Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Маркеры ретровирусов типа D при В-клеточных лимфоаденопатиях человека

Г 5 ОД 3 МАЯ 1997

На правах рукописи

Кжышковска Юлия Георгиевна

МАРКЕРЫ РЕТЮВИРУСОВ ТИПА О ПРИ В-КЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОАДЕНОПАТИЯХ ЧЕЛОВЕКА

14.00. 14 - онхология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте Канцерогенеза Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук К.В. Ильин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А.Г. Татосян доктор медицинских наук Н.П. Косякова

Ведущая организация: Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Российской Академии Медицинских Наук

Защита состоится 1997 г. в -- час.

На заседании специализированного Ученого Совета (К.001.17.01) Онкологического научного центра РАМН (Москва 115478 , Каширское шоссе д. 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического Научного Центра Российской Академии Медицинских Наук.

Автореферат разослан ^^ 1997 г.

Ученый секретарь

специализированного Ученого Совета, доктор медицинских наук, профессор

B.C. Турусов.

Общая характеристика работы 1. Актуальность проблемы. Со времени обнаружения в карциноме молочной железы макаки-резус первого ретровируса типа D - MPMV (Chopra Н.С., Mason MM., 1970) многократно предпринимались попытки установления ассоциации данных вирусов с какими-либо патологиями человека. Открытие этиологической роли ретровирусов типа D при иммунодефиците обезьян послужило основанием целенаправленного изучения ассоциации ретровирусов типа D с иммунопатологиями человека. В нашей лаборатории антитела к структурным белкам ретровирусов типа D были обнаружены у детей с лимфаденопатиями неясной этиологии (M^-ozov V.A. et al., 1989) . В отдельных случаях у серопозитнвных детей наблюдалась B-клеточная пролиферация. В то же время обширные исследования, проведенные американскими исследователями показали отсутствие серологических маркеров ретровирусов типа D у пациентов в возрасте 17-70 лет с различными патологиями иммунной системы (Heneine W., 1993; Lerche N.. 1995). Биологической особенностью ретровирусов является интеграция провирусной копии генома в клеточную ДНК, что не всегда сопровождается экспрессией вирусных белков и последующим иммунным ответом. Нам представлялось актуальным провести обследование детей с В-клеточпыми и другими лимфопролиферативными заболеваниям на наличие не только серологических, но и генетических маркеров ретровирусов типа D. На выбор данной группы заболеваний повлияло также сообщение о выделение в США MPMV-подобного ретровируса от больного со СПИД и B-клеточной лимфомой (Bohannon et.ah, 1991).

В настоящее время вопрос о способах передачи ретровирусов типа D у обезьян хорошо изучен (Moazed T. et al., 1993). Известно, что острое иммунодефицитное состояние развивается в случае заражения животных

данными вирусами на ранних этапах развития от матери (внутриутробно или при грудном вскармливании). При заражении на более поздних этапах развития вирусоносительство протекает безсимптомно, С целью возможного установления пути передачи маркеров ретровирусов типа О особенно важным представлялось обследование родителей детей с В-клегочними лимфомами на присутствие как антител к вирусным белкам, так и интегрнрованных провирусных последовательностей. 2. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение ассоциации маркеров ретровирусов, типа О с В-клеточными лимфомами детей и установление возможного семейного носительства данных маркеров.

В ходе выполнения исследования предполагалось решить следующие задачи:

1. Собрать сыворотки крови и образцы ДНК лимфоцитов периферической крови детей, больных В-клеточными лимфомами и другими лимфопролиферативными заболеваниями.

2. Исследовать сыворотки данных больных на анличие антител к структурным белкам ретровирусов типа Р.

3. Исследовать ДНК лимфоцитов периферической крови на наличие вирусспецифических полседовательностей.

4. Методом секвенирования определить структуру вирусспецифических последовательностей, однаруженных у больного с В-клеточной лнмфомой и его матери.

5. Провести секвс .ирование фрагментов провирусных последовательностей из ДНК клеточной линии НЕр-2, продуцирующей близкородственный МРМУ ретровирус типа О, и используемой в качестве положительного контроля при исследовании на наличие вирусспецифических последовательностей в ДНК пациентов.

6. Обследовать группу родителей детей с В-клелочными лимфомами на возможное присутствие маркеров ретровирусов типа D.

7. Получить клеточные культуры, содержащие вирусспецифическую генетическую информацию, обнаруженную в ДНК детей с В-клсючными лимфомами.

3. Научная ношшш. Впервые был проведен комплексный анализ досЛ с B-клеточными лимфомами и их родителей на присутствие не только серологических, но и генетических маркеров ретровирусов типа D. При помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и специфической гибридизации было показано, что в ДНК лимфоцитов периферической крови детей с В-клеточнымн лимфомами содержатся последовательности, гомологичные gag-pro-pol участку провируа MPMV, причем у трети положительных в ПЦР детей наблюдается синтез антшел к главному структурному белку MPMV, Кроме того, аналогичные последовательности были также, обнаружены в ДНК лимфоцитов периферической крови у родителей детей с B-клеточными лимфомами. Впервые была определена стр)ктура последовательностей, гомологичных ретровирусам типа D, обнаруженных в ДНК лимфоцитов периферической крови больного с В-клеточной лимфомой и его матери. Методом секвенирования было показано, что вирусспецифические последовательности, обнаруженные у ребенка и его матери, идентичны между собой и, практически, идентичны участку генома MPMV 2856-3499, однако отличаются от MPMV за исключением однонуклеотидной замены. Секвенирование провирусных фрагментов из клеток НЕр-2 выявило отличия ретровируса типа D, продуцируемого данной линией, от известных вирусов группы SRV, при том, что максимальная степень гомологии наблюдается с SRV-1.

4. Научно-практическая значимость работы. Проведенные исследования вносят определеный вклад в изучение проблемы возможной ассоциации

маркеров ретроврусов типа D с патологиями человека.Решение поставленных в работе задач позволило сделать вывод о наличии ассоциации данных маркеров с B-клеточными лимфомами человека. У 60% детей с B-клеточными лимфомами в ДНК лимфоцитов периферической крови были обнаружечы вирусспецифические последовательности, причем у 34% положительных в ПЦР пациентов методом иммуноблоттинга было показано наличие антител к вирусным струюурным белкам. Обнаружение маркеров ретрОвирусов типа D у родителей детей с , B-клеточными лимфомами дает возможность предположить семейное иосительство данных маркеров, что могло бы иметь прогностическое значение. Дальнейший анализ расширенной выборки больных детей с B-клеточными лимфомами и их родителей на присутствие маркеров ретровирусов типа D, исследование клинических особенностей ранних стадий развития данного заболевания, позволил бы более полно охарактеризовать роль маркеров ретровирусов типа D при В-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях человека.

5. Апробация работы. Апробация диссертационной работы была проведена 28 февраля 1997 г. на совместной научной конференции лабораторий иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, иммунохимии» вирусного канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН.

Основные материалы диссертационной работы были представлены на III и IV международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы" (Россия, Санкт-Петербург, 1995 и 1996 гг.), на XXI и XXII конференциях Европейской группы опухолевых вирусов (Австрия, Иннсбрук, 1995 и 1997 гг.) и 1ой Евроконференции " Вирусный онкогенез и контроль клеточного цикла" (Германия, Гейдельберг, 1995).

6. Публикации. По материалам работы опубликовано 11 работ.

Продукты ПЦР анализировались элеетрофоретически в 1,5% аг геле.

Определение специфичности продуктов ПЦР методом гибриди. Перенос на нейлоновую мембрану Hybond N (Amersham) проводили в < NaOH в течение 3 часов. Проба для постановки гибридизации готовш! на основе продукта ПЦР с использованием праймеров ОЦ или l!4 полученного на матрице плазмиды, содержащей полноразмерную вставку i MPMV-провируса (pMPMV), любезно предоставленной Ильинским П.О., Гарвардская Медицинская Школа, Бостон, США. Прнготоление пробы, гибридизация в строгих условиях и иммунная проявка проводились в соответствии с протоколом набора для нерадиактивного мечения DIG DNA Labeling and Detection Kit, Boehringer, Mannheim.

Nested-ПЦР. Для постановки Nested-ПЦР проводили два этапа ПЦР. На первом этапе использовали праймеры ОЦ и 1мкг геномной ДНК на реакцию. На втором этапе использовали "внутренние" праймеры Int и в качестве матрицы 5 мкл реакционной смеси, содержащей продукты первой реакции.

Секвенирование ДНК (Sanger F. et.al., 1977). , Для определения первичной структурной последовательности прдуктов Nested-ПЦР использовали набор реактивов USB Sequenases Version 2.0 kit. В качестве радиактивного Изотопа применяли a-[33P]dATP.

Компьютерный анализ. Компьютерная обработка данных и поиск гомологий проводились при помощи пакетов программ DNA Sun и РСОепе.Секвенирование н компьютерный анализ данных проводился совместно с Иткесом A.B., Машковой Т.Д. и Имамовон J1.P., Институт Молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва. Иммуноблоттинг. Электрофорез вирусных белков и белковых препаратов,полученных из стабильных клеточных линий, и электроперенос

*

эв на тпроцеллюлозную мембрану (Millipore.CllIA) выполняли по Гндартной методике (Laemly U., 1970. Towbin H.et al., 1984) Инкубация с тируемыми человеческими сыворотками (разведение 1:100) проводилась г3 до 12 часов. Козья гипериммунная сыворотка к gag-кодируемым лкам MPMV использовалась в разведении 1:400, нормальная козья гсыворотка - в разведении 1:100.

Результаты и обсуждение.

/. Обнаружение маркеров ретровирусов типа D у детей с В-кяетотими димфомами и их родителей.

В результате ранее проведенных серологических исследований в нашей лаборатории было показано, что антитела к структурным белкам ретровирусоэ типа D были обнаружены у детей с лнмфоаденопатиями неясной этиологии (Morozov et al., 19S9), причем в отдельных случаях у детей наблюдалась В-клеточная пролиферация. Дальнейшая работа шла по следующим направлениям: I )обнаружение серологических маркеров ретровирусов типа D у детей с В-клеточными лимфопролиферативнымн заболеваниями; 2) обнаружение и характеристика генетических маркеров ретровирусов типа D в ДНК лимфоцитов периферической крови данных пациентов. 3) Обследование родителей детей с В-клеточными лимфомами на наличие маркеров ретровирусов типа D в периферической крови. Обнаружение антител к белкам ретровирусов типа D у детей с В-клеточными лимфомами и их родителей. Сыворотки детей с различными лимфопролифератнвнымн заболеваниями, родителей детей с В-клеточными лимфомами были проанализированы с методом иммуноблоттинга с использованием MPMV в качестве антигена. Сыворотки 6 из 30 детей с В-клеточнымн лимфомами реагировали с главным структурным gag-кодируемым белком MPMV р27 (Рис.1, треки 7 и 8). Кроме того в двух

случаях наблюдалась слабая положительная реакция со это, кодируемым структурным белком МРМУ р14.

Рис.1.

Обнаружение антител к структурным белкам ретровирусов типа О методой Вестери-блоттинга у детей с В-клеточными лимфомами.

В качестве антигена использовался коммерческий препарат МРМУ.

Рм-р!0-12—

Трек I - козья гппериммунная сыворотка к gag-кoднpyeмым белкам МРМУ в разведении 1:400 (положительный контроль)

Трек 2 - ' сыворотка здорового донора в разведении 1:100

Треки 3-8 - сыворотки детей в лнмфопролиферативнымн заболеваниями в разведешш 1:100 (трек З-Т-кле-точиап лимфома, трек 4 - лимфогранулематоз, треки 5-8-В-клеточная лимфома).

Трек 9- нормальная козья сыворотка в разведении 1:100 (отрицательный контроль)

Позиции вирусных белков указаны слева.

В сыворотках детей с другими лимфопролиферативными заболеваниям] таких антител к обнаружено не было (табл. 1). В группе родителей детей В-клеточными лкмфомами (11 человек, отцы и матери) в одном случа сыворотка отца ребенка с В-клеточной лимфомой реагировала с р2'

EPMV, причем ребенок был сероотрицательный. В сыворотках стальных родителей, а так же 25 здоровых доноров антитела к белкам етровирусовтипа D обнаружены небыли.

Обнаружение серологических маркеров ретровирусов типа D у детей, ольных B-клеточной лимфомой , а так же у одного из родителей озволило предположить наличие интегрированных последовательностей етровируса типа D в ДНК пациентов.

Обнаружение последовательностей, гомологичных провирусу MPMV в \НК лимфоцитов периферической крови детей с В-клеточными имфомалш и их родителей.

Дня тестирования образцов ДНК были использованы две пары файмеров. Первая пара ОЦ ограничивала консервативный для группы эетровирусов типа D участок генома MPMV gag-pro-pol длиной 932 п.о. 2720-3652). При .помощи программы PC Gene степень гомологии для данного участка MPMV при сравнении с аналогичным участком генома SRV-1 была оценена как 93,5%, а для MPMV и SRV-2 -80,4%. В то же время гомология исследуемого участка с соответствующим участком человеческого эндогенного ретровнруса HERV-K составляла 44,5%, однако протяженность непрерывных участков гомологии была не более четырех иуклеотидов, что исключало возможность амплификации последовательностей HERV. Вторая пара праймеров Int ограничивала "внутренний" фрагмент длиной 736 п,о. (2819-3555). В результате диализа образцов ДНК т лимфоцитов периферической крови на наличие вирусспецифических последовательностей методом ПЦР и специфической гибридизации последовательности, гомологичные gag-propol участку генома MPMV, были обнаружены у 18 из 30 детей, Сольных В-клеточнымй лимфомами, что составляет 60% (Рис.2)

Рис. 2.

Обнаружение последовательностей ретропнрусов тппа Б у детей с В-клеточпыми лимфомами методом ПЦР к специфической гибридизации с пробой, приготовленной на основе МРМУ-содержащей плазмиды н меченной днгокснгенином.

932Ьр>

Н 1 2 3 4 56 7 8 9 10 11 12

Трек Н - ДНК из 1слеток НЕр-2 (положительный контроль) Треки 1, 3-11 - ДНК из лимфоцитов периферической крови

детей с В-клеточнымн лимфомами. Трек 2 - ДНК пз клеток Ка]( (отрицательный контроль) Трек 12 - водный контроль ПЦР (без матрицы)

Слева указана позиция специфического продукта ПЦР.

Шестеро из 18 положительных в ПЦР детей, имели также антитела к структурным белкам МРМУ. У детей с другими лимфопролиферативными заболеваниями МРМУ-специфических оследовательностей в ДНК лимфоцитов периферической крови обнаружено не было (Табл. 1).

Таблица 1.

Маркеры ретровирусов типа Б у детей с различными лимфопролиферативнымн заболеваниями

НАЛИЧИЕ НАЛИЧИЕ АНТИТЕЛ

ДИАГНОЗ ЛОКАЛИЗАЦИЯ КОЛИЧЕСТВО ВИГУССИЕЦНФИЧЕСКИХ К СТРУКТУРНЫМ

ПАЦИЕНТОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ДНК БЕЛКАМ МРКУ В

ЛИМФОЦИТОВ СЫВОРОТКАХ

ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

1. В-клеточная лимфоыа 1. Брюшная полость 18 12 4

2. Носоглотка 10 6 2

3. Брюшная полость в

носоглотка 1 0 0

4. Мяпше ткани орбиты и 1

верхняя челюсть 0 0

Всего 30 18 б

2 Другие

лимфопролиферативные

заболевания •

2.1. Лимфогранулематоз 6 0 0

72. Т-клсточна* лнмфома Средостение 4 0 0

2 3. Лямфобластоая 1. Костн ый мозг 1 0 0

лнмфома 2. Брюшная полость 2 0 0

2.4. Крушгоклеточная Периферические лимфоузлы

акалластическая 1 0 0

- лнмфома

Всего 14 0 0

Интересными представляется результат обнаружения вирусспецифическнх последовательностей у б из 10 клинически здоровых родителей детей с В-клеточнымн лимфомами . В 5 случаях эти последовательности были обнаружены в лимфоцитах периферической крови родителей детей, так же содержащих вирусспецифические последовательности. В шестом случае последовательности были обнаружены у отца ребенка, отрицательного в ПЦР Всего было обследовано восемь семей, в шести из которых дети содержали вирусспецифические послндовательности и в двух не содержали. Небольшое количество материала от родителей, а так же невозможность в большинстве случаев провести комплексное семейное обследование (ребенок - мать - отец) не позволяет нам на данном этапе исследований делать конкретных прогностических выводов. Однако тот факт, что в 5 из б обследованных семейных вариантов в пяти хотя бы один из родителей содержал маркеры ретровирусов типа О, говорит о высокой степени вероятности сечейного носительства маркеров ретровирусов типа О. В 25 образцах крови здоровых доноров вирусспецифические последовательности обнаружены не были. Результаты обследования различных групп людей на наличие макреров ретровиусов типа О в периферической крови суммированы в Табл. 2.

Таким образом как серологические, так и генетические мархеры ретровирусов типа р присутствуют в периферической крови у детей с В-клеточнымн лимфомами, не не другими лимфопролиферативиыми заболеваниями (Табл. 1.). Отсутствие антител к белкам ретровирусов типа О у двух третей пациентов, содержащих вирусспецифические последовательности в лимфоцитах периферической крови можно объяснить, во-первых, вероятной иммунотолерантностью к вирусным антигенам при их попадании в организм на ранних эгапах развития. С другой стороны сыворотки сероотрицательных пациентов тестировались на

наличие антивирусных антител после прохождения пациентами иммуносупрессивной химиотерапии, снижающей реактивность иммунной системы. Обнаружение маркеров ретровирусов типа Э у родителей детей с В-клеточнымн лимфомами указывает на вероятность передачи данных маркеров от родителей детям.

Таблица 2.

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ РЕТРОВИРУСОВ ТИПА С В РАЗЛИЧНЫХ ОБСЛЕДОВАННЫХ ГРУППАХ ЛЮДЕЙ

ИССЛЕДУЕМАЯ ГРУППА. ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО ОБСЛЕДОВАННЫХ НАЛИЧИЕ ВИРУ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НАЛИЧИЕ АНТИТЕЛ К СТРУКТУРНЫМ БЕДКАМ МРМУ

1. Пациент ы с В~ клепочными лимфомами. Возраст от 2 ¿014 лет. , М 18 б

2. Пациенты с другими лимфопролйферати виыми заболеваниями. Возраст от 3 до 14 лет ' ' '-' 14 0 0

3. Родители детей В-клеточнымиу лимфомами Возраст 33-:} лет. II 6 1

4. Здоровые доноры Возраст 20-33 года 25 0 ё

MPMV, SRV-1 и SRV-2 представлены в Табл. 3. Наиболее высокая гомология (выше, чем для MPMV) была показана для SRV-1. Однако учитывая тот факт, что проанализированный участок генома является высококонсервативным, HEp2V нельзя считать идентичным SRV-Ih можно предположить его независимое происхождение.

Таблица 3.

Сравнение нуклеотодных последовательностей секвеннроаянпых фрагментов участка геиомя gag-pro-pol НЕр-2-провпруса с другими ретровнрусамп типа D.

HEp-2V SRV-1 SRV-2 MPMV

1 фрагмент 98,9% 77,6% 93,4%

2 фрагмент 92,1% 80,9% 84,3%

2. ¡{окультивирован т лимфоцитов детей с Вч<леточными лимфомами и клеток стабильных клеточных,

В ходе исследования ассоциации ретровирусоа типа О с В-клеточными лимфомами детей нами было получено 14 культур, содержащих лимфоциты пациентов и клетки стабильных клеточных линий' Яа^ или 1игка1. Анализ культур проводился а двух направлениях: I) тестирование ДНК на наличйе МРМУ-специфических псследозательностсй и 2) анализ супернатанта культур присутствие белков ретровирусов типа Э. В двух культурах были обнаружены внрусспецифические последовательности (Рнс.5,трек 1). В обоих случаях лимфоциты периферической крови

культивировались с клетками 11а}|. Лимфоциты были получены от мальчиков 7 и 13 лет с диагнозом В-клеточной лимфомы брюшной полости. Сыворотки данных больных реагировали с главным структурнным белком МРМУ р27 в иммуноблоттинге, а в лимфоцитарных ДНК были обнаружены последовательности, гомологичные gag-pro-pol области генома МРМ\Л В культуральной жидкости обеих культур после центрифугирования в градиенте сахарозы в зоне с плотностью 1,16 г/мл были обнаружены белки, реагирующие в иммуноблоттинге с антисыворогхой к да§-кодируемым белкам МРМУ

Таким образом наличие серологических и генетических маркеров ретровирусов типа Б в периферической крови детей с В-клеточными лимфомами, а так же результаты кокультивирования лимфоцитов пациентов с клетками Яа^ указывают на возможную ассоциацию МРМУ-подобного вируса с данным заболеванием. Если попытаться сопоставить клинические особенности течения заболевания и наличие у больных маркеров ретровирусов типа Б, то нужно учитывать следующий факт. Все дети,' страдающие В-клеточными лимфомами, попадают на лечение на поздних этапах развития заболевания (НЫУ стадия) и подвергаются интенсивной иммуносупрессивной химиотерапии. Поэтому в данном случае трудно было бы анализировать зависимость между тяжестью заболевания и наличием исследуемых вирусных маркеров. Так "из 18 пациентов, имеющих маркеры ретровирусов типа Г), после лечения ремиссия заболевания наблюдалась у 14 человек, а четверо умерло (22,2%). В группе детей с В-клеточными лимфомами, не содержащих маркеры ретровирусов типа Э после Лечения в 9. случаях из 12 наблюдалась ремиссия и трое (25%) умерло.

Обнаружение маркеров ретровирусов типа О могло бы иметь прогностическое значение на более ранних этапах развития заболевания.

Известно, что развитию как В-, так и Т-клеточных лимфом у детей предшествует нммунодефицитное заболевание неизвестной этиологии [Гордина Г.А., 1983 г.). Причем иммунодефицит иногда диагностируется }а несколько лет до развития лнмфопролнфератнвного заболевания. Учитывая тот факт, что ретровирусы типа О вызывают у новорожденных обезьян иммунодефицит, мы могли бы предположить иммуносупрессивное действие данных вирусов и на организм человека при заражении на ранних этапах развития. Представляется вероятным, что обнаруженная ассоциация маркеров ретровнрусов типа Б с В-клеточнымн лимфомамн у детей связана с особенностями предшествующего развитию опухоли иммунодефицита, на фоне которого и развивается в дальнейшем лимфопролиферативное заболевания. Дальнейшей перспективой наших исследований является изучение особенностей иммунодефицита, предшествующего В-клеточным лимфомам у детей, а так же обследование детей с иммунодефицитом неясной этиологии на наличие маркеров ретровнрусов типа О.

Выводы

1. Методом полимеразной цепной реакции н последующей специфической гибридизации у 18 из 30 обследованных детей с В-клеточными лимфомамн в ДНК лимфоцитов периферической крови обнаружены последовательности, гомологичные ¿а£-рго-ро1 участку генома обезьяньего вируса Мезон-Пфайзера (МРМУ).

2. У трети детей, содержащих вирусспецифические последовательности, в сыворотках обнаружены антитела, реагирующие в иммуноблоттинге с §а£-кодируемыми белками МРМУ.

3. У 6 из 10 здоровых родителей детей с В-клеточными лимфомами в ДНК лимфоцитов периферической крови обнаружены последовательности, гомологичные ва£-рго-ро1 участку генома МРМУ.

4. Были секвенированы МРМУ-специфические продукты ПЦР, полученные на матрице ДНК лимфоцитов периферической' крови ребенка с В-клеточной лнмфомой и его матери. Нуклеотндные последовательности вирусспецифических фрагментов ребенка и матери совпадали и были практически идентичны участку генома МРМУ 2856-3499. В позиции 2857 и у ребенка, и у матери гуанин был заменен на аденин.

5. Были секвенированы фрагменты МРМУ-специфического продукта ПЦР, полученного на матрице ДНК клеточной линии НЕр-2, продуцирующей ретровирус типа О. Даные фрагменты были высокогомологичны (свыше 92%) и в меньшей степени МРМУ и БЯ У-2.

6. В результате кокультивирования лимфоцитов больных с клетками Яар получены Две клеточные линии, содержащие последовательности ретровирусов типа О, обнаруженные в лимфоцитах детей с В-клеточными лимфомами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

l.Ilyin К.V., Morozov V.A., Ilyinsku P.O., Kzhyshkowska J.O. Detection of antibodies to type D retrovirus proteins in patients with lymhpadenopathy. J.Tumor Marker Oncology, V.5, N36 p. 261. 2. Ilyin K.V., Morozov V.A., Ilyinskn P.O., Kzhyshkowska J,G, Koposov P.O., Miller G.G. Antibodies to type D retrovirus in patients with jymphadenopathy.

XVII Meeting of Int. Society of Oncodevelopmental Biology and Medicine, Moscow, 1990, Abstracts, p.55.

3. Ilyin K.V., Morozov V.A., Ilyinskii P.O., Kzhyshkowska J.G, Koposov P.O., Cherepovsky. D-type retroviruses antibodies in patients with lymphadenopathy. XIX Meeting of ETVG, 1991, Abstracts, p. 85.

4. Kzhyshkowska J., Morozov V., Koposov P., Ilyin K.Markers of type D retroviruses in B-cell leukemia of human. XXI Meeting of ETVG, J. Cancer Research and Clinicah Oncology, 1995,V. 121, Sup., p. 6.

5. Ильин К. В., Кзкышковска 10. Г., Морозов В.А. Последовательности рго-pol MPMV в смешанных культурах, содержащих лимфоциты пациентов с В-клеточнымн лнмфосаркомами. 3-я международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", С.-Петербург, 1995, книга абстрактов* с. 67.

6. Kzhyshkowska J., Morozov V., Koposov P., Ilyin K. Detection of type D retroviral specific sequences in B-cell leukemia patients. XXXI Meeting of Polish Biochemical Society, Warsaw, Abstracts, 1995, p. 146.

7. Kzhyshkowska J., Morozov V., Koposov P., Ilyin K. Possible association of type D retroviruses with B-cell leukemia of human. 1st Euroconference "Viral Oncogenesis and Ceii Cycle Control",Heidelberg,Germany, 1995, Abstracts,p.24

8. Kzhyshkowska J., Morozov V., Koposov P., Ilyin K. Type D retrovirus specific sequences in lymphocytes of a patient with abdominal B-cell lymphosarcoma.' J. AIDS and Human Retrovirology., 1995, V. 10, p. 240.

9. Kzhyshkowska J.G., Portjanko N.M., Kurmashow V.I., Kiselev A.V., Ostashkin A.S., Ilyin K.V. Children with Burkitt's-type B-cell lymphosarcoma contain Mason-Pfizer monkey virus homologous sequences. 4th Int Conf. AIDS, Cancer and Related Problems, St.Petersburg, 1996, Abstracts, p.61.

10. Ильин К. В., Кжышковска Ю. Г., Колосов P.O., Морозов В.А. Возможность переноса генетической информации ретровирусов типа D из лимфоцитов больных В-клеточными лимфосаркомами в клетки Raji. Бюллетень экспер. биологии и медицины, 1996, N 10, стр. 446-448.

11. Kzhyshkowska J.G., Kiselev A.V, Gordina G.A., Kurmashow V.I., Portjanko N.M., Ostashkin A.S., Ilyin K.V. Markers of type D retroviruses in children with Burkitt's-type lymphoma. Immunology Letters, 1996, N 53, p. 101-104.

Автор выражает сердечную благодарность научному руководителю, д.м.н. Ильину К.В. за ценные советы в процессе исследования. Автор так же выражает глубокую благодарность к.м.н. Павлишу О.А., к.б.н. Лушннковой А.А. и к.м.н. Маливановой Т.Ф. за критические замечания при обсуждении результатов.