ.

III серия посвящена изучению постболевых изменений кислородзависимой бактерицидности фагоцитов (НСТ-тест) у половозрелых крыс - самцов в норме и при ОВБ.

IV серия - определение продукции оксида азота нейтрофилами крыс в норме и при ОВБ.

V серия - изучение компонентов цитохимических реакций в лейкоцитах половозрелых крыс - самцов в норме и при ОВБ (активность миелопероксидазы и щелочной фосфатазы и распределение гликогена).

Острую висцеральную боль (ОВБ) моделировали путем электрораздражения рецепторной зоны прямой кишки крыс с помощью электростимулятора ЭСУ-2 со следующими параметрами: частота тока - 100 Гц;

напряжение - 35 В; длительность импульса - 500 мс; задержка импульса - 2 мс и время стимуляции - 2 минуты. На основании анализа поведенческих и вегетативных реакций опытных животных оценивали интенсивность болевого раздражения в соответствии с общепринятыми критериями (Вальдман A.B. с соавт., 1976; Васильев Ю.Н. с соавт., 1979; Овсянников В.Г., 1990).

Забор материала для исследования производили на пике развития ноцицептивной реакции (через 2 минуты после электростимуляции) и в посттравматическом периоде (через 30, 60, 120, 180 минут после элекгростимуляции). Все манипуляции с экспериментальными животными проводили в соответствии с Приказом МЗ РФ №267 «Об утверждении правил лабораторной практики» от 19 июня 2003 г.

Лейкоцитарный состав крови исследовали общепринятыми микроскопическими методами (Никитин В.Н., 1949; Бокуняева Н.И., 1975). Общее количество лейкоцитов определяли путем прямого подсчета клеток в камере Горяева. Для определения фагоцитарной активности лейкоцитов использовали метод Д.К. Новикова и В.И. Новикова, 1989 г. in vitro.

Миелограмму изучали по методам Линдер Д.П. с соавт. (1993) и Шабаева М.М. с соавт. (1995).

Тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), как показатель процесса фагоцитоза нейтрофилов, ставили в модификации Маянского Д.Н. (1996). Определение продукции оксида азота нейтрофилами крови проводили по методу, описанному Ю.В. Шебзуховым и соавт., 1998.

Для определения миелопероксидазы в лейкоцитах использовали метод Леле (реакция с бензидином) (Роскин Г.И. с соавт., 1957). Для определения щелочной фосфатазы в лейкоцитах использовали метод азосочетания по Хейхоу и Кваглино (Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д., 1983). Для исследования содержания гликогена в лейкоцитах использовали метод ШИК-реакции по Мак-Манусу (Пирс Э„ 1962).

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерных программ EXCEL «Microsoft Office 2007Pro», «STATISTICA 6.0». Достоверность различий по количественным признакам определяли с помощью критерия Стьюдента (t) для малых выборок, признавая их статистически значимыми при р<0,05, как тенденцию к достоверности при 0,05<р<0,1. Достоверность различий качественных показателей при сравнении оценивали с помощью непараметрического критерия статистики (yj ван дер Вардена (Гланц С., 1988; Боровиков В., 2003; Реброва О.Я., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изменения содержания лейкоцитов в периферической крови в ответ на острую висцеральную боль.

В исходном состоянии общее количество лейкоцитов в периферической крови составило 8,58±0,30х109/л. В лейкоцитарной формуле превалируют лимфоциты 70±2,45%. На долю нейтрофилов приходится 27,6±2,36%. Моноциты составляют 1,5±0,27%. Эозинофилы встречаются не регулярно, их количество колеблется от 1 до 3%. Наиболее неожиданным результатом было статистически

достоверное (р<0,05) снижение общего количества лейкоцитов до 7 ± 0,25 хЮ9 /л уже через 2 минуты после ОВБ. В лейкоцитарной формуле снижается удельный вес СЯ: в исходном состоянии - 27,6 ±2,36% и через 2 минуты 24,6±1,4%, при этом появляются признаки омоложения ядра. Если в исходном состоянии ПЯ отсутствовали, то через 2 минуты после воздействия их количество в лейкоцитарной формуле составляет 0,7 ±0,3%.

Через 30 минут картина белой крови принимает более определенный характер. Лейкопения становится очевидной. Количество лейкоцитов с 8,58±0,30 х 10° /л падает до 5,84 ±0,20 х 109 /л (р<0,05), т.е. снижение составляет 40%. Но при этом появляется интересный факт, более характерный для соматической боли: процент СЯ в периферической крови не только восстанавливается, но и превосходит исходные значения - 47,1 ±2,18% против 27,6 ± 2,36% в исходном состоянии.

Происходит и омолаживание ядра. Так, через 30 минут после ОВБ ПЯ стало 0,9 ± 0,1%, это на 28,6% больше, чем через 2 минуты, в исходном состоянии ПЯ отмечено не было.

Через один час лейкопения сохраняется (7,03±0,21 х 109 /л), зато нейтрофилез продолжает нарастать, прежде всего, за счет зрелых клеток, при сохранении единичных ПЯ. Увеличение СЯ через 1 час после ОВБ составило 53,6 ±1,10% (р<0,005), что в 1,9 раза больше, чем в исходном состоянии (27,6±2,36%). Через 2 часа после начала эксперимента отмечается незначительное увеличение общего числа лейкоцитов - 7,56±0,19 х 109 /л, это на 7,5% больше, чем через 1 час после ОВБ (7,03± 0,21 х 109 /л (р>0,05), но, по-прежнему, меньше (на 11,8%), чем в исходном состоянии (8,58±0,30х 109 /л).

В лейкоцитарной формуле через 2 часа после ОВБ заметных изменений отмечено не было.

Через 3 часа после ОВБ картина принимает полярный характер. Лейкопения сменяется лейкоцитозом. Общее количество лейкоцитов составляет 10,99 ±0,7 х 109 /л, что превышает исходные значения (8,58 ± 0,30 х 109 /л) в 1,3 раза, хотя это увеличение и не столь выражено в сравнении с исходным фоном, но оно значительно превышает показатели часового наблюдения (7,03±0,21х 109 /л) (р<0,05) в 1,6 раза.

Особенности лейкоцитарной формулы позволяют уже более уверенно говорить о раздражении костного мозга и его реакции.

Количество СЯ достигло 60,8 ± 1,22% (р<0,005), произошло повышение числа ПЯ (2,3 ± 0,26%) при полном отсутствии их в исходном состоянии. По мере развития нейтрофильного лейкоцитоза лимфоцитоз сменяется лимфопенией, которая носит относительный характер.

Таким образом, проведенное нами исследование выявило выраженные особенности лейкоцитарной реакции в ответ на ОВБ, вызываемую в области прямой кишки. Они заключаются в том, что уже через 2 минуты отмечаются признаки лейкопении, при этом в периферической крови уменьшается доля СЯ, что можно трактовать, как их стремительное движение в маргинальный слой кровотока. Через 30 минут после ОВБ лейкопения достигает пика, а удельный вес СЯ начинает доминировать. Через один час после ОВБ намечается тенденция

нивелирования лейкопении, которая через 3 часа сменяется лейкоцитозом. На всем протяжении эксперимента отмечается положительная динамика изменения общего количества лейкоцитов. Через 3 часа после болевого раздражения нейтрофилез принимает пиковые значения и, соответственно, исходный лимфоцитоз уступает место относительной лимфопении. 2. Реакция костного мозга на острую висцеральную боль.

В общей картине мазков костного мозга интактных животных определялись все элементы, начиная от бластных и заканчивая созревшими формами. Основной удельный вес приходился на клетки дозревающего пула и клетки, завершившие свое развитие. Так, на долю ПЯ приходилось 13,6±0,48%, а на долю СЯ - 21,4±2,41%. Определяющиеся в мазке костного мозга лимфоциты и моноциты по степени своей зрелости также находились на завершающем этапе. Их соотношение в общей гамме клеток соответственно составляло 17,8±0,69% и 2,0±0,24%. Четко определялся резерв гранулоцитов. 1,7±0,05% - это миелоциты, несколько больше - 3,6±0,63% - метамиелоциты. Таким образом, картина костного мозга свидетельствует с одной стороны о нормальном лейко- и эритропоэзе, с другой - о достаточном потенциале, обеспечивающим возможности полноценного функционирования и пополнения форменных элементов в экстремальных условиях.

Сразу после ОВБ в костном мозге практически не прослеживается его участие в алгогенном процессе. Исключение составляет потеря СЯ с 21,4±2,41% до 18,2±2,65%. Имеется некоторая тенденция увеличения метамиелоцитов и ПЯ соответственно до 4,0±0,15% (в исходном состоянии - 3,6±0,63%) и 16,1±0,68% (в исходном состоянии - 13,6±0,48%). Прослеживается и увеличение числа лимфоцитов с 17,8±0,69% до 22,3±0,92%.

Через тридцать минут после ОВБ в костном мозге также не выявляется выраженной динамики. Изменения имеются, но они носят мягкий характер. С уверенностью можно говорить о снижении в 1,4 раза количества метамиелоцитов через 30 минут после ОВБ до 2,6±0,12% (р<0,05). В исходном состоянии их было 3,6±0,63%. По-прежнему отмечается уменьшение числа СЯ в 1,2 раза 18,5±1,3% по сравнению с исходным состоянием (21,4±2,41%). Создается впечатление, что костный мозг через 30 минут покидают лимфоциты: их стало 14,4±0,75% - это на 19,1% меньше, чем в исходном состоянии - 17,8±0,69% и значительно меньше (на 35,4%), чем было при первичной реакции через 2 минуты после ОВБ - 22,3±0,92%.

Через один час отмечается увеличение доли СЯ до 23,5±0,13%. Это небольшой прирост по сравнению с фоновыми значениями (21,4±2,41%) и выраженный (в 1,3 раза), статистически достоверный по сравнению с предыдущим изменением (18,5±1,3%).

Через 3 часа регистрируется вторая волна увеличения ПЯ и СЯ. Процентное количество ПЯ - 15,8±0,58%; СЯ - 27,8±0,97% - это на 23,0% выше, чем до начала эксперимента (21,4±2,41%).

Процентное содержание моноцитов, наоборот, снижается. Их содержание в костном мозге в 2,2 раза уменьшилось до 0,9±0,22%, тогда как в исходном состоянии их было 2,0±0,24%.

Содержание лимфоцитов также изменилось: произошло снижение на 19,1% лимфоцитов в костном мозге с 17,8±0,69% в исходном состоянии до 14,4±0,72% через 3 часа после ОВБ.

Эти изменения могут иметь определенную трактовку. Длительное превалирование в периферической крови нейтрофильных лейкоцитов требует своего количественного поддержания. Уместно предположить, что логика процесса потребовала ускорения дозревания сегментоядерных форм нейтрофилов. Об этом может свидетельствовать хотя и незначительное, но заметное при малых значениях цифр снижение количества миелоцитов в костном мозге с 1,7±0,05% до 1,5±0,11% через 3 часа после начала эксперимента.

Что касается снижения процентного содержания моноцитов, то его можно расценивать как сброс в периферическую кровь. Действительно, на долю моноцитов приходится 4,8±0,39%, это самая большая цифра в динамике всего эксперимента.

Таким образом, костный мозг реагирует на разовый эпизод острой висцеральной боли; реактивные изменения в ответ на ОВБ затрагивают только интересы белого ростка кроветворения. Костный мозг проявляет свою мобилизационную готовность на случай усугубления сценария повреждения. Она выражается в смещении в сторону зрелых форм лейкоцитов, оперативной умеренной потере зрелых форм по болевому сигналу и накоплении резерва реактогенных форм нейтрофилов, судя по всему, на случай повторной стимуляции, либо наращивания патогенного воздействия на организм.

3. Изменения поглотительной способности лейкоцитов в ответ на острую висцеральную боль.

Поглотительную способность лейкоцитов оценивали по следующим показателям: ФИ - фагоцитарный индекс (процент фагоцитов, участвующих в фагоцитозе); ФЧ - фагоцитарное число (среднее количество микроорганизмов поглощенное одним фагоцитом); ФП - фагоцитарный пул (сумма всех фагоцитирующих клеток); ФЕ - фагоцитарная емкость (общее количество микроорганизмов, поглощенных фагоцитами); МНС - моноцитарно-нейтрофильное соотношение.

В исходном состоянии ФИ равен 81,6±0,67%; ФЧ составляло 2,46±0,11. Коэффициент, характеризующий свойство крови поддерживать и обеспечивать функцию фагоцитоза всеми фагоцитирующими клетками - ФЕ, составляет 5,02±0,57.

Через 2 минуты после ОВБ количество лейкоцитов - участников фагоцитоза несколько снижается. ФИ - 80,5±0,22% против 81,6±0,67% в исходном состоянии. ФЧ также практически остается неизменным. Оно равно 2,5±0,09, что несколько отличается от исходных цифр: 2,46±0,11.

Через 30 минут после ОВБ отмечается некоторое снижение фагоцитарной активности лейкоцитов. Количество активных форм фагоцитов снижается на 6% и составляет 75,7±0,67% против 81,6±0,67% у интактных животных. Это снижение хотя и не очень выраженное, тем не менее, статистически достоверное (р<0,05). ФЧ свидетельствует о меньшей активности исследуемых элементов

белой крови. Они уступают фоновым значениям не только числом, но и поглотительной способностью. ФЧ снизилось на 26,8% с 2,46±0,11 до 1,8±0,09 (Р<0,05).

На этом фоне выглядит требующим пояснения снижение ФЕ на 21,7%: 3,93±0,49/л против 5,02±0,57/л в исходном состоянии.

Через 60 минут отмечается тенденция к нарастанию значений ФИ и ФЧ. Процент клеток белой крови, участвующих в фагоцитозе, составляет 77,4±0,78%. ФЧ также увеличилось на 13,0% до 2,07±0,07 в сравнении с получасовым исследованием (1,8±0,09).

На фоне умеренной положительной динамики в сторону приближения ФИ и ФЧ к исходным значениям, очень выражено выглядит изменение ФЕ: 6,24±0,35/л против 3,93±0,49/л через 30 мин после ОВБ (р<0,005) и против 5,02±0,57/л (р<0,05).

Через 120 минут значительных отличий исследуемых показателей от предыдущих не отмечается. Картина крови продолжает сохранять паритетное соотношение СЯ (49%) и лимфоцитов (49%). Общее количество лейкоцитов, по-прежнему, не достигает исходных значений: 7,56±0,19 х 109/л против 8,58±0,30 х 109/л в исходном состоянии. К исходному уровню приближается ФИ и ФЧ. ФИ составляет 79,1±0,57% против 81,6±0,67% в исходном состоянии, ФЧ -2,28±0,07 против 2,46±0,11 в исходном состоянии. ФЕ равна 7,83±0,41/л против 5,02±0,57/л в исходном состоянии и 6,24±0,35/л через 60 минут после ОВБ.

Таким образом, общая тенденция изменений своим вектором ориентирована на обеспечение потенциала эффективной неспецифической резистентности, а точнее фагоцитоза.

Подводя итог вышеописанному следует отметить, что алгогенное раздражение вызывает формирование лейкопении, которая сменяется умеренным лейкоцитозом.

Весьма характерны изменения фагоцитарной активности вначале. Она падает, а затем несколько повышается, даже превышая исходные значения. Зато значения фагоцитарной емкости через три часа более чем в три раза превышают исходные (рис.1)

ФП

Рис.1 Реактивные изменения показателей фагоцитарной активности лейкоцитов в динамике эксперимента с острой висцеральной болью

Все это говорит о событиях, направленных на создание киллингового потенциала.

3. Изменение кислородзависимого механизма бактерицндности нейтрофилов

Результаты исследования НСТ-теста в динамике острой висцеральной боли.

В исходном состоянии НСТсп составляет 137 ± 6,7 ЕД/105. Проведение НСТ-теста на фоне стимуляции зимозаном увеличивает эти значения до 150,5 ± 4,3 ЕД/105. Коэффициент стимуляции составил 1,1±0,1. Это значит, что интенсивность образования активных форм кислорода повышается примерно на 10%.

Через 2 минуты после нанесения болевого раздражения спонтанный НСТ-тест иллюстрирует снижение базальной продукции АФК. Его значение падает до 129±3,6 ЕД/105. Однако определяемое «на глаз» снижение показателя не находит своего статистического подтверждения (р>0,05). Поэтому можно лишь говорить о тенденции к депрессии АФК-продуцирующей активности нейтрофилов. Заметим, что в этот период отмечается некоторое снижение количества лейкоцитов в периферической крови с 8,6±0,30 х 109/л до 7,0±0,25 х 109/л. Причем это снижение, судя по значениям лейкоцитарного профиля, происходит, прежде всего, за счет нейтрофилов. Если в исходном состоянии их абсолютные значения составляли 2,37±0,23 х 109/л, то через 2 минуты это значение падает до 1,72±0,13 х 109/л. Отсюда логично предположить, что наиболее активные формы нейтрофилов устремились к периферии, а в циркулирующем пуле стали превалирвоать «геёох-формы». Действительно, при стимуляции нейтрофилов они отвечают более выраженной реакцией по сравнению с исходным фоном.

Значение НСТ-теста становится равным 187,6±3,9 ЕД/105. Прирост очевиден и подкреплен статистически (р<0,05). Коэффициент стимуляции составил 1,5±0,04. Это увеличение при всей его рельефности не находит статистического подтверждения (р=0,05), однако дает основание трактовать его как выраженную тенденцию. НСТ^ обретает значение 217,4±5,3 ЕД/105. Это различие достоверно как по отношению к НСТсп, полученному через 60 минут после ОВБ, так и к НСТ„ в исходном состоянии (р<0,05)

Через 2 часа НСТсп обретает минимальные значения во всей динамике эксперимента: 119,2±3,9 ЕД/105 (р<0,05). НСТСТ хотя и выше, чем в исходном состоянии, но он ниже, чем при предыдущем измерении и составляет 184,2±9,4 ЕД/105, соответственно снижается и коэффициент стимуляции до 1,6±0,1 (р<0,05 по сравнению с исходным фоном).

В динамике времени НСТсп обнаруживает снижение активности лейкоцитов. НСТ„ наоборот прогрессивно наращивает свои значения, а по достижении пика обнаруживает тенденцию к их снижению.

Изменение продукции оксида азота в динамике острой висцеральной

боли.

К числу механизмов, обеспечивающих кислородзависимую бактерицидность фагоцитов, относится не только «респираторный взрыв», но и отсроченные механизмы генерации оксида азота (N0"). Следует отметить, что если генерация АФК (02'\ Н202) происходит в считанные минуты после стимуляции клеток, то N0' синтезируется через часы (Ginsburg I., Kohen R., 1995; Go Y.M., Halvey P.J., Hansen J.M. et al.. 2007).

Микробицидное или цитотоксическое действие NO' во многом зависит от образования оксидов азота (Ginsburg 1., Kohen R., 1995; Harrison R., Benboubetra M., Bryson S. et al., 1990). Наиболее высокой токсичностью к микроорганизмам обладает пероксинитрит, который образуется в реакции N0' с супероксид-анионом:

02" + NO" ONOO"

В исходном состоянии спонтанная продукция N0' нейтрофилами крови составила 1,444±0,011нмоль/2х105 клеток. При стимуляции нейтрофилов интактных животных продукция N0' практически не изменяется, возрастая лишь на 4,3%, и составляет 1,506±0,018 нмоль/2х105 клеток.

Через 2 минуты после ОВБ спонтанная продукция N0' несколько снижается и составляет 1,430±0,042 нмоль/2х105 клеток. Вместе с тем наблюдается явное повышение ответа на стимуляцию и продукция N0' составила 2,132 ± 0,036 нмоль/2х105 клеток, что на 41,6% больше, чем в исходном состоянии. В этот срок стимуляция нейтрофилов крови опсонизированным зимозаном приводит к повышению секреции N0' на 49%.

Через 60 минут после ОВБ спонтанная продукция N0' снизилась еще больше и составила 1,360±0,012 нмоль/2х105 клеток против 1,444±0,011 нмоль/2х105 клеток в исходном состоянии. Стимуляция нейтрофилов дает значительно меньший эффект, чем в предыдущий срок эксперимента. Величина

стимулированной продукции 1,486±0,024 нмоль/2х105 клеток, а прирост составил 9,2%.

Наименьших значений продукция N0' достигает через 2 часа от начала эксперимента и составила 1,180±0,014 нмоль/2х105 клеток, что составляет 81,7 % от исходного фона (1,444 нмоль/2х105 клеток). Значения стимулированной продукции N0' также достигают своего минимума и составляют 1,370±0,017 нмоль/2х105 клеток. По отношению к спонтанной продукции N0", выявленной через 2 часа после нанесения острой боли, стимуляция дает прирост на 16,1%.

Таким образом, после нанесения болевого раздражения в течение двух часов спонтанная продукция N0' нейтрофилами крови прогрессивно снижается. Если сравнивать стимулированную активность, то при НСТ-тесте она прогрессивно возрастала, а при стимуляции продукции N0', последний дает наиболее выраженный всплеск практически сразу после болевого воздействия, а в последующем происходит прогрессивное снижение его значений.

В условиях отсутствия реальной микробной агрессии, выявленные параллели между результатами НСТ-теста и продукцией оксида азота можно рассматривать как механизмы поддержания адекватной функциональной готовности (потенции) нейтрофилов реализовать свою главную функцию -фагоцитоз. В принципе следует подчеркнуть еще раз, мы имеем дело не с реальной микробной атакой, а с болевым стрессом. Как показала в своих исследованиях P.A. Беловолова (1992), у пациентов, переживших не только боль в результате травмы, но и инфицирование раны, в первые часы наблюдается активация фагоцитарной активности лейкоцитов, которая прогрессивно нарастает, а на пятые-шестые сутки все показатели, характеризующие ее свидетельствуют и об истощении резервов неспецифической резистентности. В нашем же случае наблюдается возврат к исходному состоянию.

Изменение пероксидазпой активности нейтрофилов в ответ на острую висцеральную боль.

Из обзора литературы мы пришли к заключению, что знаковыми ферментами, обеспечивающими функции фагоцитов, являются миелопероксидаза, фосфатазы, а основным энергетическим субстратом, обеспечивающим их функцию, является глюкоза, депонированная в форме гликогена.

В исходном состоянии активность миелопероксидазы (МПО) обнаруживается во всех исследованных клетках, она носит некоторый базальный уровень, о чем свидетельствует факт умеренной активности ферментов в подавляющем большинстве клеток. Только у 12±1,01% клеток обнаруживался позитивно окрашенный материал в виде «венчика» из Зх и более рядов. У 52±1,48% клеток выявлялся «венчик» из двух рядов позитивно окрашенных гранул, а 36±1,48% клеток в своей цитоплазме содержали лишь рассеянные гранулы.

Через 2 минуты после ОВБ регистрируется факт активации МПО. Об этом можно судить, прежде всего, по изменению среднего цитохимического

коэффициента (Кср): 1,98±0,01 против 1,76±0,01 в исходном состоянии (р<0,05). При оценке распределения МПО в нейтрофилах обнаруживается смещение влево. Стало меньше клеток, отнесенных к I группе - 30±2,17% против 36±1,48% в исходном состоянии. На 20% уменьшилось число клеток, отнесенных ко второй группе: 40±1,36% против 52±1,48% в исходном состоянии (р<0,05). Более чем вдвое увеличивается процент клеток, в цитоплазме которых обнаруживается «венчик» из Зх и более рядов позитивно окрашенных клеток, т.е. относимых к 3 группе: 28±2,05% против 12±0,01% в исходном состоянии (р<0,05).

Наиболее выражено увеличение активности МПО отмечается через 60 минут после алгогенного воздействия, Кср приобретает значение 2,09±0,02 против 1,76±0,01 в исходном состоянии. Треть клеток имеет максимальную пероксидазную активность 34±1,1%. Это на треть больше, чем в исходном состоянии - 12±0,01%. (р<0,05). В этот временной промежуток еще значительнее уменьшается число клеток с минимальным числом гранул в цитоплазме: 25±1,56% против 36±1,48% в исходном состоянии. По сравнению с предыдущим сроком наблюдения остается неизменной в количественном отношении II группа клеток: 41±1,53%, в предыдущем измерении 40±1,36%, а в исходном состоянии 52±1,48%.

Таким образом, через 60 минут активность МПО в нейтрофилах достигает максимальных значений, о чем свидетельствуют не только существенное увеличение Кср, но и преобладание в картине белой крови нейтрофилов, в цитоплазме которых обнаруживается «венчик» из трех и более рядов позитивно окрашенных гранул (р<0,05 во всех случаях).

Через 2 часа активность МПО снижается. Кср практически не отличается от исходного: 1,79±0,03 против 1,76±0,01 (р>0,05). Повысилось количество клеток II группы: 61±5,5%. Надо полагать, что клетки III группы, утратив свою выраженную активность, пополнили ряды клеток, в цитоплазме которых выявляется «венчик» не из трех, а из двух рядов позитивно окрашенных гранул.

Таким образом, вовлечение в процесс МПО клеток миелоидного ряда -нейтрофилов, очевиден. Отмечается нарастание активности в течение часа с последующей ее нормализацией. Заметим при этом, что через час мы регистрировали максимальную способность стимулированных фагоцитов генерировать активные формы кислорода.

Изменение кислороднезависимого механизма бактерицидности нейтрофилов в ответ на острую висцеральную боль

Изменение активности щелочной фосфатазы нейтрофилов в ответ на острую висцеральную боль

Относительно роли МПО, как маркерного фермента (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2002), обеспечивающей образование АФК в последующем не вызывает сомнений, а вот роль, последовательность и время вступления в процесс щелочной фосфатазы (ЩФ), так однозначно не воспринимается. Знагован С.Ю. (2004), Федотова Г.Г. и Киселева P.E. (2006) отмечают

чрезвычайно низкую активность ЩФ в лейкоцитах в покое. Иными словами требуется время после стимуляции фагоцита для ее активации. Р.И. Сепиашвили (1984) в своих исследованиях не обнаружил ЩФ в лейкоцитах собак в покое.

Исходный уровень ЩФ достаточно высок. В покое 62±2,34% клеток имеют максимальное присутствие позитивно окрашенных клеток.

Треть клеток (32±2,56%) имеют умеренное распределение гранул (II группа). На долю клеток с низкой активностью приходится 6±1,1%. Клетки, не содержащие гранулы исследуемого материала, практически не встречаются. Кср равен 2,56±0,04.

Через 2 минуты после ОВБ наблюдается достаточно выраженное изменение в картине распределения нейтрофилов по степени активности в них щелочной ЩФ. В общей картине доминируют клетки I и II групп, т.е. имеющие низкую и умеренную активность щелочной фосфатазы. На долю клеток III группы приходится 20±2,33%, это втрое меньше, чем в исходном состоянии -62±2,34%. Нейтрофилы II группы составляют 50±1.85%, в исходном состоянии их было 32±2,52%. В четыре раза увеличилось число клеток, содержащих минимальное количество гранул - 26±2,14% против 6±1,1%. Клетки, у которых отсутствуют признаки активности ЩФ составили 4±0,08%. До нанесения болевого раздражения такие клетки не встречались. Кср снижается через 2 минуты после острой боли до 1,86±0,04, исходные значения этого показателя -2,56±0,04.

Через 1 час картина изменяется. Кср свидетельствует о том, что активность ЩФ выросла по сравнению с предыдущим исследованием и составляет 2,15±0,04, тогда как в предыдущем исследовании Кср снижался до 1,86±0,04, но в сравнении с фоном активность ЩФ продолжает оставаться сниженной - 2,15±0,04 против 2,56±0,04. Восстанавливается удельный вес клеток с высокой активностью, их 35±2,035 (в предыдущем сроке исследования -20±2,33%). Это вдвое меньше, чем в исходном состоянии. Клетки II группы занимают 42±2,87% (32±2,58 в исходном фоне), на клетки I группы приходится 20±1,52%, что также значительно выше, чем в исходном состоянии (6±1,1%). Встречаются единичные клетки, не обнаруживающие активности ЩФ. Все показатели, регистрируемые через 1 час имеют достоверное различие с таковыми в исходном состоянии (р<0,05) (табл.1).

Таким образом, через 1 час после ОВБ, активность ЩФ имеет выраженную тенденцию к нарастанию и стремится к исходным показателям.

Через 2 часа отмечается умеренное повышение активности ЩФ в сравнении с исходным фоном. В этот период уже не встречаются клетки, не содержащие гранул. Клетки I группы составляют 4±1,08%, это меньше, чем при первом исследовании. На долю клеток II группы приходится 25±3,32%. Вполне понятно, что снижение числа клеток с низкой и умеренной активностью ЩФ свидетельствует в пользу увеличения числа нейтрофилов с высокой степенью выраженности ЩФ: 71±2,51% против 62±2,34% в исходном фоне. Кср соответственно вырос и составил 2,67±0,03 против 2,56±0,04.

Табл.1

Изменение цитохимических компонентов реакций в лейкоцитах при острой __висцеральной боли____

Динамика Степень цитохимических реакций, % К ср. % полож.

0 I II III

М±ш М±ш М ± m M±m М±ш кл.

Исх.фон 0 6± 1,1 32 ± 2,52 62 ± 2,34 2,56 ±0,04 100

ЩФ 2 мин после ОВБ 4 ± 0,08 2 26 ±2,14 2 50 ± 1,85 2 20 ± 2,33 2 1,86 ± 0,04 3 96

60 мин после ОВБ 3 ± 0,022 20 ± 1,522 42 ± 2,872 35 ± 2,03 2 2,15 ±0,04 97

120 мин после ОВБ 0 4 ± 1,08 25 ± 3,322 71 ±2,51 2 2,67 ± 0,03 97

Исх.фон 0 36 ± 1,48 52 ± 1,48 12 ± 1,01 1,76 ±0,01 100

мпо 2 мин после ОВБ 2 ± 0,32 2 30 ±2,172 40 ± 1,362 28 ± 2,05 2 1,98 ±0,013 98

60 мин после ОВБ 0 25 ± 1,562 41 ±1,53 2 34 ± 1,12 2,09 ± 0,02 3 100

120 мин после ОВБ 0 30 ±2,282 61 ±5,5 2 9 ±0,172 1,79 ±0,03 100

Исх.фон 1 ± 0,56 40 ±3,5 52 ± 1,48 7 ± 1,06 1,67 ±0,04 99

я U 2 мин после ОВБ 3 ± 0,372 56 ±4,562 40 ± 1,992 1 ± 0,01 2 1,43 ±0,03 97

о X S ц 60 мин после ОВБ 3 ± 0,45 2 60 ±3,822 33 ±2,13 2 4± 0,01 2 1,42 ± 0,04 97

(_ 120 мин после ОВБ 2 ±0,1 34 ±2,1 56 ±1,58' 8± 0,95 1,73 ± 0,03 98

- тенденция к изменению по сравнению с исходным фоном по t - критерию Стьюдента

(0,1 >р >0,05)

2 - достоверные изменения по сравнению с исходным фоном по t - критерию Стьюдента (р <0,05)

3 - разница существенна, в сравнении с исходным фоном, на уровне доверительной вероятности 0,05 (5%) (по х критерию ван дер Вардена)

0-в цитоплазме нет позитивно окрашенного материала; I - в цитоплазме клеток выявляются рассеянные гранулы или «венчик» из одного ряда позитивно окрашенных гранул; II - в цитоплазме клеток выявляется «венчик» из 2 рядов позитивно окрашенных гранул; III - в цитоплазме клеток выявляется «венчик» из 3 и более рядов позитивно окрашенных гранул или блоков.

Изменения в энергетическом обеспечении процессов микробицидности

В спокойном состоянии до начала эксперимента цитоплазма нейтрофилов равномерно насыщена гликогеном. Более 90% клеток имеют малое и умеренное содержание энергоисточника. На долю высоконасыщенных клеток приходится 7±1,06% клеток. Встречаются единичные нейтрофилы, не содержащие гликоген. В 40±3,5% клеток гранулы гликогена рассеяны, что позволяет их отнести к I группе. II группу образуют клетки, в цитоплазме которых выявляется «венчик» из 2х рядов гранул окрашенного гликогена. Таких клеток 52±1,48%. Таким образом, в исходном состоянии картина распределения гликогена носит

мозаичный характер. В общей картине превалируют клетки, относимые к I и II группам. Кср равен 1,67±0,04.

Как следует из результатов исследования, гликоген нейтрофилов лабилен, он оперативно включается в реакции, активируемые болевым раздражением.

Уже через 2 минуты сокращается доля клеток, имеющих максимальное насыщение гликогеном (III) с 7±1,06 в исходном состоянии, до 1±0,01%. Отмечается снижение доли клеток, имеющих умеренное количество гликогена с 52±1,48% до 40±1,99%. Вполне понятно, что за счет этого возрастают значения, характеризующие низкое насыщение клеток гликогеном и опустошение его запасов. Клеток, не обнаруживающих признаков содержания гликогена -3±0,37%, а 56±4,56% содержат этого вещества в незначительном количестве (I). Увеличение этого пула клеток достаточно выражено в начале опыта - их было 40±3,50%. Кср снизился до 1,43±0,03 против 1,67±0,04 в исходном состоянии.

Таким образом, OB Б сопровождается мобилизацией гликогена лейкоцитов, что свидетельствует о функциональной перестройке активности клеток. Все отличия от фоновых величин статистически достоверны (р<0,05).

Мобилизация гликогена оказалась стремительной и стойкой. В течение часа цифровые характеристики не претерпевают метаморфозы. 3±0,45% клеток так и не восстановили гликоген. 60±3,82% можно отнести к I группе, 33±2,13% -II группа и только 4±0,01% клеток богаты гликогеном. В сравнении с исходным фоном все показатели имеют достоверное различие (р<0,05) в сторону понижения. Кср практически сохраняет значение предыдущего и равен 1,42±0,04.

Часовая пауза в динамике распределения гликогена, очевидно, послужила мобилизации механизмов его накопления. Действительно, через два часа после нанесения болевого раздражения запасы гликогена восстанавливаются и даже превосходят исходные значения. Так, значительно возрастает относительное количество клеток с высоким содержанием гликогена (III) - их стало 8±0,95% (в исходном состоянии 7±1,06%). Нарастает число клеток по степени содержания гликогена, относимых ко второй группе (II): 56±2,58% против 52±1,48% в исходном состоянии. Доля клеток, обедненных гликогеном, снизилась до 34±2,1 (в исходном состоянии их было 40±3,5%). Динамика клеток I, II, III групп очевидна, ее отличия от исходных показателей достоверны (р<0,05). Что касается клеток, не содержащих гликоген, то на их долю приходится 2±0,1%. Кср равен 1,73±0,03, что превосходит исходный фон.

Таким образом, через два часа после болевого воздействия запасы гликогена восстанавливаются, а их восстановление носит компенсаторный характер метаболизма и свидетельствует о готовности лейкоцитов к энергетическому обеспечению их длительной и более мощной активации в будущем.

Подводя итог всему спектру гистохимического исследования, можно заключить, что между активностью МПО, ЩФ и уровнем гликогена в динамике алгогенного процесса прослеживается некоторая коррелятивная связь. Наиболее живо на боль отвечает МПО, ее активность бурно нарастает и возвращается к номе только через 2 часа.

ЩФ наоборот теряет свою активность на начальных этапах алгогенного процесса, и только через 2 часа достигает исходного уровня и превосходит его.

В процесс также включается гликоген. Снижение гликогена наступает стремительно и держится стойко в течение часа. В течение следующего часа, очевидно, за счет механизмов ресинтеза, содержание гликогена восстанавливается и даже превышает норму.

Таким образом, анализируя полученные нами факты и опираясь на данные литературы, мы приходим к заключению, что наиболее ранние этапы реакции на острую висцеральную боль направлены на мобилизацию функциональных резервов фагоцитов, которая первоначально характеризуется снижением исследуемых показателей с последующим повышением их количества и формированием признаков функциональной активности.

Это позволило нам выделить совокупность признаков, которые мы объединили в синдром мобилизационной готовности нейтрофилов.

Синдром мобилизационной готовности нейтрофилов (СМГН):

1. Сброс нейтрофилов из депо и их активация.

2. Мобилизация гликогена.

3. Активация поглотительной способности фагоцитов.

4. Наращивание киллингового потенциала.

5. Наращивание потенциала деградации убитых микроорганизмов.

ВЫВОДЫ

1. Острая висцеральная боль сопровождается развитием лейкопении, которая в течение двух часов от момента болевого раздражения сменяется лейкоцитозом.

2. Реакция костного мозга на острую висцеральную боль характеризуется снижением зрелых форм гранулоцитов и относительным омоложением клеток дозревающего пула.

3. Поглотительная способность нейтрофилов вначале снижается в ответ на острую висцеральную боль и повышается через 3 часа от начала алгогенного процесса.

4. В течение первого часа значения спонтанного НСТ-теста и продукция оксида азота падают, а стимуляция НСТ-теста и продукции оксида азота вызывает выраженное увеличение этих показателей.

5. Острая висцеральная боль сопровождается активацией миелопероксидазы нейтрофилов и снижением активности щелочной фосфатазы; через три часа картина принимает полярный характер.

6. Вовлечение нейтрофилов в алгогенный процесс является энергозависимым и обеспечивается мобилизацией гликогена. Восстановление уровня гликогена отмечается только через 2 часа от момента болевого воздействия.

СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алексеева Н.С., Тарасюк Г., Давиденко С., Шумарин К. Изменение в системе клеточных факторов неспецифической резистентности организма при острой боли // Аннотации докладов и материалов Дня науки молодых ученых Рост ГМУ (61-я Итоговая научная конференция молодых ученых). -Ростов-на-Дону, 2007. - С. 155.

2. Алексеева Н.С., Антонец А., Себастиан С., Матюшина Н. Изменение фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли // Аннотации докладов и материалов Дня науки молодых ученых Рост ГМУ (63-я Итоговая научная конференция молодых ученых). - Ростов-на-Дону, 2009.-С. 153.

3. Алексеева Н.С., Санина С., Монат JL, Ромазанова О. Изменение общего количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы при острой висцеральной боли // Аннотации докладов и материалов Дня науки молодых ученых Рост ГМУ (63-я Итоговая научная конференция молодых ученых). - Ростов-на-Дону, 2009. - С. 77.

4. Алексеева Н.С., Алексеев В.В., Себастиан С. Реакция системы белой крови на острую висцеральную боль // XV Межгородская конференция молодых ученых. - Санкт-Петербург. - 2009. - С.4.

5. Кутузова A.A., Алексеева Н.С., Макаров A.M., Бородин A.B. Баланс некоторых про- и противовоспалительных цитокинов при острой боли // XV Межгородская конференция молодых ученых. - Санкт-Петербург. -2009. - С.66.

6. Овсянников В.Г., Алексеев В.В., Алексеева Н.С. Возрастные особенности фагоцитарной реакции при острой боли у крыс в первых месяц постнатального онтогенеза // Медицинский вестник Башкортостана. -2009. - №2. - С.159-161.

7. Шестопалов A.B., Овсянников В.Г., Алексеева Н.С. Структурно-цитохимические критерии активации нейтрофилов в ответ на острую висцеральную боль // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. -№5. - С.148-152.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода;

Кср - средний цитохимический коэффициент;

МНС - моноцитарно-нейтрофильное соотношение;

МПО - миелопероксидаза;

НСТ - нитросиний тетразолий;

НСТсп - спонтанный НСТ-тест;

НСТСТ - стимулированный НСТ-тест;

ОВБ - острая висцеральная боль;

ПЯ - палочкоядерный нейтрофил;

СЯ - сегментоядерный нейтрофил;

ФЕ - фагоцитарная емкость;

ФИ - фагоцитарный индекс;

ФП - фагоцитарный пул;

ФЧ - фагоцитарное число;

ЩФ - щелочная фосфатаза

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 1410. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Развитие мысли, поступков и дела обеспечивает поступательное движение вперед. Это и в жизни, это и в науке. На перекрестке мнений сталкиваются точки зрения, взгляды, научные традиции. Они обогащают друг друга, отвергают случайное, сохраняют прошлое, формируют будущее.

В 1949 году кафедру патологической физиологии Ростовского государственного медицинского института возглавил Заслуженный деятель науки РСФСР А.Н. Гордиенко, ученик профессора И.Г. Савченко, который в свою очередь был учеником И.И. Мечникова. Так, в Ростов-на-Дону пришли идеи Лауреата Нобелевской премии И.И. Мечникова, так, в Ростов-на-Дону пришло иммунологическое направление в исследованиях, которое обрело своих учеников и последователей.

В годы Великой Отечественной войны А.Н. Гордиенко получает задание Государственного комитета обороны СССН по изучению механизмов шока. С этого времени А.Н. Гордиенко исследовал механизмы различных видов шока, разрабатывал принципы патогенетической терапии и предложил ряд противошоковых мероприятий. Так, на научном перекрестке столкнулись два самостоятельных направления.

Постепенно ученица А.Н. Гордиенко профессор С.А. Еремина тематику шока все больше соотносит с учением Г.Селье о стрессе, а ученик А.Н. Гордиенко профессор В.Г. Овсянников переводит исследования в рамки изучения боли.

Боль принимает вполне определенные очертания типового патологического процесса. Взгляды профессора В.Г. Овсянникова отражены в двух его монографиях: «Боль»(1990) и «Очерки патофизиологии боли» (2003).

Боль изучается в ключе классической патофизиологии, а именно ее влияния на нейроэндокринную регуляцию, кровообращение, иммунитет. Иммунологическое направление И.И. Мечникова, обогащенное исследованиями А.Н. Гордиенко и его учеников замыкается Заслуженным работником высшей школы Российской Федерации, заведующим кафедрой патологической физиологии Ростовского государственного медицинского университета, профессором В.Г Овсянниковым на изучении механизмов иммунологической реактивности при боли. Идеи профессора В.Г. Овсянникова воплощаются его учениками (Шумарин А.Е., Каплиев А.В., Алексеев В.В., Кутузова А.А.).

Настоящее исследование посвящено вполне конкретному вопросу: влиянию острой висцеральной боли на функциональную активность фагоцитов.

Выполнению представленной работы существенно помогли ценные советы и действенная помощь профессора Н.В. Дроботя, д.м.н. А.В. Шестопалова, профессора Г.Г. Харсеевой, доцента С.И. Куцева, за что мы приносим им искреннюю благодарность.

Было бы несправедливым оставить без внимания атмосферу товарищеской помощи и благожелательности со стороны сотрудников кафедры патологической физиологии, которая содействовала продуктивной работе соискателя.

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Боль как патологический процесс формировался на ранних этапах эволюционного развития и стал самым сложным у теплокровных животных и человека.

В повседневной жизни люди нередко сталкиваются с кратковременной соматической болью, с пароксизмами висцеральной боли, эпизоды которых ограничены в рамках времени.

В литературе накоплен обширный материал, свидетельствующий о вовлечении органов и систем организма в алгогенный процесс. Даже кратковременное болевое раздражение способно иметь определенный шлейф последствий для организма (Amit Z., Galina H.Z., 1986; Anand K.J., Craig F.D., 1997-1998).

На сегодняшний день достаточно изучен морфологический субстрат боли, ее тригерные механизмы, ее особенности при различной патологии, разработаны принципы этиотропной и патогенетической терапии (Игнатов Ю.Д., 1982, 1986, 1990; Крыжановский Г.Н., 1997, 1999, 2000; Овсянников В.Г., 1990, 2003; Jones A.R.P. et al., 2003; Кукушкин М.Л., 2004).

Вполне понятно, что центростремительные тенденции доминируют. Они обнадеживают и тем привлекательны.

Исследования посвящены «ядру» боли, а вот ее влияние на организм в целом, на отдельные системы, ткани и органы удостоено меньшего внимания.

Исследование острой висцеральной боли является актуальным, т.к. она сопровождает множество заболеваний внутренних органов и является сигналом о неблагополучии в организме человека. К сожалению, изучение влияния острой кратковременной висцеральной боли, не подкрепленной микробным фактором, на жизнедеятельность организма, на систему иммунной защиты, в частности, на неспецифическую резистентность организма, остается за рамками исследуемых проблем.

Среди десятков тысяч источников в литературе лишь отдельные посвящены влиянию боли на неспецифическую резистентность организма, в частности на фагоцитоз (Филин В.И., 1996; Вейн A.M., Авруцкий М.А., 1997; Новиков Г.А., 1998; Машфорт М.Л., 2004; Штрибель Х.В., 2005; Прощаев К.И., 2006; Алексеев В.В., 2008; Кутузова А.А., 2009).

Специфическая резистентность при боли удостоена значительно большего внимания. А ведь логичнее начинать с доиммунных процессов, только такой путь наиболее рационален с позиций логики познания (Мазурин А.В., Воронцов И.М., 2000). Поэтому настоящее исследование посвящено изучению механизмов изменения фагоцитарной активности лейкоцитов при висцеральной боли. Если к этому добавить, что в литературе весьма ограничена информация об изменениях фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли, то это придает актуальность данному исследованию.

Имеет ли изменение фагоцитарной активности лейкоцитов свои особенности, мобилизует или истощает организм фагоцитарные резервы при острой висцеральной боли. На эти вопросы в доступной литературе достаточно ясный ответ найти мы не смогли.

Вместе с тем, практика скорой медицинской помощи свидетельствует, что в стационар доставляются больные отнюдь не всегда с болью как признаком воспаления, когда роль и участие фагоцитов предполагается само собой. В больницу доставляются больные с эпизодами острой висцеральной боли, вызванной обтурацией мочеточников или желчных протоков, персистирующем фолликулом и т.д. и т.п., когда воспаления в его полноценном выражении еще нет и тем более нет присоединившейся инфекции. Все это определяет актуальность исследования фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы является изучение механизмов изменения фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли.

Для достижения поставленной цели были определены следующие конкретные задачи:

1. Изучить изменения количества лейкоцитов, лейкоцитарной формулы и лейкоцитарного профиля у крыс при острой висцеральной боли.

2. Определить изменения морфологической картины костного мозга как продуцента и динамичного депо фагоцитов.

3. Оценить поглотительную способность фагоцитов в динамике острой висцеральной боли.

4. Исследовать кислородзависимые и кислороднезависимые механизмы бактерицидности лейкоцитов в динамике острой висцеральной боли.

5. На основе сравнительного анализа всех полученных показателей составить комплексное представление об особенностях и механизме изменения фагоцитарной активности лейкоцитов при острой висцеральной боли

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые дается комплексная оценка и аналитическое сопоставление результатов изменения содержания лейкоцитов в периферической крови, лейкоцитарной формулы и лейкоцитарного профиля; параметров, характеризующих поглотительную способность лейкоцитов (фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, фагоцитарный пул, фагоцитарная емкость, моноцитарно-нейтрофильное соотношение); параметров, характеризующих кислородзависимые (НСТ-тест, продукция оксида азота, активность миелопероксидазы) и кислороднезависимые механизмы (активность щелочной фосфатазы) обеспечения фагоцитарной активности лейкоцитов в динамике острой висцеральной боли.

Установлено, что реакция белой крови на острую висцеральную боль вначале манифестируется лейкопенией, превалированием в периферической крови redox-видов нейтрофилов, в которых уже в первый час наблюдается метаболическая трансформация в сторону увеличения потенциала кислородзависимой микробицидности нейтрофилов, подкрепляемого к третьему часу развития процесса активацией механизмов кислороднезависимой микробицидности нейтрофилов.

Отмечено, что в костном мозге при острой висцеральной боли отмечается сдвиг в сторону зрелых форм лейкоцитов, умеренная потеря зрелых форм и накопление резерва реактогенных форм нейтрофилов.

Выявлена фазная динамика энергетической зависимости активации микробицидности лейкоцитов и их способность к быстрому восполнению энергонесущего материала.

На основании анализа собственных результатов экспериментальных исследований и данных литературы предложен алгоритм поэтапной активации механизмов резистентности (фагоцитоза) в динамике формирования неспецифического ответа на острую интенсивную кратковременную висцеральную боль.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Теоретическая значимость работы заключается в том, что она существенно уточнила и расширила традиционные представления об особенностях патогенеза острой висцеральной боли.

Теоретически значимым является экспериментально доказанный феномен фазной реакции белой крови на острую висцеральную боль, заключающийся в динамичном изменении лейкоцитарной реакции от лейкопении до умеренного лейкоцитоза, от нейтропении до выраженного нейтрофилеза с гипорегенеративным сдвигом влево.

Значимость для теории боли обретает временная характеристика и степень выраженности вступления в процесс поглотительного и переваривающего потенциала фагоцитирующих клеток.

Как с теоретической, так и с практической точек зрения существенным представляется выявленная последовательность и интенсивность процессов киллинга и деградации микроорганизмов: снижение фагоцитарной активности лейкоцитов сменяется ее повышением, активация кислородзависимой микробицидности переходит в умеренное повышение кислороднезависимой микробицидности и интенсивное расходование энергетического материала с быстрым его восстановлением.

В работе предложены критерии оценки мобилизационной готовности нейтрофилов к участию в механизмах фагоцитоза на начальных этапах развития патологических состояний, сопровождающихся острой интенсивной висцеральной болью. Они могут быть использованы в практической деятельности врачей широкого профиля с целью прогнозирования и коррекции возможных осложнений, связанных с истощением механизмов неспецифической резистентности организма.

Предложенная и апробированная в различных сериях исследований экспериментальная модель острой интенсивной кратковременной висцеральной боли может быть использована в дальнейшем при изучении патофизиологических механизмов данного процесса.

Работа может быть полезна для студентов, преподавателей патологической физиологии и практических врачей при изучении таких разделов, как «Боль», «Нарушение неспецифических механизмов защиты», «Патология крови», т.к. позволит расширить представление о патогенезе висцеральной боли как типового патологического процесса.

АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные результаты исследования были доложены на 63-й итоговой научной конференции молодых ученых и специалистов Рост ГМУ (Ростов-на-Дону, 2009), на XV межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009), на Российском симпозиуме с международным участием «Патофизиология и клиника экстремальных и терминальных состояний» (Уфа, 2009).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 7 работ. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Из них 1 статья напечатана в ведущем рецензируемом научном журнале, рекомендованном ВАК.

НАУЧНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Острая висцеральная боль вовлекает в алгогенный процесс систему лейкона.

2. На ранних этапах острой висцеральной боли фагоцитарная активность нейтрофилов снижается.

3. Ранняя реакция на острую висцеральную боль характеризуется повышением микробицидного потенциала нейтрофилов.

4. При острой висцеральной боли происходит увеличение активности кислородзависимых механизмов микробицидности нейтрофилов.

5. Вовлечение фагоцитов в алгогенный процесс является энергозависимым и энергозатратным.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, главы материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения собственных результатов, выводов и указателя литературы. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 28 рисунками. Список литературы содержит 281 источник, из них 224 - отечественных и 57 - зарубежных.

Выводы:

1. Острая висцеральная боль сопровождается развитием лейкопении, которая в течение двух часов от момента болевого раздражения сменяется лейкоцитозом.

2. Реакция костного мозга на острую висцеральную боль характеризуется снижением зрелых форм гранулоцитов и относительным омоложением клеток дозревающего пула.

3. Поглотительная способность нейтрофилов вначале снижается в ответ на острую висцеральную боль и повышается через 3 часа от начала алгогенного процесса.

4. В течение первого часа значения спонтанного НСТ-теста и продукция оксида азота падают, а стимуляция НСТ-теста и продукции оксида азота вызывает выраженное увеличение этих показателей.

5. Острая висцеральная боль сопровождается активацией миелопероксидазы нейтрофилов и снижением активности щелочной фосфатазы.

6. Вовлечение нейтрофилов в алгогенный процесс является энергозависимым. Восстановление уровня гликогена отмечается только через 2 часа от момента болевого воздействия.