Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Механизмы активации сокращения гладких мышц аорты при действии вазоактивного пептида эндотелина-1

и,

КиЖСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ СИВИГСЗПЯ ГОСУЛ.\?СТШ2ШИ НЕШШОЙП! УНИВЕРСИТЕТ

На правая рукописи

эагу/ША Лиана Владимировна

1КШШНЫ А1ПТГВ,%ПШ ССЖРАЗЕЗШ ГЛАД2ДХ ЕКШ АОРТИ ПРИ ЛЕгСТЕЗИ ШЗСАХЕЕШГО ПЕПТИДА ЗВДУПУША-1

1». со. 17 - нормальная Физиология

авторе». 2 раг ■

дадгссзэтатда на со^-::сзнке ученой стеяэ;ш кандидата нокипинсхш* тгл

томск - 1992

Работа выполнена на коядре ^гаиохогг.;, С/Лпрского

Государственного медацннского университета к в здсзрзхоркя ш-тофкзждагки ЮЗ! педиатраа рдиа,

Катет® руководители: Ахадэк« РАЕН, член.-корр. рдг&, грс^ссср >1Д.Е%£е£;з( доктор иедацааяся ваук, грофбосср КИШрков, догаор ьэдкцдаекгк каук, крофбесср II ¿1 Еаакааг

Офкцлаака оппонента йзкгор -^адасккх кс.ул, профессор а £ Лчоехэа, ка^кс.:.: гг.дладяск»^ • ыхга, стврдй научная еотрудшл С. А. нзсьс^.

Вадг^е ггро^я^е: Ейститу? пзюаопш и ватофовалот! (г.&хкга).

Едз^ла состоит«; " " 1292г.

в мооон ка ааседанза спечй&гкзпроьаакого совета Д 08-!-. 28.02 Ся05;>г;х>го Государственного 1»здиц»шского униьерскге»а (63-4050, г. Томск, ул. Шсковскзтй трак?, 2).

С диссертацией юга ознакомится в библиотека Севрского Государственного мэдицинского университета (ул. Лэвява,1а7)

Автореферат разослан " " 1892г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор уэднцишшх паук, профессор

Т. С. Сидорова

ЛХТУЛЛЫГОСГЬ.

одноя из актуалькчх задач недишны н физиологии кровообращения является исследование зядогенгеге регуляторов сократительной функпии гладких инзя сосудов. Особого внимания заслуживают взаимоотношения эняотелиадышя и гладхсюаечяик клетск. Изучение эндотелий-зависишь сократителышч рвакпня сосуяоэ привело к обнаружен!!» в то-з голах ондотелия-зависимого расслаблявшего Фактора (еи?ю (Гагсьвоь я. г.гауайзк! х V., »980). В кокад 80-я годов уапавхааиа к. et аь (1959) выделили высокоактивная вазоконстргаггорный пептид - эндотелии. Сосудистые гладконгаечдаэ клетки в ответ на его воздействие етвэчают медленно развивастпися сокращением, в последующей было показано. что в органазие няекопитатга з разная тканях синтезируется. по крайней мере. з типа эндотелвдов - эт-ь-г. - з; из которых. только -зт-1 имеет зняотелиал&нов происхождение <гчш а. вг ах,. £990! ига н. ег аь. 1990).

сояеразние эт-1 в сыворотке крови, молоке, спинномозговой жидкости коррелирует с иатологическита процессами. затрагивающими эта системы. уровень эт-1.г,5 вовшавтся при таких состояниях, как ин-фзркт ниокарда. шок. почечная недостаточность <лпвзаг<1 et аь, 1990. ьегаап ег . 1990). предполагают, что сне рос от-1 в коронарных сосудах может гаэивать внезапную останоску сердпа (Ьатъак ег а1.. 1969! гона в1 аь. 1990).

несмотря на иятенсив:гаэ исследования до настоящего времени нет УСедительнкз экепэрглвнталыпп данных. позволяли» сулить о ие::а-нязиз2 акткзадки гладкоттчщи клеток эпдотелинсн-1. сукмствувстэ гипотезы противоречиво овьясняэт иенаниаи действия этого пептида.

келью настоящего исследования явилось изучение физиологически:: ивнанизмов действия эндотелкна-1 на сократительную активность и динамику изменения елутркклэточноп кондэнтрзпии калыгая гладких кша аорта,

В соответствии с яель» ешвд поставлена следующие 5А,гл»-ш:

1, Исследовать сократятешшэ ответа и динамику пнутгнклоточ-ноя коняентрапии своводныя ионов кальдия гладконшачнот клеткок аорта крысы при воздействии эг-1. «енилэ^рина и хсь

2, Изучить роль внеклеточная ионов кальпия ъ рэг.пизашш сокра-тительпкх ответов >ладкия кшш аорта на 'действие и-1 и выяснить пути ия поступления з гладкошзгчныэ клетни.

3, исследовать роль натриа-сротокного обмена в сократительной реакпии гладкик нкаа аорты крысы на деяствш эт-1.

1. изучить роль ns-c в Формировании сократнтгяьпкг ответов гладких ншш аорта на действие зт-1.

научная кобизнл.

Бпэреыо изучено соотношение изжду изменениями внутриклеточной конаеютаиш ионоЬ кальдия и сократительной активность» гяаикскц-печного препарата аортн при дэйстек: гт-i. Установлена когроляк-м иевду силой, скоростью и прояоякитеяььость» смичтигеввшя и кьль-снггчх ответов гладких даак аоют при д..-;хгекя эт-i, показано, что кинетика сократительного и кальциевого стезта на действие эт-1 существенно отличается от такокдк sipk дегхтеии и KCl. Euspdüs установлено. что сокращение гладкий Г£зд аорти индуодровашое зкмото-.таном-i генерируется при маньзом уровпз 4луор0Своитного сг.гаада.1 кальанезого индикатора, 'чн ?авзап по силе сократительная реаюса. зазванная. и KCl,

показано. чт> основу» роль е «огаироваиш сокгатателыиго ответа глад:«:;; гада сорта при дейстгк; эх -1 кгрсйя сяеклеточика кя:.'. кальпяк. поступо вке&гшпиячгвста'лмышн и гглозышкирсшс-Ts:ir<uW кгльпиеиин кгкзлан. соотасизнив количества коаоа каяыда. поступавши по этим тапак каналов регулируется вгличияос иембраего-го потенаиала: при деполяриэавдм гяадкиа шет аорта гаперкаакевкн раствором вклад кальдия, входяссго п» ии*еиатнрезистбитоы?1 каиалаи уненьзаетси. оекарзггеао. что двазляркзадия» »зашикрувслл тиасшша-чувстаятельнкл вяод калымя ори деасткгн эт-1. обусловлена езстгс-лапиен в гладкомиягчпке платка ионов натрия по рскгвторуаразляоым каналам.

вперЕыэ получены яанниэ.. свидвтельстаясскв в пользу того, что натрий-пготонный обмен пвляэтся оииш из компонентов кэаашзма отрицательной обратной связи, ограянчнгахикх пеличнну сскратитольтго етззта на депстеи® эт-1. Показано участке ns-c с Фсрктаоваша сок-гатателышя ответов на действа® эт-1.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЛЕО'Ш.

Настоявая работа вносит вклад в развита® ФУнддлзкталышз представлении о роли эндотелия-зависших Факторов, коктролирэтошя сосудистый тонус, а также о механизмах. нспольэуемня эндотелия -провувдруеикм вазоколстрикторон энготвлинон-i для регуляпки сокра-

- 3 -

тительноз активности гладкая ккзд сосудов.

полученные данные имеют значение для выяснения роли потенпиал-зависимого я редепторуправляемого входа ионов кальция в Формировании зндотвлиз-иядупированного сокравения. на основании проведении* исследования сформулировано положение о роли кальпщфосфолгаиш за-внсимой протеинкгаазы (ПК-С) и иатрия-протонного сенека в сократительной ответе гладких нша аорта при действии экдотелина-1.

получешше экспершентальныо данныэ могут быть использованы при разработке средств и способов Фармакологической коррекаии патологических состояния, связанных с наргоением «ункпии гладких ншш сосудоз. а такхе служить теоретако-зкепэрнмеятальной базой целенаправленного поиска новых модуляторов сосудистого тонуса. Результата исследования будут способствовать изучении патогенетических меха-низиов спастических состояния артерий.

. Основные положения работы могут сыть использованы в курсе лек-пиа по физиологии и биофизике.

разработанный методический прием, позволяют® одновременно кз-иерять сократительную активность и данамику изменения дитозольного кальция глздкоюдачных препаратов, дополняет перечень методов исследования Функпвд гладкиа ншга, этот метод используется в лаборатория мемераяологии наи педиатрии мзд рф и на кафедре биофизики сибирского государственного медицинского университета.

апроеадия работы, материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "люминесцентный анализ в биологии и медицине* шоск-ва.1992». Международном симпозиуме "Structure and function of reíuiatorr poupeptidss" (Милан.1992). всероссийском симпозиуме •Патофизиологически» анализ Факторов риска артериальной гидертеяпш н атеросклероза* (Новосибирск.1992).

структура и объел диссертаций, диссертационная работа состоят из введения, литературного овзора. методики исследования, собственных результатов исследования и ий обсуждения, заключения и выводов, робота содержит tas страницы итазюписного текста, в тон число гг рисунка. 2 таблизы, список использованной литературы шикзчает гоа названий, из них si отечественное и íes иностранных.

МАТЕРИАЛЫ и ИЕТОДН.' работа била проведена на чоо крысах самцах лижи wistar массой ieo-гго грамм.

осьектом исследования являлись спиральные полоски, приготовленные из грудного отдела аорта крысы, эндотелий удаляли продувани-

- 6 -

ен воздуха в течение зо секта,

в газете использовались следующие растворы; нормальный раствор кресса; наа ¡зоеи. KCl 4. спя. сасгг ьзш. Kscia ьгяа. kefes юам. глюкоза ЮПИ.

Безнатриевкя раствор кресса готовился эквиноляршн заневешем KaCi на II-нетал-п-глукании или ялория литая.

Бескальпиевьа раствор готовился путен замепения в нормальном растворе КРебса всего cacie соответствуете. количество» nssi я до-«зпикия згга (0.5 ни).

для приготовления то ist гиаеркаяневого раствора 70 ни Kaci эа-кеогали иа 70 «и KCl; в мн гшеркалиевом растворе оставляли 33 кн кась

сля регистрапш! сократительной активности полоски аорты использовала изокетркческил датчик силы 57-1 и регистратор Gezam} (Ueo Еазеппе), Препарат находился в тег-костатируекоя камере (37 град о, заполненной азрируеньы кнслородоп раствором крссса гн т.ч. ксходяая аагрузк?. составляла 1.5г. в этих усаоюшх препарат лдго-дился а тачании ;с-&о кинут.

ялй исследования динамики изменения конвентраяш питозег.ькоге калын:я иезользоьали Флуориметрическия нетод с применением кальза-чузствательного индикатора fura-г. этан зоняон нагружали глгдконк-иечкш препарата аорта, для этого полоски аэртк шкУбюоваля б течение часов в з кл раствора Крсбса. содержащем 9мг еса. 5r.se. fura-s/AH. о.огх плюроника r 127, при постоянной встрягстаюш. вк: теипературэ го-аз град с, плвроник г IST способствует сооэбнянзааю больпик молекул эоиаа в «'.зиологическон растворе и лучшему проник-нонет;» fura-2 а глаккокнавчкке клетк;: препарата.

Нагрзаеиння iura-г препарат аорты Фиксировали в кварвевоя кювете спектеофлуоринетра "Spex" (USA). соединяя один конец полоски < регистратором сократительной активности, для обпучеия использовал! два нонокроиатора на длинах волн зад и зео км: препарат ваходилс: по углом 9 о град к падаяяенг сучу. Эниссвонюа сигнал принимался по; углом юграя на 5Ю нн. Едаииа селс-я на трех моаохроиаторах 0.5Ш1 йсчет абсслэтниз значения концентрации питозольного кальяия и проводился из-за частичного вытекания красителя и накопления его межклеточной пространстве, что искажает значения интенсивности Флу оресаендии.

при работе с Флуоресдентнкни эондаки. тагами как fura-г. необ

водимо учиглать то. что в процессе функционального ответа з метке вараватызаются зеиества (над, наян, фал и др.). имеюпге область свечения влизку» к краситоляи. поэтому до работы с нагруженными клэткаи:: снимались показания аутофлуоресдендии. т. е. естественное свечение клеток при различии* воздействиях, которое может накладываться на Флуогесаенпию связанна с fura-г.

для того чтоба определить вклад гутофлуореспентного сигнала в осния относительный Флуоресянтния сигнал нагрухенноя fura-2 полоски аорты провели серию контрольны* экспериментов на препаратах без са-вндикатора. эксперимента показали, что при воздействии эт-i, zci, >Э наблюдается однонапглвлоннов и близкое по значений изменение интенсивности Флуоресяениии на зчонм и звонн экстинпии. поэтому относительный Флуоресцентный сигнал гак аорты при этих воздействиях но изменялся, следовательно, при исследовании кинетики изменения концентрации яитозольного калытп нет иеобкодиности учитывать собс-гвеииую Флуоресценция гладкогалзечнщ меток аорти.

'РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ H ИХ ОБСТЯДЕНЙЕ.

эадотелин-l от-п в конвентрадияк о, i-гонн вызывал дссозави-:кное медленно развивающееся поддерживаемое сокращение деэндотели-эировашои спиральной полоски грудной аорта, при удалении эт-t из жруяжзего раствора на б-10 минуте после пагода секрасзшга нз плато, через 4-5 минут начиналось расславление и в еольсинстае случаен через »0-90 минут механическое напряжение снижалось до уровня.

5лизк0г0 к искодиону 1п;8) (рис. 1».

рис, 1, сократительная реакция га асрта при воздействии sei с то мИ!, ФенилзФряна (1 нкп;. ЭТ-1 (5 НИ).

ксгта-м вы эт-1 SM При последовательное введении равныа доз зт-i амплитуда втсро-■■о сокращения составляла лишь (401в)% от первого m=6i. Это явление зехоторые исследователи объясняют десенситиэгшиэй гладкомшечннх

- е -

клеток (гик), связанной с интегнализапией налодиссоииирутегб эх-1-редепторного комплекса (Resinü т. j. et ai..i990). поэтому при исследовании механизмов эндотелии индуцированного сокращения гладкая мкид tras аорта для опенки различных Факторов нельзя было использовать в качестве контроля сократительную реакцию на первую добавку эт-1. ш оиэнивали силу сократительного, ответа в от ампдлтуда сокрашения того же препарата на 1мм «ош;яэ№нна (ФЭ) (рис. ек .

рис. г. зависимость силы сократительной реакции ГН аорты от концентрата;; <с> ЭТ-1: а) контрольных препаратов. ¡6) в бескальциевом растворе, в) после обработки нивевшзинси. по оси ординат - сила сокра-шенкя в х от амплитуды ответа . 1 на 1нкн «э.

для выяснения особенностей сократителышв геакпий га аорта активированный от-i изучались реакщщ сосудистой полоски при действа ЭТ-Ь 4>у и ЕС1,

обрекает ка себя внимание различие сократительных реаквиа. вызываемых эт-i. ФЗ и reí. сокращение, вызываемое эт-l не имеет выраженной Фазной конаонента, которая, по литературным ванный, обусловлена мобилизацией кальпия депонированного саркоплазматачэсзшм ретикулуиом клетки, а также входом кальпия по быстрым потешшалза-висыает калкшевш каналам, скорость увеличения механического напряжений гн до максимального уровня при действии эт-i зависела от концентрации пептида и была меньше чем при действии Фэ и KCL, значения этого параметра представлены в таблице 1. максимальная амплитуда сократительного ответа была существенно больше для эт-l. чем для фэ и КС1.

таблица 1. скорость нарастания механического напряжения га аорты (нг/нин) при воздействии кп.сэ.эт-1

КС1 70MH КС1 130МН 43 О. 1МКЙ ФЭ 1MKK ЭТ--1 1НК ЭТ-1 зян

Htm п <№±3 б 4144 б £OiE б ег*з в 510. 5 б ii±i в

ФЛУОРвсяанттшя анализ кинетики внутриклеточного .ионизированного кальяия в полоске аорта важнэпиии звеном в книаиадин сокращения ншя является увеличение внутриклеточной концентрата:! ионов кальция, в связи с этим нами была изучена динамика кальвиеп« ответов и сократительных реакпий ГН аорта при действий ЭТ-Ь ФЭ и ес1 с псиссыэ Флуоресцентного индикатора ионов кальдия Д1га-2 (рйс.зк

В проведешшк исследованиях установлена корреляаиа нажду :r;v никоя сократительного кальциевого ответов гц аортн kpucu зчтиз'-.о-санных зт-1, S3 и sei, Амплитуда сократительного ответа при iioi-> гат коядентрашш эт-t и фэ увеличивалась соответственно относительного Флуоресцентного еппала fura-г (табл. 2). относитоль-шз елуорвепентгш светя в враг: /стзии эи. фэ и sei ъеглюжпгчкя на урогпе. отлично» от баэально'го. на всем протяжояга ссчротятгдь-ного отзета, это дале нзн основания судить об нэ"0К',>л'"1 ■•енпелтра-щга здггозольяого кааьвая по аинаник» сократнтзльиол гвшепа гладко-кшечного препарата аорты.

Били шзвлены существенные отличия кзльгиезнк ответов га активированных эт-1 от ответов на фэ и KCl. сбгаглют ка себя внимание слэдувш19 особенности. Бо-первнн, при м&стзки ihm и 9нн зт-i па грани прироста иенанического напряжения оппстш'лыыя Флуореспент-!ПЛ сигнал увеличивался на 0. но, Ol етн. ед. uuai, это же паганетр

¿Омын

Рис.з. сокращения я соответствующие та изменения относительного Флуоресдентного сигнала F34Q/f3s0 нагруаенных fura-г полосок аорты ври действии фэ 11mkm) и эт-1 инн).

- 10 -

таблипа г. показатели сократительной реакции га аорта при воздействии ксь фэ, эт-1

воздействие kcl ФЭ ФЭ ЭТ-1 ЭТ-1

показатели (К ± и) тсш 0, ihk» 1ИКЙ IHK SHK

скорость изменения относительного а,КМ 0,Q3!4 О.ООЫ a.0J04 0,000«

Флуоресцентного сигналам, е./сек;

Бэличкиа изменения о. ф. с. ю. е. из- «0Д12) eißHfi №<№

Амплитуда сократительного ответа «6iS м»? actio 2iOiß 3fOO*l&

<мг>

Амплитуда сокращения в г от отве- BP 70 <00 <60 em

та ка 1мкй сэ

коэФ«идиепт корреляции сокрааэния о,?? 0,50 QU 073 0.53

и изменения 0. Ф. с.

п 6 6 6 6- fc.

для i и о, 5 мкн м составлял i>8±о.os отн.ед./г <п=е.п=б>. т.е. в 1.0 раза болыге чей для эт-i. искодя из того, что изменение относительного сигнала Флуорееяеняки прямо пропорционально динамике коц-вектракки свободного оитозольного иадьтт» следует, что сокращение вызванное эт-i обеспечивается меньпоя концентрацией ионов кальяия. чек cokpasskíie индуцированное фэ.

Во-вторых, скорость нарастания.относительного сигнала фяуор«с-пектам при активации гн аорта эт-i непьие. чек при действия фэ к KCl (табл.2). в-третьин. сокращение индуцированное фэ и KCl более чувствительно к присутствию в клетке Флуоресцентного красителя fura -а. чем сокращение на эт-i, это проявляется в ток. что при нагрузке гн аорты fura-2 снижается сила сократительного ответа вызванного «э и sei, но не эт-1.

Многочисленными исследованиями доказано, что Фазное сокращение и Фазная компонента Фазно-тоннческого сокращения связаны с поступлением ионов кальция по быстрым потенциалзавискмым кальциевым каналам и/или освобождением калымя из внутриклеточных депо, отсутствие выраженной Фазной компоненты эндотелин-индудированиого сокращения и относительно медленное нарастание кальциевого сигнала свидетельствуют о незначительном участии этая,механизмов в обеспечении сократительных ответов гладких мыша аорты при действии эт-i. кроме это-

го. низкая чувствительность агонист-индудкротакного сокразакия к увеличению буферной емкости пнтоплазмн предполагает отсутствие быстрых изменении яитозольного кальяия при возбуждении, Об этом свидетельствует анализ влияния Флуоресцентного зонда сшп-г на электрическую к сократительную активность глаакошшечных клеток мочеточника шаскаков н.в. и др. .1985).

сократительная активность гн аорта при действии зт-5

относительный вклад вне- и внутриклеточного кальяия в актива-пию сокращения варьирует в зависиности от агоннста. типа сосуда, вида животного (Bremen с. van et ai.. 1986). Роль наружных ионов кальдия в генерааии сокраиэния кыиечнын клеток ножет быть определена а эксаерементах с бескальаиевш зп а-содержащим растворен. в на-вих экспериментах в этих условиях зт-i внзызал сокращение составляйте не солее 20)с от ответа в нормальной растворе кребса т=б) (рис. г.ч).

:ледозательно. в развитии сократительного ответа гй аорта на зт-! ?аружныа калькиа играет решашую роль, следует отметить, что cor.?i-:ения га аорта индудированныэ зз более чувствителыш к удадоьтю шешнего кальяия - при действии 1нг:п фэ ответ либо не «.«ждался, шбо составлял з±г/ от контроля <n=s>. KCl в бескалыагзвои растворе ie изменяет нехан'Лческого напряжения гя аорты.

в бескальциевом растворе

Рис. влияние бескальпиавого ЭГТА-содержащего раствора и ниФедиппиа (¡мкМ) на сократительную реакпи» ги аорта, вызванную эт-1 (5нн).

- 12 -

Влияние ниФедипина на эндотелии- 1-индупирот;шоб сокращение гм аорты г настоящему времени установлено, по крайней иерг. три основ-нш типа ионных каналов, обеспечивающих поступление наружного каль-еия в гладкомшпбчные клетки: потенпиалзавксимые. реаепторуправляе-нма и каналы, находящиеся под контролен со стороны рецептора а мембранного потенциала (ртгоюп V. е1 аг, . 1990».

для определения вклада потенииалзаЕискмого входа калывш в ак-тивапи» сокращения гн аорти вкзьакного эт-1 использовался антагонист потеноиалзависикых кальаневот каналов Ь-типа ниФсдипш (К}). Предварительная 13-нинутдая обработка полоски аорта НФ чнхз!) ока-з _ы . сала значительное влияние на амплитуда сократительного ответа кривая доза-эФФект спевалась вниз вправо (п= е) (рис, 2).

вэедеккз но на плато сократительного ответа вызванного эт-1 аозозавпскмо снизило механическое напряжение ГК аорта. наксинальное н»-завискиоо расслаблен«? гнзивалось 1ики ш и составляло чо-еох от достигнутого утопая сократигельног-о ответа,* после чего механическое напряжение поддергивалось на постоянней уровне (п=б) (рис,ч).

Эти да;::ше, как и работы других исследователей Шп Б. е* а1.. 1939:1азига V, с1 г1,. 1989: шаскьигп н. ег аь.1991 и пр.1. позволяет говорить об участии дигидропиридкн-чувствительиых калышевк; каналов в генерации сократительного ответа гн аорти на эт-1. причем кальпиа поступавши* по этим канала« способен обеспечить до 00?. топического Эидотелш-ипкушровапного сокращения.

сократительная . . реакпиа гк аорти на действие эт-1 при удалении из внешнего раствора ионов натрия йля активации вотенпиалзависииых кальпиевих каналов необходика деполяризация мембраны до критического уровня, результата наша экспериментов показали, что эндотелин-ишшшруемая деполяризация га аорты нояет быть обусловлена потоком ионов натрия, входящим, вероятно. по ренепторуправляеным на»-прокипаемда каналам, это заключение базируется на тон, что сократительный ответ на эт-1 в растворе, где ионы натрия замешались н-неткя-п-глуканнном (гахзк имеет значительно меньшую, чем в контроле, амплитуду (п'= б), следует особо отметить, что добавление т на плато сокращения, шзванного зндоте-лином-1 в ямм-содержашем. растворе не изменяет механического напряжения гн полоски аорт чувствительность к НФ появлялась, если юте-содержания раствор заменяли на нормальная раствор кребса на

плато сокрпеэпия. вызванного эт-1 а безнатриевсм растворе (п=Т)

(рис.5),

Рис, 5. Влияние замеяения ионов натрия на икос на сократитель-шт> реакдкю га аорта, вызван--кую эт- 1 (5131).

от-1 5»м №ф1мкм~

поаучзиные данта» гказива»т на то. что в еознатриэвои растворе. по-мкинсяу, отсутствует или уменьшается деполягизания менар'а-Ш1. ««ванная эт-1. необходимая для открывания потепилзлзавистсгх кальпиегги каналов и. следовательно, снижается голь каяьпия посту-паепего п клетку по этан каналам.

Поскольку при занесении ионов натрия на ниш. наряду с подавлением деполяразашга. обусловленной входом натрия, наблюдается угнетение ка+/н* и па*/саг+ обменных прояессов (Уе1ззьегв ш. ь. в! а1,.19331, били проведеян эксперимента по определению влияния на • сократителышя ответ выключения этих иснтраяспортируших систем, "а-кспа натряя ■ яа ионы лития, не участвующие в на*/саг+ обмене, по арошжаетио через редепторуправляеиые натриевые каналы и заиошахлие патиш в пз+/ н*-обмене, по оказкзало заметного влияния на силу сократительных ответов гй аорта вызванных эт-1 ш=в). наряду с этим угнетение нэп/ н+-обнена с покояью ¡ша не снижало амплитуду сокра-татвжышз реакяпя ГН аорта на эт-1 I с«, ниже).

Исследование роли редэнторуправляеного входа ионов кальаия в механизмах действия эт-1 пги угнетен™ нечувствительного входа кальпкч и замещении натрия кота выявляется ¡»-резистентная компонента эт-1 штудированного сокращения. эт-1 способен визквать сокршшшо га аорта в среде лишенной питрия и кальки т=5)> добавление иоков кал ыш до 1.5 мл

ЗТ-1 з»м

"ггга Ик» 1мкМ

в этан условиях называло повышение механического напряжения до зон от амплитуды ответа на 1икм Фэ. эти данкш свидетельствует о наличии НФ-резистентнои компоненты входа ионов кальпия в ги и участии депонированного кальция в генерации сокращения при действии эт-1.

НФ-резистентиая компонента может быть оеусловлена входом кальция по репепторуправдяенын кальодевни каналам. согласно литературным данным [Eavid А. L. et al..l96Sl. этот ют каналов обладает существенно меньшей чувствительность» к антагонистам входа кальпия.

одним из приемов, позволявшим изучать репепторзависимкй вход ионов кальпия. является использование деполяризованных ги препаратов ШУба М, Ф. идр..19Б11.

в наших экспериментах предварительная деполяризация га препарата в томн растворе KCl не изменяла силу сократительного ответа при идевствии эт-i в концентрациях больших ihm in=s). при действии эт-1 на гн аорты деполяризованные 130 да KCl амплитуда сократительного ответа достигала so* от сскрашения в норнальном растворе Креб-са tn=8) (рис.6).

рис. б, зависимость силы сократительной реакдии гн аорты от конпентравии 1С) ЭТ-1;

а) гн деполяризованных 70нй и

б) 130МН KCl.

по оси ординат - сила сокра-шения в у- от амплитуды ответа на 1мки фэ,

Блокада дигидропиридинчувствительных каналов ш на Фоне плато эндотелин-индудированного ответа деполяризованной- полоски аорты водностью расслабляла гик (рис. Т).

из приведенных результатов следует, что при калиевой деполяризации гн аорты исчезает нф-резистентная компонента эт-1-индупиро-ванного сокращения, можно предположить, что в этих условиях либо отсутствует нечувствительный к дигидропиршшнан вход кальпия. либо каналы, обеспечивающие это вход, становятся чувствительны к нифеди-пину.

исходя из литературных данных можно внесказать • предположения объясняющие особенности действия эт-1 на деполяризованную пшерка-оиевыи раствором полоску аорты.

<м<-

Рис, т. Эффект ниФедипина на зт-1-индуяированиое сокращение деполяризованных гиперкалиевым раствором га (а - томн ксь

И1 ЭТ-13»М

9 - 130ки ecu

s

ЛС» ЭТ-1 toq>iMK.M

шуба и. Ф. с коля. (19SS) и Bevan s. and cow. U9S7! обнаружили возможность двойного контроля серотонин- и НА-Чузствителышя каль-диеикг каналов со стороны рецептора и ненеранного потенвиала. эти рецеЕторопеР!П>уемые-потенвиалуправляе»шс кальциевые каналы могут обеспэчквать до so г. всея величины сокразения. не исключено, что кальставне каналы находящиеся под контролем со стороны рецептора и менеракного потенциала могут приобретать чувствительность к «локаторам кальциевых каналов дягидрспнридинового ряда.

крона этого, в коде электрофизиологическия исследования било показано, что некоторые мессендхери. которые образуются в процессе активапии рецепторов. способны модулировать кальпз!евыя ток. изменяя длительность периодов открытого состояния и/или увеличивать вероятность открывания этих каналов, lsizumky h. et al. 11989)и moue t. et al. ti989i показано изменение активности каныгеевык каналов при действии эт-1. под влиянием эт-i увеличивалась вероятность открывания потенпиалэависишх кальциевых каналов ги мозговых артерий, время и вероятность открытого состояния этих каналов воротной вены. Учитывая Еыаеизлоаеяное. мохио допустить, что эт-t способен модулировать потенпяалзависимые кальциевые каналы ГИ аорта активированные гкперкаанзвоя деполяризацией. в этик условиях прирост сокращения на добавление ЭТ-i к даполяртоованвоя полоске обусловлен увеличение!', входа кальция по НФ-чувствительякм потенсналзависимнч калытевмм каяалам.

для того чтобы отдать предпочтение какому-либо из представлен-

шн механизмов. объясняшик результаты этой серии экспериментов, необходимы исследования на мембранном уровне.

Исследование роли натрия-протонного обмена в активации эт-i-индуцированного сокращения га

многочисленными исследованияии показано, что процессы клеточного метаболизма, сопряжения возбуждения и сокращения, свойства сократительных белков высоко чувствительны к внутреннему рн. Есть основание полагать, что гкк способны использовать изменение внутриклеточного рн в обеспечений ответа на регуляторннэ «акторы crabiato A. et ai.»19Тв; Owen я, е. et al. 19вг; вегк В. I. et al. . 19873.

одним из основных механизмов, обеспечивавших регуляцию внутриклеточного рн является натрий-протонный противотранспорт. показано, что действие таких активаторов гн как на, вазопреесш. ангио-тензин. «орболовые зфиры и др. связано с активацией натрийпротснного обмена tHaton М et а1..198Тг НаКашга A. et al,. 19871.

Б полученных нами данных угнетение на»/н+-обмена аналогом ами-лорида селективным,блокатором этого транспортера нна оказывало ак-тивируршее влияние на сокраиение гладкокшечного препарата аорта при действии эт-1 (рис. 8), также почти в г раза усиливался сократительный ответ вызванный 5нН м. введение ш1а на плато эндотелии-1 индуцированного сокращения доэоэависимо увеличивало механическое напряхение полоски аорта на зо/. от уровня плато.

рис, б, зависимость силы сократительной реакции га аорта от концентрации (С> эт-г, поело инкубапии а) с ша инкш и б) со стауроспорином (О,гнкн). По оси ордвдач - сила ccitpa-шения в " от эмплитуси отвзта на 1мки вэ.

^ ? S 9

ио-вид-.мому, как и в taenia сои и мочеточнике (Баскаков и, Б. н др, 1935). для гак аорти крысы на+/н*-обмен является однин из кон-

понентов механизма отрицательнол обратной связи снижающим чувствительность к длительному и/игл повторному действию возбуждающих аго-пистов. имеются свидетельства току, что вротокн оказывают влияние на ионную проводимость пяазнзлемш. например, при увеличении их концентрации а питоппазмо уменьшается калиевая проводимость мемвра-ш. Активадия натрия-протошого обмена пгизодат к, увеличению рн и закоплению натрия, показано, что оба этик Фактора - и в первую очередь подсолачивапие мтоплазш - увеличивают г:алкевую проводимость <ем5ра!Ш, гыло показано, Что стимулирушее влияние выключения пат-чш-ПРотош!вг.> гитипортера может есть связало с угнетением кальий г;гс:п-!ОП каляевов цроомамости мембраны я паруаенпон аккунуляпни шея натек, влокхрозаакв яа+/н* обмена вызывает подкисление аи-:оплими. что напротиз ведет к сяижоиию калиевой проводимости мембраны trabiato Д. el ai.. i9T6s Китаем т. et ai.. 19Вг; Sato к. et п.. !5эгз. Косвэежг! свидетельством в пользу заключения о вагпой ■ели на»/н+ обмена в гепораппя еекрапення па действие эт-i. могут (дть литературные данние о тон. что егшоп из нерест ргакшп незая-иалькыз я культуральша гаадконызечпиз клнток при действии эт-t вляется ггперполягнзашя мембраны. обусловленная игходон ионов ка-ия [Ladiunsity и., 19893.

Исследование ¿клада. актавакпя кальпий-ФосФолитад-завнсммой протеинкиназа - пз-с - а ЭТ-1 -индуднгованное сокрадение в механизмах действия различии аго;да:тов больаое значение рияается пройуктзи гидролиза ♦осФокаозижаоз. один из которык. ди-пялглилвроя. является активатором кальщя-ФосФолппкдзасисииоя про-ешпеиназы - пз-с.

Показано.' что длительное тошглскоо внеокоанплэтудкое сокрапе-и9 пгя актавапяи es-e ноаэт поддерживаться при концентрациях дито-ольяого калькия близких к базальикм. медленное г-гсокоамялитудиое окрааэшга гя яря действии эт-i и развитие его при более низких, 9н при действии КС1 и ФЭ, концентрациях внутриклеточного кадьтп. эзволило предположить вагпу» роль пк-с в процессе йодулядш гаствйтаяьностй сократительных белкоз к нонам кальдия, устаповле-5. что при аппликасяя эт-l а культуре гпх аорта наблюдается након-5не® кятаичиюерфаа. пряйого акткаатора гк-с ntesmi т. J.. i99o¡ra

Ot ai,. 15901.

для изучения роли як-с ни иикувяропала зо кяпут полоску аорта 1 нки Слскатора этого «pasara стауроспсринок. з нага« зкепеги-

ментах подавление активности Ш£-с с поколь» стауроспорина (О.гккк) значительно угнетало эндотелии-!-иадупироаванное сокращение гн аорты (п=б) (рис.8). следует отметить, что сокращение вызванное фэ не было чувствительно к действию стауроспорина.

йз полученных результатов можно сделать вывод, что пк-с имеет существенное значение в активации эндотелии-индуцированного сокра-шения. влияние активации лк-с может сыть связано с изменением состояние ионтранспортируших систем клеточной мембраны и саркоплазма-тического ретикулума, активности метаболических процессов, нодулядией чувствительности сократительного аппарата к другим вторичным нессенджерам. модификацией рецепторов клеточной менсраик.

н. казвтиззеп (1985) обосновывает наличие двух ветвей кальциевой сигнальной систены передающей информацию от рецептора к эффектору клетки, первая, .кальмодулинзависимая. травэиторно актакгмкза-яся кратковременным повышением внутриклеточной коидентраадв» кальпия. ответственна за иншиатю клеточного ответа, т. е. включает первую проходящую Фазу сократительного ответа, другой путь, С-ки-назныа, который активируется накоплением дианилглиперола в плазматической мембране и обеспечивает поддерживаемый ответ ткани.

исходя из полученных результатов, а также на основании литературных данных могло заключить, что возбуждавшее действие эндотелии -i на гн аорты крысы обусловлено включением кальдиа-кальмодулинза-висимого пути передачи сигнала, который активируется преимущественно кальцием, поступающим в гн в основном по лотенакзлзависимым кальциевым каналам и частично по каналам, управляемым рецепторами, а такхе сигнальной системой, опосредуемой пк-с и связанной с гидролизом мембранных полифосфоинозитидов.

¡лшоды:

1. парапетом сократите л ыгыя ответов гладкомшечння препаратов аорты при действии kci. та и эт-i коррелирует с динамикой относительного Флуоресцентного сигнала кальаийчувствительного зонда fürа-Л: величина относительного флуоресцентного сигнала соответствует силе сократительного ответа на зт-!, KCl ФЭ . уровень этого показателя яа всем протяжении действия KCl. ФЗ и ЭТ-1 прегы-пает сазалышя. более медленному сокрапенл:' на ЗТ-1 соответствует более медленное, чем при KCl и ФЭ> поЕнаеиде относительного флуоресцентного сигнала,

г. секратителышп ответ ги аорты на зт-1 обеспечивается, в основном, Епгклеточннни ионами кальция, вольная часть которыз поступает по ииоедппинчувствительным каналам, определенный вклад вносит пнзедипкнрэзистентшй вяод ионов кальция. при деполяризации п! горты гияеркадигвкм раствором сокращение иядупнрованноо эт-1 полность» осзсперчкзаэтсл кальпиен. вяодявям по ниФедшышчувстзи-тельку.ч кальяязвнн каналам. '

3. актшидня няФедипинчувстпитепышя хадьптгсшя каналов пи аортк при дгястоия эт-l обусловлена деполяригааиея кембрапы, всягдстзни ионов натрия в клетку по реаепторуправляемкм каналам.

4. лкпгагзия йа+/Я+ обмена при действия эт-l является одним из Пэхат-лглов. обеспечивает®: генерад:» сократительного ответа. Блокирован;» патко -протонного обмена произзодк-ет амилорида ниа супсст-взяно гзгл«г>иваот чувствительность гладкоикзечяик меток и амплитуду максимального сократительного ответа препарата s'optu на действие эт-1.

5. одним из путей инициации сокраиония гладкоииявчтга клеток сосудов пи! воздействии эпдотелкна-1 является актавадия каль-гга-<вмотгаиа засяскной протеииккнази - га-С. Активация кзль-диа-ФосЮлапнд зависимой протеинккхази пх-с является одним из механизмов. обеспечивали* Формирование сократительного ответа гн аорта крксн па действие эт-1.

- £0 -

Список работ» опубликованных во теме диссертации.

I. измерение внутриклеточной концентрации кальция в перитоне-алышк накрофагав.// Бюл. экспэр. сиол. имея. 1991. не. с. Т52-Т55. соавт. пинелис в. г.. Баскаков к. Б.. парков х. и.

е. Флуоресцентный анализ кинетики внутриклеточного ионизированного кальяия в полоске аорты, //тез. докл. всесоюзн. кон«. "Хемялюминес-нентныя анализ в биологии и медицине'. 1992. г. носква, с. 35.

3. некоторые механизмы действия ваэоактивного пептида эндотели-ва-1.//нат, всеросс.сиип. "Патофизиологический анализ Факторов риска артериальной гипертензии и атеросклероза". 1992. г.Новосибирск, с. гч. соавт. Еииеяис в. г.. цедведев H.A.. Бакунина т. П.

4.saoe mechanlsns of ЕТ-i action.// intr. slop. "Structure'and function of regulatory polipeptidea* , iS9£. hi Ian, p. es, гшеш V. G.. storoeevich T. p.. BraKe p.