Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Лазерная флюоресцентная интраоперационная диагностика гинекологических заболеваний

На правах рукописи

БЕЛЯЕВА ЛЮДМИЛА АЛЕКСАНДРОВНА

ЛАЗЕРНАЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ ИНТРАОПЕРАЦИОННАЯ ДИАГНОСТИКА ГИНЕКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14.00.01. - акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -2005

Работа выполнена в Московском государственном медико-стоматологическом

университете

Научный руководитель: академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессорАдамян Лейла Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Торчинов Амирхан Михайлович Давыдов Александр Ильгизирович

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится « 14 » марта 2005 года в 14_ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.03 в Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (119992, г. Москва, ул. Б.Пироговская, д.2, строение 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (119998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49).

Автореферат разослан « 14 » февраля 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Шулутко Александр Михайлович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ФД - флюоресцентная диагностика ФДТ - фотодинамическая терапия 5-АЛК - 5-аминолевулиновая кислота Пп IX - протопорфирин IX

5-АЛК-индуцированный Пп IX - протопорфирин IX, образованный в результате трансформации в клетках экзогенно введенной 5-аминолевулиновой кислоты

Аласенс - лекарственная форма 5-аминолевулиновой кислоты, разрешенная Фармакологическим государственным комитетом для клинических испытаний в России

Аласенс-индуцированный Пп IX - понятие аналогичное термину 5-АЛК-индуцированный Пп IX

LESA-01-"Bюspec" - установка лазерная электронно-спектральная для флюоресцентной диагностики и контроля фотодинамической терапии - коэффициент флюоресценции - коэффициент диагностической контрастности

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Многие методы визуализации, иммунологические, цитогенетические и другие исследования уже произвели революцию в диагностике и лечении предраковых заболеваний и рака шейки и тела матки, вульвы и яичников (Кулаков В.И. и соавт., 2000; Адамян Л.В. и соавт., 2001), но не решили всех проблем. Интраоперационная дифференциальная диагностика в гинекологии представляет особый интерес, так как во время операции хирург принимает наиболее ответственные решения, и его действия полностью зависят от результатов ревизии и срочного гистологического исследования.

Рак яичников является одной из наиболее сложных проблем онкогинекологии: скрытое течение на первых этапах приводит к тому, что 80% больных раком яичников поступают в онкологические учреждения с III-IV стадиями процесса, и длительность их жизни в значительной степени коррелирует с возможностью максимального выявления и удаления первичной опухоли и метастазов. Информативность интраоперационного срочного морфологического исследования при пограничных опухолях яичников в сопоставлении с окончательным гистологическим исследованием, по данным некоторых авторов, составляет 45% (Жорданиа К.И. и соавт., 2001; Торчинов A.M. и соавт., 2000). Скрининг рака шейки матки и его предшественников основывается на диагностической кольпоскопии, морфологических исследованиях, выявлении инфекционных агентов, особенно вируса папилломы человека (Козаченко В.П., 2000; БохманЯ.В., 2002). Несмотря на уменьшение частоты рака шейки матки в странах с хорошими скрининговыми программами, известными проблемами остаются ложноотрицательные результаты цитологического исследования и низкая специфичность кольпоскопии, требующие высокой компетентности специалистов (Mitchell M.F. и соавт., 1999). Диагностировать предрак вульвы и влагалища - дисплазию - невозможно без инвазивной процедуры прицельной биопсии. Рак наружных гениталий, наиболее доступный для ранней диагностики, примерно в половине случаев выявляется в III стадии, что требует выполнения тяжелой обширной операции (Кузнецов В.В. и соавт., 2000). Рост заболеваемости раком эндометрия за последние 10 лет составил 29,5% (Чиссов В.И. и др., 2003). Основной задачей клиницистов является выявление и своевременное лечение фоновых и предраковых состояний, при этом аблация эндометрия уже давно расценивается как альтернатива радикальному хирургическому лечению (Стрижаков А.Н., Давыдов А.И., 1997). Частой клинической проблемой для женщин репродуктивного возраста является эндометриоз - второе по частоте заболевание репродуктивных органов, вызывающее бесплодие, боль и нарушение менструального цикла. Наружный генитальный эндометриоз может быть представлен очень изменчивыми формами, в результате чего нераспознанные во время операции очаги могут вести к рецидиву заболевания (Адамян Л.В., 1998). С этих позиций методы дополнительной визуализации эндометриоидных поражений являются перспективными и особенно актуальны для диагностики активного эндометриоза.

В связи с вышеизложенным, проблема ранней и уточняющей диагностики в гинекологии представляет значительный интерес, и в этом направлении идет интенсивный поиск принципиально новых диагностических возможностей. Одним из наиболее перспективных в этом плане является метод флюоресцентной диагностики, позволяющий прижизненно выявлять невидимые глазом патологические очаги с измененной метаболической активностью. В литературе описаны работы по флюоресцентной диагностике с 5-аминолевулиновой кислотой рака яичников (Major A.L. и соавт., 2002), цервикальной интраэпителиальной неоплазии (Hillemans P. и соавт., 2000), кондилом, дисплазий вульвы и влагалища (Fehr К. и соавт., 2000), эндометриоидных очагов (Malik E. и соавт., 2000). Нами выбрана методика измерения спектров флюоресценции, индуцированной красным лазерным излучением (длина волны 633 нм), при этом глубина оптического исследования тканей составляет 1-3 мм (Loschenov V.B. и соавт., 2000). В данной работе проведено исследование эффективности флюоресцентной диагностики при различных заболеваниях женской репродуктивной системы, изучены особенности проведения и интерпретации результатов флюоресцентной спектроскопии.

Цель исследования

Повышение эффективности ранней и дифференциальной диагностики гинекологических заболеваний с помощью метода лазерной флюоресцентной спектроскопии с препаратом Аласенс.

Задачи исследования

1. Проанализировать результаты флюоресцентной спектрометрии тканей половых органов у экспериментальных животных в зависимости от времени после перорального введения Аласенса. Разработать в эксперименте способ внутриматочного подведения лазерного излучения для анализа состояния эндометрия методом флюоресцентной спектроскопии.

2. Оценить спектроскопические данные собственной флюоресценции тканей органов женской репродуктивной системы и флюоресценции Аласенс-индуцированного протопорфирина IX (Пп IX) в норме и при эндометриозе, доброкачественных и злокачественных заболеваниях яичников, вульвы, шейки и тела матки.

3. Провести анализ результатов флюоресцентной спектрометрии в зависимости от особенностей гормонального статуса организма (фазы менструального цикла, возрастных особенностей, приема гормональных препаратов или наличия гормонально-активных новообразований).

4. Оптимизировать методики проведения флюоресцентной диагностики при лапароскопии, лапаротомии, гистероскопии, наружно-внутреннем гинекологическом исследовании и исследовании удаленных органов и тканей.

5. Провести сравнение результатов спектрального анализа тканей в зависимости от характера патологического процесса и оценить эффективность метода флюоресцентной спектроскопии в диагностике эндометриоза, предраковых заболеваний и рака.

Научная новизна

Впервые предложен метод интраоперационной экспресс-диагностики злокачественных, пограничных и доброкачественных опухолей яичников, основанный на спектроскопическом исследовании свойств тканей с 5-аминолевулиновой кислотой.

Впервые изучены диагностические возможности метода флюоресцентной спектроскопии для уточнения характера и распространенности гинекологической патологии на основе регистрации флюоресценции 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX при возбуждении лазерным излучением (633 нм).

Предложена новая методика измерения флюоресценции биопсийного материала для диагностики патологических процессов.

Экспериментально обоснован способ измерения интенсивности флюоресценции эндометрия с использованием интралипида для анализа состояния эндометрия методом флюоресцентной спектроскопии.

Практическая значимость

Определены спектрометрические критерии злокачественных и доброкачественных процессов яичников, шейки и тела матки, вульвы, а также метастатических поражений методом оптической экспресс-диагностики.

Выявлена зависимость результатов спектрального анализа тканей от характера пролиферативного патологического процесса, морфофункциональных особенностей исследуемых нормальных тканей и эндометриоидных гетеротопий.

Определены показания к флюоресцентной диагностике при различных гинекологических заболеваниях.

Разработаны методики проведения флюоресцентной диагностики при лапароскопии, лапаротомии, гистероскопии, наружно-внутреннем гинекологическом исследовании и исследовании удаленных органов и тканей.

Разработан в эксперименте способ внутриматочного подведения лазерного излучения, позволяющий анализировать интенсивность интегральной флюоресценции эндометрия.

Определены наиболее перспективные направления использования метода флюоресцентной диагностики с препаратом Аласенс в гинекологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Лазерная флюоресцентная спектрометрия с 5-аминолевулиновой кислотой при возбуждении флюоресценции лазерным излучением (633 нм) позволяет прижизненно, в реальном масштабе времени дифференцировать злокачественные опухоли гениталий (яичников, шейки матки и вульвы) от доброкачественных опухолей и нормальных тканей, а также выявлять метастазы.

2. Разработанная методика измерения флюоресценции биопсийного материала повышает достоверность диагностики патологических процессов в гинекологии.

3. Спектроскопический способ измерения интенсивности флюоресценции эндометрия с использованием интралипида позволяет осуществлять уровень накопления фотосенсибилизатора для анализа состояния эндометрия.

Апробация диссертационного материала

Материалы и основные положения диссертации представлены в виде стендовых докладов, доложены и обсуждены на Международной конференции EBiOS 2000 (Нидерланды, Амстердам, 2000); на III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); на Международной научно-практической конференции «Лазерные и информационные технологии в медицине XXI» (Санкт-Петербург, 2001); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2002); на Международной конференции «Оптические технологии в биофизике и медицине» (Саратов, 2002); на XVI Международном конгрессе «Новые технологии в гинекологии» (Москва, 2003); на XX Международной научно-практической конференции «Применение лазеров в медицине и биологии» (Украина, Ялта, 2003); на Международном симпозиуме по фотодинамической диагностике и терапии в клинической практике (Италия, Бриксен/Брессанон, 2003); на 12 Международной конференции по лазерной физике LPHYS'03 (Германия, Гамбург, 2003); на 9 Всемирном конгрессе международной фотодинамической ассоциации (Япония, Миязаки, 2003); на VIII Международной конференции «Лазеры и лазерные информационные технологии» (Болгария, Пловдив-Смолян,

2003); на XXVI итоговой конференции молодых ученых МГМСУ (Москва, 2004); на 13 Международной конференции по лазерной физике LPHYS'04 (Италия, Триест, 2004); на Международной научно-практической конференции «Лазерные технологии в медицинской науке и практическом здравоохранении» (Москва,

2004).

Обсуждение диссертации состоялось на межкафедральном совещании кафедр репродуктивной медицины и хирургии ФПДО РГМУ, акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ и лаборатории лазерной биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФРАН (15 ноября 2004 г.).

Внедрение результатов работы

Метод лазерной флюоресцентной интраоперационной спектроскопии внедрен в практику гинекологических отделений Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Главного клинического госпиталя МВД России.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 30 печатных работ, в том числе 10 в центральной печати, 9 в зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы экспериментально-клинических исследований, описания материалов и методов, результатов интраоперационной флюоресцентной диагностики, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 36 отечественных и 137 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 6 клиническими примерами, 46 рисунками и 12 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Клиническая часть работы посвящена оптимизации метода лазерной флюоресцентной интраоперационной диагностики гинекологических заболеваний. На экспериментальном этапе работы изучена собственная флюоресценция тканей органов женской репродуктивной системы, обоснована возможность проведения спектроскопических исследований с препаратом Аласенс в гинекологии и разработан способ измерения интенсивности интегральной флюоресценции эндометрия.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (материалы, методы и результаты собственных исследований)

Аутофлюоресценция тканей органов женской репродуктивной системы

ex vivo

Аутофлюоресцентную лазерную спектроскопию выполняли в клинике акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова под руководством д.м.н., профессора В.М Зуева и в отделении гинекологии Главного клинического госпиталя МВД России под руководством д.м.н., профессора, академика РАМН Л.В. Адамян. Исследование проводили на удаленном операционном материале 50 больных. Специального обследования и подготовки больных для проведения спектрально-флюоресцентных измерений не требовалось. Операционный материал включал в себя матку, маточные трубы, яичники, на которых измерялись спектры собственной флюоресценции эндоцервикса, экзоцервикса, эндометрия, миометрия, серозного слоя матки, слизистого и серозного слоев маточных труб, их фимбриальных отделов, ткани яичников, а также ткани миом, эндометриоидных очагов, кист (эндометриоидных, фолликулярных) и доброкачественных опухолей яичников (серозная, эндометриоидная цистаденома, тератома), трубной беременности. Результаты спектрального анализа около 1000 исследованных точек тканей сопоставляли с результатами планового гистологического исследования.

Исследование аутофлюоресценции нативных препаратов методом флюоресцентной спектроскопии проводили сразу же после гинекологических операций на лазерной электронно-спектральной установке LESA-01-"Biospec" (ЦЕНИ ИОФРАН, Москва, Россия). Результатом спектроскопии является кривая (спектр) аутофлюоресценции тканей, которая представляет собой графическую зависимость интенсивности собственной флюоресценции (в условных единицах) от длины волны возбуждающего ее лазерного излучения. Спектры анализировали по форме и амплитуде сигнала, они имеют два основных "подъема": первый -лазерная кривая (характеризует рассеянное и отраженное лазерное излучение), второй - кривая аутофлюоресценции (характеризует флюоресценцию эндогенных порфиринов в диапазоне 640-750 нм). Поскольку интенсивность флюоресценции определяется не только свойствами тканей, но и техническими характеристиками, в частности интенсивностью лазерного облучения, анализировались не абсолютные значения площади аутофлюоресценции, а ее отношение к площади лазерной кривой - коэффициенты аутофлюоресценции последние

отображались в виде гистограмм.

Исследование собственной флюоресценции, несмотря на многообразие видов эпителия изучаемых анатомических слоев различных органов женской репродуктивной системы при разных патологических процессах и вариабельность

данных спектрометрии в зависимости от фазы менструального цикла, позволяет выявить некоторые закономерности Подъем спектральной кривой отмечается в диапазоне 645-655 нм, наибольшие значения интенсивности флюоресценции достигаются в диапазоне 660-705 нм, затем происходит постепенный спад практически до полного прекращения регистрации флюоресценции в зоне 800 нм Выявлено, что ткани с дегенеративными изменениями обладают ярко-выраженной собственной флюоресценцией Рак эндометрия, эндометриоидные кисты, некоторые доброкачественные кистомы яичников также имеют специфическую форму спектров флюоресценции (рис 1,2)

длина волны, нм

Рис 1 Диагноз Кистома правого яичника Рис 2 Диагноз Рак эндометрия Ист

Гистология Серозная папиллярная Гистология аденокарцинома эндометрия

цистаденома правого яичника, фолликулярная, Комментарии епёосегу - эндоцервикс,

параовариальная киста левого яичника епёош-эндометрий

Полученные данные важно учитывать при исследованиях, проводимых с применением экзогенных фотосенсибилизаторов, а также при анализе видеофлюоресцентных изображений

Флюоресцентная спектрометрияАласенс-индуцированногоПп IX в половых органах и органах брюшной полости экспериментальных животных

Целью данной работы являлось изучение спектральных свойств тканей и органов самок мышей методом лазерной флюоресцентной спектроскопии и определение накопления Пп IX в зависимости от времени после перорального введения 5-АЛК

Всего исследованы 33 половозрелые самки мышей породы БЛЬБ в периоде диэструса Применялся препарат Аласенс, созданный на основе 5-аминолевулиновой кислоты (ГНЦ НИОПИК, Москва, Россия) Аласенс вводился мышам перорально в дозе 300 мг/кг, которая эквивалентна дозе 25 мг/кг для человека, в объеме 0,3 мл физиологического раствора Через определенные интервалы времени животных забивали, после чего сразу же проводилась флюоресцентная спектрометрия тканей половых органов, а также брюшины, кишечника, печени, желчного пузыря, почек, мочевого пузыря, кожи

Изучение фармакокинетики Аласенс индуцированного Пп IX методом флюоресцентной спектроскопии проводилось на установке LESA-01-"Bfospec", использовалось специальное диагностическое волокно малого диаметра (0,7 мм).

Спектры анализировались по форме и амплитуде сигнала, затем автоматически при построении гистограммы рассчитывался коэффициент флюоресценции который использовался как диагностический критерий

относительной концентрации Пп IX в различных тканях. Результаты флюоресцентной спектрометрии показали максимум накопления Пп IX в тканях матки через 4 ч после перорального введения Аласенса (рис. 3), в тканях вагины, маточных трубах и яичниках - через 4-6 ч. Полученные данные продемонстрировали быструю элиминацию Пп IX из этих тканей - через 24 ч интенсивность флюоресценции была близка к интенсивности собственной флюоресценции аналогичных тканей мышей контрольной группы. Интенсивность Пп IX (кф) была выше в тканях матки, чем в вагине в 2 раза. Низкие значения кф получены в тканях маточных труб, яичников, а также брюшины. Самая высокая концентрация Пп1Х наблюдалась в желчном пузыре (кф в 10 раз выше, чем кф матки) и в печени (кф в 3-4 раз выше, чем к® матки), при этом значения кф Аласенс-индуцированного Пп IX возвращались к исходному уровню только через 3 суток. Анализ формы спектра тканей тонкого и толстого отделов кишечника показал преобладание копропорфиринов над Аласенс-индуцированным Пп IX: пик флюоресценции смещен в область 670 нм, тогда как для Пп IX характерен пик флюоресценции в области 705 нм. Из органов мочевыделительной системы наибольшее содержание Пп IX определено в уретре - через 6 ч после приема Аласенса, к концу суток параметры возвращались к исходным значениям. В тканях почек, мочеточников и мочевого пузыря обнаружено низкое содержание Пп IX. Флюоресцентная спектроскопия тканей почек позволила выявить умеренную собственную флюоресценцию этих тканей, обусловленную содержанием в них уропорфиринов. Исследование динамики накопления Пп IX в коже экспериментальных животных показало невысокое его содержание с максимумом интенсивности флюоресценции через 6 ч после введения Аласенса.

Рис.3 Фармакокинетика Аласенс-индуцированного ПпЕХ в тканях матки мышей.

Данная работа продемонстрировала возможность изучения фармакокинетики фотосенсибилизатор-индуцирующего препарата методом флюоресцентной спектроскопии. Степень и динамика накопления Пп IX зависят от типа тканей. Из обследованных органов половой системы наибольшая концентрация Пп IX наблюдалась в функционально активной ткани матки. Пероральное введение Аласенса в дозе 300 мг/кг-веса мышей приводит к накоплению диагностически значимых концентраций протопорфирина IX в органах и тканях, в том числе половых органов, в интервале 2-8 ч после введения препарата с практически полной его элиминацией через 24 ч. Знание дозо-временной зависимости необходимо для правильного выбора времени проведения флюоресцентной диагностики. Высокая скорость синтеза Аласенс-индуцированного Пп IX и последующего его выведения имеет важное практическое значение. Препарат Аласенс обладает низкой кожной фототоксичностью и лишь в течение первых 24 ч. Протопорфирин IX подвержен относительно быстрому фотобличингу, что регламентирует проведение световой экспозиции.

Способ внутриматочного подведения лазерного излучения

Цель работы заключалась в экспериментальном обосновании способа оптимального внутриматочного подведения лазерного излучения для оценки интенсивности интегральной флюоресценции эндометрия методом флюоресцентной спектроскопии. Для этого была разработана модель, позволяющая создать равномерное освещение внутренней поверхности матки с помощью баллона, наполненного жидкостью, рассеивающей свет. Внутрь баллона вводился волоконно-оптический световод с торцевым диффузором. Такая модельная конструкция позволяет осуществлять дозиметрию фотосенсибилизатора для анализа состояния эндометрия, что важно как при флюоресцентной диагностике патологий эндометрия, так и при контроле фотодинамической аблации эндометрия.

Обеспечение равномерного освещения достигалось путем подбора концентрации интралипида, который представляет собой водную суспензию липидных капель и характеризуется определенными оптическими свойствами. Использовалась аппаратура ЛФТ-630/675-01-"Биоспек", исследовательский баллон, имитирующий по форме матку, и цифровая телевизионная аппаратура для ввода изображения в компьютер и последующей обработки изображения. Цифровые изображения баллона, заполненного разбавленным раствором интралипида с различными его концентрациями, подсвеченные волоконным источником лазерного света, размещенным внутри баллона, запоминались и обрабатывались в цифровом формате специальной программы компьютера. По полученным изображениям оценивалась неравномерность свечения наружной поверхности баллона. Оценка эффективности подведения лазерного излучения для измерения интенсивности интегральной флюоресценции эндометрия проводилась с помощью компьютерного моделирования распространения лазерного излучения и излучения флюоресценции в баллоне. Математическая модель, использованная для моделирования распространения света, изложена в работе Киселева Г.Л., ЛощеноваВ.Б. (1998).

Оптимальная концентрация интралипида К (%) зависит от объема баллона

V (мл): К = 1.3У3. Средняя интенсивность света I (Вт/см2) по поверхности баллона зависит от его объема V (см3) и подводимой мощности Р (Вт):

/ = 1.3-Р-К3. Для повышения равномерности освещения поверхности матки можно изменять положение торца волокна, подводящего свет. В работе продемонстрировано, что лишь при двух положениях излучателя - 5 мм и 15 мм от внутреннего зева матки нормальных размеров - вся внутренняя поверхность матки освещена равномерно, что подтверждается равномерным распределением флюоресценции по объему баллона.

Разработанный способ подведения лазерного излучения в полость матки с использованием эластичного прозрачного баллона и интралипида при флюоресцентно-спектральной диагностике позволяет определять уровень накопления фотосенсибилизатора по интегральному показателю интенсивности флюоресценции эндометрия.

ИНТРАОПЕРАЦИОННАЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ ДИАГНОСТИКА С ПРЕПАРАТОМ АЛАСЕНС

Материалы и методы исследования

Интраоперационная диагностика методом лазерной флюоресцентной спектроскопии выполнена 85 гинекологическим больным на базе кафедры репродуктивной медицины и хирургии ФПДО Московского государственного медико-стоматологического университета (зав. кафедрой - академик РАМН, профессор, д.м.н. Л.В. Адамян) в отделении гинекологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН (зав. отделением -профессор, д.м.н. В.В. Кузнецов). Исследование проводилось во время лапаротомии, лапароскопии, гистероскопии и при наружно-внутреннем гинекологическом исследовании. Обследованные больные были в возрасте от 20 до 77 лет.

Основная или сочетанная патология Количество больных

Миома матки 21

Аденомиоз 13

Эндометриоз брюшины малого таза, яичников, ретроцервикальный 13

Кисты и доброкачественные опухоли яичников 28

Пограничные опухоли яичников 4

Рак яичников и метастазы в яичники 13

Атипическая гиперплазия эндометрия 3

Рак эндометрия 11

Саркома матки 1

Полипы эндометрия 11

ДМК климактерического периода 1

CIN I, II 2

CIN III, рак шейки матки in situ 6

Рак шейки матки (Tía, Tib) 8

Рак вульвы 6

Табл.1. Характер патологий обследованных больных.

Результаты флюоресцентной спектрометрии четырех пациенток исключены из дальнейшего статистического анализа из-за промежутка времени меньшего, чем 3 часа или большего, чем 8 часов после введения фотосенсибилизатор-индуцирующего препарата. У 81 больной (средний возраст составил 47,71+2,81 лет) выявлена и гистологически подтверждена 141 патология (табл. 1).

Злокачественные новообразования по стадиям распределились следующим образом (TNM Classification of Malignant Tumours, 6th edition, UICC, 2002):

Рак яичников IA стадии (Tla N0 MO) - 2, И С ст. (Т2с N0 МО) - 1, III А ст. (ТЗа N0 МО) - 1, IV ст. (ТЗа N0 Ml, ТЗс N0 Ml, ТЗс N1 Ml) -3; две пациентки имели предшествующее комбинированное лечение по поводу рака яичников IIIC ст. (ТЗС N0 МО) - 1 и I ст. - 1 (метастаз опухоли в культю шейки матки). У одной больной раком сигмовидной кишки IIIB ст. (ТЗ N1 МО) имелся метастаз в яичник. Аденокарцинома эндометрия I А стадии (Tla NO МО) - 5, I В ст. (Tib N0 МО) - 3, 1С ст. (Tic N0 МО) - 1, II В ст. (Т2Ь N0 МО) - 1, IIIA ст. (ТЗа N0 МО) - 1. Гистологическое исследование удаленных препаратов двух больных выявило отсутствие аденокарциномы эндометрия, которая была удалена при предшествующем полостной операции диагностическом выскабливании слизистой полости матки. Рак шейки матки 0 стадии (Tis NO МО) - 5, IA1 ст. (Tlal N0 МО) - 2, IB1 ст. (Т1Ы N0 МО) - 3,1 B2 ст. (Т1Ь2 N0 МО) - 2, III В ст. (Т1Ы N1 МО) - 1. Рак вульвы II стадии (Т2 N0 МО) - 1, III ст. (Т2 N1 МО, ТЗ N0 МО, ТЗ N1 МО) - 5.

Больным проводились общепринятые плановые предоперационные обследования и специальные инструментальные исследования. В дальнейшем, учитывая данные анамнеза заболевания, физикального, инструментального обследования больной, лабораторных исследований, формировалась диагностическая концепция (предварительный диагноз), и принималось решение о показаниях к интраоперационной лазерной флюоресцентной спектроскопии. Всем оперированным пациенткам наряду с традиционно проводимым осмотром выполняли флюоресцентную диагностику. Анализ

спектроскопических характеристик тканей проводился в реальном масштабе времени. Среднее время оптической экспресс-диагностики тканей составило 2 мин. Для проведения интраоперационной флюоресцентной диагностики гинекологических заболеваний использовалась лазерная электронно-спектральная установка LESA-01-"Biospec" (рис.4). В комплект используемой диагностической аппаратуры входят следующие основные компоненты: гелий-неоновый лазер длиной волны 632,8 нм (выходная мощность 1-10 мВт); многоканальный волоконно-оптический зонд, представляющий собой систему, состоящую из двух частей - лазерная часть

(используемая для подведения лазерного излучения к исследуемому объекту) и приемно-измерительная часть (регистрирующая флюоресценцию и рассеянное лазерное излучение и позволяющая передавать получаемый сигнал на регистрирующее устройство); система светофильтров; портативный многоканальный спектральный анализатор, позволяющий проводить регистрацию спектра в ускоренном режиме; получаемая информация обрабатывалась на специализированной программе компьютера. Диаметр 1,8 мм и гибкость диагностического волокна позволяют вводить его в операционный канал гистероскопа.

При подготовке к флюоресцентной диагностике целенаправленно исключалось заболевание больных порфирией. После информирования и получения согласия пациентки, интраоперационная флюоресцентная диагностика проводилась в интервале от 3 до 8 часов после перорального приема 40 мл водного раствора Аласенса в дозе 25 мг/кг. В целом переносимость препарата была хорошая.

Флюоресцентно-спектроскопическое исследование во время гинекологических операций проводилось следующим образом: диагностическое волокно от гелий-неонового лазера, предварительно обработанное в растворе гигасепта или сайдекса, подводилось к исследуемым тканям до легкого соприкосновения по возможности перпендикулярно - при лапаротомии или наружно-внутреннем гинекологическом исследовании непосредственно рукой, при лапароскопии - через боковой пятимиллиметровый троакар при помощи аспирационной канюли, при гистероскопии - через операционный канал. Измерения осуществлялись путем легкого соприкосновения дистального конца оптического волокна гелий-неонового лазера с исследуемыми тканями. Во время регистрации спектров флюоресценции при эндоскопических операциях необходимо кратковременное отключение источника света, при чревосечениях и наружно-внутреннем исследовании - затемнение или кратковременное отключение источников общего освещения. Время одного измерения составляло 1-2 сек. Перед операцией с целью сравнительного анализа и оценки всасываемости Аласенса измерялось накопление протопорфирина IX в коже внутренней поверхности предплечья пациентки и слизистой губы, а также измерялась собственная флюоресценция кожного покрова здорового человека. Спектральный анализ тканей проводился также непосредственно после операции на макропрепаратах для дополнительного контроля достоверности результатов. В этом случае спектры снимали с разрезов тканей удаленного материала в зонах видимых патологических изменений и неизмененных тканей.

Анализ получаемых спектрограмм проводился как во время операции, так и после нее. Результатом ФД является спектр флюоресценции: острый пик спектральной кривой в области 633 нм соответствует рассеянному лазерному излучению, а более широкий диапазон - излучению флюоресценции, для анализа выделялся всегда одинаковый диапазон от 685-690 нм до 715-720 нм. Спектры анализировались по форме, так как флюоресцентные свойства тканей определяются не только флюоресценцией Пп IX, но и собственной флюоресценцией, которая может вносить ошибку в результаты исследования. Одним из важных моментов получения количественных характеристик

флюоресценции является одновременное измерение спектра флюоресценции и рассеянного от исследуемого объекта лазерного излучения. Для этого используется коэффициент флюоресценции кф - диагностический критерий относительной концентрации Пп IX в различных тканях. Данная нормировка дает возможность количественно сравнивать результаты измерений, проведенных на разных пациентах, исключить зависимость результатов спектрометрии от мощности лазерного излучения, а также частично от наличия поглощающих свет веществ (крови, слизи). Кроме того, полученные значения кф нормированы относительно нормальной кожи руки, принятой за единицу. Для оценки различия интенсивности флюоресценции нормальной и патологической ткани вычислялся коэффициент диагностической контрастности Для документирования

информации была составлена специальная форма протокола, куда вносились индивидуальные данные пациентки, а также комментарии. Всего были проанализированы результаты лазерной флюоресцентной спектрометрии около 2000 точек исследовавшихся тканей органов (по 20-40 у каждой больной).

Результаты интраоперационной лазерной флюоресцентной спектроскопии с исследованием Аласенс-индуцированного Пп IX, плановых гистологических исследований подвергнуты ретроспективному сравнительному анализу. Сравнительная оценка эффективности изучаемого метода диагностики проведена путем расчета чувствительности, специфичности и точности. Статистическая обработка результатов исследования проведена с помощью компьютерной программы "Sigma Plot 8.02" с вычислением средней арифметической (М), среднего квадратического отклонения (о), ошибки средней арифметической (т), после чего находился доверительный интервал 95%-вероятности безошибочного прогноза. Для сравнений патологий между собой и с нормой использовался t-тест.

Результаты исследования и их обсуждение

Нормальные ткани. Обработка результатов спектрального анализа показала минимальное накопление протопорфирина IX в нормальной брюшине: кф=2,25±0,29 (р<0,05), в серозном покрове матки: кф=3,09±0,44 (р<0,05), маточных труб: кф=3,52±0,51 (р<0,05) и в нормальной ткани яичников: кф=3,05±0,35

(р<0,05). Это позволит при разработке метода панорамной флюоресцентной визуализации сравнивать норму с патологически яркой флюоресценцией. Обнаружено высокое накопление Аласенс-индуцированного Пп IX в фимбриальном отделе маточных труб: При спектральном

анализе получено различие в накоплении Пп IX в нормальном эндометрии: по сравнению с миометрием: - в 3,5

раза, что позволяет обосновать возможность проведения фотодинамической аблации эндометрия без повреждения миометрия.

Корреляционной зависимости результатов флюоресцентной спектрометрии от фазы менструального цикла, а также наличия или отсутствия у пациенток менструальной функции не обнаружено. Следует отметить один случай нехарактерно высокого значения -внешне нормальной ткани яичников у

одной больной эндометриозом яичников и брюшины позадиматочного пространства, которая постоянно принимала Диане-35 (более года), и даже в день

операции прием препарата не был прекращен. Интенсивность флюоресценции была повышена не только по сравнению с нормальной тканью яичников (в норме средний кф=3,0), но даже по сравнению с эндометриозом яичников, при котором средний кф=б,4. Таким образом, прием гормональных препаратов, очевидно, может влиять на спектрально-флюоресцентные результаты исследований.

Кисты и опухоли яичников.

Кисты и доброкачественные опухоли яичников имеют низкую интенсивность флюоресценции Пп IX - эндометриоидная, фолликулярная, параовариальная киста, киста желтого тела: кф=2,81±0,70 (р<0,05); серозные, муцинозные цистаденомы, цистаденофиброма, фиброма, фибротекома, тератома: кф=2,42±0,64 (р<0,05) При эндометриоидных кистах или других кистах с кровоизлиянием иногда наблюдаются более высокие значения кф| обусловленные вкладом собственной флюоресценции, при этом форма спектров характерно отличается от формы спектров Пп IX смещением максимума флюоресценции в область 670 нм (рис.5).

600 650 700 750 1 0 2 3 9

Рис. 5. Диагноз: Киста желтого тела с кровоизлиянием.

Комментарии: h-n - кожа руки здорового человека; lips-p - слизистая губы пациентки; big t-r ovarii - киста желтого тела с кровоизлиянием (d =11 см); periton-n - нормальная брюшина.

У одной больной была обнаружена гранулезоклеточная опухоль яичника на фоне аденокарциномы эндометрия. Коэффициент флюоресценции - 12,03 -был повышен по сравнению со средним значением кф (2,6) доброкачественных образований яичников. Возможно, это связано с гормональной активностью опухоли. Известно, например, что ткани щитовидной железы характеризуются высокой собственной флюоресценцией.

Пограничные опухоли яичников: кф=28,98±3,48 (р<0,05); кдапо отношению к нормальной ткани яичника составил 9,7 (рис.6).

Я

Рис. 6 Диагноз: Пограничная серозная цистаденома яичника. Комментарии: ^п - кожа руки здорового человека; ovaг-n-left -нормальный яичник слева; kistoma-гight - кистома яичника справа.

При раке яичников интенсивность флюоресценции Аласенс-индуцированного Пп IX в 1,7 раза выше по сравнению с опухолями яичников пограничной злокачественности: кф=48,17±16,36 (р<0,05); кдк - 17,1 (рис.7).

Рис.7 Диагноз: Рак яичников ТзсЫоМ|. Комментарии: ^п - кожа руки здорового человека, c-г-ovaг -рак яичников; ovaг-нормальная ткань яичников; ШЬ^г - нормальная серозная оболочка маточных труб; tub-met-seг-метастаз в серозную оболочку маточных труб, n-seг-uteг-нормальная серозная оболочка матки; seгosa-met-метастаз в серозную оболочку матки; penton-n - нормальная брюшина; pent-met-метастаз в брюшину, met-salmk-метастаз в сальник.

Полученные статистические данные позволяют со 100% чувствительностью и специфичностью дифференцировать рак, пограничные и доброкачественные опухоли яичников1.

Метастазы в яичники характеризуются высокой интенсивностью флюоресценции Пп IX: кф=20,20±7,26 (р<0,05). Метод показал высокую эффективность при выявлении метастазов в яичниках (средний кф - 20,2), большом сальнике, лимфоузлах, брюшине не только при раковых заболеваниях гинекологических органов, но и, например, при раке сигмовидной кишки, злокачественной мезотелиоме брюшины.

Следует отметить, что иногда при больших размерах и дегенеративных изменениях тканей новообразований и метастазов имеется низкая интенсивность флюоресценции Аласенс-индуцированного Пп IX или даже преобладание флюоресценции, очевидно, других порфиринов, что проявляется смещением пика флюоресценции к 670 нм. Например, у одной больной метастазы в яичники при карциносаркоме матки имели высокую интенсивность флюоресценции Аласенс-индуцированного Пп IX - 21,6, тогда как кф огромного опухолевого узла матки был низким - 7,9

Статистически значимые различия получены при сравнении нормальных, неизмененных тканей с метастазами в брюшине: кф=19,18±6,57 (р<0,05); кдК=13,7, метастазами в серозном слое матки: кф=17,66±11,50 (р<0,05), кдк=6,2; и маточных труб: кф=25,09±13,41 (р<0,05), кдк=7,8. Достоверно отличаются между собой нормальный сальник: кф=3,42±1,47 (р<0,05)) и метастазы в большом сальнике: кф=29,05± 10,39 (р<0,05), кдк=12,5; нормальные лимфатические узлы: кф=4,63±2,27 (р<0,05) и метастазы в лимфатических узлах: кф=28,10±10,39 (р<0,05), кдк=8,8. Ложноположительные результаты отмечены при реактивной гиперплазии и липоматозе лимфатических узлов у двух больных раком вульвы, а также при липогранулеме большого сальника.

Патологии эндометрия. Сложность дифференциальной диагностики различных патологических процессов в эндометрии связана со способностью эндометрия, как функционально активной ткани, даже в норме накапливать протопорфирин IX, концентрация которого возрастает при аденокарциноме, атипической гиперплазии, полипах эндометрия.

Рак эндометрия: кф=37,26±8,68 (р<0,05); при ограниченной форме рака тела матки кдк=5,3 (рис.8).

Атипическая гиперплазия эндометрия: кф=26,35±13,55 (р<0,05). Вследствие диффузной формы патологии определить было нельзя.

При полипах эндометрия: кф=27,38±6,94 (р<0,05); кдкмеждунормальным эндометрием и полипом равен 2,6, что примерно в 2 раза меньше по сравнению с

Принятая методика расчета чувствительности и специфичности для оценки малого количества больных является недостаточно корректной. При выборке меньше 100 человек по каждой нозологии правильней указывать нижнюю границу рассчитываемых показателей. Гак, например, если в расчетную группу вошло 10 человек, то специфичность и чувствительность не может быть достоверно выше 90%. Эту поправку следует иметь в виду в рассчитанных показателях диагностической ценности лазерной флюоресцентной спектроскопии.1

раком эндометрия. Однако у одной больной, имеющей на фоне атипической гиперплазии эндометрия железисто-фиброзный полип эндометрия и микрофокусы высокодифференцированной аденокарциномы, полученные данные флюоресцентной спектрометрии были одинаково высокими и достоверно позволили лишь заподозрить патологию эндометрия.

600 650 700 750 0 6 7

Рис. 8. Диагноз: Рак эндометрия Т^оМо. Плановое гистологическое исследование: разрастания высокодифференцированной аденокарциномы преимущественно в левом маточном углу.

Комментарии: ^п - кожа руки здорового человека; endom-n - нормальный эндометрий в дне матки; endom-left-ang - эндометрий в левом маточном углу.

Дисфункциональное маточное кровотечение климактерического периода: флюоресцентно-спектральное исследование проведено во время диагностической гистероскопии на фоне отсутствия кровянистых выделений, полученный кф эндометрия - 15,6 - незначительно отличается от значений нормального эндометрия. Однако при исследовании во время гистероскопии на фоне метроррагии у другой больной практически не обнаружено Пп 1Х-флюоресценции в эндометрии; результаты флюоресцентной спектрометрии расценены как недостоверные вследствие погрешностей измерений из-за наличия крови и не включены в статистический анализ. Карциносаркома матки характеризуется низкой флюоресценцией Аласенс-индуцированного Пп IX: кф—7,94.

Дисплазия и рак шейки матки. Зона поражения локализовалась в зоне переходного эпителия, либо в эндоцервиксе или поражен был как экзоцервикс, так и эндоцервикс. Спектрометрические данные нормального экзоцервикса и эндоцервикса сходны между собой: кф=6,78±0,65 (р<0,05).

Рак шейки матки характеризуется высоким кф, равным 34,10±5,22 (р<0,05), при дисплазии кф значительно ниже: при CIN III -19,4, а при CIN Щ средний кф -11,0.

У обследованных больных раком шейки матки I al, I bl, IM стадии (рис. 9), 0 стадии - cancer in situ, а также с дисплазией III степени выявлена разница в интенсивности флюоресценции по сравнению с неизмененными тканями в среднем в 5,7 раза, тогда как при дисплазии I и II ст. составляет в среднем 1,7.

600 650 700 750 0 '3 16 1» IE

Рис. 9. Диагноз: Рак шейки матки Тм^оМо. Комментарии: Ь-п - кожа руки здорового человека; епдосегу-5шрююп - эндоцервикс, подозрительный на рак; ейосегу-^рююп -экзоцервикс, подозрительный на рак; епёосегу - нормальный эндоцервикс; ес(:осегу -нормальный экзоцервикс.

Чувствительность метода при дифференциальной диагностике нормального эпителия и рака составляет 85%, специфичность - 100%, точность метода - 98% (рис. 10). Были установлены достаточно отчетливые тенденции к увеличению интенсивности флюоресценции слизистой шейки матки с увеличением степени дисплазии и глубины инвазии опухоли (рис.11).

Сплошные линии - средние значения величин, пунктирные линии - верхнее и нижнее значение

доверительных интервалов 95%. Рис. 10. Коэффициенты флюоресценции эндоцервикса и экзоцервикса в норме и при раке шейки матки.

Рис.11, вдк между нормой и патологией шейки матки: п=1-2 - CIN 1,11; n=3 - CIN III; n=4-8 c-r in situ; значения выше 4,9 (сплошная линия на графике) относятся к инвазивному раку шейки матки Т1А,В - (п=9-16).

Рак вульвы характеризуется кф = 33,06±7,48 (р<0,05); кдк по сравнению с нормой составляет 5,8 (рис. 12). Нормальная вульва имеет кф = 6,41±1,77 (р<0,05). Показатели чувствительности и специфичности метода при дифференциальной диагностике рака вульвы и нормального эпителия составляют 100%.

Миома матки со стороны серозного покрова матки имеет низкий кф=2,72±0,61 (р<0,05). При субмукозной локализации узлов, а также при активно растущей опухоли кф был в 5 раз выше.

Аденом иоз в целом характеризуется более высокой интенсивностью флюоресценции Аласенс-индуцированного Пп IX в эндометрии по сравнению с нормальным эндометрием: кф=24,10±4,92 (р<0,05). Кроме того, при исследовании ex vivo выявлена повышенная флюоресценция Пп IX в миометрии (по сравнению с нормальным миометрием): кф=9,45±2,93 (р<0,05), и обнаружено соответствие ее протяженности со степенью распространенности аденомиоза, что подтверждено гистологически.

Наружный генитальный эндометриоз. Всего обследовано 13 больных, из них с ретроцервикальным эндометриозом - 1, эндометриозом брюшины - 11, эндометриозом маточных труб - 8, эндометриозом яичников - 5. Эндометриоз брюшины характеризуется кф=7,07±3,83 (р<0,05), маточных труб: кф=8,09±4,54 (р<0,05), яичников:кф=6,40±2,77 (р<0,05),ретроцервикальный эндометриоз: кф -5,3. Пигментные эндометриоидные очаги практически не отличаются по интенсивности флюоресценции от окружающих тканей: средний Однако у 7 больных обнаружено различие интенсивности флюоресценции Пп IX в эндометриоидных гетеротопиях по отношению к интактным тканям в среднем в 3,4 раза (в 4,2; 3,6; 2,4 раза соответственно для брюшины, серозного слоя маточных труб и яичников), что, вероятно, связано с пролиферативной активностью эндометриоза. Прослеживается положительная корреляционная связь повышенного накопления Пп1Х в эндометриоидных очагах с синдромом хронических тазовых болей у этих больных.

Правильная интерпретация результатов спектрального анализа во многом зависит от корректности проведения флюоресцентной спектроскопии. Выполнение данной научной работы выявило ряд физико-технических проблем, которые решались совместно с сотрудниками лаборатории лазерной биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФРАН. С целью оптимизации способов проведения флюоресцентной диагностики была разработана новая методика измерения флюоресценции биопсийного материала (биопсий эндометрия, эндоцервикса, экзоцервикса и др.) для диагностики патологических процессов. Были разработаны специальные предметные стекла с поглощающим свет покрытием. Тестовые исследования показали, что разработанная методика дает погрешность измерения 10% по сравнению с результатами флюоресцентной спектрометрии тканей целого органа, в то время как измерения, которые проводились без специального стекла, были вообще недостоверны. Исследование эндоцервикса с использованием торцевого волокна (обеспечивающего направление распространения лазерного излучения вперед) приводит к существенным ошибкам измерений вследствие малого диаметра цервикального канала, поэтому для обеспечения эффективного подведения излучения к исследуемой ткани была разработана специальная конструкция волоконно-оптического катетера - с падением светового луча под углом 70° к оси диагностического волокна. Флюоресцентная спектрометрия тонких слоев тканей потребовала также оптимизации методики измерений, так как зондирующее лазерное излучение обуславливает быстрый фотобличинг исследуемой тонкой ткани и может возбуждать флюоресценцию окружающих тканей органов, приводя к неправильным результатам спектрального анализа. В целом, разработанные методики измерения флюоресценции тканей повышают достоверность диагностики патологических процессов в гинекологии.

Проведенные исследования свидетельствуют, что флюоресцентная спектроскопия при возбуждении флюоресценции лазерным излучением (633 нм) является весьма эффективным и информативным методом экспресс-диагностики новообразований яичников, рака шейки матки и вульвы и позволяет прижизненно, в реальном масштабе времени проводить дифференциальную диагностику. Метод флюоресцентной спектроскопии на основе определения интенсивности флюоресценции Аласенс-индуцированного протопорфирина IX показан в первую очередь в диагностически сложных случаях. В связи со своей простотой и безопасностью метод может стать стандартным этапом интраоперационного исследования при новообразованиях яичников, при скрининговом обследовании для выявления предраковых заболеваний шейки матки, при дифференциальной диагностике рака вульвы, эндометрия, метастатических поражений.

Противопоказаний к проведению флюоресцентной диагностики нет, за исключением выявления у больной порфирии. Лазерная спектроскопия является безопасной, как для пациентов, так и для медицинского персонала, поскольку используемое низкоинтенсивное лазерное излучение малой мощности не обладает лучевым или фото динамическим действием.

В целом метод имеет ряд несомненных достоинств: оперативность (возможность обработки данных в реальном масштабе времени), неинвазивность (не вызывает повреждения исследуемой биологической ткани и позволяет получать информацию о состоянии тканей без оказания влияния на динамику

различных биологических процессов), совместимость с другой эндоскопической диагностической аппаратурой

Сравнивая скорость проведения спектроскопического исследования и срочного гистологического исследования, следует отметить, что последнее требует больше времени. Быстрое и безопасное исследование, направленное на установление точного диагноза доброкачественной, пограничной и злокачественной опухоли, имеет особую ценность, когда диагностические или технические возможности других методов интраоперационной диагностики ограничены или недостаточны. Комплекс применяемой для исследования аппаратуры является компактным и мобильным, что в совокупности всех факторов позволяет отнести лазерную флюоресцентную спектроскопию к разряду экспресс-методов диагностики.

Полученные данные открывают перспективу не только для оптимизации использования методов флюоресцентной диагностики, но и для развития фотодинамической терапии. Полученные спектрально-флюоресцентные характеристики тканей в норме и патологии позволяют создать новые более эффективные методы оптической экспресс-диагностики с применением техники флюоресцентных видеоизображений.

Все вышеизложенное позволяет рекомендовать метод лазерной флюоресцентной спектроскопии для использования в гинекологии.

ВЫВОДЫ

1. На основании исследования фармакокинетики Аласенс-индуцированного протопорфирина IX методом флюоресцентной спектроскопии выявлено наибольшее накопление Пп IX в половых органах экспериментальных животных в интервале 2-8 часов после перорального введения препарата и почти полная его элиминация из организма в течение 24 часов. Разработанный способ внутриматочного подведения лазерного излучения с использованием эластичного прозрачного баллона и интралипида позволяет анализировать интенсивность интегральной флюоресценции эндометрия.

2. Аутофлюоресцентные исследования позволяют выявить характерные спектральные особенности при эндометриоидных кистах, доброкачественных кистомах яичников, раке эндометрия, однако показатели флюоресценции имеют значительную вариабельность в разные фазы менструального цикла, что затрудняет анализ полученных результатов. В то же время, накопление Аласенс-индуцированного Пп IX в тканях репродуктивных органов существенно не зависит от фазы менструального цикла и возраста пациенток.

3. Разработанные методики проведения флюоресцентной диагностики позволяют успешно применять этот метод при лапароскопии, лапаротомии, гистероскопии, наружно-внутреннем гинекологическом исследовании и исследовании удаленных органов и тканей.

4. Лазерная флюоресцентная спектроскопия с препаратом Аласенс является эффективным методом экспресс-диагностики рака яичников, пограничных и доброкачественных опухолей яичников, рака эндометрия, шейки матки и вульвы, а также метастатических поражений яичников, брюшины, сальника и лимфатических узлов.

5. Имеющиеся особенности в накоплении Аласенс-индуцированного протопорфирина IX в эндометриоидных очагах брюшины, маточных труб, яичников у больных с различным клиническим течением заболевания свидетельствуют о пролиферативной активности эндометриоза.

6. Разработка скрининговых программ по выявлению предраковых и онкологических заболеваний шейки матки и вульвы с использованием флюоресцентной диагностики позволит прижизненно, в реальном масштабе времени осуществлять диагностический поиск и расширит возможности ранней диагностики и динамического наблюдения. Свойство эндометрия накапливать 5-АЛК-индуцированный протопорфирин IX при его низком содержании в миометрии позволяет обосновать возможность аблации эндометрия методом фотодинамической терапии без повреждения миометрия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Метод флюоресцентной диагностики с исследованием 5-АЛК-индуцированного Пп IX рекомендуется к применению в клинической практике как высокоинформативный экспресс-метод дифференциальной диагностики доброкачественных, пограничных и злокачественных опухолей яичников, рака шейки матки и вульвы, а также выявления метастазов. Он отличается простотой и безопасностью для пациентов и персонала.

2. Оптимальное время для проведения флюоресцентной диагностики - 38 часов после перорального приема Аласенса в дозе 25 мг/кг веса.

3. При регистрации флюоресценции Аласенс-индуцированного Пп IX в визуально неизмененной исследуемой ткани, превышающей диагностический критерий нормы, следует брать прицельную биопсию.

4. При флюоресцентной спектроскопии необходимо исследовать не менее 3 точек в патологической зоне и интактной ткани, располагая диагностическое волокно перпендикулярно к исследуемой поверхности, что повышает точность диагностики. Спектрометрию эндоцервикса, биопсийного материала, тонких слоев тканей необходимо проводить по специальным методикам.

5. Для правильной интерпретации результатов спектрометрии необходимо учитывать вклад собственной флюоресценции в величину интенсивности общей флюоресценции.

6. Следует учитывать, что флюоресцентная диагностика некротизированных, кровоточащих тканей и на фоне гормонотерапии имеет сниженную информативность.

7. Необходимо соблюдать световой режим в первые сутки после перорального приема Аласенса для предупреждения возможного фотодерматоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Адамян Л.В., Беляева Л.А., Лощенов В.Б. Возможности лазерно-флюоресцентной диагностики при эндоскопических операциях в гинекологии // В кн. «Лапароскопия и гистероскопия в гинекологии и акушерстве», М., 2002, -с. 513-518.

2. Адамян Л.В., Беляева Л.А., Странадко Е.Ф., Лощенов В.Б. Диагностические возможности Аласенс-индуцированной флюоресценции в гинекологии // Актуальные аспекты лазерной медицины: материалы научно-практической конференции российских ученых, М, Калуга, 2002, - с. 308-310.

3. Беляева Л.А. Лазерная флюоресцентная интраоперационная диагностика в гинекологии // Сборник трудов XXVI итоговой научной конференция молодых ученых МГМСУ, 2004, - с. 61-63.

4. Беляева Л.А., Адамян Л.В.,. Жорданиа К.И, Лощенов В.Б. Диагностическая ценность лазерной флюоресцентной спектроскопии с препаратом Аласенс в оперативной гинекологии // Проблемы репродукции, 2004, № 2, т. 10, -с. 26-32.

5. Беляева Л.А., Адамян Л. В., Степанян А. А., Лощенов В. Б. Флюоресцентная диагностика в гинекологии // Материалы VI Российского форума «Мать и дитя», 2004, - с.297-298.

6. Беляева Л.А., Адамян Л.В., Степанян А.А., Лощенов В.Б. Перспективы развития флюоресцентной диагностики в гинекологии // Лазерная медицина, 2004, 8(3),-с. 136.

7. Беляева Л.А., Адамян Л.В, Степанян А.А., Васильченко С.Ю., Тараз М., Лощенов В.Б. Спектроскопическое исследование фармакокинетики эндогенного фотосенсибилизатора протопорфирина IX в тканях самок мышей // Российский биотерапевтический журнал, 2003, № 4, - с. 35-39.

8. Беляева Л.А., Адамян Л.В., Лощенов В.Б. Интраоперационная флюоресцентная диагностика заболеваний яичников с препаратом Аласенс // Применение лазеров в медицине и биологии: материалы XX Международной научно-практической конференции, Ялта, 2003, - с. 84.

9. Беляева Л.А., Зуев В.М., Тевлина Е.В., Лощенов В.Б. Опыт диагностики и лечения эндометриоза с использованием препарата "Аласенс" // Материалы III съезда фотобиологов России, Воронеж, 2001, - с. 15-16.

10. Беляева Л.А., Зуев В.М., Харнас С.С., Лощенов В.Б. Аутофлюоресцентная диагностика нативных препаратов в гинекологии //Лазерные и информационные технологии в медицине XXI века: материалы международной научно-практической конференции, Санкт-Петербург, 2001, - с. 466-467.

11. Беляева Л.А., Лощенов В.Б. Роль флюоресцентной диагностики с препаратом Аласенс в гинекологической практике // В кн. «Новые технологии в гинекологии», ред. В.И. Кулаков, Л.В. Адамян, 2003, - с. 20-21.

12. Беляева Л.А., Лощенов В.Б., Меерович Г.А., Аксенов А.А., Кудашев Б.В. Метод повышения селективности накопления фотосенсибилизаторов // Лазерные и информационные технологии в медицине XXI века, материалы международной научно- практической конференции, Санкт-Петербург, 2001, - с. 408-409.

13. Беляева Л.А., Степанян А.А., Лощенов В.Б. Наиболее важные направления клинического применения флюоресцентной диагностики с 5-АЛК в гинекологии // В кн. «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний», ред. В.И. Кулаков, Л.В. Адамян, 2004, - с. 40-41.

14. Беляева Л.А., Степанян А.А., Лощенов В.Б. Экспресс-диагностика опухолей яичников BQ время операций методом лазерной флюоресцентной спектроскопии //В кн. «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний», ред. В.И. Кулаков, Л.В. Адамян, 2004, - с.38-40.

15. Беляева Л.А., Степанян А.А., Адамян Л.В Основы флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии (лит. обзор) // Проблемы репродукции, 2004,№1,т. 10,-с. 6-12.

16. Беляева Л.А., Харнас С.С., Лощенов В.Б., Стратонников А.А. Применение фотосенсибилизаторов для оценки эффективности лекарственных препаратов в экспериментальной онкологии // Российский биотерапевтический журнал, 2002, № 2, т. 1, - с. 112.

17. Беляева Л.А., Харнас С. С., Киселев Г.Л., Катышев А.А. Методы доставки излучения при фотодинамической терапии и контроля ее эффективности в гинекологии // Лазерная медицина, 2000, № 12, - с. 43-46.

18. Дадвани С.А., Ветшев П.С., Харнас С.С., Ветшев СП., Беляева Л.А. Интраоперационная дифференциальная диагностика заболеваний щитовидной железы с использованием лазерной аутофлюоресцентной спектроскопии //Лазерная медицина, 2000, №12, - с. 46-52.

19. Дадвани С.А., Зуев В.М., Харнас С.С., Беляева Л.А., Лощенов В.Б. Фотодинамическая терапия в гинекологии (лит. обзор) // Лазерная медицина, 2000, №12,-с.72-80.

20. Колесников А.Н., Агафонов В.В., Беляева Л.А., Линьков К.Г., Лощенов В.Б. Распределение лазерного излучения в жировой и мышечной ткани // Фотодинамическая терапия, материалы III Всероссийского симпозиума, Москва, 1999,-с. 173-174.

21. Кузин М.И., Харнас С.С., Заводнов В.Я., Охотникова Н.Л., Лощенов В.Б., Волкова А.И., Беляева Л.А. Спектрально-флюоресцентный анализ АЛА-индуцированного протопорфирина IX в дифференциальной диагностике заболеваний желудка //Хирургия, журнал им. Н.И.Пирогова, 2000, №11, - с. 11-14.

22. Belyaeva L.A., Adamyan L.V., Stepanyan A. A., Linkov K.G., Loschenov V.B. Laser fluorescence spectroscopy with 5-aminolevulinic acid in operative gynecology // Laser Physics, 2004, v. 14, № 9, - p. 1207-1213.

23. Belyaeva L.A., Adamyan L.V., Kozachenko V.P., Stratonnikov A.A., Stranadko E.F., Loschenov V.B. Fluorescence diagnostics in oncological gynecology // Proc. of SPIE vol. 5068 (2003), Saratov Fall Meeting 2002: Optical Technologies in Biophysics and Medicine IV, ed. V.V. Tuchin, (SPIE, Bellingham, WA, 2003), - p. 55-60.

24. Belyaeva L.A., Adamyan L.V., Stranadko E.F., Loschenov V.B. Laser fluorescent spectroscopy with 5-aminolevulinic acid in operative gynecology //12-th International Laser Physics Workshop (LPHYS'03), Hamburg, Germany, 2003, P-3.4, -p. 200.

25. Belyaeva L.A., Adamyan L.V., Stranadko E.F., Loschenov V.B. The use of 5-aminolaevulinic acid in ptotodiagnostics of various gynecological diseases // 9th World congress ofthe international photodynamic association, Miyazaki (Japan), 2003, P - 050, -p. 51.

26. Belyaeva L.A., Adamyan L.V., Loschenov V.B. Laser fluorescent spectroscopy with 5-ALA in gynecology // 13-th International Laser Physics Workshop (LPHYS'04), Trieste, Italy, 2004, Book ofabstract, - p. 194.

27. Belyaeva L.A., Adamyan L.V., Loschenov V.B. Potentialities of fluorescent diagnostics with 5-aminolevulinic acid in gynecology // VIII International conference Laser and laser-information technologies: fundamental problems and applicatipns, ILLA/LTL 2003, Plovdiv -Smolyan (Bulgaria), 2003, - p. 195.

28. Belyaeva L.A., Adamyan L.V., Stranadko E.F., Loschenov V.B. Intraoperative express diagnostics of ovarian diseases and metastatic lesions by laser fluorescence spectroscopy with 5-aminolevulinic acid // 5-th international symposium on Photodynamic diagnosis and therapy in clinical practice, Brixen/Bressanone (Italy), 2003, - poster 7.

29. Stratonnikov A.A., Ermishova N.V., Loschenov V.B., Meerovich I.G., Belyaeva L.A., Kuzmin S.G., Luk'janetz E.A. Photodynamic efficiency of PP IX and hematoporphyrin derivatives activated by light at 670 nm // 10-th Congress of the European society for photobiology, Austria, 2003, P 050, - p. 90.

30. Zuev B.M., Belyaeva L.A., Tevlina E.V., Zaiceva G.U., Loschenov V.B. Autofluorescence diagnostics of gynecological diseases ex vivo // Proc. SPIE, Clinical Lasers and Diagnostics, Patrick Brouwer (ed)., 1/2001, v. 4156, - p. 26-30.

Формат 60x90/16. 1,5п.л. Бумага офсетная №1. Тираж 100 экз. Типография ВТИИ. Заказ 443 С.

St' t'< £• I

/ Г* 4

/ УК*"

( ¡¡Г429

Kjy

2 2 MAP 2005

Актуальность проблемы

В настоящее время в медицине накоплен огромный опыт диагностики и лечения онкологических заболеваний, который позволяет оценить важность и сложность своевременной диагностики рака и предраковых заболеваний. Эффективный диагностический поиск на ранних этапах гинекологической патологии способствует сохранению генеративной функции, улучшению качества жизни женщины, профилактике злокачественных заболеваний, а при наличии новообразований - повышает вероятность благоприятного прогноза. Многие методы визуализации (ультразвуковое сканирование, цветное допплеровское картирование, кольпомикроскопия, кольпоцервикоскопия, гистероскопия, лапароскопия, компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, радиоизотопные исследования), иммунологические (включая онкомаркеры, тест на опухолевый рост), цитогенетические и другие исследования уже произвели революцию в диагностике и лечении рака и предраковых заболеваний шейки и тела матки, вульвы и яичников, но не решили всех проблем [3, 4, 14, 15]. Разработка новых методов диагностики обусловлена необходимостью точных, быстро осуществимых диагностических критериев глубины, границы, особенностей роста онкопатологии, выявления наличия и распространенности метастазов.

Арсенал методов интраоперационной диагностики в гинекологии (визуальный осмотр, в том числе при эндоскопических исследованиях, пальпация, срочное морфологическое исследование) в полной мере не удовлетворяет хирургов, поскольку нередки ошибочные заключения как срочного гистологического или цитологического исследований, так и зрительного или пальпаторного осмотра, что влечет за собой принятие неадекватных решений на этом самом ответственном этапе диагностики.

Трудно переоценить значимость выявления и дифференциальной диагностики новообразований яичников. Рак яичников является одной из наиболее сложных проблем онкогинекологии: скрытое течение на первых этапах приводит к тому, что 80% больных раком яичников поступают в онкологические учреждения с III-IV стадиями процесса, и длительность их жизни в значительной степени коррелирует с возможностью максимального выявления и удаления первичной опухоли и метастазов. Информативность интраоперационного морфологического исследования при пограничных опухолях яичников в сопоставлении с окончательным гистологическим исследованием, по данным некоторых авторов, составляет 45% [8].

Скрининг рака шейки матки и его предшественников основывается на диагностической кольпоскопии, морфологических исследованиях, выявлении инфекционных агентов, особенно вируса папилломы человека [5, 10]. Несмотря на уменьшение частоты рака шейки матки в странах с хорошими скрининговыми программами, известными проблемами остаются ложноотрицательные результаты цитологического исследования и низкая специфичность кольпоскопии, требующие высокой компетентности специалистов [115].

Диагностировать истинный предрак вульвы и влагалища - дисплазии -невозможно без инвазивной процедуры прицельной биопсии. Рак вульвы в структуре заболеваемости злокачественными опухолями женских половых органов занимает четвертое место (после рака тела матки, шейки матки и яичников) [32]. Рак наружных гениталий, наиболее доступный для ранней диагностики, примерно в половине случаев выявляется в III стадии с метастазами в пахово-бедренные, подвздошные лимфатические узлы, что требует выполнения тяжелой обширной операции [13].

Рост заболеваемости раком эндометрия за последние 10 лет составил 29,5% [32]. Основной задачей клиницистов является выявление и своевременное лечение фоновых и предраковых состояний, при этом аблация эндометрия уже давно расценивается как альтернатива радикальному хирургическому лечению [28].

Частой клинической проблемой для женщин репродуктивного возраста является эндометриоз - второе по частоте заболевание репродуктивных органов, вызывающее бесплодие, боли и нарушение менструального цикла, требующее нередко повторных хирургических вмешательств. Диагностика аденомиоза при гистероскопии довольно сложна, и окончательный диагноз можно поставить только после гистологического исследования. Наружный генитальный эндометриоз клинически диагностируют на основании визуального осмотра. Однако эндометриоз может быть представлен очень изменчивыми формами, в результате чего нераспознанные очаги могут вести к рецидиву заболевания [2]. С этих позиций методы дополнительной визуализации эндометриоидных поражений являются перспективными и особенно актуальными для диагностики активного эндометриоза.

В связи с вышеизложенным, проблема ранней и уточняющей диагностики в гинекологии представляет значительный интерес, и в этом направлении идет поиск принципиально новых диагностических возможностей. Основное внимание в разработке методов диагностики нового поколения уделяется оптическим методам ввиду их высокой чувствительности, специфичности и неинвазивности. Существующие методы диагностики (рентгеновская, ультразвуковая, магнитно-резонансная) не позволяют обнаруживать рак на ранних стадиях или выявлять микрометастазы.

В последние 25 лет во всем мире интенсивно развиваются методы флюоресцентной диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований и целого ряда неопухолевых заболеваний [25, 26].

В настоящее время различают аутофлюоресценцию (эндогенную флюоресценцию), основанную на способности к флюоресценции веществ, входящих в состав тканей, и экзогенную флюоресценцию, суть которой заключается во введении больному фотосенсибилизаторов, обладающих свойством селективного накопления в быстропролиферирующих клетках и дающих более интенсивную флюоресценцию, чем аутофлюоресценция тканей.

Способностью к аутофлюоресценции обладают в основном следующие виды биологических молекул: триптофан, коллаген, эластин, НАД-Н, НАДФ-Н, флавины, порфирины. Их участие во многих сложных биохимических процессах в клетках обуславливает возможность выявления изменений в метаболизме клеток по анализу флюоресценции тканей. Изучение спектров аутофлюоресценции тканей - необходимый этап для последующего понимания и интерпретации спектров флюоресценции тканей, сенсибилизированных фотосенсибилизаторами, так как полученные результаты показывают, что при некоторых патологических состояниях наблюдается высокая интенсивность собственной флюоресценции за счет эндогенных флюорохромов [6, 131, 142].

Флюоресцентная диагностика с использованием фотосенсибилизаторов позволяет выявлять невидимые глазом патологические очаги с повышенной пролиферативной активностью. Кроме того, она необходима для обоснования проведения фотодинамической терапии и контроля эффективности лечения.

Флюоресцентная диагностика осуществляется методом спектрального анализа тканей организма. Оптическое зондирование основано на селективном возбуждении флюоресценции в тканях лазерным излучением или другим источником света определенной длины волны. Для этих целей используют как эндогенные, так и экзогенные фотосенсибилизаторы. Селективность их распределения в организме обеспечивается за счет биохимических и физиологических различий тканей и свойств межклеточной среды. Спектроскопический анализ флюоресцентных сигналов позволяет отличать здоровые и патологические биоткани друг от друга, при этом моментальная обработка получаемой информации позволяет корректировать тактику лечебного воздействия.

Одной из актуальных задач в проблеме ФД является поиск оптимального фотосенсибилизатора. Такие широко использующиеся в клинической практике фотосенсибилизаторы, как фотогем, фотофрин, фотосенс, накапливаются и длительное время сохраняются в коже, что сопряжено с риском развития фототоксических реакций и требует соблюдения светового режима.

5 -5-аминолевулиновая кислота (5-АЛК) и созданный на ее основе препарат Аласенс не являются фотосенсибилизаторами, но индуцируют в клетках синтез протопорфирина IX (Пп IX), обладающего интенсивной флюоресценцией и фотодинамической активностью. Биологической основой флюоресцентной диагностики является высокое накопление Пп IX в быстропролиферирующих клетках и быстрая утилизация его в нормальных клетках. Результатом этого является высокий флюоресцентный контраст между патологической и окружающей здоровой тканью. Быстрая продукция Пп IX и быстрая утилизация его в нормальных клетках путем превращения в фото-неактивный гем (что практически исключает кожную фототоксичность) обусловили широкие клинические исследования возможностей метода ФД с 5-АЛК [41].

Высокая информативность метода флюоресцентной диагностики с 5-АЛК доказана в мировой и отечественной практике при выявлении раннего рака мочевого пузыря [21, 101]. Опубликованные работы показали эффективность ФД с 5-АЛК в нейрохирургии [68, 85], в дифференциальной диагностике заболеваний полости рта [105], легких [87], желудка [7], пищевода [96], молочной железы [102], кожи [145].

В литературе описаны работы по флюоресцентной диагностике с 5-АЛК рака яичников [109], цервикальной интраэпителиальной неоплазии [83], кондилом, дисплазий вульвы и влагалища [63], эндометриоидных очагов [110].

Основными проблемами при использовании методов флюоресцентной диагностики в гинекологии являются определение концентрации фотосенсибилизатора в ткани, разработка диагностических критериев, подведение светового излучения к ткани и обеспечение необходимой плотности излучения.

Известно, что синий и зеленый свет, используемый зарубежными авторами для возбуждения флюоресценции и получения флюоресцентного изображения, хорошо поглощается гемоглобином крови, что не только уменьшает глубину исследования тканей (до 0,5 мм), но и приводит к ошибкам в определении реальной концентрации протопорфирина IX вследствие разной насыщенности гемоглобином исследуемых тканей. Это послужило основанием для проведения исследований по определению спектрального состава флюоресценции. Нами была выбрана методика измерения спектров флюоресценции, индуцированной красным лазерным излучением (длина волны 633 нм), при этом глубина оптической биопсии тканей составляет 1-3 мм [164].

Методы доставки лазерного излучения в полость матки сложны из-за анатомической формы полости матки [42, 146]. Необходимость осуществления равномерного облучения эндометрия важна для оценки интенсивности флюоресценции всей поверхности эндометрия и обоснования проведения фотодинамической аблации эндометрия.

Ввиду вышеизложенного, с целью увеличения диагностических возможностей в гинекологической практике проведено исследование эффективности флюоресцентной диагностики при различных заболеваниях женской репродуктивной системы, изучены особенности проведения и интерпретации результатов флюоресцентной спектроскопии.

Цель работы

Повышение эффективности ранней и дифференциальной диагностики гинекологических заболеваний с помощью метода лазерной флюоресцентной спектроскопии с препаратом Аласенс.

Основные задачи исследования:

1. Проанализировать результаты флюоресцентной спектрометрии тканей половых органов у экспериментальных животных в зависимости от времени после перорального введения Аласенса. Разработать в эксперименте способ внутриматочного подведения лазерного излучения для анализа состояния эндометрия методом флюоресцентной спектроскопии.

2. Оценить спектроскопические данные собственной флюоресценции тканей органов женской репродуктивной системы и флюоресценции Аласенс-индуцированного протопорфирина IX (Пп IX) в норме и при эндометриозе, доброкачественных и злокачественных заболеваниях яичников, вульвы, шейки и тела матки.

3. Провести анализ результатов флюоресцентной спектрометрии в зависимости от особенностей гормонального статуса организма (фазы менструального цикла, возрастных особенностей, приема гормональных препаратов или наличия гормонально-активных новообразований).

4. Оптимизировать методики проведения флюоресцентной диагностики при лапароскопии, лапаротомии, гистероскопии, наружно-внутреннем гинекологическом исследовании и исследовании удаленных органов и тканей.

5. Провести сравнение результатов спектрального анализа тканей в зависимости от характера патологического процесса и оценить эффективность метода флюоресцентной спектроскопии в диагностике эндометриоза, рака и предраковых гинекологических заболеваний.

Научная новизна.

Впервые предложен метод интраоперационной экспресс-диагностики злокачественных, пограничных и доброкачественных опухолей яичников, основанный на спектроскопическом исследовании свойств тканей с 5-аминолевулиновой кислотой.

Впервые изучены диагностические возможности метода флюоресцентной спектроскопии для уточнения характера и распространенности гинекологической патологии на основе регистрации флюоресценции 5-AJIK-индуцированного протопорфирина IX при возбуждении лазерным излучением (633 нм).

Предложены новые методики измерения флюоресценции биопсийного материала для диагностики патологических процессов.

Экспериментально обоснован способ измерения интенсивности флюоресценции эндометрия с использованием интралипида для анализа состояния эндометрия методом флюоресцентной спектроскопии.

Практическая значимость.

Определены спектрометрические критерии злокачественных и доброкачественных процессов яичников, шейки и тела матки, вульвы, а также метастатических поражений методом оптической экспресс-диагностики.

Выявлена зависимость результатов спектрального анализа тканей от характера пролиферативного патологического процесса, морфофункциональных особенностей исследуемых нормальных тканей и эндометриоидных гетеротопий.

Определены показания к флюоресцентной диагностике при различных гинекологических заболеваниях.

Разработаны методики проведения флюоресцентной диагностики при лапароскопии, лапаротомии, гистероскопии, наружно-внутреннем гинекологическом исследовании и исследовании удаленных органов и тканей.

Разработан в эксперименте способ внутриматочного подведения лазерного излучения, позволяющий анализировать интенсивность интегральной флюоресценции эндометрия.

Определены наиболее перспективные направления использования метода флюоресцентной диагностики с препаратом Аласенс в гинекологии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Лазерная флюоресцентная спектрометрия с 5-аминолевулиновой кислотой при возбуждении флюоресценции лазерным излучением (633 нм) позволяет прижизненно, в реальном масштабе времени дифференцировать злокачественные опухоли гениталий (яичников, шейки матки и вульвы) от доброкачественных опухолей и нормальных тканей, а также выявлять метастазы.

2. Разработанная методика измерения флюоресценции биопсийного материала повышает достоверность диагностики патологических процессов в гинекологии.

3. Спектроскопический способ измерения интенсивности флюоресценции эндометрия с использованием интралипида позволяет определять уровень накопления фотосенсибилизатора для анализа состояния эндометрия.

Внедрение в практику.

Метод лазерной флюоресцентной интраоперационной спектроскопии внедрен в практику гинекологических отделений Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Главного клинического госпиталя МВД России.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 30 печатных работ, в том числе 10 в центральной печати, 9 в зарубежной печати.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы экспериментально-клинических исследований, описания материалов и методов, результатов интраоперационной флюоресцентной диагностики, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 36 отечественных и 137 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 6 клиническими примерами, 46 рисунками и 12 таблицами.

ВЫВОДЫ

1. На основании исследования фармакокинетики Аласенс-индуцированного протопорфирина IX методом флюоресцентной спектроскопии выявлено наибольшее накопление Пп IX в половых органах экспериментальных животных в интервале 2-8 часов после перорального введения препарата и почти полная его элиминация из организма в течение 24 часов. Разработанный способ внутриматочного подведения лазерного излучения с использованием эластичного прозрачного баллона и интралипида позволяет анализировать интенсивность интегральной флюоресценции эндометрия.

2. Аутофлюоресцентные исследования позволяют выявить характерные спектральные особенности при эндометриоидных кистах, доброкачественных кистомах яичников, раке эндометрия, однако показатели флюоресценции имеют значительную вариабельность в разные фазы менструального цикла, что затрудняет анализ полученных результатов. В то же время, накопление Аласенс-индуцированного Пп IX в тканях репродуктивных органов существенно не зависит от фазы менструального цикла и возраста пациенток.

3. Разработанные методики проведения флюоресцентной диагностики позволяют успешно применять этот метод при лапароскопии, лапаротомии, гистероскопии, наружно-внутреннем гинекологическом исследовании и исследовании удаленных органов и тканей.

4. Лазерная флюоресцентная спектроскопия с препаратом Аласенс является эффективным методом экспресс-диагностики рака яичников, пограничных и доброкачественных опухолей яичников, рака эндометрия, шейки матки и вульвы, а также метастатических поражений яичников, брюшины, сальника и лимфатических узлов.

5. Имеющиеся особенности в накоплении Аласенс-индуцированного протопорфирина IX в эндометриоидных очагах брюшины, маточных труб, яичников у больных с различным клиническим течением заболевания свидетельствуют о пролиферативной активности эндометриоза.

6. Разработка скрининговых программ по выявлению предраковых и онкологических заболеваний шейки матки и вульвы с использованием флюоресцентной диагностики позволит прижизненно, в реальном масштабе, времени осуществлять диагностический поиск и расширит возможности ранней диагностики и динамического наблюдения. Свойство эндометрия накапливать 5-АЛК-индуцированный протопорфирин IX при его низком содержании в миометрии позволяет обосновать возможность аблации эндометрия методом фото динамической терапии без повреждения миометрия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Метод флюоресцентной диагностики с исследованием 5-AJIK-индуцированного Пп IX рекомендуется к применению в клинической практике как высокоинформативный экспресс-метод дифференциальной диагностики доброкачественных, пограничных и злокачественных опухолей яичников, рака шейки матки и вульвы, а также выявления метастазов. Он отличается простотой и безопасностью для пациентов и персонала.

2. Оптимальное время для проведения флюоресцентной диагностики — 38 часов после перорального приема Аласенса в дозе 25 мг/кг веса.

3. При регистрации флюоресценции Аласенс-индуцированного Пп IX в визуально неизмененной исследуемой ткани, превышающей диагностический критерий нормы, следует брать прицельную биопсию.

4. При флюоресцентной спектроскопии необходимо исследовать не менее 3 точек в патологической зоне и интактной ткани, располагая диагностический катетер перпендикулярно к исследуемой поверхности, что повышает точность диагностики. Спектрометрию эндоцервикса, биопсийного материала, тонких слоев тканей необходимо проводить по специальным методикам.

5. Для правильной интерпретации результатов спектрометрии необходимо учитывать вклад собственной флюоресценции в величину интенсивности общей флюоресценции.

6. Следует учитывать, что флюоресцентная диагностика некротизированных, кровоточащих тканей и на фоне гормонотерапии имеет сниженную информативность.

7. Необходимо соблюдать световой режим в первые сутки после перорального приема Аласенса для предупреждения возможного фотодерматоза.