Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Эффекторы CD4 при экспериментальной туберкулезной инфекции: фенотип и дифференцировка

На правах рукописи

Шепелькова Галина Сергеевна

ЭФФЕКТОРЫ Сй4 ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ: ФЕНОТИП И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА

14.00.36. «Аллергология и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 р [" о

МОСКВА 2009

003465563

Работа выполнена в ГУ Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Ирина Владимировна Лядова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Равшан Иноятович Атауллаханов доктор медицинских наук, профессор Аркадий Максович Мороз

Ведущая организация: Государственный Научный Центр Институт Иммунологии ФМБАРФ

Защита состоится » апреля 2009 г. в 11 часов на заседании

диссертационного совета Д 001.007.01 при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098 Москва, ул. Гамалеи 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « ^ » марта 2009 г.

Ученый Секретарь Диссертационного Сс Доктор медицинских наук, профессор

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

В настоящее время туберкулез (ТБ) является одной из самых распространенных и опасных инфекционных болезней в мире. Основными подходами к лечению и профилактике туберкулеза являются химиотерапия и вакцинация BCG, однако оба они часто оказываются неэффективными. Так, химиотерапия не эффективна при устойчивости штаммов М. tuberculosis к применяемым антибиотикам, а распространенность таких штаммов в мире постоянно нарастает. Эффективность вакцины BCG для профилактики заболевания ТБ колеблется от 0 до 80 процентов в разных популяциях [Colditz, 1994]. Причины такой вариабельности остаются неясными, несмотря на ряд попыток разобраться в этом вопросе. Разработка новых подходов к профилактике и лечению ТБ, требует точных знаний о том, каким образом происходит формирование противотуберкулезного иммунного ответа и какие клеточные и молекулярные механизмы обеспечивают протекцию при туберкулезной инфекции.

Считается, что одним из основных факторов защиты при туберкулезной инфекции являются Т-лимфоциты с фенотипом CD4+. В очаге инфекции лимфоциты CD4+ продуцируют IFN-y, который активирует как прямую анти-микобактериальную активность макрофагов, так и выработку TNF-a и IL-12 -индуктора самого IFN-y (Collins and Kaufmann, 2001; Mogues et al., 2001; Cooper et al., 2002; Cruz et al., 2007). В связи с этим дифференцировка Т-лимфоцитов и образование клеток, секретирующих IFN-y - это ключевые события в адаптивном иммунном ответе при туберкулезной инфекции. До настоящего времени подробно были изучена лишь дифференцировка этих клеток в лимфатических узлах. Однако открытым оставались вопросы о том, что происходит собственно в легочных очагах инфекции, через каше стадии проходит клетка в процессе дифференцировки, существуют ли специфические маркеры клеток, находящиеся на разных этапах дифференцировки, на какой стадии дифференцировки клетки приобретают способность мигрировать в очаг инфекции.

Ранее И.В. Лядовой и соавторами было показано, что после иммунизации мышей BCG пул активированных легочных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD44hl9hCD62L'°w включает две субпопуляции, отличающиеся по уровню экспрессии молекул CD27. Высокой способностью к продукции IFN-y обладают только лимфоциты CD62L|0WCD27|0W (lyadova et al., 2004). Однако до настоящего времени оставалось невыясненным, отличаются ли лимфоциты CD62Llov"CD27hlQh и

CD62L|0WCD27'0W по другим характеристикам, каковы взаимоотношения между этими субпопуляциями в процессе дифференцировки, и какова роль каждой из них в формировании протективного иммунитета при экспериментальной туберкулезной инфекции. Эти вопросы и определяют актуальность данной работы. Целью настоящей работы явилось исследование направления дифференцировки, фенотипов и функциональной активности Т-лимфоцитов CD4+ в лимфоидных органах и легких при туберкулезной инфекции у мышей. Задачи исследования

1. Сравнить функциональную активность Т-лимфоцитов CD4+ с различным уровнем экспрессии поверхностного маркера дифференцировки CD27.

2. Исследовать динамику перехода (дифференцировку) Т-лимфоцитов ме>еду фазами CD27high и CD27,0W при иммунном ответе на антигены микобактерий in vitro и in vivo.

3. Изучить влияние лимфоцитов CD4+CD27lli9h и CD4*CD27low на бактериостатическую активность макрофагов.

4. Оценить размеры пула лимфоцитов CD4*CD27hi9h и CD4+CD27|0W в органах зараженных мышей с различной генетической чувствительностью к туберкулезной инфекции.

Научная новизна

1. Впервые проведено детальное исследование конечных этапов дифференцировки эффекторных Т-лимфоцитов CD4 и охарактеризованы изменения их поверхностного фенотипа.

2. Разработана модель для изучения дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4+ in vitro и продемонстрировано, что Т-лимфоциты CD4+CD62L|0WCD27|0W образуются из предшественников CD4+CD62L'°™CD27h!sU при ответе на антигены микобактерий.

3. Впервые показано, что при туберкулезе окончательная дифференцировка Т-лимфоцитов-эффекторов CD4+CD62L|0WCD27|0W из предшественников CD4+CD62Ll°wCD27íligh происходит in situ в легких.

4. Установлено, что субпопуляция Т-лимфоцитов CD4+CD62Ll0WCD27l0W отличается от субпопуляции CD4tCD62Ll0WCD27high более высоким уровнем экспрессии генов регуляторных и эффекторных цитокинов и хемокинов.

5. Впервые показано, что уровень апоптоза субпопуляций Т-лимфоцитов CD4+CD62Ll0WCD27hi9h и CD4*CD62L|0WCD27|0W разный в разных органах.

6. Обнаружено, что классические регуляторные Т-лимфоциты с фенотипом CD25h'9hFoxp3+ принадлежат к субпопуляции Т-лимфоцитов CD4+CD62Ll0WCD27hi3h.

7. Впервые проведено исследование влияния различных субпопуляций эффекторных Т-лимфоцитов CD4 на бактерицидную активность макрофагов и показано, что Т-лимфоциты CD4*CD62L|0WCD27'0W намного эффективнее активируют макрофаги в системе in vitro, чем клетки CD4+CD62Llm,CD27h'9h.

8. Впервые показано наличие прямой корреляции между накоплением в легких Т-лимфоцитов CD4tCD62LlowCD27low и уровнем протекции против туберкулезной инфекции.

Практическая значимость. Полученные экспериментальные данные о характере поверхностных фенотипов Т-лимфоцитов и о маркерах, характеризующих функциональную активность Т-клеток при туберкулезной инфекции, могут быть использованы для оценки эффективности Т-клеточного ответа у больных туберкулезом. Помимо этого, полученные результаты позволяют по-новому понять процессы дифференцировки и регуляции активности Т-лимфоцитов, что важно учитывать при разработке подходов к иммуномодуляции при туберкулезе. Хотя работа носит экспериментальный характер и посвящена выяснению фундаментальных механизмов иммунного ответа, полученные результаты могут оказаться важными для понимания легочной патологии и динамики защитных и деструктивных тканевых реакций у больных туберкулезом. Это может помочь разработке новых средств патогенетической терапии, в частности целенаправленной регуляции воспалительных реакций при туберкулезе. Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ЦНИИТ РАМН.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 25 декабря 2008 года на научной конференции отдела иммунологии ЦНИИТ РАМН. Основные положения диссертации были доложены на IX Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2006), Научной сессии, посвященной 85-летию ЦНИИТ РАМН (Москва, 2006), Первой летней школе по инфекционным заболеваниям Koch-Metschnikow-Forum (Германия, Берлин, 2006), X Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2007), Международном симпозиуме «Туберкулез: от лабораторных исследований к практической работе» (Keystone, 2007), Научно-практической конференции молодых ученых, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом (Москва, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ в отечественной и зарубежной печати, в том числе 2 в рецензируемых журналах. Структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, список литературы (203 источника) и выводы. Диссертация иллюстрирована 1 таблицей и 14 рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Животные

Опыты проводили на мышах инбредной линии C57BL/6 (В6) и гибридах (A/Sn х l/St)F2, поддерживаемых в питомнике ЦНИИТ РАМН в соответствии с требованиями по содержанию животных РАМН. В опытах использовали самцов и самок в возрасте 2-4 месяцев. В пределах одного эксперимента использовали животных одного пола.

2.2. Приготовление культуры М. tuberculosis

В работе использовали микобактерии М. tuberculosis штамма H37Rv (Pasteur). Микобактерии растили в жидкой среде Дюбо (Difco) при 37°С в течение 3 недель, суспендировали в стерильном физиологическом растворе с добавлением 0,05% твина 20 и 0,1% БСА (Sigma, USA), отмывали (ЗОООд, 15 мин), ресуспендировали и аликвотировапи по 1 мл и хранили при -70°С. Для заражения мышей и постановки экспериментов in vitro специально получали культуры микобактерий, находящихся в фазе логарифмического роста (Nikonenko et al., 1996). С этой целью аликвоту размораживали, переносили в 5 мл жидкой среды Дюбо, содержащей 0,5% БСА (среда «Дюбо-БСА»), и культивировали микобактерии при 37°С. Через неделю 3 мл суспензии микобактерий переносили в свежую среду Дюбо-БСА (20 мл). Еще через неделю микобактерии центрифугировали (ЗОООд, 15 мин), переводили в физиологический раствор и фильтровали через стерильные фильтры с диаметром пор 5 мкм. Для определения количества КОЕ микобактерий в суспензии отбирали 100 мкл, готовили серию последовательных разведений и 20 мкл каждого разведения помещали в капле на чашку Петри с агаром Дюбо (Difco). Через 3 дня под инвертированным микроскопом подсчитывали количество колоний в капле. В течение этого времени исходную взвесь микобактерий хранили при -4°С. В специальных экспериментах было показано, что при таком хранении количество КОЕ в суспензии остается стабильным (Majorov et al., 2003).

2.3. Экспериментальная туберкулезная инфекция

М. tuberculosis H37Rv Pasteur, находящиеся в фазе логарифмического роста, вводили мышам внутривенно. В большей части экспериментов микобактерии вводили в количестве 5 х 105 КОЕ/мышь (Nikonenko et al, 1996). В некоторых экспериментах кроме внутривенного введения использовали также введение микобактерии в трахею. В этом случае под гексеналовым наркозом (1 мг/г веса) вскрывали трахею и вводили мышам 103 КОЕ/мышь в объеме 50 мкл (Eruslanov et а!., 2004).

2.4. Подсчет микобактериальных колоний

Через 3 недели после заражения у мышей извлекали селезенку и легкие. Полученные органы гомогенизировали и серийные разведения в стерильном PBS высеивали на агар Дюбо. Растущие колонии подсчитывали визуально под бинокулярной лупой через 3 недели после высева.

2.5. Антигены

В качестве антигена в экспериментах использовали растворимую фракцию разрушенных ультразвуком М. tuberculosis H37Rv (соникат М. tuberculosis, Авдиенко и др., 2006).

2.6. Получение суспензий клеток селезенки и лимфатических узлов

Для получения суспензий клеток селезенки и лимфатических узлов у мышей после цервикапьной дислокации извлекали подмышечные лимфатические узлы и селезенку, гомогенизировали их в среде для отмывки и центрифугировали (1100 об/мин, 5 мин). При получении суспензий клеток селезенки эритроциты лизировали раствором NH4CI, после чего клетки отмывали 2 раза. Клетки переводили в среду для культивирования и подсчитывали количество жизнеспособных клеток с трипановым синим.

2.7. Получение суспензий клеток легкого

Суспензии клеток легкого получали по методу, предложенному ранее Holt et al. (1985). Под тиопенталовым наркозом промывали сосуды и воздухоносные пути раствором Версена для удаления клеток крови и альвеолярных клеток. Легкие извлекали, измельчали до кусочков размером 1-2 мм3 и инкубировали в течение S0 мин при 37°С и 5% С02 в 6 мл среды RPMI-1640, содержащей 2% FCS (HyClone), ЮмМ HEPES, коллагеназу (200 Ед/мл, Sigma, USA) и ДНКазу I (50 Ед/мл, Sigma, USA). После окончания инкубации перевар разбивали пипеткой, клетки отмывали (1100 об/мин, 5 мин) и переводили в среду для культивирования.

2.8. Получение суспензии перитонеальных макрофагов

Перитонеальные макрофаги выделяли из перитонеального экссудата (ПЭ) через 5 дней после внутрибрюшинной инъекции мышам 2 мл 3% пептона. Очистку от немакрофагальных клеток осуществляли адгезией макрофагов на культуральном пластике. Макрофаги переводили из монослоя в суспензию раствором Версена.

2.9. Выделение высокоочищенныхТ-лимфоцитов CD4-

В ряде экспериментов in vitro и in vivo использовали высокоочищенные популяции лимфоцитов CD4*. Выделение проводили с помощью сортировки в магнитном поле на бусах фирмы Miltenyi Biotec (Германия) методом негативной селекции в соответствии с рекомендацией фирмы производителя. Чистота популяций клеток составляла 85-95%. Для ряда экспериментов in vitro и in vivo выделяли высокоочищенные субпопуляции лимфоцитов CD62Lhi9hCD27hi9h, CD62Lh¡9t,CD27l0W, CD62L|0Ï"CD27|0W. Для этого Т-лимфоциты CD4+ инкубировали с антителами РЕ-aHTH-CD62L (BD Pharmingen). Затем выделяли высокоочищенные Т-лимфоциты CD62Ltow и CD62Lhlgh с помощью анти-РЕ MultiSort MicroBeads (Miltenyi Biotec) в соответствии с рекомендациями фирмы производителя. Из субпопуляции Т-лимфоцитов CD62L|0W получали высокоочищенные лимфоциты CD62Ll0WCD27h'9h и CD62LlowCD27hi0h путем окрашивания клеток антителами РЕ-анти-С027 (BD Pharmingen) и дальнейшем делением субпопуляций с помощью анти-РЕ MultiSort MicroBeads (Miltenyi Biotec). Чистота выделения составляла 98% и 95% для Т-лимфоцитов CD62Ll0WCD27hi9h и CD62LlowCD27hí3\ соответственно.

2.10. Постановка пролиферативного теста

Для определения антигенспецифического пролиферативного ответа 105 Т-лимфоцитов культивировали в лунках 96-луночного планшета в присутствие сингенных антиген-презентирующих клеток селезенки (АПК), обработанных митомицином С, и сониката микобактерий в культуральной среде с добавлением 5% FCS. Все культуры ставили в триплетах и культивировали в течение 72 часов в СОг-инкубаторе при 5% С02 и 37°С. На последние 18 часов культивирования в лунки вносили 0,5 мкКи [3Н]-тимидина. Затем содержимое лунок переносили на фильтр с помощью харвестера (Scatron) и определяли включенную радиоактивность на сцинтилляционном счетчике (Wallac).

2.11. Анализ клеток методом проточной цитофлуорометрии

Пробы, содержащие по 5x105 клеток окрашивали монокпональными антителами anti-CD4, anti-CD27, anti-CD62L, anti-Ly6G, anti-F4/80, anti-CD44, anti-CD25, anti-Foxp3, anti-IFN-у, anti-TNF-a, меченными FITC, РЕ, PerCP и APC в соответствии с рекомендациями фирм-производителей (BDPharmingen, Caltag, eBioscience).

Анализ клеток проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Beckton Dickenson).

2.12. Адоптивный перенос Т-лимфоцитов

Из селезенки инфицированных мышей выделяли Т-лимфоциты CD62Lh3\ CD62Ll0WCD27tl¡9h, CD62LlowCD27low и CD27high методом сортировки в магнитном поле (см. выше). Субпопуляции Т-лимфоцитов метили флуоресцентным красителем CFDA-SE (CFSE). Мышам-реципиентам вводили внутривенно 4х106 клеток/мышь и выявляли донорские клетки методом проточной цитофлу о рометрии.

2.13. Культивирование Т-лимфоцитов in vitro.

Для изучения изменения поверхностного фенотипа Т-лимфоцитов из селезенки мышей, инфицированных М. tuberculosis, выделяли Т-лимфоциты CD4 как описано выше. Клетки (3-5x105/лунку) культивировали в 24-луночных планшетах в присутствие сониката (8 мкг/мл) и rlL-2 (1нг/мл). В качестве АПК использовали клетки селезенки, обработанные митомицином С (1,5х106/пунку). Для того чтобы можно было различить отвечающие Т-лимфоциты и АПК, АПК метили CFDA-SE. В разные сроки после начала культивирования оценивали уровень экспрессии различных поверхностных маркеров на отвечающих лимфоцитах, а также уровень апоптоза (окраска 7-AAD/AnnV) методом проточной цитофлуорометрии.

2.14. Выделение суммарной РНК из суспензии клаток и получение кДНК. Для выделения тотальной РНК использовали 1,5-5x10° клеток. Выделение проводили при помощи набора SV Total RNA Isolation System (Promega, США) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию 2мкг тотальной РНК с помощью обратной транскриптазы M-MLV (Promega, США), согласно инструкции производителя. Для того чтобы обратная транскрипция проходила только с мРНК, в качестве праймеров использовали oíigo(dT)is-

2.15. Определение продукции цитокинов и хемокинов клетками методом ПЦР в реальном времени.

С помощью полуколичественного ПЦР в реальном времени (TaqMan® с использованием зондов, несущих двойную метку) оценивали транскрипцию генов цитокинов, хемокинов и транскрипционных факторов в различных субпопуляциях клеток, для чего использовали различные праймеры (ABI) и 2xPCR Master Mix Probe Assay (EGT Group). Уровень экспрессии сравнивали с экспрессией housekeeping-reHOB с постоянным уровнем экспрессии - GAPDH и актина. Анализ проводили на приборе ¡Cycler (Bio-Rad).

2.16. Культивирование макрофагов с микобактериями и Т-лимфоцитами.

Культивирование проводили в плоскодонных 96-луночных планшетах в среде без антибиотиков. Для этого очищенную суспензию перитонеальных макрофагов подвергали повторной адгезии в лунках планшета, после чего к сформированному монослою макрофагов добавляли: суспензию М. tuberculosis в разных концентрациях, Т клетки в разных концентрациях и rIFN-y мыши. Жизнеспособность микобактерий в смешенных культурах оценивали по избирательному включению 5,6-[3Н]-урацила. Секрецию (ЫОг)" макрофагами оценивали по концентрации нитрит-аниона в надосадочной жидкости культур, измеренной с помощью колорометрической реакции с реактивом Грисса (Migliorini et al., 1991).

2.17. Статистическая обработка результатов.

Полученные данные обрабатывали с помощью программы GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) по методам корреляционного и вариационного анализа (ANOVA) и критерия Стьюдента (t-тест). Достоверными считали различия при р<0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Субпопуляции Т-лимфоцитов CD4*, отличающиеся по уровню экспрессии молекул CD44, CD62L и CD27.

Для решения поставленных в работе задач требовалось четкое разделение различных популяций Т-лимфоцитов Сй4+, а именно: «наивных» лимфоцитов С044'™С0621М9,> и двух субпопуляций активированных клеток С0621|°"С027Ь1зМ и С0621'0ЛС027'°™. Идентификацию данных субпопуляций проводили, определяя уровень экспрессии на поверхности Т-лимфоцитов Сй4 молекул С044, С0621_ и С027. Как показано на рис. 1 А, «наивные» и активированные лимфоциты

«наивные» Т-димфоаиты

«иаишше* Т-Л№лфацигы

сяобгь^сжп1^

Т лимфвццты-зффекторы CDÍJL^CDÍT4®

Т внифоциш-эффекгоры CD61Ll>,"CDa7b«'_

10.9 Im

* 1 . а,*

/ СШ4

Т ¿йшфоцшы-эффекторы

схм^сзжа^

CD27

Рисунок 1. Идентификация различных субпопуляций Т-лимфоцитов CD4 по уровню экспрессии поверхностных маркеров CD44. CD62L и CD27.

10

можно отличить по уровню экспрессии одного из двух рецепторов, CD44 или CD62L. Далее в большинстве экспериментов для идентификации эффекторных лимфоцитов использовали маркер CD62L.

Анализ экспрессии молекул CD27 на лимфоцитах CD4+ подтвердил полученные ранее данные о том, что все «наивные» лимфоциты имеют высокий уровень экспрессии молекул CD27, а активированные Т-кпетки различаются по экспрессии данного маркера. Это позволяет идентифицировать две основные субпопуляции активированных лимфоцитов, CD62Ll0WCD27hi9h и CD62Ll0wCD27l0" (Рис.1 Б).

3.2. Дифференцировка Т-лимфоцитов CD4+CD62LlowCD27low.

3.2.1. ДиФФеоенцировка in vitro.

В первой серии экспериментов был получен ответ на вопрос, появляются ли Т-лимфоциты CD4+D62L'°wCD27hig,, и CD4+CD62Llo"CD27low вследствие независимых путей дифференцировки Т-клеток, или представляют ее последовательные этапы. Для решения этого вопроса была разработана модель in vitro. Мышей В6 внутривенно инфицировали М. tuberculosis', через три недели из селезенки выделяли Т-лимфоциты CD4+, которые в дальнейшем делили на субпопуляции CD62LlowCD27W9h и CD62L|0WCD27,0W (см. Материалы и Методы). Лимфоциты культивировали в присутствии АПК, сониката микобактерий и rlL-2. Для того чтобы в дальнейшем исключить АПК из анализа их окрашивали CFDA-SE (рис. 2А). На разных этапах культивирования оценивали поверхностный фенотип Т-лимфоцитов. В культурах, «стартовавших» из состояния «CD4+CD27h'sh» накапливались клетки с фенотипом CD62llowCD27low (Рис. 2Б, Г)-

В принципе, накопление лимфоцитов CD62LlawCD27lov' могло быть следствием различных процессов, а именно:

1. дифференцировки клеток CD62Ll0WCD27hi9h в клетки CD62L,0wCD27low;

2. преимущественной пролиферации небольшой примеси клеток CD62L|0V*CD27|0W, исходно присутствующих в культурах «CD4+ CD27

3. преимущественной гибелью клеток CD62Ll°wCD27l"9h и выживанием небольшого количества лимфоцитов CD62L|0WCD27|0W, исходно присутствующих в культурах.

Для проверки этих возможностей были проведены эксперименты по сравнению пролиферативной активности и уровня апоптоза Т-лимфоцитов CD62LlowCD27i"eh и CD62L|0WCD27,0W в культурах. Оказалось, что пролиферативная активность

ssc tj

День 1

V

„ 36,1 0064 66.1. ' у г .. 16.4

3.63

-

».7 0.01 1.46 0.23

"5.Z-. . . 'у, « jr 9/ДХ

10 21 30 дни культивирования

Рисунок 2. Т-лимФоииты СР4:ЬСР621.1а!'СР27ш снижают экспрессию молекул CD27 in vitro. (А) Исключение АПК из анализа путем их окрашивания CFDA-SE. Анализ содержания Т-лимфоцитов CD62L|OV'CD27'OW в культурах «CD4*CD27h'sh» (Б) и «CD4*CD27'™» (В). (Г) Анализ накопления Т-лимфоцитов CD62L|OWCD27|OW при культивировании клеток CD62Ll°wCD27hlgh. j - рестимуляция клеток.

клеток CD4+CD27h'8h лишь незначительно изменялась в процессе культивирования, тогда как клетки CD4+CD27I,>V" активно пролиферировали на ранние сроки, а к 7 дню уровень пролиферации резко падал (рис. ЗА). Таким образом, накопление лимфоцитов CD62L|0WCD27I°W в культурах «CD4+CD27hi9*» не объясняется преимущественной пролиферацией примеси клеток CD62LlowCD27low в этих культурах. При сравнении уровня апоптоза в культурах лимфоцитов «CD4+CD27hi9h» и «CD4+CD27low» оказалось, что доля апоптотических клеток (Апп-V*) значительно выше в субпопуляции CD62L'0V,CD27I|0W (рис. ЗБ). д _День 2

15000

10000

Е 5000 о 5000

2500

0

CD62U~CD27^ CD62Lk~CD27'~

День 7

Ann V

С02/°" CD27I,'»,^ CD27iowC027hieh

I-1 ArmV-APC, 7JAD

ЕШ Т-ААЭ

Рисунок 3. ПролисЬерация (А) и апоптоз клеток (Б) в культурах «СР4-СР27Ш1» и «CD4±CD27lg%

Таким образом, накопление лимфоцитов С0621|0"С027'°" в культурах «С04+С027"19'1» не может быть следствием избирательной гибели клеток

CD62Llov"CD27h'9h и преимущественного выживания примеси клеток CD62L|0WCD27|0W.

Как показано на Рис. 2 и 4, при сравнении содержания живых клеток и числа лимфоцитов CD62L|0WCD27|0W в культурах на разные сроки после начала культивирования были установлено, что, несмотря на раннюю пролиферацию лимфоцитов CD62Ll0WCD27k"*', количество живых клеток в культуре «CD4*CD27|0W» значительно ниже, чем в культуре «CD4+CD27hlgh». Число эффекторов CD62L|OWCD27|OW резко уменьшалось в культуре «CD4+CD27|0VV», но оставалось приблизительно постоянным в культуре «CD4*CD27h'9V Мы пришли к выводу, что Т-лимфоциты CD62L'°™CD27h'9h при стимуляции антигеном in vitro дифференцируются в лимфоциты CD62L'°WCD27,0W. Последние представляет собой конечную стадию дифференцировки.

Рисунок 4. Т-лимфоциты CD4 СР27М снижают экспрессию молекул CD27 in vitro. Количество живых Т-лимфоцитов CD4 (А) и Т-лимфоцитов 00621^X027'™ (Б) в культурах клеток «CD4 CD27h«% (.) и «CD4 CD27low» (о).

3.2.2. Дифференцировка от vivo

В следующей серии экспериментов мы исследовали дифференцировку Т-лимфоцитов CD62LlowCD27hi9h и CD62L|0WCD27|0W in vivo. С этой целью использовали модель адоптивного переноса Т-лимфоцитов (Рис. 5). Мышей-доноров внутривенно инфицировали М. tuberculosis, через три недели с помощью сортировки из селезенки выделяли следующие популяции Т-лимфоцитов CD4+: CD27bigh, CD62Ll0WCD27h¡9h, CD62L,0WCD27l0W. Клетки метили CFSE и переносили сингенным реципиентам (4 х 106/мышь), которые также были заражены М. tuberculosis за три недели до эксперимента. Через 24 часа после введения определяли фенотип клеток донора в органах реципиентов.

Т-лимфоциты с фенотипом CD27h'3h мигрировали как в лимфоидные

органы, так и в легкие, в то время как лимфоциты С062и°"С027к™ накапливались преимущественно в легких, в меньшей степени в селезенке, и практически не

5

«и 25-

0-

0 5 10 15 20

дникутьтаироважя

Atf.fb. в.в.

3 недели

селекция «слеток в магнитном поле окрашивание CFDA-SE

7 Г

\

CD62Lho» J | CD62LI°"CD27,'H* | | CD62LI°"CD27'°™ |

r s^X

3 недели

Рисунок 5. Схема эксперимента: адоптивный перенос различных субпопуляций Т-лимфоцитов CD4.

определялись в ЛУ (рис. 6). Анализ фенотипов донорских клеток показал, что основная часть клеток CD27hieh, мигрировавших в лимфоидные органы, сохраняли высокий уровень экспрессии CD27. Напротив, часть T-лимфоцитов CD27hJ9h (CD27hig\ CD62Ll0WCD27hish) мигрировавших в легкие, приобретала фенотип CD62L|0WCD27'°W (рис. 6).

Фенотип Фенотип клеток донора, перенесенных донорских реципиентам

клеток

ЛУ

Селезенка

Легкие

CD27hi8tl

CD62u»CD27w

CD62L!GWCD27"™

CD27

19.5 л, . ео.1

¡¿¡¡¡Ш-; Яг'

1.32 ,

Яр' 1»' 11*

)7.1

# 0.017

• 2.76

6.43 1.06

Ш

г •т-

Ш1 г »0+4

• м

24+6

А ',> '

количество клеток донора

Недостаточное ä, ' количество ?, клеток донора

-67 V .Г . 29 С 32 h-

V 62

1» 'tmiinij'

Ш L

* * ■

85±2

89+1

CD62L

Рисунок 6. Т-лимфоииты-зффекторы в легких снижают экспрессию молекул CD27.

Таким образом, как in vitro, так и in vivo, лимфоциты CD62L|0WCD27|0W, образуются из предшественников CD62LlowCD27h'9h, которые снижают экспрессию молекул CD27. Поскольку донорские клетки фенотипа CD27|0W обнаруживались только в легких, мы полагаем, что снижение экспрессии CD27 происходит непосредственно в данном органе.

3.2.3. Апоптоз субпопуляций Т-лимФоцитов CD41 в лимфоидных органах и легких

Исследования дифференцировки лимфоцитов CD62L|0WCD27|DW in vitro показали, что данная субпопуляция обладает высокой предрасположенностью к апоптозу (Рис. ЗБ), вероятно, представляя собой терминально дифференцированные клетки. Для исследования жизнеспособности этих клеток in vivo, в следующей серии экспериментов мы определили уровень апоптоза в трех популяциях клеток. Доля аполтотических клеток AnnV4 среди лимфоцитов CD62Lh'9hCD27h'9h оказалась низкой и одинаковой во всех исследуемых органах и у инфицированных, и у здоровых мышей, а среди лимфоцитов CD62Ll0WCD27h'9h и CD62L'°wCD27tow - высокой в ЛУ и низкой в легких (Рис. 7). Во всех исследованных органах среди трех анализируемых популяций лимфоцитов наиболее подвержены апоптозу высоко дифференцированные клетки CD62L|0WCD27|QW.

s »

s

t

с <

se

i

li

J

GS CD62Lh®fl€D27h®h ■ CD62Ll™'CD27s8h □ CD62LlavCD27la!f

[Л

ЛУ Сепезаив Лекме ЛУ Селеэежа Лепте

Рисунок 7. Апоптоз в различных субпопуляциях Т-лимфоцитов CD4- в органах контрольных (А) и инфицированных (Б) мышей.

Итак, лимфоциты CD62LlowCD27h'sh находятся на более ранней стадии дифференцировки, чем лимфоциты CD62LlowCD27low. Последние имеют высокую предрасположенность к апоптозу и относительно низкую жизнеспособность. Лимфоциты CD4+CD62LlowCD27'ow, по-видимому, представляют собой терминально дифференцированные клетки. Наконец, полученные нами данные показывают, что образование лимфоцитов CD62L|OWCD27|OW из предшественников CD62L,0WCD27hi9h происходит, главным образом, за пределами лимфоидных органов, непосредственно в очагах воспаления.

3.3. Сравнительный анализ функциональной активности Т-лимфоцитов С0621_|°"С027ЫдК и СОбг^СОг?10™

Следующая серия экспериментов была посвящена сравнению функциональной активности Т-пимфоцитов СОбги^СОг?'1''911 и С0621|И,С027'0,\ Известно, что высокодифференцированные клетки в очаге инфекции секретируют регуляторные и эффекторные молекулы (хемокины и цитокины), способствующие направленной миграции и активации нейтрофилов, моноцитов/макрофагов и дендритных клеток (Р1упп е1 а1., 2001). В связи с этим нам было интересно сравнить функциональную активность лимфоцитов С06211о1"С027,"эИ и ' по уровню экспрессии генов, кодирующих цитокины и хемокины. 24 _

■■ с0Б2(_(о«С027ЫдЬ

^ I—I срвги^сог?10'

IFN-g TNF-a ÍP-10 RANTES Mip-2 Mip-ta Mip-1b Рисунок 8. Изменение экспрессии генов хемокинов и цитокинов в Т-эффекторах СР621^Р27М и CD62ÜggCD27—.

Мышей В6 внутривенно инфицировали М. tuberculosis, через три недели из селезенки выделяли Т-лимфоциты CD62Ll0WCD27hi9h и CD62LlowCD27bw, получали РНК и оценивали экспрессию генов для цитокинов и хемокинов методом Г1ЦР в реальном времени. Субпопуляция эффекторов CD62LiowCD27low характеризуется более высоким уровнем мРНК для цитокинов IFN-y и TNF-a (Рис. 8), а также хемокинов Mip-1a, Mip-ip, Mip-2, IP-10 и RANTES, способствующих миграции макрофагов, нейтрофилов и ДК в зону инфекции (рис. 8). Эти медиаторы принимают непосредственное участие в активации макрофагов (IFN-y и TNF-a), развитии воспаления (Mip-2, TNF-a) и привлечении клеток в очаг инфекции (Mip-1a, Mip-1 (3, Mip-2, IP-10 и RANTES).

А

Б

СГЗ CD62LlawCD27íll®fl ■■ CD62LtowCD27kw

I

1

? 5.0-

I el Й..П i,I -

2.5-

ЛУ Селезенка Легкие

ЛУ

Рисунок 9. Секреция цитокинов IFN-v (А) и TNF-g (Б) клетками 0062^0027^ и CD62LfeííCD27!íM

Уровень продукции наиболее важных в иммунном ответе при туберкулезе цитокинов был исследован и на белковом уровне. Мышей инфицировали М. tuberculosis, через три недели выделяли клетки из ЛУ, селезенки и легких, культивировали в присутствии сониката микобактерий и блокатора секреции GolgyPlug, после чего с помощью проточной цитофлуориметрии оценивали долю клеток CD62Ll0WCD27hi9h и CD62LlowCD27low, продуцирующих цитокины. Доля лимфоцитов, продуцирующих цитокины IFN-y и TNF-a, оказалась существенно выше в субпопуляции CD4+CD62L|0WCD27|0W (Рис. 9А и Б).

Наши данные показывают, что Т-лимфоциты CD62LlowCD27low -высокодифференцированные эффекторы. В очаге инфекции эти клетки являются основными продуцентами IFN-y, стимулирующего бактерицидную активность макрофагов (Collins and Kaufmann, 2001; Mogues et al., 2001). Кроме того, этими клетками секретируются цитокины и хемокины, ограничивающие распространение инфекции за счет привлечения других клеток иммунной системы, участвующих в образовании гранулем (Agloog et al., 2005; Flynn et al., 1995; Yoshie 2000; Luster 2002). Полученные нами данные дают возможность утверждать, что Т-лимфоциты CD4+CD62Ll0"CD27i0W активированы сильнее своих предшественников CD62LlowCD27hlgh, причем максимальная степень активации и минимальный уровень апоптоза наблюдается в легких. Совокупность этих признаков описывает особый механизм, позволяющий аккумулировать высокодифференцированные клетки-зффекторы именно там, где развивается инфекция.

3.4. Среди Т-лимфоцитов CD62L,owCD27h'9h имеются как эффекторные, так и регуляторные клетки

Среди разнообразных популяций Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ имеются клетки, чьей функцией является подавление иммунного ответа. В частности, эту функцию обеспечивают регуляторные Т-кпетки, имеющие фенотип

С04+С025+РохрЗ+ (Tang et al., 2008). Мы решили проверить, к какой из субпопуляций Т-лимфоцитов, CD62Ll0WCD27h¡9h или CD62L|0WCD27|0W, могут принадлежать регуляторные Т-клетки. Экспрессия поверхностного фенотипа CD4+CD25'f и транскрипционного фактора Foxp3+ исследовалась в субпопуляциях эффекторов. Мышей внутривенно заражали М. tuberculosis и через 3 недели в ЛУ, селезенке и легких определяли фенотип Т-клеток. Экспрессия маркера CD25 и транскрипционного фактора Foxp3 обнаруживалась среди клеток из субпопуляции лимфоцитов СОбг^СОг?"1911 (Рис. 10А, Б). При этом регуляторные клетки (Тгед) накапливались преимущественно в лимфатических узлах и селезенке, а не в легких (рис. 10А, Б). Таким образом, Т-лимфоциты CD62LlowCD27hl9h включают и эффекторы, и регуляторные Т-клетки, причем процент регуляторных клеток минимален в очаге инфекции, что, вероятно, способствует развитию противомикробного ответа.

CD271

CD27

Éjt

CD25

51 ::•.:• . 14 " ÉÉ

:* Ъ

ILx

II

П

У

ш CD62LfowCD27^gh CD62LIWiCD27lQW

A L

Селезенка Легкие

Foxp3

Рисунок 10. Регуляторные Т-клетки принадлежат к субпопуляции лимфоцитов 00621-^0027™. Содержание регуляторных Т-кпеток в субпопупяциях CD62Ll°wCD27l1igh и CD62Lk>wCD27low оценивали по экспрессии маркера CD25 (А) и транскрипционного фактора Foxp3 (Б).

3.5. Влияние клеток CD27lowHa антимикробную функцию макрофагов

Протективный иммунный ответ при туберкулезной инфекции во многом определяется присутствием активированных Т-лимфоцитов CD4+, способных к секреции IFN-y, который, в свою очередь, активирует бактерицидную функцию макрофагов. (Collins and Kaufmann, 2001; Mogues et al., 2001). Поскольку высокой способностью к продукции IFN-y, а также хемокинов, отвечающих за миграцию макрофагов, обладают Т-лимфоциты CD62L|OWCD27|OW, мы решили сравнить

способность клеток CD62LlowCD27hl9,, и CD62LtowCD27law активировать макрофаги. Макрофаги перитонеального экссудата мышей В6 культивировали в присутствии М. tuberculosis и разного числа Т-лимфоцитов CD62L|0WCD27'°W или CD62Ll0WCD27hl9h. Через 72 часа после начала культивирования клеток оценивали жизнеспособность микобактерий по включению последними [3Н]-урацила и активность макрофагов по продукции N0. В качестве положительного контроля использовали культуры зараженных макрофагов, к которым добавляли рекомбинантный IFN-y.

Без дополнительной стимуляции макрофаги умеренно ограничивали рост микобактерий (рис. 11). При высоком содержании Т-лимфоцитов в культурах (соотношении Т-лимфоцит:макрофаг от 1:1 до 5:1) обе субпопуляции Т-клеток вызывали подавление жизнеспособности микобактерий на 80-90%. Различия между исследуемыми популяциями Т-клеток были выявлены при снижении их количества в культуре. При соотношении Т-клетка: макрофаг = 1 : 25,

явв CD62U°wCD27,íSh

я1оо-| сйбгь'^сог?10"

in

75- ■

ш s 851 -г Г| г3^

7 2 Щ Щ П s s 5°- ж ж

р LI i

1:1 5:1 25:1

макрофаг : Т клетка

Рисунок 11. Антимикобактериальная активность перитонеапьных макрофагов. Прямая -подавление роста микобактерий макрофагами без дополнительного стимула (контроль). (*) - достоверное отличие от контроля.

клетки CD62LlowCD27h'eh угнетали жизнеспособность микобактерий приблизительно на 35%, а клетки CD62LlowCD27low - более, чем на 50% (Р < 0,05, Рис. 11).

Перитонеальные макрофаги спонтанно секретировали незначительное количество нитрит-аниона, которое не изменялось при добавлении в культуру микобактерий (3.4 ± 0.8рМ и 3.9 ± 0.8рМ, соответственно). IFN-y оказывал сильное стимулирующее действие на продукцию нитрит-аниона зараженными и интактными макрофагами (33.8 ±3 уМ и 45.3 ±2.2 цМ, соответственно). При добавлении Т-лимфоцитов в соотношении Т-лимфоцит:макрофаг = 1:1 и 1:5 наблюдалась существенная стимуляция продукции нитрит-аниона (Рис. 12). При снижении количества Т-лимфоцитов в культуре были выявлены различия между субпопуляциями CD62L'°wCD27h¡9h и CD62L|0WCD27|0W: при соотношении Т

лимфоцигмакрофаг = 25:1 лимфоциты С0621|о,"С027||:™" все еще активировали макрофаги, а влияние лимфоцитов CD62LIo"'CD27h'9h исчезало (рис. 12).

макрофаг: Т клетка Рисунок 12. Т-лимФоциты CD62L—CD27— эффективнее активируют макрофаги. Пунктир -1 FN-y (100Ед/мл).

3.6. Содержание в легких Т-клеток CD4+CD27l0W и тяжесть течения инфекции

Поскольку Т-лимфоциты CD62LlowCD27low эффективнее активируют макрофаги по сравнению с Т-лимфоцитами CD62LlowCD27h'9h, мы провели прямой анализ роли этих клеток при ТВ. Для этого мы проанализировали накопление лимфоцитов CD62L'°wCD27bw в легких мышей с различной генетической восприимчивостью к инфекции. Мышей чувствительной к ТБ линии I/St скрещивали с мышами резистентными к инфекции линии A/Sn, и гибридов первого поколения скрещивали между собой, чтобы получить гетерогенную популяцию гибридов второго поколения F2. Чувствительность к туберкулезу гибридов (A/Sn х l/St)F2 варьирует в широких пределах (Nikonenko et al., 2000; Sanchez et al., 2003). При достаточно большой выборке можно считать, что аллели разных генов, унаследованные от родителей с разным уровнем чувствительности «перемешаны» у чувствительных и резистентных гибридов в близких соотношениях. Более того, такая генетически расщепляющаяся выборка гибридов F2 в большой степени отражает естественную ситуацию в гетерогенных популяциях человека и животных.

Мышей (A/Sn х l/St)F2 инфицировали М. tuberculosis и на 4-й неделе после заражения, когда индивидуальные различия по тяжести течения заболевания становятся очевидными, исследовали содержание Т-лимфоцитов CD4+CD62Ll0WCD27h¡sh и CD4+CD62LlowCD27bw в легких. В качестве коррелята тяжести течения инфекции была использована степень кахексии на момент исследования, поскольку этот показатель напрямую связан со сроком выживания (Lavebratt et al., 1999). Был обнаружен высокий уровень корреляции между потерей

в CO62Ll0WCD27h,sh □ CD62LlMCD27iow

1.1

5.1

25.1

А

Б

г =0,4820 р <0,0001

г = 0,4043 р< 0,0001

2 50

25

-30 -21) -10 0 10 20 30 40 50 % потери веса

-30 .20 -10 0 10 20 30 40 50

Рисунок 13. Накопление в легких Т-лимФоиитов-эФФекторов СР4 00621,^027— коррелирует с уменьшением тяжести течения туберкулезной инфекции.

веса и количеством лимфоцитов разных типов Т-кпеток в легких (Рис. 13): прямая корреляция для клеток С0621|0"С027Ь'9Н (коэффициент корреляции Спирмана, г = 0,482; р<0,0001) и обратная для клеток С0621|0"С027|°У' (г = -0,4043; р=0,0001). Таким образом, в генетически гетерогенной популяции показано, что увеличение пула Т-клеток С04+С027'°" в легочной ткани на самом деле важно для протективного ответа.

1. Установлено, что субпопуляции Т-лимфоцитов CD4+CD62L,0WCD27|0W и CD4+CD62L'°wCD27hiah отличаются по степени дифференцировки и функциональной активности.

2. Впервые показано, что при ответе на антигены микобактерий клетки-эффекторы CD4+CD62Llov"CD27,ow образуются из менее дифференцированных Т-лимфоцитов CD4+CD62LloivCD27hitJh не в лимфоидных органах, a in situ в легочной ткани.

3. Обнаружено, что субпопуляция Т-лимфоцитов CD4+CD62Ll0WCD27'°" отличается от субпопуляции CD4+CD62LlowCD27hl3h более высоким уровнем экспрессии генов для цитокинов TNF-a, IFN-y, IL-12 и хемокинов Mip-1a, Mip-1|3, Mip-2, IP-10, RANTES.

4. Установлено, что Т-лимфоциты CD4+CD62L'°"CD27'°W более эффективно активируют бактериостатические функции макрофагов в системе in vitro по сравнению с Т-лимфоцитами CD4+CD62Ll0WCD27high.

ВЫВОДЫ

5. Впервые обнаружено, что классические регуляторные Т-клетки с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ принадлежат к популяции Т-пимфоцитов CD4+CD62LlowCD27Wsh.

6. Впервые показана прямая корреляция между накоплением в легких Т-лимфоцитов CD62LI°V"CD27|0W и уровнем протекции против туберкулезной инфекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Капина М.А., Шепелькова Г.С., A.C. Апт, Лядова И.В. Миграция зффекторных лимфоцитов CD4 в легочную ткань при экспериментальной туберкулезной инфекции. Медицинская Иммунология, Санкт-Петербург, 2006, 8(2-3), стр.:144.

2. Шепелькова Г.С., Капина М.А., Лядова И.В. Дифференцировка зффекторных лимфоцитов CD4+CD27hl и ее роль в формировании лротективного ответа при экспериментальной туберкулезной инфекции. Медицинская Иммунология, Санкт-Петербург, 2006,8(2-3), стр.: 192.

3. Лядова И.В., Капина МА., Шепелькова Г.С., В.В. Сосунов, Т.В. Радаева, Т.К. Кондратьева, A.C. Апт. Механизмы чувствительности и резистентности к туберкулезной инфекции: анализ с использованием нового экспериментального подхода. Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких. Материалы научной сессии, посвященной 85-летию ЦНИИТРАМН, Москва, 2006, стр.:60-61.

4. Капина М.А., Шепелькова Г.С., Авдиенко В.Г., Гусева А.Н., Сосунов В.В., Апт A.C. Исследование роли IL.-11 в регуляции иммунного ответа при экспериментальной туберкулезной инфекции. Медицинская Иммунология, Санкт-Петербург, 2007, 9(2-3), стр.:142-143.

5. М.А. Kapina, G.S. Shepelkova, V.V. Mischenko, P. Sayles, P. Bogacheva, G. Winslow, A.S. Apt, and I.V. Lyadova. CD27|0W CD4 T lymphocytes that accumulate in the mouse lungs during Mycobacterial infection differentiate from CD27h'9h precursors in situ, produce IFN-y, and protect the host against tuberculosis infection. The Journal of Immunology, 2007,178, p.:976-985.

6. Шепелькова Г.С. Оценка функциональной активности субпопуляций эффекторов CD4 CD27hl и CD4 CD27'0. Новейшие технологии в эпидемиологии, диагностике, профилактике и лечении больных

туберкулезом и других заболеваний легких. Сборник материалов научно-практической конференции молодых ученых, посвященных Всемирному дню борьбы с туберкулезом, 2007, стр.:61-64.

7. Лядова И.В., Капина М.А., Шепелькова Г.С., Винслоу Г., Апт A.C. Дифференцировка Т-лимфоцитов и регуляция восспалительных реакций в очаге инфекции. Медицинская Иммунология, Санкт-Петербург, 2007, 9(2-3), стр.:151-152.

8. Шепелькова Г.С., Капина М.А., Лядова И.В. Различия в функциональной активности субпопуляций эффекторов CD4"CD27hl и CD4+CD27'° при экспериментальной туберкулезной инфекции. Иммунология, Санкт-Петербург, 2007, 9(2-3), стр.:173-174.

9. Lyadova l„ Kapina M., Shepelkova G., Sosunov V., Racine R., Winslow G., Apt A. Segregation analysis in F2 hybrid mice reveals a role for CD27|0 CD4 T cells in ТВ protection and increased proinflammatory factor expression in ТВ pathology. Tuberculosis:From lab research to field trials. Part of the Keystone Symposia. Global Health Series. March 20-25, 2007, p.114.

10.Шепелькова Г.С. Влияние CD62L'°CD27hi и CD62L'°CD27|0 эффекторных T лимфоцитов на активацию макрофагов при экспериментальной туберкулезной инфекции. Новейшие технологии в эпидемиологии, диагностике, профилактике и лечении больных туберкулезом и других заболеваний легких. Сборник материалов научно-практической конференции молодых ученых, посвященных Всемирному дню борьбы с туберкулезом, 2008, стр.:76-78.

И.Линге И. А., Рубакова Э. И., Шепелькова Г.С., Апт А. С., Кондратьева Т. К. Исследование роли B-клеток в формировании противотуберкулезного иммунитета. Пробл. Туберк. Болезн. Легк., 2009, 2, стр.:62-64.

Подписано в печать:

27.02.2009

Заказ № 1649 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы

В настоящее время туберкулез (ТБ) является одной из самых распространенных и опасных инфекционных болезней в мире. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в течение последних десяти лет зарегистрированы 90 миллионов новых случаев заболевания активным туберкулезом и около 30 миллионов смертей от этого заболевания [WHO]. Несмотря на то, что вакцинация детей вакциной BCG охватывает около 85% населения Земли и что в основном устранен дефицит противотуберкулезных препаратов первого ряда, по данным ВОЗ за 2004 г. в мире зарегистрировано 14,6 млн. больных ТБ, в том числе 8,9 млн. новых случаев. Смертность от ТБ составляет 1,5 — 2 млн. в год [WHO; Frieden et al., 2003].

Основными подходами к лечению и профилактике туберкулеза являются химиотерапия и вакцинация BCG, однако оба они часто оказываются неэффективными. Так, химиотерапия не эффективна при устойчивости штаммов М. tuberculosis к применяемым антибиотикам, а распространенность таких штаммов в мире постоянно нарастает. К этой категории относятся штаммы, резистентные к одному-двум препаратам, к нескольким препаратам первого ряда (MDR-штаммы) и ко многим препаратам первого и второго ряда (XDR-штаммы) [Espinal et al., 2001; Migliori et al., 2007]. Эффективность вакцины BCG для профилактики заболевания ТБ колеблется от 0 до 80 процентов в разных популяциях [Colditz, 1994]. Причины такой вариабельности остаются неясными, несмотря на ряд попыток разобраться в этом вопросе. Наконец, на частоту ТБ с клиническими проявлениями существенно влияет пандемия ВИЧ-СПИД [Corbett et al., 2003]. Таким образом, неблагоприятное влияние на ситуацию оказывают факторы, связанные как с паразитом, так и с хозяином, и все они имеют глобальное распространение.

Разработка новых противотуберкулезных вакцин и лекарств, эффективных против ТБ, требует точных знаний о том, каким образом происходит формирование противотуберкулезного иммунного ответа и какие клеточные и молекулярные механизмы обеспечивают протекцию при туберкулезной инфекции. Считается, что одним из основных факторов защиты при туберкулезной инфекции являются Т-лнмфоциты с фенотипом CD4+. В очаге инфекции эффекторные лимфоциты CD4+ продуцируют IFN-y, который активирует как прямую аптимикобактериальную активность макрофагов, так и выработку последними TNF-a и IL-12 - главного индуктора самого IFN-y [Collins and Kaufmann, 2001; Mogues et al., 2001; Cooper et al., 2002; Апт и др., 2008]. В связи с этим дифференцировка Т-лимфоцитов и образование клеток, секретирующих IFN-y, - это ключевые события в адаптивном иммунном ответе при туберкулезной инфекции. До настоящего времени подробно были изучены лишь процессы дифференцировки, происходящие в лимфатических узлах. Однако открытым оставались вопросы о том, что происходит собственно в легочных очагах инфекции, через какие стадии проходит клетка в процессе дифференцировки, существуют ли специфические маркеры клеток, находящиеся на разных этапах дифференцировки, на какой стадии дифференцировки клетки приобретают способность мигрировать в очаг инфекции.

Ранее И. Лядовой и соавторами было показано, что после иммунизации мышей BCG пул активированных легочных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ CD44llighCD62L,cnv включает две субпопуляции, отличающиеся по уровню экспрессии молекул CD27. Высокой способностью к продукции IFN-y обладают только лимфоциты CD62LlovvCD27lovv [Lyadova et al., 2004]. Однако до настоящего времени оставалось невыясненным, отличаются ли эффекторные лимфоциты CD62Ll0WCD27high и CD62LIowCD27low по другим характеристикам, каковы взаимоотношения между этими субпопуляциями в процессе дифференцировки, и какова роль каждой из них в формировании протективного иммунитета при экспериментальной туберкулезной инфекции. Эти вопросы и определяют актуальность данной работы.

Цель и задачи исследования

Значительная часть информации о патогенезе ТБ и иммунном ответе на инфекцию была получена в эксперименте. Недаром рабочее совещание NIH по исследованию ТБ рекомендовало считать моделирование инфекции на лабораторных животных методом выбора для анализа патогенеза, иммунного ответа и генетического контроля заболевания [Smith et al., 2005]. Как и при других медико-биологических исследованиях, основным объектом для изучения экспериментального ТБ послужили инбредные лабораторные мыши, что объясняется следующими причинами.

Основные характеристики первичного и адаптивного иммунного ответа на микобактерии, в частности, защитная роль Т-лимфоцитов CD4+, IFN-y и TNF-a, сходны у человека и мыши [North, Jung, 2004]. Показано, что при заражении генетически резистентных к туберкулезу мышей низкими дозами микобактерий у них развивается выраженный иммунитет к М. tuberculosis, способный в течение долгого времени контролировать размножение микобактерий, что приводит к хронической туберкулезной инфекции.

Латентный туберкулез, развившийся на фоне лечения антибиотиками у генетически чувствительных мышей, как и у людей, может спонтанно реактивироваться и переходить в активную форму [Радаева и др., 2002; Radaeva et al., 2005; 2008]. Мыши незаменимы для генетического анализа, в том числе для обширных экспериментов по генетическому картированию в масштабах всего генома, благодаря наличию огромного числа инбредных конгенных, рекомбинантных и мутантных линий с разной чувствительностью к туберкулезу [Fortin et al., 2007; Yan et al., 2006]. Наконец, исследования на лабораторных мышах обеспечены бесконечным рынком реактивов и тест-систем для иммунологических и генетических экспериментов, тогда как для других лабораторных жнвотных аналогичный рынок достаточно скуден. Поэтому сформулированные нами цель и задачи исследования базируются на изучении туберкулезной инфекции на модели лабораторных инбредных мышей.

Целью работы стало исследование направления дифференцировки, фенотипов и функциональной активности Т-лимфоцитов CD4+ в лимфоидных органах и легких при туберкулезной инфекции у мышей.

В связи с этим, были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить функциональную активность Т-лимфоцитов CD4+ с различным уровнем экспрессии поверхностного маркера дифференцировки CD27.

2. Исследовать динамику перехода (дифференцировку) Т-лимфоцитов между фазами CD27hlgh и CD27low при иммунном ответе на антигены микобактерий in vitro и in vivo.

3. Изучить влияние лимфоцитов CD4+CD27lligh и CD4+CD27low на бактериостатическую активность макрофагов.

4. Провести количественную оценку пула лимфоцитов CD4" и

CD4+CD27Iow в органах зараженных мышей с различной генетической чувствительностью к туберкулезной инфекции.

Научная новизна

1. Впервые проведено детальное исследование конечных этапов дифферепцировки эффекторных Т-лимфоцитов CD4 и охарактеризованы изменения их поверхностного фенотипа.

2. Разработана модель для изучения дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4+ in vitro и продеманстрировано, что Т-лимфоциты CD4+CD62Ll№CD27l0H образуются из предшественников CD4+CD62Ll№CD27h,gh при ответе на антигены микобактерий.

3. Впервые показано, что при туберкулезе окончательная дифференцировка Т-лимфоцитов-эффекторов CD4+CD62LlowCD27low из предшественников

CD4+CD62Ll0WCD27high происходит in situ в легких.

4. Установлено, что субпопуляция Т-лимфоцитов CD4+CD62LlowCD27low отличается от субпопуляции CD4+CD62LIowCD27hlgh более высоким уровнем экспрессии генов регуляторных и эффекторных цитокинов и хемокинов.

5. Впервые показано, что уровень апоптоза субпопуляций Т-лимфоцитов CD4+CD62LlowCD27high и CD4+CD62LlowCD27low разный в разных органах.

6. Обнаружено, что классические регуляторные Т-лимфоциты с фенотипом CD25highFoxp3+ принадлежат к субпопуляции Т-лимфоцитов CD4+CD62LlowCD27high.

7. Впервые проведено исследование влияния различных субпопуляций эффекторных Т-лнмфоцитов CD4 на бактерицидную активность макрофагов и показано, что Т-лимфоциты CD4+CD62LlovvCD27lovv намного эффективнее активируют макрофаги в системе in vitro, чем клетки CD4+CD62Ll0WCD27lligh.

8. Впервые показано наличие прямой корреляции между накоплением в легких Т-лимфоцитов CD4+ CD62LlovvCD27low и уровнем протекции против туберкулезной инфекции

Практическая значимость исследования

Получены данные о характере поверхностного фенотипа эффекторных Т-лимфоцитов при экспериментальной туберкулезной инфекции. Эти данные могут быть использованы для оценки эффективности Т-клеточного ответа у больных ТБ. Помимо этого, полученные результаты позволяют по-новому понять процессы дифферепцировки и регуляции активности Т-лимфоцитов, что важно учитывать при разработке подходов к иммуномодуляции при туберкулезе.

Хотя работа носит экспериментальный характер и посвящена выяснению фундаментальных механизмов иммунного ответа, полученные результаты могут оказаться важными для понимания легочной патологии и динамики защитных и деструктивных тканевых реакций у больных туберкулезом. Это может помочь разработке новых средств патогенетической терапии, в частности целенаправленной регуляции воспалительных реакций при туберкулезе.

Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ЦНИИТ РАМН.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Установлено, что субпопуляции Т-лимфоцитов CD4+CD62LIowCD27low и CD4+CD62LlowCD27hieh отличаются по степени дифференцировки и функциональной активности.

2. Впервые показано, что при ответе на антигены микобактерий клетки-эффекторы CD4+CD62L,owCD27low образуются из менее дифференцированных Т-лимфоцитов CD4+CD62L,0WCD27high не в лимфоидных органах, a in situ в легочной ткани.

3. Обнаружено, что субпопуляция Т-лимфоцитов CD4+CD62LlovvCD27low отличается от субпопуляции CD4 fCD62Ll0WCD27high более высоким уровнем экспрессии генов для цитокинов TNF-a, IFN-y, IL-12 и хемокинов Mip-la, Mip-10, Mip-2,1P-10, RANTES.

4. Установлено, что Т-лимфоциты CD4+CD62Ll0WCD27l0W более эффективно активируют бактериостатические функции макрофагов в системе in vitro по сравнению с Т-лимфоцитами CD4 +CD62LIowCD27hieh.

5. Впервые обнаружено, что классические регуляторные Т-клетки с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ принадлежат к популяции Т-лимфоцитов CD4+CD62Ll0WCD27hlgh.

6. Впервые показана прямая корреляция между накоплением в легких Т-лимфоцитов CD62LlowCD27low и уровнем протекции против туберкулезной инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Широко обсуждаемая в литературе модель образования эффекторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ предполагает, что активация и дифференцировка «наивных» клеток в эффекторы происходит в лимфатических узлах. В лимфатических узлах лимфоциты впервые взаимодействуют с антигеном, пролиферируют, приобретают эффекторные функции, а также меняют экспрессию разнообразных поверхностных маркеров (рецепторов). В дальнейшем эффекторные Т-лимфоциты мигрируют на периферию [von Adrian et al., 2000]. На периферии эти клетки формируют пул лимфоцитов-эффекторов, которые экспрессиругат поверхностный фенотип CD62LlowCD44hlgh и обеспечивают быстрый и сильный ответ, секретируя цитокины и хемокины [Sallusto et al., 1999; Roman et al., 2002; Hogan et al., 2001; Masopust et al., 2001; Reinhardt et al., 2001; Woodland et al., 2005]. Однако до сих пор оставалось неясным, являются ли Т-лимфоциты, покинувшие лимфатические узлы, полностью дифференцированными или окончательная дифференцировка эффекторов происходит на периферии. Одной из характерных черт эффекторных Т-лимфоцитов CD4 и CD8 является пониженная экспрессия маркера CD27 [Lyadova et al., 2004; Hamann et al., 1997; Tomiyama et al., 2004], но при туберкулезе локализация и окончательная дифференцировка лимфоцитов-эффекторов CD27low до сих пор не была детально изучена.

Наши данные показывают, что Т-лимфоциты-эффекторы CD4+CD27Iow — основные продуценты IFN-y при микобактериальной инфекции — накапливаются преимущественно в легких, а не в лимфатических узлах, даже если инфекция еще не затронула легочную ткань [Kapina et al., 2007]. Это согласуется с полученными ранее результатами, согласно которым инфицирование микобактериями не является обязательным условием для миграции клеток-эффекторов в легочную ткань и дыхательные пути [Masopust et al., 2001; Woodland et al., 2005]. Об этом же свидетельствует тот факт, что в лимфатических узлах содержится намного меньше IFN-у-продуцирующих клеток, чем на периферии [Reinhardt et al., 2001; Mayer et al., 2005].

Наши результаты позволяют предложить некоторые объяснения тому, почему имеет место именно такое распределение пула эффекторных лимфоцитов. Во-первых, Т-лимфоциты-эффекторы CD27low обладают большей предрасположенностью к апоптозу в лимфоидных тканях, по сравнению с легкими (Рис. 8). Такое свойство может быть важной причиной разного накопления и персистенции отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов в разных тканях. Во-вторых, наблюдается предпочтительная миграция в легкие циркулирующих Т-лимфоцитов CD4+CD27lcm по сравнению с CD4+CD27hlgh (Рис. 7). В-третьих, нами показано образование эффекторов CD4+CD27low непосредственно в легочной ткани. Можно предположить, что все эти механизмы необходимы для защиты лимфатических узлов от действия высокодифференщфованных эффекторов CD4+CD271(m. Из полученных нами результатов также видна взаимосвязь мелсду несколькими процессами, происходящими при дифференцировке Т-лимфоцитов CD4, а именно:

• снижением экспрессии молекул CD27;

• секрецией различных цитокинов и хемокинов;

• локализацией клеток на периферии;

• апоптозом Т клеток.

Т-лимфоциты CD62LIowCD27low - высокодифференцированные, функционально зрелые клетки. При ТБ эти клетки в основном локализуются в очаге инфекции за счет предпочтительной миграции в легкие, а также за счет их локального «созревания» при стимуляции микобактериальными антигенами. Однажды образовавшись, Т-лимфоциты CD4+CD27low начинают секретировать IFN-y, стимулирующий бактерицидную активность макрофагов [Collins and Kaufmann, 2001; Mogues et al., 2001]. В системе in vitro мы показали, что T-лимфоциты CD62LlowCD27Iow намного эффективнее активируют макрофаги, чем менее дифференцированные Т-лимфоциты CD62LIowCD27high (Рис. 12, 13). Поскольку данные клетки находятся на терминальной стадии дифференцировки, после ответа они немедленно уходят в апоптоз, что согласуется с литературными данными (Пичугин и др., 2004). На фоне иерсистирующей инфекции пул высокодифференцированных эффекторных клеток в легком поддерживается за счет дифференцировки постоянно мигрирующих туда клеток-предшественников CD62LlowCD27high. Можно предположить, что постоянное возобновление пула Т-лимфоцитов CD4+CD27low позволяет поддерживать достаточно высокое содержание эффекторов в зоне инфекции, а за сокращением популяции возбудителя следует снижение их численности и начинается сворачивание эффекторной фазы ответа.