Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций у гематологических больных

На правах рукописи

ТИХОМИРОВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕРПЕСВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ У ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

14.00.29 - Гематология и переливание крови 03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 2009 г

003474278

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом научном центре РАМН

Научные руководители:

Доктор биологических наук Филатов Феликс Петрович

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Савченко Валерий Григорьевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна Доктор медицинских наук, профессор Донское Сергей Иванович

Ведущая организация: Учреждение российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН

Защита состоится

На заседании Диссертационного Совета Д 001.042.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом научном центре РАМН по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом научном центре РАМН

Автореферат разослан 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Е.Е.Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Повсеместное распространение герпесвирусов (ГВ) в природе, разнообразие путей и способов их передачи, способность к пожизненной персистенции в организме хозяина и пантропность приводят к практически тотальной инфицированности взрослого населения этими вирусами (Исаков и др., 1999, Fields et al., 2007). У больных с иммунодефицитом (к которым относятся ВИЧ-инфицированные в стадии СПИДа, больные после трансплантации солидных органов, а так же гематологические больные) герпетические инфекции, как правило, характеризуются более тяжелым течением, и могут угрожать жизни пациентов при отсутствии своевременной диагностики и терапии (Fields et al.,2007, Анохин В.А. , 1999, Галстян Г.М., 2003). Тем не менее, в литературе практически не отражена проблема развития герпетических инфекций у больных гемобластозами, в том числе у больных острыми лейкозами. Не определены факторы риска развития этих осложнений у данной категории пациентов. Не определена значимость и необходимость проведения мониторинга маркеров герпесвирусных инфекций (ГВИ) у этих больных. В то же время, каждый раз при выявлении того или иного маркера возникает вопрос о необходимости проведения' противовирусной терапии токсичными препаратами.

Цель исследования

Определение частоты лабораторного выявления герпесвирусных инфекций у больных гематологического стационара.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Выявить наиболее значимые герпесвирусы у гематологических больных, ассоциированные с инфекционными осложнениями, возникающими в ходе химиотерапии основного заболевания;

2. Оценить информативность методов иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике герпесвирусов у гематологических больных;

3. Изучить выявление маркеров активных герпесвирусных инфекций в ходе первого курса химиотерапии у больных острыми лейкозами и сопоставить с развитием инфекционных осложнений;

4. Сравнить спектр герпесвирусных инфекций у гематологических больных и доноров крови и костного мозга;

Научная новизна.

1. Определена доля активных герпесвирусных инфекций в структуре инфекционных осложнений у больных гематологического стационара (до 64%).

2. Впервые в России у больных острыми лейкозами проведен мониторинг на расширенный спектр герпесвирусов в ходе полихимиотерапии основного заболевания и охарактеризована связь возникновения инфекционных осложнений с маркерами активных герпесвирусов.

3. Доказана необходимость комплексной диагностики герпесвирусов с использованием как метода ИФА, так и метода ПЦР.

4. Зафиксирована высокая частота выявления маркеров активных герпесвирусных инфекций у доноров крови (ВЭБ - 52%, ЦМВ - 7,52%, ВПГ 1-2-0,75%).

Научно-практическая значимость работы

1. Установлена связь между наличием маркеров активных герпесвирусных инфекций и инфекционными осложнениями у гематологических больных;

2. Показана актуальность исследования бронхоальвеолярной жидкости на присутствие ДНК герпесвирусов в случае развития пневмонии;

3. Определена частота выявления маркеров герпесвирусов у доноров крови и доноров стволовых гемопоэтических клеток;

Основные положения, выносимые па защиту

1. У гематологических больных, при развитии инфекционных осложнений, достоверно чаще определяются лабораторные признаки активации вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), реже цитомегаловируса (ЦМВ), еще реже — вируса простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ 1-2).

2. При развитии пневмонии у гематологических больных, в бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛ) достоверно чаще удалось определить ДНК ВЭБ, реже ДНК ВПГ 1-2, еще реже ДНК ЦМВ. При этом показано, что исследование БАЛ более информативно, чем исследование крови.

3. Метод ИФА и ПЦР в диагностике герпесвирусов взаимно дополняют друг друга.

4. В отличие от доноров крови, у больных в дебюте острого лейкоза достоверно чаще выявляли ДНК ВЭБ и ДНК ВПГ 1-2. Однако, перед вторым курсом химиотерапии частота выявления ДНК ВЭБ у больных острыми лейкозами становится статистически неотличима от частоты выявления маркеров активных герпесвирусов у доноров крови.

5. Выявление маркеров активации герпесвирусных инфекций у больных острыми лейкозами ассоциировано с проявлениями инфекционных осложнений в дебюте заболевания в 77,8% случаев, а в ходе лечения - в 100%.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на 11 научной конференции

европейского общества химиотерапии инфекционных болезней, XIV, XV, XVI

и XVII международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье»

(С.-Петербург 2005, 2006, 2007, 2008), на юбилейной конференции,

посвященной 75-летию республиканскому научно-практическому центру

гематологии и трансфузиологии МЗ республики Беларусь в рамках VI съезда

гематологов и траисфузиологов республики Беларусь «Актуальные проблемы

гематологии и трансфузиологии» (республика Беларусь 2007), на заседании

з

отдела молекулярной вирусологии НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского (г Москва, 2007).

Объем и структура работы

Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем диссертационной работы составляет 142 страница машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 17 таблицами, 20 рисунками. Список литературы включает 119 наименований: отечественные - 25, зарубежные - 94.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биологические материалы. Маркеры герпесвирусов определяли в следующих клинических материалах: сыворотка крови, мононуклеары периферической крови, мононуклеары костного мозга, бронхоальвеолярная лаважная жидкость (БАЛ).

Больные и доноры, включенные в исследование. Больные острыми лейкозами (ОЛ), находившиеся в отделении высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН (п = 48). Гематологические больные, находившиеся на стационарном лечении в других отделениях ГНЦ РАМН (п = 1303). Основные диагнозы: апластическая анемия, аутоиммунная гемолитическая анемия, различные варианты гемобластозов, различные варианты лимфом, лимфогранулематоз, множественная миелома. Доноры компонентов крови (п = 133). Доноры стволовых гемопоэтических клеток (п = 34).

Методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяли вирусспецифические иммуноглобулины классов М и G к различным белкам герпесвирусов (ГВ). Для определения IgM-UMB использовали коммерческие тест-системы фирм «Medac» и «Euroimmun» (Германия); титр IgG-ЦМВ определяли с помощью наборов фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Для

определения IgM и титра IgG к ВПГ 1-2, а так же IgM-VCA-ВЭБ, IgG-EA-ВЭБ и количество IgG-NA-ВЭБ использовали наборы фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Серологическое исследование проводилось согласно инструкции фирм-производителей, используемое разведение сывороток было 1:100. Для определения титров IgG-антител к ВПГ 1-2 и ЦМВ проводили последовательное двукратное разведение сывороток, начиная с 1:100, затем 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200 и т.д. В дальнейшем проводили анализ, согласно инструкции производителя. Титром считали последнее разведение исследуемой сыворотки, оптическая плотность которого превышала или была равна cut-off.

Для определения спектра IgG-антител человека к антигенам вируса Эпштейна-Барр в сыворотке крови методом Вестерн-блотта использовали коммерческий набор «Anti-EBV WESTERNBLOT(IgG)» фирмы «Euroimmun» (Германия). С помощью набора определяли IgG к следующим белкам ВЭБ:

> Вирусные капсидные антигены (VCA): р22, рЗЗ, р40, р41, р42, р65 и р125

> Ранние антигены (ЕА): р43, р45 и р93

> Ядерный антиген EBNA-1: р79

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Определение ДНК герпесвирусов в клинических образцах проводили с помощью коммерческих наборов реагентов «ДНК-сорб-Б», «АмплиСенс-СМУ», «АмплиСенс-EBV», «АмплиСенс-HSV 1,11» и «АмплиСенс-HHV 6» фирмы «ИнтерЛабСервис» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора согласно инструкциям фирмы-производителя. Чувствительность определения вирусной ДНК составляла 1000 ГЭ/млн кл (для крови) и 1000 ГЭ/мл (для БАЛ).

Интерпретация маркеров. Классификацию фаз ГВ-инфекции оценивали по комбинации выявления тех или иных вирусспецифических антител в сыворотках крови:

1. Отсутствие инфекции (серонегативность) — отсутствие IgG и IgM -антител;

2. Первичная инфекция - отсутствие IgG-антител при выявлении IgM или IgG-EA-ВЭБ-антител.

3. Активная инфекция - выявление IgM-антител и/или. IgG-EA-ВЭБ-антител при наличии IgG-антител;

4. Персистенция вируса - отсутствие IgM- и IgG-EA-ВЭБ-антител при наличии титра/количества IgG, превышающего нормальные значения в 4 и более раз (т.е. >1:3200 для ВПГ 1-2 или ЦМВ и >40 у.е. для ВЭБ)

5. Бессимптомная инфекция - отсутствие IgM- и IgG-EA-ВЭБ-антител при наличии титров IgG к ВПГ 1-2 или ЦМВ меньше 1:3200 и количестве IgG-EBNA-1-антител меньше 40 условных единиц;

Наличие положительного ПЦР-сигнала считали маркером активной инфекции.

Статистическая обработка данных проводилась методами описательной статистики, анализа таблиц сопряжённости (критерий хи-квадрат Пирсона) и корреляционного анализа (коэффициент корреляции Спирмена). Критическая величина уровня значимости (р) принята равной 0,05. Обработка данных проводилась с использованием программы BIOSTAT версия 4.03 Copyright© 1998 McGrawHill.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Маркеры герпесвирусов в гематологическом стационаре (ретроспективное

исследование). Ретроспективно были проанализированы базы данных по

выявлению маркеров герпесвирусов Лаборатории клинико-вирусологической

диагностики гепатитов и СПИД Гематологического Научного Центра РАМН

(ГНЦ РАМН) за 2 года. В исследование включались гематологические больные,

имеющие те или иные проявления герпетических инфекций. К проявлениям

герпетической инфекции, относили следующие: лихорадка неясного генеза,

пневмония и/или острая дыхательная недостаточность, стоматит, гингивит,

кожные высыпания, развитие неврологической и/или менингиальной

симптоматики, развитие реакции «трансплантат против хозяина» в случае

трансплантации аллогенного костного мозга.

6

Частота выявления серологических маркеров ГВ у гематологических больных представлена на рис. №1.

80« 70« 60« 50«№ 40« 3»% 20« 10« 0«

«*Д5%

«8ДО6

бесашшгпмшах

к псдккспрупщ» ш|екцм

■ игпоши шфкщн

ДР*7'^ ■ кервячш ЯЯШи&НЬ ннфекцня

1303

Рис.№1 Серологические маркеры герпесвирусов у гематологических

больных

Так, у гематологических больных частота выявления серологических маркеров активации ВЭБ составила 20%, ЦМВ - 11% и ВПГ 1-2 - 4%.Частота выявления молекулярных маркеров и их сочетания в крови гематологических больных, представлены на рисунке №2.

Рис. №2 ДНК герпесвирусов в крови гематологических больных

Как и в серологических исследованиях, чаще других методом ПНР выявлялись признаки активации ВЭБ. Так, в 43% образцов крови была обнаружена ДНК ВЭБ, в 10% - ДНК ЦМВ, в 2% - ДНК ВПГ 1-2.

При развитии у больных пневмонии, не купируемой антибактериальными и противогрибковыми препаратами, больным выполнялась бронхоскопия с забором БАЛ. Результаты исследования БАЛ представлены на рисунке №3.

Рис.№3 ДНК герпесвирусов в БАЛ гематологических больных

Таким образом, практически в каждом втором образце БАЛ обнаружена ДНК ВЭБ. Частота обнаружения ДНК ЦМВ и ВПГ 1-2 оказалась выше, чем в крови. При этом, ДНК ВПГ 1-2 определялась чаще, чем ДНК ЦМВ. Так, ДНК ЦМВ выявлялась в 21%, а ДНК ВПГ 1-2 в 30% образцов БАЛ.

У 47 гематологических больных с пневмонией было проведено исследование крови и БАЛ. Результаты представлены в табл.№1.

Таблица.№ 1. Сравнение частоты выявления ДНК герпесвирусов в БАЛ и крови

Количество образцов, в которых обнаружены ДНК любого

искомого герпесвируса

БАЛ Кровь Р

36 22 0,005

Таким образом, показано, что у больных с пневмонией большей диагностической ценностью обладает исследование БАЛ, т.к. в этом материале чаще выявляются герпесвирусные ДНК, нежели в крови.

Результаты сопоставления маркеров герпесвирусов у гематологических больных и доноров крови.

Для более полной оценки ассоциации активных ГВИ с симптомами инфекционных осложнений были выбраны больные, у которых исследование крови было выполнено как методом ИФА, так и методом ПЦР. Был проведен анализ маркеров ГВИ у 947 пациентов. В таблице №2 приведены результаты.

Таблица№2. Маркеры активации герпесвирусов у гематологических

больных

Вирус (маркеры активации) Больные (п = 947)

п % 21,33%

ЦМВ (ДНК, ^М, ДНК+1ёМ) 202

ВЭБ (ДНК, IgШgG-EA, ДНК+1&МЛ£0-ЕА) 609 64,31%

13111 1-2(ДНК, 1дМ, ДНК+^М) 51 5,39%

Как уже было показано, у гематологических больных при наличии симптомов герпетических инфекций, достоверно чаще выявляются маркеры активации ВЭБ (64,31%) (р = 0,001), реже ЦМВ (21,33%), и еще режеВПГ 1-2 (5,39%). Это говорит о высокой степени ассоциации активации ВЭБ с возникновением инфекционных осложнений у гематологических больных в ходе Г1ХТ основного заболевания.

Однако, такой профиль частоты выявления маркеров активации герпесвирусов не является специфической особенностью гематологических больных. Такое же распределение обнаружено и для доноров крови, выбранных в качестве контрольной группы. Результаты обследования доноров крови представлены в таблице №3.

Таблица №3. Маркеры активации герпесвирусов у доноров крови.

Вирус (маркеры активации) Доноры кровп (п = 133)

п % 7,52%

ЦМВ (ДНК, 1еМ, ДНК+1еМ) 10

ВЭБ (ДНК, ДНК+1рМЯвО-ЕА) 69 51,88%

впг 1-2 (ДНК, 1йм, днк+1еМ) 1 0,75%

У доноров крови достоверно чаще (р = 0,001) выявляются маркеры активации ВЭБ (52%), реже ЦМВ и ВПГ 1-2 (1% и 8% соответственно). Тем не менее, результаты обследования больных и доноров крови имели статистически значимые отличия, как это видно из таблицы №4.

Таблица №4 Сравнение частоты выявления маркеров активации герпесвирусов у гематологических больных и доноров крови

Вирус (маркеры активации) Больпые (п = 947) Доноры крови (п = 133) Р

ЦМВ (ДНК, ^М, ДНК+^М) 202 (21,33%) 10 (7,52%) 0,001

ВЭБ (ДНК, ^М/^-ЕА, ДНК+1ёМЛёа-ЕА) 609 (64,31%) 69 (51,88%) 0,007

ВПГ 1-2 (ДНК, ^М, ДНК+^М) 51 (5,39%) 1 (0,75%) 0,034

Таким образом, у гематологических больных отмечена более высокая, по сравнению с донорами крови, частота выявления маркеров активных герпесвирусных инфекций.

Современные тенденции в лабораторной диагностике заболеваний направлены на повсеместное внедрение метода ПЦР. Иногда проверенные рутинные методики полностью заменяются новыми, обладающими более высокой чувствительностью. Мы сравнили результаты выявления маркеров активных ГВИ у гематологических больных методами ИФА и ПЦР. Результаты представлены на рисунке №4

ю

(п = 947)

60% ¡0% 40%

20% 104 0%

64%

1

213%

_I_

18.42%

е ¡2

I

О

•л л к (2

цмв

53% I

6,79%

1,77«

I 1

1,77* 1В%

К

4

ч

(5

ВЭБ

ВПГ 12

032% ¡6 £

Рисунок №4 Сравнение методов ИФА и ПЦР в диагностике герпесвирусов

Так, для 64% больных, в крови которых были обнаружены те или иные маркеры активации ВЭБ, в 39% образцов была обнаружена только ДНК ВЭБ, в 18% - только антитела острой фазы инфекции. Одновременно ДНК и антитела обнаружены в 7% из 64% случаев. Похожие результаты получены и для ЦМВ и ВПГ 1-2. Таким образом, методы ИФА и ПЦР не исключают, а взаимно дополняют друг друга в диагностике герпесвирусов.

Маркеры герпесвирусов у больных острыми лейкозами (проспективное исследование). При анализе частоты выявления активных ГВИ у больных гематологического стационара не учитывалась стадия ПХТ основного заболевания. Для выяснения взаимосвязи клинических симптомов инфекционных осложнений с маркерами ГВ и стадией ПХТ, была обследована группа больных, страдающих острыми лейкозами. Лечение ОЛ предполагает применение цитостатических химиопрепаратов, таких как цитозар, даунорубицин, винкристин, 6-меркаптопурин и другие. Все цитостатические препараты оказывают иммунодепрессивное действие на организм, поскольку подавляют митоз не только бластных, но и нормальных иммунокомпетентных клеток. Их применение приводит к миело- и иммуносупрессии, которая

изначально также обусловлена течением основного заболевания. Таким образом, у больных данной категории развивается "двойная иммуносупрессия".

Обследовано 48 больных. Среди них 13 больных, страдающих острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), и 34 - острым миелобластным лейкозом (ОМЛ). В дебюте ОЛ активная ВЭБИ серологически была обнаружена у 8,33% больных, а активная ЦМВИ у 12,5% больных. По молекулярным маркерам признаки активации ВЭБ выявлялись у большей части пациентов (66,7%). Так же были зафиксированы единичные случаи других активных ГВИ.

Динамическое обследование больных ОЛ

Мониторинг серологических и молекулярных маркеров активных ГВИ у

больных ОЛ

Были проанализированы изменения спектра маркеров активных ГВИ у больных ОЛ в зависимости от срока проведения индукционной ПХТ. Получены графики, представленные на рисунках 5 и 6. Забор проб производился в день введения цитостатических препаратов

Рисунок №6 Динамика маркеров герпесвирусов у больных ОМЛ (п = 34)

На рисунках № 5 и 6 видно, что в обеих группах чаще других выявляется ДНК-ВЭБ. При этом, в ходе ПХТ основного заболевания при достижении { терапевтического эффекта наблюдается снижение числа больных, в материалах которых обнаруживались маркеры активной ВЭБ инфекции. Так, в группе ОЛЛ к 28 дню от начала терапии ДНК ВЭБ была обнаружена только у 2 из 8 пациентов, у которых эта ДНК была обнаружена в начале исследования. ^С-ЕА-ВЭБ были обнаружены у 1 больного как до лечения, так и в момент окончания наблюдения (примерно на 80 день). Маркеры других ГВИ определялись значительно реже. Оказалось, что активная ЦМВИ не была выявлена ни у одного из пациентов в начале исследования, и только у 1 больного при завершении первого курса ХТ были обнаружены 1§М-ЦМВ-антитела. Отмечено, что с 28 по 35 день у трети пациентов определялась ДНК ВГЧ-6. На протяжении всего периода наблюдения ни в одном случае не было выявлено 1дМ-ВПГ1 -2-антител; ДНК ВПГ1-2 была обнаружена у 1 больного (7,7%) в начале и у 2 (15,4%)- в конце исследования.

У пациентов группы ОМЛ в дебюте заболевания выявлялись лабораторные маркеры разных ГВ. Так же, как в группе ОЛЛ, у большинства больных (у 24 из 34) была обнаружена ДНК ВЭБ; ^С-ЕА-ВЭБ - у 6 человек. ДНК ЦМВ тестировалась в крови у 5 больных; ^М-ЦМВ - у 2 человек. В крови 2 лиц определялась ДНК ВПГ1-2; ^М-ВГТГ1-2 не были выявлены. ДНК ВГЧ-6 обнаружена в 4 образцах крови перед началом лечения. Было установлено, что к 16 дню от начала терапии количество клинических образцов, содержащих какие-либо маркеры ГВИ резко снизилось. На 25 день индукционного курса в крови у 7 пациентов обнаруживались только ДНК ВЭБ, ^в-ЕА-ВЭБ - у 4 и ДНК ВГЧ-6 - у 2 человек. Активные ЦМВИ и ВПГ1-2-инфекции не были зарегистрированы. В момент окончания исследования (примерно на 60-й день) активная ВПГ1-2-инфекция не была обнаружена ни в одном случае; однако у двух пациентов выявлены 1§М-ЦМВ-антитела. ДНК ВЭБ определялась в 10 образцах, 1§0-ЕА-ВЭБ - в 4 и ДНК ВГЧ-6 - в трех образцах.

Отмечено, что в процессе лечения ОЛ в обеих группах наблюдается снижение частоты выявления ДНК ВЭБ: в группе 1 - на 28 день, в группе 2 - на 16 день терапии. Однако с 21 по 35 день у пациентов группы 1 появились лабораторные маркеры ГВИ, не выявляемые ранее. У пациентов группы 2, наоборот, в ходе индукционного курса наблюдалось последовательное уменьшение количества образцов с маркерами активных ГВИ. Этот эффект может быть связан с цитотоксическим действием химиопрепаратов и с сокращением количества в кровяном русле как нормальных клеток-мишеней для репликации вируса, так и опухолевых, которые так же могут быть субстратами для репликации ВЭБ.

У 4 больных ОЛ в сыворотке крови были определены антитела острой фазы ВЭБ-инфекции методом ИФА. Мы также провели исследование сывороток крови этих пациентов методом Вестерн-блота, позволяющим выявить спектр антител к различным белкам вируса Эпштейна-Барр. Различные комбинации антител позволили классифицировать первичную инфекцию или реактивацию уже существующей ВЭБИ.

14

Было исследовано 6 сывороток крови от четырех пациентов. Результаты исследования представлены в таблице №5.

Таблица №5 Интерпретация результатов иммуноблота у больных острыми лейкозами

№ Биплан Д»*« Белка штртрпади

ТСА и НА ас*

р125 Р*5 р42|р41 Р*» рЗЗ р7.7. р93 Р« Р" р7» р27

I К-да 28.03.2005 + + + + + + + + рсдЕТхиды

2 К-да 30.05.2005 4- + + + + + + + рагдиця

3 К-да 13.07.2005 + + + + + + ГСШШИЦП

4 Сов 12.02.2007 + + + + + реиппцп

5 Л-ОБ 11.12.2006 + + + иввднжшфнж итфгщц

б Б-ва 12.02-2006 + + + + + + + рсасгшацы Апвдшфш шфекцхн

Во всех случаях отмечена реактивация ВЭБ-инфекции. Ни у одного из

пациентов не выявлена первичная инфекция или реинфекция. Однако, у одного и того же пациента (К-да) результаты иммуноблота отличаются в зависимости от даты забора крови, т.е. наблюдается динамика гуморального противовирусного ответа. Так, изначально определявшиеся 1§0 к р125, через 2 месяца уже не выявляются. Через 3,5 месяца так же не выявляются к р42, определявшиеся до этого. Кроме того, появляются к р41, которые ранее не были обнаружены. Суть такой динамики пока не вполне ясна. Это может быть связано как с особенностями патогенеза вируса, так и с особенностями гуморального ответа у конкретного пациента

При сравнении спектра маркеров активных ГВИ у больных острыми лейкозами с донорами крови были получены данные, представлены в таблицах № 6 и 7.

Таблица №6 Сравнение частоты выявления маркеров активных ГВИ у больных в дебюте острого лейкоза и доноров крови

Вирус (маркеры активации) Больные в дебюте ОЛ (п = 48) Доноры крови (п = 133) Р

ЦМВ (ДНК, 1§М, ДНК+^М) 8 (16,7%) 10 (7,5%) 0,125

ВЭБ (ДНК, ^МЛ§0-ЕА, ДИК+^М/ДО-ЕА) 38 (79,2%) 69 (51,9%) 0,001

ВПГ 1-2 (ДНК, ^М, ДНК+^М) 4 (8,3%) (0,8%) 0,023

Таблица №7 Сравнение частоты выявления маркеров активных ГВИ у больных острыми лейкозами перед консолидирующим курсом ПХТ и

доноров крови

Вирус (маркеры активации) Больные перед 2 курсом ПХТ (11 = 45) Доноры крови (п = 133) Р

ЦМВ (ДНК, ^М, ДНК+^М) 4 (8,9%) 10 (7,5%) 0,921

ВЭБ (ДНК, ^М/ДО-ЕА, ДНК+1вМ/1ёС-ЕА) 18 (40%) 69(51,9%) 0,334

ВПГ 1-2 (ДНК, ^М, ДНК+^М) 1 (2,2%) 1 (0,8%) 0,971

В дебюте острого лейкоза у больных статистически достоверно чаще выявляются маркеры активации ВЭБ и ВПГ 1-2. Однако, перед вторым (консолидирующим) курсом ПХТ, при достижении терапевтического эффекта, у больных ОЛ этот параметр становится статистически неотличим от доноров.

Связь маркеров активных ГВИ с инфекционными осложнениями у больных ОЛ в ходе индукционной терапии. Данные о взаимосвязи выявления маркеров активных ГВИ в дебюте ОЛ с возникновением симптомов инфекционных осложнений представлены в таблице № 8

Таблица №8 Симптомы инфекционных осложнений у больных ОЛ с маркерами активных ГВИ

всего больных с маркерами активных инфекций из них, случаев инфекционных осложнений

лихорад ка н.г. пневмо ния пораж ения кожи мукоз ИТ энтеро колит энце фал ИТ 0 Суммар но (по больны м) 28

дебют 36 21 6 8 8 2

в ходе терапии 33 23 13 5 13 3 1 33

Так в дебюте ОЛ в 78% случаев наличие тех или иных симптомов совпадало с выявлением в материалах от больных маркеров активных ГВИ, а в ходе ПХТ -в 100% случаев.

В ходе индукционной ПХТ у 12 пациентов развилась пневмония. Этим больным была выполнена бронхоскопия. В 7 из 12 образцов БАЛ обнаружена ДНК ВПГ1-2: в 3 случаях - вместе с ДНК ВЭБ, в 1 - вместе с ДНК ЦМВ. В половине образцов была выявлена ДНК ВЭБ. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об ассоциации пневмонии у больных ОЛ с ГВ (10 из 12 образцов БАЛ содержат ДНК разных герпесвирусов). При этом в отличие от гематологических больных с другими нозологиями, у данной категории пациентов чаще в БАЛ детектировалась ДНК ВПГ 1-2, а не ВЭБ. Для 8 пациентов, с пневмонией, одновременно проводили вирусологическое исследование крови и БАЛ. ДНК ВЭБ была обнаружена и в крови, и БАЛ у 2 больных; других совпадений не было установлено. Таки образом, у данных больных так же более актуально исследование БАЛ, нежели крови.

Обсуждение

У половины доноров были зафиксированы признаки реактивации ВЭБ. Несмотря на то, что степень выявления ДНК ВЭБ достоверно меньше, чем у гематологических больных (64% против 52%, р = 0,007), этот показатель оказался значительным. Во многих странах, в частности, в США, в Германии, в Нидерландах, введено обязательное тестирование донорской крови на ЦМВ. У 2% доноров станции переливания крови ГНЦ РАМН в сыворотке крови

обнаружены ^М-ЦМВ, а у 1,5% - ДНК ЦМВ. Большое количество работ

посвящено обсуждению роли ЦМВ в возникновении различных

посттрансплантационных и посттрансфузионных осложнений. В Лаборатории

бактериологии и профилактики гепатита и СПИД ГНЦ РАМН было показано,

что 4% посттрансфузионных гепатитов вызвано именно ЦМВ (Голосова Т.В. и

др., 1983). В той же Лаборатории отмечали, что у ряда реципиентов

эритроцитарной массы, не освобожденной от лейкоцитов, наблюдались

лабораторные признаки реактивации ЦМВ-инфекции (Гаранжа Т.А. и др.,

2000). В отличие от доноров крови больные гематологической клиники

находятся, как правило, в состоянии иммуносупрессии, вызванной течением

основного заболевания и проводимой у них ПХТ. Принято считать, что это

состояние способствует активации герпесвирусных инфекций. У подавляющего

числа больных с патологией системы крови (до 72%) регистрируется

персистирующая ВПГ1-2-инфекция, о чем свидетельствует титры ^в-антител,

превышающие норму в 4 и более раз. В тоже время, маркеры активной ВПГ1-2

инфекции (1§М или ДНК) выявляются в незначительном количестве проб.

Персистирующая ВЭБИ или ЦМВИ выявляется у этих пациентов значительно

реже (у 35% и у 17% лиц соответственно). При этом в клиниках ГНЦ лишь

небольшая часть пациентов страдала от классических проявлений

герпетической инфекции, таких как кожные высыпания и поражения слизистой.

Возникновение лихорадки неясного генеза различной длительности и тяжести,

устойчивой к действию антибактериальной терапии, а также гепато- и

спленомегалию, ретинит или хориоретинит, цитопению неясного генеза,

появление кожных высыпаний и т.п., очень редко связывают с активацией

ВЭБИ. Однако, маркеры активной ВЭБИ выявляются у 64% больных.

Мониторирование этой инфекции представляется весьма целесообразным у

данной категории больных. Реактивация ГВИ, а так же тяжесть течения

заболевания связаны с состоянием иммунного статуса пациента. Различные

программы химиотерапии вызывают разную нагрузку на иммунную систему.

Химиопрепараты, используемые в гематологической клинике, по воздействию

на иммунную систему можно разделить на две группы. Одна из них содержит

18

ингибиторы митоза опухолевых клеток, а так же клеток кроветворной системы — цитостатические препараты (миелосупрессоры). Препараты другой группы действуют непосредственно на образование иммуноглобулинов и оказывают антигистаминное действие, т.е. являются прямыми иммуносупрессорами. Сведений о том, как связано появление герпесвирусных лабораторных маркеров с той или другой иммуносуппрессивной терапией, практически нет. Проводимые прежде исследования не предусматривали комплексного анализа герпесвирусных инфекций у таких пациентов, ограничиваясь изучением какого-либо одного герпесвируса, чаще всего ЦМВ, у больных после трансплантации аллогенного костного мозга (Троицкая В.В. и др., 2005). Очень мало работ посвящено другим герпесвирусным инфекциям у таких пациентов. Очевидно, что такой подход ограничен. Если о симптомах ЦМВ инфекции гематолог информирован достаточно хорошо, то активация вируса Эпштейна-Барр зачастую совсем не рассматривается — в силу отсутствия этиотропных препаратов подавления его репликации, а также многообразия клинических проявлений. Клинические симптомы ЦМВ инфекции и ВЭБ инфекции весьма схожи и требуют дифференциальной лабораторной диагностики. Проявлением герпесвирусной инфекции у гематологических больных является поражение бронхов и легких - увеличение бронхолегочных лимфоузлов и пневмония. При обследовании 450 БАЛ, полученных от больных с пневмонией в 2005 и 2006 годах, обнаруживались ЦМВ-ДНК, ВЭБ-ДНК и ДНК-ВПГ1-2: в 21%, 43,6% и 29,3% образцов соответственно. Отмечались случаи микст-инфекции: ЦМВ и ВЭБ -в 5-10%, ВЭБ и ВПГ1-2 -в 6-12%, ЦМВ и ВПГ1-2 - в 3-3,5% случаев. В 3-5% случаев в БАЛ были определены ДНК всех изучаемых вирусов (рис. 2 и 3). У больных гематологического стационара при развитии пневмонии достоверно чаще обнаруживался ВЭБ (до половины больных), нежели другие герпесвирусы (ЦМВ только у пятой части, а ВПГ1-2 — у третьей части пациентов). В БАЛ чаще, чем в крови определялась ДНК ВПГ 1-2 третьем образце. При одновременном исследовании крови и БАЛ у 47 больных было обнаружено, что в БАЛ достоверно чаще выявляются ДНК различных герпесвирусов, что делает исследование БАЛ при развитии пневмонии более

19

актуальным, нежели исследование крови. Аналогичные результаты, подтверждающие этот тезис были получены и для больных ОЛ. Необходимо тщательно выбирать материал для исследования, т.е. локальная репликация вируса в конкретном органе или ткани, может дать неверную информацию об инфекции. Результаты сравнения частоты выявления сигналов активации герпесвирусов методами ИФА и ПЦР показали, что для более надежного результата диагностику герпесвирусов целесообразно проводить, используя, по меньшей мере, два метода, ориентированных на различные мишени. Один метод, даже самый современный, не может полностью заменить другой.

Использованные нами ИФА-тест-системы для выявления ^0-ВГ1Г 1-2 сконструированы на основе структурных (поздних) антигенов вируса. Таким образом, высокие титры ^Б-антител к ним свидетельствуют о завершенных вирусспецифических синтезах, т.е. о формировании полноценного вирусного потомства, а следовательно о продуктивной вирусной инфекции. Особенностью ГВ-инфекции у больных с ОЛ было существенное превышение нормального количества антител к белку ВЭБ ЕВЫА-1 в сыворотке крови (46% больных ОЛЛ и у 68% больных ОМЛ), и это не было следствием общего повышения уровня иммуноглобулинов класса в в организме больного. Иммунологические исследования показали нормальную секрецию в организме пациентов с ОМЛ, а у больных с ОЛЛ - даже снижение уровня ^в-антител в дебюте заболевания. Ни в одном случае не было установлено гиперглобулинемии. С подобными проблемами также сталкивались другие исследователи (Меликян А.Л. и др., 2007) при анализе серологических показателей ВЭБИ у пациентов с затяжной рецидивирующей лимфаденопатией. Оказалось, что у пациентов с лимфаденопатией в сыворотках крови количество ^С-ЕВМА-1 значительно превышало нормальные значения, но этот параметр находился в обратной зависимости с количеством бета-глобулинов: чем больше антител к ЕВНА-1, тем ниже уровень бета-глобулинов. Было показано, что спектр и количество вирусспецифических иммуноглобулинов различных классов обусловлен именно вирусной инфекцией.

Активность вируса и стадия его жизненного цикла определяет количество тех или иных антител. Однако в нашем исследовании осталось не вполне ясно, почему при таких высоких тирах антител к ВПГ1-2 и при наличии иммуносупрессии нет явных клинических проявлений инфекции, вызванной вирусами простого герпеса.

По нашим данным, серологические маркеры активных ГВИ несколько отличались в зависимости от группы больных. Так, в группе больных OJIJI ни у одного из тринадцати больных в дебюте заболевания не обнаруживались IgM-антитела к ЦМВ, в то время как этот маркер определялся у 5 из 34 больных OMJI. До начала ПХТ только у 1 пациента с ОЛЛ определялись IgG-EA-ВЭБ, а в группе больных с OMJI - у 6 человек. IgM-BiIT-1-2 не были обнаружены ни у одного из 48 пациентов. Таким образом, в дебюте заболевания у больных ОЛЛ реже, чем в группе с ОМЛ выявлялись серологические маркеры активной фазы вирусной инфекции.

У 4 больных ОЛ в сыворотке крови методом ИФА определялись IgG-EA-

ВЭБ. Заметим, что используя коммерческую ИФА-тест-систему, ни у одного из

этих пациентов мы не обнаружили IgM-VCA-ВЭБ. Однако, исследуя сыворотки

этих пациентов методом Вестерн-блота, мы обнаружили антитела к различным

белкам вируса Эпштейна-Барр, входящим в состав группы вирусных

капсидных антигенов - VCA, а именно к р22, рЗЗ, р40, р42, р65, р125. Также

мы выявили антитела к белкам р93 и р45, входящих в состав «раннего

антигена» ВЭБ, и к белку р79, относящемуся к ядерным антигенам EBNA. На

основании полученного спектра антивирусных антител можно сделать

заключение, что специфический иммунный ответ у этих пациентов

соответствует реактивации ВЭБИ или поздней фазе инфекции. Речь не идет о

неспецифическом белок-белковом взаимодействии, вызванном например,

нарушением кроветворения в организме больного ОЛ. Несоответствие между

результатами ИФА и иммуноблота можно объяснить различными антигенами

вируса, используемыми для анализа. В ИФА для выявления белков вирусного

капсидного антигена был использован лишь р18, а в качестве раннего антигена

21

- р138. Именно эти белки отсутствовали в спектре иммуноблота. Для одного пациента, в сыворотке крови которого методом ИФА мы выявили антитела к раннему антигену ВЭБ, в иммуноблоте таковые обнаружены не были. Таким образом, мы делаем вывод, что при использовании даже только серологических методов исследования у одного и того же лица можно получить различные результаты. Этот факт не означает преимущества одного метода перед другим, а лишь диктует необходимость в использовании различных методов диагностики ГВИ для получения более достоверного результата.

В ходе ПХТ основного заболевания у больных острыми лейкозами происходило выраженное снижение частоты выявления ДНК ВЭБ. Этот эффект возможно связан с цитотоксическим действием химиопрепаратов и с сокращением количества в кровяном русле нормальных клеток-мишеней для репликации вируса до значений ниже 1000/мкл крови. Опухолевые клетки могут быть субстратом для репликации ВЭБ, в пользу чего также говорит следующий факт: у 19 пациентов, был исследован костный мозг до и после ПХТ. У 12 из них ДНК ВЭБ была обнаружена в костном мозге до начала терапии и только у 5 - после ее завершения. В период ремиссии, когда количество опухолевых клеток в костном мозге минимально, вирусспецифическая ДНК была выявлена у четверти больных, что, вероятно, указывает на репликацию ВЭБ в бластных клетках.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что у гематологических больных, при развитии инфекционных осложнений, достоверно чаще определяются лабораторные признаки активации ВЭБ (64,31%), реже ЦМВ (21,33%) и ВПГ 1-2 (5,39%) (р = 0,0001).

2. При развитии пневмонии у гематологических больных, в БАЛ достоверно чаще удалось определить ДНК ВЭБ (43,6%), реже ВПГ 1-2 (29,6%) и ЦМВ (21%). При этом показано, что исследование БАЛ более информативно, чем исследование крови (р = 0,005).

3. Показано, что метод ИФА и ПЦР в диагностике герпесвирусов взаимно дополняют друг друга. Одновременно признаки активации герпесвирусов двумя методами выявлялись не более чем у 7% из 64% больных с маркерами активных герпесвирусных инфекций.

4. В отличие от доноров крови, у больных в дебюте острого лейкоза достоверно чаще выявляли ДНК ВЭБ (79,2% против 51,9%, р = 0,001) и ДНК ВПГ 1-2 (8,3% против 0,8%, р = 0,023). Однако перед вторым курсом химиотерапии частота выявления маркеров активных герпесвирусов становится статистически неотличима от таковой у доноров крови (ВЭБ -40%, р = 0,3; ВПГ 1-2 - 2%, р = 0,9).

5. Выявление маркеров активных герпесвирусных инфекций у больных острыми лейкозами ассоциировано с проявлениями инфекционных осложнений в дебюте заболевания в 77,8% случаев, а в ходе лечения - в 100% (р = 0,001).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

• ЕА - ранний антиген (early antigen)

• IgG — иммуноглобулины класса G

• IgM - иммуноглобулины класса М

• NA - ядерный антиген (nuclear antigen)

• VCA - вирусный капсидный антиген (viral capsid antigen)

• БАЛ - бронхоальвеолярная лаважиая жидкость

• ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

• ВПГ 1-2 - вирус простого герпеса 1 и 2 типов

• ВЭБ - вирус Эпштейна-Барр

• ГВ - герпесвирусы

• ГВИ - герпесвирусные инфекции

• ГНЦ—гематологический научный центр

• ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

• ИФА - метод иммуноферментного анализа

• О Л—острый лейкоз

• ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

• ОМЛ — острый миелобластный лейкоз

• ПХТ — полихимиотерапия

• ПЦР — полимеразная цепная реакция

• СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

• ЦМВ — цитомегаловирус

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Меликян А.Л., Гаранжа Т.А., Тихомиров Д.С. и др. «Вирус Эпштейна-Барр у больных с затяжной лимфаденопатией». Гематология и трансфузиология, 2007, т.52, №4,с. 21-27.

2. Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Троицкая В.В. и др. «Лабораторная диагностика герпесирусных инфекций у больных острыми лейкозами». Вопросы вирусологии, 2009, №1, с.19-22.

3. Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Филатов Ф.П. и др. «Динамическое исследование герпесвирусных инфекций у больных острыми лейкозами». Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, 2006, Т.10, №2, с.38-39.

4. Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Туполева Т.А. и др. «Особенности диагностики герпесвирусов у гематологических больных». Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, том 12, № 2 (25), 2008, с.31.

5. Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Троицкая В.В. и др. «Герпесвирусные инфекции у больных острыми лейкозами». Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, С.-Пб., 2005, Т.9, №2, с. 84.

6. Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Суворова П.А. и др. «Различия в выявлении ДНК вируса Эпштейна-Барр и герпесвируса человека типа 6 у больных острым миелобластным и лимфобластным лейкозом». Русский журнал СПИД рак и общественное здоровье, Т.12, № 2 (25), 2008, с.31-32.

7. Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Суворова П.А. и др. «Маркеры герпесвирусных инфекций у доноров крови и костного мозга». Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, 2007, Т. 11, №1, с. 97 - 99.

8. Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Игнатова E.H. и др. «Распространение герпесвирусов у больных, подвергшихся спленэктомии». Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, 2006, Т. 10, №2, с. 39-40.

9. Игнатова E.H., Ярославцева Н.Г., Тихомиров Д.С. и др. «Вирусспецифические нуклеиновые кислоты в образцах костного мозга гематологических больных». Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, Т.12, № 2 (25), 2008, с. 17-18.

10.Гаранжа. Т.А, Цветаева Н.В., Тихомиров Д.С. и др. «Динамика маркеров вирусных инфекций в ходе лечения больных аутоиммунной гемолитической анемией». Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье», 2006, Т. 10, №2, с. 10-11.

11.Гаранжа Т.А., Ярославцева Н.Г, Тихомиров Д.С. и др. «Учет вирусных инфекций в дифференциальной диагностике заболеваний системы

крови». Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье", С.-Пб., 2005, т.9, №2, с. 54.

12.Гаранжа Т.А., Туполева Т.Д., Тихомиров Д.С. и др. «Диагностика герпесвирусных инфекций в гематологическом стационаре». Новое в трансфузиологии, 2006, №42, с. 74-81.

13.Гаранжа Т.А., Меликян А.Л., Тихомиров Д.С. и др. «Герпесвирус 4-го типа (ВЭБ) и затяжная лимфаденопатия». Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, том 12, № 2 (25), 2008, с. 14-15.

14.V.G.Savchenko, V.V. Troitskaya, D.S. Tikhomirov et.al. «Herpes viruses in hematology practice». Book of abstracts of 5th Russian-German conference, 24-26 march, 2008, p.25-26.

Подписано в печать: 26.05.2009

Заказ № 2154 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы.

Повсеместная распространенность герпесвирусов (ТВ) в природе, разнообразие путей и способов их передачи, способность к пожизненной персистенции в организме хозяина и пантропность приводят к практически тотальной инфицированности взрослого населения этими вирусами [1, 2, 5, 6]. У больных с иммунодефицитом, к которым относятся ВИЧ-инфицированные в стадии СПИДа, больные после трансплантации солидных органов, а так же гематологические больные, герпетические инфекции, как правило, характеризуется более тяжелым течением, и могут угрожать жизни больного при отсутствии своевременной диагностики и терапии [1, 2, 5, 9, 10,75,91,92]. На первых этапах химиотерапии гематологического заболевания и при трансплантации аллогенного костного мозга, когда индуцируется глубокая иммуносупрессия и увеличивается вероятность развития герпетической инфекции, особенно важна своевременная и адекватная лабораторная диагностика этих инфекций [6,7 9,14,19,80].

В клинической практике часто возникают сложности в трактовке результатов лабораторных исследований, зачастую довольно противоречивых, что затрудняет установление этиологии инфекционного осложнения [9,10,14,42,91,92]. ГВИ может протекать в виде мононуклеозоподобного синдрома, тромбоцитопении, нейтропении, гепатита, энтерита, пневмонии.

Инфекции, вызванные разными вирусами герпетической группы, могут иметь одинаковые симптомы, что обусловливает необходимость дифференциальной диагностики.

ЦМВ-инфекция является частым осложнением у больных после трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток. Этой проблеме посвящены многочисленные исследования. Однако и здесь имеется много противоречивых данных, требующих дальнейшего изучения. Практически не 7 отражена в литературе проблема развития ГВИ у больных гемобластозами, в том числе у больных острыми лейкозами. Не определены факторы риска развития этих осложнений у данной категории больных. Не разработаны принципы профилактики этих инфекций на фоне цитостатической химиотерапии. Не определена значимость и необходимость проведения мониторинга маркеров ГВИ у этих больных. В то же время каждый раз при выявлении того или иного маркера ГВИ встает вопрос о необходимости проведения противовирусной терапии токсичными препаратами. Все это послужило поводом к проведению собственного исследования по мониторингу ГВИ у различных групп гематологических больных.

Цель работы.

Определить частоту лабораторного выявления герпесвирусных инфекций у больных гематологического стационара

Задачи работы

• Выявить наиболее значимые герпесвирусы у гематологических больных, ассоциированные с инфекционными осложнениями, возникающими в ходе химиотерапии основного заболевания

• Оценить информативность методов ИФА и ПЦР в диагностике герпесвирусов у гематологических больных

• Провести динамическое обследование больных острыми лейкозами на маркеры активных герпесвирусных инфекций в ходе первого курса химиотерапии

• Сравнить спектр герпесвирусных инфекций у гематологических больных и доноров крови и костного мозга

Научная новизна

• Определена доля активных ГВИ в структуре инфекционных осложнений у больных гематологического стационара. Выявлен наиболее часто встречающийся герпесвирус у гематологических больных.

• Установлена частота и динамика выявления активных герпесвирусных инфекций у больных острыми лейкозами.

• Определена специфичность выявления различных маркеров активных герпесвирусных инфекций у больных острыми лейкозами и охарактеризована их связь с инфекционными осложнениями.

Научно-практическая ценность работы

• Определены объем и сроки проведения вирусологического обследования больных острыми лейкозами, позволяющие снизить вероятность развития ГВИ в процессе индукции ремиссии.

• Установлена связь между наличием маркеров активных герпесвирусных инфекций и инфекционными осложнениями у гематологических больных

• Определена частота выявления маркеров герпесвирусов у доноров крови и стволовых гемопоэтических клеток.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У гематологических больных, при развитии инфекционных осложнений, достоверно чаще определяются лабораторные признаки активации ВЭБ, реже ЦМВ и ВПГ 1-2.

2. При развитии пневмонии у гематологических больных, в БАЛ достоверно чаще определяется ДНК ВЭБ, реже ВПГ 1-2 и ЦМВ. При этом исследование БАЛ более информативно, чем исследование крови.

3. Метод ИФА и ПЦР в диагностике герпесвирусов взаимно дополняют друг друга.

4. У больных в дебюте острого лейкоза, выявляются лабораторные признаки активации ВЭБ и ВПГ 1-2 достоверно чаще, чем у доноров крови. Однако перед вторым курсом химиотерапии частота выявления маркеров активных герпесвирусов становится статистически неотличима от таковой у доноров.

5. Выявление маркеров активных герпесвирусных инфекций у больных острыми лейкозами, как правило, было ассоциировано с проявлениями инфекционных осложнений как в дебюте заболевания, так и в ходе первого курса химиотерапии.

Апробация работы

Результаты работы представлены на XIV, XV, XVI и XVII международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье» (С.Петербург 2005, 2006, 2007, 2008), на Юбилейной конференции, посвященной 75-летию Республиканскому Научно-практическому Центру Гематологии и Трансфузиологии МЗ р. Беларусь в рамках VI Съезда гематологов и трансфузиологов р. Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии» (р. Беларусь 2007), На заседании отдела молекулярной вирусологии НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского (г.Москва 2007)

Объем и структура работы

Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем диссертационной работы составляет 142 страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 17 таблицами, 21 рисунками. Список литературы составляет 119 наименований, 25 из которых отечественных, 94 зарубежных

Выводы

1. Установлено, что у гематологических больных, при развитии инфекционных осложнений, достоверно чаще определяются лабораторные признаки* активации ВЭБ (64,31%), реже ЦМВ (21,33%) и ВПГ 1-2 (5,39%) (р = 0,0001).

2. При развитии пневмонии у гематологических больных, в БАЛ достоверно чаще удалось определить ДНК ВЭБ (43,6%), реже ВПГ 1-2 (29,6%) и ЦМВ (21%). При этом показано, что исследование БАЛ более информативно, чем исследование крови (р = 0,005).

3. Показано, что метод ИФА и ПЦР в диагностике герпесвирусов взаимно дополняют друг друга. Одновременно признаки активации герпесвирусов двумя методами выявлялись у 1-7% из 64% больных с маркерами активных герпесвирусных инфекций.

4. В отличие от доноров крови, у больных в дебюте острого лейкоза достоверно чаще выявляли ДНК ВЭБ (79,2% против 51,9%, р = 0,001) и ДНК ВПГ 1-2 (8,3% против 0,8%, р = 0,023). Однако'перед вторым курсом химиотерапии частота выявления маркеров ^ активных герпесвирусов становится статистически неотличима от таковой у доноров крови (ВЭБ - 40%, р = 0,3; ВПГ 1-2 - 2%, р = 0,9).

5. Выявление маркеров активных герпесвирусных инфекций у больных острыми лейкозами ассоциировано с проявлениями инфекционных осложнений в дебюте заболевания в 77,8% случаев , а ходе лечения в 100% (р = 0,001).

Благодарности

Пользуясь случаем, автор хотел бы поблагодарить директора ГУ ГНЦ РАМН академика Воробьева. А.И. за предоставленную возможность выполнить настоящую работу, своих научных руководителей: заведующего Лабораторией клинико-вирусологической диагностики гепатитов и СПИД, д.б.н. Филатова Ф. и руководителя отделения высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга, чл.-корр. РАМН Савченко В.Г. за оказанную помощь в решении теоретических и практических вопросов при выполнении диссертационной работы, ценные советы и рекомендации. Автор выражает глубокую благодарность старшему научному сотруднику к.б.н. Гаранжа Т.А. и всему коллективу лаборатории за посильную помощь при выполнении диссертационной работы; врачу отделения высокодозной химиотерапии и трансплантации костного мозга, к.м.н. Троицкой В.В., а так же всему коллективу отделения за помощь и понимание в ходе выполнения совместной работы; заведующей лабораторией гуморального иммунитета, Варламовой Е.Ю., сотрудникам станции переливания крови ГНЦ РАМН за предоставленный материал для проведения исследования.