Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Механизмы и регуляция клеточной гибели нейтрофилов

На правах рукописи

МАЯНСКИЙ Николай Андреевич

МЕХАНИЗМЫ И РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ НЕЙТРОФИЛОВ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва, 2005 г.

Работа выполнена в Государственном научном центре Институте иммунологии Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем («Медбиоэкстрем») при МЗ РФ

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилин Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е.Б. Владимирская доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин доктор медицинских наук, профессор В.Г. Савченко

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет МЗ РФ

Защита диссертации состоится « » ¿^jL 2005 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 208.017.01 в Институте иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при МЗ РФ по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при МЗ РФ.

Автореферат разослан « О / 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.С. Сеславина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность

Термин «аполтоз» был введен в начале 1970-х гг. для обозначения особого типа клеточной гибели, отличного от некроза [Green, 2002; Newmeyer, 2003]. Эта разновидность гибели клеток много раз «открывалась» и предавалась забвению разными цитологами и учеными, изучавшими биологию развития. Изначально она была забыта как малозначимый феномен, однако оживление интереса к апоптозу произошло после того, как было осознано, что этот процесс является генетически регулируемым (программируемым) механизмом, а не просто случайным событием. После этого понятия «апоптоз» и «программируемая клеточная гибель» стали использоваться как синонимы Эта управляемая форма клеточной гибели так же важна и физиологична, как и пролиферация и дифференцировка клеток, и так же четко регулируется. Базисная информация о генетической регуляции апоптоза получена из блестящих работ на примитивном организме Caenorrhabditis elegcms [Newmeyer, 2003]. Оказалось, что гены, которые регулируют апоптоз у этого круглого червя, имеют гомологов у млекопитающих, включая человека. Это доказало, что апоптоз является важным процессом, сформированным и сохраняемым эволюционно.

В течение последних 15-20 лет число исследований, посвященных апоптозу, росло экспоненциально. Было обнаружено, что апоптоз вовлечен во множество физиологических и патофизиологических процессов. Баланс между пролиферацией и гибелью клеток должен быть точно установлен и хорошо контролироваться, поскольку дисбаланс в этой системе может приводить к болезни. Примеры заболеваний, при которых имеются нарушения апоптоза, многочисленны и значительны. Усиление апоптоза нейронов является одним из факторов патогенеза нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона [Haunstetter, 2000; Nicholson, 2000]. Связывание ВИЧ или его белка gpl20 с CD4+ Т-клетками при одновременной стимуляции комплекса МНС-II запускает апоптоз в этих клетках-хелперах, что в итоге приводит к СПИДу [Rathmell, 2002; Opferman, 2003]. Развитие многих онкологических заболеваний связывают с задержкой апоптоза [Green, 2002].

Физиологическое значение апоптоза иллюстрируется его важнейшим вкладом в регуляцию иммунной системы [Rathmell, 2002; Opferman, 2003]. Апоптоз участвует в контроле за созреванием Т- и B-клеток и элиминацией аутореактивных лимфоцитов. Пролиферация и экспансия лимфоцитов после встречи с антигеном, выживание клеток памяти и гибель активированных Т-клеток при инволюции иммунного ответа - все эти реакции приобретенного иммунитета связаны с усилением или

угнетением апоптоза. Кроме того, иммунная толерантность в иммунологически привилегированных областях (например, передняя камера глаза и яички) обеспечивается механизмами, связанными с апоптозом [Rathmell, 2002; Opferman, 2003].

Настоящая работа посвящена изучению апоптоза нейгрофилов, которые являются одним из главных компонентов врожденного иммунитета. Нейтрофилы составляют самый большой пул лейкоцитов периферической крови (от 40 до 70% в нормальных условиях). Они защищают организм от бактериальных и грибковых инфекций. Для этого нейтрофилы оснащены необходимыми инструментами, которые позволяют им выявлять очаг инфекции, двигаться в его направлении и поглощать и уничтожать микроорганизмы [Маянский А.Н., 1989; Klebanofif, 1978]. Очевидно, что для надлежащего функционирования этого рубежа защиты достаточное число нейгрофилов должно производиться костным мозгом и высвобождаться из него, будучи способными исполнять большое число различных функций. Однако, в связи с тем, что сами нейтрофилы и продукты их метаболизма потенциально опасны для тканей хозяина, существует целый ряд барьеров для предотвращения таких нежелательных побочных эффектов. Одним из таких механизмов служит апоптоз. Благодаря апоптозу удается предотвратить выход цитотоксического содержимого нейгрофилов в окружающие ткани и своевременно элиминировать погибающие клетки через тканевые макрофаги [Dransfield, 2000; Savill, 2000].

Несмотря на значительный объем литературы, посвященной исследованию апоптоза нейгрофилов, ряд важных вопросов остается неизученным. Так, по-прежнему не расшифрованы молекулярные механизмы апоптоза, хотя известно, что его регуляция осуществляется при участии белков семейства Вс1-2 и каспаз. Предполагается, что эти две группы молекул тесно взаимодействуют на уровне митохондрий: гомологи Вс1-2 могут управлять активностью каспаз через влияние на проницаемость наружной митохондриальной мембраны [Adams, 1998, 2002; Newmeyer, 2003]. Повышение проницаемости облегчает высвобождение митохондриальных проапоптозных факторов и сборку апоптосомы [Adams, 2002] - мультимолекулярного комплекса, активирующего инициаторную каспазу-9. Вслед за этим происходит активация эффекторных каспаз, которые расщепляют множество мишеней, что ведет к дезорганизации и гибели клетки. Как физиология митохондрий, так и функционирование этого внутреннего (митохондриального) механизма апоптоза в нейтрофилах до сих пор подробно не исследовалось, хотя он видится особенно значимым, т.к. нейтрофилы настроены на быструю, спонтанную гибель в отсутствие дополнительных внешних воздействий. Кроме того, неполно освещены и пути модуляции апоптоза нейгрофилов под влиянием биологически активных медиаторов, в частности, цитокинов. Эндогенные цитокины играют важную роль в регуляции воспаления. Широко применяются цитокины и в виде

фармакологических препаратов, как, например, Г-КСФ, используемый при нейтропениях. Его воздействие на нейтрофилы in vivo направлено в том числе и на регуляцию апоптоза [Spiekerman, 1997; Kuijpers, 2002]. В этом свете интересным видится изучение функциональных способностей нейтрофилов при апоптозе и его задержке антиапоптозными агентами, в частности, Г-КСФ.

В последнее время появились сообщения о каспазонезависимой (программированной) клеточной гибели, которая может играть важную роль в ряде физиологических процессов [Lockshin, 2002]. Возможность такого альтернативного механизма гибели нейтрофилов остается неизученной.

Преждевременный (ускоренный) апоптоз нейтрофилов и их костномозговых предшественников лежит в основе развития нейтропений различного спектра, включая тяжелую врожденную нейгропению, циклическую нейгропению, хроническую идиопатическую нейтропению [Aprikyan, 2000, 2001, 2002, 2003; Kuijpers, 2002; Papadaki, 2003]. В то же время, при ряде заболеваний, при которых нейтропения является сопутствующим, но нередко жизнеугрожающим синдромом, ее механизмы остаются невыясненными [Kuijpers, 2002]. К примерам таких заболеваний относятся гликогеноз типа lb (GSDlb) [Visser, 2000; Calderwood, 2001] и синдром Барта (СБ) [Barth, 1983, 1999]. В связи с этим представляется важным оценить возможный вклад апоптоза в патогенез нейтропении при указанных заболеваниях.

Таким образом, более подробное изучение событий, лежащих в основе клеточной гибели нейтрофилов, внесет вклад в понимание физиологии нейтрофилов и будет способствовать поиску новых подходов к управлению воспалением и лечению состояний, связанных с расстройствами апоптоза нейтрофилов.

Цель исследования - изучение механизмов и регуляции клеточной гибели нейтрофилов, а также потенциальной роли апоптоза в патогенезе нейтропений.

Задачи:

1. Проанализировать влияние апоптоза на функциональные способности нейтрофилов.

2. Исследовать особенности митохондрий и внутреннего (митохондриального) механизма апоптоза нейтрофилов.

3. Уточнить механизмы антиапоптозного действия Г-КСФ

4. Провести поиск альтернативных путей клеточной гибели нейтрофилов и выяснить их механизмы.

5. Изучить значение апоптоза в патогенезе нейтропении при гликогенозе типа 1 b и синдроме Барта.

Научная новизна

Описаны новые маркеры апоптоза нейтрофилов, которые могут быть использованы для количественной оценки клеточной гибели. Впервые подробно исследованы особенности митохондрий нейтрофилов и установлено их участие в регуляции апоптозной программы этих клеток. Показано, что при апоптозе нейтрофилов митохондрии выделяют в цитозоль проапоптозные белки, которые способствуют активации каспаз. Установлено, что в нейтрофилах может происходить цитохром с-независимая активация каспазы-9. Выявлена иерархия активации каспаз при ТНФ-а-индуцированном апоптозе нейтрофилов, согласно которой активация каспазы-9 и каспазы-3 предшествует активации каспазы-8. Получены дополнительные данные о работе внутреннего (митохондриального) пути апоптоза нейтрофилов и механизмах антиапоптозных эффектов Г-КСФ в рамках этого пути. Впервые описан каспазонезависимый механизм клеточной гибели нейтрофилов и определены его вероятные механизмы и эффекторы. Впервые в циркуляции у больных GSDlb обнаружены апоптозные нейтрофилы и получены данные о возможной роли апоптоза в патогенезе нейтропении при этом заболевании. Впервые детально исследованы функции нейтрофилов при СБ. Показано, что повышенное связывание аннексина-V нейтрофилами больных СБ не свидетельствует об апоптозном фенотипе этих клеток.

Теоретическая и практическая значимость

В ходе настоящего исследования получена новая информация о механизмах и регуляции клеточной гибели нейтрофилов, которая углубляет понимание физиологии нейтрофилов и механизмов реакций, опосредуемых этими клетками. Полученные данные расширяют представления о физиологии митохондрий: в нейтрофилах эти органеллы регулируют клеточную гибель, но утрачивают роль в энергетическом метаболизме клеток. Выявление цитохром онезависимой активации каспазы-9 оспаривает постулат о том, что цитохром с является универсальным и ведущим эффектором апоптоза, и станет стимулом для поиска альтернативных медиаторов клеточной гибели. Это позволит углубить знания о механизмах регуляции апоптоза. Изучение внутреннего механизма апоптоза нейтрофилов и антиапоптозных эффектов Г-КСФ обозначило ряд интересных потенциальных мишеней (конформационная активация В ах, расщепление Bid, активация каспаз) для направленного поиска средств для фармакологического управления апоптозом нейтрофилов. Исследование нейтрофилов больных GSDlb вскрывает роль усиления апоптоза в развитии нейтропении при этом заболевании, что может способствовать поиску адекватных лечебных мер. Вместе с тем, отсутствие апоптозного фенотипа и сохранные клеточные функции у нейтрофилов больных СБ несмотря на повышенное связывание аннексина-V указывает на то, что оценка клеточной гибели по единственному

критерию не всегда дает истинную картину. Это следует учитывать при изучении апоптоза, в связи с чем предложенные в настоящей работе новые маркеры клеточной гибели будут полезными.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Митохондрии нейтрофилов утрачивают метаболические функции, но продолжают участвовать в регуляции клеточной гибели.

2. В нейтрофилах возможна цитохром онезависимая активация каспазы-9; активация каспазы-9 и каспазы-3 предшествует активации каспазы-8.

3. Апоптоз нейтрофилов сопровождается конформационной активацией Вах, расщеплением Bid, транслокацией Bax/Bid к митохондриям, выходом проапоптозных белков митохондрий в цитозоль и активацией каспаз. Антиапоптозные эффекты Г-КСФ связаны с угнетением перечисленных реакций.

4. ТНФ-сс способен вызывать клеточную гибель нейтрофилов по двум механизмам: каспазозависимому (апоптоз) и каспазонезависимому. Последний отличается от апоптоза по ряду признаков, опосредуется митохондриальными АФК и требует внутримитохондриальной протеазной активности Omi/HtrA2.

5. В циркуляции у больных GSDlb присутствуют апоптозные нетрофилы.

6. Связывание аннексина-V нейтрофилами при СБ не является индикатором их апоптозного фенотипа.

Апробация работы

Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены и обсуждены на 34-ом (г. Орхус, Дания, 17-20 мая 2000 г.), 36-ом (г. Брюссель, Бельгия, 1013 апреля 2002 г.), 37-ом (г. Верона, Италия, 2-5 апреля 2003 г.) и 38-ом (г. Утрехт, Нидерланды, 14-17 апреля 2004 г.) ежегодных съездах Европейского общества по клиническим исследованиям (ESCI), на ежегодных съездах общества иммунологов Нидерландов (г. Лиссе, Нидерланды, 20-21 декабря 2001 г. и 18-19 декабря 2003 г.), на заседаниях Нидерландского общества по воспалению (г. Амстердам, Нидерланды, 9 октября 2001 и г. Лейден, Нидерланды, 9 октября 2003 г), на ежегодных съездах гематологов и трансфузиологов Нидерландов (NVB Sanquin day; г. Эде, Нидерланды, 25 мая 2000 г. и 5 июня 2003 г.), на симпозиуме Keystone «Апоптоз в биохимии и структурной биологии» (г. Кистоун, Колорадо, США, 3-8 февраля 2004 г.), на 11-ом Всероссийском симпозиуме «Хроническое воспаление» (г. Новосибирск, 4-6 октября 2000 г.), на заседаниях общества иммунологов г. Н. Новгорода.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы, из них 19 статей в центральных отечественных и международных научных

журналах и 5 публикаций в материалах российских и международных научных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, описания материалов и методов, 7 глав результатов собственных исследований, заключения и выводов. Объем диссертации 194 страницы машинописного текста Работа иллюстрирована 50 рисунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает 304 источника, в том числе 5 отечественных и 299 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе исследовали нейтрофилы периферической крови 127 здоровых доноров, 3 больных хронической грануломатозной болезнью, 5 больных гликогенозом типа lb и 7 больных синдромом Барта, а также использовали клетки миелоидной линии HL-60 и цитопласты нейтрофилов.

Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования через изотонический градиент плотности Percoll (1,078 г/л; Sigma, Швеция) с последующим лизисом эритроцитов ледяным изотоническим раствором хлорида аммония по методу [Roos, 1986]. Выделенные нейтрофилы (5 х 106 клеток/мл) культивировали в 24-луночных планшетах в среде IMDM с добавлением 10% инактивированной феталъной телячьей сыворотки в увлажненном инкубаторе при 37°С и 5% СОг- При культивировании использовали следующие агенты: 100 нг/мл Г-КСФ ("Neupogen", Amgen, Нидерланды), 2 (ir/мл ЦГМ (Calbiochem, Германия), 20 нг/мл ТНФ-а (Calbiochem), 5 ммоль/л N-ацетилцистеина (Sigma, США), 100 цмоль/л ротенона (Sigma), 500 нг/мл amn-Fas МоАт (клон СН11; Immunotech, Франция), 150 цмоль/л zVAD-fmk (Alexis Biochemicals, США). Цитопласты получали путем ультрацентрифугирования нейтрофилов в прерывистом градиенте плотности [Roos, 1983] и культивировали в концентрации 10 х 106 клеток/мл. Нейтрофильное созревание миелоидной клеточной линии HL-60 индуцировали в экспоненциально растущих клетках, которые помещали в IMDM, содержащую 1,25% диметилсульфоксида, в концентрации 0,5 х 106 клеток/мл. Апоптоз HL-60 клеток вызывали обработкой этопозидом (100 дмоль/л; Calbiochem) в течение 4-5 часов [Arroyo, 2002].

Окрашивание аннексином-V проводили с помощью меченого ФИТЦ аннексина-V (набор BenderMedsystems, Австрия), специфически связывающегося с остатками ФС на мембранах апоптозных клеток, и ПИ флуоресцентно! о красителя ДНК, позволяющего дифференцировать

клетки с интактной и проницаемой (поврежденной) мембраной [Vermes, 1995] Окрашенные клетки анализировали с помощью FACScan (Becton Dickinson, США). Морфологию клеток оценивали в цитоспинах, окрашенных по Май-Грюнвальду-Гимзе, с помощью световой микроскопии К апоптозным относили клетки с уменьшенными размерами, конденсированной цитоплазмой, уплотненным бесструктурным хроматином и фрагментацией ядра на апоптозные тела (см. рис. 1, Д)

Хемотаксис (направленную миграцию) нейтрофилов, меченых флуоресцентным красителем кальцеином-АМ (calcein-AM, Molecular Probes) оценивали по методике [Kuijpers, 2003] с помощью кювет Fluor obi ock (Falcon, США) на plate reader HTS7000+ (Perkin Elmer, США). Активность НАДФН определяли по продукции Н202, которую оценивали с помощью НгСЬ-зависимого окисления флуорогена Amplex Red (Amplex Red kit, Molecular Probes) согласно указаниям производителя на plate reader HTS7000+. Фагоцитоз ОЗ-ФИТЦ определяли, смешивая взвесь нейтрофилов с ОЗ-ФИТЦ. После фиксации реакционную смесь анализировали с помощь конфокального микроскопа Концентрацию АТФ определяли с помощью люциферазной биолюминесцентной реакции [Peachman, 2001].

Активность глутаматдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и фумаразы определяли спектрофотометрически по общепринятым методикам [Maianski, 2004].

Для получения субклеточных фракций клетки взвешивали в ледяном буфере для экстракции цитозоля, содержавшего 250 jxr/мл дигитонина. После 10-15 мин инкубации на льду, когда 80-90% клеток становились проницаемыми для трипанового синего, суспензии осаждали центрифугированием (1000 х g, 5 мин) и собирали надосадок как цитозольные фракции Остававшийся в пробирках осадок ресуспендировали в ледяном митохондриальном лизис-буфере, содержавшем 1% детергента NP-40, в объеме, равном объему буфера, использованного для экстракции цитозоля. После 10 мин инкубации на льду проводили центрифугирование (10000 у. g, 10 мин) и полученный надосадок собирали как митохондриальные фракции. ИБ проводили по методике [Маянский H.A., 2001]. Образцы для ИБ загружали в 12,5% полиакриламидный гель и проводили SDS-PAGE. После электрофореза белковые фракции с геля переносили (блоттинг) на микропористую мембрану PVDF (Bio-Rad, США). Для выявления искомых белков использовали специфичные Ат.

ИП цитохрома с и Вах осуществляли по методике [Hsu, 1997; Murphy, 2003], используя сефарозу, конъюгированную с протеином G (Amersham, США).

Для изучения митохондрий использовали KJICM (микроскоп Axiovert 100М, Carl Zeiss, Германия). Применяли специфический флуоресцентный краситель митохондрий MitoTracker GreenFM (Molecular

Probes). Этот краситель, легко проникая в клетку, начинает флуоресцировать только при накоплении в липидных структурах митохондрий, визуализируя их Для изучения локализации Вах нейтрофилы фиксировали, обрабатывали анти-Вах Ат и анализировали при помощи КЛСМ [Маянский H.A., 2001].

Фагоцитоз апоптозных нейтрофилов макрофагами, полученными из моноцитов периферической крови человека проводили по методу [Hollak, 1994]. Результаты представляли как процент макрофагов, фагоцитировавших нейтрофилы, определенный по формуле' фагоцитарный индекс = [число макрофагов с включениями миелопероксидазы/общее число подсчитанных макрофагов] х 100.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы MS Exel Вычисляли следующие статистические показатели-среднюю арифметическую (М); стандартную ошибку средней арифметической (m); стандартное отклонение средней арифметической (СО). Статистическую обработку результатов выполняли при помощи ANOVA (one-way analysis of variance) с последующим пост-тестом Бонферрони, используя программу GraphPad Prism v 3 0. Статистически достоверными различия считали при Р < 0,05. При необходимости использовали также парный i-тест Стъюдента, который проводили с помощью программы MS Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Свойства апоптозных нейтрофилов

Апоптоз, как и любой другой физиологический процесс, имеет ряд характерных признаков, которые используются для его выявления и изучения Для регистрации этих признаков существует целый спектр методов. Классическим критерием апоптоза, по которому программированная клеточная гибель была впервые отделена от некроза, является типичная морфология клеток. При апоптозе ядра округляются и разделяются на апоптозные тельца, конденсируется хроматин, и происходит сморщивание клеток (рис. 1, Д). Клеточная мембрана при апоптозе также изменяется. Одним из наиболее известных поверхностных маркеров апоптозных клеток служат остатки фосфатидилсерина (ФС) В интактных клетках этот фосфолипид находится во внутреннем слое цитоплазматической мембраны, а при апоптозе «выныривает» на поверхность Остатки ФС имеют высокую аффинность к белку аннексину-V, который (в присутствии ионов Са2+) прочно связывается с ними, и, будучи конъюгированным, например, с флуоресцентной меткой, может быть обнаружен путем проточной цитометрии Пример выявления

алоптозных клеток с помощью аннексина-У-ФИТЦ показан на рис. I, Е (пик М1). Очевидно, что свежевыделенные нейтрофилы, не экспрессирующие ФС, практически не связывали аннексин-У-ФИТЦ, тогда как значительная часть клеток после культивирования подвергалась апоптозу и становилась аннексии-V* (рис. 1, Б и Е, пик М1).

В ходе настоящей работы по изучению клеточной гибели нейтрофилов в дополнение к общеизвестным признакам были предложены другие критерии В алоптозных нейтрофилах митохондрии образуют агрегаты (рис 1, Ж), в составе которых обнаруживается проапоптозный белок Вах (рис. 1, 3) В свежевыделенных нейтрофилах митохондрии имеют трубчатую форму (рис. 1, В), а Вах локализуется дисперсно в цитоплазме, отдельно от митохондрий (рис. 1, Г). Таким образом, митохондрии и Вах выглядят совершенно по-разному в алоптозных и ингактных клетках. Эти очевидные различия дали возможность оценить пропорцию клеток с каждым фенотипом и провести корреляцию с приведенными выше традиционными маркерами апоптоза - связыванием аннексина-У и морфологическими изменениями. С помощью флуоресцентного микроскопа мы подсчитали процент клеток с агрегированными митохондриями (как на рис. 1, Ж) и гроздевидным Вах (как на рис. 1, 3) Параллельно из тех же суспензий готовились образцы для определения процента аннексии-V нейтрофилов путем проточной цитометрии (рис. 1, Б и Е, пик М1), а также для подсчета содержания клеток с апоптозной морфологией (как на рис. 1, Д). Количественные данные представлены на рис. 2. Примечательно, что число клеток с измененными митохондриями и число клеток с кластерами Вах близко коррелировали с пропорцией аннексии-V* нейтрофилов и клеток с апоптозной морфологией. Это оказалось справедливым как для нейтрофилов, спонтанно апоптировавших в 20 ч культурах без добавлений, так и для клеток, обработанных Г-КСФ, в которых апоптоз был отсрочен (рис. 2; более подробно о Г-КСФ и апоттгозе см. ниже). Перед культивированием ни один из искомых признаков в клетках не выявлялся (рис. 1, А-Г, рис. 2, 0 ч). Следовательно, структура митохондрий и особенности локализации Вах являются чувствительными и надежными маркерами апоптоза нейтрофилов и могут служить для его количественной оценки.

Для борьбы с патогенами нейтрофилы обладают целым спектром эффекторных функций. Эти функции находятся под строгим контролем, который направлен на предотвращение повреждения собственных тканей организма. Апоптоз нейтрофилов служит одним из рычагов такого контроля, вызывая снижение функциональной активности клеток. Для того чтобы оценить степень функциональных расстройств нейтрофилов при апоптозе, а также проверить, сохраняют ли нейтрофилы свои реактивные способности при задержке апоптоза, мы сравнили уровень функционирования свежевыделенных клеток и клеток из 20 ч культур без добавлений или обработанных Г-КСФ. После 20 ч инкубации без

Рис. 1. Феноменология апоптоза нейтрофилов Для демонстрации маркеров апоптоза использовали свежевыделенные нейтрофилы (А-Г) и нейтрофилы, апоптировавшие спонтанно в 20 ч культуре (Д-3) (А и Д) Морфология цитоспинов, окрашенных по Май-Грюнвальду-Гимзе, в световом микроскопе (Б и Е) Проточная цитометрия нейтрофилов, окрашенных аннексиномЛ/ Пик М1 содержит аннексин-ХЛ клетки (В и Ж) Окрашивание митохондрий с помощью специфического митохондриального флуоресцентного красителя ШоТгаскег вгеепРМ После окрашивания клетки анализировали с помощью КЛСМ (Г и 3) Окрашивание белка Вах в нейтрофилах с помощью поликлональных Ат против Вах; данные КЛСМ

□ Днм«#<н-ЪГ Щ Ар«гзты мигох

О Ч 20 Ч

Рис. 2. Феноменология апоптоза нейтрофилов (количественные данные) Нейтрофилы до (О ч) или после 20 ч инкубации без добавлений или с Г-КСФ (100 нг/мл) окрашивали и анализировали так же, как указано в подписи к рис 1 Столбцы представляют проценты клеток со следующими чертами белые столбцы - процент аннексии-^ клеток пика М1 (см. рис 1, Б и Е), черные столбцы - процент клеток с кластерами митохондрий, как на рис 1, Ж, заштрихованные столбцы - процент клеток с агрегированным Вах, как на рис. 1, 3, серые столбцы - процент клеток с типичной апоптозной морфологией (рис 1, Д) Результаты представляют М ± т 4-5 экспериментов.

добавлений апоптировали -75% нейтрофилов. Суспензия свежевыделенных нейтрофилов содержала ничтожное число аннексии-V* клеток (для удобства мы указываем это количество как <5%). Присутствие в культуре Г-КСФ значительно снижало уровень апоптоза, который в этих условиях составлял 25-30%. Уровень апогттоза, выявленный с помощью аннексина-У-ФИТЦ, близко коррелировал с другими показателями апоптоза (морфологией, агрегацией митохондрий и белка Вах; см. рис. 2).

Одной из основных клеточных функций нейтрофилов является хемотаксис, т.е. способность к направленному движению в сторону градиента хемоаттрактанта, источником которого могут служить, например, бактерии или формирующийся очаг воспаления Реакция апоптозных нейтрофилов на хемоаттрактанты С5а и ИЛ-8 оказалась резко снижена и составляла не более 5-10% по сравнению со свежими клетками Нейтрофилы, инкубированные с Г-КСФ, сохраняли способность к хемотаксису. Максимальная миграция клеток, обработанных Г-КСФ, превышала показатели апоптозных клеток в 3-5 раз, хотя была на 50-70% меньше таковой свежих нейтрофилов. Проточная цитометрия клеток из 20 ч культур, способных мигрировать, показала, что более 95% из них составляли аннексии-V" нейтрофилы. Эти данные свидетельствуют о том, что только живые клетки сохраняют способность к хемотаксису, а апоптозные полностью утрачивают ее.

Следующим после хемотаксиса этапом в реализации эффекторного потенциала нейтрофилов служит фагоцитоз С целью оценки способности к фагоцитозу у культивированных нейтрофилов мы исследовали поглощение ими опсонизированного зимозана (03), меченого ФИТЦ, с помощью флуоресцентной микроскопии. Одновременное окрашивание клеток аннексином-У показало, что только живые (аннексии-V) клетки фагоцитировали ОЗ. Следовательно, апоптозные нейтрофилы теряют способность к фагоцитозу.

Респираторный взрыв (продукция активных форм кислорода, АФК) является одной из главных функций нейтрофилов, с помощью которой они непосредственно уничтожают микроорганизмы Выделение Н2О2 служит адекватным маркером этой активности (Хицрегв, 1999] Для более точной оценки респираторного взрыва были использованы фракции нейтрофилов, разделенных по признаку связывания аннексина-У магнитными микросферами, конъюгированными с аннексином-У. Апоптозные (аннексии-V4") нейтрофилы после 20 ч инкубации практически не генерировали Н2О2 Выжившие, аннексин-У" клетки сохраняли способность к респираторному взрыву, которая составила -50% от активности свежих нейтрофилов Сходную активность демонстрировали клетки, обработанные Г-КСФ.

Клеточные функции требуют затрат энергии, и концентрация АТФ является чувствительным показателем энергообеспечения клеток. В

апоптозных нейтрофилах оставалось менее 10% АТФ по сравнению со свежими клетками, а выжившие клетки, напротив, сохраняли 40-50% АТФ

Таким образом, настоящие результаты ясно продемонстрировали связь между расстройством клеточных функций и апоптозом Сравнение фракций нейтрофилов с низким (аннексии-V") и высоким (аннексин-У+) содержанием апоптозных клеток показало выраженное снижение (более 90%) респираторного взрыва в последних. В апоптозной популяции также были нарушены хемотаксис и фагоцитоз Прямое доказательство утраты функций апоптозными нейтрофилами было получено при микроскопии клеточной суспензии, обработанной ОЗ-ФИТЦ и аннексином-У-ФИТЦ, в которой ни один нейтрофил, связывавший аннексии-V, не фагоцитировал ОЗ.

При сравнении функциональной активности свежих нейтрофилов и клеток после 20 ч инкубации из аннексии-V" фракции было выявлено -50% снижение респираторного взрыва, которое не может быть полностью отнесено на счет 20-30% контаминирующих апоптозных клеток. Такие расчеты справедливы и для нейтрофилов, инкубированных 20 ч с Г-КСФ. При уровне апоптоза в этих культурах 25-30% (т.е. —2/3 оставались аннексии-V") функциональные возможности были на уровне не более 1/2 от свежих клеток. Эти наблюдения говорят о том, что функциональные расстройства могут предшествовать появлению явных признаков апоптоза (например, экспрессии ФС и морфологическим изменениям). К похожему выводу пришли авторы работы [Огеет^ет, 2000], которые показали, что при быстрой индукции апоптоза через Раз-рецептор пропорция нейтрофилов, утративших способность к адгезии на эндотелии, превышала число аннексии-V' клеток. Тем не менее, данные о том, что Г-КСФ, предотвращая апоптоз, также сохраняет функциональный потенциал клеток, являются дополнительным свидетельством в пользу тесной связи между апоптозом и функциями клеток.

Очевидно, что весь апоптозный процесс нацелен на то, чтобы «бескровно» и эффективно переработать массу ежедневно обменивающихся нейтрофилов. Апоптоз создает условия для функциональной изоляции клеток. Они утрачивают сигнальные рецепторы, в них снижаются уровень АТФ и функциональные резервы, а изменения клеточной мембраны способствуют их своевременному удалению.

Митохондрии нейтрофилов: особенности физиологии и значение в апоптозе

Митохондрии известны как органеллы, которые обеспечивают жизнедеятельность клетки необходимой энергией в виде АТФ. Однако, за последнее десятилетие накопились данные о том, что митохондрии играют важную роль также и в апоптозе клетки [Ыештеуег, 2003]. Эти органеллы содержат в межмембранном пространстве ряд белков, которые при выходе в цитозоль способны запускать и/или усиливать активацию апоптозных

каспаз Один из таких белков, цитохром с, является ключевым элементом митохондриального дыхания, обеспечивая передачу электронов с III на IV комплекс дыхательной цепи Вместе с тем, цитохром с участвует в сборке мультимолекулярного комплекса, известного как апоптосома, в составе которого происходит активация инициаторной каспазы-9. Апоптосома представляет собой центральное звено внутреннего (митохондриального, стресс-зависимого) механизма апоптоза [Adams, 2002]. Другие белки митохондрий, например, AIF, Smac/DIABLO и Omi/HtrA2 пока известны только своими проапоптозными потенциями [Newmeyer, 2003]. Очевидно, что в большинстве типов клеток митохондрии сочетают функции, относящиеся как к клеточной жизни, так и к клеточной гибели.

В этом свете нейтрофил человека представляется исключительной клеткой по следующим причинам. В отличие от других типов клеток, в нейтрофил ах митохондрии практически не играют роли в энергетическом обмене. Это заключение было сделано на основании определения концентрации АТФ в нейтрофилах в различных экспериментальных условиях. После 6 ч инкубации в клетках наблюдалось умеренное снижение (около 30%) уровня АТФ по сравнению со свежими нейтрофштами, отражавшее, вероятно, естественный процесс старения клеток. Ингибиторы митохондриального дыхания ротенон, ТТФА и азид натрия [Schulze-Osthoff, 1992] лишь незначительно влияли на концентрацию АТФ в нейтрофилах, хотя в клетках миелоидной линии HL-60, например, ротенон после 6 ч инкубации сокращал запасы АТФ на 70%. Такой результат может быть объяснен тем, что для обеспечения себя энергией нейтрофилы в основном используют гликолиз, а не митоховдриальное окислительное фосфорилирование [Borregaard, 1982]. Действительно, ингибитор гликолиза йодо ацетат натрия вызывал почти полное (более 95%) истощение АТФ в нейтрофилах. Кроме того, активность двух важных митохондриальных ферментов, глутаматдегидрогеназы и фумаразы, которые часто используются в качестве маркеров митохондрий, в нейтрофилах оказалась чрезвычайно низкой в противоположность HL-60 клеткам, которые имеют активное митохондриальное дыхание. В то же время, активность цитоплазматического маркера лактатдегидрогеназы была сходной в нейтрофилах и HL-60 клетках, что подтверждало общую интактность ферментативных систем в лизатах нейтрофилов.

Несмотря на ограниченную роль митохондрий в метаболизме нейтрофилов, наши следующие наблюдения показали, что эти органеллы вовлечены в регуляцию клеточной гибели, выделяя проапоптозные белки в цитозоль. Для того чтобы продемонстрировать это, мы разделили нейтрофилы на цитоплазматическую и митохондриальную (обогащенную составляющими митохондрий) субклеточные фракции. В качестве модели апоптоза использовались нейтрофилы, инкубированные с ТНФ-а в комбинации с ингибитором синтеза белка ЦГМ в течение 3 ч. В этих условиях нейтрофилы быстро погибают путем классического,

каспазозависимого апогггоза [УатавЬка, 1999], причем большинство апоптирует (70-80% становится аннексии-V* и приобретает морфологические черты апоптоза), сохраняя целостность цитоплазматической мембраны (окрашивание ПИ в < 5% клеток). Таким образом удавалось минимизировать возможное вытекание интересующих белков из клеток через поврежденную мембрану, которое вероятно в суточных культурах, когда до 15-30% клеток становятся проницаемыми для ПИ. Эти же рассуждения применимы для апоптоза НЬ-60 клеток, индуцированного этопозидом в краткосрочных (4-5 ч) культурах.

Субклеточное фракционирование выявило слабую экспрессию цитохрома с в митохондриальной фракции нейтрофилов (рис. 3, дор. 4 и 5). Как показано на рис. 3, ни один белок митохондрий не определялся в цитозоле свежих нейтрофилов (дор. 1) и нейтрофилов, инкубированных в течение 3 ч без добавлений (дор. 2). Эти белки отсутствовали также в цитозоле необработанных НЬ-60 клеток (рис. 3, дор. 7). Запуск апоптоза комбинацией ТНФ-а+ЦГМ сопровождался массивным выходом белков Опн/ШгА2 и БтасЛЯАВЬО из митохондрий, в которых они обычно присутствуют в интактных (живых) клетках (рис. 3, дор. 4 и 5), в цитозоль (рис. 3, дор. 3), и реципрокным уменьшением сигнала в митохондриальной фракции (рис. 3, дор. 6). Это же наблюдалось в НЬ-60 клетках, инкубированных с этопозидом (рис. 3, дор. 8 и 10). Минимальный сигнал цитохрома с в цитозоле апоптозных нейтрофилов определялся лишь после передержки рентгеновской пленки, хотя в цитозоле обработанных этопозидом НЬ-60 клеток этот белок выявлялся легко (рис. 3, дор. 8). АШ регистрировался только в митохондриальных фракциях как нейтрофилов, так и НЬ-60 клеток вне зависимости от уровня апоптоза (рис. 3, дор. 4-6, 9 и 10). Осадочные фракции, остававшиеся после лизиса митохондрий и состоявшие из нерастворившихся белков, содержали одинаково небольшое количество А1Т. Это свидетельствовало о том, что (в наших экспериментальных условиях) А1Р не переходил из митохондрий в ядро, как наблюдалось в других типах клеток [Яауа^ап, 2002]. Качество (чистота) субклеточных образцов было подтверждено обнаружением митохондриального белка порина исключительно в митохондриальных фракциях нейтрофилов и НЬ-60 клеток (рис. 3, дор. 4-6, 9 и 10). Напротив, цитоплазматический белок АраГ-1 присутствовал только в цитозоль ных фракциях как нейтрофилов, так и НЬ-60 клеток (рис. 3, дор. 1-3, 7 и 8) независимо от апоптоза Таким образом, при индукции апоптоза митохондрии нейтрофилов выделяют свои проапоптозные составляющие в цитозоль, тем самым активно участвуя в клеточной гибели.

Нейтрофилы Н 1.-60

Циююя. Цдоиоцц. Цигоздль Моосоцц.

Рис. 3. Выход митохондриальных белков в цитозоль нейтрофилов и Н 1.-60 клеток при их апоптозе. Разделение клеток на цитозольные и митохондриальные фракции проводили путем дигитонинового фракционирования Использовали свежевыделенные нейтрофилы (дор. 1 и 4; <5% аннексинЛГ клеток), нейтрофилы после 3 ч инкубации без добавлений (дор 2 и 5; 10 ± 2% аннексинЛЛ клеток) или с ТНФ-а+ЦГМ для индукции апоптоза (Т/Ц; дор 3 и 6; 74 ± 3% аннексинЛГ клеток), а также необработанные НЫ50 клетки (дор 7 и 9, <5% аннексинЛЛ клеток) и Ш-60 клетки после 4-5 ч инкубации с этопозидом (+Е1о; дор 8 и 10; 29 ± 2% аннексинЛЛ) Процентное содержание аннексинЛЛ клеток представлено как М ± т (л=3) После разделения цитозольные (дор 1-3, 7, 8) и митохондриальные (дор. 4-6, 9, 10) фракции подвергали ¿ЮЗ-РАвЕ Затем проводили ИБ с Ат, специфичными для указанных белков Каждая фракция представляет -2* 10е нейтрофилов и ~0,4 х 10е НЬ60 клеток Пробы с анти-пориновыми и анти-АраМ Ат служили стандартами для митохондриальных и цитоплазматических фракций, соответственно Результаты репрезентативны для 3 независимых экспериментов

В клетке имеются два основных механизма апоптоза. Внешний путь (зависимый от рецепторов смерти) начинается активацией каспазы-8, а внутренний механизм апоптоза (митохо ндриаль ный, стресс-индуцированный) включает цитохром с/АраР-1 -зависимую сборку апоптосомы и активацию каспазы-9. Впрочем, разделение этих механизмов видится несколько искусственным, поскольку они пересекаются и могут усиливать друг друга, имея в качестве общего финального эффектора каспазу-3. Учитывая чрезвычайно низкое содержание цитохрома с в нейтрофилах, который удалось выявить только после фракционирования клеток (см. рис. 1), возник вопрос о том, функционирует ли в них классический апоптосомный путь активации каспазы-9. Данные ИБ указывали на то, что другой компонент апоптосомы - белок Ара!"-1 - присутствовал в цитозоле нейтрофилов. Более того, экспрессия АраР-1 в нейтрофилах была гораздо выше, чем в НЬ-60 клетках. Изучение активации каспазы-9 при помощи специфичных Ат показало, что в неапоптозных нейтрофилах находилась только неактивная (нерасщепленная) прокаспаза-9, которая почти не определялась в апоптозных клетках (рис. 4, каспаза-9, верхняя панель, дор. 1-4).

Последнее указывало на протеолитическую активацию каспазы-9. Полная активация каспазы-9 наблюдалась в нейтрофилах, апоптировавших после индукции внешнего пути клеточной гибели (ТНФ-а+ЦГМ), который в других клетках запускается расщеплением каспазы-8 (рис. 4, дор. 3). С другой стороны, и нейтрофилы суточных культур (81 ± 5% аннексии-V+ клеток; М ± т, п= 3), погибавшие без внешней стимуляции за счет внутренних механизмов апоптоза, тоже демонстрировали активацию как каспазы-9, так и каспазы-8 (рис. 4, дор. 4). Активация этих инициаторных каспаз выявлялась также в HL-60 клетках, обработанных этопозидом (рис. 4, дор. 8). Наконец, реализация обоих механизмов апоптоза завершалась активацией эффекторной каспазы-3 (рис. 4, дор. 3 и 4), которая обнаруживалась и в апоптозных HL-60 клетках (рис. 4, дор. 8) Следовательно, несмотря на минимальное содержание цитохрома с в нейтрофилах, они способны расщеплять и активировать каспазу-9. Важно подчеркнуть, что расщепление каспазы-9 сопровождалось увеличением ее ферментативной активности в апоптозных нейтрофилах, которая оценивалась с помощью гидролиза специфического флуорогенного субстрата каспазы-9 Ac-LEHD-AMC [Thornberry, 1997]: активность каспазы-9 в апоптозных клетках составила 93 ± 4 ОЕФ против 6 ± 4 ОЕФ в свежевыделенных клетках (М ± т, п=3-4).

В наших недавних публикациях описана "безмигохондриальная" модель апоптоза нейтрофилов, а именно клеточная гибель цитопластов [Маянский H.A., 2001]. В настоящей работе отсутствие митохондрий в цитопластах было подтверждено отсутствием в них экспрессии порина (при ИБ). Цитопласты нейтрофилов, лишенные органелл путем ультрацентрифугирования в прерывистом градиенте плотности, сохраняли способность к апоптозным изменениям, подобным таковым в интактных нейтрофилах. В частности, после суточного культивирования они экспрессировали ФС на своей поверхности (54 ± 7% аннексии-V+ цитопластов; М ± т, п=3) и активировали каспазу-8 и каспазу-3 (рис. 4, дор. 6), тогда как свежие цитопласты не связывали аннексин-V и не содержали расщепленных (активных) каспаз (рис. 4, дор. 5). Важно отметить, что в апоптозных цитопластах происходила активация каспазы-9 Более того, полное расщепление в них 47 кДа прокаспазы-9 совпадало с появлением ее активного фрагмента массой 37 кДа (рис. 4, каспаза-9, верхняя и нижняя панели, дор. 6), который не определялся в лизатах апоптозных нейтрофилов (рис. 4, каспаза-9, нижняя панель, дор. 3 и 4). Это могло быть связано с ускоренной апоптозной деградацией или неспецифическим протеолизом активной каспазы-9 при приготовлении образцов нейтрофилов, т. к цитопласты лишены гранул (и их агрессивных протеаз). Кроме того, в апоптозных HL-60 клетках, имеющих слабый протеолитический потенциал, активная каспаза-9 также выявлялась (рис. 4, каспаза-9, нижняя панель, дор. 8).

Нейтрофия ы Цитолл. HL-60

т

£ _ со т • т

8 » ^ s I 8 8

Каспаза-9

Проюсп. Акгивн.

Н ! н-

+ I g I I

X

р47 р37

Каспаза-8

р55«7 *»р#/41

Проикп mil

Каспаза-3

р32 р17

Рис. 4. Активация каспаз при апоптозе нейтрофилов, цитопластов нейтрофилов и HL-60 клеток. Цельноклеточные лизаты готовили из свежевыделенных нейтрофилов (дор 1), из нейтрофилов, инкубированных в течение 3 и 20 ч без добавлений (дор 2 и 4, соответственно) или 3 ч с ТНФ-а+ЦГМ (дор 3), из свежевыделенных цитопластов (дор. 5) или цитопластов после 20 ч инкубации (дор 6), а также из необработанных (дор 7) и обработанных этопозидом в течение 4-5 ч HL-60 клеток (дор. 8) Для SDS-PAGE использовали ~30 \хг общего белка, ИБ проводили с Ат, специфичными для указанных белков Экспрессию Вах использовали для контроля белковой загрузки Результаты представляют 3 независимых эксперимента

Интактность активации каспазы-9 в цитопластах стимулировала проведение более детального изучения их апоптосомного (внутреннего) пути апоптоза. Apaf-1 присутствовал в лизатах цитопластов. Вместе с тем, нам не удалось выявить цитохром с в цитопластах ни при помощи обычного ИБ, ни путем ИП, хотя цитохром с был преципитирован из HL-60 клеток и (в небольшом количестве) го нейтрофилов.

Цитохром с является одним из ключевых участников апоптозных событий. При индукции апоптоза он выходит из митохондрий в цитозоль, где включается в сборку апоптосомы, в составе которой активируется каспаза-9 [Adams, 2002]. Однако, представленные в настоящей работе результаты и данные других публикаций [Murphy, 2003] показывают, что экспрессия цитохрома с в нейтрофилах крайне низка. В наших экспериментах он обнаруживался только после концентрирования материала путем субклеточного фракционирования или ИП. Более того, при диметилсульфоксидзависимом нейтрофильном созревании HL-60 клеток мы наблюдали постепенное снижение содержания цитохрома с, которое совпадало с увеличением экспрессии системы НАДФ Н-оксидазы и формированием трубчатых митохондрии. Это не было связано с неспецифической потерей сигнала из-за повышения протеолитических потенций созревающих клеток, т.к. экспрессия других белков оставалась стабильной. Скорее всего, дефицит цитохрома с представляет собой «генуинный» признак зрелых нейтрофилов, который может объяснить ряд

особенностей их физиологии и предполагает возможность цитохром с-независимой активации каспазы-9.

Для того чтобы подтвердить важность внутреннего пути в апоптозе нейтрофилов, мы исследовали последовательность (иерархию) активации каспаз 3, 8 и 9 в нейтрофилах, обработанных комбинацией ТНФ-а+ЦГМ Как показано на рис 5 (А), увеличение числа апоптозных клеток в этих условиях начиналось между 75 и 90 мин инкубации и затем быстро нарастало. Процессинг каспазы-9 и каспазы-3 (те. появление активных фрагментов с мол. массой 35 и 19/17 кДа, соответственно) начинался примерно в то же время, т.е. на 90-105 мин после начала инкубации (рис. 5, В, дор. 4-5). Примечательно, что расщепление этих каспаз, зафиксированное с помощью ИБ, совпадало по времени с повышением ферментативной каспазной активности (рис. 5, Б). Вместе с тем, процессинг каспазы-8 задерживался до 120 мин эксперимента, когда впервые появился активный фрагмент р43/41 (рис. 5, В, дор. 6). Это свидетельствовало о том, что активация каспаз 9 и 3 предшествовала активации каспазы-8. В контрольных (необработанных) клетках, культивированных параллельно, процессинга и ферментативной активности каспаз, а также повышения уровня апоптоза в течение всей инкубации не наблюдалось (рис. 5).

Внутренний путь апоптоза нейтрофилов и механизмы антиапоптозного эффекта Г-КСФ

Регулирование продолжительности жизни нейтрофилов путем апоптоза устанавливает тонкий баланс между их эффективным функционированием в качестве одного из звеньев врожденного иммунитета и своевременным и безопасным удалением этих потенциально опасных клеток. Как и другие типы клеток, нейтрофилы содержат ряд анти- и проапоптозных эффекторов, в частности, белки семейства Вс1-2 и каспазы, которые функционально интегрированы на уровне митохондрий. Во время апоптоза они атакуются проапоптозным гомологом Вс1-2 белком Вах и выделяют в цитозоль цитохром с, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, -факторы, которые способствуют активации каспаз и дальнейшему развитию апоптозного процесса (см. выше). Эти события вместе с цитохром с-зависимой олигомеризацией Apaf-1 и формированием апоптосомы составляют внутренний (митохондриальный, стресс-индуцированный) механизм апоптоза [Adams, 2002].

В связи с тем, что нейтрофилы настроены на быстрый спонтанный апоптоз, не требующий какого-либо «позитивного сигнала смерти» [Edwards, 2003], внутренний путь апоптоза представляется важным регулятором продолжительности их жизни. В этом случае логично предположить, что антиапоптозные факторы, в частности, Г-КСФ, будут иметь точки приложения в рамках этого механизма клеточной гибели.

Q T"*« +цпя

M IS 9» IK 1211M Время (мин)

6« И И 105 121 ш Время (мин)

в

ТНФ-И.+ЦГМ Kompnm,

Время №«>4 9 SO /5 90 «И 120130 ЦП 75 90 105 120 1« 1»

Кисла»-* If piam

1 IM Sil I I II « « II (t

Рис. 5. Динамика апоптоза, ферментативной активности и процессинга каспаз при обработке нейтрофилов ТНФ-га+ЦГМ. Нейтрофилы инкубировали без добавлений (черные квадраты на А и Б; дор 9-14 на В) или в присутствии ТНФ-а и ЦГМ (белые квадраты на А и Б, дор 2-8 на В). В указанное время из культур забирали образцы и разделяли их на 3 порции для последующего анализа (А) Процентное содержание апоптозных клеток определяли путем микроскопирования цитоспинов, окрашенных по Май-Грюнвальду-Гимзе, и подсчета в них клеток с апоптозной морфологией (Б) Ферментативную активность каспаз определяли при гидролизе флуорогенного суб-страта каспаз Ac-DEVD-AMC Активность на 180 мин инкубации в присутствии ТНФ-а+ЦГМ (937 ± 240 ОЕФ, М + т) принимали за 100% (В) Цельнокпеточные лизаты подвергали SDS-PAGE и ИБ При ИБ использовали Ат, специфичные для указанных белков Экспрессия Вах служила для контроля белковой загрузки. Цифры на В (справа) указывают молекулярные массы соответствующих белков Результаты представляют 3 отдельных эксперимента

В наших предыдущих работах антиапоптозный эффект Г-КСФ был связан с угнетением митохондриально-зависимой активации каспазы-3 [Маянский H.A., 2001; Maianski, 2002]. В этих исследованиях с помощью конфокальной микроскопии мы показали, что Г-КСФ блокирует перемещение Вах к митохондриям. В настоящей работе данные микроскопии были подтверждены с помощью ИБ субклеточных фракций нейтрофилов. В свежевыделенных клетках Вах преобладал в цитозоле (рис. 6, дор. 1 и 5), а в апоптозных нейтрофилах после суточного культивирования он обнаруживался в митохондриальной фракции (рис. 6, дор. 2 и 6). Г-КСФ препятствовал перераспределению Вах, задерживая его в цитозоле (рис. 6, дор. 3 и 7).

Цитозоль Митохондрии

Оч 29 ч (ч 20ч

Г-КСФ - + + + +

цгм - - - + - +

В» аь тт*ш-

> ЩЯт'Щт " р22

Omi '///, '**»"• *' «««^«»»««"рЗ?

Sm«e ' ,, , jk РМ

ЦиНИ1С «И*

liwrirr Г ■ Jj^^^ji ¿¿¿¡¡¡¿и,

ящщр ^

№С0Д

12 3 4

Рис. 6. Анализ субклеточных фракций нейтрофилов, культивированных в различных условиях. Нейтрофилы разделяли путем дигитонинового субклеточного фракционирования на цитозольные (дор 1-4) и обогащенные митохондриями фракции (дор 5-8) Для проведения SDS-PAGE и ИБ использовали свежевыделенные клетки (0 ч, < 5% аннексин-V* клеток, дор 1 и 5) и клетки после 20 ч инкубации без добавлений (73 ± 2% аннексии-^ клеток, дор 2 и 6), только с Г-КСФ (100 нг/мл, 24 ± 1% аннексин-V* клеток, дор 3 и 7) или с комбинацией Г-КСФ + ЦГМ (5 цг/мл, 61 ± 3% аннексин-V* клеток, дор 4 и 8) Процентное содержание аннексинЛ/* представлено как М ± m (л=3)Каждая фракция представляет ~2 х 106 нейтрофилов Пробы с анти-XIAP и с анти-МпСОД Ат служили в качестве стандарта для цитозольной и митохондриальной фракции, соответственно Цифры справа указывают молекулярные массы соответствующих белков Результаты представляют 3 эксперимента

Для реализации проапоптозных потенций Вах важна не только его субклеточная локализация. В интактных клетках Вах находится в цитоплазме в неактивной форме, но после индукции апоптоза различными стимулами он изменяет конформациго (активируется), что облегчает его транслокациго к митохондриям и встраивание в их мембраны. Здесь Вах образует гомоолигомеры, которые формируют поры, позволяющие проапоптозным факторам митохондрий выходить в цитозоль [Antonsson, 2001; Wolter, 1997]. Активная конформация Вах может быть выявлена в нативных (неденатурированных) клеточных лизатах путем ИП с помощью МоАт клона 6А7, которые распознают эпитоп на N-концевой части Вах, экранированный в неактивной конформации, но открывающийся при активации Вах [Hsu, 1997] Мы использовали эту методику для выяснения роли активации Вах в процессе апоптоза нейтрофилов. В свежевыделенных нейтрофилах активный Вах отсутствовал, но появлялся в контрольных апоптозных клетках после 20 ч культивирования Добавление в культуру Г-КСФ выражено угнетало активацию Вах. Таким

образом, в нейтрофилах во время апоптоза Вах приобретает активную конформацию, а Г-КСФ препятствует этому.

Активация Вах и его релокализация к митохондриям могут быть опосредованы другим проапоптозным гомологом Вс1-2 — белком Bid [Li, 1998; Crompton, 2000]. Bid (мол. масса 22 кДа) активируется путем каспазозависимого протеолиза (расщепления, truncation) и превращается в tBid, фрагмент с мол. массой 15 кДа, который обладает большей проапоптозной активностью по сравнению с исходной формой этого белка [Li, 1998]. В интактных нейтрофилах содержался только нерасщепленный , (полный) Bid, причем исключительно в цитозоле (рис. 6, Bid, дор. 1 и 5)

Спонтанный апоптоз клеток сопровождался появлением в цитозольной фракции tBid, который отсутствовал в свежих нейтрофилах (рис. 6, tBid, дор. 1 и 2). Интактный Bid (как и Вах) также определялся в митохондриальных фракциях апоптозных, но не свежевыделенных клеток (рис. 6, Bid, дор. 5 и 6). Добавление в культуру Г-КСФ выражено блокировало расщепление Bid и появление tBid. Кроме того, Г-КСФ отменял митохондриальную релокализацию Bid, и он оставался в цитозоле (рис. 6, Bid и tBid, дор. 3 и 7).

Как указывалось выше, Bid-индуцированная активация Вах и транслокация Bid и Вах к митохондриям повышают проницаемость их внешней мембраны. Для того чтобы проверить, сопутствует ли апоптозным изменениям Bid и Вах выход проалоптозных факторов из митохондрий, мы исследовали локализацию белков Omi/HtrA2 и Smac/DIABLO в субклеточных фракциях нейгрофилов. В свежевыделенных нейтрофилах Omi/HtrA2 и Smac/DIABLO находились в митохондриях (рис. 6, дор. 5) и отсутствовали в цитозоле (рис. 6, дор. 1). Апоптоз, напротив, сопровождался переходом Omi/HtrA2 и Smac/DIABLO в цитозольную фракцию и уменьшением их сигнала в митохондриях (рис. 6, дор. 2 и 6). Г-КСФ препятствовал выходу обоих белков в цитозоль, сохраняя их митохондриальную локализацию (рис. 6, дор. 3 и 7). Роль цитохрома с в апоптозе нейтрофилов остается дискутабельной в связи с ' невысокой экспрессией (см. выше), хотя минимальное количество этого

белка выявлялось в цитозольной фракции апоптозных клеток при ИБ после передержки рентгеновской пленки (рис. 6, цигохром с, дор. 2) Таким I образом, при апоптозе нейтрофилов расщепление Bid и транслокация

Bid/Bax к митохондриям ведут к утечке апоптозных белков из митохондрий, а Г-КСФ блокирует эти реакции.

Главной целью апоптозной программы является активация каспазных протеаз, которые атакуют и разрушают важные внутриклеточные мишени, ведя клетку к гибели [Thornberry, 1998]. Описанные выше события (активация Вах, расщепление Bid, митохондриальная транслокация Bid/Bax и выход из митохондрий проалоптозных факторов) могут быть отнесены к промежуточному звену цепи реакций, служащей для индукции и/или усиления активации каспаз [Newmeyer, 2003]. Инициаторные каспаза-8 и каспаза-9 запускают,

соответственно, внешний и внутренний механизмы апоптоза, которые сходятся на уровне активации исполнительной каспазы-3. Как показал ИБ, в интактных нейтрофилах все эти каспазы присутствовали в виде неактивных проферментов (см. рис. 4, дор. 1). Апоптозные клетки обнаруживали расщепление (активацию) исследованных каспаз. Активация каспазы-9 оценивалась по снижению количества нерасщепленного профермента (р47). Появление продуктов расщепления каспазы-8 (р43/41 и р18) и каспазы-3 (р17) в лизатах апоптозных нейтрофилов сопровождалось снижением сигнала их проферментов. Процессинг исследованных каспаз в значительной степени подавлялся Г-КСФ. Важно отметить, что экспрессия Вах, использованная для контроля белковой загрузки, во всех экспериментальных условиях оставалась стабильной. Это согласовывалось с результатами ИП, хотя субклеточная локализация Вах в апоптозных клетках радикально менялась с цитозольной на митохондриальную (рис. 6, Вах, дор. 1, 2, 5, 6), и Вах приобретал активную конформацию. Экспрессия белков Omi/HtrA2 и Smac/DIABLO также не менялась. Эти наблюдения указывают на значимость качественной (посттранскрипционной) регуляции эффекторов апоптоза в нейтрофилах, что находит подтверждение в ряде экспериментов с ингибитором синтеза белка ЦГМ, описываемых ниже.

Передача антиапоптозных сигналов Г-КСФ происходит при участии de novo синтезируемых белков, которые пока точно не установлены [Edwards, 2003]. Для того чтобы проверить, требуется ли продукция новых белков для Г-КСФ-индуцированной отмены описанных выше апоптозных реакций, мы использовали подавление синтеза белка с помощью ЦГМ во время инкубации клеток с Г-КСФ. При добавлении ЦГМ в Г-КСФ-культуры в нейтрофилах наблюдались мигохондриальная транслокация Вах и выход Omi/HtrA2, Smac/DIABLO и цитохрома с из митохондрий в цитозоль (рис. 6, дор. 4 и 8), как это происходило и в "нормальных" апоптозных клетках (без Г-КСФ и ЦГМ, рис. 6, дор. 2 и 6). Обработка нейтрофилов ЦГМ в присутствии Г-КСФ частично отменяла Г-КСФ-индуцированную блокаду активации Вах. Более того, в присутствии ЦГМ возобновлялся процессинг каспаз, блокированный Г-КСФ, и наблюдалось повышение ферментативной активности каспаз, которая достигала 70-80% таковой, зарегистрированной в необработанных апоптозных клетках. Это сопровождалось увеличением апоптоза' ~25% аннексин-V клеток в Г-КСФ-культурах против ~60% аннексин-V нейтрофилов в Г-КСФ+ЦГМ-культурах. Несмотря на снижение выживаемости клеток, ЦГМ не отменял Г-КСФ-индуцированных изменений Bid. Так, вне зависимости от наличия ЦГМ, в присутствии Г-КСФ полная форма Bid находилась преимущественно в цитозоле, a tBid не определялся (рис. 6, Bid, tBid, дор. 3, 4, 7, 8). Очевидно, Г-КСФ предотвращал активацию Bid при помощи уже существующих молекул. Таким образом, представленные данные раскрывают детали внутреннего механизма апоптоза нейтрофилов и его модуляции при помощи Г-КСФ. Полученные результаты подчеркивают

интегративную роль митохондрий в регуляции этих процессов, а также свидетельствуют о том, что главным направлением антиапоптозных Г-КСФ-зависимых реакций является поддержание интактности митохондрий. Это достигается путем предотвращения активации и митохондриальной транслокации В ах при участии de novo синтезированных белков.

Каспазонезависимый путь клеточной гибели нейтрофилов, индуцированный ТНФ-а

ТНФ-а обеспечивает широкий спектр биологических сигналов, участвующих в регуляции иммунного гомеостаза, в том числе и через управление клеточной гибелью [Тгасеу, 1993]. По данным литературы, ТНФ-а играет ключевую роль в патогенезе таких воспалителньных заболеваний, как ревматоидный артрит, респираторный дистресс синдром и сепсис [Parsons, 1992; Windsor, 1993, Feldmann, 1996]. Будучи одним из важнейших провоспалительных цитокинов, ТНФ-а в ряде экспериментальных моделей обнаруживал антивоспалительный эффект [Liu, 1998; Marino, 1997], который может быть частично обусловлен индукцией апоптоза нейтрофилов. Этот вид клеточной гибели позволяет удалять потенциально опасные нешрофилы из очагов воспаления и способствует их ограничению, поскольку фагоцитоз апоптозных клеток резидентными макрофагами производит иммуносупрессивный эффект [Savill, 2000]. Апоптозное действие ТНФ-а связано с активацией каскада апоптозных протеаз, называемых каспазами [Hengartner, 2000]. Сигнал гибели передается с рецептора ТНФ-а внутрь клетки через ряд адаптерных белков, которые организуют комплекс с одной из инициаторных каспаз - каспазой-8, что ведет к активации последней. Активная каспаза-8 способствует включению эффекторных каспаз, завершающих апоптозную программу [Kischkel, 1995]. В связи с этим вполне логичными представляются данные, показывающие, что ингибирование каспаз значительно повышает выживаемость различных типов клеток, в том числе и нейтрофилов, за счет задержки апоптоза [Маянский H.A., 2001; Fadeel, 1998].

Исследуя влияние ТНФ-а на апоптоз нейтрофилов, мы столкнулись с неожиданным феноменом Было обнаружено, что несмотря на то, что каспазы играют центральную роль в апоптозе нейтрофилов, ингибирование каспаз в присутствии ТНФ-а не предотвращало гибель клеток, а, напротив, усиливало ее. Ниже описывается этот каспазонезависимый путь клеточной гибели нейтрофилов, отличающийся от классического апоптоза по ряду признаков, а также предлагаются его вероятные механизмы.

Культивируемые т vitro нейтрофилы подвергались спонтанному апоптозу, и уже через 6 ч инкубации около 30% клеток связывало аннексин-V и приобретало типичную апоптозную морфологию:

сморщивание клеток, округление ядер, выраженная конденсация хроматина (рис 7, А, Б, Контроль). При инкубации нейтрофилов на протяжении 6 ч в присутствии ТНФ-а количество аннексии-V* клеток увеличивалось до 40 ± 4% (рис. 7, А, ТНФ-а), в то время как морфологически апоптозными становились 74 ± 4% клеток (рис. 7, Б, ТНФ-а). Эти результаты согласуются с предыдущими сообщениями о способности ТНФ-а индуцировать апоптоз нейтрофилов в краткосрочных (6-8 ч) культурах [Murray, 1997; Yamashita, 1999]. Далее с помощью ИБ был исследован процесс активации инициаторной каспазы-8 и эффекторной каспазы-3. В свежевыделенных нейтрофилах обе каспазы присутствовали только в виде проферментов: прокаспазы-8 и прокаспазы-3. Нейтрофилы, апоптировавшие спонтанно в культуре без добавлений, демонстрировали начальную активацию каспазы-8, на которую указывало появление большого 43/41 кДа фрагмента. Каспаза-3 в этих условиях частично расщеплялась до 17 к Да фрагмента. Присутствие в инкубационной среде ТНФ-а приводило к более выраженной активации каспазы-8 и каспазы-3. Каспаза-8 полностью фрагментировалась с образованием активного продукта с молекулярной массой 18 кДа, а каспаза-3 целиком расщеплялась, превращаясь в активный фрагмент.

Следующим этапом работы стала проверка возможности задержки апоптоза нейтрофилов, индуцированного ТНФ-а, с помощью ингибитора каспаз широкого спектра zVAD-frnk. Пептидкетоны, подобные zVAD-fmk, блокируют активацию каспаз за счет имитации активного центра этих ферментов [Garcia-Calvo, 1998]. Наличие в инкубационной среде zVAD-fmk значительно снижало уровень апоптоза нейтрофилов (19 ± 2% аннексии-V+ клеток и 9 ± 3% клеток с апоптозной морфологией, рис. 7, А и Б, zVAD-frnk) по сравнению с культурами без добавлений. Кроме того, zVAD-fmk полностью ингибировал активацию каспазы-8 и каспазы-3, поскольку при ИБ не выявлялось продуктов их расщепления. Неожиданной находкой явилось следующее наблюдение. При инкубировании нейтрофилов в присутствии комбинации ТНФ-a+zVAD-fmk ингибитор каспаз не предотвращал гибель клеток, и после воздействия указанной комбинации 52 + 5% нейтрофилов становились аннексии-V+ (рис. 7, А, ТНФ-a+zVAD-fmk) При этом нейтрофилы обнаруживали необычную морфологию (рис. 7, Б, ТНФ-a+zVAD-frnk): некоторые клетки были увеличены в размерах, имели разреженный, дезинтегрированный хроматин и вакуолизацию (открытая стрелка), другие демонстрировали гиперлобуляцию ядра и умеренную конденсацию хроматина (закрытая стрелка). Следует обратить внимание, что описанная морфологическая картина совершенно не похожа на картину классического апоптоза, представленную на рис 7, Б, ТНФ-a. Число нейтрофилов с указанной аберрантной морфологией в культурах, обработанных ТНФ-a+zVAD-frnk, достигало 40-45%. Вместе с тем, типичная апоптозная морфология в этих же условиях была выявлена у 9 ± 4% нейтрофилов Последний показатель

Контроль ТНФ-а zVAD-fmk

% i < "" ""ж"'"'5* *''

Аннёксин-V —«-

ТНФ-а* zVAD-fmk

i <«1

Рис. 7. Клеточная гибель нейтрофилов. Нейтрофилы культивировали в течение 6 ч без добавлений (Контроль), в присутствии 20 нг/мл ТНФ-а, 150 цМ zVAD-fmk или их комбинации, после чего клеточную гибель оценивали при помощи (А) проточной флоуметрии клеток, меченных аннексиномЛЛФИТЦ и ПИ, и (Б) световой микроскопии цитоспинов, окрашенных по Май-Грюнвальду-Гимзе Количественные данные представлены на рис 8 Вершины стрелок указывают нейтрофилы, подвергнувшиеся спонтанному (Контроль) или ТНФ-а-индуцированному апоптозу и имеющие типичную апоптозную морфологию; закрытая и открытая стрелки отмечают нейтрофилы с аберрантной морфологией, появляющейся при воздействии ТНФ-a+zVAD-fmk (см детали в тексте) Результаты 6-8 независимых экспериментов

совпадает с уровнем морфологического апоптоза, обнаруженного после инкубации в присутствии только гУАП-йпк, что отражено на рис. 8, суммирующем количественные данные. Примечательно, что фракция аберрантных клеток была ничтожно мала среди нейтрофилов, культивированных без добавлений или с добавлением только ТНФ-а, и незначительна (<3%) при инкубации только с гУАБ-йпк.

П - ажвксин-V*

•потоямя морфология

«Неямннм морфология

ТНФ-а ша-tvk

Н-АЦ Ро|енан Ант-Fas Ai

Рис. 8. Количественные данные о клеточной гибели нейтрофилов после 6 ч инкубации в указанных условиях, полученные при проточной флоуметрии и анализе цитоспинов (см. рис. 7). Дозировки' ТНФ-а и гУАО-Лпк - как на рис 7; анти-Раэ МоАт - 500 нг/мл; М-ацетилцистеин (Ы-А1Д) - 5 мМ; ротенон - 100 цМ. * - Р < 0,05;

Р < 0,05 относительно соответствующего столбца в ТНФ-га+гХ/АО-Лпк Результаты (М ± т) 6-8 независимых экспериментов.

При исследовании состояния каспаз в нейтрофилах, инкубированных с ТНФ-a+zVAD-fmk, оказалось, что необычная гибель клеток, вызванная этой комбинацией, происходила без активации каспазы-8 и каспазы-3. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что ТНФ-a способен вызывать два различных типа клеточной гибели нейтрофилов-каспазозависимый (классический апоптоз) и каспазонезависимый.

Следующая серия экспериментов позволила более детально охарактеризовать каспазонезависимую гибель нейтрофилов При исследовании интернуклеосомной деградации ДНК, которая является характерным признаком апоптоза, было обнаружено, что ДНК нейтрофилов, инкубированных в присутствии только ТНФ-a, давала типичную картину апоптозной лестницы при электрофорезе. В то же время, ДНК, выделенная из нейтрофилов, обработанных ТНФ-a+zVAD-fmk, не выявляла признаков апоптозной фрагментации и электрофоретически практически не отличалась от ДНК свежевыделенных нейтрофилов, а также нейтрофилов, культивированных без добавлений или с zVAD-frnk. Следовательно, гибель нейтрофилов, индуцированная комбинацией ТНФ-a+zVAD-fmk, отличалась от классического апоптоза и по этому признаку.

Рецептор ТНФ-a имеет общие с сигнальные каскады клеточной гибели с системой Fas/Apo-l/CD95 рецептора. Они принадлежат к семейству рецепторов ТНФ/ростового фактора нервов [Nagata, 1995] и используют общий адаптерный белок (ассоциированный с Fas-рецептором домен смерти, Fas-associated death domain, FADD) при формировании

сигнального комплекса для включения каспазного каскада [Kischkel, 1995]. Как показано на рис. 8, связывание Fas-рецептора энти-Fas МоАт-агонистами клона СН11 приводило к развитию выраженного апоптоза нейтрофилов, и после 6 ч инкубации 60 ± 5% клеток были аннексии-V+, а 83 ± 5% нейтрофилов становились морфологически апоптозными. Тем не менее, индукция апоптоза через Fas рецептор почти полностью блокировалась zVAD-fmk (рис. 8; 22 ± 4% аннексин-У+ и 18 í 3% морфологически апоптозных нейтрофилов в культуре Fas+zVAD-fmk). Эти данные позволили заключить, что, несмотря на наличие у Fas и ТНФ-а рецепторов общих начальных сигнальных путей клеточной гибели, запускаемые Fas рецептором процессы являются строго каспазозависимыми и могут быть остановлены ингибитором каспаз, тогда как ТНФ-а, очевидно, имеет возможность обходить каспазный каскад, вызывая нетипичную гибель нейтрофилов в присутствии zVAD-fmk.

Далее мы проверили, участвуют ли митохондрии в каспазонезависимой гибели нейтрофилов. В свежевыделенных нейтрофилах, а также в большинстве клеток, инкубированных в течение 6 ч без добавлений или в присутствии zVAD-fmk, окрашенные специфическим флуоресцентным красителем митохондрии имели трубчатую структуру (см. рис. 1, В). В нейтрофилах, обработанных ТНФ-а, митохондрии изменяли форму, образуя крупные конгломераты, типичные для апоптоза (см. рис. 1, Ж). Культивирование нейтрофилов с комбинацией ТНФ-a+zVAD-fink также изменяло морфологию митохондрий, приводя к агрегации и деградации этих органелл.

Затем был исследован апоптозный белок Вах, который участвует в регуляции митохондриального пути апоптоза нейтрофилов. После 6 ч инкубации Вах имел точечную локализацию и флуоресцировал отдельно от митохондрий в 78 ± 5% нейтрофилов из культур без добавлений и в 86 ± 4% клетках, обработанных zVAD-fmk. Описанная картина характерна и для свежевыделенных нейтрофилов (см. рис. 1, Г). Инкубация с ТНФ-а вызывала характерные апоптозные изменения Вах (в 63 ± 9% нейтрофилов), а именно его перераспределение в крупные конгломераты флуоресценции, которые колокализовались с митохондриями (см. рис. 1, 3). В 88 ± 6% нейтрофилов, культивированных в присутствии ТНФ-a+zVAD-fmk, Вах сохранял точечное распределение и практически не был локализован с митохондриальным окрашиванием.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в обычных условиях ТНФ-a действует через классический каспазозависимый механизм апоптоза, включающий в себя субклеточное перераспределение Вах и его слияние с митохондриями. В то же время, стимуляция ТНФ-a в ситуации, когда каспазы неактивны, вскрывает способность этого цитокина вызывать каспазонезависимую клеточную гибель нейтрофилов, отличающуюся от апоптоза и протекающую без изменений Вах, но с участием митохондрий.

Для того чтобы прояснить роль митохондрий в феномене клеточной гибели нейтрофилов, индуцированной комбинацией ТНФ-a+zVAD-fmk, были использованы цитопласты нейтрофилов, которые представляют собой цитоплазматические пузырьки, лишенные ядра, гранул и органелл, в том числе и митохондрий [Маянский H.A., 2001; Roos, 1983 Maianski, 2002]. Как показало окрашивание с помощью аннексина-V, цитопласты (подобно интактным нейтрофилам) экспрессировали остатки ФС на внешней стороне клеточной мембраны после культивирования без добавлений или в присутствии ТНФ-а (рис. 9). zVAD-frnk значительно снижал пропорцию аннексии-V+ цитопластов (рис. 9). Схожие показатели были получены в экспериментах с нейтрофилами (см. рис. 8). Однако, в противоположность нейтрофилам, цитопласты, обработанные ТНФ-a+zVAD-fmk, не погибали, и только 11 ± 3% из них становились аннексин-V+ (рис. 9). Иными словами, добавление ТНФ-a к zVAD-fmk не имело влияния на выживаемость цитопластов, и ингибитор каспаз сохранял способность блокировать их гибель. Это говорит о том, что в отсутствие митохондрий ТНФ-a не мог вызывать каспазонезависимую гибель цитопластов.

Коираль

\ ---'--------' ;------

'(• v wf «г

¿VAD-Ünfc

Аннексии-V

Рис. 9. Клеточная гибель цитопластов. Цитопласты культивировали в течение 20 ч в указанных условиях (дозировки ТНФ-а и г\/АО-^пк - как на рис 7) Затем клетки метили аннексином-\/-ФИТЦ и анализировали на РАСЭсап Цитопласты, окрасившиеся аннексином-У, считали погибшими (нижний правый квадрант на диаграммах) * - Р < 0,05 относительно Контроля и ТНФ-а Результаты (М ± гл) 5 независимых экспериментов.

Приведенные результаты вновь указывают на вовлеченность митохондрий в процесс необычной гибели нейтрофилов после стимуляции ТНФ-a+zVAD-fmk Каков вклад этих органелл в данный феномен? Известно, что в ответ на стимуляцию клетки ТНФ-a митохондрии могут продуцировать АФК, которые опосредуют, по крайней мере частично, его цитотоксические эффекты [Goossens, 1999]. Действительно, утилизатор АФК N-ацетилцистеин почти полностью отменял гибельное действие ТНФ-a+zVAD-fmk. Этот агент значительно снижал число аннексии-V* нейтрофилов и предотвращал появление клеток с аберрантной морфологией (рис. 8). Митохондриальное происхождение АФК было подтверждено с помощью ротенона - ингибитора цепи транспорта электронов (дыхательной цепи) митохондрий, т.е. специфического блокатора продукции АФК в митохондриях [Schulze-Osthoff, 1992]. Ротенон имел схожий с N-ацетилцистеином эффект, предотвращая изменения клеточной мембраны и морфологическую перестройку нейтрофилов ответ на воздействие комбинации ТНФ-a+zVAD-fmk (рис. 8).

Наиболее мощным источником АФК в нейтрофилах является система НАДФ-Н оксидазы, которая обеспечивает быстрое и массивное увеличение продукции АФК, известное как респираторный взрыв [Маянский А.Н., 1989]. С целью выяснения возможной роли НАДФ-Н-зависимых АФК в ТНФ-а+гУАО-йпк-индуцированной гибели клеток мы исследовали нейтрофилы 3 больных ХГБ. Нейтрофилы этих больных из-за генетического дефекта в НАДФ-Н оксидазе не продуцируют АФК [Roos, 1999]. По уровню клеточной гибели нейтрофилы больных ХГБ в наших экспериментах практически не отличались от нейтрофилов здоровых доноров, исследованных в тот же день. Кроме того, как показало окрашивание аннексином-V, zVAD-fmk задерживал апоптоз ХГБ-нейтрофилов (как и контрольных клеток), а комбинация ТНФ-a+zVAD-fmk вызывала появление в них экспрессии ФС и аберрантной морфологии. Таким образом, система НАДФ-Н оксидазы не играет роли в ТНФ-a+zVAD-fink-индуцированной клеточной гибели нейтрофилов.

При дальнейшем изучении каспазонезависимой гибели нейтрофилов была выявлена ее зависимость от протеазной активности Omi/HtrA2. Роль митохондриальной сериновой протеазы Omi/HtrA2 в гибели клеток обнаружена недавно, когда выяснилось, что этот белок, в норме находящийся в межмебранном пространстве митохондрий, при апоптозе выходит в цитозоль (наряду с другими митохондриальными проапоптозными факторами) [Hegde, 2002]. Здесь Omi/HtrA2 связывается с белками-ингибиторами апоптоза (inhibitor of apoptosis proteins - IAPs) и инактивирует их, высвобождая секвестрированные IAPs каспазы, которые активируются и поддерживают дальнейшее развитие апоптоза (аналогично работает другой IAP-регуляторный белок, выделяемый митохондриями, -Smac/DIABLO) [Salvesen, 2002]. Предполагается, что эта функция не

требует протеазной активности (хотя имеются данные о том, что IAPs могут быть прямыми субстратами Omi/HtrA2; см. ниже). Активность Omi/HtrA2 как сериновой протеазы может быть востребована при каспазопезависимой гибели клеток, хотя субстраты-мишени в этом случае остаются неизвестными [Hegde, 2002].

В настоящей работе нам удалось предотвратить каспазонезависимую клеточную гибель нейтрофилов, вызванную комбинацией ТНФ-a+zVAD-fmk, внесением в инкубационную среду ucf-101 - специфического ингибитора сериновой протеазной активности Omi/HtrA2 [Cilenti, 2003], который значительно снижал количество аннексии-V+ нейтрофилов в этих условиях (рис 10). Количество аннексии-V" клеток коррелировало с числом клеток, имевших изменения в митохондриях, которые оценивались при помощи специфического флуоресцентного красителя митохондрий MitoTracker GreenFM. Практически все свежевыделенные нейтрофилы имели трубчатые митохондрии, которые трансформировались в апоптировавших клетках в округлые агрегаты, причем число клеток с митохондриальными кластерами примерно совпадало с числом апоптозных нейтрофилов. Агрегированные митохондрии имели 19 ± 2% клеток из культур без добавлений, 51 ± 10% клеток, обработанных ТНФ-ctJ-zVAD-fmk, и 20 ± 6% клеток, инкубированных с ТНФ-a+zVAD-fmk+ucf-101 (М + т; «=3-4) Очевидно, что ucf-101 препятствовал деградации митохондрий, индуцированной комбинацией ТНФ-a+zVAD-ftnk. Таким образом, Omi/HtrA2 наряду с ролью в апоптозе ряда клеточных линий [Hegde, 2002] имеет значение и в клеточной гибели первичных клеток (нейтрофилов) Вместе с тем, ucf-101 (в концентрации от 20 до 100 fiM) не задерживал ни спонтанный апоптоз нейтрофилов в 20 ч культурах (рис 10, Г и Д), ни апоптоз, вызванный воздействием ТНФ-а. Следовательно, активность Omi/HtrA2 как сериновой протеазы (ТНФ-a+zVAD-fmk-индуцированная клеточная гибель) не играет важной роли в процессе классического каспазозависимого апоптоза.

Рис. 10. Клеточная гибель нейтрофилов по данным окрашивания аннексином-V

и ПИ. Нейтрофилы инкубировали в течение 6 (А-В) или 20 (Г, Д) часов без добавлений (А, Г), с комбинацией 50 нг/мл ТНФ-а и 150 цМ zVAD-fmk (Б) или с ТНФ-а+zVAD-fmk в присутствии 20 цМ ucf-101 (В) или только с ucf-101 (Д). Затем клетки окрашивали аннексиномЛЛФИТЦ и ПИ и анализировали на FACScan Цифры указывают процент аннексии-V* клеток (нижний+верхний правые квадранты) в обозначенных культурах по результатам 4-6 независимых экспериментов (М ± т)

С целью дальнейшего изучения роли 01ш/№гА2 в клеточной гибели нейтрофилов было исследовано перераспределение этого белка в субклеточных фракциях нейтрофилов, культивированных в различных условиях. Обычно Огш/Н1гА2 локализуется в митохондриях, перемещаясь при апоптозе в цитозоль Это оказалось справедливым и для нейтрофилов, поскольку в свежевыделенных клетках Огт/ШгА2 присутствовал в митохондриях (рис. 11, дор. 6). При индукции апоптоза, например, путем инкубации нейтрофилов в течение 3 ч с комбинацией ТНФ-а+ЦГМ, когда 70-80% клеток становились аннексии-^, Опи/Нй-А2 выделялся в цитоплазму (рис. 11, дор. 2) с реципрокным снижением сигнала в митохондриальной фракции (рис. 11, дор. 7). Выход От1/ШгА2 в цитозоль наблюдался также и в нейтрофилах, адаптировавших спонтанно в суточных культурах (см. рис. 6). Несмотря на выраженную гибель клеток после 6 ч инкубации с ТНФ-а+гУАО-йпк (см. рис. 10, Б), Опи/ШгА2 оставался в митохондриях (рис. 11, дор. 4 и 9). В присутствии ингибитора ис£101, отменявшего ТНФ-а+гУАО-йпк-зависимую клеточную гибель, Огш/Н1гА2 также не покидал митохондрии (рис. 11, дор. 5 и 10). Чистота субклеточных фракций нейтрофилов была подтверждена при помощи определения экспрессии цитоплазматического белка АраМ (рис. 11, дор. 1-5) и митохондриального белка МпСОД (рис. 11, дор. 6-10). Отсутствие субклеточного перераспределения Отш/№гА2 при ТНФ-а+гУАО-йпк-индуцированной гибели нейтрофилов вместе с выявленной способностью ис£-101 (специфического ингибитора Огт/№гА2) полностью блокировать этот механизм клеточной гибели позволяют заключить, что при определенных условиях Опи/ШгА2 может поддерживать клеточную гибель через свою протеазную активность, находясь внутри митохондрий.

Цитозоль Митохондрии

12 3 4 S $ 7 S 9 10

Рис. 11. Субклеточное фракционирование нейтрофилов, инкубированных в различных условиях. Нейтрофильг свежевыделенные (дор 1 и 6), после 3 ч инкубации с ТНФ-а (50 нг/мл) и ЦГМ (2 цг/мл) (индукция апоптоза, Т/Ц, дор 2 и 7), после 6 ч инкубации без добавлений (-, дор 3 и 8), с добавлением ТНФ-a+zVAD-fmk (T/Z, дор 4 и 9) или ТНФ-a+zVAD-fmk и ucf-101 (T/Z+ucf, дор. 5 и 10), -фракционировали при помощи дигитонина После этого цитозольные (дор 1-5) и митохондриальные (дор 6-10) фракции подвергали SDS-PAGE Для ИБ применяли Ат, специфичные указанным белкам. Каждая фракция нейтрофилов представляет ~2 * 106 клеток. Ат к МпСОД и АраМ использовали для контроля чистоты митохондриальных и цитозольных фракций, соответственно Репрезентативные результаты одного из 3 независимых экспериментов.

Таким образом, нами исследована особая форма гибели нейтрофилов, не описанная ранее, которая индуцируется ТНФ-а в условиях, когда имеется блок активации каспаз Стимуляция нейтрофилов только ТНФ-а запускает механизм классического апоптоза, который сопровождается включением инициатор ных и эффекторных каспаз, слиянием Вах и митохондрий, агрегацией митохондрий, ингернуклеосомной фрагментацией ДНК и типичными апоптозными изменениями цитоплазматической мембраны и морфологии клеток. При ингибировании активации каспаз нейтрофилы, обработанные ТНФ-а, не обнаруживают перераспределения Вах и фрагментации ДНК. Несмотря на это, клетки погибают, экспрессируя ФС на внешней стороне клеточной мембраны и приобретая аберрантную морфологию (гиперсегментированное ядро и разреженный, дезинтегрированный хроматин) Очевидно, что в условиях блока активации каспаз ТНФ-а индуцирует альтернативный неклассический, каспазонезависимый путь клеточной гибели нейтрофилов, который опосредуется АФК митохондриального происхождения.

Избыток АФК может вызывать как прямое окислительное повреждение нуклеиновых кислот, белков и липидов, так и снижать устойчивость белков к протеолизу. Вероятно, подобные события происходят при гибели нейтрофилов, вызванной ТНФ-a+zVAD-fmk, обусловливая появление наблюдавшихся клеточных изменений, которые предотвращали ингибиторы АФК. Важно отметить, что митохондрии являются не только источником, но и мишенью АФК, и митохондриальные АФК способны повреждать сами митохондрии, вызывая апоптоз или некроз [Richter, 1995]. Это может объяснить обнаруженные нами Вах-независимые изменения митохондрий нейтрофилов после воздействия ТНФ-a+zVAD-fmk. Несомненно, что продукция АФК находится под строгим контролем, и наши данные свидетельствуют о том, что каспазы могут участвовать в этой регуляции [Vercammen, 1998]. Предполагается, что митохондриальные белки, вовлеченные в транспорт электронов и синтезирующие избыточные АФК, могут служить непосредственными субстратами каспаз, поскольку описаны митохондриальные каспазы с пока неизвестными внутримитохондриальными функциями [Costantini, 2002]. В обычных условиях каспазы инактивируют эту систему, предотвращая накопление АФК По другому сценарию каспазы могут играть роль в элиминации поврежденных белков и липидов, которые аккумулируются в клетке после стимуляции ТНФ-а и могут служить естественным каналом для стока (natural sink) излишков АФК [Vercammen, 1998].

Кроме того, для реализации каспазонезависимой гибели нейтрофилов требуется внутримитохондриальная протеазная активность Omi/HtrA2. Ее вероятные мишени пока неизвестны. Omi/HtrA2-опосредованный протеолиз может инактивировать антиапоптозные молекулы, как это было продемонстрировано на примере IAPs [Srinivasula,

2003], или же активировать какой-либо белок, чья функция требуется для каспазонезависимой клеточной гибели нейтрофилов. Как сказано выше, данный тип клеточной гибели развивается при участии АФК митохондриального происхождения, поэтому логично предположить, что в этих условиях может разрушаться митохондриальная антиоксидантная система, которая обычно деактивирует избыток таких молекул Возможно, Omi/HtrA2 вовлечен в выключение подобной системы, например, ингибируя МпСОД - антиоксидантный фермент митохондрий с высокой экспрессией в нейтрофилах (рис. 11, дор. 6-10), который особенно важен для предотвращения ТНФ-а-индуцированного оксидантного повреждения клеток [Wong, 1989].

Апоптозные нейтрофилы в циркуляции у больных гликогенозом типа lb (GSDlb)

Причиной гликогеноза типа 1 (glycogen storage disease type 1 - GSD1 ; MIM 23.200) являются врожденные дефекты в комплексе глюкозо-6-фосфатазы. Этот комплекс играет ключевую роль как в гликогенолизе, так и в глюконеогенезе, превращая глюкозо-6-фосфат в глюкозу. К клиническим симптомам заболевания относятся гепатомегалия, задержка роста, остеопения и увеличение почек в сочетании с гипогликемией, гиперлактатемией, гиперлипидемией и гиперурикемией. GSD1 связан с дефицитом активности системы глюкозо-6-фосфатазы, которая состоит из 2 мембранных белков - белка-транспортера глюкозо-6-фосфата и собственно глюкозо-6-фосфатазы. Транспортер перемещает глюкозо-6-фосфат из цитоплазмы в эндоплазматический ретикулум; глюкозо-6-фосфатаза катализирует гидролиз глюкозо-6-фосфата, в результате чего образуются глюкоза и фосфатная группа. Таким образом, синергизм работы белка-транспортера и глюкозо-6-фосфатазы обеспечивает поддержание гомеостаза обмена глюкозы Дефицит глюкозо-6-фосфатазы и белка-транспортера глюкозо-6-фосфата лежит в основе, соответственно, GSDla и GSDlb [Lei, 1993, Veiga-da-Cunha, 1999, 2000; van Schaftingen, 2002].

Для GSDlb характерны нейтропения и/или дисфункция нейтрофилов [Visser, 2000; Calderwood, 2001], которые крайне редки при GSDla [Weston, 2000]. В связи с этим больные GSDlb склонны к рецидивирующим бактериальным инфекциям, афтозному стоматиту или неспецифическим воспалительным заболеваниям толстого кишечника. Механизм нейтропении и сопутствующей нейтрофильной дисфункции, включающей расстройства хемотаксиса, фагоцитоза и респираторного взрыва [Kilpatrick, 1990; Visser, 2000; Calderwood, 2001], остается невыясненным, хотя сообщалось, что лечение Г-КСФ значительно снижает число инфекционных эпизодов у больных GSDlb [Calderwood, 2001, Visser G, 2002]. В связи с тем, что апоптоз нормальных нейтрофилов сопровождается прогрессивной потерей способности к адгезии,

хемотаксису и респираторному взрыву (см. выше) [Dransfield, 1995; Jones, 1995], было исследовано предположение о том, что дисфункция нейтрофилов при GSDIb может быть связана с усилением их апоптоза.

Для этого мы оценили ряд апоптозных маркеров у GSDlb-нейтрофилов. Оказалось, что значительная фракция свежевыделенных GSDlb-нейтрофилов связывает аннексии-V (у разных больных - от 58 до 84%, рис. 12). Моноциты и лимфоциты больных не окрашивались аннексином-У.

Контроль

Больной GSDIb

,, - -1 л ' У

1 а(1 иЙЙЙк * «OK1 ^s; «2%

Аннексин-V

Рис. 12. Нейтрофилы больных 0301Ь связывают аннексинЛ/.

Свежевыделенные нейтрофилы больного СБ01Ь и здорового донора соответствующего возраста окрашивали аннексином-\ЛФИТЦ и ПИ и анализировали с помощью РАСЭсап Показаны репрезентативные диаграммы для 5 больных и 10 здоровых доноров Цифры указывают фракцию аннексинЛ/* клеток

Связывание аннексина-V указывает на то, что циркулирующие нейтрофилы больных GSDIb экспрессируют ФС, что является ранним признаком апоптоза. В подтверждение этому в GSDlb-нейтрофилах выявлялась специфическая протеолигическая каспазная активность, ингибируемая болкатором каспаз широкого спектра zVAD-fmk. Она составила 6+2 ОЕФ/мин (M ± m, п=3) в свежевыделенных GSDlb-нейтрофилах, toi да как в контрольных клетках эта активность не определялась. Кроме того, нейтрофилы больных обнаруживали агрегацию митохондрий и перераспределение белка Вах, которые относятся к типичным признакам апоптоза, наблюдающимся в нейтрофилах здоровых доноров (см выше) [Маянский H.A., 2001].

Как говорилось выше, при GSDIb в нейтрофилах снижается транспорт глюкозы в эндоплазматический ретикулум, что вызывает локальное снижение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Этот фермент, который необходим для синтеза НАДФ, регулирует редокс-статус (redox state) клетки путем катализа регенерации восстановленного глютатиона, в результате чего снижается чувствительность к апоптозным стимулам [van Schaftingen, 2002, Watson, 2002] Новые данные [Leuzzi, 2003] подтверждают эти рассуждения. Они показали, что специфический ингибитор белка-транспортера глюкозо-6-фосфата соединение S3484

повышает апоптоз нейтрофилов, а преинкубация клеток с утилизатором АФК Trolox С или ингибитором флавопротеина дифенилениодониумом (DPI) отменяют данный эффект [Leuzzi, 2003]. Остается неизвестным, влияют ли подобные изменения внутриклеточного редокс-статуса на локализацию или активность Bcl-2-белков или каспаз. Однако, существование такого влияния могло бы объяснить причину отсутствия апоптозного фенотипа у нейтрофилов больных с другой разновидностью гликогеноза - GSDla- в GSDla-нейтрофилах не нарушен импорт глюкозо-6-фосфата в эндогшазматический ретикулум, и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа работает в «обычном» режиме.

Световая микроскопия цитоспинов GSDlb-нейтрофилов показала апоптозные изменения морфологии клеток с частотой примерно 1:25. Число аннексии-V* нейтрофилов (ранний признак апопгоза) превышало фракцию клеток с агрегированными митохондриями, транслоцированным Вах и апоптозной морфологией, которые относятся к более поздним апоптозным признакам. В цитоспинах лейкоцитов удавалось также обнаружить моноциты, поглотившие апоптозный материал

Нейтропения может быть результатом снижения продукции нейтрофилов костным мозгом и/или укорочения полу жизни нейтрофилов в кровеносном русле и их быстрого удаления из циркуляции. По поводу содержания клеток миелоидного ряда в костном мозге при GSDlb имеются сообщения как о его снижении, так и об увеличении [Ambruso, 1985; Calderwood, 2001].

Вероятно, что ускоренная элиминация незрелых GSDlb-нейтрофилов макрофагами происходит непосредственно в костном мозге перед их выходом через ФС-рецептор при участии CD 14, депозитов маннозсвязывающего лектина и/игш фрагментов комплемента [Savill, 1989, 2000; Ogden, 2001]. Быстрая утилизация нейтрофилов в костном мозге может служить объяснением несоответствия между клеточностью костного мозга и нейтропенией, не зависящего от лечения Г-КСФ. Неудаленные состарившиеся нейтрофилы могут появляться в циркуляции (рис. 12). Остается неизвестным, делает ли вклад в патогенез нейтропении при GSDlb ускоренный клиренс нейтрофилов через систему мононуклеарных макрофагов Мы не находили в мазках крови больных клетки красного ряда (клетки-мишени или тельца Жоли), которые служат индикаторами дисфункции макрофагов. Более того, спленомегалия относится к редким симптомам GSDlb и может развиться при внезапной перегрузке селезенки утилизацией апоптозных клеток при инфекциях и/или усиленной работе костного мозга. При лечении Г-КСФ размеры селезенки также могут увеличиваться за счет формирования в ней очагов экстрамедулярного кроветворения, осложняясь в некоторых случаях гиперспленизмом, требующим снижения дозы препарата или спленэктомии [Visser, 2002].

Таким образом, нейтрофилы при GSDlb демонстрируют необычную тенденцию к гибели в циркуляции, которая проявляется в экспрессии ФС,

каспазной активности, перинуклеарной агрегации митохондрий и транслокации белка Вах Более того, в цитоспинах лейкоцитов больных мы наблюдали (хотя и нечасто) моноциты, поглотившие апоптозный материал Это свидетельствует о том, что при GSDlb апоптозные тельца распознаются и активно фагоцитируются Следует отметить, что мы никогда не обнаруживали циркулирующие апоптозные нейтрофилы у детей с инфекционными состояниями (пневмония, септицемия) или при других синдромах, сопровождающихся нейтропенией (аутоиммунная нейтропения, циклическая нейтропения, синдром Shwachman-Diamond).

Нейтрофилы при синдроме Барта связывают аннексин-V в отсутствие апоптоза

Синдром Барта (СБ; Barth syndrome; MIM 302060) - это заболевание, сцепленное с Х-хромосомой и наследуемое рецессивно. Симптомокомплекс представлен триадой: дилатационная кардиомиопатия, гипотония скелетной мускулатуры и нейтропения. Больные часто погибают в младенчестве вследствие септицемии, сердечной недостаточности или их сочетания [Barth, 1999]. В первом описании этого заболевания Barth et al. в 1983 г. сообщалось об аномальной ультраструктуре митохондрий в кардиомиоцитах, миелоидных клетках-предшественниках и, в меньшей степени (до 10%), в клетках скелетных мышц. Помимо этого наблюдения адекватного объяснения изолированной нейгропении при СБ по-прежнему нет.

Мутации, вызывающие СБ, локализуются в генах дистальной части Xq28 [Bolhuis, 1991]. Было обнаружено, что один из генов этого региона, названный TAZ, имеет высокую экспрессию в сердечной и скелетной мускулатуре, и СБ развивается при мутациях именно в этом гене [Bione, 1996]. Путем альтернативного сплайсинга первичного транскрипта TAZ могут синтезироваться разные варианты мРНК, которые кодируют белки, структурно варьирующие в N-концевой и центральной частях. СБ-мутации прерывают трансляцию особых белков, названных «тафадзинами» ("tafazzins"). Четкая ассоциация между генотипом и фенотипом заболевания не прослеживается [Johnston, 1997; Cantlay, 1999].

Гомология последовательностей генов TAZ и суперкласса ацилтрансфераз (гипотеза Neuwald [Neuwald, 1997]) предполагает нарушение синтеза какого-то глицеролфосфолипида при СБ. Действительно, изучение культивированных in vitro фибробластов больных СБ выявило первичный дефект в кардиолипине и ремоделировании фосфатидилглицерола [Vreken, 2000]. Кардиолипин локализован во внутренней митохондриальной мембране и необходим для оптимального функционирования дыхательных ферментов и ферментов, синтезирующих АТФ Недавние исследования подтвердили отсутствие тетралинолоилкардиолипина в различных типах клеток больных СБ [Schalme, 2002; Valianpour, 2002].

Как указывалось выше, больные СБ могут погибать в раннем возрасте от инфекций и сердечной декомпенсации В связи с этим важным представлялось исследование функций нейтрофилов при СБ Оказалось, что свежевыделенные СБ-нейтрофилы функционируют нормально. Активность НАДФ-Н-оксидазы (респираторный взрыв) СБ-нейтрофилов, стимулированных с помощью различных стимулов' ОЗ (поглощение через рецептор комплемента 3 типа), ФМА (активация протеинкиназы С), ФАТ-праймированный ответ на fMLP (активация через поверхностные рецепторы), - не отличалась от контрольных показателей Хемотаксис нейтрофилов больных СБ, исследованный с помощью нейтрофил-специфичных стимулов (С5а, ИЛ-8, ФАТ), также был в норме. Кроме того, СБ-нейтрофилы демонстрировали нормальный киллинг Escherichia coll.

Несмотря на нормальные функциональные способности нейтрофилов больных СБ, во всех экспериментах значительная часть свежевыделенных клеток связывала аннексии-V (у разных больных - от 55 до 79% нейтрофилов), тогда как клетки здоровых, соответствующих по возрасту доноров не обнаруживали этого феномена (рис. 13). Лимфоциты и моноциты этих же больных СБ аннексии-V не связывали Эритроциты и тромбоциты также были аннексии-V"; спонтанная агрегация тромбоцитов не наблюдалась.

Контроль СБ

х 2 с

*||>й к1 1й- м « & Т и

Аннексин-У ---►

Рис. 13. Свежеизолированные гранулоциты больных СБ связывают аннексин-\/.

Свежеизолированные гранулоциты 7 больных СБ и подходящих по возрасту здоровых доноров окрашивали аннексином-\/-ФИТЦ/ПИ и анализировали с помощью проточной цитометрии Репрезентативная диаграмма здорового донора и больного СБ, цифры указывают процент аннексин-\Л клеток в общей клеточной популяции

Детальное изучение СБ-нейтрофилов в последующих экспериментах не выявило признаков апоптозного фенотипа у этих клеток. Иными словами, связывание аннексина-У СБ-нейтрофилами не служило признаком их апоптоза. Во-первых, микроскопия цитоспинов свежеизолированных нейтрофилов показала нормальную морфологию клеток (>98%) и отсутствие апоптозных изменений, которые обнаруживались только после культивирования, как и в обычных нейтрофилах Во-вторых, в свежих СБ-нейтрофилах отсутствовала агрегация митохондрий - другой маркер апоптоза' при специфическом флуоресцентном окрашивании большинство клеток демонстрировало

нормальную трубчатую структуру митохондрий, типичную для живых нейтрофилов Кластеры митохондрий появлялись только при спонтанном апоптозе в 20 ч культурах. Нейтрофилы одного больного СБ были исследованы четырежды с интервалом в 1 месяц. Во всех полученных образцах аннексин-У+ нейтрофилы имели нормальную морфологию и обычную структуру митохондрий. В-третьих, в СБ-нейтрофилах не были активными каспазы, о чем свидетельствовало отсутствие расщепления специфического флуорогенного субстрата каспаз Кроме того, окрашивание белка Вах показало его обычную локализацию в нейтрофготах больных, т е дисперсное точечное распределение в цитоплазме в отсутствие апоптозной митохондриальной транслокации.

С целью выяснения значения повышенного связывания СБ-нейтрофилами аннексина-V для их распознавания и поглощения клетками-скавевджерами мы использовали макрофаги, полученные из моноцитов здоровых доноров. С этими макрофагами были инкубированы контрольные и СБ-нейтрофилы сразу после выделения и после 20 ч культивирования. Свежевыделенные контрольные нейтрофилы (<5% аннексии-V4" клеток) практически не поглощались (фагоцитарный индекс < 10%) Свежие нейтрофилы больных СБ также не фагоцитировались макрофагами (фагоцитарный индекс < 10%), хотя более 60% клеток были аннексии-V+. Только после 20 ч культивирования, когда более 70% клеток подвергалось апоптозу (появление апоптозной морфологии, агрегации митохондрий, связывания аннексина-V*), контрольные нейтрофилы и СБ-нейтрофилы распознавались и поглощались макрофагами (фагоцитарный индекс > 30%).

Таким образом, аннексин-V связывается с мембраной циркулирующих СБ-нейтрофилов в отсутствие признаков апоптоза. Аннексин-V обладает значительной аффинностью к ФС ФС служит для усиления прокоагуляционного каскада [Vermes, 1995], однако у больных СБ активация протромбина не наблюдалась. Кроме того, экспрессия ФС нейтрофилами теоретически могла бы быть причиной нейтропении при СБ за счет усиления клиренса через рецепторы ФС на поверхности макрофагов. Однако, выраженность нейтропении варьировала от умеренной до легкой, процент клеток, связывающих аннексин-V, не коррелировал с абсолютным числом нейтрофилов, и макрофаги человека не фагоцитировали свежеизолированные СБ-нейтрофилы

Для объяснения связывания аннексина-V СБ-нейтрофилами может быть предложен ряд механизмов. Во-первых, лигандом для аннексина-V может служить ФС, который обладает необычными стереометрическими параметрами, позволяющими связывание с аннексином-V, но не с рецепторами ФС. Однако в связи с тем, что стереоспецифичность аннексина-V не описана и поглощение апоптозных СБ-нейтрофилов не изменено, эта версия представляется маловероятной. Во-вторых, экспрессия только ФС на поверхности клеток может быть недостаточна для узнавания и поглощения макрофагами, поскольку фагоцитоз

апоптозных клеток, опосредованный через рецепторы ФС, может зависеть от кофакторов, которые отсутствуют на свежевыделенных СБ-нейгрофилах, не являющихся апоптозными [Henson, 2001]. Обе гипотезы не объясняют причины выныривания (flip-flop) ФС на СБ-нейтрофилах. Наконец, аннексин-V может связываться с альтернативным лигандом или молекулой, экспрессированной на клеточной мембране гранулоцитов больных СБ, которая сама по себе не распознается рецептором для ФС. В этом отношении настоящие наблюдения при СБ перекликаются с данными [Dillon, 2000; van den Eijnde, 2001], описывающими связывание аннексина-V мышиными B-лимфоцитами и клетками формирующейся мышечной трубки у мышей в отсутствие признаков алоптоза. В этих сообщениях авторы опирались (без дополнительной проверки) на общепринятое положение о том, что связывание аннексина-V является строго ФС-зависимым.

Завершая описание данного раздела, следует подчеркнуть, что повышенное связывание аннексина-V (каким бы ни был его лиганд) не обязательно отражает апоптозное состояние клетки Следовательно, для того чтобы точно оценить уровень клеточной гибели, необходимо применять несколько методов ее регистрации.

Схема механизмов клеточной гибели нейтрофилов

В заключение, очертим ряд особенностей, характеризующих апоптоз нейтрофилов, которые были выявлены в ходе настоящей работы (рис 14). Нейтрофилы запрограммированы на спонтанную и быструю гибель, не требующую внешних стимулов Видное место в этой программе занимают митохондрии нейтрофилов, которые значительно отличаются от митохондрий в других типах клеток. Относительная недостаточность цигохрома с может создавать условия для необычного транспорта электронов в митохондриях, способствуя накоплению АФК. Изменения редокс-состояния могут дестабилизировать внутриклеточные сигнальные системы и повреждать внутриклеточные молекулы, вызывая биохимический сдвиг в сторону клеточной гибели. Выделить единственный фактор в качестве самого главного в апоптозе нейтрофилов - трудная задача. Очевидно, что комбинация многих факторов (необычные митохондрии; конститутивное отсутствие «больших» антиапоптозных гомологов Вс1-2, но высокая экспрессия проапоптозных; снижение порога чувствительности к цитохрому с в митохондриальном пути апоптоза; предсуществующий апоптозный механизм, не требующий de novo синтезированных белков для своей работы) формирует проапоптозный фенотип клеток. Эти характерные черты могут быть использованы в качестве нейтрофил-специфичных мишеней в поиске фармакологических агентов для управления нейтрофильными реакциями. Нейтрофилы задействованы в патогенезе серьезных заболеваний, и селективная элиминация этих клеток была бы полезной в ряде обстоятельств

Г-КСФ

iicf-101

Onti/HtrA2 (мдормигомдицдокяышя АДУ счттжошкюйи ■таишь) | Другие протезам?

* /

Каспазонезависииая клеточная гибель

Рис. 14. Схема механизмов клеточной гибели нейтрофилов. При старении нейтрофилов в культуре происходит активация Вах и Bid, и они перемещаются к митохондриям, нарушая целостность их внешней мембраны Это ведет к выходу проапоптозных составляющих митохондрий в цитозоль, где начинается активация каспаз Ферментативная активность каспазы-3 и других исполнительных каспаз разрушает внутриклеточные мишени, в результате чего клетки утрачивают свои функции и приобретают апоптозный фенотип Это внутренний механизм апоптоза, который может быть заблокирован Г-КСФ через задержку атаки митохондрий Bid/Bax и последующей активации каспаз Ингибирование релокализации Вах зависит от белков, синтезированных de novo, и может быть предотвращено ЦГМ, тогда как изменения Bid отменяются более непосредственно (т е без участия новых белков) zVAD-fmk блокирует апоптоз постмитохондриально, напрямую ингибируя каспазы Внешний механизм апоптоза нейтрофилов может быть запущен, например, ТНФ-а Связывание ТНФ-а со своим рецептором приводит к сборке DISC, в составе которого активируется каспаза-8 Каспаза-8, в свою очередь, активирует каспазу-3 и усиливает митохондриальный (внутренний) путь за счет активации Bid Как внутренний, так и внешний механизмы апоптоза нейтрофилов являются каспазозависимыми При блоке каспаз zVAD-fmk стимуляция ТНФ-а вскрывает каспазонезависимый путь клеточной гибели нейтрофилов Этот путь опосредуется через АФК митохондриального происхождения и требует внутримитохондриальной активности сериновой протеазы Omi/HtrA2, которая может быть заблокирована ucf-101, специфическим ингибитором Omi/HtrA2.

»

выводы

1. Апоптоз нейтрофилов сопровождается утратой клеточных функций, а задержка апоптоза, вызванная Г-КСФ, частично их сохраняет.

2. Митохондрии нейтрофилов утрачивают роль в метаболизме клеток, однако сохраняют контроль над активностью каспаз путем высвобождения своих проапоптозных белков. При нейтрофильном созревании клеток миелоидной линии HL-60 утрачивается экспрессия цитохрома с, а митохондрии в созревших клетках приобретают трубчатую форму.

3. При апоптозе нейтрофилов происходит цитохром с-независимая активация каспазы-9. При этом активация каспазы-9 и каспазы-3 предшествует активации каспазы-8, что указывает на главенствующую роль внутреннего (митохондриального) пути в апоптозной программе нейтрофилов.

4. Развитие апоптоза нейтрофилов сопровождается конформационной активацией белка Вах, транслокацией Вах и Bid к митохондриям, выходом из митохондрий в цитозоль проапоптозных белков, процессингом и ферментативной активацией каспаз. Антиапоптозные эффекты Г-КСФ опосредуется через угнетение этих реакций и дифференцированно зависят от синтеза белка de novo.

5. ТНФ-а может вызывать как классический, каспазозависимый апоптоз, так и неклассическую, каспазонезависимую клеточную гибель. Последняя наблюдается при одновременном воздействии ТНФ-а и блоке каспаз zVAD-fmk, отличается от апоптоза по ряду признаков и опосредуется АФК митохондриального происхождения.

6. Для реализации каспазонезависимой клеточной гибели нейтрофилов требуется внутримитохондриальная протеазная активность Omi/HtrA2.

7. Нейтропения и дисфункция нейтрофилов при гликогенозе типа lb связана с усилением апоптоза, о чем свидетельствует присутствие в циркуляции у больных апоптозных нейтрофилов.

8. Связывание аннексина-V циркулирующими нейтрофилами у больных синдромом Барта не указывает на их апоптозный фенотип, что не позволяет рассматривать тенденцию к повышению апоптоза как причину нейтропении при этом заболевании.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Маянский А Н., Маянский Н.А., Заславская М.И., Калашников С.П. Апоптоз: новая концепция в биологии и медицине. Нижегородский медицинский журнал, 1997, №2, с. 70-76.

2. Маянский А.Н., Маянский Н А., Абаджиди МА, Заславская М.И. Апоптоз: начало будущего. Журнал микробиологии, иммунологии и эпидемиологии, 1997, №2, с. 88-94.

3. Маянский А.Н., Маянский Н.А., Заславская М.И., Поздеев Н.М., Плескова С Н. Апоптоз нейгрофилов. Иммунология, 1999, №6, с. 11-20.

4. Маянский Н.А., Заславская М.И., Маянский А.Н. Апоптоз экссудативных нейгрофилов человека Иммунология, 2000, №2, с. 1113.

5 Маянский А.Н., Маянский Н.А. Апоптоз и воспаление. Материалы II Всероссийского симпозиума «Хроническое воспаление» (4-6 октября

2000, Новосибирск). Новосибирск, 2000, с. 52-53.

6. Kuijpers T.W., van den Berg J.M., van Buul J., Maianski N.A., Roos D. Apoptosis of neutrophils: principles of cell death. Eur. J. Clin. Invest., 2000, v. 30, suppl. 1, p. 12.

7. Маянский H. А. Состояние каспазы-3 при подавлении апоптоза нейгрофилов гранулоцитарым колониестимулирующим фактором. Иммунология, 2001, №2, с 22-25.

8. Маянский Н.А. Субклеточное перераспределение Вах и его слияние с митохондриями при спонтанном апоптозе нейгрофилов. Иммунология,

2001, №6, с. 29-32.

9. Маянский Н. А. Каспазонезависимый механизм апоптоза нейгрофилов: апоптогенный эффект туморонекротического фактора а. Иммунология,

2002, №1, с. 15-18.

10.Maianski N.A., Mul F.P.J., van Buul J.D., Roos D„ Kuijpers T.W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils Blood, 2002, v. 99, p. 672-679.

11.Maianski N.A., Kuijpers T.W., Roos D. Caspase-independent cell death in human neutrophils induced by tumor necrosis factor a. Eur. J. Clin. Invest., 2002, v. 32, suppl. 2, p. 24.

12.van der Laan L.J.W., Wolach В., Maianski N.A., Tool A.T.J., Roos D„ Kuijpers T.W. G-CSF and GM-CSF preserve functional abilities of aging neutrophils. Eur. J. Clin. Invest., 2002, v. 32, suppl. 2, p. 29.

13.Maianski N.A., Roos D , Kuijpers T W. Tumor necrosis factor a induces a caspase-independent death pathway in human neutrophils. Blood, 2003, v. 101, p. 1987-1995.

14.Маянский Н.А., Роос Д., Кайперс Т. Каспазонезависимый путь клеточной гибели нейтрофилов человека, индуцированный ТНФ-а. Цитокины и воспаление, 2003, № 1, с. 29-35.

15.Kuijpers T.W., Maianski N.A., Tool A.T.J., Smit G.P.A., Rake J.P., Roos D., Visser G. Apoptotic neutrophils in the circulation of patients with glycogen storage disease type lb (GSDlb). Blood, 2003, v. 101, p. 5021-5024.

16.Maianski N.A., Maianski A.N., Kuijpers T.W., Roos D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematologica, 2004, v. Ill, p. 56-66.

17.Maianski N.A., Geissler J., Srinivasula S.M., Alnemri E, Roos D., Kuijpers T.W. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death Differ., 2004, v. 11, p. 143-153.

18.Kuijpers T.W., Maianski N.A., Tool A.T.J, Becker K, Plecko B, Valianpour F, Wanders R.J.A, Pereira R, van Hove J, Verhoeven A.J, Roos D , Baas F , Barth P.G. Neutrophils in Barth Syndrome (BTHS) avidly bind Annexin-V in the absence of apoptosis. Blood, 2004, v. 103, p. 39153923.

19.Blink E, Maianski N.A, Alnemri E.S, Zervos A.S, Roos D, Kuijpers T.W. Intramitochondrial senne protease activity of Omi/HtrA2 is required for caspase-independent cell death of human neutrophils. Cell Death Differ, 2004, v. 11, p. 937-939.

20.Maianski N.A, Roos D, Kuijpers T.W. G-CSF delays neutrophil apoptosis through inhibition of Bid truncation and Bid/Bax targeting to the mitochondria and caspase activation. Eur. J. Clin. Invest, 2004, v. 34, suppl. 1, p. 52.

21.Maianski N.A, Roos D , Kuijpers T.W. Bid truncation, Bid/Bax targeting to the mitochondria and caspase activation associated with neutrophil apoptosis are inhibited by granulocyte-colony stimulating factor. J. Immunol, 2004, v. 172, p. 7024-7030.

22.H.A. Маянский, Э. Блинк, Д. Роос, Т. Кайперс. Роль Omi/HtrA2 в каспазонезависимой клеточной гибели нейтрофилов человека. Цитокины и воспаление, 2004, №2, с. 47-51.

23.Маянский Н.А. Митохондрии нейтрофилов: особенности физиологии и значение в алопгозе. Иммунология, 2004, т. 25, №5, с. 307-312.

24.Маянский Н.А. Внутренний путь апоптоза нейтрофилов и механизмы антиапоптозного эффекта гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Иммунология, 2004, т. 25, №6, с. 329-335.

Список принятых сокращений Ат - антитела

АФК - активные формы кислорода

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ИБ - иммуноблоттинг (Western blotting) ИП - иммунопреципитация

КЛСМ - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия МоАт - моноклональные антитела

НАДФ Н - система никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидазы

ОЕФ - относительная единица флуоресценции

03 - опсонизированный зимозан

ПИ - пропидиум йодид

СБ - синдром Барта; Barth syndrome

СИФ - средняя интенсивность флуоресценции (mean fluorescence intensity)

СО - стандартное отклонение

ТНФ-а - туморонекротический фактор а

ФАТ - фактор активации тромбоцитов

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоционат

ФМА - форболмиристатацетат

ФС - фосфатидилсерин

ХГБ - хроническая грануломатозная болезнь

ЦГМ - циклогексимид

FACScan - проточный цитометр GSDlb - гликогеноз типа lb

IAP - inhibitor of apoptosis protein (белок-ингибитор апоптоза)

M1M - Mendelian Inheritance in Man (менделевское наследование у

человека)

МпСОД - марганец-зависимая митохондриальная изоформа супероксиддисмутазы

SDS-PAGE - sodium dodecyl sulfate poliacrylamide gel electrophoresis (электрофорез белков в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия)

XIAP - X-linked inhibitor of apoptosis protein (белок-ингибитор апоптоза, сцепленный с Х-хромосомой)

Подписано в печать 25 11 2004 г Заказ №243 Тир 100 экз

ООО «Стимул-СТ» 603155, Н.Новгород, ул Трудовая,6

РНБ Русский фонд

2005-4 46394

í Í1

\

\

Т- 2 ШР 2005 175

Термин «апоптоз» был введен в начале 1970-х гг. для обозначения особого типа клеточной гибели, отличного от некроза [91, 198]. Эта разновидность гибели клеток много раз «открывалась» и предавалась забвению разными цитологами и учеными, изучавшими биологию развития. Изначально она была забыта как малозначимый феномен, однако оживление интереса к апоптозу произошло после того, как было осознано, что этот процесс является генетически регулируемым (программируемым) механизмом, а не просто случайным событием. После этого понятия «апоптоз» и «программируемая клеточная гибель» стали использоваться как синонимы. Эта управляемая форма клеточной гибели так же важна и физиологична, как и пролиферация и дифференцировка клеток, и так же четко регулируется. Базисная информация о генетической регуляции апоптоза получена из блестящих работ на примитивном организме СаепоггкаЬШШ е^ат [198]. Оказалось, что гены, которые регулируют апоптоз у этого круглого червя, имеют гомологов у млекопитающих, включая человека. Это доказало, что апоптоз является важным процессом, сформированным и сохраняемым эволюционно.

В течение последних 15-20 лет число исследований, посвященных апоптозу, росло экспоненциально. Было обнаружено, что апоптоз вовлечен во множество физиологических и патофизиологических процессов. Такая поли функциональность апоптоза нашла отражение в ряде его образных названий. Так, роль апоптоза в строительстве тканей при онтогенезе дала основание называть его «архитектором организма». Альтруистический суицид», когда клетки приносят себя в жертву, активируя программу гибели для предотвращения распространения инфекции [201, 214] - еще одно название апоптоза. Баланс между пролиферацией и гибелью клеток должен быть точно установлен и хорошо контролироваться, поскольку дисбаланс в этой системе может приводить к болезни. Примеры заболеваний, при которых имеются нарушения апоптоза, многочисленны и значительны. Усиление апоптоза нейронов является одним из факторов патогенеза нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона [101, 199]. Связывание ВИЧ или его белка gpl20 с CD4+ Т-клетками при одновременной стимуляции комплекса МНС-II запускает апоптоз в этих клетках-хелперах, что в итоге приводит к СПИДу [201, 214]. Развитие многих онкологических заболеваний связывают с задержкой апоптоза [91].

Помимо роли в эмбриональном развитии, физиологическое значение апоптоза иллюстрируется его важнейшим вкладом в регуляцию иммунной системы [201, 214]. Апоптоз участвует в контроле за созреванием Т- и В-клеток и элиминацией аутореактивных лимфоцитов. Пролиферация и экспансия лимфоцитов после встречи с антигеном, выживание клеток памяти и гибель активированных Т-клеток при инволюции иммунного ответа, - все эти реакции приобретенного иммунитета связаны с усилением или угнетением апоптоза. Кроме того, иммунная толерантность в иммунологически привилегированных областях (например, передняя камера глаза и яички) обеспечивается механизмами, связанными с апоптозом [201, 214].

Настоящая работа посвящена изучению апоптоза нейтрофилов, которые являются одним из главных компонентов врожденного иммунитета. Нейтрофилы составляют самый большой пул лейкоцитов периферической крови (от 40 до 70% в нормальных условиях). Они защищают организм от бактериальных и грибковых инфекций. Для этого нейтрофилы оснащены необходимыми инструментами, которые позволяют им выявлять очаг инфекции, двигаться в его направлении и поглощать и уничтожать микроорганизмы [1]. Очевидно, что для надлежащего функционирования этого рубежа защиты достаточное число нейтрофилов должно производиться костным мозгом и высвобождаться из него, будучи способными исполнять большое число различных функций. Однако, в связи с тем, что сами нейтрофилы и продукты их метаболизма потенциально опасны для тканей хозяина, существует целый ряд барьеров для предотвращения таких нежелательных побочных эффектов. Одним из таких механизмов служит апоптоз. Благодаря апоптозу удается предотвратить выход цитотоксического содержимого нейтрофилов в окружающие ткани и своевременно элиминировать погибающие клетки через тканевые макрофаги [70, 233].

Несмотря на значительный объем литературы, посвященной исследованию апоптоза нейтрофилов, ряд важных вопросов остается неизученным. Так, по-прежнему не расшифрованы молекулярные механизмы апоптоза, хотя известно, что его регуляция осуществляется при участии белков семейства Вс1-2 и каспаз. Предполагается, что эти две группы молекул тесно взаимодействуют на уровне митохондрий: гомологи Вс1-2 могут управлять активностью каспаз через влияние на проницаемость наружной митохондриальной мембраны [7, 8, 198]. Повышение проницаемости облегчает высвобождение митохондриальных проапоптозных факторов и сборку апоптосомы - мультимолекулярного комплекса, активирующего инициаторную каспазу-9. Вслед за этим происходит активация эффекторных каспаз, которые расщепляют множество мишеней, что ведет к дезорганизации и гибели клетки. Как физиология митохондрий, так и функционирование этого внутреннего (митохондриального) механизма апоптоза в нейтрофилах до сих пор подробно не исследовалось, хотя он видится особенно значимым, т.к. нейтрофилы настроены на быструю, спонтанную гибель в отсутствие дополнительных внешних воздействий. Кроме того, неполно освещены и пути модуляции апоптоза нейтрофилов под влиянием биологически активных медиаторов, в частности, цитокинов. Эндогенные цитокины играют важную роль в регуляции воспаления. Широко применяются цитокины и в виде фармакологических препаратов, как, например, Г-КСФ, используемый при нейтропениях. Его воздействие на нейтрофилы in vivo направлено в том числе и на регуляцию апоптоза [138, 148]. В этом свете интересным видится изучение функциональных способностей нейтрофилов при апоптозе и его задержке антиапоптозными агентами, например, Г-КСФ.

В последнее время появились сообщения о каспазонезависимой (программированной) клеточной гибели, которая может играть важную роль в ряде физиологических процессов [159]. Возможность такого альтернативного механизма гибели нейтрофилов остается неизученной.

Преждевременный (ускоренный) апоптоз нейтрофилов и их костномозговых предшественников лежит в основе развития нейтропений различного спектра, включая тяжелую врожденную нейтропению, циклическую нейтропению, хроническую идиопатическую нейтропению [16-19, 138, 207]. В то же время, при ряде заболеваний, при которых нейтропения является сопутствующим, но нередко жизнеугрожающим синдромом, ее механизмы остаются невыясненными [138]. К примерам таких заболеваний относятся гликогеноз типа 1Ь (0801Ь) [38, 278] и синдром Барта (СБ) [25, 26]. В связи с этим представляется важным оценить возможный вклад апоптоза в патогенез нейтропении при указанных заболеваниях.

Таким образом, более подробное изучение событий, лежащих в основе клеточной гибели нейтрофилов, внесет вклад в понимание физиологии нейтрофилов и будет способствовать поиску новых подходов к управлению воспалением и лечению состояний, связанных с расстройствами апоптоза нейтрофилов.

Цель исследования - изучение механизмов и регуляции клеточной гибели нейтрофилов, а также потенциальной роли апоптоза в патогенезе нейтропений.

Задачи:

1. Проанализировать влияние апоптоза на функциональные способности нейтрофилов. ю

2. Исследовать особенности митохондрий и внутреннего (митохондриального) механизма апоптоза нейтрофилов.

3. Уточнить механизмы антиапоптозного действия Г-КСФ.

4. Провести поиск альтернативных путей клеточной гибели нейтрофилов и выяснить их механизмы.

5. Изучить значение апоптоза в патогенезе нейтропении при гликогенозе типа 1Ь и синдроме Барта.

Научная новизна

Описаны новые маркеры апоптоза нейтрофилов, которые могут быть использованы для количественной оценки клеточной гибели. Впервые подробно исследованы особенности митохондрий нейтрофилов и установлено их участие в регуляции апоптозной программы этих клеток. Показано, что при апоптозе нейтрофилов митохондрии выделяют в цитозоль проапоптозные белки, которые способствуют активации каспаз. Установлено, что в нейтрофилах может происходить цитохром с-независимая активация каспазы-9. Выявлена иерархия активации каспаз при ТНФ-а-индуцированном апоптозе нейтрофилов, согласно которой активация каспазы-9 и каспазы-3 предшествует активации каспазы-8. Получены дополнительные данные о работе внутреннего (митохондриального) пути апоптоза нейтрофилов и механизмах антиапоптозных эффектов Г-КСФ в рамках этого пути. Впервые описан каспазонезависимый механизм клеточной гибели нейтрофилов и определены его вероятные механизмы и эффекторы. Впервые в циркуляции у больных в801Ь обнаружены апоптозные нейтрофилы и получены данные о возможной роли апоптоза в патогенезе нейтропении при этом заболевании. Впервые детально исследованы функции нейтрофилов при СБ. Показано, что повышенное связывание аннексина-У нейтрофилами больных СБ не свидетельствует об апоптозном фенотипе этих клеток.

Теоретическая и практическая значимость

В ходе настоящего исследования получена новая информация о механизмах и регуляции клеточной гибели нейтрофилов, которая углубляет понимание физиологии нейтрофилов и механизмов реакций, опосредуемых этими клетками. Полученные данные расширяют представления о физиологии митохондрий: в нейтрофилах эти органеллы регулируют клеточную гибель, но утрачивают роль в энергетическом метаболизме клеток. Выявление цитохром с-независимой активации каспазы-9 оспаривает постулат о том, что цитохром с является универсальным и ведущим эффектором апоптоза, и станет стимулом для поиска альтернативных медиаторов клеточной гибели. Это позволит углубить знания о механизмах регуляции апоптоза. Изучение внутреннего механизма апоптоза нейтрофилов и антиапоптозных эффектов Г-КСФ обозначило ряд интересных потенциальных мишеней (конформационная активация Вах, расщепление Bid, активация каспаз) для направленного поиска средств для фармакологического управления апоптозом нейтрофилов. Исследование нейтрофилов больных GSDlb вскрывает роль усиления апоптоза в развитии нейтропении при этом заболевании, что может способствовать поиску адекватных лечебных мер. Вместе с тем, отсутствие апоптозного фенотипа и сохранные клеточные функции у нейтрофилов больных СБ несмотря на повышенное связывание аннексина-V указывает на то, что оценка клеточной гибели по единственному критерию не всегда дает истинную картину. Это следует учитывать при изучении апоптоза, в связи с чем предложенные в настоящей работе новые маркеры клеточной гибели будут полезными.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Митохондрии нейтрофилов утрачивают метаболические функции, но продолжают участвовать в регуляции клеточной гибели.

2. В нейтрофилах возможна цитохром ¿-независимая активация каспазы-9; активация каспазы-9 и каспазы-3 предшествует активации каспазы-8.

3. Апоптоз нейтрофилов сопровождается конформационной активацией Вах, расщеплением Bid, транслокацией Bax/Bid к митохондриям, выходом проапоптозных белков митохондрий в цитозоль и активацией каспаз. Антиапоптозные эффекты Г-КСФ связаны с угнетением перечисленных реакций.

4. ТНФ-а способен вызывать клеточную гибель нейтрофилов по двум механизмам: каспазозависимому (апоптоз) и каспазонезависимому. Последний отличается от апоптоза по ряду признаков, опосредуется митохондриальными АФК и требует внутримитохондриальной протеазной активности Omi/HtrA2.

5. В циркуляции у больных GSDlb присутствуют апоптозные нейтрофилы.

6. Связывание аннексина-V нейтрофилами при СБ не является индикатором их апоптозного фенотипа.

Выводы

1. Апоптоз нейтрофилов сопровождается утратой клеточных функций, а задержка апоптоза, вызванная Г-КСФ, частично их сохраняет.

2. Митохондрии нейтрофилов утрачивают роль в метаболизме клеток, однако сохраняют контроль над активностью каспаз путем высвобождения своих проапоптозных белков. При нейтрофильном созревании клеток миелоидной линии HL-60 утрачивается экспрессия цитохрома с, а митохондрии в созревших клетках приобретают трубчатую форму.

3. При апоптозе нейтрофилов происходит цитохром с-независимая активация каспазы-9. При этом активация каспазы-9 и каспазы-3 предшествует активации каспазы-8, что указывает на главенствующую роль внутреннего (митохондриального) пути в апоптозной программе нейтрофилов.

4. Развитие апоптоза нейтрофилов сопровождается конформационной активацией белка Вах, транслокацией Вах и Bid к митохондриям, выходом из митохондрий в цитозоль проапоптозных белков, процессингом и ферментативной активацией каспаз. Антиапоптозные эффекты Г-КСФ опосредуется через угнетение этих реакций и дифференцированно зависят от синтеза белка de novo.

5. ТНФ-а может вызывать как классический, каспазозависимый апоптоз, так и неклассическую, каспазонезависимую клеточную гибель. Последняя наблюдается при одновременном воздействии ТНФ-а и блоке каспаз zVAD-fmk, отличается от апоптоза по ряду признаков и опосредуется АФК митохондриального происхождения.

6. Для реализации каспазонезависимой клеточной гибели нейтрофилов требуется внутримитохондриальная протеазная активность Omi/HtrA2.

7. Нейтропения и дисфункция нейтрофилов при 0801Ь связана с усилением апоптоза, о чем свидетельствует присутствие в циркуляции у больных апоптозных нейтрофилов.

8. Связывание аннексина-У циркулирующими нейтрофилами у больных СБ не указывает на их апоптозный фенотип, что не позволяет рассматривать тенденцию к повышению апоптоза как причину нейтропении при этом заболевании.