Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Эпителио-мезенхимальная пластичность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в норме и патологии (экспериментальное исследовние)

САБУРИНА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ЭПИТЕЛИО-МЕЗЕНХИМАЛЬНАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03. - патологическая физиология 03.03.04. - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 3 НОЯ 2010

Москва-2010

004613147

Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии и патологии развития УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук.

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Репин Вадим Сергеевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна

Доктор биологических наук, профессор Викторов Илья Васильевич

Доктор медицинских наук, профессор Лищук Александр Николаевич

Ведущее учреждение:

Российский государственный медицинский Университет

Защита диссертации состоится « «^У » 2010 г. в /¥ часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, Балтийская ул., д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института. Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. С середины XX века сформировалась концепция, что все органы и ткани млекопитающих и человека способны к физиологической и репаративной регенерации [Полежаев JI.B., 1968; Саркисов Д.С., 1970]. Поддержание общей численности (физиологический гомеостаз) клеток в здоровом органе является универсальным механизмом. Показано, что каждый орган имеет свой автоматический ритм обновлений (около 7 дней для полного обновления кишечного эпителия, несколько месяцев - эндотелия артерий, 4-8 месяцев - миофибрилл в мышечном волокне, 4-6 месяцев - гепатоцитов в ацинусе, несколько лет - гиппокампа головного мозга). Однако полноценная регенерация поврежденных взрослых тканей при разной патологии часто невозможна. Остаётся неизвестным, почему при средних и крупных повреждениях дефинитивных тканей не мобилизуются и не принимают участие в репарации собственные запасы региональных стволовых клеток (РСК), а наблюдается патологическая репарация (фиброз) в ответ на повреждение.

Атеросклеротическая фиброзная бляшка - характерный пример патологической репарации, запускаемой активированной соединительной тканью сосуда [Versari D. et al., 2007; ShantsiJa E. et a]., 2007]. Другой пример патологической репарации - это острый или хронический цирроз печени, при котором стромальные клетки синусоидов инициируют фиброз в виде активно пролиферирующей рубцовой ткани из матрикса и миофибробластов. Это ведет к формированию портальной гипертензии и печеночной недостаточности [Schuppan D., 2008; Atzori L. et al., 2009]. Различные повреждения миокарда ведут к активации интерстициальных фибробластов, формированию избытка фиброзной ткани, кардиосклерозу, что множественными путями снижает функциональные характеристики миокарда [Weber К. et al., 1989]. Нервная ткань в ответ на повреждение также формирует глиальный рубец. Однако патогистологическое исследование тканей не дает ответа на вопрос о путях и механизмах правильной клеточной репарации.

Изучение репарации повреждений тканей и органов в норме и при патологии требует разработки новых клеточных моделей in vitro.

Сравнительно недавно эксплантаты поврежденной соматической ткани, а также 2D/3D культуры с модельными дефектами стали использовать для изучения вклада локального эпителия и мезенхимы, а также локальных и циркулирующих стволовых клеток в репаративные процессы. Накопленные предварительные данные показали множественные механизмы и пути участия

соматических и стволовых клеток в репарации повреждений. Остается актуальным вопрос, почему эпителио-стромальные резервы тканей и органов взрослых организмов не участвуют в формировании полноценной регенеративной ткани без фиброза.

В последнее время показано, что локальная и системная трансплантация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) ускоряет процессы репарации в поврежденных органах и тканях. Например, трансплантация ММСК, выделенных из костного мозга, в зону глубокого кожного повреждения блокировало избыточный фиброз и формирование рубца в очаге повреждения [Smith A.N. et al., 2009; Falanga V., 2009]. Введение ММСК в системный кровоток блокировало формирование мелких и средних хронических повреждений эндотелия и стимулировало реэндотелизацию крупных повреждений [Devanesan A.I. et al., 2009]. Трансплантация ММСК оказалась эффективной при лечении хронической и подострой печеночной недостаточности и сахарного диабета I и II типа [Онищенко Н.А. с соав., 2009]. Однако до сих пор остаются не изученными механизмы репарационных эффектов ММСК в органах при разной патологии.

Показано, что ММСК направленно находят мелкие и средние повреждения in vivo [Anjos-Afonco F. et al., 2004], что указывает на возможность их участия в клеточной репарации [Kopen J.C. et al., 1999; Ortiz L.A. et al., 2003]. В зоне повреждения разных соматических тканей ММСК пролиферировали и дифференцировались в разных направлениях под влиянием локальных сигналов микроокружения [Devine S.M. et al., 2003]. Однако остается неизученным, могут ли ММСК влиять на равновесие и границы между эпителием и стромой органа, снимать блок реэпителизации, запускать процессы репаративной регенерации и каков вероятный механизм этого процесса. Первые результаты исследований в этом направлении показали, что циркулирующие в кровотоке ММСК с высокой эффективностью опознавали мелкие эпителиальные повреждения, адгезировались в данной зоне, приобретая эпителиальный статус, и участвовали в репарации [Prockop D.J., 2009; Syn W.K. et al., 2009].

Разрабатываемая в нашей лаборатории концепция пластичности ММСК дала основание предположить, что эти клетки in vitro и in vivo формируют модули с клетками, находящимися в двух устойчивых эпигенетических состояниях [Репин B.C. и др. 2006; Сабурина И.Н. и др. 2009]. Согласно этой гипотезе, пластичные эпителио-мезенхимальные сфероиды (ЭМ-сфероиды) служат донорами эпителия/стромы в зонах повреждения, когда процесс реэпителизации ограничен.

Исследование образования эпителио-мезенхимальных сфероидов in vitro открывает новую модель для изучения эпителио-мезенхимальной пластичности клеток и дает возможность с новых позиций изучать клеточные механизмы 3D репарации поврежденных органов и тканей, что представляется актуальным, научно и практически значимым.

Цель исследования. Изучить эпителио-мезенхимальную пластичность ММСК в 2D/3D культуре диссоциированных клеток и культуре эксплантатов фетальной и взрослой ткани и их вклад в репаративные процессы при повреждении эпителио-стромальных тканей в условиях эксперимента.

Задачи исследования.

1. Изучить формирование репаративных сфероидов в культуре миниэксплантатов фетальных тканей (головного мозга, миофибрилл, слизистой оболочки тонкой кишки, сетчатки) и органов взрослого организма (миофибрилл, тонкой кишки, сетчатки).

2. Получить и изучить сфероиды из первичных диссоциированных культур здоровых органов и тканей (стромальных клеток жировой ткани, пупочного канатика, сетчатки, миобластов). Изучить индуктивную роль поврежденных миниэксплантатов в 3D культуре.

3. Разработать воспроизводимую модель 3D культивирования ММСК; исследовать полученные сфероиды ММСК на жизнеспособность и уровень экспрессии мезенхимальных и эпителиальных маркеров.

4. Исследовать и сопоставить эпителио-мезенхимальную пластичность клонов ММСК в 2D и 3D культуре.

5. На моделях животных с экспериментальной патологией исследовать поведение ММСК, соматических клеток при системном и локальном введении и проверить возможность формирования репарационных сфероидов в зонах повреждений.

6. Обобщить полученные результаты и обосновать новые представления о роли сфероидов в репарации взрослых тканей в норме и при патологических процессах.

Научная новизна. Впервые отработана оригинальная воспроизводимая методика получения ММСК человека и животных в стабильном эпителио-мезенхимальном статусе в 2D и 3D культуре. Прослежена динамика образования сфероидов и проведена характеристика фенотипа и поведения in vitro. Данная технология позволяет наращивать мезенхимальные стромальные клетки человека в виде лабораторных репаративных модулей с регулируемым соотношением эпителий/строма. Прогениторные клетки в сфероидах становятся непосредственными предшественниками эпителия и стромы в

зоне повреждений ткани. За счет эпителио-мезенхимальной пластичности сфероиды могут стать донором эпителия, одновременно блокируя фиброз.

Также впервые была разработана и изучена методика получения ЭМ-сфероидов из ферментативно диссоциированных соматических клеток разных органов и тканей (первичные культуры РСК пупочного канатика, подкожной жировой ткани, скелетных мышц).

Подтверждена способность поврежденных нормальных фетальных и взрослых тканей и органов формировать репаративные агрегаты (сфероиды) в культуре изолированных мини-эксплантатов.

Впервые было продемонстрировано, что трансплантация ММСК и миобластов человека в скелетную мышцу тс1х-линии мышей приводила к ограниченному новообразованию дистрофин+ мышечных волокон в зоне введения (преимущественно в раневом канале). Ограниченную миграцию миобластов и ММСК наблюдали в течение только первых 6 часов после введения.

При трансплантации НСПК и ММСК человека крысам с ишемическим повреждением головного мозга также наблюдали ограниченную (в течение первых 6 часов) миграцию ММСК на незначительное расстояние с образованием новых капилляров вокруг зоны введения. НСПК при трансплантации сохраняли способность к миграции до 10 дней с последующей дифференцировкой введенных клеток в нейроны и глию.

Внутриартериальная трансплантация ММСК человека приводила лишь к частичной репарации островковой ткани поджелудочной железы с улучшением показателей эндокринного статуса и восстановлению структуры почечных гломерул.

Предложена гипотеза, что наблюдаемая эффективность трансплантаций ММСК при повреждении как эпителиальных, так и соединительных тканей объясняется их эпителио-мезенхимальной пластичностью, проявляющейся в 30 культуре.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые описаны лабораторные условия и протокол получения сфероидов из ММСК с автоматической обратимой конверсией стромальных клеток в эпителий. До сих пор способность к спонтанной обратимой эпителио-мезенхимальной конверсии клеток была описана в трех тканях зародыша: примитивной полоске, узелке и нервном гребне.

Вторым важным источником репаративных сфероидов являются мини-эксплантаты поврежденных фетальных тканей и органов. Третьим источником репаративных сфероидов могут служить диссоциированные

клетки из взрослых тканей и органов. Добавленные мини-эксплантаты поврежденной ткани индуцировали образование репаративных сфероидов со смешанным эпителио-мезенхимальным фенотипом. Клетки в сфероидах формировали интенсивные межклеточные контакты и ограниченно синтезировали фрагменты базальной мембраны. Сфероиды являются первичной регенерационной тканью. Полученные по данной методике сфероиды могут быть использованы как модель многофункциональных модулей для изучения сигнальных и клеточных механизмов физиологической регенерации и репарации.

Полученные данные имеют также существенное значение для трансплантологии и клинической медицины, подсказывая пути создания более оптимальных «репарационных модулей» на базе первичных сфероидов млекопитающих и человека.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Изолированные ММСК костного мозга, фетальных и взрослых эксплантатов, а также первичных диссоциированных культур взрослых органов и тканей способны формировать сфероиды в 3D культуре с ограниченной способностью к синтезу экстрацеллюлярного матрикса.

2. В формирующихся сфероидах активно идет обратимая мезенхимо-эпителиальная конверсия незрелых клеток, сопровождающаяся экспрессией ранних генов эмбриогенеза.

3. Эффективность клеточных трансплантаций ММСК при различных повреждениях объясняется эпителио-мезенхимальной пластичностью 3D модулей.

4. В патологически измененных тканях формирования репаративных сфероидов не наблюдается.

Апробация работы проведена на межлабораторной конференции УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН. Основные положения диссертации были многократно доложены на международных научных конгрессах и конференциях, в том числе на конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, 1998), Международном междисциплинарный семинаре «Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина» (Словакия, Татры, 2003), II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), Международной научной конференции «Фундаментальные основы инженерных наук» (Москва, 2006), Британско-Российском Конгрессе по проблемам изучения стволовых клеток (Москва, 2007), III и V

Международном междисциплинарном Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2007, 2009), Международном научном симпозиуме «Стволовые клетки, перспективы применения» (Австралия, Сидней, 2007), 7-ой Всероссийской научно-практической конференции «Федоровские чтения - 2008» (Москва, 2008), Международном симпозиуме «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Москва, 2009), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине» (Тула, 2009), IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010), Международном симпозиуме «Стволовые клетки в биологии и медицине» (Португалия, Лиссабон, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 статей (в т.ч. 19 статей в рецензируемых журналах), 19 тезисов докладов, 1 монография (в соавторстве), получено 8 Российских патентов и 2 Международных патента.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы и изложена на 261 странице машинописного текста. Список литературы включает 396 источников (55 - отечественных и 341 -зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 52 рисунками и 9 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Клеточные культуры

Для получения первичной культуры мулыпипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека мононуклеарную фракцию клеток изолировали из костного мозга здоровых доноров (п=9) градиентным центрифугированием с фиколлом по протоколу, предложенному Девидом Прокопом. [Prockop D. et al. 2007]. Затем клетки высевали с высокой плотностью в чашки Петри в ростовой среде (а-МЕМ, 17% FCS (Fetal Clone Serum), L-глютамина (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин). ММСК животных выделяли из красного костного мозга большеберцовых и бедренных костей GFP+ и GFP" мышей (п=40). Для этого разрезали кожу, тщательно отсепаровывали большеберцовые и бедренные кости, отрезали эпифизы и инсулиновым шприцем, заполненным средой а-

8

MEM с добавлением L-глутамина 2мМ и гентамицина 50мкг/мл, промывали полость кости, извлекая строму костного мозга,. Полученные суспензии центрифугировали в течение 7 мин при 1000 об/мин, супернатанты сливали, осадки ресуспендировали в ростовой среде (а-МЕМ, 20 % FCS, L-глютамина (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин). Клетки высевали с высокой плотностью в чашки Петри.

Стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) животных и человека получали по методу, описанному Zuk [P. Zuk., et al. 2001]. Выделенные у животных (п=51) из области нижней части живота фрагменты ткани подкожного жира и полученные в процессе хирургической операции с добровольного согласия пациентов (п=11) фрагменты подкожной жировой ткани человека в стерильных условиях механически измельчали до получения суспензии мелких фрагментов, дезагрегировали в растворе коллагеназы I типа (0,07%) и диспазы (0,025%) в течение 25-30 мин. В полученный раствор с ферментами и оставшимися фрагментами ткани добавляли полную ростовую среду, пропускали через нейлоновый фильтр и центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин, после чего супернатант сливали, осадок ресуспендировали в среде культивирования (DMEM/F12 (1:1), L-глутамин (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин, 10% FCS. Клетки высевали в чашки Петри с высокой плотностью.

Стромальные клетки пупочного канатика человека (СКПК) получали из фрагментов ткани канатиков (п=9) размером 1-2 см, которые тщательно промывали раствором Хенкса с антибиотиками, измельчали механически ножницами, дезагрегировали в растворе коллагеназы I и IV типа (0,07%) в соотношении 1:1 в течение 6 часов, добавляли среду для культивирования и фильтровали через алюминиевую сеточку (размер пор 1мм2). Затем центрифугировали в течение 7 мин при 1000 об/мин, после чего супернатант сливали, осадок ресуспендировали в ростовой среде ДМЕМ/Р12 (1:1) с добавлением L-глютамина (2мМ), гентамицина (50мкг/мл), ИТС (1:100) и 10% FCS и высевали на чашки Петри с высокой плотностью.

Миобласты (МБ) человека (п=6) и животных (п=40) получали по единой методике. Полученные в процессе хирургической операции с добровольного согласия пациентов фрагменты мышечных волокон механически измельчали ножницами, дезагрегировали в растворе диспазы (0,5%) в течение 30 мин. В полученную суспензию добавляли ростовую среду и центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, супернатант сливали, осадок ресуспендировали в среде культивирования (DMEM/F12

(1:1), L-глутамин (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин, 20% FCS, FGF (Юнг/мл) и высевали в чашки Петри.

Далее все культуры помещали в стандартные условия С02-инкубатора (5% С02, 37°С), через 24 часа отмывали раствором Хенкса, среду меняли на свежую. В дальнейшем среду меняли каждые 48 часов, пассируя культуры при достижении 70% конфлюэнтности с посевной плотностью 1-2x105 клеток/мл. Рост и состояние культивируемых клеток контролировали с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия) в видимом и ультрафиолетовом диапазонах, фоторегистрацию осуществляли цифровой камерой AxioCam HRC (Carl Zeiss, Германия). Для проведения экспериментов использовали клетки 2 пассажа.

Нейральные стволовые и прогениторные клетки (НСПК) животных и человека выделяли из головного мозга эмбрионов мышей 14 дней развития (п=40) и головного мозга человека 11 недель развития (абортивный материал) (п=8). После освобождения от мозговых оболочек головной мозг помещали в ростовую среду, механически дезагрегировали с помощью пипетки до получения однородной клеточной суспензии и центрифугировали в течение 5 мин при 800 об/мин. Супернатант сливали, осадок ресуспендировали в среде культивирования (DMEM/F12 (1:1), L-глутамин (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин, FGF (Юнг/мл), EGF (Юнг/мл), В27 (1:100), N2 supplement (1:100), 2% FCS). Клетки высевали в чашки Петри в концентрации 1-2x106 клеток/мл. Культуру помещали в стандартные условия С02 -инкубатора (5% С02, 37°С). Через 3 сут суспензию образовавшихся агрегатов центрифугировали 5 мин при 600 об/мин, супернатант удаляли пипеткой, добавляли свежую ростовую среду и продолжали культивировать, меняя среду через каждые 48 часов, пассируя культуру при достижении полного монослоя. Для последующих экспериментов использовали клетки 2 пассажа.

Исследование клоногенности клеток. Клеточные культуры высевали с плотностью 5-10 клеток/см2. Через 2 нед клетки отмывали и инкубировали в 1 % растворе кристалвиолета в метаноле. После чего чашки промывали водой и подсчитывали колонии с диаметром более 1 мм.

Иммуноцитохимия. Культуры фиксировали в 4% растворе параформальдегида, затем блокировали 5% бычьим альбумином (Sigma). Далее инкубировали с антителами к нестину (1:20; Biogenesis), виментину (1:10; V2258; Sigma), десмину (1:100; Biotrend), а-ГМА (1:200; Chemicon), миозину (1:200; Chemicon), коллагену I типа, коллагену III типа, коллагену IV типа (1:100; 2003605; Chemicon), GFAP (1:250; DAKO), ß-тубулину (1:100; Abeam), PODXL (1: 1000; R&D systems), аб-интегрину (1: 250; MP4F10;

R&D systems), а4-интегрину (1:200; 44H6; Abeam), c-Met (1: 250; clone 95309; R&D systems), a затем с несущими флюоресцентную метку видоспецифичными вторичными антителами (1:1000, Alexa-594 or Alexa-488, 1:200, FITC; Invitrogen).

Проточную цитометрию проводили на цитометре FACScaiibur (BD Biosciences) с программным обеспечением CellQuest. Прибор стандартизовали при помощи микрогранул (7, 10, 15 и 20 микрон Dynosphere Uniform Microspheres; Bangs Laboratories Inc.; Fisher scientific). Для исследования клеточные культуры инкубировали в фосфатном буфере, содержащем 1% бычьего альбумина и первичные антитела, а затем, при необходимости, с вторичными антителами.

Наличие хромосомных аберраций в клеточных культурах проверяли методом сравнительной геномной гибридизации, основанном на одновременной гибридизации двух различно меченых библиотек ДНК, одна из которых была выделена из анализируемой ткани, а другая - из кариотипически нормальной и являлась контролем. Исследования были выполнены на базе лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН под руководством н.с. Черемных А.Д.

Культивирование минижеплантатов тканей.

Постхирургические перивитальные фрагменты нормальных и патологических тканей измельчали ножницами до мелких (1-3 мм) кусочков, которые помещали в чашки Петри в ростовую среду и культивировали в течение 2-3 недель. Состав ростовой среды соответствовал среде, которую использовали для культивирования диссоциированных первичных клеточных культур, полученных из этих тканей.

2.3D культивирование ММСК, СКЖТ и СКПК

Клеточные сфероиды получали методом «висячей капли». Монослойные клеточные культуры 2 пассажа снимали с чашек, подсчитывали количество клеток в камере Горяева, центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде до конечной концентрации 5-6,5х 104 клеток/мл. Для получения «висячих капель» из полученной суспензии на крышку 90-мм чашки Петри (Corning) наносили капли объемом 30 мкл. Для предотвращения испарения в чашку добавляли 5-6 мл полной ростовой среды. Клетки культивировали в «висячих каплях» в стандартных условиях С02 -инкубатора (5% С02, 37°С) в течение 6 сут.

Для изучения динамики формирования и включения клеток в состав сфероидов проводили следующие эксперименты: 1) готовили суспензию

СКЖТ GFP+ и СКЖТ GFP" в соотношении 1:1 для получения СКЖТ сфероидов; 2) суспензию ММСК GFP+ и ММСК GFP" в соотношении 1:1 для получения ММСК сфероидов; 3) к формирующимся (на 3 сут) и уже сформированным (на 6 сут) сфероидам СКЖТ GFP' и ММСК GFP" добавляли суспензию клеток ММСК GFP+ в концентрации 5-6,5><104 клеток/мл и продолжали культивирование в течение 3 сут. Для получения вторично прикрепленных культур сфероиды после б сут культивирования в «висячих каплях» помещали на пластик, обработанный ламинином, фибронектином, коллагеном I и IV типа.

Иммуноцитохимическое исследование. 3D культуры фиксировали в 4% растворе параформальдегида, затем блокировали 5% бычьим альбумином (Sigma). Сфероиды инкубировали с антителами к нестину (1:20; Biogentsis), виментину (1:10; V2258; Sigma), а-ГМА (1:200; Chemicon), коллагену I типа, коллагену IV типа (1:100; 2003605; Chemicon), ламинину (1:100; Chemicon), СК18 (1:100; RAHC44; ИМТЕК), а затем с несущими флюоресцентную метку видоспецифичными вторичными антителами (1:1000, А1еха-594 или Alexa-488, 1:200, FITC; Invitrogen). Докрашивали флуоресцентным красителем бис-бензимид (Hoechst 33258, Sigma)

3D культуры анализировали с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия) с лазерной конфокальной приставкой LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия) и Leica TCF SPE (Leica, Германия) в видимом и ультрафиолетовом диапазонах. Фоторегистрацию осуществляли цифровой камерой AxioCam HRC (Carl Zeiss, Германия). Регистрацию и обработку изображений вели с помощью программ AxioVision, LSM и LAS AF.

Жизнеспособность 2D и 3D культур оценивали с помощью трипанового синего (0,4%, 2-3 мин, 25°С) и иодида пропидия (1,7мкмоль/мл, 15мин, 25°С) по стандартным протоколам.

Трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия.

Сфероиды фиксировали глютаровым альдегидом (1,5% раствор на 0,1М какодилатном буфере, рН=7,3; 1-2 часа), дофиксировали 0s04 (1% раствор на 0,1М какодилатном буфере, 1,5часа), отмывали от 0s04 в 0ДМ какодилатном буфере, вновь помещали агрегаты в глютаровый альдегид (1,5% раствор на 0,1М какодилатном буфере, рН=7,3) и хранили при 4°С. Отмытые от фиксатора в растворе 0,1М какодилатного буфера (рН=7,3) сфероиды проводили по спиртам (40°С, 50°С, 70°С, 96°С, 100°С) по 3-5 минут в каждом растворе. Затем осуществляли сушку препаратов в ацетоне в критической точке для дальнейшего исследования на сканирующем электронном микроскопе. Для трансмиссионного исследования сфероиды обезвоживали в

12

ацетоне и 1 сут инкубировали при комнатной температуре в смеси ацетона/смолы (3:1). На следующий день переносили в чистую эпоновую смолу и оставляли на сутки при 37°С и на 2 сут при 58°С. Полученные блоки серийно резали на ультратоме «Tesla» (толщина среза 1-2 мкм) до максимального диаметра клеточного агрегата. Полутонкие срезы окрашивали 0,5% раствором толуидинового синего в 1% растворе буры по стандартной методике (Детлаф и др., 1974) и фотографировали в видимом световом диапазоне под микроскопом Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия) с помощью цифровой камеры AxioCam HRC (Carl Zeiss, Германия).

Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-111 (Швеция), окрашивали в 1% растворе уранилацетата/свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Полученные препараты изучали под электронным трансмиссионным микроскопом JEM-100B.

3. Исследование поведения ММСК и НСПК после инъекции в органотипическую культуру сетчатки

Сетчатку выделяли из энуклеированных глаз новорожденных (2 дня) крыс Wistar (п=56) после декапитации (по протоколу Kretz А., 2007), промывали раствором Хенкса с антибиотиками и помещали в культуральную чашку с полной ростовой средой (DMEM/F12 (1:1), L-глутамин (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин, FGF (Юнг/мл), EGF (Юнг/мл), В27 (1:100), N2 supplement (1:100), 5% FCS). Среду меняли каждые 48 часов. Клетки (ММСК GFP+ и НСПК GFP+) инъецировали (500-1000 клеток/0,1 мкл) на 10 сут культивирования стеклянным капилляром диаметром 30 мкм при помощи микроинъекционной приставки под бинокуляром Olimpus CZX 20 и продолжали культивировать в течение 6 сут. Для прижизненного наблюдения за поведением инъецированных клеток применяли метод конфокальной микроскопии на микроскопе Leica TCS SPE с программным обспечением Leica application suite advanced fluorescence (LAS AF). Для иммуногистохимического анализа использовали виментин (1:10; V2258; Sigma), GFAP (1:250; G9269; Sigma), ß-тубулин (1:100; MAB1637; Chemicon) с последующим использованием вторичных антител Texas read, Су2.

4. Экспериментальные исследования на животных

Трансплантацию МБ и ММСК в скелетные мышцы мыши

проводили на лабораторных мышах линий ICR (самцы возраста 2-2,5 мес., п=55) и C57BL/10J-mdx (mucular dystrophy X-chromosome linked, самцы возраста 4-6 мес., п=29), Для визуализации клетки перед трансплантацией окрашивали флуоресцентным красителем бисбензимид (Hoechst 33258, Sigma). Мышей наркотизировали внутрибрюшинным

введением калипсола (500 мг/10мл; Гедеон Рихтер АО, Венгрия) в расчете 0,004 мл/г массы животного. В поверхностную и среднюю ягодичные мышцы (m. glutaeus superficialis, т. glutaeus médius) с помощью гамильтоновского шприца вводили MB и ММСК в разведении 500 тыс. клеток/мкл на глубину 2-3 мм. Проводили 5 инъекций на расстоянии 3-5 мм друг от друга. Общее количество введенных клеток составило 2,5><10б клеток в 5мкл. Контрольной группе вводили равный объем 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. Через 30 мин, 2, 4, 6 и 18 ч, 21 и 37 сут после проведенной операции мышей умерщвляли, диссектировали ягодичную мышцу, замораживали в жидком азоте и готовили серийные криостатные срезы толщиной 10-15 мкм, которые высушивали при комнатной температуре и просматривали под люминесцентным микроскопом. По люминесцентному свечению клеток, окрашенных бисбензимидом, отбирали срезы с трансплантированными клетками, которые инкубировали с моноклональными антителами мыши к дистрофину человека (1:100; Abeam) в течение 2 часов при 37°с и с антимышиными иммуноглобулинами козы, конъюгированными с фикоэритрином (1:100; Abeam).

Трансплантацию НСПК и ММСК выполняли на самцах крыс линии Wistar 2 месячного возраста с моделью локальной ишемии головного мозга (п=46) путем дистальной окклюзии левой средней мозговой артерии (ипсилатеральное полушарие) (Chen S.T., 1986). Крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением калипсола (500 мг/10мл; Гедеон Рихтер АО, Венгрия) в расчете 0,004 мл/г. Клетки, предварительно окрашенные бисбензимидом (Hoechst 33258, Sigma) (0,5><105 клеток/мкл), в объеме 4 мкл стереотаксически трансплантировали в область бокового желудочка противоположного полушария. Через 6 часов, 10 и 20 сут животных перфузировали транскардиально 4% параформом на 1 M фосфатном буфере pH 7,3, извлекали мозг, помещали на сутки в фиксатор, затем в 30% сахарозу и готовили криостатные срезы (20-40 мкм). Срезы просматривали под люминесцентным микроскопом. По люминесцентному свечению трансплантированых клеток, окрашенных бисбензимидом, отбирали срезы, часть которых окрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля, другую антителами к нестину (1:20; Biogentsis), виментину (1:10; V2258; Sigma), GFAP (1:250; DAKO), ß-тубулину (1:100; Abeam), а затем несущими флюоресцентную метку видоспецифичными вторичными антителами (1:1000, А1еха-594 или А1еха-488, 1:200, FITC; Invitrogen).

Трансплантация ММСК мышам с моделированным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом проводили на

самцах иммунодефицитных мышей линии NOD /seid (NOD.CB 1 1-PrkdcU-, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) в возрасте 7-8 недель (n=52). Для моделирования стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета мыши ежедневно с 1 по 4 сут эксперимента получали иньекции 35мг/кг стрептозотоцина (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), растворенного в цитратном буфере. Мышей наркотизировали смесью кетамин/ксилазин, после чего внутриартериально вводили суспензию клеток инсулиновым шприцем (1-Зх10б клеток в 150 мкл).

Для гистологического исследования поджелудочную железу фиксировали формалином, затем раствором сахарозы, образец ткани заливали криопротектором (Tissue-Tek ОСТ Compound; Sakura Finetek, Torrance, CA) и подвергали быстрой заморозке в изопентане на сухом льду. Затем на криостате готовили срезы 5-8 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином (Н&Е, Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI, USA). Образцы почечной ткани фиксировали формалином в нейтральном буфере, затем раствором сахарозы, заливали парафином, готовили срезы толщиной 8 мкм и окрашивали по ШИК (PAS, Richard-Allan Scientific). Для иммуногистохимического исследования образцы тканей заливали криопротектором и замораживали в изопентане на сухом льду. Изготовленные на криостате срезы (5-10 мкм) окрашивали антителами к человеческому р2-микроглобулину (1:200; Roche, Switzerland), антигенам ядер человеческих клеток (1:200; clone 235-1; Chemicon, Temecula, CA, USA), человеческому инсулину (1:40; clone E2E3C2; Calbiochem, San Diego, CA, USA), мышиному инсулину (1:50; clone 182410; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), мышиному/человеческому PDX-1 (1:50; clone 267712; R&D Systems), мышиному/человеческому CD31 (1:500; clone MEC 13.3; BD Biosciences, San Jose, CA, USA), а затем видоспецифическими вторичными антителами (1:1000; Alexa-594 или Alexa-488; Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Во всех экспериментах для контроля срезы окрашивали только вторичными антителами.

Препараты исследовали на микроскопе Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия) с лазерной конфокальной приставкой LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия) и Leica TCF SPE (Leica, Германия) в видимом и ультрафиолетовом диапазонах, фоторегистрацию осуществляли цифровой камерой AxioCam HRC (Carl Zeiss, Германия). Регистрацию и обработку изображений вели с помощью программ AxioVision, LSM и LAS AF.

Статистический анализ результатов исследования проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 и SPSS 11,5. Для

расчета минимально необходимого количества животных во всех группах для каждого эксперимента использовали программу Power and precision (Biostat Inc., Englewood, NJ;). С использованием критериев Шапиро-Вилка и х2 Пирсона были проверены гипотезы о нормальности распределений исследуемых показателей. При сравнении параметров, имевших нормальное распределение, использовали t-тест для независимых выборок в предположении неравных дисперсий. При сравнении параметров, имевших ненормальное распределение, использовали критерий Манна-Уитни или критерий Крускалла-Уоллиса, а затем post-hoc анализ. Критический уровень значимости для всех статистических критериев принимали равным 0,05. Все показатели и значения представлены как средние и указано стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика первичных клеточных культур

2D культура стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ).

Суспензия клеток, полученная после выделения, была гетерогенна: в ней присутствовали клетки сосудистого эндотелия, фибробласты, стромальные клетки, макрофаги, перициты, гладкомышечные клетки. При дальнейшем культивировании на селективной среде в культуре в основном сохранялась фракция стромальных клеток, характеризующаяся высокой жизнеспособностью и пролиферативной активностью. При культивировании в низкой плотности (10 клеток/см2) СКЖТ формировали 2D колонии из мелких стромальных клеток (рис. 1В, цветная вставка 1). Анализ культуры СКЖТ после 2 пассажа методом проточной цитофлуориметрии показал, что доля CD34+ клеток варьировала в пределах 1,5-3%, CD 45+ - 4-6%, CD1 lb+ -1-2%, CD90+ - 90-100%, CD 105+ - 90-98% от общего количества клеток в культуре. Фенотип клеток, определенный по данным поверхностным маркерам не менялся на протяжении первых 4 пассажей и соответствовал фенотипу, описанному и принятому Международным обществом клеточной терапии для ММСК. При иммуноцитохимическом анализе в СКЖТ была выявлена экспрессия нестина, виментина (рис. 1А, 1Б, цветная вставка 1) и а-ГМА. Сохранение стабильности кариотипа СКЖТ после 2 пассажа было показано с помощью метода сравнительной геномной гибридизации.

2D культура стромальных клеток пупочного канатика (СКПК).

В процессе культивирования СКПК время удвоения на 2 пассаже в среднем составило 48 часов. Визуально в культуре было выявлено два вида клеток: «классические» фибробласты, имеющие крупное, распластанное по

16

пластику культуральной чашки тело и клетки меньшего размера с длинным веретеновидным телом (Рис. 2А). Соотношение этих двух типов клеток в культуре менялось в процессе культивирования. В начале культивирования преобладали клетки первого типа, после 2-3 пассажей - второго (Рис. 2Б).

При рассеве в низкой плотности (10 клеток/см2) СКПК формировали активно пролиферирующие 20 колонии из мелких стромальных клеток (Рис. 2В). Доля клеток, экспрессирующих С034 составляла 0,5-2%, СБ 45 - 2-5%, СОНЬ - 3-7%, СБ90 - 90-99%, СО 105+ - 85-97% от общего количества клеток. После 2 пассажа практически все клетки экспрессировали виментин, который распределялся однородно по всему объему клетки, фибронектин, а-ГМА и белки внеклеточного матрикса - коллагены I и IV типа (Рис. 3, цветная вставка 1). Методом сравнительной геномной гибридизации было показано отсутствие хромосомных аберраций в первичных и пассированных культурах СКПК.

Рис. 2. Культура СКПК человека: А - СКПК (0 пассаж), треугольные стрелки - клетки I типа, вытянутые; - клетки II типа; Б - СКПК (2 пассаж); В -образование колонии из СКПК. Фазово-контрастная микроскопия. У в. у-10.

2Г) культура миобластов человека (МБ).

Выделенные из мышечной ткани клетки прикреплялись к пластику культуральной чашки в течение первых 12 часов. Учитывая разную скорость прикрепления клеток разного фенотипа к подложке, уже на втором пассаже в ростовой среде, рекомендованной для культивирования миобластов, получали культуру, содержащую более 90% МБ с высокой жизнеспособностью и пролиферативной активностью (рис. 4). При рассеве клеток в низкой плотности (10 клеток/см2) МБ формировали 21) колонии из мелких стромальных клеток. Анализ культуры МБ человека после 2 пассажа методом проточной цитофлуориметрии показал, что доля С034+ клеток варьировала в пределах 1-5%, СО 45+ - 0,5-4%, СО!1Ь+ - 3-7%, С090+ - 96-98%, СО 105+ -88,3-95% от общего количества клеток.

Рис. 4. Культуры MB человека: А - первичная культура; Б - культура MB (2 пассаж); В - образование симпластов и миотубов, 26 сут культивирования. Фазово-контрастная микроскопия. Ув. ><10.

МБ экспрессировали десмин, миозин (рис. 5, цветная вставка 1) и а-ГМА и не экспрессировали коллаген I и коллаген III. При длительном культивировании (25-28 сут) в высокой плотности без пассирования наблюдали формирование симпластов и миотуб (рис. 4В).

2D культура нейральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК).

Первичные суспензии НСПК в селективной, безсывороточной среде формировали клеточные кластеры, которые в процессе культивирования постепенно увеличивались в размерах (рис. 6А). Через 6-7 сут после первого пассажа НСПК из дезагрегированных в растворе трипсина/версена (1:1) клеточных кластеров переводили на полную питательную среду, содержащую 2% FCS, в которой уже на 1 сут НСПК прикреплялись к поверхности культуральных чашек, и дальнейшее культивирование велось в виде монослойной (2D) культуры (рис. 6Б, 6В).

Рис. б. Первичная культура НСПК человека (11 нед гестсщии): А - первичная суспензионная культура НСПК, 4 день культивирования, ув. х4; Б - 2И культура НСПК (1 пассаж), ув. х10; В - 2Э культура НСПК (2 пассаж), у в Фазово-контрастная микроскопия.

Результаты иммуногистохимического исследования показали, что НСПК, формирующие первичные агрегаты и нейросферы, более гетерогенны по клеточному составу. Наряду с нестинположительными стволовыми клетками и виментинположительными прогениторными клетками в них были

выявлены дифференцирующиеся клетки, экспрессирующие вРАР (маркер глиальных клеток) и бета-тубулин (дифференцировочный маркер нейронов). Адгезивные культуры были менее гетерогенны, 80% культуры было представлено нестинположительными клетками, 40%-50% виментинположительными клетками и только 10%-20% приходилось на дифференцирующиеся клетки, экспрессирующие вРАР и бета-тубулин (рис. 7, цветная вставка 1).

Проведенное исследование первичных культур показало, что разработанные методы забора, выделения и культивирования позволили получить воспроизводимые культуры РСК с высоким содержанием стволовых и прогениторных клеток, которые по фенотипу и экспрессии маркерных белков соответствовали фенотипу ММСК.

Шулыпипотентные мезенхималыше стромальные клетки костного мозга (ММСК).

В ходе проведенных исследований была модифицирована технология получения ММСК костного мозга. Был разработан оптимальный протокол выращивания ММСК в низкой плотности (нпММСК), направленный на получение максимального выхода клеток из одного биоптата костного мозга человека и сохранения высокого качества культуры. Во всех опытах при начальной плотности посева - 100 клеток/см2 на 5 сут после пассажа получали культуру нпММСК с конфлуэнтностью 50%-60% и выходом 40006000 клеток/см2. На 9 сут после пассажа получали культуру с 100% конфлуэнтностью и плотностью - 40000-60000 клеток/см2 (ММСК, выращенные в высокой плотности (впММСК)). Показано, что нпММСК имели большую способность к образованию колоний (рис. 8, цветная вставка 1), чем впММСК. Также жизнеспособность нпММСК была выше. Дифференцировочный тест показал, что нпММСК более эффективно дифференцировались в адипоциты и минерализующие клетки, чем впММСК.

Культуры нпММСК и впММСК экспрессировали маркеры к СБ73 (8589%), СБ90 (90-99%), СБ105 (90-99%) и не экспрессировали к СБ34 (0,5-4%), СО 45 (0,2-3%), СОНЬ (0,6-3%). Только для нпММСК был отмечен высокий уровень экспрессии белков РОБХЬ, интегрина-аб, интегрина-а4 и НОРК, который при увеличении срока культивирования без пассирования для впММСК резко понижался.

Таким образом, высокий уровень экспрессии маркерных белков является важным критерием чистоты и качества культуры ММСК с преобладанием клеток-предшественников с высокой клоногенной активностью, пролиферативным и дифференцировочным потенциалом. Подобранная оптимальная плотность посева (100 клеток/см2) и сроки культивирования нпММСК (не более 7 сут) позволяют получать

максимальное число высокоочищенных клеток ММСК в кратчайшее время. Клеточные культуры нпММСК, полученные по данной отработанной методике, применялись во всех дальнейших экспериментах.

2. Эпителио-мезенхимальная пластичность 20 культуры ММСК

При клональном культивировании высокоочищенных ММСК (с плотностью посева 5-10 клеток/см) наблюдали образование трех типов колоний: классические мезенхимальные, описанные в работах А.Я. Фриденштейна, и состоящие из фибробластоподобных клеток; эпителиоидные, состоящие из эпителиоподобных клеток; и смешанные, в состав которых входили как фибробластоподобные так и эпителиоидные клетки (рис. 9).

В фибробластоподобных колониях клетки экспрессировали СВ105, 14-кадгерин, виментин и а-ГМА. В эпителиоидных колониях клетки экспрессировали Е-кадгерин и нестин. Смешанные колонии состояли из клеток двух перечисленных фенотипов. При дальнейшем культивировании эпителиоидные и смешанные колонии исчезали из культур и только фибробластоподобные колонии оставались в культуре. Объяснить возникновение ЭМ-полиморфизма в 20 культуре ММСК (изначально однородной популяции) мы не смогли. Мы предположили, что ММСК в условиях культивирования могут находиться в двух состояниях: в статусе мезенхимы (стромы) и в статусе эпителия за счет эпителио-мезенхимальной пластичности. Но функциональное объяснение этому феномену клеток в 2Б культуре мы не нашли. Условия стандартных «жестких» режимов выделения, культивирования и многократного пассирования ММСК минимизируют фенотип изначально пластичных клеток. Кроме того, условия 2Э-культивирования с формированием цитоскелета и внеклеточного матрикса способствуют сохранению только одного стромального фенотипа клеток.

Рис. 9. Три типа колонии в 2Б культуре ММСК: А - фибробластоподобная колония; Б - эпителиоподобная колония; В - смешанная колония. Фазово-контрастнаямикроскопия. Ув.*10.

Переход от 20 к ЗБ культивированию, при котором минимизируется вклад внеклеточного матрикса и цитодифференцировка клеток, а значит, появляется

больше свободы морфологичекого перехода и возможностей для межклеточных взаимодействий, помогает сохранить природную пластичность ММСК.

30 культивирование миииэксилаитатов пренатальных и дефинитивных тканей.

Образование сфероидов в культуре минюксплантатов головного мозга 15-дневных зародышей крыс и фетусов человека (9-10 недель гестации) наблюдали уже через 1-2 сут культивирования. Кусочки эксплантатов формировали нейросфероиды (рис. 10А), которые при дальнейшем культивировании образовывали мультиагрегатные модули (рис. 10Б). На периферии сфероидов и между растущими агрегатами накапливались клетки округлой формы. Через 5-7 сут культивирования на поверхности некоторых неровных поврежденных эксплантатов наблюдали спонтанное образование новых сфероидов (рис. 10В). Сформировавшиеся сфероиды содержали нестин+, виментин+ и СРАР+ клетки.

Рис.10. Нейросфероиды из миниэксплантатов фетапьного головного мозга человека (10 нед. гестации): А - сформированные нейросфероиды (3 сут культивирования), ув. х20; Б - формирование модуля, ув. *10; В - формирующийся нейросфероид на поверхности эксплантата, ув. х20. Фазово-контрастная микроскопия.

Формирование организованных многослойных энтеросфероидов из миниэксплантатов слизистой оболочки тонкого кишечника человека происходило на 4-5 сут культивирования. Они состояли из плотно упакованных округлых клеток (рис. 11 А). Некоторые энтеросфероиды через 7-8 сут формировали внутреннюю неолуминальную полость (рис. 11Б). При дальнейшем культивировании на 10-12 сут наблюдали агрегирование некоторых энтеросфероидов между собой с образованием модулей из нескольких сфероидов (рис. 11В).

Рис. 11. Энтеросфероиды из слизистой оболочки тонкой кишки человека: А - Многослойный энтеросфероид через 4-5 сут культивирования, ув. *20; Б -энтеросфероид с полостью, ув. х20; В - модуль из нескольких энтеросфероидов (12 сут),ув. хЮ. Фазово-контрастная микроскопия.

В ходе культивирования фетальных и постнатальных миниэксплантатов сетчатки в роллерной установке или в культуральных чашках при постоянном пипетировании наблюдали формирование двух типов сфероидов: слоистых (рис. 12А), которые формировались на 4-5 сут культивирования, и розетко-подобных (рис. 12Б), которые появлялись позже, на 6-7 сут. Розетко-подобные сфероиды при культивировании в течение двух недель сохраняли радиальный каркас и упорядоченное послойное расположение клеток. На отдельных сформированных, но поврежденных при пипетировании, сфероидах сетчатки (в основном слоистых) наблюдали образование молодых сфероидов меньших размеров (рис. 12В). При адгезии сфероидов к пластику на 2-3 сут наблюдалась активная миграция клеток (из слоистых сфероидов - эпителильных, а из розетко-подобных - мелких веретеновидных). При культивировании эксплантатов сетчатки от больных, страдающих макулодистрофией или диабетической ретинопатией, формирования сфероидов не наблюдали.

Рис. 12. Эксплантаты сетчатки: А - слоистый сфероид миниэксплантата сетчатки мыши, ув. х20; Б - розетко-подобный сфероид человека, ув. *40; В -формирующийся сфероид на поверхности сформированного сфероида сетчатки мьиии, ув. хЮ; В. Фазово-контрастная микроскопия.

Рис. 1. 2D культура СКЖТ; А - экспрессия нестина (красный); Б - экспрессия виментина (зеленый); В - колония СКЖТ. А, Б - иммуноцитохимическое окрашивание, докраска ядер Hoechst 33258 (синий), ув. *40; В - окрашивание кристаллвиолетом, ув. *4.

Рис. 3. 2D культура СКПК: А - экспрессия виментина (красный); Б - экспрессия коллагена I типа (зеленый); В - экспрессия коллагена IV типа (зеленый). Иммуноцитохимическое окрашивание, докраска ядер Hoechst 33258 (синий). А, В - ув. х40; Б -ув.х 10.

Рис. 5. 2D культура МБ: А - экспрессия десмина (зеленый); Б - экспрессия миозина (красный). Иммуноцитохимическое окрашивание, докраска ядер Hoechst 33258 (синий). Ув. *40.

Рис. 7. 2И культура НСПК: А - экспрессия бета-тубулина (красный); Б - экспрессия СБАР (красный). Иммуноцитохимическое окрашивание, окраска ядерЭАР1 (синий). Ув. х40.

нпММСК впММСК 100 клеток 100 клеток А J Рис. 8. Общий вид чашек с колониями, окрашенными кристаллвиолетом. Б В

? ф V (\ ■ Ä \ J х ПЩцГ ш. %

Рас. 15. Сфероиды ММСК (б сут культивирования): А- экспрессия нестина (красный) и виментина (зеленый);Б - экспрессия CD 105 (красный) и коллагена IVmuna (зеленый); В - экспрессия ламинина (зеленый). Иммуноцитохимическое окрашивание, докраска ядер Hoechst 33258 (синий), сканирующая лазерная конфокальная микроскопия.

А Б

А " Б В

Г Д Е

Рис. 17. 3D сокультивирование: А -6 сут сокультивирования GFP-СКЖТ и GFP+СКЖТ; Б - 3 сут сокультивирования GFP-СКЖТ сфероида с GFP+ ММСК. (А, д - фазово-контрастная микроскопия. Б, в, г, Е - флуоресцентная микроскопия: Б - флуоресценция GFP+ клеток (зеленые); в - окрашивание ядер Hoechst 33258 (синий); г - окрашивание йодидом пропидия (красный); Е - совмещение изображений Б, в, г).

Рис. 16. Сфероид ММСК (6 сут культивирования): А,Б - сканирующая электронная микроскопия; В - трансмиссионная электронная микроскопия.

Масштабные отрезки - 200 ики

Рис. 18. Распределение вБР+ ММСК и йРР+НСПК в первые 3 сут после инъекции. Прослеживается наиболее активная миграция НСПК до образования дифференцированных клеток и образование агрегатов ММСК с последующей миграцией клеток из них.

Рис. 19. Распределение флуоресцентно меченых клеток в поврежденном головном мозге крыс (мозолистом теле) через 10 сут после трансплантации: А - флуоресцентно меченые ММСК, у в. х-10; Б — флуоресг^ентно меченые НСПК, ув. *20. Флуоресцентная микроскопия криосрезов.

Рис. 20. Распределение дистрофина в мышце тс!х мыши через 37 сут после введения клеток: А, Б -после введения МБ; В, Г - после введения ММСК. Поперечные гистологические срезы ягодичной мышцы мыши, обработанные антителами к дистрофину человека, конъюгированными с фикоэритрином. (А, В - флуоресцентная микроскопия; Б, Г -фазово-контрастная микроскопия, измерительный отрезок - 200 мкм).

¿¿РЖ-' ® А

■Л В

СД + нпММСК Здоровые мыши

'Ч

РОХ-1 (32-м икрогл обул ин « А рох-1 мЫшиныи инсулин

СД + нпММСК Здоровые мыши

/ ■Г > ) /) -^У А

\ - £

человеческий инсулин Р2-микроглобулин человеческий инсулин мышиный инсулин

Рис. 21. Исследование тканей поджелудочной железы (иммуногистохимия; 32 сут эксперимента) окраска антителами к человеческому инсулину, мышиному инсулину, /32-микроглобулину человека, РВХ-1, ядра окрашены ОАР1; толщина среза 5 мкм; увеличение Х400.

в2- микроглобулин мышиный инсулин

ч

3

г

т

Рис. 22. Исследование тканей поджелудочной железы (иммуногистохимия; 32 сут эксперимента; группа «СД+нпММСК»): окраска антителами к мышиному инсулину (зеленый), ¡32-микроглобулину человека (красный), ядра окрашены ОАР1; толщина среза 5 мкм; увеличение Х400, (вытянутые стрелки - клетки человека, треугольные стрелки - человеческие клетки, экспрессирующие мышиный инсулин).

Рис. 23. Гломерула почки мыши (иммуногистохимия, увеличение Х400). Трехмерная реконструкция изображения, полунного при деконволюционной микроскопии среза ткани. Двойное окрашивание антителами к антигенам ядер человеческих клеток и мышиному/человеческому СОЗ!, ядра окрашены ОАР1. Стрелками указаны плоскости деконволюции.

Миниэксплантаты скелетных мышц в виде изолированных фрагментов миофибрилл размером 3-5 мм готовили из биопсийной ткани человека или животных под бинокуляром, культивировали в течение 20-25 дней в ростовой среде в С02-инкубаторе при 5% С02 и 37°С (рис. 13А).

Рис. 13. Эксплантат скелетной мышцы человека: А - изолированные миофибриллы скелетной мышечной ткани, у в. х10; Б - формирующиеся агрегаты и сформированный миосфероид на краевом поврежденном конце мышечного волокна через 5 сут культивирования, ув. *20; В - миотубы из прикрепившихся миосфероидов, 12 сут культивирования, ув. х20. Фазово-контрастная микроскопия.

На 3 сут культивирования на раневой поверхности миофибрилл наблюдали формирование рыхлых клеточных агрегатов, которые к 5 сут преобразовывались в миосфероиды (рис. 13Б). При дальнейшем культивировании (12-15 сут) после прикрепления плавающих миосфероидов к пластику отмечали массовое выселение мелких полигональных клеток с последующим формированием новых миотубов (Рис. 13В). Из изолированных миофибрилл из биопсийной ткани людей, страдающих мышечной дистрофией Дюшена, миосфероиды не образовывались.

Культивирование миниэксплантатов показало, что механически поврежденные эксплантаты фетальных и взрослых тканей проявляют универсальную способность отвечать на повреждение образованием регенеративной ткани, имеющей сфероидную организацию. Эксплантаты взрослой патологически измененной ткани в сходных условиях культивирования сфероидов не формировали.

4. ЗБ культивирование диссоциированных первичных культур СКЖТ, СКПК, МБ и ММСК

Для всех первичных культур клеток, включая ММСК костного мозга, условия получения сфероидов были одинаковы: 1) метод «висячей капли»; 2) концентрация клеток, позволяющая получать сфероиды размером 100-150 мкм; 3) высокий уровень жизнеспособности клеток сфероида в течение всего периода культивирования; 4) динамика образования сфероидов.

На 3 сут культивирования формировались небольшие (20-30 мкм в диаметре), рыхлые скопления клеток. К 6 сут практически все кластеры и одиночные клетки формировали одиночные агрегаты, достигавшие 100-150 мкм в диаметре (рис. 14). Агрегаты становились более плотными, с гладкой

Рис. 14. Формирование сфероидов: А - 20 культура ММСК (2 пассаж); Б - образование клеточных агрегатов ММСК, 3 сут культивирования в «висячей капле»; В - клеточный агрегат ММСК(4 сут); Г - ММСК сфероид (6 сут); Д - СКПК сфероид (6 сут); Е - миосфероиды (6 сут). Фазово-контрастная микроскопия. Масштабный отрезок - ¡00 мкм.

поверхностью и характеризовались высокой жизнеспособностью клеток в сфероиде в течение 2 недель культивирования. Методом иммуноцитохимического окрашивания была показана экспрессия нестина, виментина, СБ 105 и компонентов базальной мембраны - коллагена IV типа и ламинина в сфероидах (рис. 15, цветная вставка 2). При дальнейшем культивировании отмечали формирование внешнего организованного слоя клеток в сфероидах (ламинацию) с одновременным усилением в них синтеза нестина и белков внеклеточного матрикса. Клетки в сфероидах экспрессировали не только мезенхимальные маркеры - СОЮ5 и виментин, но и маркеры примитивной энтодермы и нейроэктодермы - вАТА-б и нестин. Ламинация сфероидов была подтверждена методами сканирующей и

трансмиссионной электронной микроскопии (рис. 16, цветная вставка 2). Внутреннее пространство сфероидов состояло из плотно упакованных клеток и их отростков. Тела многих клеток имели лишь тонкий ободок цитоплазмы с минимальным содержанием органелл. Тонкие недифференцированные клеточные отростки содержали немногочисленные цитоплазматические включения. В поверхностном слое сфероидов клетки имели вытянутую форму и тесно прилегали друг к другу. Были видны электронноплотные участки плазмолеммы контактирующих между собой клеток, что свидетельствовало о протекающей в данный момент апикально-базальной поляризации клеточного слоя (рис. 16В, цветная вставка 2).

На 6 сут ЗБ культивирования часть сфероидов переносили в чашки Петри и продолжали культивировать в условиях 2Б культуры. Через сутки сформированные сфероиды адгезировали к пластику с последующим выселением и миграцией эпителиоподобных клеток из наружнего клеточного слоя. Ламинин усиливал миграцию клеток в течение первых 10 часов после адгезии сфероидов к пластику. Другие компоненты матрикса (фибронектин, коллаген I, коллаген IV) не влияли на миграцию клеток из сфероидов. Ускоренную миграцию клеток на ламинине, вероятно, можно объяснить стимуляцией экспрессии вАТА-б и активацией КОСК/Сс1с42 цитоскелета быстро мигрирующих клеток. По-видимому, в 2В культуре стромальных клеток происходит однонаправленный эпителио-стромальный переход, что объясняет исчезновение эпителиоподобных и смешанных колоний при клональном культивировании. Образование сфероидов ММСК в ЗБ культуре индуцирует стабильную стромально-эпителиальную конверсию, сопряженную с активацией экспрессии ранних генов эмбриогенеза.

При ЗБ сокультивировании клеток СКЖТ и ММСК, экспрессирующих маркер ОБР, полученных от мышей линии С57ВЬ/6-Т^'(АСТВ-ЕСРР)/0.5ЬЛ1, и клеток, не экспрессирующих вРР, полученных от мышей линии С57В1/61, формировались гибридные сфероиды. При сокультивировании СБР-СКЖТ и вРР+СКЖТ (1:1) в одной капле, СБР-ММСК и СБР+ММСК (1:1) и ОБР-СКЖТ и вБР+ММСК (1:1) на 6 сут образовывались гибридные сфероиды, состоящие из беспорядочно расположенных клеток обоих типов, с высокой жизнеспособностью (рис. 17А, цветная вставка 2). При добавлении суспензии вРР+ММСК или СИР+СККМ к уже сформированным 6-ти сут СРР-СКЖТ сфероидам к 3 сут меченые клетки встраивались исключительно во внешний слой сфероидов (рис. 14Б, цветная вставка 2). При ЗБ сокультивировании уже сформированных сфероидов, предварительно культивированных в течение 6 сут, через 1-2 сут наблюдали образование модулей из 2 и более сфероидов.

Таким образом, ЗЭ культивирование стромальных клеток открывает новые возможности для изучения механизмов и сигналов самосборки хаотически организованных клеток в ЗБ модули репарации поврежденных тканей и соматического эмбриогенеза млекопитающих и человека.

5. Исследование поведения ММСК и НСПК при инъекции в органотипическую культуру сетчатки Прижизненные наблюдения показали, что миграция инъецированных клеток начиналась через 10 мин после введения. НСПК активно мигрировали из зоны введения на значительные расстояния (1-5мм) за первые 6 часов. Через 3 сут они выходили за границы самого эксплантата и продолжали мигрировать по клеткам, выселяющимся из эксплантата (рис. 15, цветная вставка 3). Через 1 день после инъекции НСПК образовывали короткие неветвящиеся отростки. К 3 дню наблюдали образование длинных сильно ветвящихся тонких отростков, формирующих сети между собой и с клетками эксплантата. Результаты иммуногистохимического исследования показали, что мигрирующие клетки экспрессировали бета-тубулин и СБ АР.

Зона миграции ММСК была значительно меньше, чем у НСПК. Инъецированные клетки образовывали небольшие агрегаты, из которых затем мигрировало незначительное количество клеток, в основном в течение 1 сут после инъекции и незначительно на 2 и 3 сут. Наибольшей подвижностью обладали мелкие клетки (до 10 мкм). На 3 сут миграции ММСК не наблюдали. Отдельные мигрирующие клетки образовывали отростки, становясь похожими на нейрональные, но не экспрессировали дифференцировочных маркеров нейронов и глии.

Таким образом, инъецированные локально ММСК формировали агрегаты с мигрирующими клетками. Однако миграция клеток носила краткосрочный и ограниченный характер. Зоны миграции ММСК были значительно меньше, чем НСПК. Дифференцировки ММСК в нейрональном направлении не наблюдалось.

6. Трансплантация ММСК животным с экспериментальной патологией

Трансплантация ММСК и НСПК в мозг крыс с моделью локальной ишемии головного мозга

Результаты микроскопического исследования показали, что через 6 часов после трансплантации флуоресцентно меченные ММСК и НСПК распределялись в треке инъекции и на незначительном расстоянии от него, в коре мозга, мозолистом теле и латеральном желудочке. Через 10 сут после введения НСПК, попавшие в боковой желудочек, мигрировали по

эпителиальному слою желудочка и распределялись в его боковой стенке на расстоянии 0,5-1,5мм. Наиболее интенсивная миграция НСПК наблюдалась в области мозолистого тела. Клетки мигрировали на расстояние 2-3 мм от места введения (рис. 19Б, цветная вставка 3), достигая в отдельных случаях к 20 сут противоположного травмированного полушария. Мигрирующие НСПК через 10 сут экспрессировали виментин, бета-тубулин и в БАР. В клеточном слое коры миграция НСПК была значительно менее выраженной, наблюдалась только в течение первых 6 часов.

При трансплантации ММСК незначительную миграцию флуоресцентно меченных клеток наблюдали только в первые 6 часов после введения. Даже на 10 сут в области мозолистого тела, где отмечали наиболее интенсивную миграцию НСПК, ММСК мигрировали на минимальное расстояние - до 0,5 мм, основная часть флуоресцентно меченных ММСК оставалась в треке введения (рис. 19А, цветная вставка 3). Попавшие в полость бокового желудочка ММСК встречались исключительно только в полости желудочка в области сосудистого сплетения. Через 20 дней после введения в месте локализации ММСК по ходу трека отмечали образование большого числа новых капилляров. Периваскулярное накопление ММСК с ограниченным капиллярогенезом подтверждает про-ангиогенный эффект

трансплантированных клеток. Иммуногистохимическое исследование выявило в ММСК экспрессию нестина, но не выявило в этих клетках экспрессии маркеров нейрональной дифференцировки. Часто ММСК располагались небольшими группами, но образования репаративных сфероидов из ММСК в зоне введения не наблюдали.

Трансплантация ММСК и МБ животным в поврежденную мышечную ткань.

Через 0,5 часа после введения вокруг инъекционного трека начиналось формирование зоны миграции жизнеспособных трансплантированных клеток, в то время как погибшие клетки располагались только в треке (зоне повреждения). Спустя 3-4 часа трансплантированные клетки обнаруживались в мышечной ткани в стороне от инъекционного трека, а уже через б часов формировалась достаточно объемная зона распространения клеток (до 5-6 мм вокруг зоны повреждения), которая в дальнейшем практически не увеличивалась. Таким образом, зона распределения трансплантированных клеток в основном формировалась в течение первых 6 часов после инъекции за счет активной миграции живых клеток вдоль мышечных волокон и пассивного переноса по сосудам при их попадании в сосуд после инъекции.

Мышечные волокна, положительно окрашенные на дистрофии, были обнаружены у всех мышей, которым вводили клетки. При этом были выявлены существенные различия в локализации дистрофина в мышечной ткани при трансплантации ММСК и МБ. У мышей нормального фенотипа дистрофии располагался в кортикальной области мышечных волокон и выявлялся на препаратах сплошной светящейся зоной по периметру срезанных поперек волокон. При трансплантации МБ через 21 и 37 сут после инъекции обнаружены очаги дистрофин+ мышечных волокон, располагающихся только вокруг инъекционного трека. Наряду с волокнами с нормальным расположением дистрофина во внутренней зоне дистрофин+ области были обнаружены группы волокон с атипичным расположением дистрофина. Кроме яркого свечения по кортикальной области наблюдали выраженное диффузное свечение всего мышечного волокна (рис. 20А, цветная вставка 3). У животных с трансплантацией ММСК вокруг места введения клеток в мышечной ткани выявлялись дистрофин+ волокна только с нетипичным распределением флуоресцентной метки. Яркое свечение наблюдали по эпимизию и, в основном, по перимизию (рис. 20В, цветная вставка 3). Более ярко светились соединительнотканные оболочки мышечных волокон непосредственно около инъекционного трека, менее ярко по периферии зоны введения. Часто неравномерное свечение фикоэритрина выявляли вдоль соединительнотканной оболочки в виде дискретных, ярких очагов, соответствующих локализации отдельных дистрофин+ клеток. При трансплантации ММСК свечение фикоэритрина наблюдали на более дальних расстояниях от инъекционного трека по сравнению со свечением при трансплантации МБ. В обеих группах новые дистрофин+ области (соответствующие расположению трансплантированных клеток) занимали ограниченные зоны в мышечной ткани.

В наших исследованиях трансплантированные ММСК в мышцах mdx мышей были обнаружены в составе мышечных волокон с аномальным диффузным распределением дистрофина и аномальной морфологией ткани. Положительное свечение при окраске антителами к дистрофину дали также мелкие клетки, располагающиеся вдоль эпимизия и перимизия. Существуют данные, что трансплантированные клетки немиогенных фенотипов принимают участие в репарации, не демонстрируя экспрессию миоспецифических генов. Например, ММСК при пересадке в мышцы мышей с нокаутированным геном дельта-саркогликана сливались с мышечными клетками реципиента, не экспрессируя саркогликан [Cossu et al., 2004]. В наших экспериментах ММСК, введенные в мышцы mdx мышей,

экспрессировали дистрофии в аномальных миофибриллах.

Таким образом, трансплантированные ММСК и миобласты участвовали в репарации мышечных волокон за счет образования дистрофин+ мышечных волокон. Однако формирования репаративных сфероидов в очаге повреждения не наблюдали. Вероятно, репаративный сфероидогенез оказался блокированным в патологически измененных скелетных мышцах.

Трансплантация ММСК животным с стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом.

Животных разделили на 4 группы: 1-мыши с индуцированным сахарным диабетом, получавшие инъекцию ММСК («СД+ММСК»); 2-мыши с индуцированным сахарным диабетом, получавшие инъекцию фибробластов («СД+фибробласты»); 3-мыши с индуцированным сахарным диабетом, не получавшие клеток («СД»); 4- группа здоровых животных. Животным первой «СД+ММСК» группы вводили суспензию 2,5 х 106 ММСК на 10 и 17 сут после первой инъекции стрептозотоцина. Поскольку при сахарном диабете в первую очередь патологические процессы наблюдаются в поджелудочной железе и почках, репаративный эффект клеток оценивали по гистологии этих органов.

На 32 сут эксперимента наблюдали атрофию паренхимы поджелудочной железы животных в группе «СД». Размеры и численность островков были уменьшены, клетки в них плохо дифференцировались на подтипы, часть островков была гиалинизирована. Некоторые островки находились в состоянии гипертрофии. Наблюдали перидуктальный, перилобулярный склероз. По ходу протоков определяли лимфогистиоцитарную инфильтрацию. В группе «СД+ММСК» также наблюдали уменьшение численности и размеров островков. В отличие от группы «СД», сохранные островки находились в состоянии гипертрофии, в них определяли полиморфные клетки (что отражало, по-видимому, начало дифференцировки на подтипы). В группе «СД+ММСК» по сравнению с группой «СД» выявляли большее количество гипертрофированных островков.

ММСК человека в островках поджелудочной железы животных группы «СД+ММСК» экспрессировали мышиный инсулин, что было выявлено при двойном окрашивании антителами к человеческим клеткам (р2-микроглобулину человека) и мышиному инсулину (рис. 21, рис. 22, цветная вставка 4).

При гистологическом исследовании тканей почек на 32 сут эксперимента у животных группы «СД» были обнаружены клубочки разного

размера, часть клубочков была гиалинизирована и склерозирована. Единичные клубочки были гипертрофированы. Наблюдали расширение мезангиального матрикса, пролиферацию мезангиальных клеток, утолщение базальной мембраны капилляров и расширение и полнокровие сосудов всех калибров. Наблюдали также небольшие участки периваскулярных кровоизлияний и лимфогистиоцитарную инфильтрацию с примесью макрофагов. Некоторые канальцы были расширены, в их просвете определяли гомогенные эозинофильные массы (гиалиново-капельная дистрофия). В тканях почек животных группы «СД+ММСК» по сравнению с группой «СД» выявляли уменьшение мезангиального матрикса и гипопролиферацию мезангиальных клеток. Базальные мембраны капилляров были утолщены меньше, чем у животных группы «СД». Капиллярные петли клубочков были расширены, полнокровны.

Иммуногистохимическое исследование показало, что ММСК человека в почках локализовывались преимущественно в гломерулах. На некоторых срезах человеческие клетки были обнаружены в 20% гломерул. ММСК не были найдены в канальцах. Большинство гломерул содержали по одной человеческой клетке. Гломерулы с двумя и более человеческими клетками встречались редко, находясь на большом расстоянии друг от друга. Следовательно, клетки не делились после того, как приживлялись в почечной ткани.

Иммуногистохимическое исследование с двойным окрашиванием показало, что некоторые клетки человека окрашивались моноклональными антителами к CD31 — маркерному белку эндотелиальных клеток. На некоторых срезах было видно, что CD31+ ММСК человека имели вытянутую форму. Продольная форма клеток хорошо была видна на трехмерной реконструкции изображений, полученной при проведении деконволюционной микроскопии (рис. 23, цветная вставка 4). Экспрессия CD31 человеческими ММСК in vivo свидетельствовала о начале их дифференцировки в эндотелиальные клетки.

Существуют противоречивые данные относительно судьбы ММСК in vivo после трансплантации. 1) Происходит трансдифференцировка ММСК в условиях индукции сахарного диабета. Было установлено, что 1,7-3% островковых бета-клеток реципиентного животного являются клетками донорского костного мозга [Ianus A. et al., 2003]. 2) Происходит частичная химеризация: ММСК донора «сливаются» с клетками реципиента. На модели стрептозотоцин - индуцированного сахарного диабета у мышей с трансплантированными ММСК, трансфецированными геном GFP, было

отмечено усиление пролиферации островков Лангерганса и стойкая экспрессия клетками поджелудочной железы животных-реципиентов гена GFP [Choi J.B. et al., 2003]. 3) ММСК-опосредованное усиление пролиферации клеток островков и гипертрофия бета-клеток. Поскольку дифференцировка ММСК в островковые клетки продемонстрирована только in vitro, в настоящее время вопрос о механизмах участия ММСК в репарации после трансплантации остается открытым. Возможно эпителио-мезенхимальная пластичность ММСК, проявляющаяся при 3D культивировании и продемонстрированная в нашей работе, вносит свой вклад в процессы репарации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение фенотипической, морфологической и функциональной гетерогенности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vivo и in vitro было актуальным с момента их открытия А.Я. Фриденштейном. Сам А.Я. Фриденштейн назвал их мезенхимальными стволовыми клетками, полагая, что они имеют один устойчивый незрелый фенотип. Новые возможности изучения пластичности стромальных прогениторных клеток возникли в связи с разработкой новых методов 2D и 3D культивирования, позволивших количественно изучать динамику эпителио/мезенхимального статуса колоний или отдельных клеток in vitro.

Наши ранние исследования показали, что в условиях 2D культуры ММСК формировали эпителиоидные, мезенхимальные и смешанные эпителио/мезенхимальные колонии. В процессе дальнейшего культивирования и формирования внеклеточного матрикса происходила элиминация зпителиоидных и смешанных колоний. Однако потенциал ММСК к формированию зпителиоидных, мезенхимальных и смешанных колоний сохранялся при пассировании ММСК в низкой плотности. Это означает, что изначально клетки ММСК в 2D культуре находятся в двух устойчивых эпигенетических состояниях: эпителиальном и мезенхимальном. Условия 2D культивирования смещают равновесие в сторону стромального фенотипа.

Разработанная нами технология культивирования ММСК в 3D культуре позволила детально изучить эпителио-мезенхимальный статус клеток по мере агрегации и формирования зрелых сфероидов в суспензии.

Мы показали, что эпителиальные клетки возникают в сфероидах на стадии компактизации. Новообразованные нестин+, GATA6+ клетки нейроэктодермы и примитивной энтодермы мигрируют во внешний слой

сфер, где одновременно происходит синтез компонентов базальной мембраны (ламинин, коллаген IV). Созревание сфероидов заканчивается ламинацией -перераспределением новообразованных эпителиальных клеток во внешний слой сфероида.

Второе направление наших исследований связано с изучением формирования репаративных клеточных сфероидов из поврежденных миниэксплантатов фетальных и взрослых тканей. Образование репаративных сфероидов проходило в одинаковых условиях культивирования и имело похожую временную и количественную динамику. Репаративный сфероидогенез был прослежен на эксплантатах фетальной мозговой ткани, миофибриллах, сетчатке, слизистой оболочки тонкой кишки.

Результаты третьего направления исследований были связаны с изучением сфероидогенеза на базе диссоциированных клеток первичной культуры здоровых тканей. При 3D культивировании клетки агрегировали в суспензионные сфероиды. В присутствии индукторов (минифрагментов поврежденной ткани) образование сфероидов проходило гораздо быстрее. Временные и количественные закономерности сфероидогенеза оказались схожими у клеток первичных культур из разных тканей. In vitro новообразованные агрегаты, доставленные в зону повреждения, соучаствовали в репарации эпителио-мезенхимальных повреждений.

В отличие от нормальных тканей, диссоциированные клетки из первичных культур, полученных из патологически измененных органов и тканей, не формировали сфероидов. Таким образом, патологически измененные ткани теряли способность к формированию репаративных сфероидов in vitro.

В работе были прослежены эффекты локального введения ММСК и миобластов в поврежденную дистрофин-дефицитную скелетную мышцу mdx-линии мышей. Было показано, что трансплантированные ММСК и миобласты участвуют в репарации мышечных волокон за счет ограниченного образования здоровых дистрофин+ мышечных волокон. При этом формирования репаративных сфероидов в очаге повреждения не наблюдали. Очевидно, репаративный сфероидогенез блокируется в патологически измененной скелетной мышечной ткани. Введение ММСК в патологически измененную сетчатку, животным с ишемическим повреждением головного мозга, поджелудочную и почечную ткань диабетических животных также не сопровождалось образованием репаративных сфероидов.

На основании полученных по 4 направлениям исследования результатов была сформулирована и предложена новая концепция эпителио-

мезенхимальной пластичности ММСК. Согласно этой концепции, поврежденные нормальные ткани органов оказываются триггером, запускающим образование репаративных сфероидов из региональных или системно циркулирующих мультипотентных стромальных клеток. Репарирующие сфероиды являются бифункциональным донором-модулем эпителиальных и стромальных клеток, особенно в условиях, когда реэпителизация блокирована или ограничена.

Работа имеет новую технологическую научно-практическую перспективу, поскольку 3D культуры могут оказаться важным исходным сырьем для получения эпителио-мезенхимальных модулей репарации второго и третьего поколения. В теоретическом и прикладном плане изучение физиологии и эпигеномики репаративных сфероидов in vitro и in vivo открывает новые направления в разработке оригинальных биомодулей в регенеративной медицине.

ВЫВОДЫ

1. Эксплантаты фетальных и взрослых тканей в культуре формируют репаративные ЭМ- сфероиды из стромальных мезенхимальных клеток. Эксплантаты взрослой патологически измененной ткани в сходных условиях культивирования сфероидов не формируют.

2. При культивировании в низкой плотности ММСК костного мозга проявляют эпителио-мезенхимальную пластичность в виде формирования 2D колоний 3 видов: 1) типичных мезенхимальных колоний из CD105, N-кадгерин, виментин, альфа-актин позитивных клеток; 2) эпителиоидных колоний из Е-кадгерин, нестин позитивных клеток; 3) смешанных эпителио/мезенхимальных колоний из клеток двух перечисленных фенотипов.

3. Разработанная новая методика получения сфероидов ММСК в условиях 3D суспензионной культуры методом «висячей капли» позволяет проследить динамику образования сфероидов и провести характеристику фенотипа и поведения исходных изолированных ММСК и сфероидов ММСК.

4. Эпителио-мезенхимальная пластичность сфероидов ММСК подтверждена наличием эпителиоидных нестин+ GATA-6+ клеток с их преимущественной локализацией во внешнем слое сфероидов (вместе с компонентами базальной мембраны - ламинином, коллагеном IV). Высказано предположение, что сфероиды могут участвовать в репарации

за счет сбалансированной поставки эпителия и стромы в зону повреждения.

Диссоциированные клетки первичных культур нормальных органов и тканей, подобно тканевым эксплантатам, формируют 3D сфероиды. Добавление миникусочков поврежденной фетальной ткани ускоряет образование клеточных сфероидов в суспензионных культурах. Диссоциированные клетки первичных культур патологически измененных органов не формируют 3D сфероидов. Предложена гипотеза, что именно агрегаты стромальных клеток или ММСК являются модулем безрубцовой репарации.

При повреждении мышечной ткани введение ММСК и МБ приводило к ограниченному образованию новых дистрофин+ мышечных волокон в зоне введения. Трансплантированные ММСК в патологически измененной мышечной ткани репаративных сфероидов не формировали.

При трансплантации НСПК и ММСК крысам с ишемическим повреждением головного мозга ММСК мигрировали на незначительное расстояние в течение первых 6 часов. При этом отмечалось образование новых капилляров вокруг зоны введения. НСПК при трансплантации сохраняли способность к миграции до 10 дней с последующей дифференцировкой введенных клеток в нейроны и глию. ММСК формировали небольшие скопления в зоне, но образования репаративных сфероидов введения не наблюдали.

Системное введение ММСК животным с индуцированным стрептозотоцином диабетом приводило к частичному восстановлению островковой части поджелудочной железы и восстановлению нарушенной эндокринной функции. Системное введение ММСК животным с модельным повреждением почек приводило к восстановлению функции гломерул.

Предложена новая концепция об участии ММСК в репаративном восстановлении поврежденных тканей и органов за счет их ЭМ-пластичности, проявляющейся в 3D культуре.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

Александрова М.А., Сабурина И.Н., Корочкин Л.И., Ревищин A.B., Репин B.C., Ржанинова A.A., Сухих Г.Т. Поведение и дифференцировка

нейрональных стволовых клеток in vivo. // Известия АН. Серия биологическая. - 2001. - №6. - С. 656-665.

2. Александрова М.А., Полтавцева Р.А., Марей М.В., Ревищин А.В., Сабурина И.Н., Дубровина И.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т. Трансплантация культивированных нейральных прогениторных клеток человека в мозг крыс: миграция и дифференцировка. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2001. - Т. 132. - №10. - С. 455-458.

3. Александрова М.А., Сабурина И.Н., Полтавцева Р.А., Марей М.В., Дубровина И.В., Ревищин А.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т. Миграция и развитие нейральных стволовых клеток человека при трансплантации в мозг крыс. // Цитология. - 2001. - Т. 43. - №9. - С. 838.

4. Корочкин Л.И., Александрова М.А., Павлова Г.В., Башкиров В.Н., Ревищин А.В., Муркин Е.Н., Сабурина И.Н., Евгеньев М.Б., Зеленцова Е.Н., Модестова Е.А., Венгрова С.Н. Использование стволовых клеток дрозофилы для стимуляции развития аллотрансплантатов у крыс. // Цитология. - 2001. - Т. 43. - №9. - С. 867.

5. Alexandrova М.А., Saburina I.N., Poltavtseva R.A., Revistchin A.V., Korochkin L.I., Sukhikh G.T.. Behavior of human neural progenitor cells transplanted to rat brain. // Development Brain Research. - 2001. - Vol. 132. - Supp 1.2.-P. 1-3.

6. Сабурина И.Н., Ревищин А.В., Александрова М.А., Возникновение и дифференцировка НАДФН-Д - нейронов а онтогенезе коры мозга у крыс. // Онтогенез. - 2002. - Т. 33. - №1. - С. 36-42.

7. Ржанинова А.А., Горностаева С.Н., Гольдштейн Д.В., Сабурина И.Н., Репин В.С. Мезенхимальные стволовые клетки из фетального и донорского костного мозга человека: получение и сравнительная характеристика. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2003. - Приложение. -С. 39-43.

8. Сабурина И.Н., Семенова М.Л., Гольдштейн Д.В., Томм Н.А., Ржанинова А.А., Голиченков В.А., Репин В.С. Трансплантация эмбриональных миобластов и стромальных клеток костного мозга человека в скелетную мышцу мышей линии C57BL/10J-MDX. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2004. - Т. 137. - №5. - С. 593-596.

9. Миронов Н.В., Гольдштейн Д.В., Сабурина И.Н., Ржанинова А,А., Иванов С.А., Архипов С.Л., Шмырев В.И., Миронов И.Н., Свинов М.М., Голобородько Е.В., Репин В.С. Применение трансплантации нейрональных стволовых клеток для лечения ишемического инсульта. // Кремлевская медицина, клинический вестник. - 2004. - Т. 3. - С. 7779.

10. Патент на изобретение № 2242980. Приоритет изобретения 27.12.2004. «Культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека и способ их получения». Авторы: Гольдштейн Д.В., Репин B.C., Сабурина И.Н., Ржанинова A.A., Шаменков Д.А., Макаров

A.B., Бажанов H.A., Пулин A.A., Фатхудинов Т.Х.

11. Патент на изобретение № 2242981. Приоритет изобретения 27.12.2004. «Биотрансплантат и способ лечения дегенеративных и травматических заболеваний суставного хряща». Авторы: Гольдштейн Д.В., Репин

B.C., Сабурина И.Н., Ржанинова A.A., Шаменков Д.А., Макаров A.B., Бажанов H.A., Пулин A.A., Фатхудинов Т.Х.

12. Миронов Н.В., Сабурина И.Н., Ржанинова A.A., Шмырев В.И., Миронов И.Н., Архипов С.Л., Иванов С.А., Кузнецова С.Е., Репин B.C. Применение трансплантации нейрональных стволовых клеток для лечения ишемического инсульта. // Актуальные вопросы клинической транспортной медицины. -2005. - Т. 13. - С. 512-521.

13. Миронов Н.В., Иванов С.А., Миронов И.Н., Сабурина И.Н., Архипов

C.Л., Репин B.C. Лечение паркинсонизма. // Актуальные вопросы клинической транспортной медицины. -2005. - Т. 13. - С. 531-537.

14. Патент на изобретение № 2258521. Приоритет изобретения 20.08.2005. «Биотрансплантат и способ лечения ишемического инсульта». Авторы: Миронов Н.В., Гольдштейн Д.В., Горяйнова И.И., Архипов С.Л., Иванов С.А., Миронов И.Н., Шмырев В.И., Репин B.C., Сабурина И.Н., Ржанинова A.A., Шаменков Д.А., Макаров A.B., Фатхудинов Т.Х.

15. Патент на изобретение № 2259836. Приоритет изобретения 10.09.2005. «Биотрансплантат и способ лечения паркинсонизма». Авторы: Миронов Н.В., Гольдштейн Д.В., Горяйнова И.И., Архипов С.Л., Иванов С.А., Миронов И.Н., Шмырев В.И., Репин B.C., Сабурина И.Н., Ржанинова A.A., Шаменков Д.А., Макаров A.B., Фатхудинов Т.Х.

16. Патент на изобретение № 2265442. Приоритет изобретения 10.12.2005 Биотрансплантат и способ лечения остеопороза. Авторы: Гольдштейн Д.В.,Макаров A.B., Фатхудинов Т.Х., Репин B.C., Шаменков Д.А., Ржанинова A.A., Сабурина И.Н., Пулин A.A., Утяшев И.А., Бажанов Н.А

17. Репин B.C., Сабурина И.Н. Обратимые эпителио-мезенхимальные трансформации клеток в эмбриогенезе и постнатальном обновлении тканей. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2006. -Т. 3. - №5. - С. 64-73.

18. Репин B.C., Сабурина И.Н. Эмбриональные и взрослые стволовые клетки: место в современной медицине. // Лабораторная медицина. -2006. - №8. - С. 33-43.

19. Репин B.C., Архипов СЛ., Миронов Н.В., Сабурина И.Н., Танкович Н.И., Миронов И.Н, Сравнительная характеристика поведения НСК, МСК, эндотелиальных прогениторных клеток и нейронов в зоне ишемического инсульта: от верифицированной экспериментальной платформы в клинику. // Актуальные вопросы клинической транспортной медицины. - 2006. - Т. 15. - С. 501-538.

20. Патент на изобретение № 2271818. Приоритет изобретения 20.03.2006. «Биотрансплантат, способ его получения и способ лечения косметических дефектов кожи (варианты)». Авторы: Гольдштейн Д.В., Макаров A.B., Фатхудинов Т.Х., Репин B.C., Шаменков Д.А., Ржанинова A.A., Сабурина И.Н., Пулин A.A., Утяшев И.А., Бажанов H.A., Швецова Е.В.

21. Патент на изобретение № 2272638. Приоритет изобретения 27.03.2006. «Биотрансплантат, способ его получения и способ лечения хронического гепатита и цирроза печени (варианты)». Авторы: Гольдштейн Д.В., Макаров A.B., Фатхудинов Т.Х., Репин B.C., Шаменков Д.А., Ржанинова A.A., Сабурина И.Н., Пулин A.A., Утяшев И.А., Бажанов H.A.

22. Репин B.C., Сабурина И.Н., Сухих Г.Т.. Клеточная биология фетальных тканей и фундаментальная медицина. // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2007. - №3. - С. 123-133.

23. Репин B.C., Сабурина И.Н., На пути к расшифровке кодов эмбриональных стволовых клеток. И Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2008. - Т. 3. - №2. - С. 30-35.

24. Тахчиди Х.П., Гаврилова H.A., Ланевская Н.И., Тищенко О.Е, Сабурина И.Н., Сергеев С.А., Павлова Г.В., Рыбалкина Е.Ю., Ревищин A.B. Влияние Авастина и фактора пигментного эпителия (PEDF) на состояние органотипических культур сетчатки // Объединенный медицинский журнал,- 2008. - Т. 217 - С. 43-48.

25. Гундорова P.A., Ченцова Е.В., Купрашвили И.Т., Зуева М.В., Цапенко И,В., Сабурина И.Н., Репин B.C., Ревищин A.B. Влияние ксенотрансплантации мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток на восстановление структурной организации и функциональной активности сетчатки при её повреждении // Вестник офтальмологии. -2008.-Т. 124.-№3.-С. 14-18.

26. Мелихова В.С., Сабурина И.Н., Орлов А.А., Репин В.С., Новикова Н.И., Мурашов А.Н. Исследование безопасности использования аутологичных, аллогенных и ксеногенных культур клеток-предшественников из подкожной жировой ткани. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2008. - Т. 3. - №3. - С. 2634.

27. Пулин А.А., Сабурина И.Н., Репин В.С. Поверхностные маркеры, характеризующие мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга человека. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2008. - Т. 3. - №3. - С. 5263.

28. Сергеев С.А., Кошелева Н.В, Сабурина И.Н., РевищинА.В., Семенова M.JI. Исследование поведения клеток стромы костного мозга и пигментного эпителия глаза при инъекции в органотипические культуры сетчатки.//Цитология. - 2008. - Т. 50. -№9.-С. 821.

29. Galoyan А.А., Korochkin L.I., Pavlova G.V., Saburina I.N., Zaraiskí E.I., Galoyan N.A., Davtayn Т.К., Bezirganyan K.B., Revishchin A.V. Hipothalamic Prolin-Rich Polipeptide Enhances Bone Marrow Colony-Forming Cell Proliferation and Stromal Progenitor Cell Differentiation // Cell Transplantation. - 2008. - Vol. 17. - №9. - P. 1061-1066.

30. Мелихова В.С., Сабурина И.Н., Орлов А.А., Мартиросян И.А., Репин

B.С., Новикова Н.И., Мурашов А.Н.Моделирование функционального остеогенеза с использованием биодеградируемого матрикса и аутогенных стромальных клеток подкожной жировой ткани. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2009. - Т. 4. -№1. - С.59-68.

31. Далгатов Г.Д., Зубрицкий В.Ф., Сабурина И.Н., Репин В.С., Деев Р.В., Зайцева И.В., Минок М.Н., Далгатова М.А. Применение клеточных и рентгенэндоваскулярных технологий в сочетании с региональной перфузией перфторуглеродной эмульсии в течение хронических диффузных заболеваний печени. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2009. - Т. 4. - №2. - С.76-86.

32. Гаврилова Н.А., Ланевская Н.И., Бакаева Л.М., Борзенок С.А., Павлова Г.В., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Шацких А.В., Сабурина И.Н., Сергеев С.А., Влияние нейротрофического фактора головного мозга -BDNF на органотипические культуры сетчатки. // Офтальмохирургия. -2009. - №.1. - С. 44-47.

33. Тахчиди Х.П., Гаврилова Н.А., Ланевская Н.И., Тищенко О.Е, Борзенок

C.А., Шацких А.В., Сабурина И.Н., Сергеев С.А., Павлова Г.В.,

Рыбалкина Е.Ю., Ревищин А.В. Сравнительная характеристика влияния фактора пигментного эпителия (PEDF) и Авастина на органотипические культуры сетчатки // Офтальмохирургия. - 2009. -№4. - С. 45-49.

34. Сабурина И.Н., Горкун А.А., Кошелева Н.В., Семенова М.Л., Пулин А.А., Репин B.C. Сопоставление поведения стромальных клеток пупочного канатика и мультипотентных стромальных клеток взрослого костного мозга в 2-D и 3-D культуре: моделирование стромальной регенерации. // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - №4. - С. 9-11.

35. Молчанова Е.С., Семенова М.Л., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Ивановская М.Г. Проникновение антисмысловых олигонуклеотидов в стромальные клетки жировой ткани мыши. // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - №4. - С. 11-13.

36. Международный патент на изобретение US Patent 20090214485 A1 OTAugust 27, 2009. Stem cell therapy for the treatment of experimental diabetic retinopathy and diabetic optic neuropathy. Inventors: Gavrilova N, Saburina I, Mironov N.

37. Международная заявка на изобретение WO 2009/120111 А1 от 01.10.2009. Method for producing fibroplast cells from the newborn's navel-cord. Inventors: Prikhod'ko A, Isaev A, Kiseljov S, Lagar'kova M, Kosheleva N, Saburina I, Melikhova V.

38. Сабурина И.Н., Репин B.C. 3D культивирование: от отдельных клеток к регенерационной ткани (К вопросу о феномене эпителио-мезенхимальной пластичности) // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2010. - Т. 5. - №2. - С.75-87.

39. Семенова М.Л., Сергеев С.А., Сабурина И.Н. Использование органотипической культуры сетчатки как модели для исследования миграционной активности трансплантированных клеток. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2010. - Т. 5. - №2. - С.56-62.

40. Патент на изобретение №2384618 от 20.03.2010. «Способ получения эмбриональных фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного». Авторы: Приходько А.В., Исаев А.А., Киселев С.Л., Лагарькова М.А., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Мелихова B.C.

41. Репин B.C. и Сабурина И.Н. Клеточная биология развития. М.: И.С.К.Ч., 2010.-200с.

Тезисы докладов

42. Сабурина И.Н., Клещинов В.Н., Александрова М.А. Ультраструктурные изменения сосудистой ткани головного мозга реципиента под воздействием эмбриональных нейротрансплантатов. // Тезисы конференции: Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей. - М., 1998. - С. 27.

43. Сабурина И.Н., Ржанинова A.A., Семенова M.JI, Голиченков В.А., Репин B.C.Трансплантация культивированных миобластов в скелетные мышцы мыши. // Международный междисциплинарный семинар: Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина. -Словакия. Татры., 2003. - С.107-111

44. Семенова M.JI., Сабурина И.Н. Метод двойного флуоресцентного окрашивания для оценки краткосрочных эффектов при трансплантации клеток в предклинических исследованиях. // Материалы Всероссийской научной конференции: Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы развития. - М., 2003. - С. 263-264.

45. Сабурина И.Н., Семенова М.Л., Гольдштейн Д.В., Ржанинова A.A., Томм H.A., Голиченков В.А., Репин B.C. Выделение, характеристика и трансплантация миопрогениторных клеток человека. // Материалы II Московского Международного Конгресса: Биотехнология: состояние и перспективы развития. - М., 2003. - С. 132-133.

46. Ржанинова A.A., Горностаева С.Н., Гольдштейн Д.В., Сабурина И.Н., Репин B.C. Мезенхимальные стволовые клетки из эмбриональных и взрослых тканей. Получение и характеристика. // Материалы II Московского Международного Конгресса: Биотехнология: состояние и перспективы развития. - М., 2003. - С. 130-131,

47. Гарелик Е.И., Лукин Е.С., Муравьев Э.Н., Сабурина И.Н., Сафина М.Н., Сафронова Т.В., Кондратьев С.Н., Орлов A.A.. Биоактиная высокопористая керамика на основе гидроксиапатита и ее применение для пластики кости. // Сборник трудов Международной научной конференции: Фундаментальные основы инженерных наук. - М., 2006.

48. Saburina I.N. and Repin V.S.. Dormant stem cells (DSC) in embryogenesis and cancerogenesis. Proceedings of the British-Russian workshop in association with the European Commission: Stem cells: policy, research, and innovations. European Union - Russian Federation perspectives. -Moscow, 2007.

49. Сергеев C.A., Кошелева H.B., Бакаева Л.М., Ревищин A.B., Семенова М.Л., Сабурина И.Н. Влияние нейротрофического фактора головного

мозга (BDNF) на эксплантаты сетчатки крыс и человека in vitro // III Международный междисциплинарный Конгресс: Нейронаука для медицины и психологии. - Судак, Украина, 2007. - С. 180

50. Ченцова Е.В., Купрашвили И.Т., Иванов А.Н., Зуева М.В., Цапенко И.В., Сабурина И.Н., Репин B.C. Воздействие трансплантации обкладочных клеток эктодермального происхождения на регенерацию сетчатки в эксперименте. // Юбилейная научно-практическая конференция: Федоровские чтения -2007. - М., 2007. - С. 214.

51. Сабурина И.Н., Мелихова B.C., Кошелева Н.В., Горкун A.A., Исаев A.A., Приходько A.B., Репин B.C. Характеристика клеток, выделенных из пупочного канатика. // Международный симпозиум: Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения. - М.: МГУ, ФФМ, 2008. - С. 49-50.

52. Ченцова Е.В., Купрашвили И.Т., Иванов А.Н., Зуева М.В., Цапенко И.В., Сабурина И.Н., Ревищин A.B. Трансплантация аутологичных нейрональных стволовых/прогениторных клеток при травме сетчатки // 7-я Всероссийская научно-практическая конференция: Федоровские чтения - 2008 - М., 2008. - С. 331.

53. Горкун A.A., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В., Ревищин A.B., Павлова Г.В., Репин B.C. Индукция миогенной дифференцировки стромальных клеток основного вещества пупочного канатика. // Материалы Всероссийской научной школы-конференции для молодежи. - М., 2009.-С. 21.

54. Сергеев С,А., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Ревищин A.B., Семенова M.JI. Сравнение поведения нейральных стволовых/прогениторных клеток и клеток пигментного эпителия глаза при инъекции in vivo и in vitro. // Материалы Всероссийской научной школы-конференции для молодежи. М„ 2009. - С. 65.

55. Горкун A.A., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В., Исаев A.A., Приходько A.B., Репин B.C. Характеристика фибробластоподобных клеток пупочного канатика человека. // Тезисы VII Международной конференции: Молекулярная генетика соматических клеток. - М., 2009.-С. 58.

56. Сергеев С.А., Горкун A.A., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Семенова М.Л. Исследование поведения стромальных клеток костного мозга в составе 3D культур нейросетчатки. // Пятый международный междисциплинарный конгресс: Нейронаука для медицины и психологии. - Судак, 2009.

57. Тахчиди Х.П., Гаврилова Н.А., Комова О.Ю., Сабурина И.Н., Сергеев С.А., Павлова Г.В., Рыбалкина Е.Ю., Ревищин А.В. Влияние различных типов человеческих прогениторных клеток на функциональное состояние сетчатки и степень выраженности дегенеративных изменений сетчатки у крыс линии Кэмпбелл. // Сборник материалов Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи: Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине. - Тула, 2009. - С. 8-9.

58. Евсеенков Э.Ф., Скобцова Л.А., Орлов А.А., Сабурина И.Н., Репин

B.C., Бизяев А.Ф., Горелик Е.И., Новикова Н.И. Исследование активности формирования костной ткани из композиции ChronOS ТМ+МСК в эксперименте. // Сборник материалов Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи: Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине. - Тула, 2009. -С. 16-17,

59. Сабурина И.Н., Репин B.C. От ЭСК-эмбриогенеза к МСК-репарации. // Сборник материалов Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи: Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине. - Тула, 2009. - С. 35-39.

60. Gavrilova N.A., Saburina I.N., Revischin A.V., Pavlova G.V., Takhchidi

C.P., Lukashev A. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) improves cell viability in post mortem human retinal explant cultures and enhances neurite regeneration from ganglion ctlls. // Thirteenth Ahnual Vision Research Conference: Retinal Ganglion Cells. Development, function and disease. Florida, USA, 2010.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

PCK - региональные стволовые клетки

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки НСПК- нейрональные стволовые/прогениторные клетки СКЖТ - стромальные клетки жировой ткани

СКПК - стромальные клетки основного вещества пупочного канатика МБ - миобласты

ЭМ-сфероиды - эпителио-мезенхимальные сфероиды

а-ГМА - гладкомышечный альфа актин

EGF - epidermal growth factor (эпидермальный фактор роста)

FGF - fibroblast growth factor ( фактор роста фибробластов)ММСК GFP+ -мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)/Osb/J, экспрессирующие маркер EGFP.

EPITHELIO-MESENCHYMAL PLASTICITY OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS IN NORMAL AND PATHOLOGY (EXPERIMENTAL RESEARCH)

I.N.SABURINA

The scientific term "mesenchymal stem cells" (MSCs) term survived several generations of scientists who kept opinion that undifferentiated stromal progenitors pertain only mesenchymal phenotype. The first breakthrough has been done by our lab findings in 2D MSC culture. It was found, that purely isolated MSCs can form 3 types of flat colonies on plastic: 1) mesenchymal 2) epithelial and 3) mixed epithelio-mesenchymal 2D aggregates. 3 years later our lab demonstrated the epithelial-mesenchymal MSC cell plasticity in a suspension 3D MSC culture. The compaction and lamination of MSC spheroids have been described as the late phase of MSC spheroid maturation in vitro. We observed the accumulation of early nestin+, GATA6+ cell at the outer layer of spheroids with a laminin+, collagen IV+ fragments of basal epithelial lamina. Then we were able to describe and examine the details of MSC spheroid participation in the repair of various adult tissue via direct cooperation with the injured epithelial and stromal recipient tissue. According to a new concept the mixed epithelio-mesenchymal spheroids serve as a donor module both epithelial/stromal cells in the areas of organ/tissue regeneration. This new concept about the functional mission of MSCs has been found new support on a new model of fetal and adult tissue mini-explants. The cultured mini-explants of healthy organs were found to generate the reparative spheroids in the area of surface injury. The time- and dose-response of spheroid formation were similar to that of MSC spheroids. In contrast to normal healthy tissue, the formation of spheroids in a pathological tissues was completely arrested. More over, the direct injection of MSCs to pathological mdx-mouse skeletal muscle was found to induce the local neogenesis of distrophin+ myofibers but without the formation of reparative spheroids from injected MSCs. Summing up these data, a new physiological concept of MSC plasticity has been suggested. The injured tissue in healthy organ play the role of trigger which initiates the regional formation of reparative spheroid from local pool of stromal cells or via aggregation of circulating stromal cells.

Заказ № 103-а/10/10 Подписано в печать 18.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 mvw.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.ги

С середины XX века сформировалась концепция, что все органы и ткани млекопитающих и человека способны к физиологической и репаративной регенерации [8, 30,43].

Спонтанная физиологическая репарация и поддержание общей численности клеток характерны для всех здоровых органов. Каждый орган имеет свой независимый автоматический ритм клеточных обновлений (7-10 дней для полного обновления! кишечной крипты, несколько месяцев для полного обновления эндотелия артерий, 4 — 8 месяцев для полного обновление миоцитов в одной миофибрилле, 4-6 месяцев для полного обновления гепатоцитов в ацинусе, несколько лет для полного обновления клеток гиппокампа головного мозга). Удаление единичных устаревших клеток происходит путем апоптоза, а восстановление (замещение одиночных клеток органа) происходит за счет пролиферации/ миграции соседних эпителиальных или эндотелиальных клеток. Региональные стволовые клетки и мезенхимальные клетки костного мозга могут лишь опосредованно влиять на темпы естественного обновления клеток в разных органах.

При мелких и средних повреждениях эпителия или эндотелия тип репаративного ответа зависит от состояния базальной мембраны, разделяющей паренхиму и строму. Причиной повреждений могут быть региональная ишемия, вирусы, иммунные, механические, химические и сигнальные факторы. Мелкие повреждения (3-5 клеток) восстанавливаются за 24-48 часов при отсутствии повреждений базальной мембраны. За несколько часов поверхность раны покрывается распластанными тромбоцитами и лейкоцитами. Подлежащая строма секретирует ростовые факторы (ЬБОР, ЕОБ, НОР), ускоряющие пролиферацию и распластывание соседних эпителиальных (эндотелиальных) клеток. Через 48 часов целостность пласта полностью восстанавливается без видимого участия стромы.

В случае мелких и средних повреждений пласта с одновременным разрывом базальной мембраны подлежащая строма локально производит фиброзную ткань из фибробластов и матрикса, заполняющих весь раневой дефект ткани. Одновременно краевые эпителиальные (эндотелиальные) клетки формируют второй пул фибробластов путем эпителио-мезенхимальной трансформации [399]. Под действием дополнительных сигналов из фибробластов формируются линии миофибробластов, продуцирующих рубцовую ткань. Миофибробласты образуются только во взрослой репарационной ткани. Они полностью отсутствуют в фетальных органах после повреждений. Миофибробласты подавляют ре-эпителизацию и способствуют формированию рубца после повреждений. Показано, что в зоне хронических дефектов накапливаются стромальные прогениторы из циркулирующей крови. Мононуклеары и ММСК тормозят рост фиброзной ткани. Избыток грануляционной ткани образуется, когда в популяции преобладают пролиферирующие перициты из периваскулярных пространств [137]. Таким образом, если мелкие и средние повреждения фетальных органов и тканей завершаются безрубцовой физиологической регенерацией, то те же дефекты взрослых тканей могут инициировать очаги фиброза (патологической репарации). Быть или не быть фиброзу - зависит от региональных факторов микроокружения.

В случае крупных повреждений эпителиальной паренхимы возникает очаг патологической репарации в виде потока фибробластов, миофибробластов, грануляционной ткани, который резко сдвигает равновесие и границы между эпителием и стромой органа. Поэтому полноценная регенерация поврежденных взрослых тканей при разной патологии часто невозможна.

Атеросклеротическая фиброзная бляшка — характерный пример патологической репарации, запускаемой активированной соединительной тканью сосуда [336, 384]. Другой пример патологической репарации -это острый или хронический цирроз печени, при котором стромальные клетки синусоидов инициируют фиброз в виде активно пролиферирующей рубцовой ткани из матрикса и миофибробластов. Это ведет к портальной гипертензии и печеночной недостаточности [67, 334]. Различные повреждения миокарда ведут к активации интерстициальных фибробластов, формированию избытка фиброзной ткани, кардиосклерозу, что множественными путями снижает функциональные характеристики миокарда [392]. Нервная ткань в ответ на повреждение также формирует глиальный рубец. Однако патогистологическое исследование тканей не дает ответа на вопрос о путях и механизмах клеточной, репарации. Остаётся неизвестным, почему при средних и крупных повреждениях дефинитивных тканей не мобилизуются и не принимают участие в репарации собственные запасы региональных стволовых клеток (РСК), а наблюдается патологическая репарация (фиброз) в ответ на повреждение.

Изучение репарации повреждений тканей и органов в норме и при патологии требует разработки новых клеточных моделей in vitro.

Сравнительно недавно эксплантаты поврежденной соматической ткани, а также 2D/3D культуры с модельными дефектами стали использовать для изучения вклада локального эпителия и мезенхимы, а также локальных и циркулирующих стволовых клеток в репаративные процессы. Накопленные предварительные данные показали множественные механизмы и пути участия соматических и стволовых клеток в репарации повреждений [36, 37, 177]. Но остается актуальным вопрос, почему региональные и системные эпителио-стромальные резервы тканей и органов взрослых организмов не дают полноценной регенеративной ткани без фиброза.

В последнее время показано, что локальная и системная трансплантация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

ММСК) ускоряет процессы репарации в поврежденных органах и тканях. Например, трансплантация ММСК из костного мозга в зону глубокого кожного повреждения блокировала: избыточный фиброз и формирование рубца в очаге повреждения [145, 343]. Введение ММСК в кровоток блокировало формирование мелких и средних хронических повреждений эндотелия и стимулировало реэндотелизацию крупных повреждений [133]. Трансплантация ММСК оказалась эффективной нри= лечении хронической и подострой печеночной- недостаточности и сахарного диабета I и II типа [10, 45, 51, 273]; Однако до сих пор остаются не изученными механизмы репарационных эффектов ММСК в органах при разной патологии.

Показано- что ММСК направленно находят мелкие и средние повреждения in vivo [63], что указывает на возможность их участия в клеточной репарации! [231, 298]: В зоне повреждения разных соматических тканей ММСК пролиферировали и дифференцировались в разных направлениях под влиянием локальных сигналов микроокружения [134]. Однако не известно, могут ли ММСК влиять на равновесие и границы между эпителием; и стромой органа, снимать блок реэпителизации, запускать репаративную регенерацию, и каков вероятный механизм этого процесса. Первые результаты исследований в этом? направлении показали, что циркулирующие в кровотоке ММСК с высокой эффективностью опознавали мелкие эпителиальные повреждения. Часть адгезированных ММСК приобретали эпителиальный статус, участвуя в репарации [318, 358].

Разрабатываемая в нашей лаборатории концепция эпителио-мезенхимальной (ЭМ) пластичности ММСК дала основание предположить, что мультипотентные стромальные клетки in vitro и in vivo формируют 2D/3D модули из клеток, находящихся в двух устойчивых эпигенетических состояниях [37, 39, 40]. Согласно этой гипотезе, пластичные эпителио-мезенхимальные сфероиды (ЭМ сфероиды) могут одновременно служить донорами эпителия/стромы в зонах повреждения, когда процесс реэпителизации ограничен.

Изучение образования ЭМ сфероидов in vitro открывает новую модель для< исследования ЗО-пластичности ММСК и дает возможность с новых позиций изучать клеточные механизмы ЗО-репарации поврежденных органов и тканей, и поэтому представляется актуальным, научно и практически значимым.

Цель. исследования. Изучить эпителио-мезенхимальную пластичность ММСК в 2D/3D культурах диссоциированных клеток и. культуре эксплантатов фетальной и взрослой ткани и их вклад в репаративные процессы при повреждении эпителио-стромальных тканей в условиях эксперимента.

Задачи исследования.

Изучить, формирование репаративных сфероидов в культуре миниэксплантатов фетальных тканей (головного мозга, миофибрилл, слизистой оболочки тонкой кишки, сетчатки) и органов взрослого организма (миофибрилл, тонкой кишки, сетчатки).

Получить и изучить сфероиды из первичных клеточных культур здоровых органов! и тканей (стромальных клеток жировой ткани, пупочного канатика, сетчатки, миобластов). Изучить индуктивную роль поврежденных миниэксплантатов в 3D культуре.

Разработать воспроизводимую модель 3D < культивирования ММСК; исследовать полученные сфероиды ММСК на жизнеспособность и уровень экспрессии мезенхимальных и эпителиальных маркеров.

Изучить и сопоставить эпителио-мезенхимальную пластичность клонов ММСК в 2D и 3D культуре.

На моделях животных с экспериментальной патологией исследовать поведение ММСК, соматических клеток при системном и локальном введении и проверить возможность формирования репарационных сфероидов в зонах повреждений.

Обобщить полученные результаты и обосновать новые представления о роли сфероидов в репарации взрослых тканей в норме и при патологических процессах.

Научная новизна исследования

Впервые отработана оригинальная воспроизводимая методика получения ММСК человека и животных в стабильном эпителио-мезенхимальном статусе в 2D и 3D культуре. Прослежена динамика образования сфероидов и проведена характеристика фенотипа и поведения in vitro. Данная технология позволяет наращивать мезенхимальные стромальные клетки человека в виде лабораторных репаративных модулей с регулируемым соотношением эпителий/строма. Прогениторные клетки в сфероидах становятся непосредственными предшественниками эпителия-и стромы в зоне повреждений ткани. За счет эпителио-мезенхимальной пластичности сфероиды могут стать донором эпителия, одновременно блокируя фиброз.

Также впервые была разработана и изучена методика получения ЭМ-сфероидов из ферментативно диссоциированных соматических клеток разных органов и тканей (первичные культуры РСК пупочного канатика, подкожной жировой ткани, скелетных мышц).

Подтверждена способность поврежденных нормальных фетальных и. взрослых тканей и органов формировать репаративные агрегаты (сфероиды) в культуре изолированных мини-эксплантатов.

Впервые было продемонстрировано, что трансплантация ММСК и миобластов человека в скелетную мышцу mdx-линии мышей приводила к ограниченному новообразованию дистрофин+ мышечных волокон в зоне введения (преимущественно в раневом канале). Ограниченную миграцию миобластов и ММСК наблюдали в течение только первых 6 часов после введения.

При трансплантации НСПК и ММСК человека крысам с ишемическим повреждением головного мозга также наблюдали ограниченную (в течение первых 6 часов) миграцию ММСК на незначительное расстояние с образованием, новых капилляров^ вокруг зоны введения. НСПК при трансплантации сохраняли способность, к миграции до 10 дней с последующей дифференцировкой введенных клеток в нейроны и глию.

Внутриартериальная трансплантация ММСК человека приводила лишь к частичной репарации- островковой ткани поджелудочной железы с улучшением показателей эндокринного статуса и восстановлению структуры почечных гломерул.

Предложена гипотеза, что» наблюдаемая эффективность трансплантаций ММСК при повреждении как эпителиальных, так и соединительных тканей объясняется их эпителио-мезенхимальной пластичностью, проявляющейся в ЗЮ культуре.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Впервые описаны лабораторные условия и протокол получения сфероидов из ММСК с автоматической обратимой конверсией стромальных клеток в эпителий. До сих пор способность к спонтанной обратимой эпителио-мезенхимальной конверсии клеток была описана в трех тканях зародыша: примитивной полоске, узелке и нервном гребне.

Вторым важным источником репаративных сфероидов являются мини-экспланты поврежденных фетальных тканей и органов. Третьим источником репаративных сфероидов могут служить диссоциированные клетки от взрослых тканей и органов. Добавленные мини-экспланты поврежденной ткани индуцировали образование репаративных сфероидов со смешанным эпителио-мезенхимальным фенотипом. Клетки в сфероидах формировали интенсивные межклеточные контакты и ограниченно синтезировали фрагменты базальной мембраны. Сфероиды являются первичной регенерационной тканью. Полученные по данной методике сфероиды могут быть использованы как ЗО - модель для изучения сигнальных и клеточных механизмов физиологической регенерации и репарации.

Полученные данные существенны для трансплантологии и клинической медицины, подсказывая пути создания более оптимальных «репарационных модулей» на базе первичных сфероидов млекопитающих и человека.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту;

• Изолированные ММСК костного мозга, фетальных и взрослых эксплантатов, а также первичных культур взрослых органов и тканей способны формировать сфероиды в ЗО культуре с ограниченной способностью к синтезу экстрацеллюлярного матрикса.

• В формирующихся сфероидах активно идет обратимая мезенхимо-эпителиальная конверсия незрелых клеток с одновременной экспрессией ранних генов эмбриогенеза.

• Эффективность клеточных трансплантаций мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при повреждениях объясняется эпителио-мезенхимальной пластичностью ЗО-модулей.

• В патологических тканях формирование репаративных сфероидов не наблюдается.

Апробация работы'

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на международных научных конгрессах и конференциях: конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, 1998); Международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина» (Словакия, Татры, 2003); II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); Международной научной конференции «Фундаментальные основы инженерных наук» (Москва, 2006); Британско-Российский Конгрессе по проблемам изучения стволовых клеток (Москва, 2007); 1П и V Международном междисциплинарном Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2007, 2009); Международном научном симпозиуме «Стволовые клетки, перспективы применения» (Австралия, Сидней, 2007); 7-ой Всероссийской научно-практической конференции «Федоровские чтения — 2008» (Москва, 2008); Международном симпозиуме «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008); VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Москва, 2009); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине» (Тула, 2009); IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); Международном симпозиуме «Стволовые клетки в биологии и медицине» (Португалия, Лиссабон, 2010).

Внедрение результатов исследования

Культуры клеток, полученные в результате исследования, используются при проведении научно-исследовательских работ по разработке новых клеточных технологий. Результаты исследования используются с учебной целью на кафедре общей патологии и патофизиологии РАМПО и в других учебных учреждениях.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 30 статей (в т.ч. 19 статей в рецензируемых журналах), 19 тезисов докладов, 1 монография (в соавторстве), получено 8 Российских патентов и 2 Международных патента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ I 1

Как известно, ММСК всей, соединительной ткани имеют онтогенетически «тёмную» историю происхождения. [283]. Генеалогия стромальных клеток, поиски «родительских» линий- и- эмбриональных предшественников во взрослой ткани и органах наталкиваются на серьезные методические трудности.

1) Природную исходную» гетерогенность банка, стволовых/прогениторных популяций- во взрослой строме индивидуального' органа. Клоны ММСК отличаются выраженной сигнальной и биохимической гетерогенностью на уровне РНК регуляторных генов. [260]. Сигнальные РНК локализованы в микровезикулах (сигнальных эндосомах) цитоплазмы и секретируются в ответ на сигналы микроокружения [92, 168, 322]. Другая, часть, РНК микровезикул выполняет роль репрессоров альтернативной дифференцировки, некоммитированных клеток [214].

2) Пластичность фенотипа и множественность, потенциала дифференцировки ММСК. Например, исследование 100 колоний МСК, полученных одномоментно из одной выборки клеток (второй-третий пассаж) выявило высокую гетерогенность наборов мРНК от колонии к колонии. Одновременно, 20 клоны МСК имели разный исходный потенциал дифференцировки в разные соматические линии клеток [311, 330].

3) Эпигенетическую пластичность поведения ММСК, которая первично регулируется факторами микроокружения и культивирования.

4) Наличие множественных альтернативных механизмов поддержания пластичности фенотипа клеток для репаративного органогенеза в 2D и 3D системах.

5) Гетерогенность фенотипа ММСК в культурах высокой и низкой плотности клеток [33, 335].

Открытие ММСК А.Я. Фриденштейном опиралось не столько на новые молекулярные маркеры, сколько на особенности поведения клеток:

1) селективную адгезию ММСК на пластике в среде с высокой концентрацией сыворотки;

2) клоногенность в низкой плостности культуры;

3) пересадки изолированных ММСК под капсулу почки или под кожу вызывали образование эктопической кости с сосудами реципиента;

4) эктопические пересадки ММСК в камере (с целью блока инвазии клеток хозяина) приводили в образованию соединительной ткани из фибробластов, адипо- и остеоцитов. Образование сосудов из ММСК в камере не было верифицировано.

При этом фенотип ММСК in situ, в том числе сравнительный фенотип ММСК в разных органах и тканях, оставался плохо изученным. Были предложены следующие морфологические критерии для идентификации ранних мезенхимальных клеток в 2D прикрепленной культуре:

1) передне-задняя полярность (вместо апикально-базальной у эпителия) в сочетании с высокой подвижностью;

2) вытянутая фибробласто-подобная морфология;

3) филоподии;

4) инвазивная подвижность;

5) синтез З-О-матрикса по всей поверхности клеток (а не базальной j [ i мембраны);

6) отсутствие экспрессированных генов мезодермы и эндодермы; . 7) молекулярные маркеры, идентичности- ММСК.

Большинство, накопленных сведений относятся к прикрепленным линиям ММСК, полученным в 10-15% FBS. Эти два, условия «упрощают» рабочий фенотип клеток за счет подавления региональных генов органогенеза и селекторных генов закладок и зачатков органов [326, 391] . Адгезированные стромальные клетки теряют тот набор «ранних» генов органогенеза, который участвует в репарации и защите ткани. Специальные сигнальные эндосомы защищают клетки от новых повреждений в зонах репарации. Как фенотип индивидуальных ММСК, ! так и фенотип клонов и плотной конфлуентной культуры остается главной переменной, которая мешает созданию общепринятых золотых стандартов. Лишь в самые последние годы стал очевидным ограниченный потенциал развития прикрепленных к подложке , стромальных клеток.

Стандартные жесткие режимы выделения пластичных популяций в культуру, процедуры многократного пассирования клеток неизбежно «обрезают» естественную природную гетерогенность МСК во имя так называемой однородности и воспроизводимости «клеточных препаратов». Отсюда возникает коренное противоречие и начинает работать «принцип неопределенности» в отношении критериев выделения и критериев изучения МСК in vitro по отношению к природной популяции МСК in situ [371, 372]. Воспроизводимость результатов находится в обратной зависимости от гетерогенности материала, пластичности индивидуального и корпоративного фенотипа клеток [85, 321, 385].

Международное общество Клеточной терапии (International Society of Cell Therapy) и 10 лидирующих специалистов предложили программу-минимум для фено-паспорта адгезированных ММСК. Экспансия прикрепленных к подложке клеточных популяций должна проходить, в стандартных условиях и заканчиваться наработкой клеток следующего фенотипа: CD105+, CD73+ и CD90+ (95% и больше), CD45-. CD34-, CD 14-, CD lib-, С079альфа-, CD9-, HLA-DR- ( меньше 2%). Полученные ММСК должны как минимум дифференцироваться в три линии соединительной ткани — адипо-, остео- и хондроциты [141]. Эти культуры теряют маркеры ранней эмбриональной мезенхимы, и лишены автоматики эпителио-мезенхимальных конверсий.

Поэтому в первой части нашей работы мы сосредоточились на разработке нового оптимального протокола выделения и культивирования ММСК из минимального объема ткани, позволяющем на выходе получать максимальное количество некоммитированных клеток за минимальное число пассажей. Нами в ходе исследований была подтверждена высокая молекулярная однородность изолированных популяций в сочетании с сохранностью их фенотипической и функциональной гетерогенности.

Прикрепленные к подложке ММСК не имеют общих маркеров склеротома, хотя и сохраняют следы селекторных ключевых генов региональных мезодермальных/эндодермальных прогениторов, краткосрочно функционирующих в период закладки сердца, печени, поджелудочной железы (Nkx6.1, Nkx5.2, Nkx5.3, Pdxl) [141, 262, 304, 355, 405]. Экспрессия перечисленных селекторных генов органогенеза резко возрастала, когда из изолированных ММСК формировались плотные

7f суспензионные конденсаты [107].

Сильный антагонизм ключевых генов мезо-, экто- и эндодермы г укорачивает время существования зародышевых листков до нескольких суток. Эпителио — мезенхимальные конверсии зародышевых листков используются в первую очередь для перезагрузки «репертуара» софт-программ и контрольных генов эмбриогенеза. Изолированные экспланты эпибласта в культуре индуцируют формирование узелка или первичной полоски лишь после добавления «чистых» сигналов или ЭЭ-тканей-индукторов.

Главным принципиальным отличием между МСК эмбриональной и взрослой ткани, а также прогениторами мезодермы является наличие мРНК и белков f нейроэктодермы (нестин, виментин, GFAP, beta-tubulin Ш). Истинные мезодермальные клетки за счет экспрессии Brachyury, Goosecoid, Nodal, Cripto и других мезодермальных генов, полностью блокируют экспрессию генов нейроэктодермы [192]. Клетки мезодермы обособлены отдельной программой и не смешиваются с нейроэктодермой, эндодермой и ЭЭ-тканями. Вторым важнейшим отличием эмбриональной мезенхимы от мезодермы является способность МСК к спонтанной агрегации в суспензионной культуре высокой плотности. Мезодермальные одиночные клетки преимущественно взаимодействуют с подлежащим матриксом с помощью системы рецепторов и аппарата миграции. По этой причине мезодермальные прогениторные клетки не агрегируют в сферы на низко адгезивном матриксе. Третьей важной особенностью эмбриональной и взрослой мезенхимы является отсутствие экспрессии ключевых генов мезо- и эндодермы. Более того, в ходе 2-D- и 3-D- дифференцировки МСК в экто нейроны) - эндо (гепатоциты, островки Лангерганса) — или мезодермы (миоциты, кардиомиоциты) образование соматических линий in vitro идет в обход экспрессии генов зародышевых листков. Только при определенном фенотипе (ошаренные клетки) и- статусе культуры МСК (сферы или пеллет) удается добиться ре-экспрессии генов гаструлы.

Выращивание ММСК в суспензии без сыворотки индуцирует экспрессию нестина [391]. Выращивание ММСК в 10-15% фетальной сыворотке вызывает репрессию многих ранних генов эмбриогенеза. Когда первичную культуру ММСК помещали в бессывороточную среду, наблюдали восстановление эспрессиии Oct4; Nanog, Rex-1, GATA-4, Tert . Если те же образцы ММСК культивировали в среде с высоким содержанием сыворотки, то экспрессия упомянутых генов полностью подавлялась [326]. Если первичное выделение и культивирование ММСК проводили без сыворотки, то многие первичные клетки культуры экспрессировали Oct4, Rex-1, Tert. Длительное культивирование ММСК в суспензии в бессывороточной среде в N2/B27 среде приводило к стабильной экспрессии нестина, А2В5, GFAP, МВР, CNP-азы, Ol, GalC [242].

Жировая ткань, как и костный мозг, возникая из зародышевой мезодермы, представляет весьма гетерогенную клеточную популяцию. Однако незрелые стромальные клетки сохраняли широкий диапазон дифференцировки в линии всех трех зародышевых листков [219, 265, 329, 407]. Пролиферирующие ММСК сохраняли нестин ABCG2, SCF, Thy-1 маркеры, как и транскрипционный фактор закладки поджелудочной железы — Ilsl [374]. Уже накопились серьезные экспериментальные наблюдения, убеждающие в том, что ММСК являются уникальным клеточным, резервом, который наиболее точно и адэкватно реагирует на местные повреждения эпителиальной паренхимы взрослых органов, формируя локальные репарационные ответы [248, 309]. На мышах и крысах разработаны^ модели хронической и острой печеночной недостаточности, в основе которых лежит частичное удаление или повреждение паренхимы печени [154, 288, 301]. Эти- модели функциональной недостаточности печени широко используются для оценки биологической активности свежих гепатоцитов, а также дериватов печеночной эндодермы, полученной из ММСК и ЭСК.

Изучение динамики репарации кожных повреждений показало, что ВШЖ-меченые или ОБР-меченые МСК дифференцируются не только в кератиноциты, но и региональный, сосудистый' эндотелий и эпителий сальных желез [153]. Аутогенные МСК на- полужидком матриксе способны существенно- ускорять заживление мелких и крупных повреждений, кожи [402]. Максимальный эффект репарации кожи был достигнут, когда плотность, добавленных ММСК составляла 106 л клеток/см [144]. В зоне кожных повреждений было увеличено образование эпиморфина, который стимулирует конверсию стромальных клеток в кератиноциты [293]. Аутогенные пересадки ММСК в зоны трофических язв нижних конечностей у пациентов, страдающих диабетом, оказались эффективными в ситуациях, когда другие средства лечения оказывались не эффективными. Локально апплицированные ММСК стимулировали реэпителизацию эпидермиса, формирование грануляционной ткани и ангиогенез. Внутривенное введение 2x105 стволовых стромальных клеток костного мозга вызвало снижение индексов острой почечной недостаточности на модели взрослых мышей, где острые двухсторонние повреждения паренхимы почек вызывались циспластином [276]. Локальные трансплантации- ММСК или кондиционированная среда от стромальных клеток вызывали достоверные усиление регенерации поврежденной роговицы (в том числе крупных повреждений, которые самостоятельно не заживали) [291, 409]. В отличие от других эпителиальных органов, в зоне повреждения роговицы не наблюдали образования нео-эпителиальных клеток из пересаженных MMGK. Репарация, усиливалась за счет усиления* реваскуляризации ткани вокруг повреждений [409].

В'практическом плане вторичная региональная дифференцировка ММСК в, зоне поврежденной паренхимы, опосредованная сигналами4 дифференцированных эпителиальных клеток, является наиболее продвинутой областью теории и практики, где результаты фундаментальных находок раньше всего и. скорее всего находят подтверждения в предклинических и пилотных исследованиях. Только ММСК свойствена особая пластичность: в. дифференцированных репарирующих эпителиальных тканях: они подвергаются репаративной дифференцировке, которая связана с автоматикой мезенхимо -эпителиальной конверсии. Мезенхима в ходе реэпителизации имеет возможность экспрессировать ключевые транскрипционные комплексы соматических линий, начинающих региональную специализацию клеток. Автоматизм включения этих ключевых Nkx транскрипционных факторов еще блокирован в мезодерме и эндодерме и запускается сразу после выключения генов зародышевых листков (например, выключение Brachyury запускает экспрессию Nkx2.5 /GATA- 4 в кардиогенной мезодерме.

Одни факторы микроокружения индуцируют экспрессию ключевых транскрипционных факторов и селекторных генов эпителиальных линий. Второй эшелон факторов обеспечивает быструю перестройку цитосклета и реорганизации фенотипа стромальных клеток в региональный эпителий [73]. Главное отличие пластичности ранней эмбриональной мезенхимы (гаструлы) в том, что взаимные обратимые переходы эпителия в мезенхиму не связаны с непременным повреждением и гибелью клеток.

Долгое время эти идеи не воспринимались морфологами, поскольку нарушали привычные представления о стереотипном поведении и стабильности фенотипа эпителия и стромы главных органов.

Первые важные находки относительно судьбы ММСК in situ были сделаны на пациентах после пересадки костного мозга. Пересадки костного мозга мужчины выявили стабильную химеризацию (0.01 -0.1%) эпителия ротовой полости женщины-реципиента донорскими XY-клетками [378]. В экспериментальных исследованиях было показано, что пересадки костного мозга сопровождаются появлением и размножением эпителия донорского происхождения во многих органах, особенно в случае частичного повреждения органа [194, 233]. Однократное переливание 0.5 литра женской крови в кровоток мужчины-реципиента приводило к стабильной химеризации органов мужчины женскими XX-стромальными клетками. Изолированные линии МСК человека могут дифференцироваться в множественные соматические линии при следующих условиях: после введения клеток в брюшную полость фетусов [249]; 2) после внутривенного введения животным с модельным минимальным повреждением органов [63].

Системное введение ММСК сопровождается встраиванием I

I вводимых клеток в паренхиму органов реципиента, особенно в зонах повреждений легкого, печени, почек, мышц, поджелудочной железы- [89,

207, 232, 233, 234]. Показано, что только малая' часть ММСК, коммитированная к эпителио-мезенхимальной конверсии, активно, принимает участие в репаративной эпителизации поврежденной, ткани: I

Для этого ММСК должны иметь готовый «инструментарий» эпителио-мезенхимальной трансформации. Причем экспрессии одного-двух генов ЭМТ достаточно для активации всей батареи генов. Например, фибробласты кожи, трансфицированные одним геном кадгерин-11, приобретают способность к ре-эпителизации в зоне повреждения паренхимы органов [225, 324]. В здоровых тканях и органах (без повреждения эпителия) уровень захвата и реэпителизации донорскими ММСК был на уровне порога детекции [86].

Паренхима органов и кожные покровы новорожденных животных демонстрируют на порядок более высокую скорость» накопления эпителиальных клеток — дериватов донорской ММСК [63, 93, 127]. Потенциал инфузии аллогенных ММСК в кровоток увеличивается, благодаря мощной иммуно-супрессивной активности изолированных ММСК [128]. Системное и региональное введение ММСК костного мозга от мышей с резистентностью к блеомицину изучали на чувствительных к блеомицину мышах с индуцированными некротическими повреждениями легочной ткани. Оказалось, что донорские ММСК способны распознавать зоны поврежденных альвеол и накапливаться в зонах повреждений.

Часть донорских ММСК ре-эпителизировалась и встраивалась в новообразованные альвеолы. Часть донорских ММСК встраивалась в дуктулярный легочной эпителий [298].

Как известно; облитерирующий бронхиолит является главной причиной неудачных пересадок лёгкого на почве иммунного конфликта и летальных перибронхиальных осложнений. На новой мышиной модели облитерирующего бронхиолита было показано, что массированные инфузии аллогенных ММСК в значительной степени блокируют воспаление в периваскулярных пространствах бронхиол и защищают животных от неизбежной гибели [302]. Введение донорских ММСК в кровоток защищает животных от пост-радиационной гибели» вследствие массированного некроза альвеол. Существует критический период максимальной эффективности ММСК в индексе выживаемости животных, который не совпадает с максимумом повреждений легочной ткани [194, 195]. В лаборатории Д; Прокопа была разработана* специальная клеточная модель - монослой легочного эпителия,, с повреждениями, куда встраивались меченые ММСК [317], включая регистрацию tight junctions и ионных каналов между соседними клетками [389].

На следующем этапе было показано, что предварительная инкубация ММСК с кусочком эпителиальной ткани, первичной культурой эпителия или средой инкубирования от культуры эпителия, «коммитирует» ММСК к более эффективному встраиванию в поврежденную паренхиму органов in situ [68, 73,101, 110, 317, 348].

Накопились данные о том, что поврежденные клетки паренхимы взрослых органов и поврежденный экстраклеточный матрикс вырабатывают сигналы, которые через кровоток обеспечивают направленную миграцию циркулирующих ММСК в зоны повреждения. Например фрагменты коллагена и матрикс после воздействия локальных протеиназ становятся не только индуктором ангиогенеза но и провоцируют образование новых капиллярных сетей вокруг повреждения [382]. Ишемизированная или механически поврежденная почечная^ ткань многократно активирует сигнальный каскад тревоги через Бека 1 /№^с112/НеБ 1 сигнализацию. Эти сигналы привлекают стволовые и прогениторные клетки в область повреждения [228].

Первые данные о репаративной эпителизации донорских ММСК в почках были получены у мужчины, который наблюдался после трансплантации- женской почки. Стромальные и эпителиальные XX-клетки были выявлены в дуктулярном эпителии в, зонах репарации повреждений. Были выявлены циркулирующие ХХ-ММСК в кровотоке [314]. Диффузный мезангиальный склероз (наследственный дефект гена), Бапуз-Бгаз!! синдром — наиболее известные наследственные дегенеративные заболевания почек в детском возрасте - привлекают внимание специалистов по органной/клеточной трансплантации, поскольку не имеют эффективного медикаментозного лечения. На мышиной модели \\^-дефекта было показано, что пересадка здорового костного мозга резко снижала клинические манифестации заболевания, хотя встраивание донорских ММСК в почечную паренхиму оставалось на уровне 0.4% [182, 183]. Клинический эффект у всех пациентов был больше, чем доля регистрируемой репаративной эпителизации почек. На следующем этапе было доказано, что ОБР-меченые ММСК встраиваются и восстанавливают паренхиму почек при остром поражении ткани [169, 193, 276, 403]. Более того, системное введение ММСК защищает почки от новых раундов повреждений [84, 183, 207]. Поврежденная паренхима почки секретирует важный селективный сигнал для привлечения ММСК и

J t.

I инициации репарации - KIM-1( kidney injury molecule) [306]. B< i присутствии локальных вторичных индукторов до 70-80% ММСК принимают участие в мезенхимо-эпителиальной репарации органов [94].

Эффекты донорских GFP-MMCK прослеживались на животных с массированным циррозом печени, вызванном 4-нед введением СС14. После введения в кровоток основная масса меченых МСК оказалась локализованной-в поврежденных ацинусах. Никакие другие гематогенные s или эпителиальные клетки не накапливались в зонах повреждений.

Авторы сделали вывод, что поврежденные дольки печени секретируют хемо-аттракторы, привлекающие ММСК в зоны острых и хронических повреждений эпителия. Эпиморфин, ретиноевая кислота, V

HGF, ВМР-7 и антагонисты Wnt оказались важными локальными агонистами регенеративной эпителизации ММСК в зонах повреждений [179, 221, 294]. Однако лабораторные гепатоциты, полученные с помощью вторичной индукции из ММСК, в ряде случае демонстрировали низкий индекс направленной миграции в печень и низкие цифры колонизации ацинусов [148. 290]. Опубликованы обнадеживающие результаты первой фазы клинических испытаний системной пересадки ММСК у пациентов с декомпенсированным циррозом печени [273].

Предклинические испытания терапевтических эффектов ММСК на динамику регенерации миокарда после инфаркта позволили лучше понять механизм активации ММСК в кровотоке, пути их направленной доставки к участкам поврежденного миокарда и характер первичных взаимодействий между ММСК и поврежденной тканью. Показано, что локальные факторы ишемии, Jagged/Notch, SDF1/CXCR4, G-CSF, VEGF/Flk играют существенную роль в направленной миграции МСК в зоны поврежденного миокарда. На следующем этапе ErbB2/Src программа реорганизации цитоскелета формирует филоподии и ламеллоподии у стромальных клеток для контактного взаимодействия в зоне поврежденной, мышцы. Эффекторная система цитоскелета из сети Src/ErbB2/FAK/pl30/paxilin. формирует репаративные ламеллы для» стабильной стыковки донорских и реципиентных клеток [287]. Из-за сложностей визуализации гораздо хуже прослежены следующие два важнейших процесса репарации: 1)локальная пролиферация кардиомиоцитов и собственных стволовых клеток; 2) реэпителизация пришлых ММСК и их встраивание в фибриллы. Наилучшим маркером репаративного регионального кардиогенеза признано появление мРНК и белков Nkx2.5/GATA-4, поскольку в моноцитах и. незрелых ММСК эти два транскрипционных фактора отсутствуют. Наилучшими« маркерами регионального ангиогенеза признано повышение РНК/белка Flkl, VIII фактора [136].

Прямая дифференцировка фетальных ММСК человека в инсулин продуцирующие клетки была продемонстрирована на модели изолированной фетальной поджелудочной железы человека, пересаженной в брюшную полость nude мышей. ММСК, предварительно изолированные из фетального костного мозга фетусов человека, вводили иглой в ткань поджелудочной железы. Через несколько дней наблюдали скопления, донорских ММСК вокруг регенерирующих островков эндокринной ткани. С помощью селективных антител удалось определить присутствие Nkx2.2+ Nkx6.1+ Pdxl+ дериватов ММСК в виде клеточных инфильтратов в зонах повреждений эндокринной части железы [56]. Наличие маркерных транскрипционных факторов, характерных для линии бета-клеток, говорит о- локальной индуцируемой дифференцировке, запускаемой поврежденной? эндокринной, тканью: Если? синхронная экспрессия Ккх2.2/Ыкх6.1 факторов транскрипции: в. 1з1еИ+ прогениторных клетках характерна для начала дифференцировки: бета-клеток, то синхронная активация Мсх2.2/Р(1х1ЛЧ§пЗ факторов транскрипции, в ¡б^И- свидетельствует о появлении мультипотентных прогениторов островковой ткани, способной дифференцироваться, в любую эндокринную, линию клеток [258]. В другой' работе изолированные, высокоочищенные ММСК вводили после лапартэктомии непосредственное ткань ,поджелудочной»железы диабетическим, мышам. Изучали судьбу БУДР-меченых клеток, в зонах, регенерации, островков: Многие пересаженные клетки интенсивно пролиферировали в. зонах повреждения ткани-и принимали фенотип дуктулярного эпителия. Часть клеток начинали встраиваться в региональные дуктулы. Новообразованные эпителиальные клетки окрашивались позитивно антителами против Рс1х1, N§113, >1кх2.2, Nkx61., Рах4, Рахб. Через 2 недели клетки новообразованного эпителия начинали синтезировать инсулин [160].

Подробно изучены эффекты системных пересадок ММСК в кровоток на заживление хронических язв кожи, не* поддающихся лекарственному лечению. Ускорение регенерации трофических язв связывают с региональной неоваскуляризацией, которая, предшествует последующей ММСК-реэпителизации [72]. Местная аппликация ММСК, выращенных на фибриновом геле, также ускоряла заживление хронических язв кожи [144]. Кератиноциты кожи получены из ММСК, изолированной из взрослого костного мозга [113].

Показано, что сокультивирование высокоочищенных пассированных ММСК с фетальными кардиомиоцитами приводит к индукции ключевых генов кардиомиоцитов (Ыкх2.5,ОАТА-4, ОАТА-6) в стромальных клетках в течение 10- 14 дней совместного выращивания [405]. На втором этапе начинается перестройка цитоскелета и фенотипа клеток. Между тем, совместное культивирование ММСК с взрослыми зрелыми'кардиомиоцитами заметно активировало экспрессию поздних генов созревания кардиомиоцитов без фазы экспрессии «ранних» генов (№х 2.5, ОАТА-4,ОАТА-6) (1Л X. & а1. 2007).

Таким образом, репарационная* активность ММСК в зонах повреждения характеризовалась; 1)низкой краткосрочной выживаемостью и миграцией одиночных клеток 2) клетки в области повреждения не формировали регенерационной ткани или сфероидов 3) часть клеток подвергалась дифференцировке в локальные соматические клетки 4) клетки практически- не встраивались в поврежденную ткань.

Очевидно, что лишь ЗБ-конструкции клеток на матриксе приближают нас к ответу на главный вопрос регенеративной медицины -что такое оптимально устроенная регенерационная ткань млекопитающих? Первые предварительные исследования» в этом направлении показывают, что, в отличие от эмбриональной (фетальной) ткани, строма поврежденных органов взрослых лишена способности создавать репаративные модули в зонах повреждения.

В отличие от мезодермы, все дериваты соединительной ткани на базе ММСК из склеротома имеют упрощенный эмбриогенез (кость, хрящ, жировая ткань, дерма). Для эффективной репарации необходимо образование так называемых репаративных модулей из 106-108 клеток/мл, прикрепленных к матриксу-индуктору [404]. Сборка модулей' in« vitro одновременно контролируется индуктивным матриксом, сигнальным микроокружением и стромальными. прогениторными клетками. Переход от адгезированной «плоской» культуры к. 3?D> сферам, собранным за счет высокоафинных взаимодействий, открыл дорогу к получению «лабораторного^ эмбриобласта» из ММСК и более зрелых клеток. Подобно эпибласту, лабораторные сфероиды, из ММСК* приобретают способность к новой клеточной автоматике - эпителио-мезенхимальной пластичности: Подобно клеткам примитивной полоски, узелка- и нервного гребня ММСК приобретает способность генерировать клетки пластичной «досклеротомной» мезенхимы, - прямой предшественницы клеток эндодермы И' нейроэктодермы. Образование репаративных 3D модулей ММСК (или фетальных тканей), поставляющих одновременно линии эмбриональной стромы и эпителия^ существенно повышает репаративный потенциал тканей за счет того, что: 1) ранняя мезенхима лишена1 способности? генерировать фибробласты и миофибробласты; 2) новые резервы стромы/эпителия поврежденных тканей возникают из общего пула- клеток-предшественников.

Подобно регуляторным модулям эмбриогенеза, модули репарации Q из 10-10° клеток формируют вертикальную ось сигнализации и управления, с помощью которой' направляется и координируется корпоративное выходное поведение клеток. Модуль в морфогенезе и регенерации работает эффективно, потому что сигнальное микроокружение способно выделять наиболее приоритетные топ-сигналы, которые управляют сборкой и морфогенезом клеточной корпорации. Первые модули регенерации уже используются для репарации крупных дефектов кожи, хряща и костной ткани. Известно, что дефекты хряща или кости размером 5-6 см спонтанно не репарируют, в том числе из-за репаративного фиброза и инкапсуляции. Особенно замедлена репарация вдоль границы кости с мягкими тканями. В настоящее время крупномасштабные сегменты кости размером 5-7 см создаются в чашке Петри в трехкомпонентной культуральной системе в составе:

1) остеоиндуктивного крупнопористого ЗБ-матрикса;

2) остеобластов, стромальных прогениторов или линий ММСК;

3) среды культивирования, которая содержит все необходимые сигналы первичного остеогенеза.

Обычно такие среды содержат ингибиторы адипо-, хондро-, кардиомиодифференцировки [168].

Пересаживая такой трансплантат в мышцу, получают хорошо васкуляризованный костный графт. Помещая ЗБ-хрящевой модуль в подкожную жировую клетчатку, добиваются значительного роста ткани in vivo. Покрывая хрящ кожей, получают модельные ушные раковины разных размеров и форм.

Полученные в нашей работе данные полностью подтверждают концепцию модульной «регенерационной ткани» на базе ММСК и фетальных тканей.

• Эксплантаты фетальных и взрослых тканей в культуре формируют репаративные ЭМ- сфероиды из стромальных мезенхимальных клеток. Эксплантаты взрослой патологически измененной ткани в сходных условиях культивирования сфероидов не формируют.

• При культивировании в низкой плотности ММСК костного мозга проявляют эпителио-мезенхимальную пластичность в виде формирования 2Б колоний 3 видов: 1) типичных мезенхимальных колоний из СБ 105, Ы-кадгерин, виментин,. альфа-актин позитивных клеток; 2) эпителиоидных колоний из Е-кадгерин, нестин позитивных клеток; 3) смешанных эпителио/мезенхимальных колоний из клеток двух перечисленных фенотипов.

• Разработанная новая методика получения сфероидов ММСК в условиях ЗБ суспензионной культуры методом «висячей капли» позволяет проследить динамику образования сфероидов и провести характеристику фенотипа и поведения исходных изолированных ММСК и сфероидов ММСК.

• Эпителио-мезенхимальная пластичность сфероидов ММСК подтверждена наличием эпителиоидных нестин+ ОАТА-6+ клеток с их преимущественной локализацией во внешнем слое сфероидов (вместе с компонентами базальной мембраны - ламинином, коллагеном IV). Высказано предположение, что сфероиды могут участвовать в репарации за счет сбалансированной поставки эпителия и стромы в зону повреждения.

189 у т

• Диссоциированные клетки» первичных культур нормальных

5 органов г и тканей, подобно, тканевым^ эксплантатам, формируют ЗБ сфероиды. Добавление миникусочков поврежденной фетальной ткать ускоряет образование клеточных сфероидов в суспензионных культурах. Диссоциированные клетки первичных культур патологически измененных органов не формируют ЗБ. сфероидов! Предложена гипотеза, что именно, агрегаты стромальных клеток или ММСК являются модулем безрубцовой репарации.

• При повреждении мышечной ткани введение ММСК и МБ приводило к ограниченному образованию'новых дистрофин+ мышечных волокон в> зоне введения. Трансплантированные ММСК в патологически, измененной мышечной ткани репаративных сфероидов не формировали:

• При трансплантации НСПК и ММСК крысам с ишемическим повреждением головного мозга ММСК мигрировали* на* незначительное расстояние в течение первых 6 часов. При этом отмечалось образование новых капилляров вокруг зоны введения. НСПК при трансплантации сохраняли способность к миграции до 10 дней с последующей дифференцировкой введенных клеток в нейроны и глию. ММСК формировали небольшие скопления в зоне, но образования репаративных сфероидов введения не наблюдали.

• Системное введение ММСК животным с индуцированным стрептозотоцином диабетом приводило к частичному восстановлению островковой части поджелудочной железы и восстановлению нарушенной эндокринной функции. Системное введение ММСК животным с модельным повреждением почек приводило к восстановлению функции гломерул.

• Предложена новая концепция об участии ММСК в репаративном восстановлении поврежденных тканей и органов за счет их ЭМ-пластичности, проявляющейся в ЗБ культуре.