Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Конформационный анализ молекулярных факторов иммунитета

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

ДЕНЕСШ Александр йлыгч

конФоишдаокный анализ

МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФАКТОРОВ .ИММУНИТЕТА 14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Любучаш - 19Э1

Работа выполнена в Институте иммунологии Государственного концерна "Биопрепарат".

Официальные оппоненты:

Академик /Ж СССР, профессор Л.А.Воробьев Доктор биологических наук, профессор Ю.Н.Чиргадзе Доктор медицинских наук, профессор А.А.Ярилин

Ведущая организация:

Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР

/

■гХ Н0<кЦ/01 199¿г. в IV

Защита состоится "О т" гУУ Цу 1ЭЭ_д г. в I у часов на заседании специализированного Совета Д 074-.09.01 при Институте иммунологии МЗ СССР.

4 Адрес: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24, к. 2.

С диссертацией моано ознакомиться в библиотеке Института иммунологии МЗ СССР.

Автореферат разослан

"2к- йМ^ ^¿г,.

Ученай секретарь специализированного Совета доктор биологических наук

А.В.Колобов

->■ -Л?-

^ -г >- | ВВЕДЕНИЕ.

Наши знания о детальной конформации молекулярных факторов иммунитета базируются в первую очередь на рентгеноструктурном анализе их кристаллических структур. Уникальные возможности этого метода особенно проявились при определении пространственной структуры иммуноглобулинов, интерлейкина-1р, интерлейкина-2, "фактора некроза опухолей, антигенов главного комплекса гистосовместимости и ряде других иммунологически важных белков. Однако, проведение .рентгеноструктурных исследований требует больших материальных и временных затрат. Кроме того, некоторые белки оказываются в течение длительного времени малопригодными объектами для выращивания качественных монокристаллов, необходимых для проведения рентгеноструктурного анализа. С другой стороны, в последнее время произошел существенный прогресс в проблеме определения аминокислотной последовательности белков за счет ее сведения к решению задачи клонирования и секвенирования соответствующих генов. Поэтому развитие и применение теоретических методов • для конформационного анализа структуры биополимеров, основывающихся только на аминокислотной последовательности белка, является актуальной задачей современной биологии и, в частности, молекулярной иммунологии.

За последние двадцать лет в структурном моделировании достигнуты заметные успехи. Прежде всего, имеются подходы, с помощью которых можно рассчитывать .процентное содержание а-спиралей и р-структуры, исходя из аминокислотного состава полипептида. В результате их использования становится известным с определенной точностью («80%) структурный тип белка. Особое место среди методов теоретического конформационного анализа занимают алгоритмы предсказания локализации а-спиралей, (¡-структуры и р-изгибов вдоль полипептидной цепи. В настоящее время исследователями используется около десятка различных наиболее широко известных подходов. Каждый из них обладает своими преимуществами и недостатками, которые отражаются в качестве получаемых результатов предсказания (60-80$ правильно локализованных вторичных структур). Как правило, всеми методами достаточно хорошо определяется вторичная структура белков с одним преобладающим типом вторичной структуры и несколько хуже в случав ■ смешанного варианта. Однако для каждого конкретного белка улучшение расчетных данных о характере расположения

структурированных сегментов вдоль шлипептидной цепи можно достигнуть за счет одновременного использования результатов предсказания несколькими методами, что будет неоднократно применяться в диссертации. По сравнению с алгоритмами определения локализации сегментов а-спиралей, р-структури и р-изгибов на аминокислотной последовательности белка методы их упаковки в пространственную структуру развиты значительно слабее. Тем не менее, существуют критерии, шзволяюцие смоделировать образование плотноупакованного гидрофобного ядра, -основного конформационного элемента пространственной структуры белков.

Помимо получения пространственной упаковки элементов вторичной структуры белка теоретические конформационные методы дают возможность _ выявить фрагменты аминокислотной последовательности, ответственные за осуществление той или иной функции. Для описания структурно - функциональных свойств изучаемых белков мы привлекали методы предсказания границ доменов, локализации Т- и В-клеточных антигенных детерминант и анализа консервативных позиций в алайнментах гомологичных аминокислотных последовательностей. Например, при изучении интерферонов использовался алайнмен$, состоящий из 72 первичных структур.

Перечисленные возможности конформационного анализа дали основание поставить задачу наиболее эф$ективного использования теоретического моделирования для определения структурно функциональных свойств молекулярных факторов иммунитета (иммуноглобулинов, первого фактора системы комплемента, поверхностных белковых структур некоторых, микроорганизмов, интерферонов всех типов, интерлейкинов от первого до восьмого, ростовых и колонне стимулирующих факторов). Следует отметить, что для многих из упомянутых выше белков на момент проведения исследований ничего, кроме аминокислотной последовательности, не было известно. Решение этих проблем и было основной целью данной работы.

Научная новизна и практическая ценность диссертации заключается в определении конформацни для большинства из перечисленных белков и в осуществлении перехода от предсказанной пространственной упаковки макромолекулы к локализации фрагментов шлипептидной цепи, участвующих в образовании активных центров. В ней впервые:

1) предложены возможные пространственные модели "шарнирных"

участков в иммуноглобулинах G первого, второго и четвертого подклассов, а также их расположение относительно СдЗ-доменов;

2) построена структурно - функциональная модель глобулярной части молекулы C1q; выявлены фрагмента A-цепи, участвующие в образовании комплекса IgG-C1q; локализован сегмент 42-48 В-цепи, формирующий центр взаимодействия C1q с тетрамером С1ггС1ва;

3) для антигена Ф1 чумного микроба предсказана вторичная структура; локализованы Г- и В-клеточнае антигенные детерминанты, объяснен характер формирования мэжмолекулярных комплексов;

4) изучена" взаимосвязь между первичной структурой нового Ус-рецептора стрептококков и другими поверхностными белками этого микроорганизма; определены аминокислоты, имеющие важное значение во взаимодействиях Po-рецептора и иммуноглобулинов G;

5) обнаружена гомология между участком 10-38 адренокортикотропного гормона (АКТГ) овцы и фрагментами интерлейкинами-1 мыши и -1а человека;

6) предсказана вторичная и третичная структура интерферонов; определены фрагменты полипептидных цепей, отвечающие за антивирусную и иммунорегуляторную активности;

7) установлено, что интерлейкин-2, FDGP и трансформирующий балок p28sis должны иметь третичную структуру, аналогичную конформации интерферонов;

8) получены данные, позволяющие утверждать, что интерферона -а, -ß и 7, интерлейкины со второго по седьмой и колоние -стимулирующие факторы (G-, М- и GM - CSF) являются членами единого структурного (а-спирального) семейства белков;

9) выявлены структурные параметры, которым должна удовлетворять аминокислотная последовательность, чтобы быть причисленной к семейству IL-8 - подобных белков.

Большинство выводов диссертации, первоначально сформулированных в качества предсказаний, в дальнейшем получили экспериментальные подтверждения в результате исследований, проведенных как в Институте иммунологии, так и в ряде сторонних организаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, одиннадцати глав, выводов и списка цитируемой литературы из 267 наименований. Первая глава посвящена краткому обзору литературы по используемым в диссертации теоретическим конформационным методам исследования глобулярных белков. Главы со второй по двенадцатую содержат изложение полученных структурно -

функциональных результатов для изученных молекулярных факторов иммунитета. Диссертация содержит 250 страниц, включая 54 рисунка, 9 таблиц, оглавление, вывода и список литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Исследование коифорыации "шарнирных" участков в подклассах иммуноглобулинов С человека.

В нашем Институте Тищенко были измерены температурные зависимости удельной теплоемкости миеломных человека и их фрагментов, принадлежащих к четырем различным подклассам. Анализ микрокалориметрических данных выявил существенные различия в температуре плавления области контактов между Сц2- и С^-доменами." Так, при рН 5.5 у 1^2 эта область плавится при 45°, а у 1ёС4 - при 55-60°. Для и 1^3 эти процессы

происходят при температурах выше 60°. При рН 3.5 для 1§с:1 и 1^3 плавление области контактов мекду 0^2- и С^З-доменами наблюдается при 50-53°, в то время как для 1^4 температура плавления этой области на 10° ниже, а для 1ф2 этот процесс, по-видимому, у»е произошел при комнатных температурах. Объяснить наблюдаемые различия в конформационных свойствах подклассов человека

особенностями структуры С^- и СцЗ-доменов не представляется возможным, так как гомология их первичных структур достигает 92-95%, а аминокислотные замены в большинстве случаев носят консервативный характер. Остается допустить, что структура "шарнирной" области влияет на конформационные свойства Ро-субъ0диниц, по всей видимости, через посредство взаимодействия с Сд2-доменами. О том, что "шарнирная" область обладает упорядоченной структурой свидетельствуют полученные данные по плавлению Ро-фрагмента 1^3, обладающего 3/4 шарнирной области. В данном образце Ро-фрагмента наблюдается процесс, который соответствует плавлению упорядоченной структуры "шарнирной" области, и существующий еще только у нативных Последовательное восстановление дисульфидных связей в 1^3 приводит к уменьшению температуры плавления этого процесса, что указывает на стабилизацию упорядоченной структуры "шарнирной" области мекцепочечными дисульфидами связями.

Наиболее вероятные ' конформации полипептидных участков,

соединяющих Fab- и Fo-субъединицы, были промоделированы. Прежде всего на основе координат Са-атомов участка Oys220 - Суз229 была построена соответствующая двухдепочечная пространственная модель, которую располагали меаду С^-доменами Po-фрагмента. Ориентацию комбинированной структуры выбирали, исходя из следующего условия: для основной цепи фрагмента "шарнирной" области Pro"" - My"? должна существовать возможность соединения с Суз229 и Pro238 (Я-концевой остаток Po-фрагмента) с одновременным образованием единой полипептидной цепи, а также встраивания в ß-структуру Сцй-доменов. При выборе конформации боковых групп учитывали лишь геометрию боковых групп и стерические ограничения. "Шарнирные" участки IgG2 и IgG4 были построены на основе полученной структуры для IgG1 и с учетом различия некоторых аминокислот.

На рис. 1.1 представлено отдельно и в комплексе, с Fo-фрагментом изображение "шарнирного" участка IgG1 от Суз220 до Glu237. N-концевая половина "шарнирного" участка от Суз220 до

ppQ

Cys 3 состоит из одного незавершенного витка спирали (остатки до

рос 00(\

Thr'J) и поли- а-пролиновой двойной спирали от Суз. С-концевая половина "шарнирного" участка от Pro230 до Glu237, гомологичная у всех подклассов IgG человека, с одной стороны соединяет Суз229 и Pro238, образуя единую политаптидную цепь, а с другой - остатки Pro232 - Glu - Leu - Leu235 формируют дополнительную неполную антипараллельную цепочку ß-складчатого слоя С„2-домена, т.е. имеют вытянутую конформацию. Поскольку

прр

конформационные возможности сегмента Суз"* - Cys - Val - Glu -Oys22 "шарнирной" области IgC2 резко ограничены из-за наличия трех мекцепочечных связей, то наиболее' вероятное предположение состоит в том, что основная цепь этого сегмента имеет структуру, подобную шли- а-пролиновой конформации участка Cys226 - Pro -Pro - Oys229 IgGI (рис.1 .II). У IgG4 в "шарнирном" участке отсутствуют две мэжцепочечные дисульфидные связи, предшествующие сегменту Cys226 - Pro - Pro - Cys229. Но, с другой стороны, имеется делеция в три аминокислоты и вместо Val224-Glu225 расположены два пролина. Последнее дает основание предположить, что и в данном случае несколько остатков перед тетрапептидом

орС PPQ

Cys - Pro - Pro - Суз 3 могут находиться в гголипролин -подобной конформации (рис.1.III).

С помощью метода диффузного рассеяния рентгеновских лучей в растворе было проверено соответствие предложенных моделей экспериментальным результатам. Структура Fo-фрагмента IgGI Kol

Рис.1. Изображение "шарнирных" участков иммуноглобулинов 01(1), С2(П) и С4(Ш) (а - все атомы) и их комплексов с Сдг-доменами Ро-фрагмента (б- а-углероднае атомы).

исследовалась с помощью данного метода (Pilz). Кроме того, ранее наш были разработаны метода расчета теоретических кривых рассеяния из координат атомов макромолекул. Поэтому стало возможным экспериментально проверить правильность предложенных моделей для "шарнирных" участков, сравнивая теоретические кривые рассеяния Го-фрагмента с "шарнирным" участком и без него с экспериментальной кривой (Fo-фрагмент плюс "шарнирный" участок). Результаты такого сравнения показывают,что добавление к Fo-фрагменту "шарнирного" участка IgG1 почти наполовину уменьшает различия между теоретической и экспариментальной кривыми рассеяния. Кроме того, наши попытки изменить положение "шарнирного" участка относительно Го-фрагмента приводили в большинстве случаев к ухудшению совпадения кривых.

Таким образом, есть основания полагать, что "шарнирный" участок сообщает молекуле IgG не только определенную степень гибкости, но влияет и на другие структурно - функциональные свойства молекулы. Модулируя конформацию Ро-субъединиц, "шарнирный" участок может воздействовать на эффекторные свойства подклассов. Известно, что тяжелая цепь IgG содержит пептиды, гомологичные ряду гормонов. Совокупность накопленных к настоящему времени экспериментальных данных позволила сформулировать представление об антителах, как своеобразных прогормонах. Эта функция реализуется в результате , процессинга антител под воздействием протеолитических ферментов. Показано, что процессинг программируется субдоменной организацией молекулы антител и существенно зависит от изменения pH и температуры в физиологически допустимых пределах. В случав подклассов IgG характер процессинга в значительной степени модулируется уникальной структурой "шарнирного" участка.

II. Пространственная упаковка молекулы C1q и расположение активных центров.

Структурно - функциональная модель глобулярной части молекулы C1q. Нами -было сделано предсказание вторичной структуры А- и В-цешй субкомпонента C1q первого фактора системы комплемента человека и показано, что ß-структура является преобладающим типом вторичной структуры их С-концевых частей. Использованные в работе три метода предсказания дали в целом

- в -

совпадающие между собой результаты. Анализ результатов локализации вторичной структуры позволил нам выделить у А- и В-цепей по десять фрагментов, предпочитающих р-структурную конформацию.. Так как между аминокислотными последовательностями глобулярных частей А- и В-цепей наблюдается 40% гомологии и 70% .консервативных остатков входит в совпадающую p-структуру, то можно сделать обоснованное предположение, что и пространственные укладка! полипептидных последовательностей С-концевых частей А- и В-цепей будут аналогичны.

Для построения модели пространственного расположения р-структурных тяаюй глобулярных частей А- и В-цепей используем конформационную единицу, названную Ефимовым abed- структурой, общую для большинства двухслойных (3-белков и р-доменов. Было предположено, что abed- структура является зародышем в процессе сворачивания р-белков. Тогда пристраивая к ней с одной стороны в определенном порядке остальные элементы вторичной структуры и соблюдая некоторые стереохимические ограничения можно получить упаковку р-тяжей в белковых молекулах. Применяя развитый структурный подход для получения' пространственного расположения рассчитанных р-тяжей С-концевых частей А- и В-цепей субкомпонента C1q с учетом возможной Дисульфидной связи меаду цистеинами, мы получили структуру, схематическое изображение которой представлено на рис.2.

Построенные модели А- и В-цепей глобулярных частей G1q могут дать новую информацию о деталях электростатического взаимодействия G1q с иммунными комплексами. Установлено, что для полной инактивации IgG-связываюцей способности необходима модификация или одного остатка гистидина, или не более трех аргининов при расчете на могомерную единицу. Анализ топографии поверхностно - расположенных заряженных остатков показывает (рис.2), что у А-цепи внешняя поверхность одного из р-слоев содержит кластер из четырех отрицательно заряженных аминокислот. При этом непосредственно к данному р-слою прилегают три аргинина, два лизина и один из двух имеющихся в глобулярной части А-цепи гистидинов.

Таким образом,можно высказать утверждение, что со стороны С1 q в образовании комплекса IgG-C1q, по крайней мере, участвуют поверхностные аминокислоты четырех пептидов А-цеш, первичные структуры которых показаны на рис.3. Из указанных пептидов, по-видимому, наиболее важным во взаимодействии Clq-IgG является

цепь

,206

Л

г буусит/ЖНТ

-,135

0 n

1

К | Р У ]р М С V у| О Р О Т У

1р р м с р|

и n v v т

сигу

Пег

а' У с I Б Н°Е* с а

П:

с с к п

,Р У

в к

В - цепь

*** 112

кйрот

ТШГГ№ГА

174

-,(39

Р ь

А И О Н |р I ь в!

Б А

Е

о

Б I, V

а

i т v р у| n р*1 р*р

1ь с р к б!

б р р*е*с

|А Ь й V У| ТРОКУ

|а у м с р!

к n v 1 т

т,

с и

i е*

ь с

Б А n n

Р И I У I, и С Г V г| 1т I Ъ ? У! Н°' 1У Т Н°1 Р

С У I Р 1| N Р*Я*Т Г |ь С 7 А б| с ? р*а о

V ь V

а т к к

Б И*

с а

Л1

ь-бнкаур$есш'-

[Б Б I V ь! Ь н ь о!

I р

й

Б

1 2 8 4 5

оаяхэ

1 92

Б Т А

N V V Р Ь

I V I V ь

6 7 3 9 10

М К" Й*(2

с а-

Е*

-ЕСКЕ!)1^

2845 6739

Р

р

Р*

м

Е*

Агг

10

КБ

КБ

КБ

Рис.2. Схематическое представление расположения р-структурных тяжей А и В цепей субкомпонента С^. Прямоугольниками выделены остатки, участвующие в контакте (Э-слоев друг с другом. Поверхностные заряженные группы одного из рядов и прилегахщих к нему петель отмечены звездочками. Цифры внизу показывают номера р-структурных тякей.Триптофаны и гистидины отмечены кружками.

203 - Н° С К* К* Р Р* К Е* V „о V а р* - 191

109 - V I Р Р* т V I т N - 117

170'- Т Р* С Р 0 1 Б и* И* - 162

147 - щО Е* I N 1_ Б 1_ V Б_ Б И*- 158

Рис.3. Структура одного из рядов А-цепи С^, поверхностные аминокислоты которого возможно взаимодействуют с

фрагмент 191-203.

Локализация у C1q центра связывания с ClrgOlBg. На рис.4

представлены частичные аминокислотные последовательности А-, В- и' С-цепей коллагеновых фрагментов молекулы C1q. Нумерация аминокислот относится к В-цепи. Ассоциация А-, В- и С-цепей дает возможность сформировать тройную спираль, характерную для структуры коллагена, Однако нарушения в периодичности и вводимые делеции приводят к излому стержневой структуры мономера C1q. Изгиб молекулы осуществляется в позициях 35-45 аминокислотных последовательностей. Поскольку нас интересует область контактов CTq с С1ггС1вг (она, по данным электронной микроскопии, расположена справа, вблизи от излома), то было решено проанализировать первичные структуры А-, В- и С-цепей в данном месте. С этой целью мы использовали результаты по распределению аминокислот в триплете G^Xg-Y^ на основа первичных структур коллагенов типа al, выделенных из трех видов животных (Piez).' Было установлено, что некоторые аминокислоты предпочитают ту или иную позицию. В частности, фенилаланин и гистидин располагаются только в положении "2". Аналогичный анализ триплетов А-, В- и С-цепей CIq показал, что только два триплета отличаются по своему составу от структуры триплетов коллагена типа ai. У В-цепи вблизи излома имеется фрагмент 42-G-D-H-G — E-F-G - 4-8, .у которого аминокислоты гистидин и фенилаланин располагаются в третьем положении соответствующего триплета.

С целью локализации места взаимодействия факторов С1г и Oís с коллагеновой частью молекулы C1q нами использовался метод химической модификации диэтилпирокарбонатом остатков гистидана в его .фибриллах. Было показано, что происходит модификация только одного гистидана В-цели в расчете на мономэрную единицу. Второй гистидин мономерной единицы имеется у С-цепи, но он не видоизменялся. При такой модификации зафиксировано'резкое падение константа ассоциации субкомпонент 01 г, С1в с C1q. Из всего

31 » * «> * 50 * 6°

-0G L K0G D Q^G E P G P S„G N P„G I К О I LG 1 P - G L A G I) H G E í,0 E LG В P G I P.G DP.G

ж щ * * o *

EPGAP„GIRTGIQ

EPGIPAIK-GIR

-GPPGQKGEPGbPGHKG

Рис.4. Н-концевые фрагменты A-,В- и С-цвшй молекулы. C1q человека. Фенилаланин и два гистидана выделены дужками.

вышесказанного следует, что пептид 42-G-D-H-G-E-F-G - 48 В-цепи входит в состав участка С1q, участвующего во взаимодействии с тетрамером С1г2С1вг.

III. Структурные особенности «1 антигена чумного микроба.

Для конструирования рекомбинантных вакцин необходимо знать структуру гена и локализацию поверхностных иммуногенных детерминант. Показано, что фракция 1 (Ф1 или F1) - важнейший протективный капсульный антиген чумного микроба. Сейчас мы рассмотрим некоторые структурные характеристики антигена Ф1, основываясь на последовательности его гена r.pestls саГ1, секвенированного в нашем Институте Галевым и Смирновым.

Проведенные расчеты показали, что в белке Ф1 а-спиралей практически нет, а степень p-структурированности достигает 50%. На рис.5 представлена аминокислотная последовательность полипептида Ф1. Имеется лидерный пептид длиной в 21 аминокислоту и секретируемая форма белка Ф1, состоящая из 149 остатков, с молекулярным весом Мр=15.5 КД и pl=4.3. Кроме того, на рис.5 показана вторичная структура белка Ф1. Совместный анализ полученных результатов предсказания дает возможность выделить положение одиннадцати участков с p-структурной конформацией.

Поскольку капсульный антиген Ф1 является важнейшим иммуногеном чумного микроба, мы попытались с помощью различных подходов теоретически локализовать В- и Т-клеточйыа эпитопы. Для предсказания В-клеточннх эпитопов мы использовали профили гидрофильности (Hoop, Woods), антигенности- (Welling et al.)" и вариабельности (Ерошкин с соавт.). В качестве наиболее вероятных мест локализации антигенных детерминант были выбраны фрагменты полипептидной цепи, одновременно предсказанные, по крайней мере, двумя подходами. К таким фрагментам относятся N- и С-концевые сегменты 17-28 и 149-160 соответственно. Поскольку несколько аминокислот выделяемого N-концевого фрагмента относятся к ■яидврному__пептиду, то данный сегмент следует укоротить с N-конца на пять остатков. Кроме того, в районе 110-го остатка также, по-видимому, может быть В-клеточный эпитоп. Помимо B-клеточных эпитопов мы локализовали Т-клеточные антигенные детерминанты с помощью алгоритма DeLlsI, Berzoísky. Метод выделяет фрагмент цепи в районе 110-го остатка, практически совпадающий с

соответствуюцим B-клеточным эпитопом, локализуемым по профилю гидрофильности. Второй эпитоп 131-148 непосредственно'примыкает к С-концевому сегменту 149-160 В-клеточной антигенной детерминанты.

Анализируя совместно данные локализации вторичной структуры белка Ф1 (рис.5) и описанные выше результаты предсказания Т- и В-клеточннх эпитопов, можно сделать следующие вывода относительно антигенной организации этого белка: 1) 10-12 N-концевых аминокислот обладают нерегулярной конформацией и являются В-клеточным эпитопом; 2) фрагмент 105-116 одновременно и В- и Т-клеточный эпитоп; остатки 105-110 обеспечивают образование амфипаткческой спирали, хотя в составе целого белка они образуют

3 2 1

«»» о о оо *ооо *ооо * «KKISSVIAIAIFGTIATAl'iAABLTASrTATATIVEPARITLTYKEGAPITIKINGKIDT 1 10 20 А 30 ¿0 50 60

ооо о о » о о ** ооо о о оо о о

mVGTLTKGYKTGTTSTSVKTTDMGDPMYlTTTSQEGHMHQFTTKVIGKBSRBFDIS 61 ТО 80 90 100 110 120

10 11

* оо оооо ооо о *** * оо о о

РКТМОЖЬТСВБУтТСБдаГУНЗХСЗКССКМАСКетБАУТУТУБВД

121 130 140 150 160 170

Рис.5. Аминокислотная последовательность белка Ф1 и его вторичная структура, определенная тремя методами: 1

Финкельштейна ,■ Птицана; 2 - Завьялова и 3 - Ноуогпу. - -

р-структура; втшшт - а-спирали. Стрелка (О указывает на Ы-концевую аминокислоту секретируемого . полипептида Ф1. Звездочками и крухками отмечены гидрофобные остатки, располагающиеся в петлевых районах и р-тяжад полипептидной цепи зрелого белка соответственно.

ß-структурную конформацию; аминокислоты 111-116 расположены на поверхности молекулы и обладают структурой ß-изгиба; 3) фрагмент 140-160 - также и В- и Т-клеточный эпитоп с аналогичным структурно - функциональным устройством. Отметим, что на район 120-ого остатка приходится абсолютный минимум профиля доменности, рассчитанного согласно методу Vondervlszt, Simon. Таким образом, если предположить, существование двух доменов у Ф1 антигена, то основная иммуногенность этого беЛка сосредоточена на концах и стыках этих структурных образований.

Капсульный антиген выделяется из культуральной жидкости в виде олигомеров. Предполагают ведущую роль гидрофобных взаимодействий в формировании различных молекулярных образований капсульного белка. Зрелый белок содержит 54 гидрофобные аминокислоты (Р, А, Y, V, L, I и М). Из них приблизительно половина располагается на поверхности молекулы: 14 остатков в петлевых районах и почти столько же на внешней стороне ß-слоев (внутренняя сторона ß-слоев участвует в формирований гидрофобного ядра молекулы) (рис.5). Это происходит из-за того , что ß-тяжи образованы в большинстве случаев идущими подряд гидрофобными аминокислотами. Поверхностные гидрофобные аминокислоты распределены равномерно вдоль полипептидной цепи за исключением петлевых районов между 6, 7, 8, 9 и 10 ß-тяжами, где имеется только один гидрофобный остаток. Отсутствие гидрофобных аминокислот в указанных петлях может привести к определенной гибкости структуры белка Ф1. Отметим, что это согласуется с предполагаемой выше двухдоменной организацией молекулы мономера.

IV. Молекулярные аспекты взаимосвязи М-белков и рецепторов иммуноглобулинов стрептококков.

Стрептококки содержат на своей клеточной поверхности белки, _ которые обладают антифагоцитарной (М-белки) и Ig-связывающей активностями. В нашем Институте Смирновым был клонирован и частитао секвенирован новый ген FoRV - io-рецептор стрептококка ■ из Str. sp. Valente (* 22/58, коллекция г. Прага).

Внутренняя гомология белка FcRV. Анализ аминокислотной последовательности белка FoHV выявил высоко гомологичные внутренние участки. Превде всего, имеются четыре повторяющихся фрагмента А1 - А2 - A3 - A4 длиной в 35 аминокислот каждый. Кроме

того, на С-концэ располагается аналогичный, но более короткий (26 остатков), участок А5. Уровень гомологии, равный 100% между А1 и А2, постепенно падает до 72£ мевду A3 и A4. Количество совпадающих аминокислот мевду частью A4 и А5 значительно меньше (46%). Далее за повторами А^ размещаются два повторяющихся участка В1 и В2, отличающиеся по своей структуре от фрагментов А1, А2, A3 и A4, хотя и равные им по длине. Величина гомологии меаду BI и В2 равна 83%.

Сопоставление первичных структур сигнальных пептидов FcRV, FcRA, RIgA и М-белков. Последовательность сигнального пептида белка FoRV обладает всеми структурными чертами, присущими другим сигнальным пептидам, включая небольшой участок заряженных и полярных аминокислот на N-конце, за которым следует протяженный гидрофобный район и далее место расщепления. Сравнение первичных структур сигнальных пептидов поверхностных белков стрептококков FoRV, FoRA - Fo-рецептора типа А76, RIgA - рецептора иммуноглобулина А и М1, М5, Мб, М12, М24 показало заметную гомологию - между ниш. В основном расхождения наблюдаются в краевых функциональных зонах. Тем не менее структура района отщепления сигнального пептида у белка FoRV, так же как у FoRA, RIgA и М-белков, соответствует правилу, согласно которому в первом и третьем положениях слева•от места разрыва располагаются незаряженные аминокислоты с небольшими боковыми группами.

Гоиология N - концевнх и AI, А2, A3, A4 участков белка FcRV и FcRA. После сигнального пептида первичные структуры сравниваемых белков абсолютно не похожи друг на друга вплоть до аминокислоты Leu-148, с которой вновь начинается совпадение последовательностей FoRV и FoRA. Сравнение структуры фрагмента 148-233 белка FoRV с областью 134-219 FoRA показывает, что 74% остатков идентичны. Почти такой же уровень гомологии наблюдается и при сравнении соответствующих нуклеотидных последовательностей (70%).

Следующие 140 аминокислот белка FoRV и 105 остатков FoRA можно разделить на четыре и три гомологичных участка длиной по 35 остатков каждый, соответственно (рис.6). В связи с идентичностью участки А1 и А2 FoRV на рис.6 совмещены. Процентный уровень совпадений аминокислот между соответствующими участками белка FoRV и FoRA различается достаточно сильно. Повторы А^ имеют 7-членную периодичность, характерную для суперспирализованных а-спнралей (McLachlan, Stewart). В такой структуре две а-спирали

скручены друг относительно друга, образуя левую суперспираль. Семь повторяющихся позиций (от "а" до "g") двух параллельных a-спиралей несут различную структурную нагрузку. Анализ показывает, что положения "а" и "d" (рис.6), обеспечивающие контакт в суперспирали, обычно заняты гидрофобными остатками. В позициях "е" и "g" располагаются заряженные аминокислоты, которые образуют солевые мостики. Полярные аминокислоты обычно сосредоточены на внешней поверхности, в положениях "Ь", "с" и "Г". Аминокислотная последовательность Ser - Asn - Arg - Ala -Ala, образуемая из остатков положения "f" каждого повтора структуры белка FoRV, за исключением одной замены, консервативна (рис.6). Никакие другие позиции таким свойством не обладают. Кроме того, аналогичная последовательность наблюдается и у участков AI, А2 белка FoRA. Предполагается; что Aj повторы FoRA

FoRV Уровень совпадений FoRA

аминокислот

234- А К X е S Е А 220- А К Ii q S E A

k m Ъ Е N L 1 а t L E N Ii 1

А1 . о s g К Н Е Ь 69% G S a К R E L A1

(А2) g D ъ е А К X t D L q A К L

a d А п А q К -зоз d t A t A e к -254

304- А К Ъ Е S е а 255- А К Ъ E S 9 v

к m L Е N L 1 t t-L E N £ 1

АЗ G S g К R Е 1 71% G s a К R E 1 A2

a D Ii Q А К ь t D L Q A К L

D е А К А d К -зза D a A N A e к -289

339- а К L eíü е А 290- e К ь q S q A

t.i L Е г 1 ь a а ъ E q l

А4 Е S g К Г Е L 51 % E a t К k E L A3

А е q Q А К L A d 1 QfflK L

d А а Н а d П -373 a A t N q e К -324

Рис.6. Семичленная периодичность в аминокислотных последовательностях фрагментов А.^ белков РоНУ и РойА. Структурно эквивалентные позиции обозначены буквами от "а" до "g'', включительно. Совпадающие аминокислоты в двух структурах выделены заглавными буквами. Гомологичные остатки в позиции "Г" каждого повтора заключены в прямоугольники. Показан уровень совпадений аминокислот между соответствующими 35-членными фрагментами. Даны номера граничных аминокислот фрагментов.

содержат Ig-связывавдий центр (Heath, Cleary). По-видимому, консервативные остатки, находящиеся на внешней позиции "f", могут иметь важное зн^эние во взаимодействиях Fo-рецепторов стрептококков с иммуноглобулинами.

Анализ структуры С-конца FcRV. В отличие „от FoRA у FoRV за повторами А^ располагаются гомологичные фрагменты В1 и В2. Однако эта область FoHV совпадает с рядом районов М-белков и RIgA. Идентичность структур продолжается до С-конца. Только в конце последовательности FoRV вновь наблюдается гомология с FoRA. Отсюда следует, что конформация FoRV в С-концевой половине блике к структуре RIgA и М-белков по сравнению с FoRA. С-концевая часть гена FoRV пока не определена. Сравнение первичных структур показывает, что обрыв расположен в начале сегмента, обогащенного пролинами и глицинами. Этот сегмент длиной приблизительно.в сорок аминокислот взаимодействует с пептидогликанами клеточной стенки. За ним непосредственно размещается трансмембранный фрагмент.

Из всего вышесказанного следует, что гены М-белков и Fo-рецепторов стрептококков являются продуктами межгенной рекомбинации генов - предшественников и последующей дивергенции -основных механизмов при формировании новых генов (Doolittle) и их семейств (Ohta).

V. Вирус Т - клеточной лейкемии человека (ATLV) кодирует белок, структурно родственный антигенам главного комплекса гистосовыестиыости.

Нуклеотидаая последовательность генома провируса АТЬУопределена (Seiki et al.). В 3' концевой части генома обнаружены четыре небольшие рамы в различных фазах, одна из которых может быть трансформирующим геном этого вируса. Нуклеотидаая последовательность, кодирующая полипептид с молекулярным весом 27.000 - (рХ27) ATIV, была переведена в аминокислотную. С помощью номограмм (Троицкий, Завьялов), установлено, что в белке рХ27 должно быть не более 8% а-спиралей. В связи с этим с помощью метода предсказания вторичных структур (Завьялов) было проанализировано содержание и локализация только р-структурных участков полипептидной цепи рХ27 AT1V. В качестве основной конформации этого белка предсказывается р-структура.

Длина полипептидной цепи белка рХ27 равна примерно длине

двух доменов 1вС. В И- и С-концевых половинах рХ27 АТЪУ можно, как и в доменах выделить по 8 примерно равных по длине

р-структурных участков. В И-концевой половине рХ27 АТЬУ есть 2 цистеина, входящие в (3-структурные тяжи и разделенные точно таким же количеством аминокислот, как и в С^З домене Поэтому мы .решили сравнить аминокислотные последовательности Н- и С-концевых частей рХ27 АТЬУ с первичными структурами константных доменов человека и 1е-подобных фрагментов НЬА-А, -В, -Ш и -ВД антигенов. Наилучшая гомология наблюдается между С-концевой частью рХ27 АТЬУ и ^-подобным доменом НЬА-1Х2и1 антигена (рис.7). Видно, что сравниваемые последовательности разделены двумя делециями в районах 190 и 205-215 аминокислот на три неравные части. Область рХ27, включающая остатки 135-204, совпадает с НЬА-П0я1 в 16 позициях (23% гомологии), а фрагмент 135-183 - в 12 (24% гомологии).

Вероятность (Р) получения 16 случайных совпадений между рХ27 и НЬА-ВОП на фрагменте длиной 68•аминокислот может быть оценена с помощью биномиального распределения случайных величин согласно уравнению:

п 68-п

• Ш - Ш 3 2,10-7

Число возможностей распределения делений равно С62!/(3!'591)1'23 ~ 3«105, а число комбинаций длин делеций - [4!/(2!'2!)] = 6. Таким образом, число независимых сравнений приблизительно равно 2-Ю6. Следовательно, вероятность случайного совпадения равна 0.4. Однако, если сравнивать более короткие фрагменты длиной в 50 аминокислот, имеющие 12 совпадающих остатков, то оцениваемая аналогично вероятность случайного совпадения значительно меньше и равна 2-10"2. Такая оценка уже позволяет утверждать, что гомология ' между сравниваемыми фрагментами рХ27 и НЬА-БОкИ статистически ■ достоверна. Полученные . данные позволяют предположить, что С-концэвая часть рХ27 АТЬУ. структурно гомологична ^-подобному домену антигена НЬА-Б0те1.

п=68

Р =

68!

п=16 п!(68-п)!

140 150 160 170

р27(с) ATLV TLT^PGIIWTÍJDgTJMISGPgPKpGQ-jsiyLQSSSÍir

HU - Ш«1 PCTOTPSKSPVTKEP-OTÍlIOL'VDNIFPPVVNITWLSNG i_i i _i i_i

180 190 200 210

p27(c) ATLV pTQTKAYHPg^iiSHGLIQYgSIHSIfl^EEYTHIPIS

HU - DQw1 - H3VTEGVSETSPLSKS---DHSFPKISYLTPLPS------

i_i i_i

220 230 240

p27(c) ATLV • ttFHEKE^DjJNBHEPQISPGjJJ^JSEgjJFHETEY

HU - DQw1 -------AED-IYDCKVEHViGLDEPIilKHW

i-)

Рис.7. Сравнение первичных структур С-концевой части рХ27 ATLV и Ig-подобного домена KLA - DQw1. Цифры указывают позиции аминокислот в структуре рХ27 AT1V. идентичные остатки помечены звездочками. Под цепью HLA-DQw1 изображено положение р-тяжей по аналогии с p-струйтурой в константных доменах IgG человека. (—) - делеции.

VI. Интерлейкин-1 (IL-1) содержит АКТР-подобный участок ашшокислотной последовательности.

IL-1 - белок, синтезируемый активированными моноцитами -макрофагами и другими типами клеток, обладает широким спектром биологических активностей. В настоящее время под термином IL-1 подразумевают два белка: IL-1a и -1 ¡3, кодируемые различными генами. Клонированные ДНК 1Ь-1а и -1 р.человека, а также 1Ъ—1 мыши известны (March, Lomedico). Анализ аминокислотной последовательности IL-1 мыши позволил выявить около 32% гомологии между первыми 100 остатками IL—1 и 100 С-концевыми аминокислотами а1-антитрипсина (Lomedico).

Мы рассчитали общее количество вторичных структур по аминокислотному составу IL-1 мши и получили, что этот белок должен содержать 10% а-спиралей и 40% p-структурн. Анализ последовательности аминокислот IL-1 мыши с помощью правил Завьялова, Chou .- Fasman, Птицына - Финкелыптейна и Лима подтвердил это заключение (рис.8) и позволил установить наиболее вероятную локализацию участков вторичной структуры. Результаты предсказания вторичной структуры Н-концевой половины IL-1 мыши с

помощью различных правил удовлетворительно согласуются с данными рентгеноструктурного анализа для гомологичной последовательности, а,-антитрипсина. По-видимому, конформация И-кондевого фрагмента 11.-1, состоящего приблизительно из 100 аминокислотных остатков, будет в общих чертах совпадать со структурой гомологичной части а,-антитрипсина.

На рис.8 показано сравнение результатов теоретического предсказания вторичной структуры С-концевой половины Пг-1 мыши с более поздними данными рентгеноструктурного анализа для П#-1 р человека (Рг1ез1;1е ег а1._). Видно, что в данцом случае метод Завьялова наиболее корректно, по сравнению с другими подходами, описывает локализацию р-структурных участков. •

Завьял. Птицын СЬои Лим

120 130 140 150 160 .170

Пг-1 (йртширтщтунок^^

11-1 р АР---УВЗШСТШКООКЗШЕа-----РГЕЬШВ-ШЗ---01)ШЮУ7КМ

рент 120 130 140 150 160

струк. - - - -

анализ

Завьял---- -

Птицын-

С*ш --- --мяв

180 190 200 210 Э20

11,-1

р9НТ 1Т0 180 190 200 210

струк.- - - --—

анализ

Завьял - - _____

Птицын---

СЬоц - - ---

230 240 250 26О 270

1ь-1 р гуижхЕПШи^ЕЗАдаргшУЕКОАХжрурьсатксаовхтвртморузз Рент 220 230 240 250 260

струк---- - -

анализ

Рис.8. Сопоставление первичных и вторичных структур 1Ь-1 мшш

и человека. (-) - р-структура, (^вв) - а-спираль.

Звездочками отмечены идентичные остатки. (----) - делеции.

Имеются данные об идентичности IL-1 и эндогенного пирогена, а также об антипирогенной активности АКТГ (Duíf, Llpton). Молекулярной основой этой активности АКТГ может быть его прямая конкуренция с эндогенным пирогеном (IL-1) за общий рецептор. Поэтому мы попытались поискать гомологию мевду 11-1 и АКТГ. Как влдно из рис.9, участок 81-108 IL-1 мыши совпадает в 12 позициях ^"'участком 10-38 АКТГ овцы (более 40% гомологии). Вероятность Случайного совпадения сравниваемых последовательностей равна 0,02%, т.е. обнаруженная гомология является статистически достоверной. На одно совпадение меньше в паре АКТГ - IL-1a человека. В этом случае вероятность случайного совпадения уже на порядок больше. Не обнаружено гомологии мевду АКТГ овцы и ХХ-1 р человека. На основании полученных данных можно предположить, что вероятный. терморегуляторный центр эндогенного пирогена (1Ь-1) соответствует АКТГ - подобному участку 81-108.

АКТГ IL-1 IL-1a IL-Iß

G К G К

TJ|KJ

p[v]g -Шь

— — ii

a о

kkrrpvkvyp kkhrlsfset к к erlslsqs

ТГ|кргтгу р с р а т 80

Рис.9. Алайнмент первичных структур 1Ь-1 мыши, 1Ь-1а и -1( человека й АКТГ. Нумерация аминокислот дана для АКТГ и ХЬ—1 р. Рамкой выделены консервативные остатки между АКТГ и 1Ъ.

VII. Конфорыационные взаимоотношения интерферонов -а, -р и -7.

Интерфероны (IFN) - белки, которые секретируются животными клетками в ответ на различные индукторы (Stewart). По своим физическим и биологическим свойствам IFN делятся на два основных типа: 1 )-а, -ß и 2)-ц. В настоящее время известна первичная структура IFN-p и ряда IFN-a.■ Предсказание пространственной структуры следует начать с оценки процентного содержания а-сшршшй и .p-структуры на основе аминокислотного состава (Завьялов). У IFN -а и -р доля о-спиралей практически совпадает и варьирует в пределах от 55 до 751. В то же самое время содержание p-структуры не превышает 5-20%. Таким образом, согласно этим данным, IFN являются высоко- спиральными белками.

Для анализа возможных пространственных укладок первичных

структур IТЯ-а и -р 'используем закономерности, характеризующие плотную упаковку а-спиральных сегментов в- глобулу (Ефимов). В 1РИ-а можно выделить 5 а-спиральных сегментов (рис.Ю). Число возможных вариантов упаковки 5 сегментов можно.резко ограничить, используя известную схему расположения дисульфидных связей. Цистеины-29 и -138 являются компонентами гидрофобных кластеров "1" и "5", соответственно. Тесная упаковка этих кластеров, которая разрешает образование первой дисульфидной связи, показана на рис.Ю. Вторая дисульфидная связь образована между цистеином-98 а-спирального сегмента "3" и 1*-концевым цистеином-1. Еэ образование возможно в двух случаях. Рассмотрим случай упаковки а-спирального сегмента "3" в одном слое с сегментами "1" и "5". На рис.Ю показан оптимальный для образования дисульфидной связи и наибольшего числа гидрофобных контактов вариант антипараллельной упаковки спиралей "1" и "3".

Для образования гидрофобного ядра второй слой должен состоять из спиралей "2" и "4". Упаковка этих спиралей ограничивается фиксированным расположением спиралей "1я, "3" , "5" и непосредственным соседством кластеров "2", "3", "4" и "5" вдоль полипептидной цепи. Рис.1Оа показывает упаковку спиралей "2" и "4" в соответствии с перечисленными ограничениями и плотную упаковку гидрофобных кластеров всех а-спиралей двух различных слоев.

Рассмотрим другую возможность, когда а-спираль "3" расположена в том же слое, где и спирали "2" , "4". Принимая во внимание фиксированное расположение спиралей "1" , "5" и ограниченную длину фрагментов полипептидной цепи между спиралями "2" и "3" , "4" и "5" видно, что упаковка спиралей "2" , "3" и "4" возможна только при их антипараллельном взаимном расположении (рис.106). Добавим, что и в этом случае есть оптимальные условия для образования второй дисульфидной связи. Таким образом, для конформации ПГЛ-а получены две альтернативные структуры.

Сравнение аминокислотных последовательностей ПЭД-а и -р с учетом предсказанных а-спиральных сегментов показало, что аминокислоты, входящие в гидрофобное ядро, или консервативны, или заменены на другие гидрофобные группы. Когда сравниваются структуры целиком, то консервативность достигает 35%, тогда как для остатков, образующих гидрофобное ядро, гомология равна 50%. По-видимому, в общих чертах а-спиральная конформация различных ХРЛ-а и -р одна и та же.

Рис.10. Схематическое изображение двух вариантов (а и б) плотной упаковки пяти а-спиралей интерферона-а. Жирные линии показывают границы гидрофобных кластеров, а цифры - их номера. Большие буква обозначают остатки верхнего слоя, а маленькие -нижнего. Направление хода голипептидной цепи отмечено стрелками.

Результаты расчета процентного содержания вторичной структуры IPN-7 показали, что a-спиралей в этом белке - 50-70%, а p-структуры менее, чем 15%. Предсказание локализации структурированных участков в IFN-7 дает возможность выделить 5 а-спиральных сегментов (рис.11). Эти конформационныэ характеристики близки к тем, что были получены для IFN-a и -р. В одной из двух альтернативных структур, предложенных для IFN-a, гидрофобные поверхности а-спиральных сегментов "1", "3" и "5" образуют один слой, а сегменты "2" и "4" - другой. Так как для IFN-7 было найдено также 5 a-спиральных сегментов, то было решено образовать гидрофобные поверхности и слои IFN-7 по аналогии с IFN-a. Результаты представлены на рис.11. Видно, что соответствующие a-спиральные сегменты "IFN-a и -7 имеют гидрофобные кластеры, практически совпадающие по размеру (рис.Ю и 11). Отметим консервативность поверхности, образованной сегментами "1" и "3", и гидрофобного ядра в целом. На этом основании можно сделать вывод, что все IFN имеют в общих чертах одинаковую a-спиральную глобулярную конформацшо.

Рентгеноструктурный анализ интерферонов-p мыши и -7 человека показал, что, действительно, полипептиднне цепи этих белков содержат пять а-спиралей, упакованные в похожие пространственные структуры (Senda, Ealick).

VIII. Т-клвточный ростовой фактор структурно родственней IFN.

Известно, что OTÍ и ростовые фасторы входят в качестве составной части в гормональную систему организма (Sen). В этом разделе мы определим содержание, локализацию и вероятную упаковку вторичных структур в IL-2 человека, первоначально называемым Т-клеточным ростовым фактором.

Оценка содержания вторичных структур в IL-2 человека показала, что основным типом вторичной структуры этого белка является a-спираль. Ее содержание составляет 50 - 65%. В связи с этим аминокислотная последовательность IL-2 были свернута в а-спираль и с помощью двойной a-спиральной развертки локализованы участки а-стгралей, удовлетворящие требованиям встраивания в гидрофобное ядро. В структуре IL-2 можно выделить пять а-спиральных участков (рис.12). Так как количество а-спиральных сегментов, а также общая длина полипептидной цепи для 1Ь-2

Рис.11. Схематическое изображение плотной упаковки пяти а-спиралей инт^рферонов-а (А) и -у (В). Жирные линии показывают границы гидрофобных кластеров, а цифры - их номера. Больше' буквы обозначают остатки' верхнего слоя, а маленькие - нижнего. Совпадающие аминокислоты в обоих интерферонах помечены точками. Направление хода полипептидной цепи отмечено стрелками.

Рис.12. Схематическое изображение ожидаемых третичных структур интерферонов-а (А), -(3 (В), -7 (0) и интерлейкина-2 (Б). Прямоугольниками и цифрами обозначены а-спиральные сегменты. Буквами показаны аминокислоты, образующие гидрофобное ядро: больше соответствуют остаткам, располагающимся в верхнем слое, маленькие - в нижнем. Аминокислоты, совпадающие в интерлейкине-2 и интерферонах-а, -|3, -7 помечены темными кружками, светлыми кружками и крестиками, соответственно. Ход полипептидной цепи указан стрелками.

совпадают с НИ, то было решено упаковать а-спирали в одну из глобулярных структур, ранее предложенных для Ш1. В результате обнаружено, что в 9 из 29 позиций в гидрофобных ядрах 1Ш-р и 1Ь-2 находятся идентичные аминокислотные остатки (рис.12). По этому признаку гомология сравниваемых белков превышает 30%. .Несколько меньшая гомология (8 из 29 позиций) наблюдается при сравнении 1РМ-а и 11-2. Еще слабее гомология между и 1Ь-2

(4 из 29 позиций).

Достоверность полученных результатов была оценена следующим образом. Для каждой пары соответствующих спиралей вероятность (№) случайного совпадения (К) остатков в (М) позициях для 10 различных гидрофобных аминокислот была вычислена, исходя из формулы биномиального распределения случайных величин:

М! Г 1] К Г 9") М-К

~ К! (М-К)! * [ю] " [ю]

Предполагая, что совпадения аминокислот в определенных •позициях каждой пары соответствующих спиралей являются независимыми событиями, вероятность (г) случайного совпадения (Ь) остатков в Ш) позициях гидрофобного ядра равна произведению (И) величин, полученных для кавдой пары спиралей. Кроме того, величина (V?) должна быть умножена на общее число (I) возможных независимых сравнений выбранной пары спиралей. Из рис.12 видно, что а-спирали, входящие в гидрофобное ядро, содержат от одного до трех витков. Поэтому, параметр (Ю также варьируется от одного до трех. В итоге, величина (2) рассчитывается по формуле:

и

I = П

1=1

V

»1

где п - число а-спиралей в сравниваемых белках. .

Величина {V) может быть использована в качестве расчетного параметра для оценки вероятности (Р) случайного совпадения гидрофобных ядер, состоящих их п спиралей, двух сравниваемых белков:

Р = X Г

х1,хг'

0 «х1,хг.

Г ах,-«г

п-1 , 1

^.....^= 2. 2 - • ш-1=0 11 &

Величина Р, полученная при сравнении аминокислот в- гидрофобных ядрах 1Ь-2 и 1Ж-а, -р и -7, равна 0.15, 0.05 и 1.00, сответственно. Эти данные говорят о том, что, по-видимому, пространственные укладки 11-2 и ИЫ аналогичны между собой.

IX. Интерлейкин-2 подобная конфорыация интер-феронов и ориентация активных центров.

После определения пространственной структуры 11-2 с помощью рентгеноструктурного анализа (ВгапсКшЬег) оказалось, что упаковка полипептидной цепи 1Ь-2 в целом совпадает с одной из двух моделей, предложенных нами для ПЭД-а и -р. Первичные структуры нескольких десятков природных ПТС-а и -р различных видов животных, и высоко гомологичного ГРЯ-ш человека уже известны, что позволяет уточнить результаты предсказания вторичной и третичной структур 1т, а также сделать некоторые выводы в отношении локализации активных центров, используя пространственную структуру 11,^-2 в качестве базиса.

На рис.13 приведены результаты локализации вторичной структуры и границ доменов для ОТ-а А. Видно, что если выделить участки вторичной структуры, предсказываемые семью использованными методами, то остается пять сегментов а-спиралей и ни одного р-структурного участка. Метод определения границ доменов выделяет два домена в структуре 1РН-а А. Граница между ними лежит в районе 100-го остатка. Аналогичные расчеты были выполнены нами и для других типов ПИ-а, ряда Ш1-р и 1РП-о>. Поскольку они практически совпали с данными для Ш*-а А, то результаты предсказания вторичной структуры, представленные на верхней строке рис.13, мы будем рассматривать как общие для ПП-а, -р и -щ.

На рис.14В показана схематическая модель пространственной . структуры 1Ь-2 и его предполагаемого взаимодействия с рецепторами. Выше было высказано предположение, что 1Ь-2 и Ш! должны иметь в общих чертах сходную третичную структуру. Поэтому мы попытались уложить предсказанные а-спиральные сегменты 1РИ в третичную структуру, экспериментально установленную для 11,-2. Отметим, что в 1Ь-2 - подобной модели (рис.14А) остатки цистеинов оказываются на расстояниях, которые не препятствуют образованию между ними нативных дисульфидных связей. В целом же

'btl жк в Чг i vc

V£ 1! 1

d tji aiw vIM

)-QD—Y—Я yW7~

>63—i

-(■J J—-<•) )—Q—:3-€TZ>€ZZ>

РИС.13. Данные локализации вторичной структуры интерферона -а методами Завьялова (Z). Chou-Газшап (CP). Птицына -Финкельштейна (PF), Лима (I), Ефимова (Е) и Gamier (G). Цилиндры - а-спирали, зигзагообразные линии - ^-структура. Сверху изображены обобщенная вторичная структура (5 а-спиралей от А до Е) и расположение консервативных аминокислот (темные кружки -гидрофобные остатки, светлые - гидрофильные). Сплошные стрелки -места |3-изгибов, пунктирные - позиции расщепления интерферона-а ферментами. Показаны усредненные профили р-изгибов, а-спиралей и p-структур, а также границ доменов, полученные методами Novotny и Vondervlszt.

Рис.14. Схематическое изображение третичной структуры интерферонов-а, -р (А), полученной после упаковки предсказанных' а-спиралей в модель конформации интерлейкина-2 (В). а-Спирали представлены в виде цилиндров и помечены буквами от А до ]?. Дано расположение консервативных аминокислот и мест расщепления интерферона-а ферментами (см.рис.13). Возможные активные центры интерферонов-а, -р и интерлейкина-2 закрашены. Показана предполагаемая ориентация рецепторов.

ход полипептидной цепи в • модели, представленной ■ на рис.14А, совпадает с предсказанной нами структурой, изображенной на рис.106.

Проведанный анализ консервативных позиций в структурах 72 IFN-a, -р и чо показал, что имеется 17 позиций , в которых или вообще нет замен аминокислот или существует всего лишь одна замена (алаймент структур 72 IFN предоставлен нам Стронгиным). ■Как видно из рис.14А, все консервативные остатки можно разбить на 3 кластера: "петлевой" - I3, L3Q, R33, F36, P3g, ЕД1, и 047; "гидрофильный" - К50> Esg, Q6a, ST3 и Qga; и "гидрофобный" - Lg6,

^Ив' ^123* Г130' ^ЗТ С139» 40' W141 И ^144'

Консервативные остатки "гидрофобного" кластера принадлежат соседним а-спиралям D и Е и служат, по-видимому, для стабилизации конформации петли между ниш. На рис.15 представлен алайнмент С-концевой последовательности IFN-a2 и структуры протимозина-al. Уровень гомологии равен 36%, вероятность случайного совпадения -Р " 5'Ю-4. Отметим, что идентичный у IFN-ой и протимозина-а1 5-членный фрагмент IKEKK соответствует петле между a-спиралями D и Е в структуре IFN. Протимозин-al является иммунорегуляторным белком. Поэтому мокно предположить, что петля, образованная a-сщралями D и Е , входит в состав центра, отвечающего за иммунорегуляторную активность IFN. -

Тогда возможно, что "петлевой", и частично "гидрофильный" кластеры отвечают ■ за противовирусную активность IFN. В пользу этого свидетельствуют результаты анализа гомологии между структурами IFN-p и IFN-p2 (Zilbersteln et а1.). Хотя в целом по этим белкам гомология не превышает 20%, из 12 консервативных остатков, принадлежащих "петлевому" и "гидрофильному" кластерам IFN, в IFN-p сохранены иесть: F36, ЕД1, E5g, Q62, S73 и Qga. В то же самое время из 9 консервативных "гидрофобных" позиций в С-концевом фрагменте IFN только одна позиция присутствует в IFN-p2 СЫ1) и наблюдаются две существенные делеции. Известно,

120 130 140 150 160

* ** * ***** *** #* * # * * *

ни IFN-a A SIIAVracrF®ITbYlKEKKYSFCAWEWR-AEIMRSFSbSmQ-iBLRSKE РТМ -а 1 SDAAVDTSSEITTKDLKEKK------EWEEAENGRDAPANGNAQNEENGEQE

10 20 .30 -40 47

Рис.15. Алайнмент первичных структур IFN-aA и протимозина -a1- (PTM-a1). Звездочками отмечены ' совпадающие аминокислоты. (-----) - делеции.

что IFN-p2 сохраняет противовирусную активность. Допуская, что консервативные аминокислоты "петлевого" и "гидрофильного" кластеров, а также петля между a-спиралями D и Е , непосредственно участвуют в формировании активных центров IFN, мы обозначили на рис.14А ориентацию молекулы по отношению к гипотетическому рецептору.

С целью изучения функциональных свойств участка 69-80 IFN-a2, аминокислоты которого входят в состав антивирусного активного центра, нами был! синтезированы и испытаны три пептида: 76-80, 73-80 и 69-80 (Майоров с соавт., Нолль с соавт.). Пептиды сами по себе проявляли очень слабую антивирусную активность. Но было показано, что в присутствии каждого из них увеличивалась противовирусная активность рекомбинантного IFN-a2. Этот эффект можно объяснить предположением, что пептида связываются с аллостерическим местом рецептора IFN, вызывая конформационные изменения, которые влияют на взаимодействие лиганд - рецептор.

Октапептид, соотвествующий области наибольшей гомологии I?H-a2 (фрагмент 131 - leu - Ьуэ - Glu - lys - 1уэ - Туг - Бег -Pro - 138) с протимозином-а1, и сам IFM-a2 были изучены в сравнительном аспекте в терминах их иммуномодулирущих эффектов (Наволоцкая с соавт., Василенко с соавт.). Установлено, что пептид, аналогично IFN-a2 человека, проявляет регуляторный эффект при клеточном и гуморальном типах иммунного ответа и стимулирует функциональную активность клеток, обеспечивая неспецифическую иммунную защиту. Проявление этих свойств зависит от дозы пептида и способа использования.

Таким образом, полученные данные указывают на существование у IFN-a и -р по крайней мере двух активных центров. На рис.14А участки, содержащие консервативные аминокислота IFN, выделены штриховкой. Для сравнения на рис.14В также штриховкой показаны активные центры молекулы IL-2 (Ju et al.. Weir.et al.). Отметим, что локализация сегментов, ответственных за биологическую активность, аналогична в пространственных моделях IFN-a и -¡3 и IL-2.

X. Структурный анализ семейства a-спиральных белков - инмуноцитокинов.

К настоящему времени клонированы кДНК и определены структуры

генов нескольких 1Ь и колонне - стимулирующих факторов (СБЕ). В ряде случаев выявлена гомология первичных структур меаду с одной стороны, и II,, СЭР - с другой (например, между 1РН-р2, гранулоцит (С) - СЭР и миеломоноцитным ростовым фактором кролика (оМбР); между 11,-5 и 1РЫ-7 (Н1гапо et а1,"Ьеи.1:г е1; а1)). Кроме этого, 1РИ-рг проявляет функциональную активность 1Ь и известен также как 11-6 или В - клеточный стимулирующий фактор второго типа (ШР-2) (5евйа1 е1 а1). Поэтому мы проанализируем с помощью методов конформационного анализа вторичную структуру некоторых IX и ОБР, чтобы выявить структурные и эволюционные взаимоотношения меаду ними.

В .Табл.1 (графи 3 и 4) приведены результаты расчета содержания а-спиралей и р-структурн для 1РИ-и, 1Ь-3, 4, 5, 6 и 7, СЗР (макрофаг (М) - СВР, С-СБР и гранулоцит - макрофаг (СМ) -СЭР) и оККИ?. Для сравнения представлены также аналогичные данные для ПРН-а, -р и -7 и 11,-2, полученные ранее (см. разделы VII и VIII). Как видно из Табл.1, содержание а-спиралей в анализируемых белках предсказывается в пределах от 55% до 73%, а р-струк!уры -от 0% до 31%. Имемциеся экспериментальные данные (графы 5 и 6) хорошо соответствуют результатам расчетов по аминокислотному составу (кроме оценки содержания р-структуры у СМ-СБР). Таким образом, общей характеристикой' белков, перечисленных в Табл.1, является довольно высокая степень а-спиральности. Белки содержат (кроме 11,-3) четыре экзона (графа 8) в части гена, соответствующего зрелому белку без лидерной последовательности. Для М-СБР количество экзонов указано для И-концевой части зрелого белка , образуемого после предполагаемого протеолитического расщепления мембран - связанного предшественника.

На рис.16 показаны результаты предсказания вторичных структур для представленных в Табл.1 белков. Расчет осуществлялся с помощью метода (Ефимов) локализации сегментов а-спиралей, способных встраиваться в гидрофобное ядро белков. В большинстве случаев у отдельного зрелого белка определено пять а-спиральных сегментов. Кроме того, на рис.16 дана совокупность имеющихся экспериментальных данных по расположению интронов вдоль аминокислотной последовательности. Отметим, что существует определенная корреляция между расположением а-спиралей и локализацией интронов. Первый и второй экзоны содержат, как правило, одну спираль, третий экзон - две спирали и четвертый -оставшиеся а-спиральные сегменты. Исключение составляет 11,-3, у

Таблица 1,

Вторичная структура некоторых иммуноцитокинов.

№ Название белка

Теорет. Экспериментальное определ. определение содерж. содержания

Кол-во амино-т в зрелом белке

65 (Х-ЯАГ)

Кол-во экзонов в гене зрелого

аЖ РЖ аЖ рЖ белка

1 2 3 4 5 6 7 8

1 ни ПТС-аА 66 15 45- -ТО (ОС) 165

2 ни 1РК-Р 63 9 70 (СБ) 166

3 ни 1ПНГ 64 13 66 "(СБ) 146 4

4 ни 68 16 1Т2

5 ни 11,-2 58 28 46- -65 (СБ) 23-25. (СВ) 133 4

6 НО 11-3 54 7 133 5

т ни 11-4 , 61 31 129

8 ни 11-5 56 1$ 60- -76 (СИ) 112

9 Ш 11-6 67 6 184 4

ю ни 11-7 72 16 -152

11 ни М-СБР 55 1 165 4

12 Ш в-ОБР 73 27 66 (СБ) 17 (СБ) 177 4

13 ни СМ-СЭР 55 0 47 (СБ) 46 (СБ) ' 127 4

14 оМСР 71 7 • 178

которого дополнительный интрон располагается между двумя последними а-спиралями.

Кроме аналогий во вторичной структуре и интронно - экзонной организации гена, в ряде случаев между анализируемыми белками наблюдается гомология непосредственно в первичных структурах. Так показана гомология между НТС-а, -(3 и ОТТ-4, ЛЭТ-р и ЮТ-рг (11-6), ГО1-рг и С-СБР, сМСР и С-ОЗГ, 1Ь-6, а также между 11-3 и 11-5. В Табл. 2 даны оценки вероятности случайного совпадения (Р) этих гомологий. 'Можно считать, что только в случае пары 11-3 и 1Ь-б наблюдаемая гомология статистически не достоверна.

Рис.16. Результаты локализации а-спиралвй в IШ-а, -р, -у, -чо; 11,-2, -3, -4, -5, -6, -7; СБР-М, -С, чаГи с!ШР. Цилиндры обозначают а-спиральные сегменты. Закрашенные треугольники доказывают положение интрон - экзонных границ.

Таблица 2

Вероятность случайного совпадения аминокислот в иммуноцитокинах

Л Белок Номера Длина К-во Длина К-во Вероятность

n- и С- участка деле- деле- совпа- случайного

концов ний ний дающих совпадения

сравнив. амино- (р)

фраг-тов кислот

N- С-

1 Ш-а 1 163 164 1 1 55 7•10-ге

IFN-p 3 166

2 IFN-p 67 112 46 1 1 14 3-10"6

IFN-7 60 104 -

3 IFN-p 33 67 37 3 3 11 6-Ю~г

от-р2 42 77

4 IFN-p 136 165 32 2 4 9 8•10-г

ifn-p2 122 151

5 IFN-рг 28 101 77 3 4 19 3'10"г

G-CSF 20 95

6 G-CSF 1 ■177 182 5 9 72 2-10'зг

oMGF 1 178

7 oMGF 1 175 183 3 8 40 4-Ю"7

iir-6 2 ' 184 1

8 11-5 41 74 37 6 6 11 47

IL-3 27 60

XI. Определение вторичной структуры интерлейкина-8 и гомологичных ему белков.

Интерлейкин-8 (IIr-8) входит в состав семейства белков, включенных в регуляцию воспалительного процесса и иммунитета.' Данное семейство также содержит: p-тромбоглобулин (pTG) ; четвертый фактор тромбоцитов (PF4) ; белок, -индукцируемый 7-интерфероном (7ip-IO); ростовой фактор (GRO); белок, индукцируемый вирусом саркомы Ноиз (9-ЕЗ) и фактор активации иммунитета (АСТ-2) (Charles et al.). На рис.17 представлено сравнение аминокислотных последовательностей перечисленных выше белков. У каждого белка имеется 4 цистеина.

В настоящее время для одного представителя данного семейства белков (РР4 быка) известна конформация, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа (Charles et al.).- Вторичная структура одной молекулы • PF4 состоит из трех тяжей

B-PF4

H-PF4

R-FF4

H-pTG

IP-10

C-GRO

H-GRO

9-E3

ACT-2

IL-8

LPADSEGGE--DEDL----QCVCLKTTS

AFASAEAEE--DGDL----QCLCVKTTS

AVTRASPEES-DGDL----SCVCVKTSS

RNLAKGKEESLDSD'LYAEIiRCMCIKTTS

L S G I Q

gF

PIS-R-IÍ----RCTCISISN

LATGAPVANE1RCQCLQTMT RAAGASVATELRCQCLQTLQ

LILIilS

L Ь L V A A C,_

L V S A0L SQCRTL. VKKGHELRCeOISTHS

С S P A L S0P MGSDPPTA---7C-CFS-YT

LISAALCEGAVLP RÍÍ]A KELRCQCIKTYS

l—' 10

X-HAY

B-PF4 - G I N Р Е ,Н I S S L Е V I G А G Т Н с р SPQ1LAT

H-PF41 - Q V R P 'R'H I Т S I Е V I К А G Р Н с р Т А Q I I А Т

R-PF4 S R I Н L К R I т S L Е V I К А G Р н с А V Р Q L I А Т

H-J3TG - G I Н Р К N I Q S L Е V I G К G Т н с N а V Е V I А Т

IP-10 Q Р V N Р R S 1 Е К I Е I I Р А S Q F с Р R VE I I А Т

C-GHO - G V Н L К N I Е S L К V Г- Р Р G Р н с Т Q 1EYIA1

H-GRO - G I Н Р К N I Q S V N V К S Р G Р н с А Q Т Е V I А Т

9тЕЗ К F I Н Р К S I Q D7KIIÍS G Р н с К N V Е I I А Т

АСТ-2 А R К L Р R N F - V V D Y Y Е Т S S L с S Q Р А V V F Q

IL-8 KPFHPKFI KELRVIES G Р н с А N Т Е I I V К

20 30 40

ЯМР 1 1- 1 1-

Рио.17. Аминокислотные последовательности IL-8 и его гомологов. Остатки белков, совпадающие с аминокислотами IL-8, выделены жирным шрифтом. Рамками обозначены установленные или предполагаемые íí-концевые аминокислоты зрелых белков. Нумерация остатков дана для IL-8. (----)- делении. Часть алайнмента взята из работы Charlea et al. (Продолжение рис.17 и подписи к нему на следующей странице).

- 37 -

X-RAY 3 I f 4

B-PF4 К - KTGRKICLDQ Q RPLYKKI. L - К К Ы D G

H-PF4 L - KNCRKIOLD L Q APLYKKII -KK1IES

R-FF4 L - KNGSKICLD R Q YPLYKKI I - К К L L E S

H-|3TG - L - KDCRKICLD P D APRIK. KIV Q К К L A - G

IP-1Q MKKKGEKRCLN P E SKAIKHLL - К A V S - К

C-6R0 L - KNGQEACLN P E APMVQKIVQKMLK-S

H-GRO L - KNGRKACLN P A SPIVKKII E К M L N SD

9-ЕЗ L - К D G R E V CL D P T APUVQLIV 1 К A L M А К

АСТ-2 Т - KRSKQ7CAD P s ESWVQEYV - Y D L E L N

IL-8 L - SDGRELC1D 50 P к ENWVQRVVEKFLKRA 60

ЯМР -I | |

3 4

В-РР4 D Е s

Н-РР4

R-PF4

н-ртс IP-10 Г Е Е М SAD S KR S P

C-GRO G I R К

H-GRO К S N

9-Ю A Q HSIiPL

АСГ-2

IL-8 Е N 70 s

ЯМР ттт

- Рис.17. Продолжение. "X-RAY" - рентгеноструктурнне данные для РР4 быка. "ЯМР" - данные о вторичной структуре IL-8, определенные методом ядерного магнитного резонанса. Показано предсказание вторичной структуры методом Финкелыитейна, Птицына. (^нв) - а-спираль, (-) - (3-структура.

антипараллельной p-структуры и одной - a-спирали (рис.17). IL-8 в растворе был исследован с помощью Двухмерной ЯМР спектроскопии (Clore et al.). Показано, что конформации IL-8 и РГ4 аналогичны между собой. В растворе молекула IL-8 существует в виде димера, у которого сформирован единый р-слой из шести р-тяжей, прикрытый с одной стороны двумя а-спиралями.

Экспериментально определенные и теоретически рассчитанные вторичные структуры IL-8, PF4 и гомологичных им белков в целом .близки . между собой (рис.17). N-концевые аминокислоты вплоть до 1 позиции "21" формируют петлю. За гидрофобными остатками законсервированы позиции "7", "9", "10" и "19". В свою очередь, только гидрофильные аминокислоты располагаются в положениях "11" , "14" и '"20". Такое распределение остатков коррелирует с образованием изгибов цепи вокруг позиций "10" и "20".. Остатки от "22" до "29" образуют первый р-тяк. Для этого участка цепи наблюдается характерное р-структурное распределение аминокислот: позиции "22", "25" и "27" содержат только полуконсерватйвные гидрофобные аминокислоты, а "23" и "26" - гидрофильные. Второй p-структурный тяж состоит из аминокислот от "37" до "43". Между первым и вторым р-тяжами расположена петля, содержащая р-изгиб. Второй р-тяж имеет блок из трех последовательных полуконсервативных гидрофобных аминокислот: позиции "39", "40" и "41". Слева и справа от блока находятся гидрофильные остатки. Аналогичное распределение аминокислот наблюдается и для третьего р-тяжа. Петля между вторым и третьим р-тяжами образует (3-язгиО. Остатки от "57" до "69" формируют a-спираль. Для нее, также как и для p-структуры, основные структурные-позиции'законсервированы. ' Гидрофобные аминокислоты сосредоточены в позициях "57", "58", "61", "62" и "66". Гидрофильные остатки расположены в позициях "59", "60" и "64".

У анализируемого семейства белков, первичные структуры которых представлены на рис.17, на поверхности а-спирвлей имеются позиции, в которых располагаются консервативные гидрофильные аминокислоты: "59" и "64". Другие остатки - в позициях "60", "63", "65" . и "67" - принадлежащие а-спирали и доступные растворителю, также могут контактировать с лигандами или рецепторами, обуславливая специфичность каждого отдельного белка.

Таким образом, из белков системы иммунитета можно выделить семейство молекул, поливдптидныэ цепи которых содержат от 70 до 90 аминокислот и среди них четыре цистеина в одних и тех же

позициях. Вторичная структура этих белков состоит из трех антипараллельных ß-тяжей, образукщих ß-слой, который в свою очередь прикрыт а-спиралыо. Анализ гомологии первичных структур показал, что некоторые консервативные аминокислоты а-спирали могут отвечать за взаимодействие с лигандами или рецепторами.

t

основные вывода.

1. Методами микрокалориметрии показано, что конформационные свойства Fo-субъединиц в составе интактных IgG человека разных подклассов, так и соответствующих им Fo-фрагментов, отличаются между собой по энергии взаимодействий между Cjj2- и СдЗ-доменами, а также жесткости структуры К- и С-концевых частей С^г-доменов. Предложены возможные пространственные модели "шарнирных" участков в IgG1, IgG2 и IgG4, а также их расположение относительно Сц2-доменов. Анализ кривых малоуглового рассеяния рентгеновских лучей свидетельствует об адекватности теоретических моделей экспериментальным данным.

2. Для глобулярной части молекулы C1q построена структурно -функциональная модель. Выявлена поверхность A-цепи, содержащая кластеры положительно и отрицательно заряженных остатков и, по-видимому, участвующая в образовании комплекса IgG-C1q. Сопоставление первичных структур коллагеновых фрагментов молекулы С1 q с последовательностями коллагенов типа a1 дало возможность локализовать пептид 42-48 B-цепи, участвующий во взаимодействии с тетрамером С1г2С1в2. При модификации гистидина в структуре пептида происходит резкое падение константы ассоциации субкомпонент С1г, С1з с C1q.

3. У антигена Ф1 чумного- микроба определено процентное содержание ß-структуры (50%) и предсказана локализация одиннадцати ß-тяжей. Рассчитаны профили доменности, гидрофильности, антигенности,вариабельности и амфипатичности. Сделан вывод, что основная иммуногенность сосредоточена на концах и стыках доменных образований.

4. Анализ аминокислотной последовательности Po-рецептора V стрептококка показал, что N-конец и внутренние повторяющиеся участки А^ имеют 50-70% гомологии с соответствующими фрагментами Fo-рецептора А? 6, а следующие за ними два гомологичных повтора В1, В2 и С-конец сходны со структурой М-белков (90% совпадений).

Повторы Aí . имеют свмичленную периодичность, характерную для суперспирализованных белков. Последовательность SER - ASN - ARG -ALA - ALA во внешней позиции "Г" каждого повтора консервативна и может иметь важное значение во взаимодействиях Fo-рецептора и IgG. Сходство между районами Fo-рецепторов и М-белков говорит о том, что гены этих белков являются продуктами межгенной рекомбинации генов - предшественников и последующей дивергенции.

5. Показано, ' что основной конформацией полипептида с молекулярным весом 27 ООО дальтон вируса Т-клеточной лейкемии человека (ATLV) должна быть р-структура. В результате совмещения ß-структурных участков и цистеинов в N- и С-концевнх половинах белка рХ27 ATLV с р-структурными участками и цистеинами в С^2- и СуЗ-доменах IgG человека установлена статистически достоверная гомология между С-концом исследуемого бежа и иммуноглобулин -подобным доменом антигена HIA-DQw1.

6. Обнаружена гомология между участком 10 - 38 адренокортикотропного гормона (АКТГ) овцы и фрагментами IL-1 мыши и -1а человека. Высказано предположение, что вероятный терморегуляторный центр IL-1 ' располагается в АКТГ-подобном участке.

7. С помощью методов оценки процентного содержания а-спиралей и ß-структуры в белке, эмпирических и стереохимических правил предсказана вторичная структура IFN-a, -р и -7 и показано, что a-спираль является доминирующей вторичной структурой (50-70%) для всех классов этих белков. Используя метод упаковки a-спиральных сегментов в глобулу и принимая во внимание распределение дисульфидных связей в IFN-a, предложены две альтернативные глобулярные конформации для IFN-a и -р. Обнаружена консервативность гидрофобных ядер исследуемых белков. Сделано заключение, что все IFN, в общих чертах, имеют аналогичную глобулярную a-сшральную конформацию.

8. Установлено, что доминирующей вторичной структурой IL-2 (TCGF), FDGF и трансформирующего белка р28В1в вируса саркомы обезьян является a-спираль. Оценка показывает, что ее содержание в FDGF и p28sls равно « 50%, в то время как в IL-2 - «< 50-65%. Во всех исследованных белках выделено по пять a-спиральных сегментов. После упаковки полученных a-спиралей каждого белка в одну из глобулярных структур, предложенных для "онформации- IFN-a и -р, выявлена гомология гидрофобных ядер сравниваемых белков (>30%). Предположено, что IL-2, PDGF и p28SÍB должны иметь

третичную структуру, аналогичную конформации IFN.

9. Принимая во внимание консервативность гидрофобных ядер IL-2 и IFN, построена конформация IFN-a ,-ß и -и с использованием в качестве базиса экспериментально определенной пространственной структуры IL-2. Проведенный анализ консервативных позиций в структурах 72 IFN-a, -ß и -и показал, что все постоянные остатки можно разбить на три кластера: "петлевой", "гидрофильный" и "гидрофобный". Локализация консервативных кластеров и гомология фрагментов IFN-a с протимозином-а1 и IPH-ß2 дала возможность предположить, а затем экспериментально проверить существование у IFN-a и -р двух активных центров.

10. Приведены результаты расчета содержания a-спиралей и ß-структуры для IFN-co; IL-3, -4, -5, -6 и -7; CSF и oMGF. Содержание a-спиралэй в анализируемых белках предсказывается в пределах от 55% до 73%, в то время как содержание ß-структуры -от 0% до 31%. Расчет расположения вторичной структуры для перечисленных выше белков осуществлялся с помощью метода локализации сегментов a-спиралей, способных встраиваться в гидрофобное ядро. В большинстве случаев у отдельного зрелого белка определено пять а-спиральных сегментов. Существует корреляция между расположением a-спиралей и локализацией нитронов. Показаны возможные эволюционные связи между этими белками. Полученные данные позволяют утверждать, что IFN, II и CSF являются членами единого структурного (a-спиралыюго) семейства белков.

11. Среди белков системы иммунитета выделено семейство иолекул, состоящее из IL-8, pTG, PF4, 7ip-IO, GR0, 9-ЕЗ и ACT-2, юлипептидные цепи которых содержат от 70 до 90 аминокислот и зреди них четыре цистеина в одних и тех же позициях. Вторичная зтруктура этих белков состоит из трех антипараллельных ß-тяжей (аминокислоты 22 - 29 , 37 - 43 и 47 - 52), образующих ß-слой, юторый прикрыт a-спиралью (остатки 57 - Б9). N-концевые аминокислоты вплоть до позиции "21" формируют петлю. В районе юзиций "10" и "20" формируются консервативные по первичной ¡трукгуре ß-изгибы. Между первым и вторым, вторым и третьим 3-тяжами также расположены петли, содержащие консервативные J-изгибы. Анализ изменчивости поверхностных аминокислот показал, reo остатки a-спирали в позициях "58", "59", "62", "64" и "66" югут отвечать за взаимодействие с лигвндами или рецепторами.

Печатные работы по теме диссертации:

1. Zav'yalov V.P., Denesyuk A.I. Possible conformation of interferons: a prediction based on amino acid composion and sequence // Immunol. letters. - 1982. - V.4. - N.1. - P.7-14.

2. Denesyuk A.I., Zav'yaloY V.P. Conservativity of three -dimentional structures of a~, p- and 7-interferons // Immunol. letters. - 1982. - V.5. - N.2. - P.223-226.

3. Завьялов В.П., Абрамов В.М., Тищенко В.М., Дудич Е.И., Дудич И.В., Денесюк А.И., Архангельская Э.А. Новые функции иммуноглобулинов и механизмы их реализации // Химия белков и пептидов: Тез. докл. VI Всесоюз. симп. - Рига, 1983, С.40-41.

4. Завьялов В.П., Денесюк А.И. Эволюционные, конформационные и функциональные взаимоотношения а-, р- и 7-интерфвронов // Химия белков и пептидов: Тез.-докл. VI Всесоюз. симп. - Рига, 1983, С. 49-50.

5. Денесюк А.И., Тищенко В.М., Абрамов В.М., Завьялов В.П. Теоретические и экспериментальные исследования конформации "шарнирных" участков в подклассах иммуноглобулинов G человека // Молек. биол. - 1983. - Т.17. - № 6. - 0.1262-1271.

6. Завьялов В.П., Абрамов В.М., Тищенко В.М., Дудич Е.И., Дудич И.В., Денесюк А.И., Архангельская З.А. Новые функции иммуноглобулинов и молекулярные механизмы их реализации // 16-ая конф. ФЕБО: Тез. докл. - Москва, 1984, С.371.

7. Завьялов В.П.. Денесюк А.И. Эволюционные, конформационные к функциональные взаимоотношения а~, р- и 7- интерферонов // Докл. АН СССР.- 1984.- Т.275.- № 1.- С.242-246.

8. Zav'yalov V.P., Denesyuk A.I. Predicted secondary structure and hydrophobic cores of T-cell (TCGP or Ib-2). anc platelet-derived growth factors as well as of transforming protein p28sl3 of simian sarcoma virus are similar to those ol interferons // Immunol. Lett. - 1985. - V.10. - N.I. - P.7!-79.

9. Завьялов В.П., Тищенко В.М., Денесик А.И., Абрамов В.М., Жилина И.Л., Наволоцкая Е.В., Привалов П. Л. Антитела Kai

прогормоны: внутримолекулярная программа процессинга антител // ] Всес.-биохим. съезд: Тез. докл. - М., 1986, Г.2,. С.429-430.

10. Завьялов В.П., Денесюк А.И., Суровцев В.И., Тищенко В.М Структурно - функциональные исследования Clq, субкомпонент! первого фактора системы комплемента // VII Всесоюз. симп. п< межмолекулярному, взаимодействию и конформациям молекул: Тез

экл. - Пущино, 1986, С.158-159.

11. ZaVyalov V.P., Бепеэуик A.I. Human adult T-cell эакаеш1а vlrya (ATÍV) genome codea for the protein pX27 tructurally homologous to Immunoglobulin - like part of HLA-DQ it Igen // Immunol. Lett, - 1986/1987.- V.14.- N.1.- P.139-142.

12.Завьялов В.П., Денесш А.И. Интэрлэйкин-1 мыши содержит гаг-и Н-2Кв-подобные участки аминокислотной последовательности / Докл. АН СССР. - 1987. - Т.297. - Л 3. - С.727-730.

13. Эйхман Е., Шнейдер Ф., Денесюк А.И., Майоров В.А., Кожич .Т., Завьялов В.П., Хэндшак В., Нолль Ф. Биологическая ктивность синтетических пептидов, соответствующих: по структуре тасткам'полипептидной цепи интерферона-чх2 человека // Структура, иосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы: эз.докл. Межд. симп.2-4 июня 1987.-Пущино,1987, С.29.

14. Завьялов В.П., Денесюк А.И. Структурные основы заимосвязи процессов канцерогенеза с системами иммунной и ейроэндокринной регуляции. // Структура, биосинтез и функции олекулярных элементов иммунной системы: Тез. докл. Межд. симп.--4 июня 1987. - Пущино, 1987, С.27.

15. Нолль Ф., Шнейдер Ф., Денесюк А.П., Майоров В.А., Кожич .Т., Завьялов В.П. Антигенпость синтетических пептидов -рагментов структуры интерферонов человека // Структура, иосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы: Тез. окл. Межд. симп. 2-4 июня 1987. - Пущино, 1987, С.30.

16. Завьялов В.П., Денесюк А.И. Конформация и активные ентры суперсемейства интерфероноподобных белков - интерцеллонов / VII Всесоюз. симп. по химии белков и пептидов: Тез. докл. -аллинн, 1987, С.53-54.

17. Денесюк А.И., Завьялов В.П. Ростовые факторы: поиск омологии в аминокислотных последовательностях и пространственных паковках на основе сопоставления предсказанных вторичных труктур // II Всесоюз. конф. по математическим и вычислительным етодам в биологии. Биомолекулярные системы: Тез. докл. - Пущино, 987, С.68.

18. ZaT'yaloY V.P., Denesyux. A.I. Conformation and actlYe itea of superfaraily oí interferon-like proteins, lntercellons // 8th Mettlng FEES: Abstracta. - Ljubljana, 1987, P.95.

19. Zav'yalov V.P., Denesyuk A.I., Dudlch E.I., Dudlch I.V., íaiorov V.A., Vasllenko R.N. Conformation and functional sites of

superfanily of a-chelical lnterieron-llke proteins

lOTnunoreguIators // 14th International congress оi biochem.: Abstracts. - Prague, 1988, P.181.

20. Абрамов B.M., Тшенко B.M., Христофоров B.C., Рязанцев C.H., Денееюк А.И.,. Завьялов В.П. Конформация подклассов IgG человека в связи с их функцией как прогормонов // I Всесоюз. съезд иммунологов: Тез. докл. - М., 1989, Т.1, С.5.

21. Тшценко В.М., Суровцев В.И., Денееюк А.И., Завьялов В.П. Исследование активных центров фактора Clq методом химической модификации // I Всесоюз. съезд иммунологов: Тез. докл. - М.,

1989, Т.1. С.115.

22. Zav'yalov V.P., Denesyuk A.I., Zav'ylova G.A. Theoretical analysis or conlormation and active sites of interferons // Immunol.Lett.- 1989. - V.22. - N.2. - P.173-182.

23. Денеснк A.M., Завьялов В.П., Завьялова Г.A. Теоретическое структурно - функциональное изучение интерферонов и интерфероно - подобных белков // I Всесоюз. съезд иммунологов: Тез. докл. - М., 1989, Т.1, С.68.'

24. Zavlyalov 7.P., Eenesyuk A.I. Theoretical ana experimental analysis of conformation and active sites of iramunocytoicines // Structure, biosynthesis, and functions of the molecular elements of the immune system: Abatr. of commun. 10th workshop and symposium 7-9 June 1989.- Cracow, 1989, C.23.

25. Завьялов В.П., Наволоцкая Е.В., Абрамов В.М,, Васильев В.Д., Володина Е.Ю., Денееюк А.И., Исаев И.С., Митин Ю.В., Рязанцев С.Н., Тшценко В.М., Христофоров B.C. Антитела как прогормоны // Всесоюз. симп. по химии белков: Тез. докл. -Тбилиси, 1990, С.36.

26. Zav'yalov V.P., Kavolotskaya E.V., Abramov V.M., Vasilier V.D., Volodina E.Yii., Denesyuk A.I., Isaev I.S., Mitin Yu.V., Ryasantsev S.N., Tishchenko V.U., Khristoforov V.S. Antibodies as prohormones // 20th Metting PEBS: Abstracts. -Budapest, 1990, P.39.

27. Denesyuk A.I., Zav'yalov V.P. The results of the theoretical structural analysis of immmocytoklnes as a basis for their classification // 20th Metting FEBS: Abstracts. - Budapest,

1990, P.254.

28. Смирнов О.Ю., Спирина Г.В., Денееюк А.И. Структурно -функциональные свойства белка 77-нового Fo-рецептора II.типа из Streptococcus pyogenes Yalente (груша G) // Всесоюз. школа -семинар "Молекулярная биология и медицина": Тез. докл. -

энинград, 1990, С.62.

29. Завьялов В.П., Денесюк А.И., Эйхман Е., Галактионов .Г., Исаев И.О., Кауров О.А., Кожич А.Т..Майоров В. А., аволоцкая Е.В., Нолль Ф., Прусаков А.Н., Шнайдер Ф., Василенко .Н., Володина Е.Ю. Изучение взаимосвязи между структурой и ункцией интерферонов с ' помощью синтетических пептидов // сесоюз. симп. по химии пептидов: Тез. докл. - Рига, 1990, С.5.

30. Zav'yalov V.P., Denesyuk A.I., Zav'yalova G.A. heoretical conformational analysis of a family of a-helical mmunocytokines // Biochim. Blophys. Acta. - 1990. - V.1041. -.2. - P.178-185.

31. Gayloy E.E., Smirno? O.Yu., Karllshev A.V., Volkovoy :.I., Denesyuk A.I., Nazimoy I.V., Rubtsoy K.S., Abramov V.M., lalvadyanz S.M., Zav'yalov V.P. Nucleotide sequence oi the ersinla peatis gene encoding P1 antigen and the • primary, itructure of the protein. Putative T and В cell epitopes // PEBS fitters.' - 1990. - 7.277. - N.1 ,2. - P.230-232.

Материалы диссертации были доложены на VI и VII Всесоюзных :импозиумах по химии белков и пептидов 1 (Рига, 1983, Таллинн, 987), XVI, XVIII и XX конференциях ФЕБО (Москва, 1984, Любляна, 987, Будапешт, 1990), V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 986), VII Всесоюзном симпозиуме по межмолекулярному )заимодействию и конформациям молекул (Пущино, 1986), Лэадународном симпозиуме по структуре, бпссттвзу и функциям юлекулярных элементов иммунной системы (Пущино,1987),. II Зсесоюзной конференции по математическим и вычислительным методам з биологии (Пуцино, 1987)', XIV Международном биохимическом гонгрессе (Прага, 1988), I Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи,

1989), Международном симпозиуме по структуре, биосинтезу и Йгакции молекулярных элементов иммунной системы (Краков, 1989), Зсесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбилиси, 1990), Всесоюзной пколе - семинаре по молекулярной биологии и медицине (Ленинград,

1990), Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов (Рига, 1990).

19.07.91 г. Зак. 345IP Тир. 150 экз. Уч.-изд.л. 3.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ДНЦ АН СССР