Автореферат и диссертация по медицине (14.01.18) на тему:Коррекция повреждения головного мозга мезенхимальными стромальными клетками в модели нарушений венозного кровотока

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ

Игорь Анатольевич

КОРРЕКЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ В МОДЕЛИ НАРУШЕНИЙ ВЕНОЗНОГО КРОВОТОКА

14.01.18 — нейрохирургия

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 6 НАР 2014

Новосибирск 2014

005545720

005545720

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор член-корреспондент РАМН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Ступак Вячеслав Владимирович

Черных Елена Рэмовна

Дралюк Михаил Григорьевич

врач-нейрохирург нейрохирургического отделения краевого государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Краевая клиническая больница» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Красноярск

доктор медицинских наук, профессор Сакович Владимир Петрович

профессор кафедры нервных болезней и нейрохирургии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Екатеринбург

Ведущая организация: федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский нейрохирургический институт им. проф. А .Л. Поленова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится « » « _» 2014 г. ъ/%? ч. на

заседании диссертационного совета Д 208.064.01 при федеральном государственном бюджетном учреждении «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте ФГБУ «ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России.

Автореферат разослан

« » 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Д 208.064.01 Ф/у/Аб^

доктор медицинских наук с/ Фаламеева Ольга Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

Поражение головного мозга (ПГМ) в результате нарушения мозгового кровообращения представляет серьезную медико-социальную проблему и наносит огромный экономический ущерб обществу, поскольку является причиной экстренной госпитализации, длительной инвалидизации и в развитых странах занимает третье место среди причин смертности взрослого населения после онкологических заболеваний и сердечной патологии (Гусев Е.И. и др., 2001; Elbert T. et al., 2003; Петрова O.A., 2005; ТибекинаЛ.М. и др., 2009; Федоров В.Н., 2012).

Лидирующая позиция в структуре сосудистых заболеваний головного мозга принадлежит ишемическим инсультам, которые встречаются в 70-80% случаев, 20-30% приходится на долю геморрагических инсультов и 5 % в структуре цереброваскулярных патологий занимают субарахноидальные кровоизлияния (Исмагилов М.Ф., 2005).

Наряду с нарушениями артериального кровообращения серьезную проблему — в связи со сложностью диагностики, недостаточной изученностью патогенеза и отсутствием эффективных методов лечения - представляют нарушения венозного кровотока, обусловленные венозными кровоизлияниями, тромбозами мозговых вен и тромбозами синусов. В последнее время этой патологии посвящено немало работ (Литвиненко Д.В., 2006; Музлаев Г.Г. и др., 2002; Семенов С.Е. и др., 2009; Стулин И.Д. и др„ 2009; Шахнович А.Р. и др., 2009; Clenaghan S. et al., 2005; Dawson E. A. et al., 2004; Doepp F. et al„ 2008; Handley T.P. et al., 2010; Müller-Bühl U„ 2010; Иванов А.Ю., 2011; Kotlinska-Hasiec E. et al., 2013; В eggs C.B. et al., 2013; Guo X.B. et al., 2013).

Вместе с этим, развитие очаговых церебрально-васкулярных нарушений может быть следствием осложнений хирургического лечения парасагиттальных менингиом, локализованных в средней и задней трети верхнего сагиттального синуса (Габибов Г.А., 1975; Иванов А.Ю. 2011; Ступак В.В. и др., 2013). Это связано с тем, что удаление парасагиттальных менингиом данной локализации нередко ведет к травматизации впадающих в синус крупных венозных коллекторов и развитию обширного венозного инфаркта мозга. Все это нередко приводит у больного к развитию нового или к углублению уже имеющегося неврологического дефицита. Развитие парезов и параличей в конечностях приводит к значительному снижению качества жизни. Об этом свидетельствует тот факт, что после удаления менингиом, растущих из верхнего сагиттального синуса, большое число больных остаются инвалидами. Так, по данным Габибова Г.А. (1975), только 50 % больных через 5 лет после операции были практически здоровы и трудоспособны, 15 % являлись инвалидами, но могли обслуживать себя, а остальные оставались глубокими инвалидами. Согласно исследованиям Габибова Г.А. (1975); Тиглиева Г.С., Можаева C.B. и др. (1994) до 50 % (28,8-47,5 %) больных после операции имеют неврологические нарушения, а 18,6 % - остаются глубокими инвалидами (Беставашвили Ф.И., 1995; Чернов C.B., 2008; Ступак В.В. и др., 2013).

Отсутствие эффективных методов лечения при данных поражениях головного мозга побуждает искать новые терапевтические подходы, направленные на стимуляцию процессов репарации нервной ткани. Особая роль в этом направлении отводится клеточным технологиям. Долгое время считалось, что центральная нервная система (ЦНС) не способна к репарации. Однако экспериментальные исследования последних лет показали, что процессь1 репарации могут наблюдаться и в поврежденной ткани ЦНС, причем эти процессы во многом обусловлены образованием новых сосудов, генерацией новых нервных клеток и в значительной степени - реорганизацией нейронной сети (нейропластичность) (Tate С.С. et al., 2012). Более того, многочисленные экспериментальные исследования показали эффективность клеточной терапии при коррекции неврологических нарушений в моделях повреждения головного мозга сосудистого генеза (Omori et al., 2008; Акопян Ж.А., 2010; Yang M. et al., 2010; Ярыгин K.H. и др., 2012).

Среди различных типов клеток наибольшее внимание в последнее время привлекают мезенхимальные стромальные клетки (МСК), способные стимулировать ангиогенез, активировать нейральные стволовые клетки, оказывать ней-ротрофическую поддержку и модулировать процессы воспаления (Chen J. et al., 2001; Соколова И.Б. и др., 2007; Griffiths M.R. et al., 2010; Walker Р.А. et al., 2011; Wang S. P. et al., 2012; Bao X.J. et al., 2013).

Однако ограниченность моделей очаговых ПГМ сосудистого генеза, среди которых основной является окклюзия среднемозговой артерии, а также отсутствие ясности в отношении оптимальных сроков и путей введения клеток, существенно тормозят развитие клеточных технологий и их трансляцию в клиническую практику.

Цель исследования: Разработать экспериментальную модель очагового церебрального поражения, индуцированного нарушением венозного кровотока, и на основании комплексных исследований оценить влияние мезенхимальных-стромальных клеток на морфо-функциональное восстановление головного мозга.

Задачи исследования:

1. Разработать модель очагового поражения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока, и оценить характер повреждений головного мозга, тяжесть неврологических расстройств и эффективность их спонтанного восстановления.

2. В разработанной модели исследовать влияние мезенхимальных стромальных клеток на восстановление неврологического дефицита в зависимости от путей и сроков проведения клеточной терапии.

3. Провести сравнительную оценку электрофизиологических параметров головного мозга путем регистрации сомато-сенсорных вызванных потенциалов до и после оперативного вмешательства в группах животных с самопроизвольным восстановлением неврологического дефицита и с трансплантацией мезенхимальных стромальных клеток.

4. В рамках разработанной модели провести сравнительную характеристику патогистологических изменений головного мозга у экспериментальных животных после трансплантации мезенхимальных стромальных клеток и в группах с самопроизвольным восстановлением.

Научная новизна заключается в том, что впервые:

- показано, что облитерация верхнего сагиттального синуса в средней трети путем его полной биполярной коагуляции с одновременной коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области у крыс моделирует выраженное ПГМ, которое характеризуется тяжелым неврологическим дефицитом с доминированием очаговых расстройств, сочетающихся в остром периоде с общемозговой симптоматикой, и низким уровнем спонтанного восстановления;

- установлено, что морфологическим субстратом церебрального повреждения является зона омертвения (некроза) головного мозга, который развивается на фоне выраженного отека и нарушения микроциркуляции в венозном русле по смешанному типу (стазы, тромбозы, кровоизлияния), и впоследствии подвергается рубцовому замещению с кистозной дегенерацией. Формирование очага отека на фоне выключения венозного кровотока при сохранении артериального кровообращения с последующим образованием в зоне повреждения кистозной полости подтверждается также данными магнитно-резонансной томографии (МРТ);

- на основе полученных экспериментальных данных разработан новый способ очагового повреждения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровообращения «Способ моделирования ишемического поражения головного мозга» (Патент №. 2432 619 РФ. Авторы Ступак В.В., Васильев И.А., Самохин А.Г.);

- в разработанной оригинальной модели очагового нарушения церебрального венозного кровотока продемонстрирована безопасность и эффективность трансплантации МСК с целью коррекции неврологического дефицита;

- установлено, что трансплантация животным МСК в разработанной модели не вызывает локальных или системных осложнений и приводит к достоверному улучшению неврологических функций. Положительный эффект трансплантации МСК проявляется при внутривенном и локальном их введении, как в остром, так и в подостром периодах. При этом наиболее эффективным режимом является внутривенное введение клеток и проведение терапии в остром периоде, начиная с 1-х суток с момента формирования очага венозной ишемии.

Клиническая эффективность трансплантации МСК подтверждается данными электрофизиологического обследования. У животных контрольной группы снижение амплитуды сомато-сенсорных вызванных потенциалов (ССВП) в послеоперационном периоде носит выраженный и стойкий характер. У крыс с трансплантацией МСК с 14-х суток наблюдается возрастание амплитуды ССВП, а к 21-м суткам - восстановление электрофизиологической активности практически до исходного уровня.

На основании исследований морфологических изменений головного мозга животных после трансплантации МСК установлено, что позитивный эффект внутривенного введения клеток ассоциирован с активацией ангиогенеза, подавлением деструктивного отека, дистрофических изменений и воспаления и более эффективной организацией поврежденной ткани (образование компактного глиомезодермального рубца с меньшей кистозной дегенерацией).

Практическая значимость

Разработанная модель тяжелых очаговых ПГМ позволяет оценить безопасность и эффективность различных фармакологических и клеточных воздействий. Данный способ приближен к патогенезу повреждений, связанных с развитием венозного инфаркта, возникающих после травматизации крупных венозных коллекторов и венозных синусов после удаления парасагиттальных менин-гиом.

Выявленный позитивный эффект трансплантации МСК на восстановление неврологического дефицита у экспериментальных животных в разработанной модели очагового ишемического поражения головного мозга является обоснованием для дальнейшего продвижения клеточных технологий в клиническую практику.

Морфо-функциональные данные в виде ССВП и МРТ-исследования головного мозга свидетельствуют о целесообразности их использования в клинической практике для объективизации эффектов клеточной терапии при очаговых повреждениях головного мозга.

Положения, выносимые на защиту

1. Моделирование поражений головного мозга венозного характера путем биполярной коагуляции верхнего сагиттального синуса с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области приводит к развитию тяжелого неврологического дефицита с доминированием очаговых расстройств и низким уровнем спонтанного восстановления.

2. Морфологическим субстратом в разработанной модели является очаг некроза головного мозга с последующим замещением зоны повреждения рубцовой тканью с кистозной дегенерацией.

3. Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток в разработанной модели является эффективным методом восстановления неврологического дефицита с наилучшим клиническим эффектом при использовании внутривенного режима введения и проведения терапии в ранние сроки, что подтверждается данными клинических, электрофизиологических и морфологических исследований.

Основные положения работы доложены на:

Всероссийской научной школе-конференции МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, 2010 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Цивьяновские чтения», НИИТО, Новосибирск, 2010 г.; Заседании ассоциации нейрохирургов г. Новосибирска. 2011 г.;

VII Сибирском физиологическом съезде, г. Красноярск, 2012 г.; VI Всероссийской научно:практической конференции молодых ученых с международным участием «Цивьяновские чтения», НИИТО, Новосибирск 2013 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 научная работа, в том числе 4 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России.

Струю-ура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 страницах, содержит 32 рисунка, 10 таблиц, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка использованной литературы, содержащего 241 источник, из них 85 на русском и 156 на иностранных языках.

Личный вклад автора. Автор лично провел все 100% оперативных вмешательств на животных по моделированию очагового поражения головного мозга венозного характера и отработал методику забора клеточного материала. Все 100% клинического материала, полученные в эксперименте, проанализированы и статистически обработаны автором самостоятельно.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Показана актуальность и значимость рассматриваемой работы. Подробно изложены способы формирования очаговых ишемических повреждений головного мозга у животных и подходы к их лечению.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследований в работе было использовано 97 белых крыс породы Wistar. Экспериментальные животные в соответствии с целями и задачами исследований были распределены по группам и сериям (таблица 1). Возраст животных составлял 3-4 месяца, масса тела - 210-220 граммов.

Содержание подопытных животных и экспериментальные работы с ними проводилось в полном соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для научных целей, и приказом Министерства Здравоохранения СССР № 755 от 12 августа 1977 г.

Оценка повреждений головного мозга, индуцированных нарушением венозного оттока, проводилась на основании комплексных исследований, включающих клинико-неврологические проявления, нейрофизиологический контроль ССВП и нейровизуализационные данные (МРТ головного мозга). Состояние животных анализировали с помощью шкалы оценки тяжести неврологических нарушений (ОТНН) (Chen et al., 2001), в собственной модификации.

Таблица 1 - Распределение экспериментальных животных по сериям и группам

Серия № группы Кол-во животных Тип хирургического вмешательства Клеточная терапия Время введения клеток Путь введения клеток

1 8 коагуляция верхнего сагиттального синуса - - -

2 8 коагуляция корковых вен в теменно-височной области - - --

3 16 коагуляция сагиттального синуса + коагуляция корковых вен в левой те-менно-височной области. - - -

Б2 Контрольные группы 1 8 трепанация + моде-, лирование ПГМ - - -

2 8 трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера - - -

Исследуемые группы 3 6 трепанация + моделирование ПГМ + 1 сутки в/в

4 6 трепанация + моделирование ПГМ + 7 сутки в/в

5 6 трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера + 1 сутки местно

6 6 трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера . + 7 сутки местно

БЗ 1 6 резекционная трепанация - - -

2 8 трепанация + моделирование ПГМ - - :

3 8 трепанация + моделирование ПГМ ч- 1 сутки в/в

Б4 1 3 трепанация + моделирование ПГМ - - - .

Всего 97

Наряду с регистрацией неврологического статуса и его динамики оценивался внешний вид животных, состояние волосяного покрова, наличие или отсутствие трофических нарушений, контролировалась потеря массы тела. После выведения животных из эксперимента выполнялись морфологические исследования ткани головного мозга.

Суть модификации упомянутой шкалы заключалась во введении в нее двух дополнительных тестов, характеризующих мышечный тонус животных и их способность к самостоятельному приему пищи. В результате этого максимальная выраженность неврологического дефицита по модифицированной шкале достигала 26 баллов, где 20-26 баллов означали выраженное, 10-19 - умеренное и 1-9 легкое повреждение.

Тяжесть неврологического дефицита в исследуемых группах выражалась в виде среднего балла ОТНН в группе и ошибки среднего. Кроме того, при анализе определялся показатель, характеризующий степень снижения неврологического дефицита, рассчитанный по формуле [1 - (ОТНН на 7-е, 14-е или 21-е су-тки/ОТНН на 1-е сутки)] х 100.

Исследование влияния МСК на восстановление головного мозга в разработанной модели очагового церебрального поражения, индуцированного нарушением венозного кровотока, было проведено в группе из 32-х животных. МСК (в количестве 2x106 клеток/животное) вводили двумя способами - внутривенно (в хвостовую вену) или непосредственно в область повреждения через установленный катетер и в двух временных режимах - на 1-е и 7-е сутки после моделирования очагового поражения головного мозга.

МСК получали из суспензии клеток костного мозга, аспирированных из бедренных костей животных, при культивировании прилипающей фракции в питательной среде DMEM (Sigma), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ICN), при 37 °С в атмосфере 5 % С02 до получения конфлюентного слоя. Пассирование МСК осуществляли с использованием 0,25 % раствора трипсина и 0,02 % раствора ЭДТА. МСК, использованные для введения животным, соответствовали Минимальным критериям, разработанным Комитетом по стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии (Dominici, 2006). Жизнеспособность вводимых клеток, определяемая по окраске трипановым синим, во всех экспериментах превышала 93 %.

Морфологические исследования были произведены на препаратах продольных срезов участка повреждения головного мозга с захватом пограничной зоны повреждения толщиной 5-7.мкм. Для изучения морфоцитоархитектоники срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином и заключали в канадский бальзам. Оценку гистологических препаратов производили методом световой микроскопии под увеличением (100-300). Для проведения иммуноморфологиче-ского исследования использовали методические рекомендации фирмы-производителя («АЬсат», Англия). Перед проведением иммуногистохимическо-го исследования приготовленные срезы депарафинизировали и производили демаскировку антигенов тканей в РТ Link модуле (Dako, Дания) в цитратном буфере (рН 6,0), блокировали эндогенную пероксидазу 3 %-м раствором Н:02, проводили протеиновый блок сывороткой. Далее инкубировали полученные срезы с первичными антителами (клон Vim, DAKO Дания). Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему детекции с пероксидазной меткой Novolink Polymer («Novocastra», Великобритания). Последним этапом докрашивали ядра клеток гематоксилином. Микроскопическую картину поврежденного

участка и приграничной области головного мозга оценивали на 1-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки после моделирования ПГМ.

Для оценки функционального состояния мозга регистрировались ССВП на стимуляцию нервов передних конечностей с помощью электромиографа «Нейропак-2» (NIHON KOHDEN Corp., Япония). Частота стимуляции составляла 3/сек, сила стимулирующего тока, достаточная для вызова видимых движений, варьировала от 1,2 мА до 2,9 мА. Оценка нейрофизиологических показателей включала измерение амплитуды (в мкВ) и латентности (в мс) компонентов ССВП.

МРТ подопытных животных проводилась на расположенном в Центре коллективного пользования «SPF-виварий» ИЦиГ СО РАН сверхвысокополь-ном томографе «BioSpec 117/16» (Bruker, Germany) с напряженностью основного магнитного поля 11,7 Тл. В соответствии с планом исследования МРТ выполнялась несколько раз: до хирургической процедуры и на 3-й, 8-е, 14-е и 23-и сутки после нее. Изображения были получены при помощи метода.спинового эха RARE и импульсной последовательности F1SP-3D. Церебральная МР-ангиография сосудов головного мозга выполнялась с использованием импульсной последовательности FLASH-TOF-2D-flow compensation (метод времяпро-летной ангиографии). При помощи программного обеспечения томографа ParaVision 5.0. и функции 3D MIP (3d representation by Maximum Intensity Projection) реконструировались объемные изображения сосудов.

Для анализа полученных результатов использовался стандартный пакет программ Statistica 6.0. Данные представлены в виде среднего значения со стандартной ошибкой среднего. Для сравнения межгрупповых показателей использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок и Ркз - критерий знаков для зависимых выборок. Различия рассматривали как статистически значимые при значении уровня достоверности р<0,05.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Создание экспериментальной модели очагового нарушения венозного кровообращения головного мозга

Одной из первоочередных задач работы явилась разработка способа моделирования очагового поражения головного мозга, возникающего в результате нарушения венозного кровотока. Для этого были поставлены три серии экспериментов на крысах.

В первой серии животных S1 в группе № 1 с коагуляцией только сагиттального синуса и группе № 2 с коагуляция венозных корковых сосудов в левой теменно-височной области на площади 1,0x1,0 см, в зоне оперативного вмешательства формировался умеренный отек мозга с пролабированием его в дефект, кости. При этом выживаемость крыс составляла 100 %. В обеих группах тяжесть повреждений на 1-е сутки после операции соответствовала умеренному неврологическому дефициту (13,0 баллов в 1-й и 14,1 - во 2-й группе). Неврологические расстройства у животных группы №1 проявлялись легким тетрапарезом в

конечностях, а у крыс группы №2 легким гемипарезом на контралатеральной стороне и атаксией. Случаи самостоятельного восстановления до уровня легких неврологических расстройств регистрировалось уже к 7-м суткам наблюдения.

В группе № 3 сочетанная облитерация верхнего сагиттального синуса в средней трети путем его полной биполярной коагуляции с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области на площади 1,0x1,0 см приводила к развитию отека головного мозга со значительным пролабированием ткани мозга в костный дефект. Летальность среди животных была значительной и составила 50 %.

Уровень неврологических нарушений у выживших животных данной группы составил 22,20 балла, т.е. соответствовал тяжелым повреждениям. Неврологические расстройства проявлялись тетрапарезом, более выраженным на контрлатеральной стороне повреждения мозга, развитием гипестезии, грубым нарушением координации движений. Эти нарушения сочетались на 1-е сутки с выраженной общемозговой симптоматикой. У этих крыс процент самостоятельного восстановления неврологических нарушений было крайне низким (рисунок 1). Так, на 14-е сутки балл ОТНН продолжал оставаться близким к категории тяжелых повреждений и только к 21-м суткам уменьшался до среднего уровня умеренных повреждений.

Рисунок 1 - Выраженность неврологических нарушений при экспериментальном нарушении мозгового кровотока венозного характера в различные сроки наблюдения у животных первой серии. По оси абсцисс - сумма баллов неврологического дефицита по модифицированной шкале ОТНН; по оси ординат - сроки наблюдения. * Р„<0,05 -различия между группами 3 и 1, 3 и 2 достоверны.

Оценка прижизненных морфологических изменений головного мозга и характера нарушений кровотока в используемой модели выполнялась с помошью МРТ. Для этого 3 крысам серии S4 проводилось до операции, на 2-е, 8-е, 14-е и 23-и сутки после хирургического вмешательства МРТ-исследование головного мозга. Всего у этих животных последовательно было проведено 11 МРТ-исследований.

25

Сутки 1 Сутки 7 Сутки 14 Сутки 21

До проведения эксперимента структуры мозга крыс исследовались при помощи импульсных последовательностей FISP и RARE в аксиальных и коро^ нарных плоскостях. На полученных изображениях структуры мозга симметричны, патологических изменений интенсивности сигнала не выявлено (рисунок 2). На объемных церебральных МР-ангиограммах визуализируется кровоток по всем экстра- и интракраниальным артериям, синусам твердой мозговой оболочки и венам.

Рисунок 2 - МРТ головного мозга крысы до проведения эксперимента (животное № 1 серии S4); а, б - MP-томограммы, полученные в F1SP и RARE режимах; в, г - изображения, полученные при помощи импульсной последовательности TOF и реконструированные объемные церебральные МР-ангиограммы.

Было установлено, что на 2-е сутки после операции в области верхнего сагиттального синуса и над левым полушарием мозга визуализировался гемоста-тический материал. Мозговое вещество левого полушария значительно пролаби-ровало через трепанационное отверстие (рисунок 3). Срединные структуры смещены влево. В пролабирующем и прилежащем к коагулированным участкам синуса веществе мозга выражены признаки отека. На МР-ангиограммах кровоток по синусам твердой мозговой оболочки и венам отчетливо не визуализировался (рисунок 4). Кровоток по экстра- и интракраниальным артериям сохранен, выражены признаки их полнокровия.

Рисунок 3 - МРТ головного мозга на 2-е сутки после хирургического вмешательства. Изображения получены в режимах RARE и FISP; а - животное № 1; б - животное № 2.

На 14-е сутки при сохраненном кровотоке по экстра- и интракраниальным артериям появлялся участок отсутствия кровотока по одной из крупных вен левого полушария мозга. Не визуализировалась средняя треть верхнего сагиттального синуса (рисунок 5). В пролабирующих и расположенных рядом участках головного мозга определялась кистозная полость.

Рисунок 5 - MPT головного мозга на 14-е сутки после хирургического вмешательства (животное № 1, серия S4). Изображения получены в режимах FISP и RARE.

На 23-й день отмечено увеличение размеров кисты. При ангиографиче-ском обследовании кровоток по синусам твердой мозговой оболочки и венам отчетливо не визуализировался. Отмечено также увеличение количества участков крупных вен левого полушария мозга, по которым не визуализировался кровоток.

Морфологические изменения в контрольных группах

У контрольных животных второй серии очаг повреждения на 1-е сутки представлял зону полного разрушения ткани с формированием дезинтерграции и морфологическими изменениями клеток нейронов и глии, деформации капилляров, набухания эндотелия, диапедезными кровоизлияниями (рисунок 6 а). На 7-е сутки наблюдалась пролифирация глиальных клеток. В зоне повреждения было выявлено большое количество гемосидерофагов. В демаркационной зоне увеличилось количество и плотность клеток глии. К 14-м суткам имело место нарастание репаративных изменений и активация макрофагальной функции. На 21-е сутки гистологическая картина свидетельствовала о замещении очага инфаркта сетью аргирофильных и глиальных волокон с выраженной кистозной дегенерацией (рисунок 6 б).

Суммируя полученные результаты, можно констатировать, что экспериментально разработана модель ишемического ПГМ у крыс венозного характера путем последовательной коагуляции верхнего сагиттального синуса и корковых вен в левой теменно-височной области. Данная модель ПГМ соответствует цели и задачам работы. Об этом, в первую очередь, свидетельствуют клинические проявления в виде возникновения выраженных очаговых неврологических расстройств на фоне тяжелой общемозговой симптоматики с низким уровнем спонтанного восстановления вплоть до 21 -х суток.

а2 шгаомка б I шшяшяят 62 шшш шш

Рисунок 4 - Церебральная МР-ангиография головного мозга на 2-е сутки после хирургического вмешательства; а2 - животное № 1; б - животное № 2.

Рисунок 6 - Множественные диапедезные кровоизлияния в перифокальной зоне очага повреждения: контрольная группа, 1-е сутки; увеличение 100 (а); кистозная дегенерация и формирующийся глиомезодермальный рубец; контрольная группа, 21-е сутки; увеличение 300 (б). Окрашено гематоксилин-эозином.

Кроме этого, получены данные нейровизуализации (МРТ) и гистологические результаты, подтверждающие выключение венозного кровотока в головном мозге и формирование в нем очага повреждения в виде инфаркта с развитием зоны некроза, сопровождающееся выраженным отеком головного мозга в области хирургического вмешательства с последующей резорбцией некротических масс (спустя две недели с момента травмы) и формированием в зоне очага повреждения мозга глиального рубца и выраженной кистозной дегенерации.

На основе полученных экспериментальных данных нами получен патент РФ «Способ моделирования ишемического поражения головного мозга». Патент №. 2 432 619 РФ, авторы Ступак В.В., Васильев И.А., Самохин А.Г.

Поэтому созданная модель, сочетающая коагуляцию верхнего сагиттального синуса с последующей коагуляцией корковых вен головного мозга у крыс в левой теменно-височной области, будет использована в дальнейшей работе.

Влияние трансплантации мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на восстановление неврологических расстройств

У 8 животных контрольной группы № 2 серии S2 исследовалось влияние инородного тела (полихлорвинилового катетера) на сформированный очаг нарушения венозного кровообращения головного мозга. Для этого им- формировался стандартный очаг венозного нарушения кровообращения, но с дополнительным введением под кожу к зоне поражения мозга хлорвинилового катетера, через который планировалась трансплантация МСК. Группа № 1, состоящая из 8 крыс этой же серии S2, явилась своеобразным дополнительным контролем для группы № 2. Крысам данной группы формировали только очаговое повреждение мозга по разработанной методике и оценивали результаты самопроизвольного восстановления утраченных церебральных функций.

После оперативного вмешательства на 1-е сутки у выживших животных этих двух групп суммарный балл неврологических нарушений по шкале ОТНН был одинаков и составлял 22,20 ± 0,10 и 22,50 ± 0,20 соответственно (таблица 2), что свидетельствовало о наличии у всех крыс тяжелой степени повреждения, со-

храняющегося в течение 14-и суток и регрессирующего к 21-м суткам с момента операции лишь до уровня умеренной тяжести.

Таблица 2 - Выраженность неврологических расстройств по шкале ОТНН серии Б2

Группы Кол-во животных Методика эксперимента 1 -е сутки (баллы) 7-е сутки (баллы) 14-е сутки (баллы) 21 -е сутки (баллы)

1' 8 Трепанация + моделирование ПГМ 22,20 ±0,10 20,20±0,40* 18,40±0,40* 15,70±0,30*

2 8 Трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера 22,50 ±0,20 20,40±0,30* 19,40±0,40* 16,50±0,20*

Итого 16

Примечание: представлены средние значения (М ± т) балла ОТНН в динамике послеоперационного периода; * - Р<0,05 - различия по сравнению с состоянием на 1 сутки.

В дальнейшем, в серии Э2 на 24 крысах исследовательских групп № 3-6, изучалось влияния МСК на морфо-функциональное состояние головного мозга с очагом повреждения, индуцированным нарушением венозного кровотока (таблица 3).

В группах №3 и №4 МСК вводились внутривенно, крысам групп № 5 и № 6 осуществлялось местное (через катетер) введение клеток. Трансплантация клеток проводилась на 1-е и 7-е сутки после операции.

После формирования в головном мозге очага нарушения венозного кровообращения животные данных групп были сопоставимы между собой и с группами контроля № 1 и № 2 серии Б2 по тяжести неврологических выпадений и общему состоянию.

В группе с внутривенным введением МСК на 1-е сутки достоверные различия по сравнению с контрольной проявлялись виде регресса неврологического дефицита и тяжести состояния уже через неделю с момента травмы (рисунок 7), а к 14-м и 21-м суткам тяжесть неврологических выпадений была соответственно в 1,5 и 2,9 раза ниже, чем у животных контрольной группы. При внутривенном способе введения МСК на 7-е сутки достоверная положительная неврологическая динамика, по сравнению с группой контроля, отмечалась, начиная с 14-х суток, и сохранялась в сроки наблюдения до 3 недель. При этом выраженность неврологических расстройств в указанный период была также существенно ниже, чем у крыс контрольной группы. Нами отмечено, что ранняя (спустя 1 сутки с момента травмы) трансплантация МСК способствует, по сравнению с поздним их введением, более быстрому и выраженному регрессу возникающих после повреждения мозга неврологических расстройств (рисунок. 7).

Местное введение МСК животным групп № 5 и № 6 также сопровождалось более эффективным по сравнению с группой контроля восстановлением возникающего после операции грубого очагового неврологического дефицита (рисунок 8).

Рисунок 7 - Влияние внутривенного введения МСК на выраженность неврологических нарушений животных при экспериментальном очаговом повреждении головного мозга, вызванном нарушением венозного кровообращения. * - Ри<0,05 - различия по сравнению с контролем достоверны #- Ри<0,05 - различия между группами достоверны.

рушений в модели очагового повреждения головного мозга, венозного характера. * - Ри<0,05 - различия по сравнению с контролем достоверны, различия между группами не достоверны.

При этом статистически значимый регресс неврологических, нарушений регистрировался к 14-м и 21-м суткам.

Таким образом, сравнение результатов локального и системного способов трансплантации клеток показало, что МСК оказывают позитивный эффект на динамику неврологических выпадений поврежденного мозга как при внутривен-

ном, так и при местном их введении. Причем достоверных различий в динамике восстановления неврологического статуса в зависимости от путей трансплантации клеток зарегистрировано не было (таблица 3). Хотя животные с внутривенным введением МСК (на 1-е сутки) характеризовались тенденцией к более выраженному регрессу неврологических выпадений, проявляющемуся на 21-е сутки, по сравнению с крысами, которым МСК (на 1-е сутки) вводили местно.

Таблица 3 - Балльные оценки тяжести неврологических нарушений у экспериментальных животных второй серии Б2

Группы Кол-во жив-х Вид хирургических ' манипуляций 1 -е сутки (баллы) 7-е сутки (баллы) 14-е сутки (баллы) 21 -е сутки (баллы)

3 6 трепанация + моделирование ПГМ с введением МСК на 1-е сутки в/в 21,50±0,38 18,30±0,48 12,00±0,65 5,50±1,08*

4 6 трепанация + моделирование ПГМ с введением МСК на 7-е сутки в/в 22,30±0,56 22,40±0,99 13,30±1,19 9,07±0,87

5 6 трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера с введением МСК на 1-е сутки местно 22,00±0,54 18,70±0,89 •14,50±1,57 7,20±1,32

6 6 трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера с введением МСК на 7-е сутки местно 21,40±0,85 18,10±1,25 14,40±1,64 9,90±0,97

Ито го 24

Примечание: * Ри <0,05 - различия между группами № 3 и № 4 достоверны

В итоге экспериментальными исследованиями на крысах с очаговым повреждением головного мозга венозного характера установлено, что для коррекции возникающего неврологического дефицита наиболее технически простым и эффективным является раннее внутривенное введение МСК в 1-е сутки с момента повреждающего воздействия.

Влияние трансплантации мезенхимальных стромальных клеток на электрофизиологнческие параметры поврежденного головного мозга

С целью объективизации функционального состояния головного мозга у 22-х оперированных крыс, входящих в серию БЗ, регистрировались корковые ССВП.

У 14 оперированных крыс серии 553. с естественным восстановлением функции головного мозга, регистрировались в динамике корковые соматосен-сорные вызванные потенциалы (ССВП). У 6 крыс группы № 1 данной серии проводилась только резекционная трепанация черепа с сохранением целостности твердой мозговой оболочки. В группе №2 крысам по нашей методике фор-

мировали очаговое ПГМ венозного характера путем коагуляции верхнего сагиттального синуса и коагуляции корковых вен в левой теменно-височной области и исследовали спонтанную динамику восстановления неврологического дефицита. :

Регистрация ССВП осуществлялась до проведения ПГМ, на 7-е, 14-е и 21-е сутки с момента проведения операции.

Электрофизиологическое обследование животных группы № 1 серии БЗ показало, что снижение значений амплитуды ССВП и латентности потенциалов на 7-е сутки после операции на стороне повреждения являются незначительными. При этом задержка ССВП также не отличалась от исходного уровня, составляя 10,20 ± 0,19 мс (до операции Ю,10 ± 0,35 мс; (р>0,05). К исходу 21-х суток исследуемые показатели ССВП у животных 1-й группы полностью соответствовали исходным значениям (рисунок 9).

Моделирование очагового повреждения в группе № 2 серии 53 приводило к значимому снижению амплитуды ССВП у большинства особей этой группы (6 из 8) при обследовании на 7-е, 14-е и 21-е сутки на оперированной стороне, которое сохранялось в течение трех недель наблюдения. При этом среднее значение, амплитуды ССВП составляло к 21-м суткам 3,40 ± 1,33 мкВ. Наряду с этим, происходило и увеличение задержки ССВП с 9,20 ± 0,99 мс до 11,00 ± 1,14 мс, р>0,05.

У 8 животных 3-й группы серии БЗ с трансплантацией МСК на 7-е сутки после операции, выявлялось выраженное снижение амплитуды ССВП с 8,00 ±0,97 до 2,20 ± 1,42 мкВ; р<0,05 и незначительное увеличение задержки основных компонентов ССВП с 11,20 ± 1,42 до 12,60 ± 1,37 мс; р>0,05. Однако введение МСК в течение первых суток после операции приводило впоследствии, к 14-м суткам, к значимому увеличению амплитуды ССВП у большинства осо-. бей. К этому сроку среднее значение амплитуды практически не отличалось от исходного показателя (7,90 ± 2,00 мкВ по сравнению с 8,00 ± 0,97 мкВ до операции). В итоге к 21-м суткам у всех животных 3-й группы серии БЗ амплитуды

. ССВП полностью восстанавливались (рисунок. 9 а).

Характерно, что уменьшение амплитуды ССВП в интактном полушарии (рисунок. 9 6) было незначительным и практически не различалось в контрольной группе и у крыс с трансплантацией МСК. Существенные изменения ССВП в группе № 2 серии БЗ на поврежденной стороне при отсутствии таковых в интактном полушарии указывает на очаговый характер повреждений в разработанной модели, а сохранение этих изменений до 21-х суток - подтверждает низкую эффективность спонтанного восстановления. В свою очередь, восстановление амплитуды ССВП на фоне введения МСК в группе №3 серии БЗ является объективизацией позитивного эффекта клеточной терапии для разработанной модели. Наконец, отсутствие достоверных изменений амплитуды ССВП в группе хирургического контроля позволяет предполагать, что факторы хирургического стресса и травматизации вследствие резекционной трепанации не вносят существенного вклада в индукцию неврологических расстройств и функциональных повреждений головного мозга в рамках нашей модели.

а

7-е сут

14-е сут

21-е сут

♦ I группа, ■ 2 группа А 3 группа.

Рисунок 9 - Динамика амплитуды ССВП животных серии БЗ на поврежденной (а) и интактной (б) сторонах. I -я группа - резекционная трепанация, 2-я - очаговое повреждение без введения клеток, 3-я - трансплантация МСК. * Ри <0,05 - различия между 2-й и 3-й группами, # Рц <0,05, — различия между 1-й и 2-й группами достоверны (II- критерий Манна-Уитни).

Морфологические изменения при трансплантации мезенхимальных стромальных клеток

В группе № 3 серии Б2 на 7-е сутки в очаге повреждения отмечены Макро-фагальная реакция, формирование рыхлой соединительной ткани, внедрение сосудов из демаркационной зоны (рисунок 10 а). К 14-м суткам в зоне повреждения визуализировалась кистозная полость, ограниченная нежным глиомезенхи-мальным пролифератом. На 21-е сутки у животных с внутривенной трансплантацией МСК в зоне повреждения формировался компактный глиомезодермаль-ный рубец (рисунок 10 б) с небольшим количеством кист в отличие от грубых дегенеративных изменений и выраженной кистозной дегенерации, имеющих место в контрольной группе.

Рисунок 10 - Рыхлая соединительная ткань с пролиферацией сосудов, 7-е сутки исследования (а); глиомезодермальный рубец, 21-е сутки исследования (б). Окрашено гематоксилин-эозином. Увеличение 200.

Морфометрические исследования головного мозга показали, что у животных с внутривенным введением МСК объемная плотность кровеносных капилляров на 7-е и 14-е сутки послеоперационного периода была выше, чем в контрольной группе, что свидетельствует о более интенсивном ангиогенезе.

Анализ индекса соотношения площади среза капилляров к площади среза вен (К/В), характеризующего выраженность отека, показал, что на 7-е сутки в группе контроля № 1 серии Б2 он составил 0,72 ± 0,19, тогда как в группе № 3 с внутривенным введением МСК на 1-е сутки данный показатель был практически в 2,5 раза выше и.достигал значения 1,78 ± 0,67, р<0,05. На 14-е сутки величина индекса К/В в контрольной группе составила 0,76 ± 0,04, в группе № 3 серии Б2 он был равен 1,20 ± 0,05, р<0,05. На 21-е сутки.различий в значениях индекса, как в контрольной группе, так и группах с МСК не наблюдалось. '

Данные,, характеризующие клеточный состав зоны организации очага повреждения, представлены в таблице 4;

Таблица 4 - Клеточный состав зоны организации на 21-е сутки (M±m), N (%)

Исследуемый параметр Контрольная группа В/в ведение - мек (1-е сут, гр. 3) Местное введение МСК (1-е сут, гр. 5) В/в введение МСК (7-е сут, гр. 4) Местное ведение МСК (7-е сут, гр. 6)

Волокнистые астроциты 25,11 ±0,35 (34,50 ± 2,13) .35,11 ± 1,69. (41,25 ±1,24*) 22,33 ± 1,57 (29,14 ± 1,56) 29,43 ± 1,97 (38,90 ±0,66) 24,93 ±3,18 (33,85 ± 3,09) •

Фибробласты 19,22 ± 1,38 (29,43 ± 2,84) 28;50 ±1,25 . (35,19 ±1,3) 17,92 ±2,56 (26,38 ± 3,43) 23,50 ± 1,36 (32,84 ± 1,19) 18,02 ± 1,25 (27,43 ± 1,38)

Макрофаги. 4,22 ±1,82 (9,02 ± 1,67) 1,21 ± 1,74* (2,89 ± 0,96)* . 5,86 ± 1,66 ' (10,56 ± 2,23)' 2,11 ± 1,97* (4,32 ± 2,27)* 4,19 ±2,68 (8,11 ±1,67)

Примечание: (К) - численная плотность клеток на 105 мкм^ площади среза зоны; * - отличие величин значений между группами достоверно

В контрольной группе № 1 серии Б2 количество волокнистых астроцитов и фибробластов продолжало нарастать, а доля макрофагов - снижаться. В группах № 3 и № 5 'этой же серии с внутривенным введением МСК эти изменения были достоверно более выражены и проявлялись высоким относительным содержанием волокнистых астроцитов и фибробластов и меньшим количеством макрофа-

гов по сравнению с контрольной группой. При местном введении МСК подобных различий не выявлено. Таким образом,. исследование цитоархитектоники головного мозга у животных с внутривенной трансплантацией МСК свидетельствует о меньшей интенсивности воспалительного процесса и более эффективной репарации к 21-м суткам. :

ВЫВОДЫ

1. Разработана новая экспериментальная модель очагового повреждения головного мозга крыс путем коагуляции верхнего сагиттального синуса с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области, ведущей к нарушению венозного кровообращения, что проявляется в'остром периоде нарушением кровообращения венозного характера в виде тяжелого неврологического дефицита с доминированием очаговых расстройств, сочетающихся с общемозговой симптоматикой, и характеризуется низким уровнем спонтанного восстановления.

2. Повреждение головного мозга в разработанной модели характеризуется по данным МРТ формированием зоны отека с последующим образованием ин-трацеребральной кистозной полости, а по данным гистологического исследования - формированием зоны некроза на фоне нарушений микроциркуляции (развитие тромбозов, стаза и кровоизлияний) с последующей резорбцией некротических масс и формированием глиального рубца с выраженной кистозной дегенерацией.

3. Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток в количестве 2x106 клеток на одно животное, как при внутривенном, так и местном их введении, приводит к достоверному снижению тяжести неврологического дефицита, при этом наиболее выраженный эффект мезенхимальных стромальных. клеток регистрируется при использовании внутривенного введения клеток на 1,-е сутки после формирования очага нарушения венозного кровотока.

4. В отличие от контрольных животных, состояние которых характеризуется выраженным снижением амплитуды сомато-сенсорных вызванных потенциалов на протяжении всего послеоперационного периода, животные с трансплантацией мезенхимальных стромальных клеток отличаются положительной динамикой сомато-сенсорных вызванных потенциалов на 14-е сутки и полным восстановлением электрофизиологической активности к 21-м суткам. Это подтверждает низкую эффективность спонтанного восстановления функции головного мозга в рамках разработанной модели, и свидетельствует об эффективности клеточной терапии.

5. Морфологические изменения головного мозга у животных с внутривенной трансплантацией мезенхимальных стромальных клеток по сравнению с контрольной группой характеризуются более выраженной активацией ангиогенеза, меньшей выраженностью отека, быстрой санацией участков мозга с формированием глиомезедермального рубца.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанная экспериментально модель тяжелого очагового поражения головного мозга венозного характера является основой изучения патогенеза венозных нарушений головного мозга и позволяет исследовать эффективность различных фармакологических и клеточных технологий восстановления утраченных функций мозга при данной патологии.

Отсутствие осложнений и положительный эффект МСК на морфо-функциональное восстановление головного мозга-у экспериментальных животных в оригинальной модели ишемического поражения головного мозга является основанием для дальнейших экспериментальных исследований и клинической апробации МСК в нейрохирургической практике,.

Исследования ССВП и МРТ головного мозга, наряду с клиническими данными, являются объективными методами, подтверждающими эффективность морфо-функцйонального восстановления очаговых повреждений головного мозга, и могут быть использованы для мониторирования эффектов клеточной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васильев И. А., Черных Е. Р.; Ступак В. В., Шевела Е. Я., Останин А. А., Самохин А. Г. Мезенхимальные клетки в коррекции неврологического дефицита, индуцированного нарушением венозного кровотока головного мозга у крыс // Поленовские чтения: материалы IX Всерос. науч.-практ. конф., г. Санкт-Петербург, 6-10 апр. 2010 г. -СПб., 2010,- С. 172-173.

2.'' Васильев И. А., Ступак В. В., Шевела Е. Я., Черных Е. Р. Формирование очаговой венозной ишемии головного мозга в эксперименте // Многопрофильная больница: материалы. III Всерос. науч.-практ. конф., г. Ленинск-Кузнецкий, 9-10 сент. 2010 г.-Ленинск-Кузнецкий, 2010-С. 371-372.

3. Васильев И. А., Ступак В. В., Самохин А. Г., Шевела Е. Я., Черных Е. Р. Новые подходы к моделированию очаговых повреждений головного мозга «венозного» генеза // МатериалыТУ научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы нейрохирургии». - Ташкент, 2010. - С. 155-156.

4. Васильев И. А., Черных "Е. Р-, Ступак В. В., Шевела Е. Я., Останин А. А., Самохин А. Г. Возможности применения мезенхимальных клеток для коррекции неврологического дефицита в модели нарушенного венозного кровотока головного мозга // Материалы IV научно-практической конференции с ме- . ждународным участием «Актуальнаые проблемы нейрохирургии». - Ташкент, 2010. — С. 156-157 . .

5. Васильев И.А. Формирование ишемического инсульта венозного характера в средней трети верхнего сагиттального синуса // Инновационные аспекты научно-исследовательских разработок в области вертебрологии, травматологии и ортопедии, нейрохирургии, нейроонкологии: Материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, с элементами науч. шк. для молодежи (Цивь-яновские чтения), г, Новосибирск, 25-26 нояб. 2010 г. - Новосибирск, 2010. — С. 193-194. • . '

6. Васильев И. А., Черных Е. Р., Ступак В. В., Шевела Е. Я.; Останин А. А., Коррекция неврологического дефицита в модели нарушений венозного кровотока головного мозга при трансплантаций мезенхимальных стромаль-ных клеток // Всероссийская научная школа-конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина», г. Москва, 25-28 окт. 2010 г. - М„ 2011. - С. 16-17.

7. Васильев И. А., Черных Е. Р., Ступак В. В., Шевела Е. Я., Останин А. А., Возможности применения мезенхимальных клеток для коррекции неврологического дефицита в модели нарушенного венозного кровотока головного мозга // Инновационные аспекты научно-исследовательских разработок в области вертебрологии, травматологии и ортопедии, нейрохирургии, нейроон-кологии: материалы Всерос. науч.-практ. конф: с междунар. участием с элементами науч. шк. для молодежи (Цивьяновские чтения), г. Новосибирск, 25-26 но-яб. 2010 г. -Новосибирск, 2010. - С. 194-196.

. 8. Черных Е. Р., Ступак В. В., Васильев И. А., Шевела Е. Я., Само-хин А. Г., Останнн А. А. Мезенхимальные клетки в лечении очагового повреждения головного мозга крыс, индуцированного нарушением венозного кровотока // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - № 2. -С. 77-83.

9. Цветовский С. Б., Черных Е. Р., Ступак В. В., Васильев И. А., Шевела Е. Я., Половников Е. В., Останин А. А., Самохин А. Г; Изменение функционального состояния головного мозга крыс в модели очагового нарушения венозного кровообращения при трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (электрофизиологическое исследование) // Хирургия, морфология, лимфология. - 2011 .-Т. 8, № 15-С. 61-62.

10. Васильев И. А., Ступак В. В., Самохин А. Г. Черных Е. Р., Шевела Е. Я., Останин А. А. Экспериментальная модель ишемического инсульта венозного характера в средней трети верхнего сагиттального синуса // Поленовские чтения: материалы X Всерос. науч.-практ. конф., г. Санкт-Петербург, 19-22 апр. 2011 г.-СПб., 2011.-С. 257-258.

11. Цветовский С. Б., Васильев И. А., Черных Е. Р., Ступак В. В., Шевела Е. Я., Останин А. А. Функциональное состояние головного мозга крыс с нарушением венозного кровотока при проведении клеточной терапии (по данным регистрации сомато-сенсорных вызванных потенциалов) // Поленовские чтения: материалы X Всерос. науч.-практ. конф., 19-22 апр. 2011 г. - СПб., 2011. -С. 457-458.

12. Цветовский С. Б., Васильев И. А., Черных Е. Р., Ступак В. В., Шевела Е. Я., Останин А. А., Самохин А. Г- Функциональное состояние головного мозга крыс с нарушением венозного кровотока при проведении клеточной терапии (по данным регистрации сомато-сенсорных вызванных потенциалов в различные сроки после оперативного вмешательства) // Многопрофильная больница: XV Всерос. науч.-практ. конф., г. Ленинск-Кузнецкий, 8-9 сент. 2011 г. - Ленинск-Кузнецкий, 2011. - С. 324-325.

13. Цветовский С. Б., Васильев И. А., Черных Е. Р., Ступак В. В., Шевела Е. Я., Останин А. А. Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на функциональную активность головного мозга в модели локальной

ишемии венозного генеза у крыс // Актуальные проблемы нейрохирургии: материалы науч.-практ. семинара.-Ташкент; Андижан, 2011 г. - С. 195-196.

14. Васильев И. А., Черных Е. Р.; Ступак В. В., Шевела Е. Я., Останин А. А. Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток с целью коррекции неврологического дефицита в модели нарушений венозного кровотока головного мозга у крыс // Илизаровские чтения: материалы науч.-практ. конф. с междунар; участием, г. Курган, 8-10 июня 2011 г. - Курган, 2011. - С. 468-469.

Î5. Ступак В. В., Васильев И. А., Половников Е. В., Самохин À. Г., Шевела Е, Я., Черных Е. Р. Экспериментальное моделирование ишемиче-ских очаговых повреждений головного мозга венозного характера // Меди-' цина и образование в Сибири: электрон, науч. журн. - 2012. - № 1. - URL: http://www.ngmu.ru/cozo/mos/article/abauthors.php?id=604.

16. Шевела Е. Я., Васильев И. А., Ступак В. В., Половников Е. В., Самохин А. Г., Окладников Г. И., Морозов Д. В., Головнев В. А., Черных Е. Р. Мезенхимальные стромальные клетки в коррекции неврологического дефицита и морфологических изменений в модели очаговых повреждении головного мозга, индуцированных нарушением венозного кровотока//Бюл. Вост.-Сиб. науч. центра Сиб. отд-ния РАМН. - 2012. - № 3. - С. 332-336.

17. Васильев И. А., Цветовский С. Б., Ступак В. В., Черных Е. Р., Шевела Е. Я., Половников Е. В., Останин А. А., Самохин Â. Г. Электрофизиологический контроль состояния головного мозга крыс с очаговым нарушением венозного кровообращения при введении мезенхимальных стромальных клеток // Материалы VII Сибирского съезда физиологов, г. Красноярск, 27-29 июня 2012 г. -Красноярск, 2012.-С. 90-91.

18. Цветовский С. Б., Васильев И. А., Ступак В. В., Самохин А. Г., Половников Е. В., Черных Е. Р. Влияние мезенхимальных стромальных клеток на электрофизиологическую активность головного мозга крыс в модели очагового нарушения венозного кровообращения // Рос. нейрохирург. журн. им. А. Л. Полёнова.-2012. - Т. 4, № 4. - С. 5-9.

19. Васильев И. А., Дергилев А. П., Ступак В. В., Черных Е. Р., Мошкин М. П., Шевела Е. Я., Половников Е. В:, Самохин А. Г., Акулов А. Е. Магнитно-резонансное томографическое исследование у крыс в модели очагового поражения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока // "По-леновские чтения": мат. XII науч.- практ. конф., г. Санкт-Петербург, 24-27 апре-, ля 2013 г.: Российский нейрохирургич. журнал им. проф. А. Л. Поленова.- 2013.Т. V, спец. выпуск. *-С. 129.

20. Vasilev I., Okladnikov G.; Stupak V., Golovnev V., Morosov D., Golovnev A. Peculiarities of morphological changes in rat"s cerebrum under induced disorder in venous circulation and under application of mesenchymal stromal cells // Materials of the XV WFNS World Congress of Neurosurgery, Séoul, Korea, September 8 to 13, 2013 (e-poster).

21. Васильев И. A., Ступак В. В., Черных Е; Р., Шевела Е. Я., Половников Е. В. Стимуляция репаративных процессов мезенхимальными стволовыми клетками при поражении голрвного мозга, индуцированного нарушением венозного кровообращения // Цивьяновские чтения: мат. VI Всерос. науч. - практ.

конф. молодых ученых с междунар. участием, г. Новосибирск, 29-30 ноября 2013 г. / под ред. М.А. Садового. - Новосибирск, 2013. - С. 67-71.

Патенты на изобретения.

1. Патент №2432619 Российская Федерация: G09B 23/28. A61N 1/32. Способ моделирования ишемического повреждения головного мозга / Ступак В. В., Васильев И. А., Самохин А. Г.; заявитель и патентообладатель Новосиб'. науч,-ислед. ин-т травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития России. -№ 2009143265/14; заявл. 23.11.2009; опубл. 27.10.2011, Бюл.№30. - 5 с.

2. Патент №2467714 Российская Федерация: А61В 17/285. А61В 17/295. Устройство для резекционной трепанации черепа / Васильев И. А, Самохин А: Г., Ступак В. В., Кузьмин А. В.; заявитель и.патентообладатель Новосиб. науч.-ислед. ин-т травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития России. -№2011134529/14; заявл. 27.11.2012; опубл. 27.11.2012, Бюл №33.-7 с.

Список сокращений

К/В - Капилляры к площади среза вен

МРТ - Магнитно-резонансная томография

МСК - Мезенхимальные стромальные клетки

ОТНН - Оценка тяжести неврологических нарушений

ПГМ - Поражение головного мозга

ССВП - Сомато-сенсорные вызванные потенциалы

ЦНС - Центральная нервная система

SI, S2, S3, S4 - Серия 1, Серия 2, Серия 3, Серия 4

Соискатель:

И.А. Васильев

■ Подписано в печать 31.01.2014 г.

Формат 60x90. Объем 1,75 п.л. . Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman Заказ 7665. Тираж 120 экз.

Отпечатано в полном соответствии с авторским оригиналом в типографии ФГБУ «ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России Новосибирск, ул. Фрунзе, 17, телефон: 201-40-97 E-mail: niito@niito.ru