Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Лечебно-профилактические и диагностические препараты крови человека на основе безотходной технологии

г. 0 9 ?

и ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МВДИЦИНСКИХ НАУК ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ НОТНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ШШШ ВЛАДИМИР АВДРИАНОВИЧ

ЛЕЧЕБНО-ПРОФ1ШАКГИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА ОСНОВЕ БЕЗОТХОДНОЙ ТЕХНОЛОГИИ

14.00.29 - гематология и переливание крови

Диссертация в форме научного доклада-

на соисканне ученой степзни доктора биологических наук Москва - 1992

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и-микробиологии им. Г.К.Габричевского Российского комитета по с а нэ пкднадз ору.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор В.А.Макаров доктор медицинских наук профессор В.Б.Хватов доктор биологических наук М.А.Розенфельд

Ведущая организация - ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ Минздрава РФ Защита состоится 1992 г. в час .

1992 г. в

на заседании специализированного совета Д 074.08.02 в Гематологическом научном центре РАМН по адресу: 125167, Москва, Новозыковский проезд, д. 4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН.

Разослан

Ученый секретарь специализированного совета Д 074.08.02 кандидат биологических наук старший научный сотрудник

В.Д.Реук

•- .«г -, •:</ Л т

; . 3 I '• — ' " ' * — X —

ЭБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

лемн. Возрастающая потребность практического

здравоохранения в расширении арсенала средств, необходимых для профи-гактинп и лечения инфекционных заболеваний, предъявляет требования к разработке новых биологических препаратов из плазмы крови человека и штимизации процессов их получения с увеличением выхода конечного . ¡родукта.

Белки плазмы крови чнловека играют ведущую роль во многих регулирующих и метаболических системах организма. Они участвуют в транспортировке гормонов, вита-линов, холестерина, желчных пигментов, фос-юлипидов, жирных кислот и многих других жизненно необходимых небелявых молекул. Существует также специфическая группа металлсвязываю-дх протеинов, таких как трансферт и церулоплазмлв. Целый ряд плаз-енных белков связан с иммунным ответом организма - это иммуноглобу-ины и компоненты комплемента. Свертывающая и протзвосвертываищая истемы крови представлены большой совокупностью беяков, которые.. еобходимыг для поддержания- гемостаза. В последнее кремя интенсивно сследуются белковые ингибиторы протеиназ, играющие ведущую роль при атологических состояниях, связанных с воспалением, что предполагает х использование в качестве'лечебных препаратов.

При фракционировании плазмы крови человека классическим методом эна - спиртовым осади внаем на холоду удается получать часть указай-ях выше белков в более или менее очищенном виде. Это, в основном, ■эдуноглобулшш и альбумин, концентраты которых при ряде заболеваний ^сазалисБ более аффективными лечебными препаратами направленного дей-гвия, чем нативная плазма. Изначально метод Кона бш разработан для шучения зтих двух белков и поэтому, вполне естественно, что за про-;дшие почти полвека он неоднократно подвергался модафикадням с целью гучиенйя как качества получаемых препаратов, так и увеличения числа ¡деляемнх из плазмы белков.

В нашей стране этот метод после небольших модификации (Е.В.Хол-53, 1947 г., Н.А.Пономарева и соавторы, 1951 г.) до настоящего вре-!нн ис-лользуется без изменении. Такая технология позволяет получить 'лъко 25-40$ антитальной активности исходного сырья, причем, как >азнло, обусловленной антителами I? класса, с потерей большей части ;М и 1еА -антител. В отечественных препаратах гаммаэгобулина соотно-■кяе 'составляет 35,8:1,8:2,4 (Н.З.Ходввв и др. 1972 г.)

кой состав препарата не обеспечивает полного использования иммуно-гического потенциала крови звиду слишком малого содержания и IgA.

Комитет экспертов БОЗ еще в 1968 году рекомендовал разработку методов получения я исследования комплексных иммуноглобулиновых препаратов, имеющих. в своем составе наряду с з^й-антителами и

Большой интерес представляет также получение иммуноглобулинов .направленного деаствия. Удельный вес.специфических иммуноглобулинов в общем объеме напускаемых в нашей стране препаратов очень невелик, а номенклатура исчерпывается 5-6 наименованиями - противогриппозный, ан тистолбнячный, аигистафилококховый и т.д. Объем выпуска некоторых из них крайне мал, например, противостолбнячный - несколько десятков тысяч доз при потребности в миллионах, иные ае, широко производимые на Западе иммуноглобулины, скажем, к оппортунистическим вирусиш инфекциям (антигерпетзпеский, цитомегаловирусный и т.д.), - не выпускаются вовсе.

Основными причинами, сдерживающими расширение объема и номенклатуры производства специфических иммуноглобулинов, являются как недостаточность сырьевой базы, обусловленная ограниченностью донорского ко тингента и отсутствием или несовершенством соответствующих вакцин и схем иммунизации, так и несовершенство технологии.

Особое значение среди белков, попадающих в балластные фракции, имеет груша так называемых "белков острой фазы" (БОФ), к которой относятся свыше 20 белковых компонентов плазмы крови человека, обладающих различными физико-химическими и биологическими свойствами, но име ющих одну общую черту - все эти белки участвуют в реализации острофаз ного ответа.

Данная группа белков вызывает большой интерес у клиницистов не только в качестве диагностических препаратов, но и лечебных средств.

Таким образом, учитывая острую потребность в новых" отечественных диагностических е лечебно-профилактических препаратах, с одной стороны, а с друтой, шеющиеся предпосылки к более полному использованию такого ценного сарья как плазма крови, представляется актуальной разработка универсальной схемы безотходной технологии производства препа ратов крови, позволяющая совместить решение этих двух проблем.

Педъ работы. Целью настоящей работы является теоретическое и экспериментально-производственное обоснование получения ряда диагностических и лечебных препаратов крови человека путем разработки безотходной технологи на основе метода Кона.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие за

дачи:

- провести системный анализ балластных белковых фракций, получаемых при разделении плазмы крови человека методом Кона и определить критерии их пригодности для получения диагностических и. лечебных препаратов;

- определить технологические возможности использования фракции А по Кону для получения диагностических и лечебных препаратов С С1ч у М-инг.)

- разработать технологию получения препаратов иамуноглобуллпов направленного действия как на основе так и обогащенных 1£м и

из балластного осадка Б по Кону и обосновать создание новых лекарственных форм на их основе, провести клиническую апробацию препаратов, определить лечебно-профилактические дозы, внедрить их в медицинскую практику;

- усовершенствовать способы выделения биологически активных ингибиторов протеиназ и белков с амгдуношодупируицей активностью из бал-дастных фракций 1У-1, 17-17 и супернатанта У и создать на их основе диагностические препараты (й^АТ, АТШ, Ш, С1ин, ОР, СЗоО?

- разработать схему технологии переработки гшазмн'кровз человека з целью создания безотходно! технологии производства препаратов крови

Павшая новизна и практическая значимость -работа. На основании зястейЕОГо анализа свойств балластнюс батковых фракций, получаемых три разделении плазмы крови человека зтаноловнм шэтодсм Кона, обосно-заяо положение об их использовании как специфического сырья для вплетения биологически активных зещестз, играгитх зазнуэ роль в всддертл-ши гомесстаза; иммуноглобулинов, ингибиторсз протезназ, белков-имму-юмодулиторов, белков спстьзш комплемента.

Впервые создан унифицированный способ разделении балластных осад-сов, получаемых при фракционирования плазмы крови человека, позволяю-в едином технологическом процессе получить цели! ряд биологически жтизных белков: С1Ч,С1ин., ИП, ГП, СЗа ОР, АШ.

Испояьзоваяие указанных вше иммунохимичесних чистых белков в ка-гестве антигенов позволите впервые в СССР получить соответствующие юноопецифические антнсызоротки и на их основе создать оригинальные [вагностяческие гест-системы для определения состояния гомеостаза ор-■анизма человека»

На большом материале определено клиническое значение преемственно исследования уровня БОФ на этапах обследования, лечения и дзнаш-:еского наблюдения больных с различными патологическими состояниями,

позволявдее до лечения судить о тягести процесса к прогнозе течения заболевания, а при исследовании в динамике оценить эффективность лечения и выявить рецздив болезни.

Для более полного извлечения иммуноглобулинов из балластных осадков, а-также ш использовании сырья с различными-физико-химическими свойствами разработаны научно-экспериментальные основы технологии получения препаратов гаммаглобулина направленного действия с использованием метода аффинной громатограйзи на примере противостолбнячного иммуноглобулина.

В целях профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, в основном вызываемых грамотрвдательной флорой, разработан способ получения препарата, обогащенного 1ёЫ и экспериментально-теоретически обосновано создание новых лекарственных форд и способов их. введения - пероралъно, ректатьно, вагинально.'

Практическая ценность работы и внедрение результатов исследования.

1. Решена вазная народнохозяйственная задача - создан новый ■иммунобиологический препарат - комплексный иммуноглобулин для перо-раяьного применения (НТД утверндена КВС СССР 15 октября 19Э1 г., патент СССР №4850360. Выпуск препарата освоен с октября 1991 г. предприятием ШШЭ'Л им. Г.Н.Габричевского,)

2. Разработана новая лекарственная форма использования комплексного ишуноглобулинового препарата для ректального и интравагжнально-го введения (НТД находится в КВС на утвергдении, патент СССР Й1587701)

3. Создана технология получения препаратов иммуноглобулинов направленного действии с использованием аффинной хроматографии на примере антистолбнячного иммуноглобулина (авторское свидетельство СССР й 1497809).

4. Впервые создан набор отечественных моноспецифических антк-сывороток для определения БОФ (НТД на сыворотку диагностическую против орозомуковда человека утверздена Комитетом по аллергенам и имму-нодиагностическим препаратам МЗ СССР 22 декабря 1986'г.; НТД на сыворотку диагностическую против гаптоглобина человека утверждена Комитетом МИШ МЗ СССР 1Э января 1989 г. Авторское свидетельство & 1381773),

5. Впервые разработаны способы диагностики, прогноза и оценки эффективности леченая при ряде патологических состояний с помощью тест-системы для определения БОФ (авторское свидетельство й 1476386, авторское свидетельство № 1504846). Методические рекомендации •'-"Комплексная уточняющая диагностика, выбор объема оперативного вмешательства и комбинированного лечения при резектабельном раке желудка".

6. Разработай способ получения моноспецифических антисывороток

ж с-ц,С1ин.' и СЗа. Инструкция по применению и контроля утвервдена на Ученом Совете МНйИЭМ им. Г.Н.Габричевского, подана заявка на авторское свидетельство, приоритетная справка й 5043741, 5045570.

7. Создан препарат для лечения и профилактики ротавлрусной дирекции у детей - антзротазирусный иммуноглобулин для перорального при-ленения (НЩ находится на утверждении в КВС, проводятся расширенные стинпческие испытания (авторское свидетельство й 4853360.

8. Разработаны подходы к созданию антигерпетического шмуногло-5улина и оценке его эффективности (НТД на утверждении в КБС, подана !аявка на авторское свидетельство, приоритетная справка Ге 5045574.

9. Разработан способ получения орозомухоида. Показано, что данный >елок обладает иммуномодулирущей активностью (авторское свкдетельст-зо & 166203Э).

10. Выпушены методические рекомендации "Определейие агрегатов и зрагшэнтов в препаратах иммуноглобулинов методом гедьфилътрации", :987 г.

Ооновнн'а положения. выносимые на защиту.

1. Проведенные исследования позволяют создать унифицированный пособ разделения балластных осадков, образующихся при фракционирована плазмы крови человека методом Кока и дают возмоашсть получить рад кагностшескш: и лечебных препаратов в едином технологическом про-

2. Комплексный! гмглуноглобулжЕовый препарат для перорального ьве-ения в виде медицинских свечей (ректалънш; и вагинальных), содер-ащий 1яА полученный по разработанной наш: технологии из алластного осадка Б, является эффективным средством профилактики и ечэния ОКИ у детей, особенно у недоношенных и ослабленных, находятся на искусственном вскармливании, препарат ьтагет также быть ис-эльзован для лечения дисбактериозов, у больных с имыунодешидатами, ззваннвма применением хишотералевтических средств и воспалительных аболевзннй-данской половой сферы.

3. Подтвержденная" наш закономерность "распределения антител под-тассов З^й человека при фракционировании методом Кона дает возмоя-)счъ разработать технологии получения 3-х задов специфических имму-)глобулпнов - антистолбнячного', антиротавнрусшго, гнтигерпетическо-

4. Универсальный способ выделения ингибиторов протеиназ позволяет получить их биологически активными с высокой степенью иммунохи-мзческой чистоты, что дает возможность создать на их основе тест-системы для определения некоторых БОФ, изменение концентрации которых в сыворотке крови человека вазно для диагностики и имеет прогностическое значение при ряде патологических состояний.

5. Полученный из балластных осадков по разработанной наш технологии орозомукощ на моделях "ин виво" и "ш витро" обладает иммуномс дулируицей активнеетью.

Апробация работы. Материалы диссертации неоднократно докладывались на пленумах проблемной комиссии "Стандартизация медицинских биологических преператов для профилактики и диагностики инфекционных болезней человека" (г.Горький, 1986, 1988, 1990 г.г.). Основные положения диссертации изложены в 21 выступлении на симпозиумах, конференциях и съездах, в том числе на 10 международных: X Европейском конгрессе ревматологов (Москва, 1983), 17 Конференции аллергологов и иммунологов Средней Азии и Казахстана (Душанбе, 1983)", конференции по иммунологии и аллергологии (Вильнюс, 1986), Ш Всероссийском съезде онкологов (Ростов-на-Дону, 1986), УП Международном симпозиуме по ге-мосорбции (Киев, 1986), XI Всесоюзном съезде рентгенологов ж радиологов (Таллин, 1984), Всесоюзной конференции по иммунокоррекцш (Ташкент, 1984), симпозиуме "Иммунология и ее использование в медицине" (Будапешт, 1985), Всесоюзном симпозиуме "Клеточные основы иммунитета. Гибрвдомы" (Москва, 1985), У Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (Махачкала,

1986), Международном симпозиуме "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1986), Ш Мездународной конференции по столбняку (Ленинград,

1987), Всесоюзно! конференции "Актуальные вопросы биотехнологии" (Ленинград, 1987), Республиканской конференции "Актуальные вопросы биотехнологии иммунобиологических и гемотрансфузионных препаратов" (Новосибирск, 1988), 7 Европейском симпозиуме по химии углеводов (Прага, 1989), УП Дунайском симпозиуме по хроматографии (Лейпциг, 1989), Общественной конференции "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований" (Москва, 1989), Международной конференции "Лазеры и медицина" (Москва, 1989) , международной конференции ."Медицинская биотехнология, иммунизация, СПИД" (Ленинград, 1991), Международном симпозиуме по гликоконъигатаы (Торонто, 1991), У1 Всесоюзном съезде микробиологов, эпидемиологов и

паразитологов" (Низкий Новгород, 1991), Всесоюзной конференции "¿Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" (Москва, 1991).

Диссертационная работа апробирована на заседании Ученого Совета. шНИИЗМ им. Г.Н.Габричевского.

Публикации. До теме диссертации опубликовано 85 работ, в том числе 2 патента и 10 авторских свидетельств, подано 5 заявок на авторское свидетельство - получены приоритетные справки.

При исследовании биологических и иммунохимическзх свойств полученных препаратов крови и их клинической апробации в работе принимали участие коллеги и сотрудники: М.А.Розина (изучение свойств С1ин.), И.В.Борисова,, H.H.Куликова (участие в получении КИП), Л.И.Новикова и А.Г.Лютов (иммукохимический анализ отдельных БОФ), H.H.Матвеевская (иммунохимическая характеристика СЗ, Cod.), В.В.Поспелова и Г.И.Хашша (разработка новых лекарственных форм КИП), А.М.Пономарева (иммунофер-мсЕТНЫЙ анализ), Л.Ф.Феклисова, ß .Ф.Учайкии, Л.Л.Новгкшенов, Л.У7.Тими-на, И.Л.Халиф (клинические испытания КИП).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящее время известно более чем 200 белков плазмы крови человека. Около 70 из них изучены достаточно хорошо, однако, только 20 используется в профилактических и терапевтических целях. Последние цостияения белковой химии, особенно, появление широкомасштабной ли-гандной хроматографии дает возможность резко увеличить количество бея-•сов плазмы, -используемых в практической медицине. Однако, до сих лор зоновой фракционирования плазмы крови человека является метод Кона. 3 нашей стране практически с середины 50-х годов данный метод оста-зался без изменения, в то время, как в других странах он претерпел довольно серьезные модификации, которые дали возмояность получить еще [0-15 сывороточных белков (рис. I), используемых в практическом ¡дравоохранении.

Технологические возможности использования фракции Ая для получе-шя cía и Инн. Изучение иммунохимических и биологических свойств по_-гученннх препаратов- ciq является одним из ключевых белков многокомпонентной системы комплемента плазмы крови человека. Взаимодействие 4q с Ус-фрагменташ igG n.igjt, входящих в состав тмушшх комплексов ИК), есть необходимый этап активации комплемента по классическому пу-и. Сшзсенпе уровня ciq является характерным диагностическим и прог-остическим признаком тяжести процесса при различных заболеваниях, опроводцающихся патологическим накоплениемИК.

Плазма ш сыворотка

Осадок Ад (фр I) J-L -макроглобулш, остатки фибриногена,// -А-глобулина, антигемофильный глобулин, J/H-глобулин, Clfy, С1ин

Центрифугат Ag

Центрифугат А (фр 1У+У)

альбумин, часть /-и ^-глобулинов

Осадок А (фр П+Ш)

/ -глобулины, часть/-глобулинов, часть / -глобулинов, протромбин, плазмино-ген, липоидные вещества

Осадок I (фр.1У-1) (.фр. 1У-1) ¿i -антитрипсин,

галтоглобин, церу-лоплазмин, транс-феррин, гемопексин, Jn- липопротеин, крист масфактоо, Йин, ATI

Центрифугат П Осадок П (фр 1У-4 (фр. 1У-4) ¿f -антитрипсин, галтоглобин, тироксин, связывающий гл., транс-феррин, холинэс-тераза, гемопексин, гипертензи-ноген

Осадок Ш (фр У)

альбумин

Центр ишу г;

•ат Ш

(ФР орозамукоид

Центрифугат

Осадок Б

очищенный у—глобулин

Осадок Б (фр Ш)

небольшая часть, ¡¿- н / -глобулинов, фибри-нолизин, основная часть 1Ц.А иЦМ

Рис. I. Белковый состав фракции, получающихся при производстве альбумина и ¿--глобулина по методу Кона.

3 настоящее время известен большой набор методов, позволяющих определять уровень цпркулирущпх Ж в различных биологических жидкостях, но предпочтение отдается иммуноферлентному п радиоиммунному методам на основе иммобилизованного ciq, которые позволяют проводить не только количественную, но и качественную оценки выделяемых ПК. Выделение биологически активного и иммунохимически чистого dq для этих целей имеет первостепенное значение. Однако, при этом большинство авторов предлагают использовать в качестве исходного сырья донорскую плазму, которая представляет собой дорогостоящий и дефицитный материал.

Выделение ciq проводили из осадок Ад, получаемого при спиртовом фракционировании плазмы крови человека по методу Кона. Способ состоит аз 3-х основных этапов: осаздение ciq полиэтилекгликолем 60D0, лиганд-яая хроматография на igG-МПС 2000 и получение высокоочищенного препарата Cfy аффинноотрицательной хроматографией на колонках с белок \=сефарозой и Анти=1в!.т=сейарозоЁ. В связи с наличием в препарате пос-ie лигандной хроматографии примесей igG и Igfj наиболее вагным является предложенный нами третий этап - двойная аффинноотрицательная хроматография.

Ил!муно2юлическгй анализ, а таюге электрофорез в ДААГ подтвердили >тсутствие примесей в полученном препарате ciq. Гемолитическая актив-юсть полученного белка соответствовала активности ciq, выделенного и сбс:х6й плазмы.

Для выявления циркулшрущих иммунных комплексов (ЦИК) в клини-сеской практике наиболее широко применяются рекомендованные ВОЗ твердс )азные GIq-методы, в связи с чем мы и сосредоточили свое внимание на издании оригинального метода, по основным параметрам приближающегося : последншл.

Для стандартизации метода определения ЦИК, характеристики чувст-ительности и специфичности применяли агрегированный гаммаглобулин АГГ). В качестве ciq использовали полученный наш препарат из осада Ag. На рисунке 2 представлена характеристика связывания AIT и наивного гаыызглобуиша с иммобилизованным на' твердой фазе ciq. Взашло-ействие AIT с ciq носит дозозависимый характер. Цри использовании место Pab-антител белка А, меченого пероксидазой (рис. 3), получены яиэкзе результаты. При сравнении калибровочных кривых для viq-'HeTcfiti нефелометрического ПЗГ-метода установлено, что последний обладает

более низкой чувствительностью и позволяет выявлять AIT только в концентрации выше 25 шсг/мл, тогда как предлояенный нами метод -от 2 мкг/мл. .

' «о-

¡юеяяхзттх

Рис. 2. Зависимое от дозы связывание AIT (I) и наганного гаммаглобу-лина (2) с ciq-компонентом комплемента по данным ciq ИМ. По оси абсцисс здесь и на рис. 2т4 - концентрация гаммаглобу-лина (в шсг/мл); по оси ординат здесь и на рис. 2-4 - оптическая плотность при длине волны 492 нм. : кр

Рис. 3. Выявление связывания AIT с ciq в ciq-ИФМ с помощью F(ab' )2 антител s ig человека (I) и белка А (2), меченных пероксида-зой. /,

I 2 J *

Рис. 4. Концентрация ЦИК в сыворотках доноров (I), больных СКВ (2), ДКМД (3) и неспецифическим аортоартериитом (4). По оси абсцисс - группы больных; по оси ординат - концентрация ЦИК (в мкг AIT экв/мл). Черные круяки - концентрация ПИК у отдельных больных.

Как видно из рис. 4 частота обнаружения ЦИК при системной крас-:ой волчанке равнялась 50$, при дилатационной миокардиопатии - ЗОЯ, :ри неспецифическом аортоатТгериите - 53%. представленный анализ Полуниных данных свидетельствует о том, что при системной красной вол-анке частота'обнаружения и уровень ЦИК, в целом, коррелирует с ак-ивностью патологического' процесса, а при днлатационно2 кардиомиопа-ии ЦИК обнаруживались преимущественно у больных с клинико-лайоратор-:ыми и инструментальными признаками текущего миокардита.

В заключение необходимо подчеркнуть, что внедрвши с-ц ИФМ опре-еления ЦИК в клиническую практику позволит улучшить диагностику и ценку особенностей развития' иммунокомплексной патологии при различ-ых заболеваниях внутренний органов.

Как указывалось выше, система комплемента является одним из важ-ейших эффекторных звеньев гуморального иммунного ответа в защите ор-анизма от инфекционных агентов. Клинические исследования последних есятилетий указывают на патогенетическое значение нарушений в сис-еме комплемента для целого ряда заболеваний; ангионевротическик тек Квинке, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, реку-ентные стафилококковые инфекции и т.д. Этиотропная специфическая аместительная терапия" компонентов системы комплемента цри таких па-ологических состояниях дает хорошие результаты. Точное определение ровня поражения системы комплемента и его регуляторных звеньев, а так-е коррекция выявленных нарушений, является таким образом необходима условием для проведения адекватной терапии. В зарубе:шой лктера-уре имеются отдельные сообщения о применении заместительной терапии репаратами очищенного С1ин при ангионевротическом отеке Квинке. Такие пособы лечения в отечественной практике не йрименягохся вследствие гсутствия препарата С1-инактиватора. Распространенная у нас замести-ельная терапия свежей плазмой- за рубежом практически .полностью заме-ена введением препарата С1ин во избегание передачи вируса гепатита (ЗДЦ.

Изложенное выше побудило- нас к разработке способа получения шунохимически чистого и биологически активного С1ин, а сформуяиро-анные ранее подходы к использованию "бросовых" фракций гашаглобу-шзвого производства облегчают экономическое решение поставленной адачи - выделение указанного белка из преципитата Ац.

Выделение и чистку С1ин проводили двумя способами: I) с привле-' энпем методов классической хроматографии (только для выделения из

плазш) и 2) с использованием лигандной хроматографии (плазма и осадок Ад).

Следующий этап работы заключался в создании на основе полученных - иымунохттески чистого йин и антисыворотки к нему - тест-системы для определения концентрации С1ин при перечисленных виде заболеваниях. Учитывая определенные сложности с аппаратурным оснащением кли нических лабораторий в нашей стране, мы остановили свой выбор на наиболее простой тест-системе, а именно, радиальной иммунодифтузии в геле по Манчиш, где в .качестве стандарта использовалась плазма крови человека, оттитрованная по содержанию С1ин. Ниге представлены результаты использовании предложенной нами тест-системы, которая была апробирована для лабораторной диагностики ангионевротического отека и состояния системы комплемента у больных сахарным диабетом I типа.

У пациентов, страдающих ангшневротическим отеком, выявлено значительное уменьшение концентрации С1ин с одновременным сниаением его биологической активности. У больных же сахарным диабетом отмечается высокая концентрация С1ин, сочетающаяся с поннаением 'биологической активности последнего. Эти данные позволяют подтвердить предположение о напряженности состояния системы комплемента у больных сахарным диабетом, очевидно, в связи с постоянной персистенцией иммунных комплексов. Кроме того, особенности нарушения метаболических процессов при сахарном диабете способствуют инактивации некоторых 2р0хЭ2наз, в том числе и С1ин, что существенно 223аяет на состояние системы комплемента, свергняя^ЦЗ! 2 КЗЛЛбкреин-кининовой систем и является одним из звеньев в патогенезе развития диабетических микроакгпопатиЁ.

Таким образом, разрабатывая.принципы безотходной технологии га-ммаглобулинового производства, нам удалось получить из балластного осадка Ад два препарата - с^ и С1ин, близкие по своим физико-химическим свойствам ж биологичвскоЁ активности к таковым, получаемым из плазмы крови человека. Выполнение этого фрагмента работы позволяет практически подо&ги к решении проблемы неходкого сырья и удешевить получение указанных препаратов, в которых остро нуждается практическое здравоохранение.

На "Способ определения нарушения иммунного статуса", разработанный с использованием с-^полученный по предложенной выше схеме, имеет ся авторское свидетельство (й 1237215). На полученную нами моноспецифическую антиенворотку к сц утверздена "Инструкция по изготовлению и контролю" (1585 г.). На "Способ получения СТинактиватора" подана

заявка на изобретение (приоритетная справка й 5043741, НТД на моноспецифическую антисыворотку к С1ин утверздена КВС от 8 пиля 1992г.

Технологические аспекты усовершенствования комплексного толмуноглобулинового препарата, получаемого из осадка Б. и опыт его клинического применения

Современные коммерческие препараты гаммаглобулина, полученные методом Кона, содержат, как подчеркивалось выше, в основном иммуноглобулины класса с. В связи с этим применение обычных препаратов га-шаглобулина недостаточно эффективно при ряде инфекции, особенно у яовороаденных и детей первых лет ллзни, кровь которых отличается низким содержанием иммуноглобулинов классов М и А.

В сеязи с этим з плане дальнейшей разработки методов безотходной технологии производства препаратов гаммаглобулина, бшш проведены исследования по получению комплексного шлмуноглобуяиноЕого препарата (КШ) из осадка Б и создании новых лекарственных форм па его основе -тдя орального применения и в виде медицинских свечей (ректальных и вагинальных) .

Ранее бшг предложен способ получения КИП для в/н введения, состоящей чз солевой экстракции осадка Б, обработки экстракта осадка Б геороформом и декстрансульфатом (с целью удаления лшпопротеидов) и юследувщим осаддением иммуноглобулинов полаэтиленглихолем в концек-?рацшг 5%. Однако, как показали наш исследования, данный способ по-гученля нуздался в существенной модификации как с целью повышения вы-:ода антител класса так и замены хлороформа и декстрансульфата. ! результате были предложены технологические схемы (Рис. 5).

По I схеме осаддение фракции иммуноглобулинов проводилось при к :онцептрацш1 ПЭГ равной 12? к общему объему. Увеличение содержания ЭГ дает возмоянЬсть изменить.соотношение шиуноглобэашнов трех клас-ов в конечном препарате в сторону увеличения 1ба и что в свою чередь вызывает повышение концентрации специфических противовирусных нтитал. При этом титр антител к энтеробактериям 1ди класса сохра-яется на прежнем высоком уровне.

При создании второй схема была, предпринята попытка заменить или менызить концентрацию реагентов, используемых для удаления липопро-еидов, в частности, хлороформа, который является гепатотоксическим дом и высокоагрессивннм реактивом для фракционной аппаратуры. Так зми был модифицирован метод удаления лзшопротеидов высокой и низкой

плотности из плазмы крови человека с помощью солей магния и низких концентрации декстрансульфата натрия. Основная задача заключалась в подборе оптимальных условий удаления лшопротеинов из осадка Б без соответствующих потерь качественного и количественного состава КИП.

Ванной особешостью третьей схемы получения КИП является замена хлороформа и декстрансульфата на стадии отделения липосротеидов - ка-приловой кислотой - отечественным легкодоступным и дешевым реагентом

Таким образом, как следует из вышеизложенного, несмотря на то, что в основу производственной документации по получению КИП заложена I схема, продолжается совершенствование технологии получения препарата как с целью улучшения его качественных и количественных характеристик, так и модификации методов его выделения, исключающих использование дорогостоящих импортных реагентов и агрессивных реактивов.

Дальнейшие исследования бшш направлены на отработку оптимальных путей введения полученного препарата и создание адекватных лекарственных форм.

Учитывая спектр антител КИП, с одной стороны, а-с другой, -зтиопатогенеткческий механизм инфекций, вызываемых энтеропатогенными бактериями, нами была сформулирована следующая научная концепция пе-рорального использования полученного препарата: ' .

1. Комплексный иммуноглобузшновый препарат должен с од ерзать антитела против инфекционных агентов, вызываниях острые (хронические) яелудочно-Еишечные заболевания, такие как энтеропатогенные и энтеро-токсггенные эшеригин, сальмонеллы, аигедлы, ротавирус и т.д.

2. Специфические антитела, содержащиеся в КИЕ, долены обладать протективной защитой, обеспечивающей нетрализацшо патогенетического механизма энтеропатогенных микроорганизмов; последнее достигается наличием в препарате антител одной специфичности, но различных классов -

з^, способствующих гемагглютинащи, нейтрализации, преципитации инфекционных агентов.

3. Антитела, содержащиеся в КИП, доланы проявлять свою активность как в ввде мономера, так и в виде р(аЬ^-фра1иента, образующегося вследствие частичной фрагментации иммуноглобулинов под действием про-теолитичесхих ферментов гелудочно-кишечного тракта.

С целью создания формы, удобной для пероралъного применения и повышения стабильности препарата - предотвращения фрагментации иммуноглобулинов - осуществлялась его лиофшгизация. В проведенных нами исследованиях использовался КИП в виде сухого порошка в ампулах по 300 мг и флаконах по 6 г.

СХЕМ I

СХЕМА 2

СХИМ 3

Осадок Б

Экстрагирование в O.I5M z/aCl

pli 5,5 I кг осадка Б

10 л 0,85$ р-ра хлорида натрия

Центрифугат

Хлороформ 10%, рН 5,5 Декстрансульфат 0,1$

Центрифугат

Полиэтиленгликоль м.в. 6000

Осадок

Прошвание дистиллированно!) водо!!, рН 5,2 Растворение в 0.I5M Mid

Цэнтрисбугат

Глюкоза 2%, рН 7,2

Оова тлящая и стерилизующая

фильтрация

Ш

r^-e^og

Lt-i

éï - it?

Осадок Б

Экстрагирование в О,I5M лк&

рН 5,5 I кг осадка Б

10 л 0,85/1 р-ра хлорида натрия

Нентрифугат

Хлорид магния 0,55М Декотрансульфат 0,3$ ■

Центрийугат

Полиэтиленгликоль m.d. 6000

Осадок

Прошвание дистиллированной водой, рН 5,2 Растворение в 0.I5M Л'&С1

Центрифугат

Глюкоза 2%, рН 7,2 Осветляющая и отерилиэухщоя фильтрация

Щ

19-6-- 12,1% liM- 12,0% Ajt ~ I5.3SC

Осадок D

Экстрагирование в 0,1М ¿'л-ацетатном буфере, рН 5,4 I кг осадка £

5 л 0, IM -ацетатного буфера

Центрифугат Каприловая кислота 2,5^

Центрифугат

Диафильтрация и ультрафильта-ция против 0,9%, Va.ci

ДиаФильтрат

Полиэтиленгликоль м.в. 6000 50/2

Осадок

Промыванне дистиллированной водой, рН 5,2 Растворение в 0, 9$ м-СС Мальтоза 10%, рН 7,2 Осветляющая и стерилизующая фильтрация

Ш && - 70|

OI I

¿А

В ходе лечения различных заболеваний инфекционной и неинфекпдон-ной природы, дисбиотнческих состояний пищеварительного тракта и венских гениталий возникает необходимость восстановления нормальной микрофлоры и стимуляции местного иммунитета непосредственно в зоне формирования патологического очага - на поверхности эпителия толстого кишечника, шейки матки, влагалища и др., что является валным звеном па_ тогенетической терапии. Наиболее оперативное решение этой задачи требует введение в организм готовых препаратов иммуноглобулинов. До настоящего времени лекарственной формы таких препаратов - адекватной для ректального и интравагинального введения - не существовало. Нами в соавторстве с В.В.Поспеловой разработан способ получения КИП в медицинских свечах, предусматривавший использование в качестве твердой основы специального варианта пищевого кондитерского игра, обеспечивающего необходимую точку плавления и высокую стабильность биологических свойств действующего начала препарата на всех технологических этапах и в процессе хранения.

При исследовании серологическими методами препарат характеризовался повышенными титрами антител против энтеробактерий (эшерихяй, сальмонелл, шигелл), менингококка и синегкойной палочки (таб. I).

Таблица I

Содержание антител в комплексном иммуноглобулиновом препарате (5% раствор)

Антигены

Титры антител КИП

Эшерихии (О-диагностшсум комплексный) 640-1280

Сальмонеллы (О-диагностикум комплексный) 2560

Шигеллы Зонне 1280-2560

Шигеллы Флекснера 640-1280

Псевдомонас 128-256

Менингококк группы А 32-128

Менингококк группы С 32-64

ЛИС менингококка 228-256

Представленные выше данные позволили предположить эффективность исследуемого препарата для профилактики и лечения инфекций, приведенных в таблице.

В последующем биологические свойства КИП были изучены в эксперименте на обезьянах.

Что касается клинической картины, то у всех хявстных с диаррей-ными заболеваниями, взятых в опыт, наблюдалось улучшение состояния, в то время как контрольные продолжали болеть. Помимо общебшлогичес-кого действия препарата, обусловленного всасыванием в кровь фрагментов иммуноглобулинов, обладающих имцуномодулкруищей актизностыэ, проявилось и его локальное воздействие з дисталышх отделах кишечника.

Опыт клинического применения комплексного иммунологического препарата т детей

Клиническую эффективность' КИП при пероральном в ректальном введении оценивали на базе 10 клинических детских отдалений. Под наблюдением находились дети первых трех лет лизни с диагностированной кп-шечной инфекцией. Преобладала среднетяаалая форма заболевания - 65,7^, этиологию ОКИ удалось расшифровать у 26,3^ больных (таблицы 2, 3).

При пероральном использовании пациенты получали препарат с первого дня пребывания в стационаре в дозе 300 мг I раз в сутки в течение 3-5 дней за 30 мин до еды; другие этиотропные средства не применялись.

Эффективность лечения оценивали с учетом динаазки основных симптомов кишечного заболевания на протяжении 5 дней. Эффект считался хорошим, если в течение 2-3 дней уменьшалась интоксикация, снижалась краткость стула и улучшалась его консистенция, исчезали патологические примеси, а к конпу лечения (5день) - стул окончательно нормализовался. Удовлетворительный эффект подразумевал частичное улучшение стула (сокращение кратности, исчезновение патологических примесей) без последующего применения иных фармакологических препаратов. КИП считали неэффективным, если не было отчетливой полонит альной динамики болезни и для нормализации стула требовалось назначение других средств. Контрольные группы были сопоставимы с опытной по характеристике и числу больных. Первую группу составили дети, получавшие обычный (стандартный) комплекс терапевтических средств, прз соответствующих нозологических формах; вторая контрольная группа получала плацебо в заде "сухого иммуноглобулина человека нормального". Тактика лечения больных избиралась методом рандомизации. Клиническая оценка эффективности КПП представлена з таблице 2.

Как видно из таблицы, эффективность препарата при пероральном применении составила 92,5%.

Таблица 2

Оценка эффективности пероралыюго использования КИП у детей с 013-1

аффект

Хороший

Удовлетворительный

Отсутствие эффекта

Общее число боль-

Патогенные возбудители

Условно-патогенные :Гастроч Гастро-

возбудители

. саль-: ши- : эшэ-:стафило~: про-: клэб-:? Тал!: мо- :, геллы :рихии: кокк , : тей :сиелла: ^ ~ ' ( =94):^лл^:( =ю)л «5);( =</);(=2);( =1);

¡энтерит

энтерО' колит ( - 19)

Энте- :Энтернт роколмт :( =3) ( =!!):•

66 (70,2^) 3 0 4 2 I I 25 Ш) 12 (63?» 7 ' (63,6Я) 3 (юо?;)

21 (22,3$) 3 2 I I I 3 (.%) 0 (315!) 4 (36,42) —

7 (7,5#) I - - I - 4 (12$) (685) - -

Таблица. 6 Оценка эффективности КИП в свечах у детей с ОКИ

•.Общее : Патогенные :число : возбудители Условно-патогенные возбудители Гастро-:Гастро-:Энтеро-:Энтерит ¡энтерит:энтеро-:колит : ( =3) :( =21):колит :( =2) : :( = 8) : : |*|1

Эффект ■больных;оельмо_:шигел-. ~.неллы :лы :стафило-: протей когас : ( - 3) ( =1) :

Хороший Удовлетворительный Отсутствие эффекта 30(69,6® ' 3 I 7(16,552) I 6 (13,5$) - I 3 12(57,155) 7(87,32) 1(50%) 2(66,6® 5(23,8$) 1(12,52) - 1(33,45Э 4(19,1$) - 1(5025) -

н со

Среди детей контрольных групп было значительно больше детей без гормализашш стула (табл. 4).

Таблица 4

Сравнительна^ оценка эффективности КИЕ, препаратов иммуноглобулина человека и антибактериальной терапии при ОКИ у детей

Препараты : Всего Обща* эффективность Отсутствие эффекта

абс. с /0 абс. %

на 94 87 92,5 7 7,4

ммуноглобулин человека :орлалъный 85 62 72,9 23 27,1

нтибактериальные средства 82 58 70,7 24 29,3

У 82 детей, получавших лечение по поводу ОКИ, проведено сравни-ельное изучение микрофлоры кишечника при терапии КИП, иммукоглобули-ом человека нормальным и препаратами нитрофуранового ряда. После урса лечения КИП биоценоз кишечника не нарушался в отличие от детей, олучавишх химиотерапевтический препарат. Аллергические реакции в ви-е транзиторной сыпи наблюдались у детей с измененным аллергическим оном и возникали с почти равной частотой у больных, получавших КИП 5,3/5) и в контрольной группе.

43 ребенка, страдающих ОКИ, получали лечение КИП в виде меди-янских свечей, используемых рэктально. Свечи, содерзащие 300 мг пре-зрата, назначались по I в течение.5 дней; другие эткотропные средст-а не. применялись. Оценка эффективности терапии производилась по сфор-улированным выше критериям и.представлена в таблице 3.

Результаты проведенных нами клинических испытаний КИП с высоким гаром антител к возбудителям ОКИ свидетельствуют, что использование анного препарата ведет к норлализации энтероколитического синдрома, з сопровождается нарушением биоценоза кишечника, не вызывает побоч-а эффектов. Таким образом, вышеизложенное позволяет рекомендовать шный препарат в качестве этиотродного и патогенетически обоснованно средства для лечения диаррейных заболеваний.

Опыт клинического применения комплексного иммунологического препарата у проктологических больных

Дальнейшее клиническое испытание КИП проводилось на базе терапевтической клиники НИИ проктологии МЗ РСФСР. Под контролем находились пациенты, страдающие неспецифкческим язвенным колитом и болезнью Крона, получавшие лечение перорально и в-свечах. Курс лечения составлял 7-10 дней, при этом дневная доза составляла 3,0 г КИП перорально или 2-3 свечи.

Эффективность лечения оценивали по следующим параметрам: клинически, эндоскопически, цитологически и микробиологически.

Согласно полученным данным клинический эффект имел место у 72% больных, эндоскопический - в &&%, цитологический - в 98% и микробиологический - у 90% больных. Изучение микрофлоры кишечника в контрольной груше мь 9 патента®, получавших стандартное лечение, показало, что тенденция к нормализации стула наступила только у I больного, микробиологические показатели улучшились у 4 пациентов, в остальных случаях динамики не отмечено. Эффект, полученный при Лечении КИП, по-видимому, обусловлен основным механизмом действия препаратов иммуноглобулинов на нормализацию дисбиотических и регуляцию регенераторных процессов слизистой оболочки толстой кишки. Это подтверждается и выраженной цитологической эффективностью при введении препарата в виде свечей. Так при неспецкфическом язвенном колите почти у Есех больных в той или иной степени был выражен эффект от проведенного лечения по сравнению с его отсутствием при болезни Крона. Последнее обстоятельство связано, по-видимому, с распространением процесса на более глубокие слои стенки кишечника. Таким образом, полученные результаты свцдетельстуют, что наиболее эффективно применение КИП в ■ случаях активного воспалительного процесса с внр&^екной реактивно-про-лиферативной клеточной реакцией в слизистой оболочке. В результате лечения у большинства таких больных (80$) значительно снизилось общее число клетонных элементов воспаления, изменялся также качественный состав воспалительного инфильтрата, уменьшались реактивные проявления со стороны эпителиального компонента слизистой оболочки.

Опыт клинического применения комплексного шмуноглобулинового препарата в свечах при воспалительных заболеваниях аенской половой сферы

В настоящее время для терапии специфических п неспецифических

процессов гениталий применяют, в основном, химиотерапевтические препараты, обладающие супрессорной активностью в отношении иммунной системы, и антибиотики широкого спектра действия, вызывающие глубокие нарушения состава сопутствующей облигатнои микрофлоры, что ведет к угнетению ее физиологических функций, в том числе снижение уровня местного иммунитета. Длительная и штенсивная антзбиотикотерапия у ряда больных приводит к развитию дисбактериоза, кандцдоза, аллергических реакций. В связи с этим представляется перспективной возможность включения в комплексную терапию иммуноглобулшовых препаратов, содержащих готовые антитела, в частности, к стафилококку, эшершаш to¿¿ и другим микроорганизмам. до настоящего времени в целях иммунокорреги-рующей терапии использовали препараты иммуноглобулинов для внутримышечного или внутривенного введения. Однако, специфика воспалительных заболеваний ленской половой сферы, а такие анатомические и физиологические особенности явились предпосылкой для разработки новой лекарственной формы и эффективного пути введения - вагикальшх суппозиториев, содержащих КИП.

Клинические испытания препарата проводились на базе гинекологической клиники НййСП ям. Н.В.Склифосовского. Под контролем находились 80 пациентов: I группа - 50 больных с диагнозом миома матки и эндо-метриоз, осложненные кровотечением, 2-30 женщин, имеющих гнойные тубовариальные образования. Все больные получали препарат в течение 5 дней, при дневной дозе 200 мг КИП - I свеча.

Эффективность лечения оценивали клинически и бактериологически. Согласно полученным данным, клинический эффект при включении КИП в схему комплексного лечения в целях профилактики после-операционных гнойных осложнений имел место в 93,8?» случаев, лишь у одной из 16 пациенток развились послеоперационные осложнения, что составило 6,2% по сравнению с 35% у больных,- не получавших данный препарат. У 4 яен-щин, где КИП был использован с лечебной целью в послеоперационном периоде в связи с возникшими осложнениями, выздоровление ускорилось и пребывание в стационаре оказалось на 4 дня меякзе, чем у таковых без гммунокоррегирующей терапии. Из 20 больных 2-й группы, получавших лечение с целью профилактики послеоперационных гнойных осложнений, зф-рект тлел место в 95/5 случаев, у одной пациентки эффект отсутствовал -'->%, против 40 - у остальных больных этой группы. Отсутствие эффекта зарегистрировано у пациентки с бактериологическим диагнозом гонорея, сто, в частности, может объясняться отсутствием антител к гонококку ? КИП. В остальных случаях выделены: стафилококк - I9jS, энтеробакте-

ржи и кишечная салочка — 26$, у остальных - флора не идентифицирована.

Таким образом, полученные результаты, несмотря на небольшое число наблюдений, позволяют предположить, что, хотя механизм воздействия КИЛ складывается из иммуностимулирующего и антибактериального, наибольшая эффективность при использовании препарата достигается в случае его этиотропного применения, то есть при наличии высокого титра антител, комплементарных выявленным возбудителям (табл. I).

Обобщая опыт клинического применения КИП, следует подчеркнуть егс эффективность при использовании как у детей, так и у взрослых пациентов, при острой и хронической патологии. При этом результаты клинических испытаний позволили отработать дифференцированный подход как в отношении пути введения препарата, так и оптимальной лекарственной формы его использования.

Препарат по разработанной нами технологии выпускается в настоящее время в двух формах - пероральный (патент 1& 4850360) и в свечах (патент & I58770I) на предприятии МНШЩ им. Г.Н.Габричевского.

Экспериментально-производственная разработка способа получения антигерпетического иммуноглобулина из фракции Д и осадка Б

Нами показан), что осадок Б содержит герпесспецифические антитела, титр которщ, практически, равен таковому в плазме крови. Это позволяет рас сматривать данную балластную фракцию как доступное и дещевое сырье для получения препарата противогерпетического иммуноглобулина человека. Преимущество использования этого источника сырья заключается такге в том, что осадок Б обогащен 3 и 4 подклассами'igG. Это особенно ваяно, так как известно, что при рецидивирующей герпетической инфекции герпесспецийичесЕЕе антитела представлены, в основном, I, 3 и 4 подклассами igG.

Тем не менее, при создании антигерпетического препарата нами использовано два подхода. Это, во-первых, частично модифицированная схема получения КИП.

Во-зторых, классическое фракционирование по Кону с выделением осадка J, обычно используемого для получения гаммаглобулина направленного действия из предварительно оттитрованного сырья с высоким титром антител, з данном случае - антигерпетических (1:1250000).

Таким образом, несмотря на то, что в основу производственной документации по получению антигерпетического иммуноглобулина заложен классический метод фракционирования по Кону, нами продолжается совер-

шенствованле метода получения препарата из осадка Б, так как, исходя из предварительных данных, препарат мо^ет бить использован для внутривенного введения. 3 настояцее время препарат антигерпетического иммуноглобулина проходит клинические испытания в двух клиниках ¡лосквы - НИИ охраны материнства и детства и ЩСЕК игл. В.Г.Короленко.

На "Способ получения препарата антигерпетического иммуноглобулина" подана заявка на изобретение и получена приоритетная справка (]; 5045574 в КВС рассматривается НЗД на данный препарат).

Технологические аспекты получеши антнротавирусного иммуноглобулина с использованием гпракши Д и осадка Б

йце один препарат направленного действия - антиротавирускый иммуноглобулин монет быть получен с использованием фракции Д по Кону г осадка Б. Исследования последних лет показали, что ватшую роль в этиологии кишечных инфекций, наряду с бактериальной флорой, играют и зирусы, в основном, семейства ротазирусов. Среди детей первых лет гизнз ротавирус как единственный этиологически:! агент или з ассопиа-цш с другими возбудителями кишечных инфекций обусловливает высокий [роцен-т заболеваемости ротавирусной диареей, иногда с летальным истодом, Особенно опасна ротавирусная диарея для тялунокомпрометирован-шх жщ Сятрогенный вторичный имцунодефацит, возникший после воздей-•■твзя рэдиац-и или тмуносупрессивной терапии), у которых, она может '.ереходить в хроническую форму.

Изложенное выше, с одной стороны, а с другой, отсутствие эффек-ившос химиотерапевтических препаратов против указанных выше вирусов, обудило нас к проведению исследований по созданию иммуноглобулина аправленного действия.

В основу зтой работы положен известный феномен широкого распро-транения ротанврусной инфекции и в связи с этил, вероятность нали-ия достаточного количества доноров с относительно высокими титрами ятител. Для определения специфической активности антител к ротави-усам з донорских сыворотках, препаратах иммуноглобулинов и комплексам иммуноглобулиновом препарате использовали два иммунохимических ме-эда: РШГА на основе эритроцитарного диагностику!.;а "Ротатест" (Рос-эвский НИИ ЭШГ) и ИФА на основе тест-системы для обнаружения анти-знов ротавируса человека Ленинградского НИИ2М им. Л.Пастера) в нашей щифпкацш, предназначенной для определения специфических антител.

Результаты исследования представлены и показывают, что средний гер антиротавирусных антител в сыворотках доноров равен 1:4 (РШГА)

и 1:100-200 (ИФА), в препаратах иммуноглобулина нормального для внутримышечного введения 1:160 (РШГА), 1:1000-2000 (ИФА), в то время как в КЕП - 1:640 (РШГА) и 1:2000 (ИФА).

Полученные результаты дают основание утверздагь, что около 30$ серил нормального иммуноглобулина человека для внутримышечного введения могут использоваться в качестве антиротавирусного иммуноглобулина. Последний с титром антител в РШГА 1:320 был испытан в инфекционной клинике ШШИ им. М.Ф. Владимирского на детях, страдающих ОКИ ротавирусной этиологии (100 пациентов в возрасте от 3 месяцев до 5 лет). Эффективность лечения 90$ (по приведенным вше критериям).

Особый интерес представляет увеличение специфической активности КИП в отношении ротавируса. Это связано не только с наличием антител класса но и антител 12оз . Последнее обстоятельство подтверждают данные о том, что в КИП'переходит значительная часть антител п^з й

Таким образом, используя метод титрования, мы получили два препарата с антиротавирусной активностью как из фракции й (препарат коммерческого иммуноглобулина для внутримышечного введения), так и из балластного осадка Б (КИП), при этой использование последнего позволяет увеличить специфическую активность препарата за счет обогащения его антителами 1^3-

На способ получения антиротавирусного иммуноглобулина получен патент В 4850360 .ЕЩ находится на утверждении в КВС.

Разработка технологии получения гомологичного столбнячного антитоксина с использованием метода а*<ринной хроматографии из центрийугата Б д осадка Б

Постоянно повышающаяся потребность в препаратах направленного действия для проведения заместительной антибактериальной и- антивирусной терапии, обусловленная увеличением ятрогенных ищунодефицитов, вызванных широким использованием химиотералевтических и иммуносупрессивных средств, побуждает к дальнейшему совершенствованию гаммагло-булинового производства. Принимая во внимание, что только 1,5$ рутинной донорской плазмы имеют необходимый уровень столбнячного антитоксина, до'10 МЕ/мх, нами был использован способ айфинной хроматографии, позволяющий сконцентрировать на сорбенте и выделить указанный препарат из сырья с невысоким его содержанием. Данный принцип моает

быть использован практически для получения любого вида антител, в основном, к белковым антигенам.

цразде чем использовать нормальный человеческий иммуноглобулин, а такке балластные осадки в качестве исходного материала для иммуно-аффиыной экстракции протявостолбшгшого иммуноглобулина, мы определяли с помощью ИФА содержание столбнячных антител в сериях коммерческого гомологичного иммуноглобулина и балластного осадка Ш, получаемых предприятием 'тЗШИсМ им. Г.Н.Габричевского. Стандартом слунил человеческий противостолбнячный иммуноглобулин, содержащий 125 МЗ/мл специфических аитител, изготовленный Томским ffiSIBC, серия 23. Особенностями предложенной нами кммуноферментной тест-системы являются следующие: I. В качестве антигена использовали столбнячный анатоксин," изготовленный ПНИИВС им. И.И.Мечникова, серия 726, очищенный от балластных белков ионнообменной хроматографией. 2. Коныогатом служил стафилококковый белок А, меченный пероксидазой хрена. Рабочее разведение 1:8000.

Содержание столбнячных антител в 14 сериях нормального человеческого иммуноглобулина оказалось от 2,2 до 7,0 ¡Ль/мл. Высокий коэффициент корреляции мекду результатами, полученными в реакции нейтрализации и ИФА, - Т = 0,78 (р<с 0,001), посчитанный методом линейно-регрессивного анализа, указывает на то, что в ИФА определяются те ;зе антитела, что и в реакции нейтрализации.

Поскольку максимальная активность в изученных 14 сериях нормального иммуноглобулина составила 7,0 ivffi/мл, совершенно очевидно, что для приготовления столбнячного иммуноглобулина по методу Кона эти препараты не могут быть использованы (исходное сырье доляно содержать не менее 10 MS/мл антител), но в качестве исходного сырья для производства иммуноглобулинов методом^лт^ой хроматографии они вполне пригодны. Для этого было необходш&^три задачи: I) выбрать высокоочи-щенннй лиганд, обладающий индивидуальной специфичностью; 2) подобрать матрицу, пригодную для использования в качестве носителя; 3) определить характер иммобилизации лиганда на матрице.

В качестве лигацца использовали столбнячный анатоксин (производство Томского НИИВС), очищенный по разработаной нами методики.

Одним из основных моментов успешного использования аффинной хроматографии является правильный подбор хроматографического материала -сорбента. С этой точки зрения оптимальными являются синтетические макропористые кремнеземы с регулируемой структурой пор, обладающие высо-

ко:; механической прочностью, жестким скелетом, структура которого не изменяется в растворителях различной природы.

Учитывая перечисленные выше положительные характеристики макропористых кремнеземов, в качестве матрицы было ксзользовано макропористое стекло (1ШС 2000). В качестве модификатора стекла как для устранения неспецифической адсорбции молекул на поверхности матрицы, так и для "дрнпнвки" столбнячного анатоксина, был использован гидрофобный спейсор, имеющий на конце активную эпокси-группу. Эпокси-груп-па помимо перзичшт аминов хорошо реагирует также с сульфгадрильными и гштроксильныыи группаыл лпганда, формируя устойчивые ковалентные связи.

Аффинную хроматографию для получения столбнячного анатоксина осуществляли по общепринятой методики с небольшими модификациями. После 30 последовательных циклов не было обнаружено снижения емкости колонки шш специфичности. Вопрос о концентрации антител является одним из самых сло.ишх при получении лечебных препаратов методом им-глуносорбцш:, так как обычно лечебные препараты используются в виде концентрированных растворов (5-10$), а содержание иммуноглобулина в исходных эллюатах низко и составляет не более 0,2$. Мы применяли для концентрирования антитоксина улътвафилътрацны на полых волокнах.

Антихоышлементарная активность полученных препаратов, равная не менее II мг белка на 2 ОН 50, не исключает возможности внутривенного применения противостолбнячных антител. По данным гельхроматографии на ультрагеле АсА 34, полученные столбнячные антитела представлены, в основном, мономерной фракцией.

Проведенные исследования продемонстрировали возможность применения аффинной хроматографии на основе модифицированных МПС для получения терапевтических противостолбнячных иымуноглобулзновых препаратов (чистых антител) из исходного сырья с очень низкой их начальной концентрацией.

На "Способ получения препарата - противостолбнячного иммуноглобулина" получено авторское свидетельство (15 1437809). Препарат по разработанной нами технологии предполагается выпускать на предприятии МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского.

Разработка экспериментально-производственных основ выделения минорных белков плазмы крови человека и некоторые аспекты их клинического применения

Исходя из цели нашего исследования, заключающейся в создании но-

вых лечебных и шмунодеагностических препаратов крови, используя безотходную технологию, следующей задачей явилась разработка способа получения минорных белков из балластных фракций 1У-1 и 1У-1У. В рамках этого раздела работы ш использовали "бросовые" фракции для выделения следующих 5 белков: альфа I-ингибитора протеаз С£1-ИП), гап-тоглобина (Ш), И-кн активатора (С1ин), третьего компонента комплемента (СЗ Д) и антитромблн Ш (АТ Ш), большинство из которых относится к группе белков острой фазы.

Для этого были созданы 2 схемы - одна для выделения Ш з Ш и вторая - для получения СЗ Д, С1ин и антитромбина Ш (рис. 6 и 7).

Осадок 17-1 <

растворение в тоссратном буфере при рН 6,8-7,2

суспензия осадка 17-1 центрифугирование при 10000

супэрнатант ультрафильтрация через полые волокна

раствор ¿л^-глобулинов

аффинная хроматография на ИЬ -сефарозе

фракция "проскска"~7ж0ГЛ0ЕИН

аффинная хроматографа на ВШ- -сефарозе

«Ьрагсция "проскока" \

иопнообменная хроыатогрэфия на ДЭАЗ-целлюлозе прп рН 6,5 <£/- ШПЖГГОР ПРОТЕЙНАЗ

Рис. 6. Схема фракционирования бачласткого осадка 1У-1.

По нашгал данным, содержание Ш в осадке 1У-1 в расчете на общий белок з 2 раза меньше, чем з цельной плазме крови, составляя 1,5$, что соответствует прпмс-нсшго 1/4 части Ш, содержащегося в исходной плазме крови. Количество <4 ИЗ в осадке 17-1 почтп такое как в плазме крози (1,3$ и 2,5$ соответственно), причем, .удельная антптрип-

плескав активность после диализа фракции осадка не отличается от таковой в плазме крови (0,36 Ж/мл? белка), что согласуется с данными 01азйег (1388 г.), доказывающего обратимость инактивации

1Ш при низких значениях рН..

Согласно схеме первый этап при Е-делении ГП и Ш из балластного осадка, представлякаего собой спиртовой преципитат концентрацией этанола 18-25$, заключался в его удалении путем ультрафкльтрации через полые волокна. После удаления этанола выделяли ГП из растворов *•/> -глобулинов с помощью лкгандной хроматографии на НВ-сефарозе. Процесс получения ГП был прослежен с помощью СИЭФ п ИЗФ, а его анализ после диализа и концентрирования методом ШЭФ. Показана иммунохими-ческая чистота изолированного ГП. Выход чистого ГП из осадка 1У-1 составил 30-50$ в зависимости от качества исходного сырья, а в пользу сохранения им биологических свойств свидетельствует сама возможность его ввделения на НВ-сефарозе.

ВЕщеленкя«£/ ИП производилось из осадков 1У-1 и 11-11 и происходило в 2 этапа: псевдолигавднач хроматография на голубой сеаарозе и ИОХ - на ДЭАЭ-целлшозе. Препарат ¿¿/-КП был такке проконтролирован методами СИЭФ и ИЭ5, причем, было показано, что ингибитор содержит ыжкроцримесь, выявляемую виде диффузной зоны в ИЭФ с антисывороткой ко всем сывороточным белкам крови наряду с основной дугой преципитации, соответствующей -Ж.

Выход <¿/-121 при его выделении по вышеприведенной схеме составил 16-75$, а по антитрпптической активности - до 96$. В то де время удельная активность полученных препаратов нале, чем у препаратов, выделенных из плазмы крови.

Согласнв нашим данным содержание АТ !1! в осадке 1У-1 соответствует примерно 80$ содерспания его в плазме. Количество С1ин - 20$, причем биологическая активность его практически полностью отсутствовала.

Как следует из рисунка 7, впервые 6 этапов фракционирования осадка 1У-1 были общими с предыдущей схемой. Затем, после удаления этанола из раствора ь и /-глобулинов и осаждения 16$ ПЭГ с помощью лиганд-ной хроматографии на пепарин-сефарозе выделяли С1ин и АТ Ш. Процесс получения обоих белков прослеживался с помощью ЙЭФ, ШЗФ ж БЩ по каячини. Показана иммунохимическая чистота изолированных С1ин и. АТ Ш. Выход чистых препаратов составлял 30-50$, в зависимости от качества исходного сырья. Биологическая активность АТ Ш составляла около 50$ от соответствующей, полученной из плазмы крови.

Осадок 1У-1

растворение в фосфатном буфере при рН 6,3-7,2 суспензия осадка 1У-1 суспензия осадка 17-1 центрифугирование при 10000

супернатант

ультрафильтрация через полые волокна

раствор ^ - ^-глобулинов

осаждение 16$ ПЭГ 6000 центрифугирование при 6000

^осадок ^с^пернатант^

[иализ против фосфатного лигандная хроматогратия на гепа-¡уфера рр 7,5 рин-сефарозе

:роматограйия на ДЕАЕ- / ^^

'оуреаг £ ~ . антитромбин Щ С1ин

•льтрафильтрация на Ш5-10

■ельфильтрация на сетакриле 200

С3с£

Рис. 7. Схема выделения- антитромбина Ш, С1ин, СЗа.

СЗе, выделенный описанным в схеме способом, имел молекулярную массу около 45000 Дальтон и мигрировал в область в ш.илуно электрофорезе. Чистота препарата была проверена ИЭ5 и ПИЭэ.

Следующим этапом нашего исследования явилась разработка способа получения препарата орозомуковда из супернатанта У. 3 отличие от осадка 1У-1 супернатант У не столь сложен по составу и содержит, в основном, орозомукоид и альбумин. При этом он значительно обогащен орозомукоцдом по сравнению с плазмой крови -54,5$ и 1,5$, соответственно, по нашим данным, и является удобным источником его получения. Схема фракционирования супернатанта У проста и включает ионнообменную хроматографию на ДЭАЕ-целлюлозе при рН 4,4 белковой фракции, получен-

нон после пропускания, супернатанта У через полые волокна для удаления этанола и концентрирования (рас. 8).

Супернатант f ультрафпльтрацкя через полые волокна белковая'фракция ионнообменная хроматография ка ДЭАЕ- целлюлозе при рН 4,4

орозомУксщ

Рис. 8. Схема фракционирования балластного супернатанта

■ Анализ выделенного орозомукоида методами СКЭФ и 1132 показал, что среди трех белковых фракций, ашопрующихся с ДЭАЕ- целлюлозы хлористым натрием, первая содержит орозомукоид с примесямя, а П и Ш, практпчнс-ки, чистый орозомукоид. Выход орозомукоида из I литра супернатанта У составил I0C-I50 мг (до 90$). Однако, учитывая то, что в нашей стране на ряде предприятий альбумин получают спнртово-каприлатным методом, наш в соавторстве с А.Г.Лютовым была предложена еще одна схема выделения орозомукоида (рис. 9).

•Балластный осадок

Растворение в дистиллированной воде 1:6 при рН 8;5+0,5

„ I ~

Раствор

Этанол - 20$, рН 4,5-4,8 -2°С

Центрифугат Осадок

Этанол - 35$, рН 4,2 -5°С 0,085 М НаС1 У X.

Осадок Центрифугат

Растворение в воде, гель-фи|1ьтраляя на сефадексе Г-25

Раствор

ДЗАЕ-цаллвдоза рН 3,7 0,025 М ацетатный буфер, элюция 0,15 М HaCl в буфере

Раствор

КМ-целлюлоза рН.3,9 0,01 М ацетатный буфер Чистый орозомукоид Рис. 9. Схема фракционирования балластного каприлатного осадка.

Процесс получения Ор по обеим схемам прослеживался с помощью ИЗФ, Ш13Ф и ИЩ по Манчини. Показана иммунохимическая чистота выделенного белка, причем, выход в первом случае составил до 2С£, во втором - до 15р. Биологическая активность Ор была сопоставима.с препаратом, получаемым из плазмы крови, Икмуномодулирующая активность Ор • изучалась на моделях как "ин виво", так и "ин витро". "Ин виво" балок предотвращал или значительно сшгсал тялесть активного анафилактического пока, подавлял образование кокно-сенсибилизкрующнх антител и уменьшал реакцию бронхиальной мускулатуры морских свинок на специфический антиген. В опытах "ин витро" бшго установлено, что добавление Ор в инкубационную среду с лимфоцитами человека значительно изменяло уровень розеткообразувдих Т-клеток, причем, реакция была дозозависима.

Таким образом, совершенствуя принципы безотходной технологии производства альбумина, нами получены из балластных осадков 17-1, 17-17 и супернатанта 7 следующие белки -, Гц, С1ин, АН, Ор., близкие по своим физико-химическим свойствам-я биолотической активности к таковым, полученным из плазмы крови человека. Выполнение этого этапа работы позволило вплотную подойти к практическому решению проблемы создания некоторых отечественных антипротеазных препаратов С^Ип, АТЩ С1ин) и иммуномодуляторов (Ор и СЗа). Кроме того, использование полученных белков в качестве антигенов дает возможность решить вопрос исходного сырья для получения моноспецифических антисывороток, о значении которых будет сказано ниле.

На способ получения препарата Ор получено .авторское свидетельство ¡1 1662039. На способы получения С1ин, СЗа и СЗ поданы заявки на изобретение, получены приоритетные справки №5043741, 5045570,5045791.

Разработка технологии получения моноспешшических антиснвороток к отдельным Б05 и клинические аспекты их применения

Пкт.е представлены разработанные нами технологические решения получения иммунохимических реагентов для определения Б0Ф, предусматривающие, во-первых, использование полученных как указано выше путем многоэтапной очистки "чистых" антигенов; во-вторых, иммунизацию не только иммунохимически чистыми белками, но и их комплексами с другими протеинами, образующимися "ин виво" или полученными "иннтро"; в-третьих, проведение целенаправленной адсорбции, позволяющей получать нз одной и той яе исходной сыворотки препараты разной специфичности.

Наиболее перспективным, на наш взгляд, представляется использование для иммунизации иммунных комплексов, состоящих из антигена и антител к нему, получаемых, в частности, в виде иммуноярецшштацкон-нкх полос в

'Главный этап ЛП1сФ - идентификация получения линий преципитации. Поскольку все эти белки являются гликопротеинами, то идентификацию могло проводить 2 принципиально различающимися способами как через белковую, так и углеводную части молекул. Традиционно применяют I способ с использованием соответствующих моноспецифических антисывороток. Нами разработан метод идентификации через углеводную часть с помощью специфических реагентов, взаимодействующих с углеводами - лектинами. Лектинк, находящиеся, в лунках в промежуточном геле, вза1ЕЛ0дейстЕ0вали при проведении ЛИЭ5 с олигосахарздными цепями гликопротеинов, к которым алели сродство, в результате чего наблюдалось выпячивание соответствующих линий преципитации - зоны тормохения (рис, 10).

№■■—г ■ V - .......- V—

0?—-•IT_ -v-v v-----у.

rv-v-irv- "~Y~

V—V—Г-—-v— t V3 4 i ь

-Рис. 10. Образец SiaS с тормоаением лектинами (схема). А - антдсыворотка ко всем белкам крови; Б - антиген Ы-fi- глобулиновая фракция); I - СоиД 2 - RCA 3 - IVG'A 4 - PHA " 5 - SBA 5 - RCAI

Для того, чтобы определить образец торможения лектннэми, соответствующий каддому из исследуемых балков, прозодилп JEI3S на пластине, зона геля с ангисывороткой на которой состояла из двух половин. На левой половине находилась агароза с антисывороткой ко всем белкам крози, а на правой - с антисыЕороткой к данному бе.лку. Таким образом было выявлено, что иммунопреципитат ИЛ взаимодействует с Соп А и EGA I и П, PHA., wga, а Ш-с kcai и Е, HiA, Соп А и wga. Благодаря различиям в связываниях с лектинами, соответствующие ОР, ЙП, Ш линии преципитации в ЛИЭФ мопно было легко идентифицировать.

1

Б

Антиснворотки, полученные з результате иммунизации прецшштата-1ли, как правило, были моноспецифпческпки и не требовали дополнительной адсорбции.

На основе получении иммунохимически чистых антигенов и антлсы-вороток к ним был создан целый ряд-тест-систем для определения Б05.

Иммунохимкческие тест-системы ОР, Гп и ^¿Ш были использованы для определения концентрации БОФ у больных раком желудка.

На большом клиническом материале было исследовано значение преемственного использования икмунохимичесхсого метода уточняющей диагностики на всех этапах обследования, лечения и динамического наблюдения больных раком яелудка, позволяющего до лечения судить о распространенности опухолевого процесса (табл. 5) и прогнозе яизни больных (рис. II), а при исследовании в динамике - оценить эффективность лечения и выявить рецидивы и метастазы в доклинической стадии, оперезсая ■клинико-инструментальную диагностику, в среднем, на 6,25 месяца.

Следующим этапом апробации ш/мунохшлических тест-систем для определения БОФ явилось тс использование в гинекологической клинике с цшхью уточнения тяяести состояния (табл. 6) и характера воспалительного процесса (табл. 7) до лечения, а такие оценки эффективности проведенной терапии, коррелирующей со снижением уровня исследуемых белков.

Использование тлмукохжмических тест-систем для определения Ор, СЗа и /у'Ш в кардиологическом отделении позволило оценить клиническое течение острого инфаркта миокарда (табл. 8) и его прогноз (рис. 12).

Так, в частности выявление в течение первой недели инфаркта миокарда низкого содержания ¿ТШ определяет неблагоприятный прогноз как и высокий уровень Ор на второй неделе заболевания. Несмотря на то, что существуют более чувствительные индикаторы, такие как креатинки-наза, лактатдегидрогеназа и т.д., в ряде случаев определение БОФ при данной патологии оказалось преимущественнее, учитывая простоту постановки метода и его доступность.

В заключение следует подчеркнуть, что проведенные исследования с использованием разработанных нами тест-систем свидетельствуют о вагной биологической роли БОФ при различных патологических состояниях и хотя механизм острофазного ответа до конца не изучен, современные представления о функциональных особенностях этой группы белков вызывают обоснованный интерес клиницистов. Диагностические бозмо;.-зост-1

Таблица 5

Уровень Б0§ у больных раком желудка в зависимости от стадии

Группы обследованных

Число обследованных

Белки (глг/дл)

^КГП ; р

Гп

■р

1. Здоровье люди (контроль)

2. Больные доброкачественными заболе вашими

64

49

91+3

96+4

0,05

185+5

191+9

0,05

258+7

271+13

0,05

Больные раком желудка:

3. 1-П от.

4. Ш ст.

5. 1У ст.

1-2,3 0,05

61 142 147

II1+8 143+5 203+5

232±22

1-2,4 0,05

284+14

3,4 0,05

410+14

4,5 0,05

а

1-2,3 0,05 1-2,3 0,05

286+19 1

1-2,4 0,05 1-2,4 0,05

357+12

3.4 0,05 3,4 ' 0,05

524+12

4.5 0,05 4,5 0,05

6. Средняя 350 1-2,6 0,05 1-2,6 0,05 1-2,6 0,05

162+8 323+17 415+22

БОФ при целом ряде заболеваний - оценка тянестз патологического процесса и эффективности лечения, прогноз и доклиническое выявление рецидива заболевания - а такпе простота использования указанных тест-систем для определения Б05 делает применение этого теста в клини-. ческой практике не только актуальным, но и практически выполнимым.

Рис. II. Продолжительность яизни больных в зависимости от уровня БОЗ до лечения

Таблица 6

Содержание ЕОФ у больных с воспалительными заболеваниями придатков матки в зависимости от характера воспалительного процесса (мг/дл)

Группы обсл^овалных-Д^

ОР

тип

р

ГГ

78,1+3,0 2:1<0,05 196,1+7,4 2:1с 0,01 179,4+13,0 2:1с 0,1 99,6+8,7 3:1 <0,01 307,4+32,9 3:1< 0,01 196,1+25,7 3:1<0,02

136,4+14,9 4:1< 0,001 422,8+65,6 4:1 <0,001 319,0+53,9 4:К0,001

259,8+56,0 2:3<0,05 697,7+175,2 2:3^0,1 681,5+224,7 2:3с 0,05 2:4<0,001 2:4<= 0,005 2:4с 0,005

3:4<0,01 3:4<0,1 3:4^0,05

Таблица 19

Содержание БОФ в зависимости от тяжести состояния больных воспалительными заболеваниями

придатков матки (мг/дл)

1. Контроль 30

2. Больше с 30 хроническим воспалением

3. Больные с 21 острым воспалением

4. Больные с 5 тубоовариаль- " ними заболевания ми

I. Контроль 30 78,1+3,0 2:1< 0,02 196,1+7,4 2:1с 0,01 179,4+13,0 2:1< 0,1

2. Больные в 43 103,9+7,4 3:1< 0,0.1 332,1+35,4 3:1< 0,001 211,3+22,8 3:1с о,001

удовлетвори-

тельном со-

стоянии

3. Больные в 10 196,2+31,7 2:3с 0,001 612,6+108,6 2:3с.0,005 497,7+112,5 2:3< 0,001

тяжелом со-

стоянии

со сг>

Уровень БОФ в динамике инфаркта миокарда

Таблица 8"

исследование показатель ИБС .: ( контрольн..: го. ) : ИМ : I сутки : ИМ : 7 сутки : IM : 14 сутки : ИМ : 21 сутки : ИМ ■ 28 сутки

Сз 71,38+2,47 111,0+8,6*/ 139,26+11,77*/ 120,81+9,79*/ 80,17+6,44 57,33+4,56

0р 0,559+0,04 0,834+*/ 0,022 1,265+3£/ 0,05 0,963+*/ 0,033 0,845+к/ 0,039 0,752+к/ 0,022

^ИЛ 156,6+3,03 210,71+*/ 10,1 258,21±к/ 10,43 218,3+*/ 7,87 219,15+*/ 8,66 219,37+*/ 9,54

к/ По1саза.тели, достоверно (р «С 0,05), различающиеся с контролем.

Рис. 12. Острофазный ответ при инфаркте миокарда.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в практике отечественной биотехнологии переработки плазмы крови человека на основе метода Кона разработана универсальная схема, включающая использование балластных фракций для получения целого ряда иммунобиологических препаратов в едином технологическом процессе.

2. Разработано'теоретическое и экспериментальное обоснование, позволившее впервые в нашей стране создать промышленную технологию получения из балластного осадка Б, образующегося при фракционировании плазмы крови человека, нового класса иммунобиологических препаратов -комплексных иммуноглобулинов для профилактики и лечения острых кишечных инфекций, дисбактериозов, сопутствующих ятрогенным иммунодефипи-там, бактериальных инфекций и т.д. (патент).

3. Создана научная, концепция перорального использования комплексного иммуноглобулинового препарата, основывающаяся на синергическом механизме протективного действия антител одной специфичности, но раз-

личных классов - igG, igf,i, igA. способствующих гемагглютинащш, нейтрализации и преципитации инфекционных агентов при острых кишечных инфекциях.

4. Разработаны и внедрены в клиническую практику адекватные

' форкы введения комплексного иммуноглобулинового препарата с учетом ■ патогенетических механизмов различных видов воспаления и использованием непосредственно *в зоне формирования патологического очага -ректальные и вагинальные свечи (патент).

5. Научно обоснованы иимунохимические критерии создания иммуно.-глобулинов направленного действия - антдротовщэусного и антигерпетического, получаемых в результате титрования осадкоз П и Е, образующихся при фракционировании плазмы крови человека (патент, заявка на изобретение).

6. Научно обоснован и экспериментально подтвержден на примере получения столбнячного антитоксина метод аффинного концентрирования специфических антител из сырья с невысоким их содержанием для создания иммуноглобулинов направленного действия (авторское свидетельство^.

7. Разработаны экономичные методы получения СЮ, С1ин и C3d'

из балластных осадков, образующихся при фракционировании плазмы крови человека. На основе выделенных антигенов созданы тест-системы для исследования компонентов комплемента прп целом ряде патологических состояний, Доказано диагностическое и прогностическое значение определения статуса комплемента (авторское свидетельство, 2 заявки на изобретение).

8. Предложена унифицированная схема выделения белков острой фазы из отдельных балластных фракций производства препаратов крови по методу Кона, позволившая получить их с относительной биологической активностью и достаточной иммунохимической чистотой. Использование полученных белков в виде антигенов позволило создать целый набор тест-систем для определения концентряпуга острофазных белков в сыворотке крови (3 авторских свидетельства).

9. Показано, что определение белков острой фазы в сыворотке крови человека с помощью полученных иммунохимкческих тест-систем является надежным методом уто^тяющей диагностики при различных патологических состояниях как на этапе первичного обследования, так и при исследовании в динамике (авторское свидетельство).

Список работ ло теме диссертации

1. Алешкин В.А. Применение методов линейного 'Л35 для качественно:' к количественной характеристики антисквороткн против тмукогло-булинов человека ¡: мыле // Сб. тезисов Всес. ск.ш. "Лр:-шлад:-;ая -клу-нология в профилактике бакт. кнфекцп'". я аллергических заболевали?.". Iii. - 1979. С. 47-49.

2. Алешкин В.А. Новые методы получения моноспешфичбсках акти-глобуляновых сывороток // Сб. тезисов Всес. кокф. "Актуальные вопросы иммунологии". Алма-Ата. - 1981. Т. I. С. 10.

3. Алешкин В.А., Борисова К.В. Комплексные имлуноглобулшовые препараты (КИП) дяя орального п ректального применения // Тезисы Всерос. съезда микробиологов. Н.Новгород. 1991. С. 212.

4. Алешкин В.А., Борисова И.В., Фетисова Л.Ф., Озерная М.С. Оральное применение комплексного иммуноглобулинового црепарата (КИП) при лечении детей больных ОКИ // Педиатрия. 1992. Ii I. С. 73-76.

5. Алешкин- Б.А., Борисова И.В., Холчев Н.В. Способ получения комплексного иымуноглобулЕнозого препарата // Патент я 4850360. IS9I.

.6. Алешкин В.А., Башакыадзе I.A., Аиешкина Т.Н. Белки острой фазы и их значение в онкологии // Сов. медицина. 1988. - JS 7. С.51-57.

7. Алешкин В.А., Вашакмадзе Л.А., Алешхина Т.Н., Стенвна О.И. Белки острой фазы в диагностике распространенности процесса при раке недудка // Советская медицина. 1985. - JS 2. С. 25-29.

8. Алешкнн В.А., Еникеева С.А., Лютов А.Г. Влияние о^кислого глзкопротеида на возникновение анафилактического шока у морских свинок // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. IS86. Js 4. С. 15-18.

9. Алешкин В.А.,Лаврентьев Б.Л., Мшмухаметов A.A., Вавилова JE.M. Клиническая эффективность интенсивного плазмофереза на центрифуге ЦР-3 и влияние на функциональную актзвность СН50 компонентов комплемента и содерзаше иммунных комплексов у больных ревматоидным артритом // УП Мкгщунар. сеш. по гемосорбции. Сб. тезисов докладов. Киев. - 1986. С. 54.

IB. Алешкин В.А., Насонов Е.П., Еремеева М.Е. и др. Использование твердофазного ИФА-метода для определения ЦИК при заболеваниях человека // Тер. архив. IS89. - 'й 6. С. II3-IIS.

11. Алешкин В.А., Новикова Л.И., Алешкина Т.Н. Способ получения моноспецзфической антиснворотки к орозомукоиду человека // Авторское свидетельство Л I3SI773. 1587.

12. Алешкин З.А., Новикова Л.И., Куликова H.H., Попков ;л.Ю. Ионообменная хроматография гаммаглобулина на гакропористых кремнеземах, модифицированных ДЗАЕ-декстраном // "Хроматограс&яя в биологии

и медицине". Сб. тезисов докладов Мездунар. симпозиума. М. - IS86.

13. Алешкин В.А., Новикова Л.И., Лютов А.Г. Использование балластных белковых фракций, полученных при производстве препаратов крови спиртовым методом, для выделения сС -кислого глзкопротеида

// "Иммуноглобулины н другие препараты крови". Сб. Горький. - IS86. С. 78-83. '

14. Алешкин В.А., Новикова Л.И., Лютов А.Г. и др. Белки острой фазы и юс клиническое значение // Клиническая медицина. 1988. -

tö 8. С. 33-48.

15. Алешкин В.А., Ярова Л.М. Получение высокоочищенного стафилококкового ана-альфатоксгна из коммерческого препарата // Сб. Иммунобиологические препараты. 1989. М. С. 31-94.

16. Алешкина Т.Н., Агеенко Я.И., Алешкин В.А., Вашакмадзе Л.А. Функциональное состояние лимфацитов и белков острой фазы при раке лелудка // Сб. тезисов Всес. симл. "Плеточные основы опухолевого иммунитета. Гибрядомы". М. - 1985. С. 20-22.

17. Алешина Т.Н., Алешкин'В.А. Значение белков острой фазы в выборе лечения рака Еелудка // Ш Всерос. съезд онкологов. Ростов-яа-Йону. - I98S. С. 461-462.

18. Алешкина Т.П., Зашагаладзе Л.А., Алешкин В.А. Исследование Зелков острой фазы при раке желудка-// Тезисы общесошзн. конф. Ак-гуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований. М. 198Э. - С. 90-32.

19. Ананченко В.Г., Алешкин В.А., Кшмухаметов A.A., Кулаков В.И. ^пользование иммунорадиометрического способа двойных антител для сонтроля за лечением ревматоидного артрита // Сб. тезисов Всес. конф. го иммунокоррекции. Ташкент. - 1984. С. S.

20. Ананченко В.Г., Ишмухаметов A.A., Алешкин В.А., Гольдфаб Ю.С. ¡ммунотерапевтзческие возможности применения гемосорбции в клинике гаутренних болезней // Сб. тезисов Всес. конф. по шллунокоррекцни. 'ашкент. - 1984. С. 122-123.

21. Ананченко З.Г., -Кршсунов Б.П., Алешкин В. А., Ишмухаме-

тов A.A. и др. Применение гемосорбции в комбинированном лечении ревматоидных артритов и системно;! красной волчанки // Сб. тезисов до-гладов 1 Европейского конгресса ревматологов. 1,1. - 1983. С. 2CG.

22. Ананченко В.Г., Крикунов В.П., Пшмухаметов A.A., Алешкин В.А. Опыт применения гемосорбции в комплексном лечении ревматоидного артрита // Ревматология. М. - I9S4. 1> 2. С. 32-36.

23. Борисова И.В., Алешкин В.А., йилиппова Л.М., Маркелова Р.З. Комплексные иммуноглобулиновые препараты (КПЗ) для орального применения /У Материалы пленума, проблемной комиссии. .Стандартизация биологических препаратов. Горький. Май. I9S2. С. ЗС—32.

24.^Борисова И.В., Алешкин В.А., Холчев Н.В. и др. Комплексные иммуноглобулиновые препараты для перорального и ректального применения // Сб. Иммунобиологические препараты. 1989'. - М. С. 5-10.

25. Борисова И.В., Алешкин В.А., Холчев Н.В. и др. Способ лечения кишечных инфекций у детей // Авторское свидетельство j'5430472I/I3 1991.

26. Поспелова В.В., Ханина Г.И., Борисова И.В., Алешкин В.А. и др. Способ получения суппозиториев для ректального и интравагиналь-ного введения // Патент ß I58770I. 1990.

27. Вашакмадзе I.A., Алешкина Т.Н., Алешкин В.А. Белки острой фазы в диагностике рецидивов и метастазов при раке зелудка // УШ съезд онкологов УССР. Тезисы докладов. Донецк, сентябрь. 1990. С.

28. Голенков А.К., Чередёев А.Н., Елаткика А.?., Алешкин В.А., Цховребова А.З. Способ лечения множественной миеломы // Авторское свидетельство & I56I985. 19Э0.

29. Денисова О-В., Мягкова М.А., Белобокова P.M., Алешкин В.А. Получение высокоочшценного ревматоидного фактора из сыворотки крови человека для физико-химических и иммунологических исследований

// Лаб. дело. I98S. - й 9. С. '48-51.

30. Еникеева С.А., Лютов А.Г., Алешкин В.А. Е др. Создание комплексной переработки крови - основа получения новых отечественных препаратов // Сб. Актуальные вопросы биотехнологии. Мат. Всес. научн. конф. (янв. 1987). Ленинград. С. I4I-I42.

31. Ишмухаметов A.A., Алешкин В.А. Разработка и клиническая йпробапдя иммуноферментной тест-системы для определения иммунных комплексов // Всес. симпозиум по медицинской эязимологии. Сб. тезисов докладов. Махачкала. - 1986. С. 68.

32. йшмухаметов A.A., Аяанченко В.Г., Алешкин В.А., Куликов В.Н. Иммунорадиоиетрический анализ комплексов с патогенным: потенциалом

// С<3. тезисов XI Зсес. 'съезда рентгенологов и радиологов. Таллин. -1984. С. 416.

33. Ишмухаметов -A.A., Крикунов В.П., Алешкин З.А., Лаврентьев Б.А. Возможности применения гемосорбции для иммунокоррекции // Сб. тезисов Всес. конференции по иммунокоррекции. Ташкент. - IS84. С. 199-200.

34. Ишмухаметов A.A., Алешкин З.А., Кулаков В.Н. Способ определения нарушения иммунного статуса // Авторское свидетельство

й I2372I5. 1986.

35. Катупгкина Н.В., Коликов В.М., глчедлшвили Б.В., Алешкин В.А., Новикова Л.И., Быченко В.Д., Макарова С.В., Смирнов A.B., Ыертвуни-на О.Н. Способ очистки белков плазмы // Азторское свидетельство

й I3S3086. 1988.

36. Корочкш И.М., Орлова И.В., Беркинбаев C.S., Алешкин В.А. Клинлко-прогностическая значимость монпторирования белков острой фазы у больных инфарктом миокарда // !Сардиологня. I9S0. Т. 3. С. 2G-23.

37. Корочкин И.М., Чукаева И.И., Иоселиани Л.Г., Алешкин В.А. Зависимость острофазного ответа при инфаркте миокарда от размеров зоны некроза // Лаб. дело. 1991. 5. С. 78.

38. Кострова О.М., Алешкин В.А. Способ получения антигерпетического иммуноглобулина // Заявка на изобретение. Приоритетная справка

'А 5045574. 1992.

39. Кострова О.М., Львов Н.Д., Алешкин В.А., Баринский И.$. Гаммаглобулины в профилактике и терапии герпес вирусных инфекций // Вопросы вирусологии. I9SI. & 3. С. 162-167.

40.-Кузник Б.И., Лоякина А.Н. ,• Цыбиков H.H., Алешкин В.А. Влияние активации комплемента по классическому и альтернативному путям за состояние гоместаза // Сб."Клинические и экспериментальные аспекты регуляции агрегатного состояния крови. Саратов. - 1984. С. II8-I23.

41. Куликова H.H., Кондратьева О.М., Алешкин В.А. Способы уда-гения лнпопротевдов из раствора экстракта Б (Ш фракция Кона), полу-1ающаяся при производстве гамыаглобулина // Депонирование в Е'ШПТИ. 5 21474.

42. Лоякина А.П., Алешкин В.А. Влияние dq-субкомлонента ком-глемента на адгезию и распластывание тромбоцитов // 53БПМ. IS85.

: 12. С. 694-696.

43. Ло.-дшна А.П., Алешкин В.А. Влияние ста-субкомпонента комплемента на свертываемость и йибринолиз крови // БЭЕ-ЕД. I98S. ß G. С. 2S5-2S5.

44. Луганская Е.Л., Алешсик В.А., Пинегкн Е.В., Костроза С.;,'. Индукция алмунорегуляторных -клеток человека с помощью различн'лх субклассов JjG человека // Иммунология. 1990. Л 2. С„ 28-31.

45. Лютов А.Г., Еникеева С.А., Алешкин В.А. Разработка производственной технологии получения альфа-1-кислого кликопротеина человека // Научно-проззЕодственные проблеш повышения качества вакцанно-сы-вороточнкх препаратов. Ч. I. Медицина. Ташкент. - ISS8. С. 88-91.

46. Латов А.Г., Еникеева С.А., Алешкин В.А., Новикова Л.И. Способ получения ¿--кислого гликопротеина // ^атент ß 1662039. 1Э30.

47. Лютов А.Г., Еникеева С.А., Алепжет В.А., Осипенко А.М. Получение ¿^-кислого шшкопротеина из отходов производства альбумина // Гематология и переливание крови. 1987. В 5. С. 58-60.

48. Лютов А.Г., Еникеева С.А., Алешкин В.А., Хакзмова 5.3. Способ получения препарата кроьи // Авторское свидетельство ß 1362473. 1987.

49. Матвеевская Н.С., Алешкин В.А. Способ выделения СЗ-компснен-та комплемента // Заявка на изобретение. Приоритетная справка

К 5045791. 1992.

50. Матвеевская Н.С., Алешкин В.А. Способ выделения фрагмента ■СЗ¿-компонента СЗ-комплемента // Заявка на изобретение. Приоритетная справка £5045570- 1992.

51. Новикова Л.И., Алешкин В.А. Перекрестный айуиншй яммуноэлектрофорез с лектинаш для исследования белков острой фазы плазмы крови человека // Лай. дело. 1991. ß 6. С. 3-IQ.

52. Новикова Л.И., Алешкин В.А., Куликова H.H. Выделение гап-тоглобина человека из отходов производства альбумина // Сб. Ишуно-биологические препараты. 1989. - М. С. 51-55.

53. Новикова Л.И., Куликова H.H., Алешкин S.A. Получение j-пн-гибитора протеиназ из отходов производства препаратов крови // Гематология и переливание крови. 1983. Ус , С. 46-50.

54. Новикова Л.И., Алешкин В.А., Лаврентьев В.Л., Ипыухаметов A.A. О возможности оценки эффективности плазмофгреза по применению профиля белков острой фазы у больных ревматоидным артритом // 7П МаТчЦунар. симпоз. по гемосорбции. Сб. тезисов докладов. Киев. - 1986. С. 54.

55. Новикова Л.И., Алешкин В.А., Лаврентьев Б.Л., Ишмухаметов A..I Способ определения индивидуальной чувствительности к лечению методом плазмайереза у больных ревматоидным артритом // Авторское свидетельство й 1476386. 1989.

•56. Новикова Л.И., Селгщкая С,С., Алешкин В.А., Гвоздкова Н.В. Клиническое значение белков острой фазы у больных с воспалительными . заболеваниями придатков матки // Сов- медицина. 1990. - !é 8. С. III-E

57. Озерная М.С., Соловьев C.B., Новокшенов A.A., Рузайкин H.И., 7чайкин В.М., Алешкин В.А. Клинико-микробиологическое обоснование применения имглуноглобулиновьос препаратов при лечении ОКИ у детей раннего возраста // Материалы 6 Всерос. съезда эпидемиологов н мик-робиол. Н.Новгород. 1991. С. II9-I20.

58. Отчет по теме 053 // М. 1989. - С. 1-89. Номер госрегистрации 0.1.85.0.032828.

59. Петрова Н.Б., Елисеева Т.А., Розина 'Д.Н., Алешкин В.А. Иммунные комплексы крови и ликвора у больных с травмой спинного мозга

// Клин, медицина. 1991. И 3. С. 56-58.

60. Пономарева A.M., Алешкин В.А., Розина М.Н. Определение количества агрегированного иммуноглобулина в препаратах гачмаглобулина для внутривенного и внутримышечного введения по связыванию ¿^-компонента системы комплемента // Сб. Иммунобиологические препараты. 1989. - IL С. 15-19.

61. Пономарева A.M., Попков 1Л.Ю., Алешкин В.А. Использование ИФА тест-системы для количественного определения столбнячного антитоксина в препаратах иммуноглобулина и сыворотках крови // Информационное письмо. М. МЗ РСФСР. 1989.

62. Пономарева A.M., Попков 31.Ю., Игорьков H.A., Алешкин В.А. Определение уровня противостолбнячного антитоксина в иммуноглобули-новнх препаратах методом имыуноферментного анализа в реакции нейтрализации "EH зиво" // ЗШЭИ. 1988. - ;г 5. С. I-I7-II8.

ч-. 62. Пономарева A.M., Попков М.Ю., Егорьков H.A., Алешкин В.А. Методы контроля противостолбнячной активности в препаратах иммуноглобулина // Сб. Препараты крови для лечения и профилактики заболеваний человека. 1989. М. С. 66-70.

-л

63. Попков М.Ю., Пономарева A.M., Борисова И.В., Алешкин В.А. Способ получения противостолбнячных антител // Авторское свидетельство В 1497809. 1989.

64. Розина JJ.H., Алешкин З.А. Выделение ciq субкомпонента сгс-темк комплемента человека из бросового осадка Ад, получаемого при фракционировании крови по метод- Кона // Сб. тезисов докладов конф. Актуальные вопросы биотеЬшологин производства препаратов крови. Новосибирск. IS83. - С. 81-85.

65. Розина I.i.H., Алешкин В.А. Способ получения С1инактиватора // Заявка на изобретение. Приоритетная справка ü 5043741. 1992.

66. Семеншшна H.A., Волохоеич Т.Т., Алешкин В.А. и др. Рота-вирусная инфекция у беременных с патологией сердца // Тезисы Всерос. съезда микробиологов. Ы.Новгород. 1991.-С. 129-130.

67. Соколов S.U., НеугодоваГ.Л., Алешкин В.А., Глан В.В. Способ определения иммунологической блокады // Авторское свидетельство

й 1557527. 1989.

68. Уланова ¡i.A., Яндошевская С.И., Алешкин В.А. ,и др. Роль циркулирующих иммунных комплексов у детей с ревматоидным артритом // Ревматология. 1989. - В 4. С. 42-48.

69. Феклисова Л.В., Борисова И.В., Алешкин В.А., Нсвокшеяова В.В. Сравнительное изучение перорального применения иммуноглобулиновых препаратов для лечения ОКИ у детей // Тезисы конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций, я. I9SI. - С. 659-660.

70. Халиф И.Л., Борисова И.В., Алешкин В.А., Гладько И.А. и др. Применение комплексных иммуноглобулиновых препаратов (КИП) у больных воспалительными заболеваниями толстой кешки // Проблемы проктологии. Выпуск И 12. М. 1991. С. 187-190.

71. Холчев Н.Б., Поспелова В.В., Шна15дер Г.В., Алешкин В.А. Получение комплексных иммуноглобулиновых препаратов (КИП) для парентерального применения // Тезисы 5 Всес. биохим. съезда. Киев. - 1986.

Т. 2. С. 329-330.

72. Чиссов В.И., Алешкин В.А., Вашакмадзе Л.А., Алешкнна Т.Н., Новикова Л.й., Федотов С.Ю., Васильева Г.А. Способ прогнозирования течения заболевания у больных раком нелудка // Авторское свидетельство Я 1504846. IS39.

'73. Чиссов В.И., Вашакмадзе М.А., Авербах A.M., Алешкин В.А. и др. Комплексная уточняющая диагностика объема оперативного вмешательства . и комбинированного лечения при резэктабельном раке гелудка // Метод рекомендации. 1® им. Герцена. М. 1991. С. I-I8.

74. Чукаева II.И., Орлова И.В., Арутюнов Г.П., Алешин В.А. Бликайшй и отдаленный прогноз инфаркта миокарда по данным исслндо-вапия острофазного и иммунного ответа // Сб. Современные методы диагностики и лечения заболеваний внутренних органов. М. I9S0. - 2 МОЛШ. С. 47-49.

75. Чукаева И.И., Орлова Н.В., Ксрочкин И.М., Алепшин'В.А. Влияние лазеротерапии на уровень БСФ и циркулирующих иммунных комплексов при инфаркте миокарда // Материалы мевдународной конференции "Лазер и медицина", Проблемы я достижения в лазерной медицине. М. 1989. -

С. 189-190.

76. Шяян С.П., Новикова Л.И., Алешкин В.А. Молекулярные формы кислого гликопротеина сыворотки крови человека. Различия в содержании да, три и'тетраптенных систем углеводных звеньев // Биорганическая химия. 1991. - й 5. С. 665-670.

77. Ярова Л.М., Алешкин В.А., Симонова EJ3. Разработка метода ИФА для отбора серий иммуноглобулинов с повышенным уровнем стафилококковых антител // Сб. Иммунобиологические препараты. 1989. - М. С. 5-10.

73. Alyoshlfin V.A., Borisova V.N., Ponomaryova A.M. Use of chromatography' ior -the preparation of gomologous tetanus antitoxin // J. of chromatography, V. 520, 1990, P. 425-431.

79. AlyoshJcia V.A., Borisova V.1I., Ponomareva A.M., Popkov M.Yu. Production- of Homologouse Tetanus antitoxin from commercial gamma-globulin preparation // Tezia "Eight International conference of Tetanus. Tesis, Leningrade, 25-28 aug., 1987, P. 8

80. Alyoshkin, V.A., Borisova V.N., Ponomaryova A.M., Popkov M.Yu. Use of chromatography for preparation of gomologous tetanus antitoxin // Symposium on Chromatography and analytik trefen, 1989, Leipzig, Vol. 1. N. 116.

81. Matveevskaya N.S., Alyoshkin V.A. Purification and use of C3d subunit of C3 // Int. conferen. Med. Biotechology. 1991. Leningrad. P. 5-15.

82. Nasonov V.V., Shiyan S.D., Alyoshkin V.A., Novikova L.I. Comparative studies of oligosacchari chains of 1-acid glycoprotein isolated from normal human and from ascitic fluide of gastrointestinal cancer patients // Europen Symposium on carbohydrate chemistry, Prague, "E0CAEJS", »1989, P. 15.

\

83. Ponomarjova A.M., Lapuk V.A., Denisova O.V., Alyoshkin V.A. Development of an immunoenzyme test-system for the detection of RFclass // Int. Conferen. Med. Biotechology. 19S1. Leningrad. S. 18.

84. Rozina M.N., Lutchanskaya O.T., Alyoahkin V„A. Use of icn exchange and affinity, chromatography for purification of isolated hyman C1-inhibitor // Int. Conf.'Med. Biotechnology. 1991. Leningrad. P. 7-2.

85. Shiyan S.D., Hovikova L.I., Hasonov V.V., Alyoshkin V.A. Aberrant glycosilation in .¿-acid glycoprotein of cancer patient // 11th Simp on glicocon., Canada, 1991. P. 188.