Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Компьютерная морфометрия иммунокомпетентных клеток в дифференциальной диагностике дисфункций почечного трансплантата
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.00.27
Автореферат диссертации по медицине на тему Компьютерная морфометрия иммунокомпетентных клеток в дифференциальной диагностике дисфункций почечного трансплантата
На правах рукописи
СТЕПАНОВ ВАДИМ АНАТОЛЬЕВИЧ
КОМПЬЮТЕРНАЯ МОРФОМЕТРИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ДИСФУНКЦИЙ ПОЧЕЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА
14.00.27-хирургия 14.00.36 - аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва-2009
003462722
Работа выполнена в ГУ «Московский областной научно - исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского».
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор
Ватазин Андрей Владимирович
доктор медицинских наук
Василенко Ирина Анатольевна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского
Мазурин Валентин Сергеевич
доктор медицинских наук, профессор
ГУ НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского Департамента здравоохранения
г. Москвы Хватов Валерий Борисович
Ведушая организация: ГУ «Российский научный центр хирургии им. академика Б.П. Петровского РАМН».
Защита состоится «_»_ 2009 г. в_часов на заседании
диссертационного совета Д.208.049.01 при ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского по адресу: 129110, Москва, ул. Щепкина, 61/2, корпус 15а, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского
Автореферат разослан «_»_2009г.
Учёный секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Астахов П.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Трансплантация почки на сегодняшний день является методом выбора в лечении больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточностью (TXI1H), который позволяет заметно улучшить качество жизни, способствует более полной социальной реабилитации этой категории больных. Одним из главных факторов, вызывающих гибель функционирующей почечной ткани у реципиента после трансплантации, является острое отторжение. Количество и тяжесть перенесенных острых реакций отторжения напрямую имеет корреляцию с потерей массы действующих нефронов и длительностью выживания трансплантата [Томилина Н.А, Столяревич Е.С. и др., 2003].
Оптимизация схем иммуносупрессии может существенно снизить риск развития осложнений [Шумаков В.И и соавт., 1994; Астахов П.В., 2001; Shton-Chess J. et al., 2009]. Однако острое отторжение остаётся серьезной проблемой в трансплантации [Karczcwski J., 2008].
Под отторжением понимают воспалительное поражение трансплантата, вызванное специфической реакцией иммунной системы реципиента на трансплантационные антигены донора [Peter S., 2002; Рабсон.А. и др., 2006].
В реакцию взаимодействия между иммунной системой реципиента и антигенами донорского почечного аллотрансплантата вовлечены практически все механизмы клеточного и гуморального ответа. Взаимодействие антигенспецифического рецептора Т-клеток и аллогенных HLA-антигенов является центральным событием данной реакции.
Главное проявление иммунологического конфликта - ухудшение выделительной функции донорского органа или отсутствие восстановления ее. Но, на функцию трансплантата и его сроки восстановления в раннем послеоперационном периоде могут оказывать влияние неиммунные факторы, такие как цитомегаловирусная и раневая инфекция, лимфатическая
киста, тромбоз сосудов трансплантата, мочевой затек, токсичность лекарственных средств и другие.
Выяснение причин дисфункции служит основой для назначения эффективной терапии.
Диагностику острой реакции отторжения проводят на основе клинических и инструментальных исследований и лабораторно-иммунологических показателей. При этом пункционная биопсия остаётся «золотым стандартом» оценки патологических состояний нефротрансплантата. Хотя известно, что пункционная биопсия может привести к развитию целого ряда осложнений: гематома, инфаркт почки, уринома и др. [8о1ег К., 2008].
В настоящий момент иммунологические методы исследования рассматривают как наиболее информативные и безопасные для диагностики криза отторжения. Приоритет отводят методам, обеспечивающим минимальную инвазивность и оперативность исследований, которые проводят с помощью новейших оптических компьютерных лазерных систем [Лвтандилов Г.Г, 1996; Александров М.Т., 2008].
Василенко И.А. и соавт., в 1995г внедрили метод компьютерной лазерной фазоморфометрии для прижизненной оценки
морфофункционального состояния клеток периферической крови, в том числе и иммунокомпетентных клеток.
Первые результаты исследования компьютерной морфомстрии иммунокомпетентных клеток для оценки иммунного статуса реципиентов почечного трансплантата оказались весьма обнадеживающими [Метелин В.Б. и др., 2003]. Вместе с тем до настоящего времени проблема дифференциальной диагностики причин дисфункции нефротрансплантата остается актуальной и требует продолжения исследований в данном направлении, что явилось основанием для выполнения настоящей работы.
Цель исследования. Разработка морфометрических критериев функциональной активности иммунокомпетентных клеток в
дифференциальной диагностике дисфункции почечного трансплантата в раннем послеоперационном периоде.
Задачи исследования:
1. выявить особенности морфометрических изменений Т- и В-лимфоцитов в раннем послеоперационном периоде у реципиентов почечного трансплантата с неосложненным послеоперационном течением;
2. оценить характер изменений морфометрических параметров Т- и В-лимфоцитов при развитии иммунологического конфликта и при оценке эффективности противокризовой терапии;
3. изучить морфометрические изменения иммунокомпетентных клеток в раннем послеоперационном периоде при развитии дисфункции почечного трансплантата не иммунного характера;
4. оценить возможность фазовой компьютерной морфометрии в дифференциальной диагностике дисфункции почечного трансплантата;
5. на основе комплексной суммарной оценки морфометрических параметров иммунокомпетентных клеток разработать прогностически значимый критерий (индекс активации клеток) ранней диагностики острой реакции отторжения почки при дисфункции трансплантата.
Научная новизна. Дана детальная оценка оптико-геометрических изменений популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток у больных с почечным трансплантатом в раннем послеоперационном периоде с неосложненным течением.
Выявлены особенности морфометрических изменений Т- и В-лимфоцитов у пациентов почечного трансплантата при развитии реакции отторжения и при его лечении.
Определены морфометрические изменения иммунокомпетентных клеток в условиях развития неимунных дисфункций трансплантата.
Произведена оценка возможности компьютерной морфометрии Т- и В-лимфоцитов в дифференциальной диагностике причин дисфункций почечного трансплантата.
Разработан индекс активации клеток (ИАК) для математической опенки состояния реактивности субпопуляции лимфоцитов (положительное решение о выдаче Патента РФ «Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата» № 2007147991 от03.09.2008г).
Выявлены различия морфометрических изменений
иммунокомпетентных клеток, в зависимости от причин дисфункции, а так же при развитии и инволюции реакции отторжения.
Практическая значимость. Компьютерная фазовая прижизненная морфометрия иммунокомпетентных клеток позволила выявить динамику морфометрических изменений иммунокомпетентных клеток у пациентов с не осложненным послеоперационным периодом.
Фазовая компьютерная морфометрия в короткие сроки и объективно позволила оценивать особенности популяционного состава иммунокомпетентных клеток, определять уровень их функциональной активности. С помощью данного метода появилась практическая возможность проводить диагностику иммунологического конфликта и мониторинг противокризовой терапии.
На основе данной методики стало возможным проведение дифференциальной диагностики причин ранних дисфункций почечного трансплантата.
Практическим результатом выполненной работы явилась разработка индекса активации клеток (ИАК) субпопуляций лимфоцитов для дифференциальной диагностики острой реакции отторжения при дисфункции нефротрансплантата. Это позволило на доклинической стадии распознавать начало острой реакции отторжения, и тем самым, уменьшить частоту потерь пересаженных органов в раннем послеоперационном периоде и улучшить отдаленные результаты трансплантации.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Индекс активации клеток, рассчитанный на основе динамики их морфометрических параметров, характеризует уровень функциональной
перестройки ядерных структур лимфоцитов периферической крови и может рассматриваться в качестве критерия ранней диагностики иммунологического конфликта и эффективности антикризовой терапии.
2. Проведение компьютерной фазовой морфометрии с применением индекса активации клеток позволяет оперативно и своевременно выявлять причину дисфункции ренального трансплантата: дифференцировать иммунологический конфликт, хирургические и инфекционные осложнения.
Внедрение в практику. Основные положения и материалы диссертации внедрены в клиническую практику отделения гемодиализа с пересадкой почки ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Получено положительное решение о выдаче Патента РФ «Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата» №2007147991 от 03.09.2008г.
Апробация работы. Основные материалы и положения работы доложены и обсуждены на 24-й научно-практической конференции «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 2005г.; 25-й научно-практической конференции «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 2006г; научно-практической конференции «Клиническая трансплантация органов (Актуальные вопросы)» Москва, 2007г; I научно-практической конференции «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 2008г; на совместной научно-практической конференции отдела оперативной нефрологии и хирургической гемокоррекции МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского и кафедры Эфферентной медицины, клинической и оперативной нефрологии ФУВ МОНИКИ, Москва, 2008г.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 54 отечественных и 160 зарубежных источника.
Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 10 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
КЛИНИЧЕСКИЕ НАБЛЮДЕНИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводились на базе отделения гемодиализа с пересадкой почки ГУ «Московский областной научно-исследовательский институт им. М.Ф. Владимирского».
Проанализированы результаты обследования 60 реципиентов трупного почечного аллотрансплаитата в раннем послеоперационном периоде. В исследование находилось 30 мужчин и 30 женщин. Возраст пациентов составлял от 18 до 65 лет (средний возраст 39,9 ± 12,5лет).
Основными причинами, приведшими к терминальной хронической почечной недостаточности, являлись хронический гломерулонефрит 73% (п=44), поликистоз почек 10% (п=6), хронический пиелонефрит 7% (п=4).
К другим причинам относились аномалия развития мочевой системы 5% (п=3), подагра 3% (п=2), сахарный диабет 2% (п=1).
До трансплантации почки 59 больных ТХПН получали заместительную терапию гемодиализом (п=39) или перитониальным (п=20). В одном случае трансплантация донорского органа была проведена до начала диализа.
Почки для трансплантации были эксплантированы у доноров с небьющимся сердцем. Донорские органы перфузировали сразу после изъятия на ЬасШЫе консервирующим раствором Кустодиол при температуре +4°С. Срок консервации донорских почек колебался от 12 до 32 часов, что в среднем составило 21,8±5,0 час.
Подбор пары донор-реципиент осуществляли по совпадениям группы крови, антигенам А, В, Иг системы тканевой совместимости (НЬА). У всех пациентов на момент трансплантации были отрицательные перекрестные пробы с донорскими лимфоцитами, проводимые по методике стандартного
комплимент зависимого микролимфоцитотоксического теста (cross-match отрицательный).
Несовпадение по системе HLA по 2 антигенам было у 6,7%, по 3 - у 36,7%, по 4 - у 33,3%, по 5 - у 23,3%. Без учета тканевой совместимости трансплантации не проводили.
Аллотрансплантацию донорской почки проводили в подвздошную ямку. После обработки почечного трансплантата при необходимости выполнялась реконструкция сосудов донорского органа. Артериальный анастомоз накладывался между артерией нефротрансплантата и наружной подвздошной артерией реципиента по типу «конец в б?к». Венозный анастомоз осуществлялся с наружной подвздошной веной по типу «конец в бок». После пуска кровотока нефротрансплантата накладывали неоуретероцистоанастомоз.
Иммуносупресивная индукционная терапия включала внутривенно капельное введение моноклональных антител к рецептору IL-2 (симулект или зенопакс) за 30-60 минут до операции и болюсное введение метилпреднизолона в дозе 250-750 мг перед васкуляризацией почечного аллотрансплантата. После пуска кровотока больному внутривенно назначали инфузию циклоспорина А в дозе 2,5 мг/кг в сутки.
Нами использовался протокол трех компонентной базовой иммуносупрессии, который назначался через 6-12 часов после операции. Она включала: сандимун-Неорал в начальной дозе 5 мг/кг в сутки; глюкокортикостероиды - преднизолон в начальной дозе 0,5 мг/кг; селективные цитостатики - Селл-Септ (2000 мг в сутки) или майфортик (1440 мг в сутки) не зависимо от веса реципиента.
Лечение реакции отторжения начиналось с пульс-терапии метилпреднизолоном в дозе 250-750 мг в сутки в виде инфузии в течение 3-5 дней. В случаях отсутствия клинического эффекта назначались антитимоцитарный глобулин - АТГ - фрезениус с начальной лечебной дозой из расчета 3-5 мг/кг веса больного.
Мы считали, что функция трансплантата первичная, если у реципиента после пересадки почки суточный диурез составлял более 1000 мл и больной не нуждался в экстракорпоральной заместительной терапии в течение 7 дней после операции. Восстановление азотовыделелительной функции регистрировали, если уровень креатинина плазмы крови не превышал 0,2 ммоль/л. После трансплантации первичная функция нефротрансплантата была зарегистрирована у 29 пациентов, а отсроченная - у 31 пациента.
Средние сроки начала функционирования почечных шглотрансплантатов составили 9,4±6,1 день, а восстановление азотовыделительной функции - 15,9±14,7 день. В послеоперационном периоде клинико-лабораторный контроль состояния реципиента проводился не менее 4 недель.
Дисфункцию почечного аллотрансплантата диагностировали, если у пациентов была отсроченная функция или при развитии нарушений функционирующего аллотрансплантата. Клиническими проявлениями дисфункций считали отсутствие или уменьшение суточного диуреза, увеличение или «зависание» азотемии выше нормативных значений. Наличие дисфункции нефротрансплантата было установлено у 43 реципиентов.
Причинами дисфункции стали: иммунологический конфликт 28% (п=12), пациентов, острый канальцевый некроз 30% (п=13), вирусная инфекция 16% (п=7), лимфатическая киста 9% (п=4), тромбоз сосудов нефротрансплантата 7% (п=3), грибковая инфекция 5% (п=2), некроз мочеточника 5% (п=2).
Пациенты были разделены на 3 группы.
Первую группу составили 17 больных (средний возраст 37,6±15,0 лет), которые в раннем послеоперационном периоде имели стабильную функцию нефротрансплантата. Пациенты этой группы не имели хирургических, иммунологических и инфекционных осложнений.
Во вторую группу были включены 12 пациентов (средний возраст 38,9 ± 9,0 лет), у которых причиной дисфункции в раннем послеоперационном
периоде явился иммунологический конфликт с донорским органом. Диагноз устанавливался клинически и лабораторно с обязательным морфологическим подтверждением.
Третью группу составили 31 человека (средний возраст 40,1 ± 13,3 лет), у которых в раннем послеоперационном периоде была дисфункция почечного аллотрансплантата без иммунологического конфликта. Выявление причины дисфункции проводился лабораторно-инструментальными методами.
Для определения показателей нормального состояния иммунореактивности нами была обследована группа (30 человек) добровольцев. Возраст обследованных составлял от 20 до 54 лет. Средний возраст в группе добровольцев 34,2 ± 11,8 лет.
Все больные находились под ежедневным мониторингом. Помимо клинических данных, у больных ежедневно измерялось артериальное давление и температура тела, определялся суточный диурез, исследовались показатели общего и биохимического анализа крови, коагулограммы. При наличии мочи проводился её общий анализ и определение экссекреции креатинина, так же проводился ультразвуковой и доплеровский контроль пересаженного органа и его ложа с помощью прибора SSD-2000 (Aloka С°, Япония).
При отсутствии первичной функции почечного аллотрансплантата или его дисфункции во время дифференциальной диагностики проводился комплекс исследований для исключения иммунологического конфликта. Подтверждался диагноз при помощи пункционной биопсии и морфологического изучения биоптата нефротрансплантата.
Чрезкожную биопсию почечного трансплантата выполняли с помощью автоматического биопсийного «пистолета» GT GUN 22 (США), и использовали одноразовые иглы размером 16G. Оценка полученных данных проводили по классификации Banff 97.
Оценку иммунологического статуса больного проводили на проточном лазерном цитометре DAKO с использованием моноклональных антител (МАТ) производства DAKO, меченных ФИТЦ и фикоэритрином.
Для исследования морфофункционшшшго состояния лимфоцитов использовали экспресс-метод витальной компьютерной фазовой морфомегрии на основе отечественного компьютерного лазерного фазово-интерференционного микроскопа "Цитоскан" (МГИРЭА, Москва), представляющего собой интерферометр Линника на базе модифицированного и автоматизированного МИИ-4 (ЛОМО, Ленинград).
Иммунокомпетентные клетки выделяли из периферической крови (ПК). Из локтевой вены производили забор 5-7 мл венозной крови в пробирку с гепарином (250 ЕД на 1 мл). Клеточную взвесь наслаивали на два слоя градиента (1,093 и 1,077). Пробирки центрифугировали в течение 40 минут при скорости 1,5х103 об/мин, получали 2 интерфазы (кольца): верхняя на границе плазма-фиколл (плотность 1,077) - мононуклеары; нижняя -фиколл-фиколл (плотность 1,077- 1,119)-гранулоциты.
Кольца мононуклеарных клеток на границе градиента собирали и отмывали физиологическим раствором два раза по 5-7 мин при 1000 об/мин.
Разделение Т- и B-лимфоцитов проводили по методу, основанному на разной степени адгезии лимфоцитов на полимерных материалах (чашки Петри диаметром 60 мм Costar, USA). Полученной взвесью клеток заполняли стандартную камеру Горяева с зеркальным напылением и проводили морфометрические исследования.
Статистический анализ экспериментальных и клинических данных проводили с помощью алгоритмов среды MatLab и математического пакета "Statistica 6". Стандартная обработка выборок включала подсчет значений средних арифметических величин, ошибок средних, а также величины дисперсии, среднего квадратического отклонения и анализа асимметричности распределения. Различия между сравниваемыми группами
рассчитывали по критериям Вилкоксона-Манна-Уитни, Колмагорова-Смирнова или Стыодента. Уровень значимости устанавливался равным 0,05.
КОМПЬЮТЕРНАЯ МОРФОМЕТРИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК У РЕЦИПИЕНТОВ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА С НЕОСЛОЖНЕННЫМ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫМ ТЕЧЕНИЕМ
Для определения нормативных величин размерных параметров живых функционирующих иммунокомпетентных клеток методом КФМ были исследованы Т- и B-лимфоциты (п=1500) периферической крови добровольцев (п=30). Установлено, что средний в популяции диаметр (D) Т-лимфоцитов составил 7±1,13 (М±о), периметр (Р) - 20,4±3,16 (М±о), высота (Н) - 2,2±0,41 (М±о), площадь (А) - 30,3±10,1, объём (V) - 36,5±13,95 (М±с).
В популяции B-лимфоцитов диаметр (D) клеток составлял 9,20±2,26 мкм (М±с), периметр (Р) - 27,60±6,67 мкм (М±а), высота (Н) - 1,8±0,47 мкм (М±а); площадь (А) -т52,6±24,77; объём (V) - 45,8±22,9 (М±ст).
Данные величины были приняты нами как состояние функционального покоя Т- и B-лимфоцитов, что позволило в дальнейшем использовать полученные данные в качестве контрольных значений.
В группу реципиентов нефротрансплантата с неосложненным послеоперационным течением были включены 64,7% мужчин (п=11) и 35,3% женщин (п=6). Средний возраст мужчин - 41,9±15,3; женщин - 32,1 ±8,0 лет. При подборе пары донор-реципиент несовпадение по системе тканевой гистосовместимости составило по 2 антигенам 5,9 % (п=1), по 3 - 35,3 % (п=6), по 4 - 41,2 % (п=7), по 5 - 17,6 % (п=3). В среднем общее несовпадение по HLA составило 3,8±0,9 антигена. Операций без совпадений тканевой совместимости не проводилось.
Все реципиенты имели первичную функцию почечного аллотрансплантата. Азотовыделительная функция восстанавливалась на 7,3±4,7 день. Функция донорского органа была стабильной. Развитие
бактериальных, вирусных и грибковых инфекций на момент наблюдения не регистрировалось.
Изменения морфометрических параметров Т-клеток в раннем послеоперационном периоде с неосложненным течением у реципиентов почечного аллотрансплантата являются показателем адекватной ответной реакции организма на трансплантационные антигены с одной стороны и иммуносупрессию с другой.
Рисунок 1 иллюстрирует динамику посуточных изменений Т-лимфоцитов реципиентов нефротрансплантата в раннем послеоперационном периоде.
Диаметр
Периметр
Высота
Площадь
Объём
^ А+ > А11? А*1 А^ А*" Л" ^
сутки
Рис. 1. Динамика посуточных изменений Т-лимфоцитов реципиентов нефротрансплантата. По оси абсцисс - сутки после трансплантации, по оси ординат -величина морфометрических параметров (мкм).
Является очевидным, что увеличение значений Б, Р, А и V Т-лимфоцитов на 3 сутки при отсутствии значимых изменений фазовой высоты клеток (Н), отражающей уровень активации лимфоцитов по состоянию их ядер, могут свидетельствовать о смене популяционного состава Т-клеток, которые вероятнее всего сопряжены с операционной травмой и поступлением в организм чужеродных антигенов. Уменьшение в дальнейшем морфометрических параметров клеток свидетельствует об эффективной иммуносупрессии.
Начиная с 5 суток, изменения параметров Т-лимфоцитов проходят в пределах статистических достоверностей, и усредненные значения могут приниматься за нормативные показатели для сравнительного анализа.
Морфометричсские параметры В-лимфоцитов, характеризующие их морфологические и функциональные особенности, позволяют количественно оценить характер реакций клеточного звена гуморального иммунитета.
На рисунке 2 представлена динамика посуточных изменений размерных параметров в популяции В-лимфоцитов.
сутки
[—♦—Диаметр —в—Периметр —*—Высота —«—Площадь —-Объём |
Рис. 2. Динамика посуточных изменений В-лимфоцитов реципиентов нефротрансплантата. По оси абсцисс - сутки после трансплантации, по оси ординат -величина морфометрических параметров (мкм).
Мы считали, изменения показателей В-клеток периферической крови реципиентов почечного аллотрансплантата с неосложненным течением раннего послеоперационного периода являются ответом на неселективную иммуносупрессию.
Изменение морфометрических параметров В-лимфоцитов на 3 сутки, скорее всего, обусловлены реперфузионными повреждениями. Динамика размерных показателей В-клеток, начиная с 5 суток, проходят в пределах статистических достоверностей, и их усредненные значения могут приниматься за нормативные показатели для сравнительного анализа.
ИНДЕКС КЛЕТОЧНОЙ АКТИВАЦИИ В ОЦЕНКЕ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО состояния ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК
Для оптимизации мониторинга иммунореактивности реципиентов почечного аллотрансплантата в раннем послеоперационном периоде нами предложен расчетный индекс, характеризующий функциональное состояние иммунокомпетентных клеток периферической крови.
Поскольку при компьютерной фазово-интерференционной микроскопии основной физической величиной, определяющей прохождение луча через нативную живую клетку, является показатель преломления, фазовый портрет цитообъекта содержит информацию не только о его геометрических характеристиках, но и оптической плотности, которая непосредственно зависит от концентрации, химического состава и агрегатного состояния вещества клетки.
Рис. 3. Схематическое 30 изображение размерных показателей фазово-интерференционного портрета лимфоцита. О - фазовый диаметр, И - высота.
Исходную количественную информацию о клетке регистрируют в виде нормированных на длину волны значений оптической разности хода. Математический анализ этой количественной информации позволяет получить двумерные фазовые изображения, ЗБ-изображения, профили фазовой высоты в произвольных сечениях и т.д.
Величины фазовой высоты и объема характеризуют состояние ядерных структур. Известно, что конденсированный хроматин метаболически менее
активен в отношении синтеза ДНК, но оптически является более плотным но сравнению с его диффузной формой. Следовательно, чем выше фазовая высота, тем ниже пролиферативный потенциал лимфоцита.
Следовательно, отношение
к/й, где
Ь - фазовая высота ядра; с! - диаметр ядра, представляет собой индекс гетерогенности ядерных структур мононуклеарных клеток или, иначе, индекс клеточной активации (ИКА).
Расчетные значения ИАК для 95% Т-лимфоцитов периферической крови у соматически здоровых лиц составляют 0,20-0,30. Уменьшение величины индекса менее 0,20 в циркулирующей популяции 'Г-клеток свидетельствует о повышении их функциональной активности, а увеличение - об угнетении.
При исследовании В-звена иммунитета было установлено, что для 95% В-лимфоцитов периферической крови соматически здоровых лиц расчетные значения ИАК составили 0,15-0,35. Соответственно, уменьшение величины индекса 0,15 в циркулирующей популяции В-лимфоцитов свидетельствует о повышении их функциональной активности, а увеличение - об угнетении (Табл.1). Зарегистрированные нами изменения активационного статуса циркулирующих Т-лимфоцитов в группе пациентов с неосложненным течением послеоперационного периода могут быть связаны с ишемическим повреждением почечного трансплантата. Это состояние у больных с первичной функцией в среднем заканчивается к 10 суткам, характеризуется восстановлением азотовыделительной функции и уменьшением выброса антигенов поврежденного нефроэпителия аллотрансплантата.
По-видимому, именно эти изменения отражаются на динамике ИАК Т-лимфоцитов смешением в сторону активации с максимальными значениями на 3 сутки. Начиная с 10 суток, снижается антигенная нагрузка на организм и происходит превалирование иммуносупрессии. На этом сроке в клиническом
протоколе осуществляется плановое постепенное уменьшение базовой имму носупрессии.
Таблица 1
Процентное содержание Т- и В-лимфоцитов с различной величиной ИАК в циркулирующей популяции клеток у реципиентов нефротрансплантата в раннем послеоперационном периоде
Сутки Содержание (%)
В-лимф ИАК <0,15 Т-лимф ИАК <0,2
контроль 25,1 2,8
0 сутки 8,8* 3,3
3 сутки 3,7* 7,7
5 сутки 15,4 6,2
8 сутки 00 7,0
11 сутки 2,9* 0,0*
13 сутки 4,1* 2,5*
16 сутки 9,3* 6,5
19 сутки 2,6* 0,0*
22 сутки 12,2 3,5
Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р < 0,01
Анализ результатов посуточного мониторинга величины ИАК в циркулирующей популяции В-лимфоцитов показал, что у реципиентов нефротрансплантата до трансплантации процент ИАК<0,15 В-лимфоцитов не превышал 8,8%, в то время как у соматически здоровых лиц этот показатель был почти втрое выше и составил 25,1%.
Изменения ИАК В-лимфоцитов, которые мы наблюдали в группе неосложненного течения в раннем послеоперационном периоде пациентов почечного аллотрансплантата, вероятнее всего, связаны с ослабленным иммунным ответом больных до трансплантации с ТХПН на фоне хронической уремии и нарушением белкового обмена. Незначительную
активацию на 5, 16 и 22 сутки можно связать с определенным влиянием на гуморальное звено адаптивного иммунитета проводимой иммуносупрессии.
Таким образом, можно считать, что колебания ИАК в пределах от 2,0 до 7,7% (в среднем 3,8±2,9%) для Т-лимфоцитов и от 2,6 до 9,3% (в среднем 6,8±4,5%) для В-лимфоцитов у пациентов с неосложнепным течение раннего послеоперационного периода являются нормальными.
Полученные данные позволяют нам рекомендовать разработанный индекс активации клеток (ИАК) в качестве объективного критерия оценки иммунореактивности реципиентов почечного аллотрансплантата. При этом динамика величины ИАК пациентов с неосложненным течением послеоперационного периода может быть использована как нормативные показатели для проведения сравнительной диагностики возможных посттрансплантационных осложнений.
РОЛЬ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНОКОМПЕТЕНТПЫХ КЛЕТОК В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ДИСФУНКЦИЙ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА
Среди наблюдаемых нами пациентов у 12 человек (6 мужчин и 6 женщин) был диагностирован иммунологический конфликт. Средний возраст в данной группе мужчин составил 41,7±10,2 лет, женщин 36,1±7,7 лет.
При подборе пары донор-реципиент несовпадение по системе тканевой гистосовместимости составило по 2 антигенам - 8,3% (п=1), по 3 - 50,0% (п=6), по 4 - 25,0% (п=3), по 5 - 16,7% (п=2). Трансплантации донорского органа без учета тканевой совместимости не проводились. Следует отметить, что в данной группе на момент регистрации и проведения противокризовой терапии пациенты не имели бактериальных, вирусных и грибковых инфекций.
В таблице 2 суммированы данные величины ИАК Т-лимфоцитов обследованных реципиентов нефротрансплантата.
Таблица 2
Данные морфометрии Т-лимфоцитов в циркулирующей популяции клеток на момент реакции отторжения
ИАК Т-клеток Реакция отторжения Неосложненное течение После антикризовой терапии
М Е М о М о
<0,2% 19,0%* 5,9% 5,1% 2,6% 3,8%* 2,9%
>0,2% 81,0%* 5,9% 94,9% 2,6% 96,2% 2,9%
Примечание: * - достоверно относительно группы с неосложненным течением, при р < 0,01
Является очевидным, что при реакции отторжения наблюдается достоверное (практически в 4 раза) увеличение процента клеток с ИАК <2,0. Эффективность антикризовой терапии подтверждается снижением процента клеток с данной величиной ИАК.
В В-популяции на начальной стадии острого отторжения процент активных лимфоцитов остается невысоким, ИАК практически не отличается от показателя пациентов с неосложненным течением - 7,9±4,5% против 6,8±4,5%, соответственно (Табл.3).
Таблица 3
Данные морфометрии В-лимфоцитов в циркулирующей популяции клеток на момент реакции отторжения
ИАК В-клеток Ре: отто 1КЦИЯ ржения Не осложненное течение После антикризовой терапии
М а М Е М с
<0,15% 7,9 4,5 17,4 5,8 6,8 4,5
>0,15% 92,1 4,5 82,6 5,8 93,2 4,5
Примечание: * - достоверно относительно группы с неосложненным течением, при р < 0,01
У 31 из обследованных нами реципиентов нефротрансплантата в раннем послеоперационном периоде диагностировали дисфункцию трансплантата без иммунологического конфликта.
Установлено, что среди причин дисфункций, на фоне которых проводили дифференциальную диагностику с реакцией отторжения, на
первом месте стоял острый изолированный канальцсвый некроз - 4],9% (п=13). Вирусная инфекция была выявлена - 22,6 % (п=7). Лимфатическая киста явилось причиной дисфункции у 12,9% пациентов (п=4). К редким осложнениям, которые мы наблюдали, относились тромбоз почечной вены аплотрансплантата - 9,7% (п=3), г рибковая инфекция - 6,5% (п=2) и некроз мочеточника - 6,5 % (п=2).
В исследуемой группе оказалось 41,9% мужчин (п=13) и 58,1% женщин (п=18). Средний возраст мужчин составил 47,9±13,0 лет, женщин - 40,3±12,4 лет.
При подборе пары донор-реципиент несовпадение по системе тканевой гистосовместимости по 2 антигенам составило 3,2 % (п=1), по 3 - 42,9% (п=13), по 4 - 25,8% (п=8), по 5 - 29,0% (п=9). Трансплантацию донорского органа без учета тканевой совместимости не проводили.
Первичная функция трансплантата была выявлена в данной группе у 32,3 % (п=10), отсроченная функция - у 58,1 % (п=18), и в 9,8% (п=3) мы наблюдали отсутствие функции трансплантата вследствие хирургических осложнений - раннего тромбоза почечной вены трансплантата.
Результаты исследования морфометрических показателей Т- и В-лимфоцитов периферической крови у больных с дисфункцией почечного аплотрансплантата суммированы в таблице 4.
Анатиз полученных данных показал, что достоверное увеличение показателей диаметра, периметра, площади и объема, при снижении показателей высоты Т-лимфоцитов были зарегистрированы у больных с грибковой инфекцией. При этом процент активных Т-лимфоцитов оставатся на уровне 10,4±2,9%, что выше показателей Т-клеток у реципиентов с неосложнснным течением, но ниже, чем у пациентов с диагностированным иммунологическим конфликтом.
При вирусных осложнениях имелась тенденция к снижению всех показателей. Но процент активных Т-лимфоцитов на момент выявления вирусной инфекции не отличатся от такового в группе неосложненного
течения. У больных с тромбозом сосудов почечного аллотрансплантата в раннем послеоперационном периоде (диагноз подтвержден с помощью доплеровского исследования) мы наблюдали тенденцию к снижению средней в популяции высоты при отсутствии изменений остальных показателей. При этом ИАК составил 9,8±3,2%. Этот относительно высокий процент активных клеток, вероятнее всего, мы объясняли некрозом почечной ткани.
Таблица 4
Данные морфометрии Т-лимфоцитов в циркулирующей популяции клеток на момент выявление дисфункции аллотрансплантата
Причина дисфункции Э* р* Н* А* V* ИАК<0,2 %*
Нсосложн. течение 6,9±1,2 19,9±3,9 2,2±0,5 28,5±12,7 34,4±14,4 3,5±2,9
Лимфоцеле 6,1±1,2 17,2±3,5 2,1 ±0,4 22,3±9,0 21,2±8,7 2,9±2,1
тромбоз вены трансплантата 6,7±1,2 19,0±3,8 1,9±0,3 26,6±11,7 28Д±11,2 9,8±3,2
ЦМВ-инфекция 6,8±1,2 19,5±3,4 2,4±0,5 28,0±9,7 33,5±16,0 4,0±3,1
грибковая инфекция 8,2±1,3 23,8±4,0 2,1±0,4 38,7±12,7 38,7±16,8 10,4±2,9
ОКН 6,4±1,5 18,5±4,4 2,1 ±0,3 23,2±13,1 26,7±14,0 5,3±3,2
Морфометрические параметры В-лимфоцитов при выявлении лимфоцеле достоверно не отличались от аналогичных показателей В-клеток реципиентов нефротрансплантата с неосложненным течением послеоперационного периода (Табл.5). В то же время, величина ИАК составила 2,9±2,5%, что вдвое ниже, чем в группе сравнения.
Пациенты, потерявшие почечный трансплантат вследствие тромбоза почечных сосудов, имели наибольшие показатели активации В-клеточного звена. Так, мы отмечали увеличение морфометрических показателей диаметра, площади, периметра, при уменьшении высоты и объёма, а значения ИАК увеличивались до 14,3±4,6%.
У больных имевших вирусные осложнения активация В-клеточного звена была схожей с изменениями, зарегистрированными при грибковой инфекции. Однако обращало внимание резкое увеличение среднего объёма циркулирующих В-лимфоцитов. Значения ИЛК так же были сопоставимы с подобным показателем у пациентов с грибковыми инфекциями (17,1±3,6%)
Таблица 5
Данные морфометрии В-лимфоцитов в циркулирующей популяции клеток на момент выявление дисфункции аллотрансплантата
Причина дисфункции Э* р* Н* А* V* ИАК<0,2 %*
Неосложи. течение 8,6±1,9 24,9±6,1 2,1 ±0,5 42,8±24,8 49,0±24,4 6,Ш,5
Лимфоцеле 8,7±1,6 25,0±4,8 2,0±0,4 43,4±14,9 44,7±16,5 2,9±2,5
тромбоз вены трансплантата 9,5±2,0 26,8±5,9 1,8±0,4 50,9±20,7 44,5±23,5 14,3±4,6
ЦМВ-инфекция 8,8±1,0 24,7±3,1 2,3±0,6 41,7±1 .0 50,9±18,7 17,1±3,6
грибковая инфекция 8,9±1,8 26,0±5,4 2,0±0,6 46,9±18,0 42,3±21,4 18,3±5,1
ОКН 9,2±2,1 26,4±6,1 1,9±0,5 48,6±22,8 49,7±28,4 14,6±3,2
Реакция активации морфометрических показателей В-лимфоцитов при грибковой инфекции была невыраженной. При этом следует отметить, тенденцию к уменьшению среднего объёма В-клеток. ИАК составил 18,3±5,1%.
У реципиентов с отсроченной функцией нефротрансплантата, причиной которой стал острый канальцевый (тубулярный) некроз, выявлен высокий уровень активности В-звена иммунитета. Диаметр, периметр и объём клеток в циркулирующей популяции были достоверно выше, чем в группе сравнения, а величина средней фазовой высоты снижалась до 1,9±0,5 мкм. Процент активных клеток составил 14,6±3,2%, что несколько ниже, чем в подгруппах больных с вирусной и грибковой инфекцией, но значительно выше, чем у пациентов, не имевших осложнений в раннем послеоперационном периоде.
ВЫВОДЫ
1. У реципиентов почечного аллотрансплантата с неосложненным послеоперационным течением динамика морфометрических показателей циркулирующих Т-лимфоцитов остается в пределах нормативных значений практически здоровых людей, у В-лимфоцитов наблюдается снижение средних в популяции значений диаметра, площади и периметра при увеличение фазовой высоты.
2. Развитие иммунологического конфликта сопровождается активацией Т-клеточного звена (увеличением средних в популяции значений диаметра, периметра, площади и снижением фазовой высоты), достоверных изменений В-лимфоцитов не зарегистрировано; при эффективной противокризовой терапии все морфометрические параметры Т-лимфоцитов возвращаются к докризовым значениям.
3. При дисфункциях почечного трансплантата, не связанных с реакцией отторжения, отмечаются морфометрические признаки активации В-клеточного звена иммунитета, достоверных изменений Т-лимфоцитов не наблюдается. Исключение составляет хирургическое осложнение лимфоцеле, при котором оба звена иммунокомпетентных клеток резко угнетены.
4. В скрининговых исследованиях витальная компьютерная морфометрия иммунокомпетентных клеток может быть использована как метод, позволяющий определить вектор диагностического поиска причины дисфункции нефротрансплантата в раннем послеоперационном периоде.
5. Для ранней диагностики острой реакции отторжения почки при дисфункции трансплантата целесообразно использовать разработанный нами индекс активации клеток (0,2-0,3 для Т-клеток, 0,15-0,35 для В-клеток); уменьшение величины индекса в циркулирующей популяции свидетельствует о повышении функциональной активации лимфоцитов, а увеличение — об угнетении.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. У реципиентов почечного трансплантата целесообразно применение компьютерной фазовой морфометрии в раннем послеоперационном периоде в качестве скринингового метода при мониторинге состояния иммунной системы.
2. Выявление морфометрических признаков активации Т-клеточного звена иммунитета диктует необходимость проведения комплекса лабораторпо-инструментальных обследований для исключения иммунологического конфликта.
3. Динамика морфометрических параметров иммунокомпетентных клеток при лечении острой реакции отторжения может служить показателем эффективности противокризовой терапии.
4. При наличии дисфункции нефротрансплантата и отсутствии морфометрических признаков активации иммунокомпетентных клеток необходимо исключить причину нарушения уродинамики.
5. При наличии дисфункции нефротрансплантата и выявлении морфометрических показателей активации В-клеточного звена иммунитета следует направить диагностический поиск на выявления инфекционных и сосудистых осложнений.
6. Изменение морфометрических показателей иммунокомпетентных клеток и в отсутствии данных за хирургическую, иммунную и инфекционную патологию, необходимо выполнение биопсийного исследования для конечной дифференциальной диагностики острого канальцевого некроза и возможной патологией трансплантата.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Морфометрические параметры иммунокомпетентных клеток как критерии ранней диагностики отторжения ренального трансплантата // Тезисы докладов научно-практической конференции «Актуальные
вопросы современной клинической медицины». - Пенза. - 2006.
- С.58. (Ватазин A.B., Василенко ИЛ., Валов AJI., Астахов П.В., Метелин В.Б., Геращенко М.А., Степанов В.А., Цалман АЛ.)
2. Информативность общепринятых методов диагностики острого отторжения почечного трансплантата на доклинической стадии // Материалы научно-практической конференции «Клиническая трансплантация органов (актуальные вопросы). - Москва. - 2007. -С.116-117. (Арзуманов C.B., Степанов В.А.)
3. Компьютерная фазово-интерференционная микроскопия лимфоцитов периферической крови в диагностике острого отторжения ренального трансплантата // Материалы научно-практической конференции «Клиническая трансплантация органов (актуальные вопросы).
- Москва. - 2007. - С.126-127 (Ватазин A.B., Василенко И.А., Метелин В.Б., Арзуманов C.B., Степанов В.А.)
4. Морфометрия иммунокомпетентных клеток в экспресс-диагностике иммунологического конфликта у реципиентов почечного аллотрансплантата // Материалы научно-практической конференции «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - Москва. 15 мая 2008г. - С.61-63. (Степанов В.А., Арзуманов C.B., Валов A.JL, Ватазин А.В, Василенко И.А.)
5. Иммунобиологические маркеры в диагностике отторжения трансплантированной почки (Обзор литературы) // Иммунология.
- 2008. - №1. - С.52-55 (Арзуманов C.B., Синютин А.А, Степанов В.А.)
ИЗОБРЕТЕНИЯ И ПАТЕНТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата. (Василенко И.А., Ватазин A.B., Валов АЛ., Метелин В.Б., Степанов В.А.) Положительное решение о выдаче Патента РФ № 2007147991 от 03.09.2008г.
Подписано в печать:
20.01.2009
Заказ № 1602 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Оглавление диссертации Степанов, Вадим Анатольевич :: 2009 :: Москва
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ПРИЧИНЫ И ДИАГНОСТИКА ДИСФУНКЦИЙ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА (литературный обзор).
1.1. Патогенез иммунологического конфликта.
1.2. Не иммунологические причины ранних дисфункций.
1.3. Мониторинг функции трансплантата.
1.4. Методы лечения криза отторжения.
1.5. Интерференционные методы измерений фазовых микрообъектов.
ГЛАВА 2. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Клиническая характеристика больных.
2.2. Выделение иммунокомпетентных клеток.
2.3. Разделение мононуклеаров по степени адгезивности к пластику.
2.4. Метод витальной компьютерной морфометрии клеток.
2.5. Методы статистической обработки результатов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ КОМПЬЮТЕРНОЙ МОРФОМЕТРИИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК У РЕЦИПИЕНТОВ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА С НЕОСЛОЖНЕННЫМ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫМ ТЕЧЕНИЕМ.
3.1. Витальная морфометрия Т-лимфоцитов периферической крови реципиентов почечного аллотрансплантата.
3.2. Витальная морфометрия В-лимфоцитов периферической крови реципиентов почечного аллотрансплантата.
3.3. Разработка индекса клеточной активации для оценки морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток
ГЛАВА 4. РОЛЬ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ДИСФУНКЦИЙ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА.
4.1. Витальная компьютерная морфометрия иммунокомпетентных клеток у реципиентов почечного аллотрансплантата с острой реакцией отторжения.
4.2. Витальная морфометрия иммунокомпетентных клеток крови у пациентов после эффективной терапии острой реакции отторжения.
4.3. Результаты морфометрии у больных после пересадки почки с дисфункцией аллотрансплантата без иммунологического конфликта:.
Введение диссертации по теме "Хирургия", Степанов, Вадим Анатольевич, автореферат
Актуальность проблемы. Трансплантация почки на сегодняшний день является методом выбора в лечении больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточностью (ТХПН), который позволяет заметно улучшить качество жизни, способствует более полной социальной реабилитации этой категории больных. Одним из главных факторов, вызывающих гибель функционирующей почечной ткани у реципиента после трансплантации, является острое отторжение. Количество и тяжесть перенесенных острых реакций отторжения напрямую имеет корреляцию с потерей массы действующих нефронов и длительностью выживания трансплантата [51].
Оптимизация схем иммуносупрессии может существенно снизить риск развития осложнений [5; 54; 70]. Однако острое отторжение остаётся серьезной проблемой в трансплантации [158].
Под отторжением понимают воспалительное поражение трансплантата, вызванное специфической реакцией иммунной системы реципиента на трансплантационные антигены донора [40,144].
В реакцию взаимодействия между иммунной системой реципиента и антигенами донорского почечного аллотрансплантата вовлечены практически все механизмы клеточного и гуморального ответа. Взаимодействие антигенспецифического рецептора Т-клеток и аллогенных НЬА-антигенов является центральным событием данной реакции.
Главное проявление иммунологического конфликта - ухудшение выделительной функции донорского органа или отсутствие восстановления ее. Но, на функцию трансплантата и его сроки восстановления в раннем послеоперационном периоде могут оказывать влияние неиммунные факторы, такие как цитомегаловирусная и раневая инфекция, лимфатическая киста, тромбоз сосудов трансплантата, мочевой затек, токсичность лекарственных средств и другие.
Выяснение причин дисфункции служит основой для назначения эффективной терапии.
Диагностику острой реакции отторжения проводят на основе клинических и инструментальных исследований и лабораторно-иммунологических показателей. При этом пункционная биопсия остаётся «золотым стандартом» оценки патологических состояний нефротрансплантата. Хотя известно, что пункционная биопсия может привести к развитию целого ряда осложнений: гематома, инфаркт почки, уринома и др. [173].
В настоящий момент иммунологические методы исследования рассматривают как наиболее информативные и безопасные для диагностики криза отторжения. Приоритет отводят методам, обеспечивающим минимальную инвазивность и оперативность исследований, которые проводят с помощью новейших оптических компьютерных лазерных систем [1,2].
Василенко И.А. и соавт., внедрили метод компьютерной лазерной фазоморфометрии для прижизненной оценки морфофункционального состояния клеток периферической крови, в том числе и иммунекомпетентных клеток [39].
Первые результаты исследования компьютерной морфометрии иммунокомпетентных клеток для оценки иммунного статуса реципиентов почечного трансплантата оказались весьма обнадеживающими [30]. Вместе с тем до настоящего времени проблема дифференциальной диагностики причин дисфункции нефротрансплантата остается актуальной и требует продолжения исследований в данном направлении, что явилось основанием для выполнения настоящей работы.
Цель исследования. Разработка морфометрических критериев функциональной активности иммунокомпетентных клеток в дифференциальной диагностике дисфункции почечного трансплантата в раннем послеоперационном периоде.
Задачи исследования:
1. выявить особенности морфометрических изменений Т- и В-лимфоцитов в раннем послеоперационном периоде у реципиентов почечного трансплантата с неосложненным послеоперационном течением;
2. оценить характер изменений морфометрических параметров Т- и В-лимфоцитов при развитии иммунологического конфликта и при оценке эффективности противокризовой терапии;
3. изучить морфометрические изменения иммунокомпетентных клеток в раннем послеоперационном периоде при развитии дисфункции почечного трансплантата не иммунного характера;
4. оценить возможность фазовой компьютерной морфометрии в дифференциальной диагностике дисфункции почечного трансплантата;
5. на основе комплексной суммарной оценки морфометрических параметров иммунокомпетентных клеток разработать прогностически значимый критерий (индекс активации клеток) ранней диагностики острой реакции отторжения почки при дисфункции трансплантата.
Научная новизна. Дана детальная оценка оптико-морфологических изменений популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток у больных с почечным трансплантатом в раннем послеоперационном периоде с неосложненным течением.
Выявлены особенности морфометрических изменений Т- и В-лимфоцитов у пациентов почечного трансплантата при развитии реакции отторжения и при его лечении.
Определены морфометрические изменения иммунокомпетентных клеток в условиях развития неимунных дисфункций трансплантата.
Произведена оценка возможности компьютерной морфометрйи Т- и В-лимфоцитов в дифференциальной диагностике причин дисфункций почечного трансплантата.
Разработан индекс активации клеток (ИАК) для математической оценки состояния реактивности субпопуляции лимфоцитов (положительное решение о выдаче Патента РФ «Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата» № 2007147991 от 03.09.2008г).
Выявлены различия морфометрических изменений иммунокомпетентных клеток, в зависимости от причин дисфункции, а так же при развитии и инволюции реакции отторжения.
Практическая значимость. Компьютерная фазовая прижизненная морфометрия иммунокомпетентных клеток позволила выявить динамику морфометрических изменений иммунокомпетентных клеток у пациентов с не осложненным послеоперационным периодом.
Фазовая компьютерная морфометрия в короткие сроки и объективно позволила оценивать особенности популяционного состава иммунокомпетентных клеток, определять уровень их функциональной активности. С помощью данного метода появилась практическая возможность проводить диагностику иммунологического конфликта и мониторинг противокризовой терапии. I
На основе данной методики стало возможным проведение дифференциальной диагностики причин ранних дисфункций почечного трансплантата.
Практическим результатом выполненной работы явилась разработка индекса активации клеток (ИАК) субпопуляций лимфоцитов для дифференциальной диагностики острой реакции отторжения при дисфункции нефротрансплантата. Это позволило на доклинической стадии распознавать начало острой реакции отторжения, и тем самым, уменьшить частоту потерь пересаженных органов в раннем послеоперационном периоде и улучшить отдаленные результаты трансплантации.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Индекс активации клеток, рассчитанный на основе динамики их морфометрических параметров, характеризует уровень функциональной перестройки ядерных структур лимфоцитов периферической крови и может рассматриваться в качестве критерия ранней диагностики иммунологического конфликта и эффективности антикризовой терапии.
2. Проведение КФМ с применением ИАК позволяет оперативно и своевременно выявлять причину дисфункции ренального трансплантата: дифференцировать иммунологический конфликт, хирургические и инфекционные осложнения.
Внедрение в практику. Основные положения и материалы диссертации внедрены в клиническую практику отделения гемодиализа с пересадкой почки ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Получено положительное решение о выдаче Патента РФ «Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата» № 2007147991 от 03.09.2008г.
Апробация работы. Основные материалы и положения работы доложены и обсуждены на 24-й научно-практической конференции «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 2005г.; 25-й научно-практической конференции «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 2006г; научно-практической конференции «Клиническая трансплантация органов (Актуальные вопросы)» Москва, 2007г; I научно-практической конференции «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 2008г; на совместной научно-практической конференции отдела оперативной нефрологии и хирургической гемокоррекции МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского и кафедры Эфферентной медицины, клинической и оперативной нефрологии ФУВ МОНИКИ, Москва, 2008г.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 54 отечественных и 160 зарубежных источника.
Заключение диссертационного исследования на тему "Компьютерная морфометрия иммунокомпетентных клеток в дифференциальной диагностике дисфункций почечного трансплантата"
выводы
1. У реципиентов почечного аллотрансплантата с неосложненным послеоперационным течением динамика морфометрических показателей циркулирующих Т-лимфоцитов остается в пределах нормативных значений практически здоровых людей, у В-лимфоцитов наблюдается снижение средних в популяции значений диаметра, площади и периметра при увеличение фазовой высоты.
2. Развитие иммунологического конфликта сопровождается активацией Т-клеточного звена (увеличением средних в популяции значений диаметра, периметра, площади и снижением фазовой высоты), достоверных изменений В-лимфоцитов не зарегистрировано; при эффективной противокризовой терапии все морфометрические параметры Т-лимфоцитов возвращаются к докризовым значениям.
3. При дисфункциях почечного трансплантата, не связанных с реакцией отторжения, отмечаются морфометрические признаки активации В-клеточного звена иммунитета, достоверных изменений Т-лимфоцитов не наблюдается. Исключение составляет хирургическое осложнение лимфоцеле, при котором оба звена иммунокомпетентных клеток резко угнетены.
4. В скрининговых исследованиях витальная компьютерная морфометрия иммунокомпетентных клеток может быть использована как метод, позволяющий определить вектор диагностического поиска причины дисфункции нефротрансплантата в раннем послеоперационном периоде.
5. Для ранней диагностики острой реакции отторжения почки при дисфункции трансплантата целесообразно использовать разработанный нами индекс активации клеток (0,2-0,3 для Т-клеток, 0,15-0,35 для В-клеток); уменьшение величины индекса в циркулирующей популяции свидетельствует о повышении функциональной активности лимфоцитов, а увеличение - об угнетении.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. У реципиентов почечного трансплантата целесообразно применение компьютерной фазовой морфометрии в раннем послеоперационном периоде в качестве скринингового метода при мониторинге состояния иммунной системы.
2. Выявление морфометрических признаков активации Т-клеточного звена иммунитета диктует необходимость проведения комплекса лабораторно-инструментальных обследований для исключения иммунологического конфликта.
3. Динамика морфометрических параметров иммунокомпетентных клеток при лечении острой реакции отторжения может служить показателем эффективности противокризовой терапии.
4. При наличии дисфункции нефротрансплантата и отсутствии морфометрических признаков активации иммунокомпетентных клеток необходимо исключить причину нарушения уродинамики.
5. При наличии дисфункции нефротрансплантата и выявлении морфометрических показателей активации В-клеточного звена иммунитета следует направить диагностический поиск на выявления инфекционных и сосудистых осложнений.
6. Изменение морфометрических показателей имуунокомпетентных клеток и в отсутствии данных за хирургическую, иммунную и инфекционную патологию, необходимо выполнение биопсийного исследования для конечной дифференциальной диагностики острого канальцевого некроза и возможной патологией трансплантата.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Степанов, Вадим Анатольевич
1. Автандилов Г.Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии / Г.Г. Автандилов М.: РАМПО. -1996.-256 с.
2. Александров М.Т. Лазерная клиническая биофотометрия (теория, эксперимент, практика) / М.Т. Александров — М.: Техносфера 2008. -584с.
3. Арзуманов C.B. Диагностика острой реакции отторжения почечного трансплантата на фоне отсутствия начальной функции: Автореф.дис. .канд.мед.наук / C.B. Арзуманов М. - 2005. - 25с.
4. Артемов Д.В. Исследование электрофоретической подвижности нейтрофилов методом знакопеременного микроэлектрофореза / Артемов Д.В., Метелин В.Б. // «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты. М., РИАЛТЕКС: 2008. С.25-26
5. Астахов П.В. Комплексное лечение хирургических заболеваний у больных терминальной стадией хронической почечной недостаточности до и после аллотрансплантации почки: Дисс. д-ра мед. наук / П.В. Астахов, М. 2001.
6. Белорусов О.С. Достижения и перспективы в проблеме пересадки почки. / О.С. Белорусов // Клиническая медицина. 1992. - С.4-12.
7. Белорусов О.С. Причины потерь аллогенных почек в раннем посттрансплантационном периоде / О.С. Белорусов, В.А. Горяйнов, A.A. Синютин // Трансплантология и искусственные органы. 1998. - №3. — С.27-29.
8. Белорусов О.С. Успехи и перспективы трансплантации почки. / О.С. Белорусов, В.А. Горяйнов // Хирургия. 1986. - № 6. - С. 18-20.
9. Введение в клиническую трансплантологию / Труды научного центра хирургии РАМП / Под ред. Константинова Б.А., Дземешкевича C.JL // Москва. 1993.-391с.
10. Вест Ч. Голографическая интерферометрия / Вест Ч. М.: Мир. — 1982. — 504с.
11. Витальная компьютерная морфометрия клеток крови в решении клинико-диагностических задач. / Кардашова 3.3., Власова Е.А., Кастрикина И.С., Лысенко М.А., Модина М.А. // Вестник последипломного медицинского образования. — 2008. № 3-4. - С.75-77
12. Влияние различных факторов на функцию ренального трансплантата в раннем послеоперационном периоде / С.А. Пасов, A.B. Ватазин, П.В. Астахов и др.* // Нефрология и диализ. 1994. - №4. - С. 19-21.
13. Галактионов В.Г. Иммунология / В.Г. Галактионов М.: «РИЦ МДК». -2000.-'488с.: ил.
14. Горяйнов В.Н. Функция трансплантированной, почки в раннем послеоперационном периоде: Автореф.дис.канд.мед.наук./ Горяйнов1. B.Н.-М.- 1971.- 22с.I
15. Двумерная реконструкция карты двулучепреломления саркомера скелетной мышцы в релаксированном и ригорном состояниях по данным интерференционной микроскопии / Л.К. Сребницкая, Г.Н. Вишняков,
16. C.А. Нейман и др. // Биофизика. 2001. - Т.46. - Вып. 3. - С.518-523.
17. Демихов В.П. Пересадка жизненноважных органов в эксперименте. / В.П. Демихов. М.: Медгиз. - 1960. - С.12-26.
18. Захарьевский А.Н. Интерференционные биологические микроскопы / А.Н. Захарьевский, А.Ф. Кузнецова // Цитология. 1961. - Т.З. - №2. -С.213-224.
19. Иванов А.Е. Анализ причин неудачных исходов пересадки аллогенной трупной почки человеку. / А.Е. Иванов // Сов. Медицина. 1987. - №3. -С.86-92.
20. Измерение субмикронных структур на лазерном фазовом микроскопе «Эйрискан» / В.П. Тычинский, Г.Э. Куфаль, Т.В. Вышенская и др. // Квантовая электроника. Т.24. - №8. - С.754-758.
21. Ильинский И.М. Патология почечных аллотрансплантатов. / И.М. Ильинский, Р.Л. Розенталь Рига: Звайнгзне. - 1990. - 151с.: ил.
22. Исследование активации лимфоцитов методом когерентной фазовой микроскопии./ Игнатьев П.С., Тычинский В.П., Вышенская Т.В., Метелин В.Б., Василенко И.А. // Альманах клинической медицины.-2008. Т.ХУП (Часть 2). - С.65-67.
23. Каабак М.М. Послеоперационное лечение реперфузионного повреждения трансплантированной почки: новый взгляд на патогенез реперфузионной травмы: Автореф. дис. . д-ра. мед. наук / М.М Кабак. -М., 2003. 35с.
24. Кабак М.М. Трансплантация почки. // «Клиническая трансплантология» / М.М. Каабак., В.А. Горяйнов; под редакцией Б.А. Константинова. М. — 2004. - 174с.
25. Компьютерная морфометрия тромбоцитов в оценке показателей гемостаза потенциальных доноров почки. / И.В. Нестеренко, А.В
26. Ватазин, Л.Л. Валов и др. // Вестник трансплантологии и искусственных, органов. 2008. -№3 (41). С.19-23.
27. Компьютерная фазово-интерференционная микроскопия в биологии и ' медицине / В.Б. Метел ин, В.Л. Минаев; АЛ. Валов? и др. // Сборникнаучных трудов. Красноярск. -2003. - С.34-35.
28. Левин F.F. Когерентные осцилляции;состояния-молекул белка в живых; клетках / F.F. Левин, Ф.В. Булыгин, F.H: Вишняков // Цитология: .- 2005: Т.47. - №4. - С.348-356.
29. Лопаткин Н.А.Реакцияотторжениятрансплантированнощпочки. / I LA Лопаткин.// Урология и нефрология. — 1972. — №1. — С.13—22.
30. МетелинйВШ.ГГрижизненнаяшорфофункциональнаяюценка^лимфоцитов! человека при различных иммунодефицитных состояниях: Дисс. . .Канд. Биол наук / В.Б. Метелин М., 2005. - 106с. , :.
31. Микроскопы. / F.E. Скворцов, В:А. Панов, Н.И.Поляков, Л.А. Федин; Под ред: Н1И; Полякова■- Ленинград: Машиностроение,; 1969г.- 512с:> ;
32. Мойсюк Я.Г. Мультиорганное донорство в клинической трансплантологии: Автореф. дис;. д-ра. мед: наук / Мойсюк Я.Г. Mi -1991.-36с. . •
33. Онищенко H.A. Гипотермическая консервация паренхиматозных органов: / Н.А.Онищенко, И.Д. Кирпатовский // Итоги науки и техники: Общие проблемы биологии. ВИНИТИ. - 1987. - Т 8; - С.54.
34. Эль-Зейн // Сб. «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты. М., РИАЛТЕКС: 2008. С.66-67
35. Оценка точности измерения сухой массы клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе / Г.Г. Левин, A.A. Ковалев, В.Л. Минаев, К.А. Сухоруков // Измерительная техника. 2004. - С.62-67.
36. Петровский Б.В. Пересадка почки в клинике. / Б.В. Петровский, В.И. Шумаков // Актуальные проблемы трансплантологии и искусственных органов. М.: Медицина. - 1975. - С.9-17.
37. Платова Е. Н. Диагностика ранних признаков криза отторжения трансплантированных почек в ближайшем послеоперационном, периоде с помощью дуплексной сонографии: автореф. дис . кан. мед. наук, / Платова Е. Н. М. - 1994. - 25с.
38. Прижизненная компьютерная динамическая фазометрия клеток крови человека в норме и патологии / И.А. Василенко, В.П. Тычинский, A.A. Конрадов и др. // Тез. докл. науч.прак. конф.: «Лабораторная диагностика 2002». - Москва. - 2002. - с.317-318.
39. Рабсон. А. //Основы медицинской иммунологии: Пер. с англ. / А. Рабсон., А. Ройт, П. Делвз М.: Мир, 2006г. - 320с.: ил.
40. Рациональная фармакотерапия в нефрологии: руководство для практикующих врачей/ Мухин Н.А, Козловская Л.В., Шилов Е.М. и др.; Под ред. Мухина H.A., Козловской Л.В., Шилова Е.М. — М.: Литература. -2006.-896с.
41. Регистр лекарственных средств России РЛС Доктор 2008.: Выпуск 11. Общая врачебная практика. / Под редакцией Г.Л. Вышковского Изд-во: РЛС.-2008- 1088стр.
42. Ржевская О.Н. Комплексный подход к ведению больных группы высокого риска в ранние сроки после пересадки почки.: Автореф. дис . д-ра. мед. наук. / О.Н.Ржевская. М, 2003. - 30с.
43. Ройт А. Иммунология: Пер. с англ. / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл -М. Мир, 2000. - 592с.: ил.
44. Сандриков В.А. Клиническая физиология трансплантированной почки. /
45. B. А. Сандриков, В.И. Садовников М.: МАИК «Наука/ Интерпериодикп». - 2001. - 288с.: ил. - С.182-216
46. Синдром отторжения при трансплантации почки / В.И. Шумаков, Э.Р. Левицкий, Н.Ф. Порядин, Л.П. Алексеев; Под ред. В.И. Шумакова. -М.: Медицина. -1982. 270с.
47. Сравнительная оценка различных способов инициальной гипотермической перфузии донорских почек / В.И. Шумаков, Я.Г. Майсюк, Н.В. Тарабарко, А.Г. Долбин // Хирургия. 1990. - N6.1. C.91-97.
48. Трансплантация почки / В.И. Шумаков, Я.Г. Мойсюк, H.A. Томилина и др.; под редакцией В.И. Шумакова // Трансплантология. — М.: Медицина; Тула: Репроникс Лтд. 1995. - С. 194-196.
49. Тычинский В.П. Когерентная фазовая микроскопия внутриклеточных процессов / В.П. Тычинский // Успехи физических наук. 2001. - Т. 171. - №6. - С.649-662.
50. Тычинский В.П. Компьютерный фазовый микроскоп / В.П. Тычинский. -М.: Знание. 1989.-64с.
51. Факторы риска поздней дисфункции трансплантированной почки / Томилина H.A., Столяревич Е.С., Баранова Ф.С. и др. // Нефрология и диализ. 2003. - №5(1). - С.70-75.
52. Шумаков В.И. Диагностика и лечение кризов отторжения после трансплантации почки (методические рекомендации) / В.И. Шумаков -Москва. 1985.-С. 1-19.
53. Шумаков В.И. Консервация органов / В.И. Шумаков, Е.Ш. Штенгальд, H.A. Онищенко. -М.: Медицина. 1975. - 18с.:ил.
54. Шумаков В.И. Трансплантация почки в России / В.И. Шумаков, Я.Г. Майсюк, И.А. Томилина // Трансплантация и искусственные органы. — 1994. С.35-38.
55. A randomized, double-blinded comparison of Thymoglobulin versus Atgam for induction immunosuppressive therapy in adult renal transplant recipients / Brennan DC, Flavin K, Lowell JA, et al. // Transplantation. 1999 Apr 15. -Vol.67(7). -P.1011-8.
56. A review of sonographic evaluation of renal transplant complications / Irshad A, Ackerman S, Sosnouski D, et al. // Probl Diagn Radiol. 2008. -Vol.37(2). - P.67-79.
57. Agha I. BK virus and immunosuppressive agents / Agha I, Brennan D. //Adv Exp Med Biol. 2006. - Vol.577. - P. 174-184.
58. Analysis of the arterial blood flow patterns of normal and allografted-kidney by the direc-tional ultrasonic Doppler technique / Arima M., Ishibashi M., UsamitM., Sagava S. // J. Urol. 1979. -№ 122. - P.587-591.
59. Anti-CD4 Mo Ab therapy in kidney transplantation: a pilot study in early prophylaxis of rejection / Dantal J, Ninen E, Hourmant M, et ah // Transplantation. 1996. - Vol.62. - P. 1502-6.
60. Are wound complications after a kidney transplant more common with modern immunosuppression? / Humar A, Ramcharan T, Denny R, et al. // Transplantation. -2001. Vol.72( 12). - P. 1920-3.
61. Barer R. Refractometry of living cells. Basic principles / Barer R., Joseph S. // Quart. J. Microscop. Sei. 1954. - №95. - P. 399-423.
62. Bartrum R. Evaluation of renal transplants with ultrasound / Bartrum R., Smith E. // Radiolodgy. 1976. - №118. - P.405.
63. Becker YT. Rituximab as treatment for refractory kidney transplant rejection / Becker YT, Becker BN, Pirsch JD. // Am J Transplant. 2004. - №4. P.996-1001.
64. Blane C. Doppler ultrasonography in the early postoperative evaluation of renal transplants in children / Becker YT, Becker BN, Pirsch JD. // Can. Assoc Radiol. 1993.-№44. P. 176-178.
65. Bock H. Steroid-Resistant Kidney Transplant Rejection: Diagnosis and Treatment / Bock H., Andreas A. // Journal of the American Society of Nephrology. -2001. Volume 12. - Suppl.17. - P.48-52.
66. Cadaveric kidney transplantation under prophylactic polyclonal antibody immunosuppression with anti-lymphoblast globulin versus anti-thymocyte globulin / Indudhara R, Novick AC, Hodge E, et al. // Urology. 1996. -Vol.47(6). - P.807-12.
67. Campath 1H allows low-dose cyclosporine monotherapy-in 31 cadaveric renal allograft recipients / Calne R, Moffatt SD, Friend PJ, et al. // Transplantation. 1999.-Vol. 68.-P.1613-6.
68. Campath 1H induction plus rapamycin monotherapy for renal transplantation: results of a pilot study / Knechtle SJ, Pirsch JD, H Fechner J Jr, et al. // Am-J Transplant. 2003. - Vol.3. - P.722-30.
69. Can immune monitoring help to minimize immunosuppression in kidney transplantation? / Ashton-Chess J., Giral M., Soulillou J., Brouard S. // Transplant International. 2009. - Vol.22 (1). - P. 110-119.
70. Cattaneo D. Pharmacogenetics of immunosuppressants: progress, pitfalls and promises / Cattaneo D, Baldelli S, Perico N. // Am J Transplant. 2008. -Vol.8*. - P. 1374.
71. Chapman JR. Introduction: targets for improving outcomes in renal allografts transplanted during the next ten years / Chapman JR. // Transplantation. -2008:-Vol. 85.-p.211
72. Clinical application of the kidney to aortic blood flow index (K/A ratio); / Kirchner P.T., Goldman M.H., Leapman S.B., Kiepfer R.F. // Contribution to Nephrology. 1978.-Vol.1.-P. 120-6.
73. Colvin Ri.B- Chronic allograft nephropathy / ColvinR.B; //N. Engl; JLMëdl-2003. Vol. 349(24). P.2288-2290.
74. Creath K. Phase-shifting speckle interferometry / Creath K. //Applied;optics.- 1985. Vol. 24 (18). - P. 3053-3058.
75. Danovitch G.M. 2001. - P. 163-313. 79: Davis; C.L. ThromboelastograpHy for the prediction of bleeding after transplant renal'biopsy / Davis C.E.,;Chandlèr:W.L. // J; Am; Soc. Nephrol! -1995.-Vol.6.-P. 1250.
76. Deconvolution analysis of renal blood flow: evaluation of postrenal transplant complications / Chaiwatanarat T., Laorpatanaskul S., Poshyachinda M., et al. // J. Nucl. Med. 1994. - Vol. 35(11). - P.792-796.
77. Delayed graft function influences renal function, but not survival / Boom H, Mallat MJ, de Fijter JW, et al. // Kidney Int. 2000 Aug. - Vol.58. - Suppl: 2.- P.859-66 ' :
78. Denton M. Immunosuppressive strategies, in transplantation / Denton M, Magee C, Sayegh MM Lancet. 1999. - Vol.53. - P! 1083-91. : . .
79. Dharnidharka V. Risk for post-transplant lymphoproliferative disorder after polyclonal antibody induction; in kidney transplantation / Dharnidharka V., Stevens G. // Pediatr Transplant. 2005 Oct. - Vol.9(5). - P.622-6.
80. Differentiation of cytomegalovirus infection from acute rejection using renal allograft fine needle aspirates / Nast C.C., Wilkinson A., Rosenthal T. et al. // J.Am. Soc. Nephrol. 1991.-Vol.1.-P. 1204.
81. Distribution of cell adhesion molecules (ICAM1, VCAM1, ELAM1) in renal tissue during allograft rejection / Brockmeyer C, Ulbrecht M, Schendel DJ, et al. // Transplantation. 1993. - Vol.55. - P.610-5.
82. Dubovsky E.V. Report of the Radionuclides in Nephrourology Committee for evaluation of transplanted kidney (review of techniques) / Dubovsky E.V. // Semin. Nucl. 1999. - Vol.29(2). - P. 175-88.
83. Dunn G. A. Transmitted-light interference microscopy: a technique born before its time / Dunn G. A. // Proceedings of the Royal Microscopical Society. 1998. - Vol.33. - P.189-196.
84. Dynamic renal transplant imaging with Tc-99m DTP A (Sn) supplemented by a transplant perfusion index in the management of renal transplants / Hilson A.J., Maisey M.N., Brown C.B., et al. // Journal of Nuclear Medicine. 1978. - Vol.l9(9). - P.994-1000.
85. Early and late urological complications corrected surgically following renal transplantation / Dinckan A, Tekin A, Turkyilmaz S, et al. // Transpl Int. -2007. Vol.20(8). - P.702-7.
86. El-Maghraby T.A. Renographic indices for evaluation of changes in graft function / El-Maghraby T.A. // Eur J Nucl Med. 1998. - №25(11). -P.1575-86.
87. Evaluation of fine-needle aspiration biopsy in the diagnosis of renal transplant dysfunction / Danovitch G.M., Nast C.C., Wilkinson A., Rosenthal T. // Am. J. Kidney Dis.- 1991.-Vol. 17(3).-P.362.
88. Evaluation of the pathologic cri-teria for acute renal allograft rejection: reproducibility, sensitivity and clinical correlation / Colvin R.B., Cohen A., Sianoz C., et al. // J. Am. Soc. Nephrol. 1997. - Vol.8. - P. 1930.
89. Five preventable causes of kidney graft loss in the 1990s: a single-center analysis / Matas AJ, Humar A, Gillingham KJ, et al. // Kidney Int. 2002. -Vol.62(2). — P.704-14.
90. For The Daclizumab Double Therapy Study Group: Reduction of acute renal allograft rejection by daclizumab / Nashan B, Light S, Hardie IR, et al. // Transplantation. 1999. - Vol.67. - P. 110-5.
91. Frauchiger B. The value of different resistence parameters in distinguishing biopsy-proved dysfunction of renal allografts / Frauchiger В., Bock A., Eichlisberger R. // Nephrology, Dialysis, Transplantation. 1995. - Vol.10 (4). — P.527-532.
92. Garin E. Contribution of 99Tcm-DMSA scintigraphy to aetiological diagnosis in renal transplant recipients with impaired renal function / Garin E. // Nucl Med Commun. 2000. - Vol.21(1). -P.77-81.
93. Griffin J. Morphological appearance of renal allografts in transplant failure / Griffin J., McNicholas M. // JCU-J-Clin. Ultrasound. 1992. - Vol.20 (8). -P.529-537.
94. High resolution ultrasound characterization of early allograft hemodynamics in pediatric living related renal transplantation / Herz DB, McLorie GA, Hafez AT, et al. // J Urol. 2001. - Vol. 166(5). - P.l853-8.
95. Holger Pettersson. Общее руководство по радиологии / Holger Pettersson // Nicer. 1995.-том 1.- C.72-84,136-139.
96. Hricak H. Renal allografts: evaluation by MR imaging / Hricak H., Terrier F., Demas B.E. // Radiology. 1986 May. - №159(2). P.435-41.
97. Hricak H. Sonographic manifestation of acute renal vein thrombosis: an experimental study / Hricak H., Sandier M., Mandrazo B. // Invest. Radiology. 1981.-№16.-P.30-35.
98. Hypothesis: Is renal allgraft rejection initiated by the response to injury sustained during the transplant process? / Lu C.Y., Penfield J.G., Kielar M.L., et al. // Kidney International. 1999. - Vol.6 (55). - P.2157-2168.
99. Immunohistochemical manifestations of unilateral kidney ischemia / Hutchinson I, Jacobs F., Zukin Y., et al. // Clin Transplant. 1999: - Vol.10. -№6(2).- P.646-652.
100. Immunoprophylaxis with basiliximab compared with antithymocyte globulin in renal transplant patients receiving MMF- containing triple therapy / Lebranchu Y, Bridoux F, Büchler M, et al. // Am J Transplant. 2002. -Vol.2.-P.48-56.
101. Immunosuppressive drug-free operational immune tolerance in human kidney transplant recipients / Part 1. Blood gene expression statistical analysis / Braud C, Baeten D, Giral M; et al1. // J Cell Biochem. 2008. - Vol.103. -P.1681.
102. In vivo effects of monoclonal antibody to ICAM-1 (CD54) in nonhuman primates with renal allografts / Cosimi AB, Conti D, Delmonico FL, et al. // J Immunol. 1990. - Vol.44. - P.4604-12.
103. Increased impact of acute rejection on chronic allograft failure in recent era / Meier-Kriesche H.U., Ojo A.O., Hanson J.A. et. al. //Transplantation. 2000. -Vol.70.-P.1098-1100
104. Indudhara R. Posttransplant lymphocele presenting as 'acute abdomen' / Indudhara R, Menon M, Khauli R. // Am J Nephrol. 1994. -Vol. 14(2). -P. 154-6.
105. Jones T., Shirasugi N.,Adams A. et al. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts //Journal Clin. Invest. -2003. -№112. — P.1714 1723.
106. Kidney transplant rejection^and tissue injury by gene profiling of biopsies and peripheral blood lymphocytes / Flechner SM, Kurian SM, Head >SR, et al. // Am J Transplant. 2004. - Vol.4. - P1475.
107. Kidney transplantation without calcineurin inhibitor drugs: a> prospective, randomised trial of sirolimus versus cyclosporine / El-Husseini AA, Foda MA, Bakr MA, et al. // Transplantation: 2002. - Vol.74. - P. 1070-6.
108. Koike J. Clinical and pathological assessment of acute vascular rejection in the transplant kidney. // Clin. Transplant. 2001. - Vol.15. - Suppl 5. - P.41-44.
109. Kuypers D.R. Predictors of renal transplant histology at three months / Kuypers D.R. // Transplantation. 1999. - Vol.67(9). - P. 1222-1230.
110. Kuypers DR. Monoclonal antibodies in renal transplantation: old and new / Kuypers DR, Vanrenterghem YF. // Nephrol Dial Transplant. — 2004. -Vol.19. -P.297-300.
111. Laparoscopic drainage of lymphocele after kidney transplant / Garay JM, Alberu J, Angulo-Suarez M, et al. // J Laparoendosc Adv Surg Tech A. — 2003.-Vol. 13(2).-P. 127-9.
112. Laparoscopic fenestration of posttransplant lymphoceles / Doehn C, Fornara P, Fricke L, Jocham D. // Surg Endosc. 2002. - Vol. 16(4). - P.690-5.
113. Levi V., Ruan Q., Gratton E. 3-D Particle Tracking in a Two-Photon Microscope: Application- to the Study of Molecular Dynamics in Cells // Biophysical Journal. 2005. - 88. - P.2919 - 2928.
114. MAG3 renogram deconvolution in kidney transplantation: utility of the measurement of initial tracer uptake / Bajen M.T., Puchal R., Gonzalez A., et al. // J. Nucl. Med. 1997 Aug. - Vol:38(8). - P.1295-1299.
115. McLaren A.J. Delayed graft function: risk factors and the relative effects of early function and acute rejection on long-term survival in cadaveric renal transplantation / McLaren A.J. // Clin. Transplant. 1999. - Vol. 13(3). -P.266-72.
116. Meiser BM, Reiter C, Reichenspurner H, Uberfuhr P, Kreuzer E, Rieber EP, Riethmuller G, Reichart B. Chimeric monoclonal CD4 antibody: a novel immunosuppressant for clinical heart transplantation // Transplantation. -1994.-Vol.58.-P.419-23.
117. Miqueu P, Guillet M, Degauque , Dore JC, Soulillou JP, Brouard S. Statistical analysis of CDR3 length distributions for the assessment of T and B cell repertoire biases // Mol Immunology. 2007. - Vol.44. - P. 1057.
118. Mohamed H. Sayegh. The role of T-cell costimulatory activation'pathways in transplant rejection / Mohamed H. Sayegh. // New England Journal of medicine. 1998. - Vol-.338(25). - P. 1813-21.
119. Molnar I. Treatment of post-transplant lymphoproliferative disorder with rituximab and radiation in a patient with second renal allograft / Molnar I, Keung YK. //Nephrol Dial Transplant. 2001. - Vol.16. - P.2114-5.
120. Multiparameter immune profiling of operational tolerance in liver transplantation / Martinez-Lordella M, Puig-Pey I, Orlando G, et al. // Am-J Transplant. 2007. - Vol.7. - P.309.
121. Nankivell BJ, The significance of subclinical rejection and the value of protocol biopsies / Nankivell BJ, Chapman JR. // Am J Transplant. 2006. -Vol.6. -P.2006.
122. Nast C.C. Renal transplant fine needle aspiration and cytokine gene expression /Nast C.C. // Pediatr. Nephrol. 1995. - Suppl 9. -P.56-60.
123. New immunosuppressive therapies in renal transplantation: Monoclonal antibodies / I.Buhaescul., L.Segall, D.Goldsmith, A.CovicJ // Nephrol. -2005. Vol. 18. - P.529-536.
124. Opelz G. Multicenter analysis of kidney preservation / Opelz G, Dohler B. // Transplantation. 2007. - Vol.83. - P.247.
125. Ortho Multicenter Transplant Study Group. A randomized clinical trial-of OKT3 monoclonal antibody for acute rejection of cadaveric renal transplants // N Engl J Med. 1985. - Vol.313/ - P.337-42.
126. P450 3A polymorph isms and immunosuppressive drugs: an update / Anglicheau D, Legendre C, Beaune P. et al. // Pharmacogenomics. 2007. -№ 8. - P.835.
127. Padi S. Salvage of cyclosporine A-induced oxidative stress and renal dysfunction by Carvedilol / Padi SS, Chopra K. // Nephron. 2002. -Vol.92(3). - P.685-92.
128. Parameter-optimized digital holographic microscope for high-resolution living-cell analysis' / Carl D, Kemper B, Wernicke G, von Bally G. // Appl Opt. 2004 Dec 20. - Vol.43(36). - P.6536-44.
129. Pavlakis M. Intragraft expression of T-cell acti-vation genes in human renal allograft rejection / Pavlakis M., Lipman M., Strom T.B. // Kidney Int.1996.- P.49:57.
130. Pediatric live-donor kidney transplantation in Mansoura Urology & Nephrology Center: a 28-year perspective / El-Husseini AA, Foda MA, Bakr MA, etal. //Pediatr Nephrol.-2006 Oct. №21(10). - P. 1464-70.
131. Perella R., Duericky A., Tessler F. et. al. Evalation of renal transplant dysfunction by duplex Doppler sonography: A prospective study and review of the literature. // Am. J. Kidney Dis. 1990. - №15. - P.544-550.
132. Persistent long-term changes in lymphocyte subsets induced by polyclonal antibodies / Muller TF, Grebe SO, Neumann MC, et al. // Transplantation. —1997.-Vol.64(10).-P. 1432-7.
133. Peter S. Immune Monitoring in Kidney Transplant Recipients Revisited / Peter S. Heeger and Donald Hricik // J Am Soc Nephrol.- 2002. №13. -P.288-290.
134. Polyomavirus in renal transplantation: a hot problem / Bonvoisin C, Weekers L, Xhignesse P, et al. // Transplantation. 2008 Apr 15. - Vol.85. - Suppl. 7. — P.42-48.
135. Praz V, Leisinger HJ, Pascual M, Jichlinski P. Urological complications in renal transplantation from cadaveric donor grafts: a retrospective analysis of 20 years. Urol Int. 2005;75(2): 144-9.
136. Pre-transplant and post-transplant soluble CD30 for prediction and diagnosis of acute kidney allograft rejection / Nafar M, Farrokhi F, Vaezi M, et al. // Int Urol Nephrol. 2008. - Vol.12. -P.2114-5.
137. Pyramidal appearance and resistive index: insensitive and nonspecific sonographic indicators of renal transplant rejection / Kelcz F., Pozniak M.A., Pirsch J.D., Oberly T.D. // Am. J. Roentgenol. Vol.155. - P.531-535.
138. Rajpoot DK, Gomez A, Tsang W, Shanberg A.Ureteric and urethral stenosis: a complication of BK virus infection in a pediatric renal transplant patient // Pediatr Transplant. 2007. - Vol. 11(4). - P.433-5.
139. Rare breast lesions: correlation of imaging and histologic features with WHO classification / Irshad A, Ackerman SJ, Pope TL, et al. // Radiographics. -2008. Vol.28(5). - P.1399-414.
140. Reduced graft function (with or without dialysis) vs immediate graft function--a comparison of long-term renal allograft survival / Johnston O, O'kelly P, Spencer S, et al. // Nephrol Dial Transplant. 2006. - Vol.21(8> - P.2270-2274.
141. Remission induction in non-Hodgkin lymphoma with reshaped- human monoclonal antibody CAMPATH 1H / Hale G, Dyer MJ, Clark MR, et al. // Lancet 1988.-Vol.2.-P. 1394-9.
142. Rituximab in association with rapamycin for post-transplant lymphoproliferative disease treatment / Garcia VD, Bonamigo Filho JL, Neumann J, et al. // Transplant Int. 2003. - Vol.16. - P.202-6.
143. Role of TH1/TH2 cytokines in kidney allograft rejection / Karczewski J, Karczewski M, Glyda M, Wiktorowicz K. // Transplant Proc. 2008. -Vol.40(10). - P.3390-2.
144. Savushkin A. Changes in the morphofiinctional state of rat erythrocytes caused by the native venom of the red cobra (Naja pallida) / Savushkin A., Vasilenko I. // Biull Eksp Biol Med. 1998. - Vol. 126(8). - P. 152-5.
145. Sayegh M. Mechanisms of T cell recognition of alloantigen / Sayegh M:H., Watschinger B., Carpenter C.B. // Transplantation. — 1994. — Vol.57. -P.1295.
146. Sayegh M. The role of T-cell costimulatory activation path-ways in transplant rejection / Sayegh M.H., Turka L.A. // N. Engl. J. Med. 1998. - Vol.338. -P.1813.
147. Sayegh M. The role of T-cell costimulatory activation pathways in transplant rejection / Sayegh MH, Turka LA. // New Engl J Med. 1998. - Vol.338. -P.1813-21.
148. Shamila Mauiyyedi. Acute Humoral Rejection in Kidney Transplantation: II. Morphology, Immunopathology, and Pathologic Classification / Shamila Mauiyyedi // Journal of the American Society of Nephrology. 2002. - Vol. 13 (3). - P.779-87.
149. Shoskes D.A. Increased major histocompatibility complex antigen expression in unilateral ishemic acute tubular necrosis in the mouse / Shoskes D.A., Parfrey N.A., Halloran P.F. // Transplantation. 1990. - Vol.49. - P.201-207.
150. Solez K, Colvin RB, Racusen LC, et al. Banff 07 classification of renal allograft pathology: updates and future directions // Am J Transplant. — 2008. -№8. -P.753"
151. Solez K. et al. International* standardization of criteria for the histologic diagnosis of renal allograft rejection: The Banff working classification of kidney transplant pathology. // Kidney Int. 1993 - Vol.44(2). - P:411-22.
152. Solez K. et al. Report of the third> Banff conference on allograft pathology on classification and lesion scoring^n renal allograft pathology. // Trans. Proc. — 1996. Vol.28(l): — P.441-444.
153. Sollinger H, Kaplan B, Pescovitz MD, Philosophe B, Roza A, Brayman K, Somberg K. Basiliximab * versus antithymocyte globulin for prevention of acute renal allograft rejection // Transplantation. -2001. Vol.72. - P. 1915-9.
154. Specific acceptance of cardiac allograft after treatment with antibodies to ICAM1 and LFA1 / Isobe M, Yagita H, Okumura K, Ihara A. // Science: -1992.-Vol.255.-P.l 125-7.
155. Spontaneous operational tolerance after immunosuppressive drug withdrawal in clinical renal allotransplantation / Ashton-Chess J, Giral' M<, Brouard S, Soulillou J. // Transplantation. 2007. - №84. - P. 12-15.
156. Subramaniam M. Revascularization of kidney allograft-after renal artery occlusion secondary to angioplasty / Subramaniam M, Edwards R, Osman HY. // Prog Transplant. 2007. - Vol. 17(3). - P. 177-9.
157. Szwarc I, Soullier S, Gayrard N, Mejean C, Mourad G, Argiles A. Ischemic postconditioning prevents ischemic acute renal failure // Transplant Proc. — 2007. Vol.39(8). - P.2554-6.
158. Tacrolimus sparing: a randomized prospective trial in renal.transplantation / Daclizumab induction / Light JA, Sasaki TM, Ghasemian R, et al. // Clin Transplant. 2002. - Vol.16,(7). - P.30-3.
159. Tc-99mDTPA Aperfusion scintigraphy and color coded duplex sonography in the evaluation of minimal renal allograft perfusion / Bair H., Gunter E., Ruppretcht H.< et al. //Nuklearmedizin. 1997. - Vol.36. - P. 178.
160. The importance of early renal graft function / Martinek V, Lanska V, Tschernoster E, Kocandrle V. // Nephrol Dial Transplant. 1993. - Vol.8(4). -P.361-5.
161. The pharmacokinetics of anti-thymocyte globulin (ATG) following intravenous infusion in man / Bunn D, Lea CK, Bevan DJ, et ah // Clin Nephrol. 1996 Jam - Vol.45( 1). - P.29-32.
162. The role of polyclonal anti-T-lymphocyte antibodies (ATG) in the kidney transplantation / Nikolovski M, Kotsev Iu, Dimitrov S, et al. //Khirurgiia (Sofiia). 2004. - Vol.60(4-5). - P.42-5.
163. Treatment of recurrent symptomatic lymphocele after kidney transplantation with intraperitoneal Tenckhoff catheter / Adani GL, Baccarani U, Risaliti A, et al. // Urology. 2007 Oct. - Vol.70(4). - P.659-661.
164. Treatment of renal transplant complications with a mesh hood fascial closure technique / Nguan CY, Beasley KA, McAlister VC, Luke PP. // Am LSurg. -2007.-Vol.l93(l).-P.l 19-21.
165. Treatment with humanized monoclonal antibody against CD 154 prevents acute renal allograft rejection in nonhuman primate / Kirk AD; Burkly LC, Batty DS, et al. // Nat Med. 1999. - Vol.5. - P.686-93.
166. Tribbles I as a novel biomarker of chronic antibody-mediated rejection / Ashton-Chess J, Giral M, Mengel M, et al. // J Am Soc Nephrol. - 2008. -Vol.19.-P.H-16.
167. Trivedi HS, Lai SM; Gupta N, Ross G Jr. ATGAM associated coagulopathy in renal, transplant patients: a report of two unusual cases // Int J Artif Organs. - 1996.- Vol. 19(8). - P.448-50.
168. Tumor necrosis factor alpha blockade for the treatment of steroid-refractory acute GVHD / Couriel D, Saliba R, Hicks K, et al. // Blood. 2004. -Vol.104. -P.649-54.
169. Tyden G, Kumlien G, Fehrman I. Successful ABO-incompatible kidney transplanatation without splenectomy using Ag-specific immunoadsorption and rituximab // Transplantation. — 2003. — Vol.76. P.730-1.
170. Ureteral necrosis after kidney transplantation: risk factors and impact on graft and patient survival / Karam G, Maillet F, Parant S, et al. // Transplantation.- 2004. Vol.78(5). - P.725-729.
171. Uretero-vescical anastomosis during kidney transplantation. Preliminary results of two surgical techniques Minerva / Adani GL, Baccarani U, Lorenzin D et al. // Urol Nefrol. 2007 Sep. - №59(3). - P.217-222.
172. Van Galder T. Drag interactions with tacrolimus / Van Galder T. // Drag Saf.- 2002. Vol. 25. - P.707-712.
173. Vincenti F, Grinyô JM, Ramos E, Nashan B; Stuart F, Kuypers D,.Brattstrom C, Cho S, Ekberg H, Johnson R. Can antibody prophylaxis allow sparing-of other immunosuppressives // Transplant Proc. 1999. - Vol.31. - P. 1246-8.
174. Vincenti F. A phase I/II trial of anti-CDlla monoclonal antibody in renal transplantation / Vincenti F, Mendeze R, Rajagopalan PR. // Am J Transplant. -2001. — №1. -P.276.
175. Vincenti F. New monoclonal antibodies in renal transplantation / Vincenti F. // Minerva Urol Nefrol. 2003. - Vol.55. - P.57-66.
176. Waddell T.K., Gorczynski R.M., DeCampos K.N., Patterson G.A., Slutsky A.S. Major histocompatibility complex expression and lung ischemia-reperfusion in rats. // Ann. Thorac. Surg. 1996. - Vol.62 (3). - P.866-872.
177. Waid TH, Lucas BA, Thompson JS, McKeown JW, Brown S, Kryscio R, Skeeters LJ. Treatment of renal allograft rejection with T10B9.1A31 or OKT3 //Transplantation. 1997. - Vol.64. - P.274-81.
178. Wekerle T, Kurtz J, Bigenzahn S, Takeuchi Y, Sykes M. Mechanisms of transplant tolerance induction using costimulatory blockade // Curr Opin Immunol. 2002. - Vol. 14. - P.592-600.
179. Yigit B, Tellioglu G, Berber I, Aydin C, Kara M, Yanaral F, Titiz I. Surgical treatment of urologie complications after renal transplantation // Transplant Proc. 2008. - Vol.40(l). - P.202-4.
180. Zhang Z., Ohkohchi N., Sakurada M., Mizuno Y., Satomi S., Okazaki H. Analysis of urinary DNA from graft origin in renal transplant recipient new method for diagnosis of acute rejection. // Clin. Transplant. - 2002. -Vol.16(8). - P.45-50.