Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Механизмы фармакологической регуляции процессов активации и гибели лимфоцитов периферической крови человека

Р Г Б 0 а

пи нрапах рукописи

ШМЛРИНЛ I'ДЛИНА ВАСИЛЬЕВНА

МЕХАНИЗМЫ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ АКТИВАЦИИ И ГИБЕЛИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

14. 01). 36. - A.i.icpin.ioiпя и пммуноло!и»

АВТОРЕФЕРАТ uicccpiaiiim па соискание j'ieimii ciciiciiu капдп/ина медицинских наук

[Москва 19%

Работа выполнена в Институте генетики человека Медико-генетического научног о центра РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Л.Л. Певшшкии

доктор медицинских паук AJI. Пухальскпй

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Д.М. Сии i конский

кандидат медицинских наук Ч.П. 1>елкин

Ведущее учреждение: Российский I "осударственный медицинский

университет

Защити диссертации соотоится _1 _ _года

в_ часов на заседании дпссершшюпного Совета К. 176.01.02.

Московского Научно-Исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского ( 125212, г. Москва, ул. адм. Макарова, 10)

Автореферат разослан "_" _ _г ода

С диссертацией можно ознакомиться в биб;шо1екс института

Ученый секретарь диссергациоиио! о Concia,

K.M.II.

.4.11. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ Ш'ОВЛКМЫ. Аноним или программированная клетчная гибель нредоавляс! собой универсальный мехашпм, позволяющий многоклеточным организмам избавляйся от лишних нлн опасных клеток без участия воспалительно!о процесса (Vaux et al., 1404; King cl al., 1495; Meikrantz et al., 1495). Песмофя на большое ранюобраше выпивающих aiionioi ешмулов, существуют строг о определённые биохимические и морфоло! нчсскнс пришаки программированном клеючиой шбелп. Как правило, в тбпушеи kjicikc происходи! конденсация хроматин и активация шдоиуклеа!. осуществляющих олитонуклеосомпую фра1 менищию ДНК. Другими харамерпымп признаками анонюза являются вакуолизация шпоплазматнческои мембраны, редукция клеючного обьёма и (|ipai менкпшя ядра. В конечном more, клока распадается на отельные мечбрамоассонипровапмые i|)pai мешы (аношошчсскнс тела), коюрыс фа! 0Ц1Пирую1СЯ и перевариваю кя макрофш амн (Clark et al., 1990; Arends et al., 1991; Steiler, 1995). Таким oGpaioM, пошбшая клетка бморо ¡лпминмруеи'я, н ее потенциально опасное содержимое не угрожает окружающим i каням.

Лимфопднмс KjieiKii infiiiyi аношошчсскп в опнч на самые разнообразные стимулы, включая глюкокоргикоиды. у-облучеипе, отсутствие фактором роста п дифференнировкп, активацию (ашп-СПЗ анппеламп, Miiioi снами), вирусную инфекцию, химпотерапев шческие aienn.i. Аиошоз являемся одним из основных мехашпмов регуляции количесчва пчмунокомщчетпных клеюк, злимнпаиии ауюрсакгнвных клопов в omoieiieie, а ткже удаления итбытка акшвированных лимфоцитов после свершения нммуниото ornera (Nagata et al., 1995; Pohl et al.. 1995). Нарушение рсчуляцнн апонтогических процессов в нммунокомпекчтшых кле1ках приводит к развитию [яжёлой иатлоти. Гак, повышенная рсшасиптосп. к аионюiнческим ешмулам может приводить к ncoi раннчепной жепапепн лпм(|юцц|ов и рашнппо ауюпммуппыч (сиск'мная красная волчанка, аутоиммунный i ломсруломсфрит, диабе! I шпа) пли лнмфопролпфсрашвных ((фолликулярная лнм||юма) !аболеваний. 1!)быючная тбел). лнм(|)оидных клеюк ciiocoGcinyei вошпкиовеипю иммуподефмипюв (СИИД) (Barr et al., 1994; Tompson, 1995). В связи с вышеизложенным приобрести ¡начнмосп. исследования, связанные с

фармакологической регуляцией процессом активации н гибели иммупокомпстспгпых клеток.

Н лаборатории нммуиогciiciикц Мсдико-i eriei ическог о научног о цегмра 1'ЛМН на |тро1яжс111Ш нескольких лег исследовали свойства синтетическою гексапеи гида имунофана. ')ioi иммуиомодулягор представляет собой модифицированный аналог акпгшюю цешра i iimoiki i i iii iu II. При исследовании свойств препарата выяснилось, что нмунофаи способен модулиронаи, продукцию провощали! ельпых шиокннов (факюра некрота опухоли и н ннтерлейкипа 6), а также окатывап. мммуиокоррш пруюигсе влияние на уровень иммуноглобулинов классов А и Н (IIпсарен, 1У1>5; Pnkhalsky ct al., I(>%).

ЦОЬ И ЗАДАЧИ П(ХЛ1Д()11\МИЯ

Целью настоящею исследовании явилось тучсипс клеточных п молекулярных механизмов действия иммупомодуля юра имунофана, а 1акже выяснение возможности фармакологической регуляции процессов активации н гибели лимфоцитов человека с помощью ног о препарата.

В задачи работы »ходило:

1) выяснить особенности peíуляцпп апогтготических процессов в мононуклеарач периферической крови человека:

2) тпучшь влияние имунофана па пролпферашвпый ответ лимфоцита человека, стимулированных I'-клеточными ми именами конканавалпном А и фптогемаплю шинном;

3) исследован, влияние имунофана па состояние Са-+,К^2+-)авнснмой чндонуклеа ты и пролиферацию лпмфоциюи человека на (|)оне действия т лкжокортпкондных тормопов;

4) выясншь значение свободпыч ионов Ca'* ;гля реалпгацин эффектов имунофана и активированных им клеюк па сосюяпне Ca2t,Mg2MaBHcnMoíí зндоггуклеазы, пролиферацию, и индуцированную лппополисахаридом продукцию факюра пскрота опухоли:

5) исследован» некоторые клеточные н молекулярные мехагнпмы действия имунофана.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАПОТЫ

В результате проведённых исследовании было усыновлено, чю разнообразные анототчсскне атешы (глюкокоргикоиды, ншпбптор синтеза белка цнклогексимид, хелаюр ионов Са3+ ннлсшлпкольicipaaneiai, пншбигор протеппкиназы С Н-7), а также синтетический гексапсптид пмунофан вызывают активацию Ca-+,Mg:+-3aBiicnMoíi шдонуклеазы в лимфоцитах периферическом крови человека. Активация ферме)iia не зависит oí дополнительно! о синтеза белка п не сопровождается фра1 мсшацпеп хрома шна и i ибсзыо клеюк. Обнаружено, чю нммупомодуляюр пчунофап шачпмо снижает пролпферашштып ответ мопопуклеароп человека па |'-к нмочпые ми loi спи (фп mi емап лютнппм II конканавалии А). Покатано, чю iipenapai смисственно усиливает чувствительность лимфоцитов человека к ашштролпферат шшому действию i люкокортикопдов. При изучении влияния имунофама на аиоп юшческие процессы выяспилое!., чю iipenapai способен модулирован, акшвносм. Ca:\Mg-f-кшпсимоп шдонуклеа ты - одного in основных (|)epvciirori. viatiиуюпгич в реализации программы клеючпой шбели. Установлено, чю мш пбируюшее влияние имупофаиа, а также обработанных им клеюк. па активпосп. шдонуклеазы н iipojiiii|)epanino лимфоцитов человека существенно зависит от присутствия свободных ионов Са;* в инкубационной среде. В то же время наличие свободных попов Са2* п период втанмодейетвня лпм|])оциюв с тшупофаиом не являсмся обятательным для пш ибпруюшего действия препарата п активированных пм клеюк на пндуцировапную лппополисахаридом продукцию фактора искрою опухоли. При исследовании молекулярных механизмов действия имупофана выяснилось, чю обработка лммфошпоп мчмупомодулятром вызывает продукцию растворимых факторов, коюрые обнаруживаются » падосадочноп жидкое i и уже черст 2-4 часа после обработки клеюк препаратом и Moiyi опосредован. эффекты ииуиофапа на состояние Ca:\Mg:MaBiiciiMoii тпдопуклеазы и пролиферацию лимг|)оци юн периферической крови человека.

Представленные в работе результаты расширяю! имеющиеся представления о мехашпмах имм\номоду.тир\тоще1 о депстни нммюфапа, что liMeei важное практическое шачеиие для paipa6oii<n адеквашмх схем пммупокоррекции в клинике.

ОГНОПНМК ГЮЛОЖКНИЯ, ВБШОСИМЫ1. ИЛ ЗАЩИТУ

1. 11 ммуномодуля! ор пмунофап способен cymeci пени о спижаи. нролпферашвиып oibci лпмфоцнюн периферической кроим человека па Т-клеючиые мнютсны конканавалнн А и фшшемаилюшшш, а также повышап. чуиспниельноси, моиомуклеар1м.1\ клеюк к ан i пиролпферашвиому денешшо глюкокортикоидных I ормопов.

2. Boi;iciicnine самых ра шообра шых атпов, включая I люкокоршкопды, шинбптор сишста белка циклот ексимнд, сшпетнчсскпм гексаненгид пмунофап, существенно усплнвае! акжшюсть Ca-+,Mg:+-)aBiicn.\ioH шдоиуклеаты в лимфошпач периферической крови человека. Акшнмоси. фермента jici ко выявляемся ш vitra пучем инкубации и нитрованных ядер в присутствии ионов CV+ и Mg:+ и не чапнеп i 01 дополнигслыюго синтеза белка.

3. г)ф(|)ск1Ы нмумо(|)апа па акшвпосп, Ca:+,Mg2t-jaBncnMOH эндонуклсаш и пролнфератпвнып oibci лпмфоцшов, обработанных глкжокоршкомдами, опосредованы растворимыми фактрами, Koiopi.ie обнаруживаются в падосадо'шоп жидкости ужо мере! 2-4 часа после нрепнкубацтш клеток с иммуномодуля тором.

АПРОБАЦИЯ ДИСС'КРТАЦИИ. Основные положения работы были обсуждены на XII ljiponeiicKoii конференции но иммуноломш (Барселона. 1994), на IX Международном конгрессе по иммуподошн (США, 1995), на конгрессе "Человек н лекаре!во"(Москва. 1995).M;iн-рналы дпссерктни апробированы па межлаборатрноп научной конференции Медикомепетческою научною центра 1'ЛМН 15омября 1996 | ода. Диссер тцня рекомендована к танине.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 3 научные рабо1Ы, в том числе и в тарубежноп иечаш.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация панисана по традиционному плану, coeiom 111 введения, об юра jiiuepaiypi.i (глава I), описания материалов и мешдок (глава 2), и шожецпя рспдмаюв собственных исследовании (|лава 3), обсуждения полученных данных Олива 4). выводов. Библиографический ука uikmii. jniiepaiypi.i включает 4 источника отечественных н 240 тарубежных

авторов. Работа изложена на 99 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 28 рисунков.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Имф - нмунофан Кон Л - конканавалин Л J1F1C - липополисахарид МНК - мононуклеарные клетки

M I T - 3-(4,5-диметилтиазол-2-]1л)-2,5-дпфенил зетраюлиумбромпд

РФпмф - растворимые факторы, полученные п i суперна I актов обрабокшпых

нмуиофаном лпмфоцшов 1'Фн - растворимые факторы, полученные из супернаташов ишакпил лимфоцитов

рФНО - рекомбинантный фактор ncKpota опухоли СМЭ - Ca2+,Mg24'-3aBncHMaH чнлонуклеаза Ф1 Л - фпгогемагглюшннн ФИО - фактор некроза опухоли

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ и методы ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали мононуклеарные кле!ки (МНК), которые выделяли из гепарнпизнроваппой (25 Нд/мл) периферической крови здоровых доноров с помощью одноступенчатого градиента плогносзи фиколла-верографина (р= 1,077 г/см5).

Реакцию бласттрансформации лимфоцитов проводили в среде RPMI-1640 (ICN, Великобритания) с 10% сывороткой плода коровы ("Flow", Великобритания) в пластиковых %-луночпых планшетах. Клетки стимулировали фитогемагглютинином ("Difco", США) пли конканавалнном A ("Calbiochem", Швейцария) и культивировали 72 часа при 374' во влажной атмосфере, содержащей 5/<> СОг. За 4 часа до окончания инкубации к лнмфоцшам добавляли 41-тпмидин в концентрации 40 кГ>к на лунку. Kjicikii собирали на аекловолоконнме фнлыры с помощью клеточного харвсора ("Flow",

Великобритания). Высушенные фильтры помещали во флаконы со сцинтилляционноп жидкостью и определяли интенсивность включения радиоактивной метки на сцинтилляционном спектрофотометре Mark III ("Tracer Analitic", США).

Для определения продукции факюра некрота опухоли (ФИО) мононуклеары здоровых доноров помещали в 24-луиочные планшеты ("Nunc", Дания). Клетки стимулировали лппополтахарпдом (ЛИС. "Sigma", США) н культивировали 12 часов в среде RI'MI-1640, содержащей 5% сыворотки плода коровы, при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5"i. СО:. По окончании инкубации клетки осаждали и собирали суперна кипы.

Активность ФИО в образцах определяли но степени лизиса чувствительных к этому цнзокшту клеток мышиной фибросаркомы L-929. Клетки рассевапи в плоскодонные 96-луночныс планшет ы в полной среде 199 и культивировали при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СОз, до образования монослоя на дне лунок. Затем кульгуралытую среду удаляли и вносили но 100 мкл полной среды 199 с акгнномпципом D, а также образцы надосадочных жидкостей и инкубировали 16-20 часов при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СОг. По окончании инкубации клетки окрашивали 0,2% раствором кристалл-виолета в 2% этаноле. Ошнчсскую плотность выживших окрашенных клеток измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом "Multiscan" (Великобритания) при длине волны 540 пм. В качестве стандарта использовали рекомбпнантпый ФИО человека, зизровочные кривые анализировали с помощью метода проби тв, содержание ФИО выражали в пкг/мл.

Активность Ca:+,Mg2*-3aBiiciiMoii эндоиуклеазм (СМЭ) оценивали путем инкубации изолированных ядер в присутствии ионов Ca1* и Mg2+. Очистку проб производили с помощью 1'НКазы Л (20 мкг/мл) п протенпазьт К (I мкг/мл). Пробы депротеинизировали добавлением равного обьема смеси хлорлформ/изоамиловый спирт. Электрофорез ДНК проводили в Iелях 1,2/п агарозы в трис-ацетатном буфере. Гели окрашивали этидиумом бромидом п фотографировали через оранжевый фильтр в проходящем ультрафиолетовом cBeie. Полученные lierai ивы подвергали дснсизометрпи, по результатам которой рассчитывали активность Ca2+,Mg2+-3aBHCiiMori эпдонуклеа ты.

Для определения шпенсивностн иосс1аповлення 3-(4,5-дпметилтт1азол-2-ил)-2,5-дифенил1етразолпумбромнда (Ml 1) клетки культивировали в RPMI-1640

без добавления сыворотки в течение 4 часов или в полной культуралытой среде 24 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО?. Ча 3-4 часа до окончания инкубации к клеткам добаляли МТТ в концентрации 50 мкг на лупку. Клегки осаждали центрифугированием при 400 § в течение 15 мину г, удаляли среду культивирования. Чтобы растворить образовавшиеся кристаллы формазана в лунки вносили по 150 мкл диметилсульфоксида (0М80). Интенсивность окрашивания измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом "МиШясап" (Великобритания) при длине волны 540 нм. Результаты представляли в единицах оптической плотности.

Мононуклеарные клетки инкубировали I час с имунофаном (Имф) в концентрации 0,25 мкг/мл п среде К РМI -1640 без добавления смиорожн при 37°(\ 11о окончании инкубации клетки отмывали, ресуспендировали в тон же среде и инкубировали ещё 2-4 часа при 37°С. Надосадочные жидкости ингактных и преинкубированных с Имф тспегок фракционировали с помощью т ель-филмрацпи па колонках с сефадексом О-100 или сефакрилом 8300, предварительно уравновешенных 10 мМ иагрнй-фосфатным буфером, содержащим 15 мМ ЫаС1 (рН=7,2), и откалиброванных с помощью набора калибровочных белков с молекулярной массой 232000, 158000, 67000, 13700. Злюцшо проводили тем же буфером со скоростью 6 мл/час. После выхода свободного объёма собирали фракции, соответствующие выходу белков с определённой молекулярной массой.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ

1. Влияние имунофапа на пролиферацию мононуклеарпых клеток периферической крови человека

В экспериментах, связанных с исследованием влияния имунофана (Имф) на пролнферативный ответ мопопуклеарных клеток (МНК) периферической крови человека, лимфоциты претшкубировали с препаратом в течение I часа в среде ЯРМ1-1640 без добавления сыворотки. По окончании инкубации клетки отмывали п обрабатывали конканавалином А (Кон А) или фпюгемагглтопншном (ФГА) в концентрации 5 мкг/мл. Данные, представленные в виде кривых на рис. 1, являются результатом суммацни четырёх опытов с Кон А и двух - с ФГА. Как видно на графике, Имф сгаитстичсски значимо снижал пролпферашвный ответ МНК па Т-клеточиые чнюгены. Следует отметить, что при стимуляции

I I

лимфоцитов ФГЛ имело место более глубокое утнететше нролиферативного о1вс1а, чем при стимуляции клеюк Коп Л.

КОНЦЕНТРАЦИЯ ИМУПОФЛЦЛ (MKI/MJI)

Рис. 1. Влияние имунофана на пролиферацию лимфоцитов человека

Примечание: на рисунке покатан суммарный резульки четырёх опытов с Кои Л и

двух - с ФГЛ.

2. Значение евоГшлнмх иоиоп Ca2t дли ск\инпп шиш »ффектон имунофана ил пролиферацию мононуклеаров м продукцию фактора пек-poia опухоли л ими

к.те1камн*

Общеизвестно, что ионы Са-+ являются универсальными вторичными мессенджерами при передаче клеткам как акшвацпонных. так и аиогттотических сигналов (Iseki et al.. 1991; Bcrrige, 199Л). 15 свят с ним представлялось интересным выяснить значение свободных ионов С'а:+ при непосредственном воздействии имунофана на лимфоцит периферической крови человека.

В этих опытах лимфоциты человека инкубировали 1 час в среде RPMI-1640 без добавления сыворотки плп в той же среде, содержащей хелатор ионов Са2* этиленглпкольтеграцегаг ("ЛТА) в концентрации 250 мкМ. По окончании инкубации исследовали способность монопуклеаров отвечать на Т-клеточные митогены п продуцирован» факюр некрота опухоли. Полученные данные показывают, что нреннкубатшя клеюк с пмумофаном в стандартных условиях существенно снижала их пролпферашвный oibct па мпюген (рис. 2). В то же время, инкубация лимфоцитов с препаратом в среде, не содержащей свободных ионов Са:+, не влияла па высоту пролиферашвнот ответа. Аналогичные

* - эта часть рабо1ы выполнена совместно с ведущим научным сотрудником лаборатории нммупотенешки МГПЦ I'AMll II.М. Писаревым

результаты были получены в опытах с конкаиавалином Л. Следует отметить, что на фоне ингнбируюшего действия ЭГТА выявилась способность Имф стимулировать пролиферативный ответ. На рисунке видно, что уровень пролиферации лимфоцитов, преинкубированных с ЭГТА, был значимо ниже пролиферативного ответа клеток, обработанных Имф в присутствии хелатора ионов Са2+.

ПРОЛИФЕРАЦИЯ

140000 т

130000 --

120000 -■

X 110000 --

X

я юоооо --

с

я 90000 --

X

80000 - -

70000 - -

60000 - -

50000 --

ПРОДУКЦИЯ ФНО

1400 1300

1200 О

поо^й

1000 1 Н

II

800 10

-• 900

700 600 500

е

X

о

□ Контроль ЯИмунофан ■ ЭГТА

□ Имунофан и ЭГТА

Рис. 2. Роль свободных ионов Са2+ в осуществлении эффектов пмупофаиа на пролиферацию и продукцию фактора некроза опухоли

Как видно на рис. 2, часовая инкубация клеток с Имф в концентрации 0,25 мкг/мл в обычной среде RPMI-1640 приводила к значимому снижению индуцированной ЛПС продукции ФНО. Присутствие в инкубационной среде 250 мкМ ЭГТА существенно не изменяло эффекта Имф на индуцированную JIIIC продукцию ФНО. Следует отметить, что сама по себе часовая пренпкубацня клеток в среде, не содержащей свободных ионов Са- \ не влияла на уровень цнтокина в !2-часовон надосадочной жидкости МНК, стимулированных JII1C. Таким образом, мало верояшо, что влияние Имф на индуцированную ЛИС продукцию ФНО зависит от содержания в среде свободных попов Са-+ в период

взаимодействия мрспарага с клетками. Напротив, ингнбнрующее влияние нмунофана па пролиферацию лимфоцитов, стимудпроваииых Т-клеточпыми митогеиами, в значительной степеин зависит or присутствия в инкубационной среде свободных ионов Са2\ Аналогичные результаты были получены при исследовании шачепни свободных ионов ('а'1 для рсалнищип эффекти активированных имупофапом клеток па iipojni(|)epaiiiHo и индуцированную ЛИС продукцию ФИО.

3. Влияние нмунофана на чувствительное!!. лимфоцитов человека к анпшролиферашвному действию дексаме1азона*

На следующем этапе работы изучали влияние нмунофана на пролиферацию лимфоцитов человека на фоне ттпгибирующего действия дексаметазона. Чтобы повысить резистентность мононуклеаров к антипролиферативному действию ппококортикоидов, интактные клетки культивировали 4S часов in vitro. По окончании инкубации лимфоциты отмывали,

татем стимулировали

Иотахтным

Koiiipojlb

--•□-■- Тс uicic u[ пые

" МНК

--А--1"I>c4iicieiri ние

"Ml IK.

oñpaomaiHUje Нмф

Рис. 3. Влияние нмунофана на чувствшсльность лимфоцитов человека к ангипролифераишиому эффеюу дексаметазона

Примечание: приведённые на рисунке данные являются суммацисй девяти отдельных экспериментов.

обрабатывали дсксаметазоиом и пмунофаном, а фитогемагглютптшном.

КОНЦЕНТРАЦИЯ ДККСАМКТ л (ОН А (М)

* - эта часть рабош выполнена совмеепю с младшим научным софуднпком лаборатории н.ммупотспешки МГПЦ РАМП А.В. Данилиной

Полученные результаты показывают, что культивирование с дсксаметазоном контрольных (не инкубированных 48 часов) клеток существенно снижало пролиферативный ответ лимфоцитов на фитогемагглютиннн. 48-часовая инкубация интактных клеток in vitro значимо повышала резистентность лимфоцитов к аитипролиферативному действию гормона. Обработка лимфоцитов одновременно имунофаном и дексаметазоном статистически достоверно повышала чувствительность резистентных клеток к аитипролиферативному эффекту дексаметазона, но полного восстановления чувствительности не происходило.

4. Влияние глгококоргикоидных гормонов, ингибитора синтеза белка циклогексимида, а также иммуномодулитора имунофана на aici nniioci ь Ca2t,!\1g2+-зависимой эндомуклеазы в лимфоцитах периферической крови человека

Одним из последствий запуска апоптотического каскада является олигонуклеосомная фрагментация ДНК, осуществляемая Ca2+,Mg2+-3aBnciiMon эндонуклеазон(Мс.Сопкеу et al., 1989; Aagaard-Tillery et al., 1995). Активность этого фермента легко выявляется in vitro путём инкубации изолированных ядер в присутствии ионов Са2+ и Mg2+ (Cohen et al., 1984; Khodarev et al., 1996). Следует отметить, что в зрелых лимфомдных клетках, в том числе в лимфоцитах периферической крови человека, активность Са2 \ М g2 * - з а в и с и м о й эндонуклеазы обнаружить не удалось (Duke et al., 1986; Lindhout et al., 1995). Это позволило некоторым исследователям предположить, что Ca-\Mg2Ma гшеи мая эндонуклеаза вообще отсутствует в таких клетках (Lindhout et al., 1995). Тем не менее, нам удалось получить результаты, опровергающие эту точку зрения.

Представленная на рис. 4 электрофореграмма иллюстрирует результаты опытов, в которых лимфоциты периферической крови человека инкубировали с имунофаном и ингибитором синтеза белка циклогексимндом в течение 1 часа, затем отмывали и культивировали ещё 4 часа. По окончании инкубации клетки осаждали и оценивали состояние хроматина и активность Ca2+,Mg2+-3aBiicnMori эндонуклеазы в изолированных ядрах. На рисунке нечётные дорожки под номером I содержат ДНК, экстрагированную из интактных неинкубированных ядер. Чётные дорожки под номером 2 содержат ДНК, полученную из ядер, преинкубированных 2 часа в присутствии ионов Са2+ и Mg2+. На рисунке видно, что элсктрофоретический анализ ДНК не выявил признаков деградации

хроматина как в интактных лимфоцитах, так и в мононуклеарах, преинкубированных с имунофаном, циклогексимидом или имунофаном и циклогексимидом одновременно (нечётные дорожки). После двух часов инкубации изолированных ядер с нонами Са2+ н на электрофореграмме можно было

наблюдать типичную картину, свидешн.овукмцую о деградации ДНК лимфоцитов, обработанных имунофаном, циклогексимидом или двумя препаратами одновременно. О распаде ДНК па о1дельпые олингонуклеосомныс фрагменты говорит образование характерной "лсспшцы"("леддерный" характер фрагментации хроматина). Такая фрагментация свидетельствует о высокой активности Са2+,\^2+-зависимой эндонуклеазы. В ядрах интактных кпегок существенной активации эндонуклеазы в присутствии ионов Са2* и не

происходило.

«

Рис. 4. Электрофоретический анализ состояния хроматина в МНК человека, обработанных имунофаном (0,25 мкг/мл) и/или циклогексимидом (30 мкг/мл)

Примечание: I - ДНК экстра! ировапа т интактных ядер.

2 - ДНК получена п< ядер, инкубированных в присутствии ионов Га21" и

В следующей серии опытов исследовали влияние глюкокортикоидных гормонов на активность Ca2+,Mg2+-3aBHciiMofi эндонуклеазы в лимфоцитах периферической крови человека. Полученные результаты представлены на рис. 5, из которого видно, что активность эндонуклеазы в интактных лимфоцитах крайне лабильна и зависит ог времени инкубации клеток in vitra. Так, после 6 часов культивирования активность фермента в изолированных ядрах интактных мононуклеаров составляла 30 абс. ед., после 12 часов инкубации активность СМЭ значимо возрастала и достигала 89 абс. ед., и, наконец, к 24 часам инкубации активность эндонуклеазы снижалась до 50 абс. ед.. Обработка МП К человека дексаметазоном в высокой концентрации (105 М) приводила к существенному усилению активности эндонуклеазы уже через 6 часов инкубации клеток с глюкокортикоидным гормоном. Уровень активности фермента оставался высоким через 12 часов и 24 часа культивирования лимфоцитов с дексаметазоном.

Близкие результаты были получены при инкубации клеток с предннзолоном.

500

450

400

ГЧ

S 350

и

300

£ 250

О S 200

а 150

jjjj 100

50

0

6 часов 12 часов 24 часа

ВРЕМЯ ИНКУБАЦИИ

120

100 >

80 > 5

и s

60 п о Р

40

20 и

0

ï Контроль

Дексаметаэон

-Активность СМЭ в интакгных МПК (абс.ед.)

Рис. 5. Влияние дексаметазона на активность Са2+,\1к2+-зависимои эндонуклеазы в мопонуклеарах периферической крови человека

Таким образом, воздействие самых разнообразных агентов (глюкокортикоидных гормонов, ингибитора синтеза белка циклогексимида, а также синтетического гексапсптпда имуиофана) существенно повышало активность фермента в мононуклеарных клетках. Поскольку ингпбиция синтеза

белка сама по себе стимулировала эндонуклсазу и даже усиливала активность фермента в клетках, обработанных нмунофапом, то можно предполагать, что Ca2+,Mg2+-3aBHCiiMaH эндонуклеаза не синтезируется Je novo, а постоянно ирисутствуег в лимфоцитах периферической крови человека в виде неактивного предшественника или в комплексе с белком-ннгибнюром (Nelipovitch et al., 1988; Cohen et al., 1992).

В дальнейшем изучали совместное влияние имунофана и дексаметазона на апоп готические процессы в моионуклеарах периферической крови человека.

Как видно на рис. 6, в интактных моионуклеарах активность фермента крайне низка и не превышает 30 абс. сл.. Шестичасовая инкубация клеток с дексаметазоном статистически достоверно усиливала активность эндонуклеазы в лимфоцитах человека. Импульсная обработка клеюк имунофанам также приводит к существенной стимуляции активности фермента. В то же время, инкубация с дексаметазоном лимфоцитов, предварительно обработанных имунофанам, отменяла стимулирующий эффект, который каждый из ирепартов оказывал в отдельности. Диалогичные результаты были получены при одновременной обработке клеток имунофаном и предиизолоном.

АКТИВНОСТЬ смэ

ВОССТАНОВЛЕНИЕ МТТ

160 т

Т 1-6

- 1,3

-1,5

-1,4

-1.2 8

О о

[Г

1,1

■ Контроль

□ Дексаметазон ОИмунофан

□ Имунофан и дексаметазон

Рис. 6. Влияние имунофана и дсксамстазопа на активность эндонуклеазы и восстановление M IT в лимфоцитах человека

Следует отметить, что оценка количества погибших клеток с помощью окрашивания трипановым синим не выявила снижения жизнеспособности в экспериментальных группах, обработанных глюкокортнкоидными юрмонамн, имунофаном или двумя препаратами одновременно. Так, количество погибших (окрашенных) клеток не превышало 4" о после 24 часов куль нитрования клеток in vitro в присутствии дексаметазона пли имунофана.

Справа на рисунке представлены результаты опызов, в которых изучали влияние имунофана и дексаметазона на интенсивность восстановления МТТ моноиуклеарными клетками. Жизнеспособные клетки восстанавливают водорастворимый краситель жёлтого цвета МТТ до не растворимых в воде фиолетовых кристаллов формазана (Sieuwerts et al., 1995). Восстановление красителя осуществляется митохондриальными ферментами, поэтому количество образовавшихся кристаллов формазана зависит от жизнеспособности клеток и метаболической активности их митохондрий (Mossman, 1983; Kaneko et al., 1995). П этих опытах лимфоциты периферической кровп человека нрепнкубировали 1 час с имунофаном, отмывали и культивировали ещё 4 часа в присутствии дексаметазона. МТТ добавляли к клеткам за 3 часа до окончания инкубации. На рисунке видно, что обработка мононуклеаров человека дексаметазоном значимо снижала их способность восстанавлнвап, МТТ. Сходным образом, инкубация клеток с имунофаном статистически достоверно снижала интенсивность восстановления красителя. Культивирование обработанных имунофаном клеток в присутствии дексаметазона отменяло шнибпрующий эффект каждого из препаратов в отдельности.

Таким образом, на рисунке видно, что активация эндонуклеазы в лимфоцитах человека сопровождается снижением способности клеток восстанавливать МТТ, что свидетельствует о нарушении метаболической активности митохондрий. Это означает, что при стимуляции дексаметазоном или имунофаном лимфоциты человека вступают в латентную фазу программированной клеточной гибели, что сопровождается такими физиологическими изменениями, как снижение восстанавливающей функции митохондрий и активация Са:+Д^2+-зависимой эндонуклеазы. Однако, по неизвестной причине клетки задерживаются в латентной фазе апопготической гибели по меньшей мере на 24 часа, поэтому в этот период не удастся обнаружить пи фрагментации хроматина, пи снижения жизнеспособности клеток.

к.

5. Влияние растворимых факторов с молекулярной массой 70000-80000 на активность Са2+,Мй2Мависи\1ой эндонуклеазы и пролиферацию лимфоцитов преифсричсской крови человека*

Приведённые выше результаты показывают, что влияние имунофапа иа активность Са2+,М§2Мавпспмои эндонуклеазы можно определить уже через 4 часа после обработки клеток препараюм. И свяш с этим было предположено, что эффекты имунофана могут опосредоваться растворимыми факторами, которые продуцируются в культуралытую среду в очень ранние сроки. Чтобы проверить это предположение были поставлены специальные эксперименты, в которых мононуклеары инкубировали I час с имунофаном в концентрации 0,25 мкг/мл, отмывали и культивировали ещё 2 или 4 часа в среде без добавления сыворотки. По окончании инкубации клетки осаждали, супериатанты собирали. Растворимые факторы получали путём I ель-филы рации надосадочных жидкостей ннтактных н обработанных имунофаном лимфоцитов. При исследовании эффектов полученных фракций выяснилось, что итп ибирующее влияние имунофана на пролиферацию и продукцию фактора некроза опухоли может опосредоваться растворимыми факторами с молекулярной массой 70000-80000, полученными из 2 или 4 часовых надосадочных жидкостей лимфоцитов, нреинкубированных с имунофаном. В связи с вышеизложенным в следующей серии опытов исследовали влияние факторов с молекулярной массой 70000-80000 па пролиферацию лимфоцитов человека, обработан и ы х дексам ета зо и о м.

В этих экспериментах МПК человека стимулировали ФГА (5 мкг/мл) в присутствии дексамстазона (105 М) и растворимых факторов (в разведении 1:7). Клетки культивировали 72 часа в полной среде во влажной атмосфере, содержащей 5% СО:. Пролнфсрагивпый ответ оценивали по включению 41-тимидина. Полученные результаты представляли в процентах к контролю, которым являлись клетки, стимулированные ФГЛ в присутствии дексаметазона. Как видно па рис. 7., уровень пролиферации МПК, инкубированных с фракциями РФимф, был достоверно ниже пролиферашвното ответа контрольных клеток. В то же время присутствие фракций РФ,, не влияло на анптнролиферативное действие пнококортикоидното гормона. Следуе! оIметить, что добавление в культуру М11К, обработанных лсксамоаюпом, растворимых факторов с молекулярной массой 150000 не оказывало значимою эффекта па пролиферацию этих клеток.

* - эта часть работы выполнена совместно с Л И. Данилиной и В.М. Писаревым

Рис. 7. Влияние растворимых фактории на пролиферацию лимфоцитов человека, обработанных дексаметазоном

Примечание: РФ» - растворимые факторы, полученные из 2-4 часовых надосадочных жидкостей ннтакзных MIIK человека.

РФнчф - растворимые факторы, полученные из 2-4 часовых супериатангов МНК, обработанных Имф.

В дальнейшем исследовали влияние растворимых фактров с молекулярной массой 70000-80000 на активность Ca2\Mg2MaBiiaiMoiï эндонуклеаэы. В этих опытах клетки инкубировали 6 часов с дсксамекпоном в концентрации 10"5М и фракциями в разведении 1:10. Количественная оценка ферментативной активности (рис. 8) показала, что доб; шлемне фракций РФ,,ч,<|, в культуру МНК, обработанных дексаметазоном, отменяло активацию СМ'), наблюдаемую в лимфоцитах, инкубированных только с глюкокортпкондным гормоном. Так, в присутствии РФ,™,], активность эндонуклеаэы не превышала 50% уровня активности фермента в контрольных клетках. Следует отметить, что ингибирующе влияние растворимых факторов, полученных как из двухчасовых, так и четырёхчасовых супернатантов преннкубпрованных с Имф лимфоцитов, было статистически достоверным согласно критерию t Стыодента. В то же время фракции, выделенные из надосадочных жидкостей шпакшых МНК, не оказывали нпгнбиругошего эффекта на активность СМЭ. На рис. 8 видно, чю в присутствии четырёхчасовых РФ,, активность эндонуклеаэы была шачпмо выше уровня активности фермента в контрольных (инкубированных только с

глюкокортикоидиым гормоном) клетках. Растворимые факторы, полученные из двухчасовых супсрнатантов иптактных МНК, не влияли на активность эндонуклеазы в обработанных дсксаметазоном лимфоцитах человека.

□ Дексаме газон

□ Добавление РФн

2 часа 4 часа

ВРЕМЯ НМКЯ.ЛЦШ! ( ПМУПОФЛМОМ

Рис. 8. Влияние растворимых факторов на активность Саг+,\^2+-зависимой эндонуклеазы в лимфоцитах человека, обработанных дексаметазоном

Примечание: РФ,, - растворимые факторы, полученные из 2-4 часовых надосадочных жидкостей пнгактных МНК человека.

РФ„„ф - растворимые факторы, полученные из 2-4 часовых супернатантов МНК, обработанных Имф.

Таким образом, очевидно, влияние имунофана на пролиферацию и активность Са2+,М§2МависимоГ| эндонуклеазы в системе обработанных глюкокортикоидами лнмфоциюв человека может опосредоваться растворимыми факторами с молекулярной массой 70000 - 80000, которые обнаруживаются в надосадочной жидкости уже через 2 пли 4 часа после обработки клеток нммуномодулятором.

6. Влияние растворимых факюров на чувавшелыюаь клеток линии 1.-929 к цитотоксическому эффекту рекомбпнантного фактора некроза опухоли*

Установлено, что пш ибпрующее влияние имунофана на продукцию фактора некроза опухоли опосредуется растворимыми факторами с молекулярной

* - эта часть работы выполнена совместно с A.B. Данилиной и В.М. Писаревым

массой 70000-80000, полученными из надосадочных жидкостей лимфоцитов, преинкубированных с препаратом (Писарев и др., 1995). В связи с этим было предположено, что фракции, полученные из надосадочной жидкости обработанных имунофапом лимфоцитов, способны непосредствепо связываться с фактором некроза опухоли, уменьшая активность этого цитокипа. Чтобы проверить это предположение, изучали влияние растворимых факторов с молекулярной массой 70000-80000 па чувствительность мышиных фибробластов линии Ь-929 к цнтотоксическому эффекту рекомбинаншого факюра некроза опухоли.

Па рис. 9 представлены результаты опытов, в которых клетки инкубировали 18 часов в присутствии рекомбинантного фактора некрота опухоли и фракций. Об эффекте цитокина судили по интенсивности окрашивания клеток кристалл-внолетом. Результаты представлены в единицах оптической плотности. На рисунке видно, что добавление в культуру фибробластов растворимых факторов, полученных из надосадочной жидкости интактных клеток, не влияло на токсический эффект цнтокнна. При культивировании клеток линии Ь-929 в присутствии фракций, выделенных из супернатамтов обработанных имунофапом лимфоцитов, наблюдалось значимое повышение резистентности фибробластов к воздействию рекомбинаншого факюра некроза опухоли.

£ 0,6 т О

0 0,55 +

1 ~

3

к о

з о

В рЕ

ш О

°'5 ~' г ■ ""Ч Т

0,45 -(• _]_ 'ф ' т |--

, И

---1--

"Г

Пеимлульсная обработка фракциями

Импульсная обработка фракциями

ОрФНО=125 пкг/мл

□рФНО+РФн

□рФНО+РФимф

Рис. 9. Влияние растворимых факторов на чувствительное и» клеток линии 1,-929 к иигогоксическому эффекту рФНО

Следующие опыты были поставлены таким образом, чтобы исключить непосредственное взаимодействие цитокипа и факторов. Фнбробласты линии I.-929 инкубировали 1 час с фракциями, тщательно отмывали, а затем обрабатывали рекомбинантным фактором некроза опухоли. Клетки культивировали 18 часов, затем окрашивали кристалл-виолстом. Па рисунке видно, что импульсная обработка фибробластов линии I .-929 растворимыми факторами, полученными из надосадочной жидкости обработанных пмунофаном лимфоцитов, существенно повышала резистентность клеток к цитотокснческому воздействию рекомбннантного фактора некроза опухоли. Часовая преинкубацня с фракциями, полученными щ супериатантов ипгакгных клеюк, не оказывала существенною влияния па чувствительность клеток линии 1.-929 к цшокнну.

Таким образом, проективное действие (фракций не зависело ог их непосредственного взаимодействия с цнгокнном. К сожалению, "смягчение" токсического эффекта рекомбинананюю факюра некроза опухоли на I.-929 и другие чувспимсльные к цшокнну клеючные липни не являемся специфическим свойством ог раниченной I руины белков (I НуисЫ с1 а!.. 199(); .1ааНе1а, 1993; РарНат е( а1., 1993). Эю означает, чго полученные роульгаш не позволяют судить о природе растворимых факторов с молекулярной массой 70000-80000, выделенных из супериатантов преннкубпрованных с пмунофаном клеюк.

ВЫВОДЫ

1. Глюкокортикоидные гормоны, ингпбнюр сип кча белка циклогексимид, а также синтетический гексапенгнд имунофан вызываю! акшвапню Са2+,М§2+-завнснмой эндонуклеазы в лимфоцнгач периферической крови человека. Активность фермента легко выявляется ¡и \itro путём инкубации изолированных ядер в присутствии попов Са2+ и

2. Активация Са2+,М§2+-завнсимой эпдопуклеап.! в лнмфоцшах нернферпчеекой крови человека не занпеш ог лополншельно! о еншеча белка.

3. После вступают

обработки дексамстазопом пли пмунофаном мононуклеары человека в латеншую фазу анонима. признаками ко юрой являются активация

Ca2+,Mg2+-3aBiiciiMon эндонуклеазы и снижение восстанавливающей функции митохондрии.

4. Пмунофан значимо снижает пролиферативный огвег лимфоцит» человека на Т-клс!очные мтогсиы конканавалин А и финнема1 пюпппш.

5. В условиях культивирования in \ilrn пмунофан повышает чувствительность лимфоцитов человека к аитннролифсративному действию т люкокоршкоидов.

6. ! I рису I с I иие в инкубационной среде свободных ионов C'a'1 является необходимым условием для нншбнруюшею влияния имунофапа и обработанных им клеток на пролиферацию лимфоцитов, стимулированных Т-клеючными мигогенамн. Напротив, влияние нммуномодулятора на индуцированную лнпополисахаридом продукцию фактора некроза опухоли не зависит от содержания в среде свободных ионов Са2+ в период вкшмолсйствпя препарата с клетками.

7. Импульсная обработка лимфошпов человека пмунофапом вы н.тваст продукцию растворимых факюров с молекулярной массой 70000-80000, которые обнаруживаются в надосадочной жидкости уже черсч 2-4 часа после обработки клеток препаратом и окатывают следующие эффекты:

1 ) усиливают а/т шттролпфера тшшое деист ште i дмко\оршкоидон;

2) отменяют активацию Ca2+.Mg:+-3aBnciiMoii ■)ндонуклсазт.1 в обработанных дексамета¡омом лнм(|юциiax человека:

3) повышают решететпноегь клеток лишит !.-929 к шпоюксичеекому )ффекту рекомбннашно! о ФИО-«.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ГЕЛ1Е ДИССЕРТАЦИИ

1. I'isarev V., V. Volgina. A. Danilyna, G. Shmarina, I. Ikachieva, A. Tntelian. Modulation of corticosteroid-induccd apoptosis in human lymphoid cells. 12th European Immunology Meeting. - Barcelona, 1994. p.220.

2. I'isarcv V.M., CJ.V. Shmarina, A.V. Danilyna, V.V. Volgina, 1..A Pevnitzky. TNI7 and drug-induccd TNI7 receptor-related soluble factors modulati endonucleuse activity induced by corticosteroid hormones in human blood lymphocytes 4th International Congress of Immunology. - I ISA, 1945. p. 92.

3. Писарев B.M., Шмарииа Г.В.. Данилина Л.15., Bojii ина В.В., Лебеда В.В. Лекарсч венная регуляция коммггшровапня лимфоцитов человека i апомтошческон гибели. - Кошрссс "Человек н лекарство". Тешем докладов. Москва. 1995. - Сгр. 141.