Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Лихорадка Западного Нила на Юге России: современные эпидемиологические проявления и совершенствование методов выявления возбудителя

На правах рукописи

094605592

АФАНАСЬЕВА Екатерина Евгеньевна

ЛИХОРАДКА ЗАПАДНОГО НИЛА НА ЮГЕ РОССИИ: СОВРЕМЕННЫЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ

14.02.02 - эпидемиологии

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 о (!ЮН 2010

Москва-2010

004605592

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук Василенко Надежда Филипповна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Ющенко Галина Васильевна; кандидат медицинских наук Гренкова Татьяна Аркадьевна

Ведущая организация: ФГУЗ «Волгоградский научно-

исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Защита состоится «18» июня 2010 года в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.02 в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан «_»_2010 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современном мире неуклонно растет понимание высокой социально-экономической значимости широкого распространения различных инфекционных болезней. Особенностью современной эпидемиологической обстановки является не только активизация многих инфекционных заболеваний, которые традиционно находятся под контролем санитарно-эпидемиологических служб, но и возникновение очагов новых и возвращающихся инфекций бактериальной и вирусной природы (Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Кривуля С.Д и соавт., 2006; Локтев В.Б., 2007; Кутырев В.В., 2008: Львов Д.К., Савченко С.Т., Алексеев В.В. и соавт., 2008; Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Жаркенов А.Ф. и соавт., 2009; Онищенко Г.Г., Смоленский В.Ю., 2009).

Проблема лихорадки Западного Нила (ЛЗН) в настоящее время остается актуальной в связи с постоянным расширением ареала этой инфекции. Крупные вспышки ЛЗН (Онищенко Г.Г., 2000, 2001; Бутенко A.M., 2007; Львов Д.К., Савченко С.Т., Алексеев В.В. и соавт., 2008; Платонов А.Е., Карань Л.С., Гаранина С.Б. и соавт., 2009), тяжелое течение болезни с преобладанием серозных менингитов, документированная передача вируса лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) при переливании крови являются новыми фактами в изучении этой актуальной арбовирусной инфекции. Вспышки и эпидемии ЛЗН и даже единичные случаи рассматриваются в Международных медико-санитарных правилах ВОЗ (2005) как чрезвычайная ситуация здравоохранения международного масштаба. Сезонные миграции птиц способствуют трансконтинентальному переносу ВЛЗН (Львов Д.К.,2002; Бутенко A.M., Вышемирский О.И. и соавт., 2002; Забашта М.В., Москвитина Э.А., Забашта A.B., 2006 и др.).

Не возникает сомнений в том, что территория Юга России является эндемичной по широкому спектру природно-очаговых инфекций бактериальной и вирусной природы, требующих особого внимания в силу того, что этиологические агенты большинства из них относятся к возбудителям I-II групп патоген-ности, а обострение обстановки по некоторым из них может привести к чрезвычайной эпидемической ситуации международного значения (Малецкая О.В., Грижебовский Г.М., Бейер А.П. и соавт., 2009).

Ставропольский край (CK) в силу своего географического положения и природных условий (жаркий засушливый климат, обилие водоемов, комаров и клещей, большое количество перелетных птиц и др.) представляет большой интерес в отношении изучения циркуляции вируса ЛЗН и его роли в патологии человека. Такие исследования на территории Ставропольского края ранее не проводились.

Сложившаяся ситуация диктует необходимость широкомасштабного реального мониторинга вируса ЛЗН в антропогенных и природных биоценозах с привлечением современных методов экспресс-диагностики. Мониторинг инфекционных болезней является одной из наиболее важных составляющих комплекса мер по предотвращению и борьбе с эпидемиями (Онищенко Г.Г., 2006). Один из блоков мониторинга - сбор, доставка и лабораторное исследование полевого материала - необходим как для прямого обнаружения компонентов воз-

з

будителя (антигенов или фрагментов генома), так и для последующей изоляции и идентификации инфекционного агента. Однако часто низкие концентрации возбудителя инфекции и его компонентов в полевом материале, а также огромное количество примесей не позволяют обнаруживать антигены вирусов и бактерий или их генетический материал непосредственно в исследуемых пробах. Разработка высокоэффективных способов концентрирования патогенов с последующей детекцией их антигенов или нуклеиновых кислот, либо их селективной сепарацией для бактериологических или вирусологических исследований - одно из приоритетных направлений совершенствования их лабораторной диагностики (Ефременко В.И., Василенко Н.Ф., Жарникова И.В. и соавт., 2009).

Актуальность проблем, изложенных выше, послужила основанием для проведения данной работы.

Цель исследования: совершенствование эпидемиологического мониторинга за лихорадкой Западного Нила и методов выявления её возбудителя.

Для достижения цели были определены основные задачи:

1. Изучить на примере Ставропольского края условия, способствующие формированию природных очагов лихорадки Западного Нила на Юге Российской Федерации.

2. Провести анализ результатов эпизоотологического обследования и заболеваемости ЛЗН на территории Юга РФ.

3. Провести обследование территории Ставропольского края на наличие переносчиков и резервуаров вируса ЛЗН.

4. Изучить иммунную прослойку выборочных групп здорового населения, проживающих в Ставропольском крае, и провести исследования сывороток крови больных с лихорадкой неизвестной этиологии на наличие специфических антител к вирусу ЛЗН.

5. Усовершенствовать методы изучения распространения возбудителя лихорадки Западного Нила за счет использования иммуномагнитной сепарации при эпидемиологическом мониторинге вируса ЛЗН в объектах окружающей среды.

Научная новизна.

• Впервые на территории Ставропольского края при исследовании объектов внешней среды выявлено наличие вируса ЛЗН и установлены его основные переносчики - комары рода Aedes.

• Впервые установлена инфицированность ВЛЗН клещей Н. marginatum, что указывает на возможность их вовлечения в паразитарные системы природных очагов ЛЗН на территории Ставропольского края.

• Изучены показатели гуморального иммунитета больных с лихорадками неясной этиологии и здоровых людей (доноров крови) и установлено наличие антител класса IgG к вирусу ЛЗН в обеих группах, что свидетельствует об инфицировании этим вирусом населения Ставропольского края и является дополнительным критерием в оценке эпидемической значимости природных очагов этой инфекции.

• Впервые использованная иммуномагнитная сепарация при исследовании полевого материала методами иммуноферментного анализа

(ИФА) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) повысила их эффективность и увеличила число положительных находок в 2 - 3 раза, что позволяет более достоверно оценивать эпидемиологический потенциал территорий.

• Получены данные о достаточно высоком эпидемиологическом потенциале природных очагов ЛЗН на территории Юга Российской Федерации, выражающиеся в ежегодной регистрации случаев заболеваний людей и зараженности комаров и клещей ВЛЗН. Практическая значимость.

Установление факта циркуляции возбудителя J13H на территории Ставропольского края является предпосылкой для разработки комплекса мероприятий по эпидемиологическому и эпизоотологическому мониторингу, диагностике и профилактике ЛЗН. Применение иммуномагнитной сепарации в сочетании с методами лабораторной экспресс-диагностики (ИФА и ОТ-ПЦР) позволяет увеличить их чувствительность и специфичность, повышая возможность выявления возбудителя в 3 - 3,5 раза в ИФА ив 1,8-2 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20-21 часа до 1-3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов при проведении анализов.

По результатам выполненных исследований получено 2 патента РФ: «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)», № 2290641, Бюл. № 36 от 27.12. 2006 г.; «Способ получения иммуносорбента», № 2363732, Бюл. № 22 от 10.08. 2009 г.

Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций: «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях», утвержденных директором СтавНИПЧИ ( протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 9 от 27.10.2005 г.), «Применение органокремнеземного аффинного сорбента для селективного концентрирования возбудителя ЛЗН и последующего проведения экспресс-анализов (ИФА и ПЦР)», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 2 от 28 февраля 2007 г.); «Исследование полевого материала на наличие арбовирусов методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 8 от 09.07.2009 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Территория Юга Российской Федерации характеризуется наличием природных очагов ЛЗН с высоким эпидемическим потенциалом, при этом основным резервуаром и переносчиком вируса являются комары рода Culex, Anopheles, Aedes, Coquillettidia и иксодовые клещи Н. marginatum, Rh. rossicus.

2. Установленная зараженность вирусом ЛЗН комаров рода Aedes, ик-содовых клещей Hyalomma marginatum, синантропных врановых, обнаружение специфических антител к ВЛЗН в сыворотках крови людей с лихорадками неизвестной этиологии и у доноров крови свидетельствуют о циркуляции данного вируса на территории Ставропольского края.

3. Применение иммуномагнитной сепарации позволяет максимально сконцентрировать ВЛЗН в исследуемом материале, что увеличивает чувствительность методов на несколько порядков по сравнению с традиционными

5

ИФА и ПЦР. Разработанные сочетанные методы МИС + ИФА и МИС + ПЦР могут использоваться при проведении мониторинга за JI3H.

Апробация работы. Результаты диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников содружества Независимых Государств (Оболенск, 2006); второго съезда военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 2006); расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» РАМН и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 2006); Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине основания Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург,2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора (Оболенск, 2009).

Апробация диссертации состоялась 6 августа 2009 г. на межлабораторной конференции ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно.

Отдельные этапы работы были выполнены совместно с д.б.н. Жарнико-вой И.В., к.б.н. Орловой Т.Н., д.х.н. Брыкаловым А.В.

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 4 работы - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 161 листе и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 19 таблицами. Список использованной литературы включает 279 источников, из них 209 отечественных и 70 - зарубежных авторов.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Материалы и методы.

При выполнении работы использован клинический и полевой материал, собранный нами на 23 из 26 административных территориях Ставропольского края и в краевом центре - г. Ставрополе: 268 сывороток крови лихорадящих больных и 1302 сыворотки крови доноров; 8626 объектов окружающей среды, в том числе 3573 имаго орнитофильных комаров (230 пулов) родов Culex, Aedes, Anopheles, Coquillettidia\ 4853 особи иксодовых клещей (454 пула) - Нуа-

б

lomma marginatum, Dermacenter marginatus, Ixodes ricinus, Rhipicephalus rossicus, Boophilus annulatus и 61 особь аргасовых клещей Argas persicus (2 пула); 139 проб головного мозга птиц и грызунов.

По родам и видам собранных клещей и комаров систематизировали согласно определителям Б.И. Померанцева (1950), A.B. Гуцевич, A.C. Мончадского, A.A. Штикельберга (1970), H.H. Плавилыцикова (1994). Комплектацию комаров в пробы (пулы) проводили с учетом вида и места сбора в количестве 25 - 50 экземпляров. Иксодовых клещей объединяли по виду, месту сбора, виду хозяина (прокормителя), упитанности и фазе развития (имаго, нимфы, личинки). Голодных имаго объединяли по 10 - 30 особей, нимф - по 20 - 50 особей, личинок - от 50 до 200 в пробе. Каждая напитавшаяся особь исследовалась индивидуально.

Проведен анализ материалов по заболеваемости лихорадкой Западного Нила и исследованию проб из объектов внешней среды на наличие возбудителя J13H, предоставленных Территориальными управлениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека субъектов Юга России за 2001-2006 гг.: Астраханской, Волгоградской, Ростовской областей, Краснодарского края, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской, Чеченской Республик, Республик Северная Осетия-Алания, Калмыкия, Адыгея.

Антиген вируса Западного Нила, мышиная иммунная асцитическая жидкость (ИАЖ) к вирусу J13H с высоким титром специфических антител класса G получены в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

При проведении ИФА для индикации антигена вируса J13H использовали тест-системы, изготовленные в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск, Московской обл.); ЗАО «Биосервис» (г. Боровск, Калужской обл.); тест-система иммуноферментная для выявления антител класса IgM к вирусу лихорадки Западного Нила производства ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск, Московской обл.); тест-система иммуноферментная «ВектоНил - IgG» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирская обл.); тест-система иммуноферментная для выявления индекса авидности иммуноглобулинов класса G к вирусу лихорадки Западного Нила «ВектоНил -IgG - авидность» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирской обл.); набор реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса клещевого энцефалита «ВектоВКЭ-антиген» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирской обл.); набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита «ВектоВ-КЭ-IgG» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирской обл.). Выявление РНК вируса J13H в пробах проводили методом ОТ-ПЦР, используя тест-систему «ГенНил», изготовленную в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов). Анализы проводили согласно инструкциям по применению.

Сорбент для иммуномагнитной сепарации получали на основе природного алюмосиликата, химическую модификацию поверхности которого осуществляли в присутствии карбоксиметилированного лигнина и карбодиимида. В качестве магнитного компонента при синтезе применяли магнетит (Рез04). Микроструктуру сорбентов исследовали на сканирующем электронном устройстве IMZ-T3000 (Япония) как описано в работе Я. Фрайфельдер (1980). Удельную

7

поверхность магносорбента (MC) определяли по методу A.A. Клячко-Гурвича (1961), основанному на низкотемпературной адсорбции азота. Суммарный объем и диаметр пор определяли методом ртутной порометрии на приборе AYTO PORE - 9200 (Кельцев Н.В., 1984).

Экспериментальные данные обработаны методами вариационной статистики, изложенными в работах И.П. Ашмарина и A.A. Воробьева (1962), Т.Н. Зайцева (1991). Для обработки картографических изображений применяли программу Map Info Professional 8.5. 2.2.Результаты исследований и их обсуждение.

Г. Условия, способствующие формированию природного очага JI3H, и основные эпидемиологические особенности лихорадки Западного Нила на Юге Российской Федерации.

На территории Юга РФ выделяют следующие ландшафтные зоны: пустынные северного подтипа, полупустынные южного подтипа (в Республике Калмыкия и Астраханской области); луговые незатопленного подтипа, пойменные и пойменно-дельтовые, лесные умеренного пояса пойменного подтипа - в пределах Астраханской области; степные, полупустынные - в пределах Волгоградской области, Ставропольского края; лесостепные - в Ставропольском крае; предгорная - в Ставропольском крае; а также зоны полусухих и влажных субтропиков в пределах Краснодарского края (Новороссийск, Сочи). Разнообразие ландшафта, богатый растительный мир, многочисленность популяций членистоногих, благоприятные климатические условия на территории Юга РФ могут обеспечивать циркуляцию вируса JI3H в пустынном, степном и лесостепном зональных поясах. Через территории Юга России пролегают восточноевропейские пути пролета птиц из стран Центральной и Восточной Африки, Центральной, Юго-Западной и Южной Азии, эндемичных по JI3H. Особенности гидрологического режима на этой территории приводят к образованию узлов концентрации гнездящихся и мигрирующих птиц, в том числе водного и околоводного комплекса. В этих же районах создаются благоприятные условия для массового выплода комаров - основных переносчиков вируса JI3H, и клещей, выполняющих функции резервных хозяев. Среди комаров по видовому составу доминирует род Aedes. A. vexans и A. dorsalis - многочисленные виды в лесах и речных долинах степной зоны. Практически повсеместно обилен тропический род Culex, в частности, С. pipiens.

Ареал распространения клещей рода Hyalomma на территории Юга России в основном ограничен южными районами Волгоградской области, севером Астраханской области, Республикой Калмыкией, Ставропольским краем. Однако, в связи с тем, что основными прокормителями личиночных и нимфальных стадий этих иксодовых клещей являются птицы, а период пребывания на хозяине премагинальных фаз иксоид весьма продолжителен, все это способствует транспортировке личинок и нимф клещей рода Hyalomma птицами во время их весенних миграций на значительные расстояния. Масштабы заноса и адаптации паразитов к местным условиям свидетельствуют о возможности формирования за пределами ареала псевдопопуляций клещей рода Hyalomma.

Таким образом, основными факторами, способствующими формированию на территории Юга России природных очагов ЛЗН и ее эпидемическому проявлению, являются: климатические условия - свыше 100 дней в году со среднесуточной температурой более 20 °С, до 30 дней - более 30 °С, сумма эффективных температур (температура выше 10 °С) составляет 3200-3500°; весьма разнообразный спектр кровососущих членистоногих (комаров, клещей) и птиц - основных переносчиков и носителей вируса ЛЗН; наличие большого числа миграционных русел перелетных птиц, способствующих заносу на территорию Юга России вируса ЛЗН из стран Азии и Африки.

Слежение за эпизоотическим процессом является одним из основных компонентов эпиднадзора за ЛЗН. Используя результаты исследований методом ИФА кровососущих членистоногих, мелких млекопитающих и птиц на наличие антигена вируса ЛЗН, осуществленных Территориальными управлениями Роспотребнадзора субъектов Юга России, нами проведен комплексный анализ этих данных с целью оценки эпидемиологической напряженности природных очагов ЛЗН на Юге РФ, а также д тя уточнения видового состава основных переносчиков и носителей ВЛЗН, их распространения и территориальной приуроченности.

В период с 2001 по 2006 гг. в регионах Юга РФ методом иммунофермент-ного анализа было исследовано 16111 проб, в том числе 3230 проб, полученных от птиц (20,0 %), 2341 проба органов грызунов (14,5 %), 2675 проб комаров (16,6 %) и 7865 проб клещей (48,8 %). При этом общее количество положительных проб равнялось 295 (1,8 %). В целом на Юге РФ у грызунов антиген вируса ЛЗН выявлен в 1,0 % проб, среди птиц положительные пробы составили 1,9 %, у клещей ВЛЗН обнаружен в 0,9 % случаев; наибольший процент заражения вирусом ЛЗН отмечен у комаров (2,2 %). Анализ лабораторных данных показал, что основными переносчиками ВЛЗН являются комары родов Aedes, Anopheles, Culex, Coquillettidia и иксодовые клещи Н. marginatum и Rh. rossicus.

Как показал анализ, в Краснодарском крае, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской, Чеченской республиках, Республиках Северная Осетия-Алания и Адыгея при исследовании объектов внешней среды антиген вируса ЛЗН не выявлен.

О степени активности природных очагов ЛЗН, распространения возбудителя на территории Юга РФ можно сделать достоверное заключение по результатам изучения уровня иммунной прослойки к вирусу ЛЗН у населения, проживающего на этой территории. Сыворотки крови доноров, проживающих в Астраханской области, исследовали в ИФА и установили высокий уровень се-ропозитивных (47,0 %) среди населения. Уровень иммунной прослойки к вирусу ЛЗН у жителей Краснодарского края составил 2,8 %. За период с 2001 г. по 2006 г. ЛЗН зарегистрирована в трех из 13 субъектов Южного федерального округа (ЮФО): в Астраханской, Ростовской и Волгоградской областях. За эти шесть лет заболели лихорадкой Западного Нила 293 человека. Наибольшая эпидемиологическая активность отмечалась в Астраханской области, где за указанные годы выявлены 205 больных, что составило 69,9 % от числа всех больных, зарегистрированных в ЮФО. В Ростовской области число заболевших ЛЗН составило 43 (14,7 %), в Волгоградской области - 45 (15,4 %).

9

В 2006 г. эпидемиологическая обстановка по ЛЗН изменилась: на Юге России зарегистрированы 39 больных в трех субъектах, что на 42,4 % меньше по сравнению с 2005 г. (92 больных). При этом существенно снизилась заболеваемость в Астраханской области (в 5,2 раза), незначительно - в Ростовской области (в 1,2 раза). В Астраханской области выявлены 14 больных в трех районах: Икрянинском - 1, Камызякском - 1, Приволжском - 1 и в г. Астрахани -11. Один случай заболевания ЛЗН закончился смертельным исходом (7,1 %). В Ростовской области зарегистрированы 13 больных в двух районах (Азовском -1, Сальском - 1) и в трех городах (Ростове-на-Дону - 7, Каменск-Шахтинском -1, Сальске - 3). В Волгоградской области заболеваемость возросла в 4 раза, всего отмечены 12 больных в г. Волгограде, в 2007 г. заболеваемость в этом регионе повысилась в 5,3 раза, а в 2008 г. снизилась в 31,5 раза. У всех больных диагноз в 100 % случаев подтвержден лабораторно (рисунок 1).

Рис. 1. Заболеваемость лихорадкой Западного Нила на Юге РФ в 2001-2007 гг.

В Краснодарском крае, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской и Чеченской республиках, Республиках Северная Осетия-Алания, Адыгея, Калмыкия за период 2001-2006 г.г. случаи заболевания лихорадкой Западного Нила в официальных сводках не зарегистрированы.

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что эпидемиологическая обстановка по J13H на территории Юга РФ продолжает оставаться нестабильной. Как показывают результаты полевых наблюдений, прогноз эпидемиологической обстановки по ЛЗН следует признать неблагоприятным.

В Ставропольском крае подобных исследований никогда не проводили. Исходя из реальной эпидемиологической ситуации, сложившейся на сопредельных к С К территориях, совершенно очевидна своевременность и необходимость проведения эпидемиологического мониторинга за ЛЗН на территории Ставропольского края с привлечением современных методов исследования. II. Совершенствование мониторинга за лихорадкой Западного Нила на примере Ставропольского края.

На наличие антигена ВЛЗН нами исследованы 3573 экземпляра кровососущих комаров, представленных четырьмя родами: Culex- 1948 экз. (43 пула), Aedes - 1253 (138), Anopheles - 200 (36), Coquillettida - 172 (13). Сбор комаров осуществляли в июне - июле 2005 - 2008 гг. в Александровском, Благодар-ненском, Георгиевском, Грачевском, Изобильненском, Кировском, Красногвардейском, Курском, Нефтекумском, Петровском, Советском, Степновском, Шпаковском районах Ставропольского края и окресностях г. Ставрополя. Антиген ВЛЗН в ИФА обнаружен в девяти суспензиях комаров рода Aedes: А. cantans - семь проб, A. vexans - одна проба; A. diantaeus - одна проба; положительные пробы составили 6,5 % от всего количества проб рода Aedes. При анализе результатов исследования кровососущих комаров обращает на себя внимание высокая зараженность ВЛЗН орнитофильного вида A. cantans, обнаруженного, главным образом, во влажной лесопарковой зоне. Три пробы приготовлены из комаров, собранных в г. Ставрополе (парк Победы, лиственный лес), две - из комаров, отловленных на опушке леса х.Молочного (пригородная зона г. Ставрополя), одна проба - в 2-х км от леса в с. Красном Грачевского района, одна проба - в Изобильненском районе. Оба района граничат с краевым центром. Инфицированная проба комаров A. diantaeus также обнаружена в г. Ставрополе. Зараженные ВЛЗН комары A.vexans доставлены из Нефтекумского района, расположенного в полупустынной ландшафтной зоне.

Исследование 4853 особей иксодовых и 61 особи аргасовых клещей на зараженность ВЛЗН, собранных нами в различных районах Ставропольского края, позволило обнаружить в ИФА восемь положительных проб Hyalomma marginatum (2,7 %) из 299 исследованных и одну положительную пробу Boophi-lus annulatus (3,8 %) из 26 исследованных. Антиген ВЛЗН выявлен в двух пробах мозга грачей, с которых были сняты инфицированные клещи. При исследовании этих же проб комаров и клещей молекулярно-генетическим методом (ОТ-ПЦР) РНК вируса ЛЗН обнаружена в 14 пробах суспензий комаров рода Aedes , что составило 6,0 % от общего количества исследованных проб и 10,1 % от количества проб Aedes . В пробах клещей методом ОТ-ПЦР положительные результаты получены в 13 пулах, что составило 3,1 % от исследованного количества клещей Н. marginatum (414 проб) и 2,9 % от общего количества (454 пула) иксодовых клещей (таблица 1).

и

Положительные результаты по JT3H (2005-2008 гг.) при исследовании членистоногих и птиц в ИФЛ и ОТ-ПЦР

Таблица \

Район Точка (населенный пункт) Дат сбора Вид насекомого, птипы Кол-во исследованных особей (абс.) Кол-во nviOB (абс.) Метод выяления

ИФЛ ОТ-ПЦР

абс. % абс. %

г. Ставрополь Парк Победы, лиственный лее Июль. 2005 г. Комар Aedes camans 36 11 2 18,2 3 27,8

Шпаковский х. Молочный, опушка леса Июль. 2005 т. Комар Aedes eantans 14 2 1 50.0 2 100,0

1 рачеиский с. Красное, 2 км от леса Июль, 2005 г. Комар Aedes eantanл 10 1 1 100,0 1 100.0

Нсфзскумский с. Каясула Мюль. 2006 г. Комар Aedes vexans 118 1 50.0 1 50.0

г. Ставрополь парк 1(обеды. лиственный лес Июль, 2006 г. Комар Aedes diantens 54 3 1 33,3 1 33.3

г. Ставрополь лес, вблизи пересохших дренажных канав Июль. 2006 г. Комар Aedes eantans 58 3 1 33,3 3 100,0

Шпаковский х. Молочный, опушка леса Июль. 2006 г. Комар Aedes eantans 15 2 1 50,0 2 100,0

Июбильненский х. Смыков, лесополоса Мюль. 2006 г. Комар Aedes eantans 29 3 1 33,3 1 33,3

Курский с. Привольное, кошара Июль. 2005 г. Клещ Boophflus imnulatus 353 26 1 3.8 1 3.8

Сонетекий г. Зеленокумск, фермерское хозяйство Июнь, 2008 г. Клеш Hyaiomma marginatum 219 27 1 3,7 -> 7,4

Советский г. Зелснокумск Июнь, 2008 г. Клеш Hyaiomma marginatum 225 32 2 6.25 3 9,4

Стспновский с. Иргаклы. кошара Июнь. 2008 г. Клеш Ilyalamnm marginatum 561 62 2 3.2 3 4.8

1 1овоеелипкий с. Чсрнолссскос. кошара Июль. 2008 г. Клещ Hyaiomma Marginatum 263 40 2 5.0 3 7.5

Пефзекумский п. Ьейсей Мюль. 2008 1. Клеш Hyaiomma Marginatum 251 45 1 2.2 1 2,2

11ефтекумский п. Ьейсей Июль. 2008 г. Грач (головной мои) 23 1 1 100,0 н.и н.и.

Ьлагодарнепский с. Каменная Валка Июль. 2008 т. Грач(головной мозг) 10 1 1 100,0 H.H. н.и.

Итот 2039 261 20 7.7 27 10.4

* н.и. - пс иcc.'iслопано

С целью обнаружения специфических антител класса О к ВЛЗН исследованы 268 сывороток крови больных людей с лихорадками неустановленной этиологии, доставленных из районов Ставропольского края. Выявлены девять положительных проб, из них четыре - с титрами 1:6400 - 1:12800. При исследовании положительных проб на авидность оказалось, что высокотитражные сыворотки содержали низкоавидные антитела, свидетельствующие о недавно перенесенной болезни. Для оценки уровня естественной иммунизации населения исследовались сыворотки крови доноров, при этом из 1302 проб положительной оказалась 21 (1,6 %). Полученные нами результаты свидетельствуют о циркуляции ВЛЗН (рисунок 2), и это требует расширенных исследований с применением новых современных экспрессных, информативных лабораторных методов для проведения эпидемиологического надзора за этой инфекцией.

Эффективность ряда методов индикации возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов может быть значительно увеличена после предварительного концентрирования вирусов и их антигенов с отделением от контами-нирующей микрофлоры и ингибирующих примесей. Эта цель может быть достигнута путем применения методов иммуносорбции, особое место среди которых занимают методы с использованием сорбентов с магнитными свойствами. Магносорбенты служат твердой фазой при селективном концентрировании на их поверхности патогенов.

Нами впервые для синтеза твердофазной матрицы сорбента использован природный алюмосиликат, представляющий собой продукт, содержащий в своем составе, по данным проведенного нами химического анализа, двуокись кремния (массовая доля) - 78%. Химическое модифицирование сорбента с целью образования функционально активных групп, способных к взаимодействию с лигандами белковой природы, осуществляли в присутствии карбоксиме-тилированного лигнина и карбодиимида. В качестве магнитного компонента при синтезе применяли магнетит. На основе проведенных исследований определены оптимальные параметры получения алюмосиликатного магносорбента: соотношение компонентов синтеза 1,5:1:1, соответственно 8Ю2, Ре304, карбок-симетилированный лигнин; время гелеобразования - 2 часа, значение рН геле-образования - 7,0. Для придания магносорбенту биоспецифических свойств и получения магноиммуносорбента (МИС) на поверхность МС иммобилизовали специфические , выделенные фракционированием ПЭГ-6000 из мышиной ИАЖ против ВЛЗН.

ЛЗН - магноиммуносорбент имел следующие характеристики: у образцов МИС наблюдалась ярко выраженная губчатая, пористая микроструктура с участками аморфной массы, удельная поверхность сорбента - 63,0 ±0,84 м2/г, объем пор - 1,23 ±0,009 см3/г, радиус пор - 29,7 ± 0,29 нм.

Ростовская область

АПАЯАСЕНКОВСКЙЙ

ЩШ

тру но ас кий

НО ВОАП ЕКСАН Д РО ВС КИ ЯЛ

I. СТАЩШШ®

ЛЕВОКУМСКИЙ

БУДЕННОВСКИЙ

АЛЕКСАНДРОВСКИЙ

АндроповеКИЙ

ц И н ЕР ало водс кни-

ги" едгорнцй

КИРОВСКИЙ

Карачаево-Черкесская Республика

Кабардини балкарская Республика

"илометры

Республика Калмыкия

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

^—Административные I........I территории Юга РФ

Границы районов РайонысА1к ВЛЗН у доноров Районы с положительными результатами исслед. на ЛЗН Доноры с А1 к ВЛЗН

шт

О

Республика Дагестан

Чеченская Республика

Рис.2. Результаты исследования полевого материала и сывороток крови доноров в Ставропольском крае на ЛЗН

С целью упрощения и удешевления постановки иммуноферментного анализа, повышения его специфичности и чувствительности в качестве твердой фазы вместо полистироловых микроплат, традиционно применяемых при постановке ИФА, мы применили разработанные нами МИС при постановке «сэндвич» - варианта этого метода для обнаружения вируса JI3H. При этом были определены оптимальные параметры постановки ИФА с использованием МИС, чувствительность и специфичность сочетанного метода, проведено сравнение модифицированного метода МИС+ИФА с методом постановки реакции в полистироловых планшетах. Лабораторные испытания полученных нами трех серий алюмосиликатных лигнинсодержащих МИС к вирусу ЛЗН проводили с инакти-вированным антигеном, полученным в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Для проверки специфичности использовали антиген вируса клещевого энцефалита (инактивированный контрольный образец из набора реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса клещевого энцефалита «ВектоВКЭ-антиген»), Антиген вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) выбран нами в связи с тем, что он относится, так же как и вирус ЛЗН, к экологической группе арбовирусов, семейству Flaviviridae, роду Flavivirus. Большая часть флавивирусов передается комарами, некоторые -клещами, ряд вирусов обладает очень высокой экологической пластичностью, в частности, способностью к трансмиссивной передаче и комарами, и клещами (например, вирус Западного Нила) (Львов Д.К., Дерябин П.Г., 2008).

Время постановки ИФА с применением МИС составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18-ти часовую сенсибилизацию микропланшетов - 20 - 21 час. При этом показания оптической плотности (ОП) пробы превышали величину ОП отрицательного контроля в 2,0 - 2,2 раза, что свидетельствовало о более высокой чувствительности ИФА с применением МИС. При раститровке нативных антигенов показано, что чувствительность традиционного ИФА составила 15 мкг/мл (по белку), а чувствительность ИФА с МИС - 100 - 50 нг/мл. С антигеном ВКЭ окрашивание раствора не наблюдалось, что свидетельствовало об отсутствии перекрестных реакций и подтверждало специфичность имуноферментного конъюгата и МИС.

Таким образом, при использовании МИС в ИФА для проведения реакции не требовались полистироловые планшеты, сокращалось время сенсибилизации твердой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твердой фазы ( с 20 дней до 2 лет и более); время проведения анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА.

При исследовании в модифицированном ИФА с применением иммуно-магнитной сепарации 3573 имаго комаров (230 пулов), собранных в 13 районах Ставропольского края и окрестностях г. Ставрополя в июне - июле 2005 -2008 гг., получены следующие результаты: использование селективного концентрирования на МИС дало возможность обнаружить антиген вируса ЛЗН в 27 пробах, в то время как в ИФА без применения МИС выявлено девять ан-тигенсодержащих проб. Таким образом, нами подтверждено наличие антигена ВЛЗН в девяти суспензиях комаров и дополнительно выявлено 18 положи-

15

тельных проб комаров Ае. cantans, отловленных в Георгиевском, Грачевском, Изобильненском, Курском, Нефтекумском, Петровском, Шпаковском районах, г. Ставрополе, причем, в Георгиевском, Курском и Петровском районах положительных находок в традиционном ИФА ранее не было. Применение МИС позволило повысить выявляемость инфекционного агента в 3 раза.

При исследовании 4853 особей иксодовых клещей (454 пула) модифицированным ИФА удалось обнаружить антиген BJI3H в 32 пробах, а традиционным ИФА - лишь в девяти пулах. Таким образом, дополнительно выявлены 23 положительных пробы клещей Н. marginatum, из них из Благодарненского, Грачевского, Ипатовского и Алекасандровского районов положительных проб традиционная постановка ИФА не обнаруживала. Тем самым выявляемость В ЛЗН увеличена в 3,5 раза.

Эффективность применения метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для диагностики, изучения молекулярной эпидемиологии лихорадки Западного Нила и анализа структуры генома возбудителя JI3H подтверждена целым рядом работ (Гаранина С.Б., Щербакова A.M., Куличенко А.Н. и соавт., 2001; Журавлев В.И., 2002; Львов Д.К., Писарев В.Б., Петров В.А. и соавт., 2004; Петров В.А., 2004 и др.).

При использовании в качестве проб клинического материала особых трудностей в подготовке образцов для постановки ПЦР не возникает. Более сложной задачей представляется подготовка проб из объектов внешней среды, в частности, клещей и комаров, так как в этом случае необходимо использовать особые методические приемы, позволяющие избавиться от контаминирующих примесей и максимально сконцентрировать искомую РНК. Для этого мы объединили два метода: высокоэффективное избирательное концентрирование инфекционного агента на магноиммуносорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции, проведя многочисленные серии опытов по адаптации этих методов друг к другу. Результаты наших исследований свидетельствовали о том, что применение МИС при проведении ПЦР позволяет на этапе подготовки пробы путем многократных промываний сорбента с фиксированным на нем вирусом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повысило выявляемость РНК вируса ЛЗН в 1,8-2 раза. РНК вируса ЛЗН сочетанным методом выявлена в 29 пробах комаров, из них 14 проб подтверждено и дополнительно выявлено 15, при этом в Изобильненском, Курском и Петровском районах - по четыре пробы, в Нефтекумском -две и Георгиевском - одна положительная проба (рисунок 3).

1 - ladder 100 bp; 2-7 - без МИС;

8-13 - после концентрирования на МИС;

14 - К(-); 15 - К(+)

Рис. 3. Результаты выявления РНК вируса J13H методом ОТ-ПЦР до и после селективного концентрирования проб суспензии комаров на МИС.

При исследовании иксодовых клещей РНК вируса ЛЗН выявлена в 27 пробах, из них подтверждено 13 полученных ранее положительных результатов и дополнительно выявлено еще 14 положительных проб: Александровском, Грачевском, Ипатовском, Курском, Новоселецком, Нефтекумском -по две пробы, а Благодарненском и Степновском - по одной пробе.

При сопоставлении результатов, полученных в ИФА и ОТ-ПЦР, и результатов сочетанных методов экспресс-анализов МИС + ИФА и МИС +ПЦР установлено закономерное повышение чувствительности традиционных методов за счет селективного концентрирования вируса на иммуномагнитном сорбенте (таблицы 2, 3).

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о распространении и циркуляции вируса ЛЗН в 17 из 23 обследованных административных районов Ставропольского края и г. Ставрополе. Обнаружение специфических IgG к вирусу ЛЗН у лихорадящих больных и здоровых людей (доноров) в целом ряде районов Ставропольского края сигнализирует об инфицированно-сти населения и реальной угрозе возникновения как единичных случаев заболевания, так и вспышек ЛЗН. При этом иксодовые клещи Н. marginatum и комары рода Aedes могут служить индикаторами потенциального природного очага ЛЗН в Ставропольском крае. Обнаружение вируса ЛЗН в организме птиц (грачи) позволяет отнести их к числу активных сочленов природного очага ЛЗН и подтверждает индикационное значение массовых видов птиц, в частности, врановых.

Таблица 2

Положительные результаты по ЛЗН (2005-2008 гг.) при исследовании членистоногих в ИФА и ОТ-НЦР в сочетании

с пммуномагншной сепарацией

Район Вид насекомого Кол-во исследованных особей (абс.) Кол-во пулов (абс.) Метол выявления

МИС + ИФА МИС + ОТ-ПЦР

абс. % абс. %

г. Ставрополь Комар Aedes cantam 148 17 7 41,2 2 41.2

Шпаковский Комар Aedes cantam 29 4 2 50,0 4 100.0

Грачевекий Комар Aedes cantons 20 1 1 100.0 1 100.0

11ефтекумский Комар Aedes vermis, Aedes cantans 298 32 4 12.5 3 9,4

Изобильнснекнй Комар Aedes cantans 49 8 4 50.(1 5 62,5

Георгиевский Комар Aedes cantans 13 1 1 100,0 1 100,0

Петровский Комар Aedes cantans и 4 4 100,0 4 100,0

Курский Комар Aedes canians 374 30 4 13,3 4 13,3

Советский Клещ Hvakmma marginatum 290 76 4 5.3 5 7,9

Курский Клещ Hyalomma marginatum, Boophilux annularis 640 55 3 5,5 3 5,5

Степновский Клещ Hyalomma marginatum 361 62 4 6,5 4 6.5

Новоселецкий Клещ Hyalomma marginatum 661 60 4 6,7 5 8,3

Нефтекумекий Клещ Hyalomma marginatum 591 62 4 6.5 л л 8,8

Благ одариепский Клещ Hyalomma marginatum 731 64 4 6,3 1 1.6

^Грачевекий Клеш li d mma marginatum 181 9 3 33,3 2 22 2

Инатовский Кл щИ} ¡omnia marginatum 291 15 3 20,0 2 13.3

Александровски й Kji щ thai типа marginatum 287 33 3 9.1 2 6,1

Итого 5465 533 63 11,9 56 10.5

Таблица 3

Результаты сравнительного исследования комаров и клещей с целью детекции возбудителя ЛЗН

Метод исследования Количество исследованных проб Количество положительных результатов

клещи комары

клещей комаров абс. % абс. %

ИФА 456 230 9 1,9 9 3,9

МИС+ИФА 456 230 32 7,0 27 11,7

ОТ-ПЦР 456 230 13 2,9 14 6,0

МИС+ ОТ-ПЦР 456 230 27 5,9 29 12,6

Выводы

1. Впервые показано наличие важнейших переносчиков и резервуаров вируса лихорадки Западного Нила, которыми являются комары рода Aedes и птицы семейства врановых; иксодовые клещи Н. marginatum вовлекаются в паразитарную систему ВЛЗН на территории Ставропольского края, что свидетельствует о наличии природных очагов ЛЗН на данной территории.

2. Впервые при исследовании сывороток крови лихорадящих больных с неустановленным диагнозом и доноров крови из районов Ставропольского края методом ИФА обнаружены специфические иммуноглобулины класса G к ВЛЗН, что свидетельствует об инфицированности населения и позволяет выделить следующие территории наибольшего риска заражения людей: Благодар-ненский, Изобильненский, Кочубеевский, Красногвардейский, Курский, Александровский, Нефтекумский, Туркменский, Шпаковский районы Ставропольского края и г. Ставрополь. Опасность возникновения заболевания ЛЗН существует также в Георгиевском, Грачевском, Новоселицком, Петровском, Советском, Степновском районах Ставропольского края, в которых выявлены носители и переносчики ВЛЗН.

3. Наличие природных очагов ЛЗН на сопредельных и близлежащих к Ставропольскому краю территориях Юга России, ландшафтно-географические, климатические, фаунистические особенности Ставропольского края, расположенного на восточно-европейском пути миграции перелетных птиц из эндемичных по ЛЗН стран Азии и Африки, а также установленная методами ИФА и ОТ-ПЦР зараженность ВЛЗН собранных на территории Ставропольского края комаров, иксодовых клещей и синантропных врановых свидетельствуют о формировании природных очагов на его территории и необходимости проведения широкомасштабного эпидемиологического мониторинга за лихорадкой Западного Нила.

4. Применение иммуномагнитной сепарации с разработанным алюмо-силикатным аффинным ЛЗН-сорбентом в сочетании с ИФА и ОТ-ПЦР позволя-

ет увеличить их чувствительность и специфичность, тем самым повышая выявляемое™ инфекционного агента в 3 -3,5 раза в ИФА ив 1,8-2 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20 - 21 часа до 1 -3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает их экспрессность, достоверность, информативность и, как следствие, эффективность эпидемиологического мониторинга за JI3H.

5. Показано, что сформировавшиеся природные очаги на территории Волгоградской, Ростовской, Астраханской областей характеризуются ежегодными заболеваниями людей с преобладанием среди заболевших городского населения (87,2 %) и средне-тяжелой формы без поражения ЦНС (84,6 %), при этом в трансмиссивном механизме передачи вируса ЛЗН (79,5 %) в основном принимают участие комары родов Culex, Anopheles, Aedes, Coquilletti-dia и иксодовые клещи H.marginatum, Rh.rossicus.

Список опубликованных работ

1. Афанасьева, Е.Е. Разработка сочетанного метода детекции вируса лихорадки Западного Huna (ЛЗН) путем избирательного концентрирования на магноимму-носорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией / Е.Е. Афанасьева //Вестник Российской военно-медицинской академии. - СПб, 2006. -№ 1(15). - Приложение. - С. 486.

2. Алиева, Е.В. Аффинные сорбенты для экспресс-диагностики различных заболеваний /Е.В.Алиева, И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, Н.Е. Афанасьев, М.П. Лаврешин, Е.Е. Афанасьева, Т.Н. Орлова //Курский научно-практический вестник « Человек и его здоровье». - 2008. - №1. - С.5-9.

3. Жарникова, И.В. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний /И.В.Жарникова, И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, В.И. Ефременко, Е.В. Жданова, Т.В. Жарникова, Е.Е. Афанасьева, Т.Н. Орлова, Д. В. Ефременко, Н.Е. Афанасьев, М.П. Лаврешин, Н.В. Левченко, A.A. Семирчева, С.А. Курчева, A.M. Бабий //Вестник Российской военно-медицинской академии. — Санкт-Петербург, 2008. - Приложение №2(22). - 4.1. - С. 180-181.

4. Тюменцева, И.С. Иммуномагнитные сорбенты для экспресс-диагностики опасных инфекционных заболеваний: аспекты биотехнологии и опыт применения /И.С.Тюменцева, E.H. Афанасьев, Л.В. Ляпустина, О.И. Коготкова, И.В. Жарникова, В.И. Ефременко, Д.А. Будыка, Н.Ф. Василенко, Е.Е. Афанасьева, А.Н. Куличенко //Проблемы особо опасных инфекций. - Вып. 3, №101. - Саратов, 2009. - С. 59-61.

5. Василенко, Н.Ф. Изучение циркуляции вируса лихорадки Западного Нила в Ставропольском крае / Н.Ф. Василенко, Е.Е. Афанасьева, Д.А. Грядских, Е.А. Горобец, Т.В. Марьева, Л.В. Дегтярева // Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагопо-лучия и защите прав потребителей. 9-я Ежегодная Неделя Медицины Ставрополья: Материалы науч.-практ. конф.- Ставрополь, 2005. - С. 173-177.

6. Афанасьева, Е.Е. Эпидемиологический мониторинг ЛЗН на территории Ставропольского края / Е.Е. Афанасьева, Н.Ф. Василенко, Т.В. Марьева, И.В. Чумакова; Ставропольский н.-и. противочумный ин-т. - Ставрополь, 2006. - 7 с. - Деп. в ВИНИТИ 13.04.2006, № 477 В-2006.

7. Чумакова, И.В. Орнитофильные комары (Diptera, Culicidae) Ставропольского края / И.В. Чумакова, Н.Ф. Василенко, Т.В. Марьева, Е.Е. Афанасьева, И.Э. Ляпин // Проблемы энтомологии Северо-Кавказского региона: Материалы 1-й Всероссийской науч.-практ. интернет - конференции. - Ставрополь: «Агрус», 2006. - Вып.2. - С. 33-35.

8. Афанасьева Е.Е. Эпидемиологический надзор за лихорадкой Западного Нила в Ставропольском крае /Е.Е, Афанасьева, Н.Ф. Василенко, Т.В Марьева //Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сб. тезисов науч.-практ. конф. молодых ученых. - СПб.: Издательский дом СПб МАПО, 2006. - С.289-290.

9. Ефременко, В.И.О значении птиц в заносе и циркуляции патогенных для человека вирусов в природных и антропогенных биоценозах Юга России / В.И. Ефременко, Г.М. Грижебовский, А.П. Бейер, И.В. Чумакова, Н.В. Ефременко, Н.Ф. Василенко, Т.Н. Орлова, Е.Е. Афанасьева; Ставропольский н.-и. противочумный ин-т. - Ставрополь, 2006. - 15 с. - Деп. в ВИНИТИ 26.07.2006, №1008- В2006.

10. Чумакова, И.В. Освоение комарами урбаценозов городов Ставропольского края /И.В. Чумакова, С.А. Сироткина, Н.Ф. Василенко, Т.В. Марьева, Е.Е.Афанасьева // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: Сб. науч. трудов. - М., 2006. - Вып. 8. - С. 676-678.

11. Афанасьева, Е.Е. Разработка метода селективного концентрирования на магноиммуносорбенте с последующей постановкой ИФА для детекции возбудителя лихорадки Западного Нила / Е.Е. Афанасьева // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: Матер. VII Межгосударственной конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) /Под ред. академика РАМН Г.Г.Онищенко, член. - корр. РАМН В.В. Кутырева, докт. мед. наук, профессора И.А. Дятлова. -Протвино: А-ПРИНТ ЗАО, 2006,- С. 178-179.

12. Афанасьева, Е.Е. Разработка биотехнологии получения магноиммуно-сорбентов для экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила /Е.Е.Афанасьева, Д.А.Грядских //Там же. - С. 179-180.

13. Алиева, Е.В. Унификация и разработка тест-систем диагностических для мониторинга возбудителей бактериальной (кампилобактериоз, туляремия, лептоспироз) и вирусной (лихорадка Западного Нила) природы / Е.В. Алиева, A.B. Таран, Е.Е. Афанасьева, С.А. Курчева, Т.В. Жарникова, И.С. Тюменце-ва, И.В. Жарникова, И.В. Самарина // Вестник СГУ. - Ставрополь, 2006. -Вып. 47. - С. 292-298.

14. Пат. РФ № 2290641. МПК8 G 01N 33/551, С 12 Q 1/04. Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА) / Д.И. Ефременко, И.В. Жарникова,, A.A. Ефременко, И.В.Гаркуша, Е.В.Жданова, И.В. Юркина, Е.В. Алиева,

Е.Е. Афанасьева. - №200510921/13 заявлено 30.03.2005; опубл. 27.12.2006, Бюл. №32. - 4с.

15. Афанасьева, Е.Е. Разработка биотехнологии получения магноиммуно-сорбентных тест-систем для экспресс - диагностики лихорадки Западного Нила и детекции ее возбудителя / Е.Е. Афанасьева, В.И. Ефременко, И.С. Тюменцева, Н.Ф. Василенко; Ставропольский н.-и. противочумный инт. - Ставрополь, 2007. - 20 с. - Деп. в ВИНИТИ 23.01.2007, № 66 - В2007.

16. Афанасьева, Е.Е. Совершенствование экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила / Е.Е. Афанасьева // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России: Материалы научно-практ. конференции (21-22 марта 2007 г.). - Ставрополь, 2007. - 4.1. - С. 29-32.

17. Василенко, Н.Ф. Эпидемиологическая обстановка по лихорадке Западного Нила в Южном Федеральном округе в 2006 г. /Н.Ф.Василенко, О.В.Малецкая, А.П.Бейер, И.В.Чумакова, Е.Е.Афанасьева // Там же. - С.64-67.

18. Ефременко, В.И. Применение тест-систем магноиммуносорбентных для вьивления возбудителей инфекционных заболеваний / В.И. Ефременко,

A.A. Зуенко, О.И. Коготкова, Н.В. Чурикова, И.С. Тюменцева, И.В. Жарни-кова, Е.С. Шиянова, В.Д. Майская, Е.Е. Афанасьева, Т.В. Жарникова, С.А. Курчева; Ставропольский н.-и. противочумный ин-т. - Ставрополь, 2007. - 28 с. - Деп. в ВИНИТИ 18.07.07. - №741-В2007.

19. Афанасьева, Е.Е. Опыт применения аффинного сорбента для экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила / Е.Е. Афанасьева, Н. Ф. Василенко,

B.И. Ефременко, И.В. Чумакова, Т.В. Марьева, А.М. Бутенко, Т.Ю. Крассов-ская, С.А. Щербакова, И.Н. Шарова // Материалы IX съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-27 апреля, 2007. - М.: Санэпидемия, 2007. - Т.З. - С. 9-10.

20. Василенко, Н.Ф. Цируляция некоторых арбовирусов на территории Ставропольского края /Н.Ф. Василенко, А.П. Бейер, И.В. Чумакова, В.И. Ефременко, О.В. Малецкая, М.П. Григорьев, Е.Е. Афанасьева, Т.В. Марьева, В.М. Мезенцев //Научно-практический журнал «РЭТ-ИНФО». - Москва, 2007. -№1.-С.15-18.

21. Василенко, Н.Ф. Распространение некоторых арбовирусов на территории Ставропольского края /Н.Ф. Василенко, А.П. Бейер, И.В. Чумакова, В.И. Ефременко, О.В. Малецкая, М.П. Григорьев, Е.Е. Афанасьева, Т.В. Марьева, В.М. Мезенцев //Арбовирусы и арбовирусные инфекции: Материалы расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» и на-уч.-практ. конф. «Арбовирусы и арбовирусные инфекции», Астрахань, 17 -20 окт. 2006. - Москва, 2007. - С.165-168.

22. Орлова, Т.Н. Получение ферромагнитного кремнезема, модифицированного карбонизированным лигнином и карбодиимидом, и его характеристика /Т.Н.Орлова, Е.Е. Афанасьева, E.H. Афанасьев, И.С. Тюменцева, Н.Ф. Василенко /Вестник Московского ун-та. Серия 2. - Химия, 2008. - Т.49, №3. - С.213-216.

23. Афанасьева, Е.Е. Мониторинг за лихорадкой Западного Нила в Ставропольском крае (2005-2008 гг.) /Е.Е.Афанасьева, Н.Г. Варфоломеева, Г.П. Шкарлет, Н.Ф. Василенко // Материалы науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотреб-надзора (21-22 апреля 2009, Оболенск, Московская обл.) Биологическая безопасность в современном мире. - Оболенск, 2009. - С.37-39.

24. Варфоломеева, Н.Г. Изучение циркуляции некоторых арбовирусов на территории Ставропольского края в 2008 г. /Н.Г.Варфоломеева, Г.П. Шкарлет, Е.Е. Афанасьева, Н.Ф. Василенко, Т.Н. Орлова, Л.И. Шапошникова, О.В. Малецкая //Там же. - С.10-12.

25. Пат. РФ № 2363732 МПК8 C12N 11/14, G 01 N 35/551. Способ получения иммуносорбента /Е.Е. Афанасьева, А.В.Брыкалов, И.С. Тюменцева, В.И.Ефременко, Д.А. Грядских, E.H. Афанасьев, М.П. Лаврешин. -№2008110836/13 заявлено 18.03.2008; опубл. 10.08.2009, Бюл. № 22. - 5 с.

Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60>£4/16 Физ. печ. л. - 1,5 Усл. печ. л. - 1,39

Заказ-205 Тираж-100 Отпечатано в оперативной полиграфии отдела информации и региональной статистики Ставропольстата г. Ставрополь, ул. Пушкина,4

Актуальность темы. В современном мире неуклонно растет понимание высокой социально-экономической значимости широкого распространения различных инфекционных болезней. Особенностью современной эпидемиологической обстановки является не только активизация многих инфекционных заболеваний, которые традиционно находятся под контролем санитарно-эпидемиологических служб, но и возникновение очагов новых и возвращающихся инфекций бактериальной и вирусной природы (Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Кривуля С.Д и соавт., 2006; Локтев В.Б., 2007; Кутырев В.В., 2008: Львов Д.К., Савченко С.Т., Алексеев В.В. и соавт., 2008; Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Жаркенов А.Ф. и соавт., 2009; Онищенко Г.Г., Смоленский В.Ю., 2009).

Проблема лихорадки Западного Нила (ЛЗН) в настоящее время остается актуальной в связи с постоянным расширением ареала этой инфекции. Крупные вспышки ЛЗН (Онищенко Г.Г., 2000, 2001; Бутенко A.M., 2007; Львов Д.К., Савченко С.Т., Алексеев В.В. и соавт., 2008; Платонов А.Е., Ка-рань Л.С., Гаранина С.Б. и соавт., 2009), тяжелое течение болезни с преобладанием серозных менингитов, документированная передача вируса лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) при переливании крови являются новыми фактами в изучении этой актуальной арбовирусной инфекции. Вспышки и эпидемии ЛЗН и даже единичные случаи рассматриваются в Международных медико-санитарных правилах ВОЗ (2005) как чрезвычайная ситуация здравоохранения международного масштаба. Сезонные миграции птиц способствуют трансконтинентальному переносу ВЛЗН (Львов Д.К.,2002; Бутенко A.M., Вышемирский О.И. и соавт., 2002; Забашта М.В., Москвитина Э.А., За-башта А.В., 2006 и др.).

Не возникает сомнений в том, что территория Юга России является эндемичной по широкому спектру природно-очаговых инфекций бактериальной и вирусной природы, требующих особого внимания в силу того, что этиологические агенты большинства из них относятся к возбудителям I-II групп патогенности, а обострение обстановки по некоторым из них может привести к чрезвычайной эпидемической ситуации международного значения (Малецкая О.В., Грижебовский Г.М., Бейер А.Г1. и соавт., 2009).

Ставропольский край (СК) в силу своего географического положения и природных условий (жаркий засушливый климат, обилие водоемов, комаров и клещей, большое количество перелетных птиц и др.) представляет большой интерес в отношении изучения циркуляции вируса JI3H и его роли в патологии человека. Такие исследования на территории Ставропольского края ранее не проводились.

Сложившаяся ситуация диктует необходимость широкомасштабного реального мониторинга вируса JI3H в антропогенных и природных биоценозах с привлечением современных методов экспресс-диагностики. Мониторинг инфекционных болезней является одной из наиболее важных составляющих комплекса мер по предотвращению и борьбе с эпидемиями (Они-щенко Г.Г., 2006). Один из блоков мониторинга - сбор, доставка и лабораторное исследование полевого материала — необходим как для прямого обнаружения компонентов возбудителя (антигенов или фрагментов генома), так и для последующей изоляции и идентификации инфекционного агента. Однако часто низкие концентрации возбудителя инфекции и его компонентов в полевом материале, а также огромное количество примесей не позволяют обнаруживать антигены вирусов и бактерий или их генетический материал непосредственно в исследуемых пробах. Разработка высокоэффективных способов концентрирования патогенов с последующей детекцией их антигенов или нуклеиновых кислот, либо их селективной сепарацией для бактериологических или вирусологических исследований - одно из приоритетных направлений совершенствования их лабораторной диагностики (Ефременко В.И., Василенко Н.Ф., Жарникова И.В. и соавт., 2009).

Актуальность проблем, изложенных выше, послужила основанием для проведения данной работы.

Цель исследования: совершенствование эпидемиологического мониторинга за лихорадкой Западного Нила и методов выявления её возбудителя.

Для достижения цели были определены основные задачи:

1. Изучить на примере Ставропольского края условия, способствующие формированию природных очагов лихорадки Западного Нила на Юге Российской Федерации.

2. Провести анализ результатов эпизоотологического обследования и заболеваемости J13H на территории Юга РФ.

3. Провести обследование территории Ставропольского края на наличие переносчиков и резервуаров вируса JT3H.

4. Изучить иммунную прослойку выборочных групп здорового населения, проживающих в Ставропольском крае, и провести исследования сывороток крови больных с лихорадкой неизвестной этиологии на наличие специфических антител к вирусу JI3H.

5. Усовершенствовать методы изучения распространения возбудителя лихорадки Западного Нила за счет использования иммуномагнитной сепарации при эпидемиологическом мониторинге вируса JT3H в объектах окружающей среды.

Научная новизна.

• Впервые на территории Ставропольского края при исследовании объектов внешней среды выявлено наличие вируса JI3H и установлены его основные переносчики - комары рода Aedes.

• Впервые установлена инфицированность BJI3H клещей Н. marginatum, что указывает на возможность их вовлечения в паразитарные системы природных очагов JI3H на территории Ставропольского края.

• Изучены показатели гуморального иммунитета больных с лихорадками неясной этиологии и здоровых людей (доноров крови) и установлено наличие антител класса IgG к вирусу JI3H в обеих группах, что свидетельствует об инфицировании этим вирусом населения

Ставропольского края и является дополнительным критерием в оценке эпидемической значимости природных очагов этой инфекции.

• Впервые использованная иммуномагнитная сепарация при исследовании полевого материала методами иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) повысила их эффективность и увеличила число положительных находок в 2 - 3 раза, что позволяет более достоверно оценивать эпидемиологический потенциал территорий.

• Получены данные о достаточно высоком эпидемиологическом потенциале природных очагов JI3H на территории Юга Российской Федерации, выражающиеся в ежегодной регистрации случаев заболеваний людей и зараженности комаров и клещей ВЛЗН. Практическая значимость.

Установление факта циркуляции возбудителя ЛЗН на территории Ставропольского края является предпосылкой для разработки комплекса мероприятий по эпидемиологическому и эпизоотологическому мониторингу, диагностике и профилактике ЛЗН. Применение иммуномагнитной сепарации в сочетании с методами лабораторной экспресс-диагностики (ИФА и ОТ-ПЦР) позволяет увеличить их чувствительность и специфичность, повышая возможность выявления возбудителя в 3 - 3,5 раза в ИФА ив 1,8-2 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20-21 часа до 1-3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов при проведении анализов.

По результатам выполненных исследований получено 2 патента РФ: «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)», № 2290641, Бюл. № 36 от 27.12. 2006 г.; «Способ получения иммуносорбента», № 2363732, Бюл. № 22 от 10.08. 2009 г.

Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций: «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях», утвержденных директором СтавНИПЧИ ( протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 9 от 27.10.2005 г.), «Применение органокремнеземно-го аффинного сорбента для селективного концентрирования возбудителя ЛЗН и последующего проведения экспресс-анализов (ИФА и ПЦР)», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 2 от 28 февраля 2007 г.); «Исследование полевого материала на наличие арбовирусов методами иммупоферментного анализа и полимеразной цепной реакции», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 8 от 09.07.2009 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Территория Юга Российской Федерации характеризуется наличием природных очагов ЛЗН с высоким эпидемическим по1енциалом, при этом основным резервуаром и переносчиком вируса являются комары рода Culex, Anopheles, Aedes, Coquillettidia и иксодовые клещи Н. marginatum, Rh. rossicus.

2. Установленная зараженность вирусом ЛЗН комаров рода Aedes, иксодовых клещей Hyalomma marginatum, синашропных врановых, обнаружение специфических антител к В ЛЗН в сыворотках крови людей с лихорадками неизвестной этиологии и у доноров крови свидетельствуют о циркуляции данного вируса на территории Ставропольского края.

3. Применение иммуномагнитной сепарации позволяет максимально сконцентрировать ВЛЗН в исследуемом материале, что увеличивает чувствительность методов на несколько порядков по сравнению с традиционными ИФА и ПЦР. Разработанные сочетанные методы МИС + ИФА и МИС + ПЦР могут использоваться при проведении мониторинга за ЛЗН.

Апробация работы. Результаты диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств — участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников содружества Независимых Государств (Оболенск, 2006); второго съезда военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 2006); расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» РАМН и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 2006); Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине основания Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург,2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора (Оболенск, 2009).

Апробация диссертации состоялась 6 августа 2009 г. на межлабораторной конференции ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно.

Отдельные этапы работы были выполнены совместно с д.б.н. Жарни-ковой И.В., к.б.н. Орловой Т.Н., д.х.н. Брыкаловым А.В.

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 4 работы - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Выводы

1. Впервые показано наличие важнейших переносчиков и резервуаров вируса лихорадки Западного Нила, которыми являются комары рода Aedes и птицы семейства врановых; иксодовые клещи Н. marginatum вовлекаются в паразитарную систему ВЛЗН на территории Ставропольского края, что свидетельствует о наличии природных очагов ЛЗН на данной территории.

2. Впервые при исследовании сывороток крови лихорадящих больных с неустановленным диагнозом и доноров крови из районов Ставропольского края методом ИФА обнаружены специфические иммуноглобулины класса G к ВЛЗН, что свидетельствует об инфицированности населения и позволяет выделить следующие территории наибольшего риска заражения людей: Благодарненский, Изобильненский, Кочубеевский, Красногвардейский, Курский, Александровский, Нефтекумский, Туркменский, Шпаковский районы Ставропольского края и г. Ставрополь. Опасность возникновения заболевания ЛЗН существует также в Георгиевском, Грачевском, Новоселицком, Петровском, Советском, Степновском районах Ставропольского края, в которых выявлены носители и переносчики ВЛЗН.

3. Наличие природных очагов ЛЗН на сопредельных и близлежащих к Ставропольскому краю территориях Юга России, ландшафтно-географические, климатические, фаунистические особенности Ставропольского края, расположенного на восточно-европейском пути миграции перелетных птиц из эндемичных по ЛЗН стран Азии и Африки, а также установленная методами ИФА и ОТ-ПЦР зараженность ВЛЗН собранных на территории Ставропольского края комаров, иксодовых клещей и синантропных врановых свидетельствуют о формировании природных очагов на его территории и необходимости проведения широкомасштабного эпидемиологического мониторинга за лихорадкой Западного Нила.

4. Применение иммуномагнитной сепарации с разработанным алю-мосиликатным аффинным ЛЗН-сорбентом в сочетании с ИФА и ОТ-ПЦР позволяет увеличить их чувствительность и специфичность, тем самым повышая выявляемость инфекционного агента в 3 -3,5 раза в ИФА ив 1,8-2 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20 -21 часа до 1 — 3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает их экспрессность, достоверность, информативность и, как следствие, эффективность эпидемиологического мониторинга за ЛЗН.

5. Показано, что сформировавшиеся природные очаги на территории Волгоградской, Ростовской, Астраханской областей характеризуются ежегодными заболеваниями людей с преобладанием среди заболевших городского населения (87,2 %) и средне-тяжелой формы без поражения ЦНС (84,6 %), при этом в трансмиссивном механизме передачи вируса ЛЗН (79,5 %) в основном принимают участие комары родов Culex, Anopheles, Aedes, Coquillettidia и иксодовые клещи Н. marginatum, Rh.rossicus.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время лихорадка Западного Нила среди вновь возникающих вирусных инфекций человека является актуальной проблемой для здравоохранения России и других государств, в том числе членов ШОС (Львов Д.К., 2000; Львов Д.К., Савченко С.Г., Алексеев В.В. и соавт., 2008). В социально-экономическом отношении лихорадка Западного Нила - наиболее значимая арбовирусная инфекция для Юга России. Значимость данной нозологической формы определяется её широким распространением среди населения, вовлечением в эпидемический процесс трудоспособной части населения, возможностью возникновения вспышек, выраженной сезонностью, полиморфизмом клинических проявлений («агрессивностью болезни»), о чем свидетельствует значительный удельный вес тяжелых форм (40 %) и высокая летальность ( более 10 %) (Львов Д.К., Писарев В.Б., Петров В.А. и соавт., 2004).

Наличие эндемичных по ЛЗН территорий в странах Азии и Африки, возможность переноса вируса ЛЗН перелетными птицами, которые в эволюционном плане среди других позвоночных являются одним из древнейших резервуаров арбовирусов, в том числе ВЛЗН, его способность реплицироваться в новых видах млекопитающих, птиц и насекомых, высокая генетическая изменчивость, легкая адаптация к новым природным условиям обеспечивают формирование новых природных очагов ЛЗН, в которые вовлекается и проживающее на этой территории население (Локтев В.Б., Вышемир-ский О.И., Гуторов В.В. и соавт., 2009; Москвитина Э.А., Пичурина Н.Л., Орехов И.В. и соавт., 2009).

Юг Российской Федерации расположен на восточно-европейском пути пролета птиц из стран Центральной и Восточной Африки, Центральной, Юго-Западной и Южной Азии, в том числе эндемичных по ЛЗН.

На территории Юга РФ выделяют следующие ландшафтные зоны: пустынные северного подтипа, полупустынные южного подтипа (в Республике

Калмыкия и Астраханской области); луговые незатопленного подтипа, пойменные и пойменно-дельтовые, лесные умеренного пояса пойменного подтипа - в пределах Астраханской области; степные, полупустынные - в пределах Волгоградской области, Ставропольского края; лесостепные - в Ставропольском крае; предгорная - в Ставропольском крае; а также зоны полусухих и влажных субтропиков в пределах Краснодарского края (Новороссийск, Сочи). Разнообразие ландшафта, богатый растительный мир, многочисленность популяций членистоногих, благоприятные климатические условия на территории Юга РФ могут обеспечивать циркуляцию вируса ЛЗН в пустынном, степном и лесостепном зональных поясах. Особенности гидрологического режима на этой территории приводят к образованию узлов концентрации гнездящихся и мигрирующих птиц, в том числе водного и околоводного комплекса. В этих же районах создаются благоприятные условия для массового выплода комаров - основных переносчиков вируса ЛЗН, и клещей, выполняющих функции резервных хозяев. Среди комаров по видовому составу доминирует род Aedes. A. vexans и A. dorsalis — многочисленные виды в лесах и речных долинах степной зоны. Практически повсеместно обилен тропический род Culex, в частности, С. pipiens.

Ареал распространения клещей рода Hyalomma на территории Юга России в основном ограничен южными районами Волгоградской области, севером Астраханской области, Республикой Калмыкией, Ставропольским краем. Однако, в связи с тем, что основными прокормителями личиночных и нимфальных стадий этих иксодовых клещей являются птицы, а период пребывания на хозяине премагинальных фаз иксоид весьма продолжителен, все это способствует транспортировке личинок и нимф клещей рода Hyalomma птицами во время их весенних миграций на значительные расстояния. Масштабы заноса и адаптации паразитов к местным условиям свидетельствуют о возможности формирования за пределами ареала псевдопопуляций клещей рода Hyalomma.

Таким образом, основными факторами, способствующими формированию на территории Юга России природных очагов ЛЗН и ее эпидемическому проявлению, являются: климатические условия - свыше 100 дней в году со среднесуточной температурой более 20 °С, до 30 дней - более 30 °С, сумма эффективных температур (температура выше 10 °С) составляет 3200-3500 ; весьма разнообразный спектр кровососущих членистоногих (комаров, клещей) и птиц - основных переносчиков и носителей вируса ЛЗН; наличие большого числа миграционных русел перелетных птиц, способствующих заносу на территорию Юга РФ вируса ЛЗН из стран Азии и Африки.

Слежение за эпизоотическим процессом является одним из основных компонентов эпиднадзора за ЛЗН. Используя результаты исследований методом ИФА кровососущих членистоногих, мелких млекопитающих и птиц на наличие антигена вируса ЛЗН, осуществленных Территориальными управлениями Роспотребнадзора субъектов Юга России, нами проведен комплексный анализ этих данных с целью оценки эпидемиологической напряженности природных очагов ЛЗН на Юге РФ, а также для уточнения видового состава основных переносчиков и носителей ВЛЗН, их распространения и территориальной приуроченности.

В период с 2001 по 2006 гг. на территории Юга РФ методом иммуно-ферментного анализа было исследовано 16111 проб, в том числе 3230 проб, полученных от птиц (20,0 %), 2341 проба органов грызунов (14,5 %), 2675 проб комаров (16,6 %) и 7865 проб клещей (48,8 %). При этом общее количество положительных проб равнялось 295 (1,8 %). В целом на Юге РФ у грызунов антиген вируса ЛЗН выявлен в 1,0 % проб, среди птиц положительные пробы составили 1,8 %, у клещей ВЛЗН обнаружен в 1,9 % случаев; наибольший процент заражения вирусом ЛЗН отмечен у комаров (2,2 %).

Анализ лабораторных данных показал, что основными переносчиками ВЛЗН являются комары родов Aedes, Anopheles, Culex, Coquillettidia и иксо-довые клещи II. marginatum и Rhipicephalus rossicus, при этом циркуляция вируса ЛЗН имеет выраженную сезонность, совпадающую с пиками активности основных преносчиков.

Как показал анализ, в Краснодарском крае, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской и Чеченской республиках, Республиках Северная Осетия-Алания и Адыгея при исследовании объектов внешней среды антиген вируса ЛЗН не выявлен.

О степени активности природных очагов ЛЗН, распространенности возбудителя на территории Юга России можно сделать достоверное заключение по результатам изучения уровня иммунной прослойки к вирусу ЛЗН населения, проживающего на этой территории. Сыворотки крови доноров, проживающих в Астраханской области, исследовали в ИФА и установили высокий уровень иммунной прослойки (47,0 %) среди населения. Уровень иммунной прослойки к вирусу ЛЗН у жителей Краснодарского края составил 2,8 %. За период с 2001 г. по 2006 г. ЛЗН зарегистрирована в трех из 13 субъектов Южного федерального округа: в Астраханской, Ростовской и Волгоградской областях. За эти шесть лет заболели лихорадкой Западного Нила 293 человека. Наибольшая эпидемиологическая активность отмечалась в Астраханской области, где за указанные годы выявлены 205 больных, что составило 69,9 % от числа всех больных, зарегистрированных в ЮФО. В Ростовской области число заболевших ЛЗН составило 43 (14,7 %), в Волгоградской области - 45 (15,4%).

В 2006 г. эпидемиологическая обстановка по ЛЗН изменилась: на Юге России зарегистрированы 39 больных в трех субъектах, что на 42,4 % меньше по сравнению с 2005 г. (92 больных). При этом резко снизилась заболеваемость в Астраханской области (в 5,2 раза), незначительно - в Ростовской области (в 1,2 раза). В Астраханской области выявлены 14 больных в трех районах: Икрянинском - 1, Камызякском - 1, Приволжском - 1 и в г. Астрахани — 11. Один случай заболевания ЛЗН закончился смертельным исходом (7,1 %). В Ростовской области зарегистрированы 13 больных в двух районах (Азовском — 1, Сальском - 1) и в трех городах (Ростове-на-Дону - 7, Каменск-Шахтинском - 1, Сальске - 3). В Волгоградской области заболеваемость возросла в 4 раза, всего отмечены 12 больных в г. Волгограде, в 2007 г. заболеваемость в этом регионе повысилась в 5,3 раза, а в 2008 г. снизилась в 31,5 раза. У всех больных диагноз в 100 % случаев подтвержден лабораторно.

В Краснодарском крае, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской и Чеченской республиках, Республиках Северная Осетия-Алания, Адыгея, Калмыкия за период 2001-2006 г.г. случаи заболевания лихорадкой Западного Нила в официальных сводках не зарегистрированы (рисунок 16).

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что эпидемиологическая обстановка по ЛЗН на территории Юга РФ продолжает оставаться нестабильной. Как показывают результаты полевых наблюдений, прогноз эпидемиологической обстановки по ЛЗН следует признать неблагоприятным.

В Ставропольском крае подобных исследований никогда не проводили. Исходя из реальной эпидемиологической ситуации, сложившейся на сопредельных к СК территориях, совершенно очевидна своевременность и необходимость проведения эпидемиологического мониторинга за ЛЗН на территории Ставропольского края с привлечением современных методов исследования.

На наличие антигена ВЛЗН нами исследованы 3573 экземпляра кровососущих комаров, представленных четырьмя родами: Culex — 1948 экз. (43 пула), Aedes - 1253 (138), Anopheles - 200 (36), Coquillettida - 172 ( 13). Сбор комаров осуществляли в июне — июле 2005 - 2008 гг. в Александровском, Благодарненском, Георгиевском, Грановском, Изобильненском, Кировском, Красногвардейском, Курском, Нефтекумском, Петровском, Советском, Степ-новском, Шпаковском районах Ставропольского края и окресностях г. Ставрополя. Антиген ВЛЗН в ИФА обнаружен в девяти суспензиях комаров рода Aedes: A. cantans — семь проб, A. vexans - одна проба; A. diantaeus — одна проба; положительные пробы составили 6,5 % от всего количества проб рода Aedes. При анализе результатов исследования кровососущих комаров обра

Старополтавский

Ольховский^ t'V Среднеахтубинский

Г Kjbk;

Городищенскии^^;, ^ -^^^Врлгоград ►

-> j J Октябрьский г

Западно-Казахстанская область

Ленинский

Атыраусская область ' - • J у fXf-, Сальскии'

ГЧ

Ростов-на

•АЗОВСКИ!

Астрахань > { Икрянский. ненский юселицкий ' i -бУДЕННОвскийJ изобильненский; iakobcki овскй^ц советски! фтекумский

Республика Грузия

Украина

Камызякский

Километры

Республика Азербайджан -%

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

Граница административных f территорий Юга РФ

Граница районов

Ш Зарегистрированы больные ЛЗН

Зарегистрированы антитела к ВЛЗН у доноров, антиген фрагменты РНК

Рис. 16. Результаты лабораторных исследований на ЛЗН на территории Юга России щает на себя внимание высокая зараженность BJI3H орнитофильного вида А. cantans, обнаруженного, главным образом, во влажной лесопарковой зоне. Три пробы приготовлены из комаров, собранных в г. Ставрополе (парк Победы, лиственный лес), две - из комаров, отловленных на опушке леса х. Молочного (пригородная зона г.Ставрополя), одна проба - в 2-х км от леса в с. Красном Грачевского района, одна проба - в Изобильненском районе. Оба района граничат с краевым центром. Инфицированная проба комаров A. dian-taeus также обнаружена в г. Ставрополе. Зараженные В ЛЗН комары A.vexans доставлены из Нефтекумского района, расположенного в полупустынной ландшафтной зоне.

Исследование 4853 особей иксодовых и 61 особи аргасовых клещей на зараженность ВЛЗН, собранных нами в различных районах Ставропольского края, позволило обнаружить в ИФА восемь положительных проб Hyalomma marginatum (2,7 %) из 299 исследованных и одну положительную пробу Boophilus anmdatus (3,8 %) из 26 исследованных. Антиген ВЛЗН выявлен в двух пробах мозга грачей, с которых были сняты инфицированные клещи. При исследовании этих же проб комаров и клещей молекулярно-генетическим методом (ОТ-ПЦР) РНК вируса ЛЗН обнаружена в 14 пробах суспензий комаров рода Aedes , что составило 6,0 % от общего количества исследованных проб и 10,1 % от количества проб Aedes . В пробах клещей методом ОТ-ПЦР положительные результаты получены в 13 пулах, что составило 3,1 % от исследованного количества клещей Н. marginatum (414 проб) и 2,9 % от общего количества (456 пулов) иксодовых клещей.

С целью обнаружения специфических антител класса G к ВЛЗН исследованы 268 сывороток крови больных людей с лихорадками неизвестной этиологии, доставленных из районов Ставропольского края. Выявлены девять положительных проб, из них четыре — с титрами 1:6400 - 1:12800. При исследовании положительных проб на авидность оказалось, что высокотит-ражные сыворотки содержали низкоавидные антитела, свидетельствующие о недавно перенесенной болезни. Для оценки уровня естественной иммунизации населения исследовались сыворотки крови доноров, при этом из 1302 проб положительными оказались 21 ( 1,6 %). Полученные нами результаты свидетельствовали о циркуляции BJ13, и это требует расширенных исследований с применением новых современных экспрессных, информативных лабораторных методов для проведения эпидемиологического надзора за этой инфекцией.

Эффективность ряда методов индикации возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов может быть значительно увеличена после предварительного концентрирования вирусов и их антигенов с отделением от контаминирующей микрофлоры и ингибирующих примесей. Эта цель может быть достигнута путем применения методов иммуносорбции, особое место среди которых занимают методы с использованием сорбентов с магнитными свойствами. Магносорбенты служат твердой фазой при селективном концентрировании на их поверхности патогенов.

Нами впервые для синтеза твердофазной матрицы сорбента использован природный алюмосиликат, представляющий собой продукт, содержащий в своем составе, по данным химического анализа, двуокись кремния (массовая доля) - 78%. Химическое модифицирование сорбента с целью образования функционально активных групп, способных к взаимодействию с ли-гандами белковой природы, осуществляли в присутствии карбоксиметилиро-ванного - лигнина и карбодиимида. В качестве магнитного компонента при синтезе применяли магнетит (Fe3C>4). На основе проведенных исследований определены оптимальные параметры получения алюмосиликатного магно-сорбента: соотношение компонентов синтеза 1,5:1:1, соответственно SiCb, Fe304 , карбоксиметилированный лигнин; время гелеобразования - 2 часа, значение рН гелеобразования - 7,0. Для придания магносорбенту биоспецифических свойств и получения магноиммуносорбента (МИС) на поверхность МС иммобилизовали специфические IgG , выделенные фракционированием ПЭГ-6000 из мышиной ИАЖ против ВЛЗН.

ЛЗН - магноиммуносорбент имел следующие характеристики: у образцов МИС наблюдалась ярко выраженная губчатая, пористая микроструктура с участками аморфной массы, удельная поверхность сорбента - 63,0 ±0,84 м~/г, объем пор - 1,23 ±0,009 см /г, радиус пор - 29,7 ± 0,29 нм.

С целью упрощения и удешевления постановки иммуноферментного анализа, повышения его специфичности и чувствительности в качестве твердой фазы вместо полистироловых микроплат, традиционно применяемых при постановке ИФА, мы применили разработанные нами МИС при постановке «сэндвич» - варианта этого метода для обнаружения вируса ЛЗН. При этом были определены оптимальные параметры постановки ИФА с использованием МИС, чувствительность и специфичность сочетанного метода, проведено сравнение модифицированного метода МИС+ИФА с методом постановки реакции в полистироловых планшетах. Лабораторные испытания полученных нами трех серий алюмосиликатных лигнинсодержащих МИС к вирусу ЛЗН проводили с инактивированным антигеном, полученным в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Для проверки специфичности использовали антиген вируса клещевого энцефалита (инактивированный контрольный образец из набора реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса клещевого энцефалита «ВектоВКЭ-антиген»). Антиген вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) выбран нами в связи с тем, что он относится, так же как и вирус ЛЗН, к экологической группе арбовирусов, семейству Flavivi-ridae, роду Flavivirus. Большая часть флавивирусов передается комарами, некоторые - клещами, ряд вирусов обладает очень высокой экологической пластичностью, в частности, способностью к трансмиссивной передаче и комарами, и клещами (например, вирус Западного Нила) (Львов Д.К., Дерябин П.Г., 2008).

Время постановки ИФА с применением МИС составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18-ти часовую сенсибилизацию микропланшетов — 20 - 21 час. При этом показания оптической плотности (ОП) пробы превышали величину ОП отрицательного контроля в 2,0 - 2,2 раза, что свидетельствовало о более высокой чувствительности ИФА с применением МИС. При раститровке нативных антигенов показано, что чувствительность традиционного ИФА составила 15 мкг/мл (по белку), а чувствительность ИФА с МИС - 100 - 50 нг/мл. С антигеном ВКЭ окрашивание раствора не наблюдалось, что свидетельствовало об отсутствии перекрестных реакций и подтверждало специфичность имуноферментного конъюгата и МИС.

Таким образом, при использовании МИС в ИФА для проведения реакции не требовались полистироловые планшеты, сокращалось время сенсибилизации твердой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твердой фазы ( с 20 дней до 2 лет и более); время проведения анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА.

При исследовании в модифицированном ИФА с применением иммуномагнитной сепарации 3573 имаго комаров (230 пулов), собранных в 13 районах Ставропольского края и окрестностях г. Ставрополя в июне - июле 2005 - 2008 гг., получены следующие результаты: использование селективного концентрирования на МИС дало возможность обнаружить антиген вируса ЛЗН в 27 пробах, в то время как в ИФА без применения МИС выявлено девять антигенсодержащих проб. Таким образом, нами подтверждено наличие антигена ВЛЗН в девяти суспензиях комаров и дополнительно выявлено 18 положительных проб комаров Ае. cantans, отловленных в Георгиевском, Гра-чевском, Изобильненском, Курском, Нефтекумском, Петровском, Шпаков-ском районах, г. Ставрополе, причем, в Георгиевском, Курском и Петровском районах положительных находок в традиционном ИФА ранее не было. Применение МИС позволило повысить выявляемость инфекционного агента в 3 раза.

При исследовании 4853 особей иксодовых клещей (454 пула) модифицированным ИФА удалось обнаружить антиген ВЛЗН в 32 пробах, а традиционным ИФА - лишь в девяти пулах. Таким образом, дополнительно выявлены 23 положительных пробы клещей Н. marginatum, из них из Благодар-ненского, Грачевского, Ипатовского и Алекасандровского районов положительных проб традиционная постановка ИФА не обнаруживала. Тем самым выявляемость В ЛЗН увеличена в 3,5 раза.

Эффективность применения метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для диагностики, изучения молекулярной эпидемиологии лихорадки Западного Нила и анализа структуры генома возбудителя ЛЗН подтверждена целым рядом работ (Гаранина С.Б., Щербакова A.M., Куличенко А.Н. и соавт., 2001; Журавлев В.И., 2002; Львов Д.К., Писарев В.Б., Петров В.А. и соавт., 2004; Петров В.А., 2004 и др.).

При использовании в качестве проб клинического материала особых трудностей в подготовке образцов для постановки ПЦР не возникает. Более сложной задачей представляется подготовка проб из объектов внешней среды, в частности, клещей и комаров, так как в этом случае необходимо использовать особые методические приемы, позволяющие избавиться от кон-таминирующих примесей и максимально сконцентрировать искомую РНК. Для этого мы объединили два метода: высокоэффективное избирательное концентрирование инфекционного агента на магноиммуносорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции, проведя многочисленные опиты по адаптации этих методов друг к другу. Результаты наших исследований свидетельствавали о том, что применение МИС при проведении ПЦР позволяет на этапе подготовки пробы путем многократных промываний сорбента с фиксированным на нем вирусом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повысило выявляемость РНК вируса ЛЗН в 1,8-2 раза. РНК вируса ЛЗН сочеганным методом выявлена в 29 пробах комаров, из них 14 проб подтверждено и дополнительно выявлено 15, при этом в Изобильненском, Курском и Петровском районах - по четыре пробы, в Нефтекумском - две и Георгиевском - одна положительная проба.

При исследовании иксодовых клещей РНК вируса ЛЗН выявлена в 27 пробах, из них подтверждено 13 полученных ранее положительных результатов и дополнительно выявлено еще 14 положительных проб: Александровском, Грачевском, Ипатовском, Курском, Новоселецком, Нефтекумском - по две пробы, а Благодарненском и Степновском - по одной пробе.

При сопоставлении результатов, полученных в ИФА и ОТ-ПЦР, и результатов сочетанных методов экспресс-анализов МИС + ИФА и МИС +ПЦР установлено закономерное повышение чувствительности традиционных методов за счет селективного концентрирования вируса на МИС.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о распространении и циркуляции вируса ЛЗН в 17 из 23 обследованных административных районов Ставропольского края и г. Ставрополе (рисунок 17).

Условные обозначения оАслеаоммныс районы с жшжпечышша л яыгдгоий ми .lilt j районы не обследованы районы оЛслелонаны

Дсакеная гачек «цжо

3 - littilHVdttfMtlil t- - Wiimuiiiawv.-aHapniu.ujitit: - lilimpiwuiNiit |Ц)КМ1МЛНИН|> Vp .1 u|)i i.ui)i 14 • lUiiiiKimt-uilli 111 - |lj)n>HII№Hll( 1С U fiif«»4H||lueiW.441

-fewifi ЧУМШ»! 114'- lit.Mt-Veoi^wuti

I ; - \\Jiilpnimittui4lH

Г - Ml*«4ri« AHlMtii' IA-- fcvflBllUiUMIlil

- l1b|tl«jN»nu.Vhl№ 3*1- ШН^ЬИКНЧШЖП'. -'II - CluiplUHUHlWIHl 22-«C,<MWBWi{|i

38-С 'laAiHUHUMlftl

- iljlHjlVipiniHl ' kjipiiituKim:

Рис. 17. Результаты обследования районов Ставропольского края на ЛЗН

Обнаружение специфических IgG к вирусу ЛЗН у лихорадящих больных и здоровых людей (доноров) в целом ряде районов Ставропольского края сигнализирует об инфицированности населения и реальной угрозе возникновения как единичных случаев заболевания, так и вспышек ЛЗН. При этом иксодовые клещи Н. marginatum и комары рода Aedes могут служить индикаторами потенциального природного очага ЛЗН в Ставропольском крае. Обнаружение вируса ЛЗН в организме синантропных врановых (грачи) позволяет отнести их к числу активных сочленов природного очага ЛЗН и подтверждает индикационное значение массовых видов птиц.