Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Морфофункциональное состояние ядерных структур лимфоцитов как критерий оценки иммунологического статуса реципиентов почечного трансплантата

На правах рукописи 1

ЦАЛМАН АНТОН ЯНОВИЧ ии^4И64ЭВ

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЯДЕРНЫХ СТРУКТУР ЛИМФОЦИТОВ КАК КРИТЕРИЙ ОЦЕНКИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА РЕЦИПИЕНТОВ ПОЧЕЧНОГО

ТРАНСПЛАНТАТА

(клинико-экспериментальное исследование)

14.00.27 - хирургия 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2009

- 3 ДЕК 2003

003486496

Работа выполнена в ГУ «Московский областной научно - исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского».

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Ватазин Андрей Владимирович

доктор медицинских наук, профессор

Василенко Ирина Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского

Лобанов Александр Иванович

доктор медицинских наук, профессор

ГУ НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения

г. Москвы Хватов Валерий Борисович

Ведущая организация: «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. В.И.Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.

Защита состоится «_»_ 2009 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д.208.049.01 при ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского по адресу: 129110, Москва, ул. Щепкина, 61/2, корпус 15а, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского

Автореферат разослан «_»_2009г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Астахов П.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Важным фактором ухудшения функции почечного ашютрансплантата является острое отторжение в раннем послеоперационном периоде, поэтому своевременная его диагностика и адекватное лечение являются важными предикторами благоприятного клинического исхода (Divate S.A., 2000; Johnston О, O'kelly Р, 2006; Karczewski J., 2008).

В настоящее время диагностика острой реакции отторжения основывается на комплексной оценке клинических симптомов, лабораторных показателей и результатов специальных инструментальных методов, включая ультразвуковое, допплеровское исследование и динамическую нефросцинтиграфию. Однако большинство определяемых признаков не являются строго специфичными для острого отторжения (Сандриков В.А., Садовников В.И., 2001; Danovitch G.M., 2001; Tinckam K.J. et al., 2004). Они могут регистрироваться в различных комбинациях вследствие острого канальцевого некроза, инфекционных, хирургических осложнений, токсичности ингибиторов кальциневрина и других лекарственных средств (Арзуманов С.В. и соавт., 2005; Шумаков В.И. и соавт., 2006; Dalton R.S. et al., 2005).

Наиболее достоверным методом диагностики острой реакции отторжения (ОРО) в настоящее время остается пункционная биопсия. Однако, в связи с инвазивностью данного метода, необходимостью проведения подготовки пациента, наличием ряда противопоказаний и определенного риска развития осложнений, считать пункционную биопсию «золотым стандартом» дифференциальной диагностики патологических состояний нефротрансплантата можно достаточно условно.

В последнее время активно ведутся научные поиски по разработке инструментальных способов обследования реципиентов почечного аллотрансплантата и использованию лабораторных методов на основе учета и анализа патогенетических факторов дисфункции трансплантированной

почки. И если использование современных инструментальных методов в определенной мере ограничено наличием существующих диагностических аппаратов и приборных комплексов, то широкий круг лабораторных тестов продолжает увеличиваться (Сандриков В.А., Садовников В.И., 2001; Шумаков В.И. и соавт., 2006; РаЬ'^ак К. Л а1., 2004).

Сотрудниками отделения гемодиализа с пересадкой почки ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского был разработан способ диагностики острых реакций отторжения почечного трансплантата на основе измерений витальных морфометрических параметров иммунокомпетентных клеток методом компьютерной фазово-интерференционной микроскопии (Патент на изобретение «Способ диагностики отторжения почечного аллогрансплантата» № 2348932, 2009). Однако необходимость определения целого комплекса размерных показателей лимфоцитов, проведение многоуровневого математического анализа и сложность интерпретации полученных данных ограничивают возможность широкого использования метода в клинической практике, тем более для экспресс-диагностики ранней дисфункции почечного трансплантата.

Все вышеизложенное определяет актуальность выбранного направления исследований в плане совершенствования витальной компьютерной морфом етрии. Анализ морфофункционального состояния ядерных структур иммунокомпетентных клеток может иметь не только научное значение для детального исследования патогенетических звеньев реакции отторжения трансплантированного органа, но и весьма важный практический результат для оперативной оценки иммунореактивности и прогнозирования состояния реципиента, а также построения индивидуализированных лечебно-реабилитационных- программ, сравнения эффективности различных видов терапии; своевременного--выявления- осложнений, побочных и/или неблагоприятных эффектов лечения. Все это явилось основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования. Оценить диагностические возможности морфометрии ядерных структур лимфоцитов в мониторинге иммунологического статуса реципиентов почечного трансплантата.

Задачи исследования:

1. Изучить в режиме реального времени качественные и количественные изменения денситометрических параметров лимфоцитов периферической крови человека при их активации в условиях in vitro.

2. Провести сравнительный анализ структуры хроматина интерфазных ядер лимфоцитов периферической крови практически здоровых добровольцев и пациентов с терминальной стадией хронической почечной недостаточности методом витальной компьютерной морфометрии.

3. Изучить особенности динамики функциональной активности лимфоцитов у пациентов со стабильной и отсроченной функцией трансплантата в раннем посттрансплантационном периоде.

4. Оценить ядерный полиморфизм иммунокомпетентных клеток крови при острой реакции отторжения трансплантата.

5. Проанализировать изменения функциональной активности лимфоцитов на основе денситометрических показателей морфофункционалыюго состояния их ядерных структур после проведения противокризовой терапии для оценки эффективности программ иммуносупрессии.

Научная новизна. В экспериментах in vitro изучены денситометрические параметры ядер лимфоцитов периферической крови при переходе клеток от состояния покоя к активной пролиферации, индуцированной фитогемагглютишшом. Определены качественные и количественные показатели функционального состояния клеточных ядер, которые являются маркерами метаболической и пролиферативной активности лимфоцитов.

Впервые методом компьютерной фазовой морфометрии выявлена функциональная гетерогенность ядер циркулирующих лимфоцитов у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности до и после аллотрансплантации трупной почки в раннем посттрансплантационном периоде.

Для оценки морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток на основе витальных денситометрических параметров предложен показатель функциональной активности ядер лимфоцитов (приоритетная справка на получение патента «Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата» № 2009139822 от 28.10.2009).

Изучены особенности ядерного полиморфизма циркулирующих Т- и В-лимфоцитов у больных с признаками острой реакции отторжения нефротрансплантата и после проведения противокризовой терапии.

Практическая значимость.

Разработаны дифференциально-диагностические цитологические критерии реактивных изменений ядер лимфоцитов на основе исследования морфоденситомстрических характеристик хроматина и особенностей ядрышково-ядерного соотношения.

Полученные экспериментальные данные расширяют возможности витальной компьютерной морфометрии в оценке функционального состояния ядер лимфоцитов. Предложенный показатель ядерной активности лимфоцитов является ранним и объективным маркером их пролиферативного потенциала.

Проведение мониторинга денситометрических показателей ядер циркулирующих лимфоцитов позволяет своевременно выявлять изменение иммунореактивности реципиентов почечного трансплантата в раннем послеоперационном периоде.

Определение ядерной активности циркулирующих Т- и В-лимфоцитов позволяет проводить уточняющую экспресс-диагностику острой реакции

отторжения нефротрансплантата, прогнозировать результаты лечения, оценивать эффективность противокризовой терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Показатель функциональной активности ядер лимфоцитов, характеризующий конформационное состояние нуклеолярных белков и степень деконденсации хроматина, является универсальным количественным критерием пролиферативного потенциала иммунокомпетентных клеток.

2. Величина показателя функциональной активности ядер лимфоцитов может рассматриваться в качестве критерия ранней диагностики острого отторжения почечного трансплантата и эффективности проводимой противокризовой терапии.

Внедрение в практику. Основные положения и материалы диссертации внедрены в клиническую практику отделения гемодиализа с пересадкой почки ГУ МОНИКИ им.М.Ф Владимирского.

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 6 печатных работ.

Апробация работы. Основные материалы и положения работы доложены и обсуждены: на 24-й научно-практической конференции «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 2005г.; 25-й научно-практической конференции «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 2006г.; I научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 2008г.; II научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 2009г.; научно-практической конференции сотрудников отделения гемодиализа с пересадкой почки, отделения хирургической гемокоррекции и детоксикации, кафедры Эфферентной медицины, клинической и оперативной нефрологии ФУВ ГУ МОНИКИ им.М.Ф Владимирского, Москва, 2009г.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего отечественных и зарубежных источника.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Клиническая характеристика больных, материал и методы исследования

В исследование включены результаты обследования 36 больных с терминальной стадией ХПН, которым выполнена трансплантация почки в 2005-2008гг. в ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. В исследовании участвовали 18 мужчин и 18 женщин в возрасте от 20 до 59 лет (средний возраст 42±9,5 лет).

Для определения показателей нормы морфофункционального состояния ядерных структур лимфоцитов были обследованы 30 практически здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 59 лет (средний возраст - 36±7,6 лет).

Причинами, приведшими к терминальной стадии хронической почечной недостаточности, являлись хронический гломерулонефрит 61% (п=22), хронический пиелонефрит 22.2% (п=8), синдром Альпорта 5,6% (п=2), подагра 5,6% (п=2), хронический тубуло-интерстициальный нефрит 5,6% (п=2).

Все больные до аллотрансплантации трупной почки (АТТП) получали заместительную почечную терапию - гемодиализ или перитонеальный диализ. Средний срок нахождения на диализе составил 29,7±18,4 мес.

Во всех случаях органы были получены от трупных доноров. Среднее время холодовой ишемии донорской почки составило 22,1±2,6 ч.

Степень НЬА-совместимости оценивали по числу антигенов НЬА донора, совпадающих с антигенами НЬА реципиента. Уровень

предсуществующих антител у реципиента определяли в стандартном комплсмент-зависимом лимфоцитотоксическом тесте.

В послеоперационном периоде использовали следующий протокол иммуносупрессии: Циклоспорин (ЦсА) 2.5 мг/кг массы тела, Селлсепт 1,5-2г/сут, Преднизолон 0.5 мг/кг. Зенапакс 1мг/кг массы тела вводился в/в перед операцией, на 14, 28 и 42 дни, метилпреднизолон в/в перед включением почки в кровоток, на 2-е и 4-е сутки.

Острое отторжение почечного трансплантата купировали "пульсами" метилпреднизилона до общей дозы 3,0 г. При стероидрезистентных кризах применялся антитимоцитарный глобулин - АТГ (Фрезениус). При остром отторжении сосудистого или смешанного типа в комплексное лечение включали плазмаферез.

Для оценки адекватности получаемой дозы ЦсА всем больным после трансплантации почки определялась концентрация ЦсА в цельной крови иммуноферментным анализатором «TDX» фирмы «Abbott».

Всем пациентам проводились стандартные клинико-лабораторные, рентгенологические, ультразвуковые доплеровские исследования, динамическая нефросцинтиграфия.

Клинико-лабораторное обследование пациентов включало общий и биохимический анализ крови, общий анализ мочи, определение уровня креатинина в сыворотке крови, клиренса креатинина, определение белковых фракций, ферментов АсТ и АлТ, общего холестерина и холестерина липопротеидов высокой и низкой плотности, триглицеридов, концентрации циклоспорина А, вирусологическое и бактериологическое исследование. Для оценки функции пересаженного органа определяли следующие показатели: уровень сывороточного креатинина и мочевины, скорость клубочковой фильтрации, уровень креатинина в моче, уровень общего белка в плазме и в моче, уровень суточной протеинурии.

При наличии показаний производилось морфологическое исследование трансплантата. Реципиентам с дисфункций трансплантата и/или

s

инфекционными осложнениями выполнялось дополнительное иммунологическое обследование.

До и после трансплантации почки все больные обследовались с целью выявления вирусных гепатитов "В", "С": выполнялось биохимическое исследование сыворотки крови, определялись иммунологические маркеры (антигены и антитела) вирусов гепатита в ИФЛ. Кровь пациентов с положительными результатами определения иммунологических маркеров гепатитов исследовалась на наличие РНК HCV и ДНК HBV.

При подозрении на развитие бактериальных инфекций, проводилось микробиологическое исследование крови, мочи, мокроты, плеврального выпота, раневого отделяемого и т.д. - в зависимости от локализации инфекционных осложнений.

Пункционные биоптаты трансплантата получали в стерильных условиях под местной анестезией и ультразвуковым контролем. Пункции осуществлялись с помощью аппарата для биопсий GT GUN 22 (Италия). Для гистологического исследования биоптаты фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, обезвоживали в спиртах нарастающей крепости и заливали в парафин по общепринятой методике. Срезы толщиной 5-7 мкм исследовали гистологически, гистохимически и иммуногистохимически. Оценку полученных данных проводили по классификации Banff 97.

Метод витальной компьютерной цитоморфометрии был применен для изучения количественных показателей надмолекулярной организации интерфазного хроматина ядер лимфоцитов периферической крови на базе отечественного компьютерного лазерного фазово-интерференционного микроскопа "Цитоскан" (МГИРЭА, Москва). Больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности на этапе лечения перитонеальным' диализом и гемодиализом обследовали однократно. Реципиентов почечного аллотрансплантата наблюдали в течение раннего послеоперационного периода (30 суток после АТТП), осуществляя

посуточный мониторинг клинико-лабораторных показателей и выполвяя компьютерную фазометрию лимфоцитов.

Статистический анализ экспериментальных и клинических данных проводили с помощью алгоритмов среды MatLab и математического пакета "Statistica 6". Стандартная обработка выборок включала подсчет значений средних арифметических величин, ошибок средних, а также величины дисперсии, среднего квадратического отклонения и анализа асимметричности распределения. Различия между сравниваемыми группами рассчитывали по критериям Колмагорова-Смирнова или Стьюдента. Уровень значимости устанавливался равным 0,05.

Морфометрический анализ ядерных структур лимфоцитов in vitro

В качестве модельной системы in vitro для изучения перехода клеток от состояния покоя к активной пролиферации были выбраны лимфоциты периферической крови, активированные фитогемагглютинином (ФГА). В исследованиях были получены доказательства, что компьютерная фазовая морфометрия (КФМ) позволяет выявить детальные изменения фазовых параметров лимфоцитов, непосредственно связанные с их активацией. Исследования образцов с интактными лимфоцитами, находящимися в интерфазе показали, что на их топограммах четко визуализируются цитоплазма, ядро и слабо контрастное ядрышко (Рис. 1).

П nucleolus Aumideauis u ^__t _"

У ~f Л Ahcell

J Aiv, \

2 ' 4 ' 6 ' 8 ' 10 х.цт

Рис.1. Тоиограмма и фазовый профиль интактного Т- лимфоцита периферической крови.

h, nr

Для активации лимфоцитов к взвеси клеток in vitro добавляли в качестве индуктора активации ФГА с экспозицией в течение 1 часа при 37°С. После инкубации проводили компьютерную морфометрию активированных лимфоцитов (Рис.2).

Рис.2. Топограмма и фазовый профиль активированного Т- лимфоцита периферической крови.

Изучение динамики морфометрических показателей в процессе активации показало, что уже в течение одного часа после добавления ФГА фазовая высота клетки и ее ядра достоверно, снижаются практически в 1,5 и более раза (с 220,0 ± 39,0 нм до 95,0 ± 24,0 нм). Снижение фазовой высоты сопровождается существенными изменениями в морфологии лимфоцита: уменьшается фазовая толщина цитоплазмы, на фоне ядра выделяется контрастное ядрышко, в котором перераспределяется хроматин, и появляются множественные фибриллярные центры.

Исходя из полученных результатов, следует, что при активации клетки в ядре происходит перераспределение гетерохроматина к периферии, заметное снижение его электронной плотности, а в ядрышке идентифицируются множественные фибриллярные центры, окруженные плотным фибриллярным и гранулярным компонентом.

Оптические параметры живых клеток крови зависят от природы внутриклеточного вещества, его концентрации и конформационного состояния. Количество хроматина в соматической клетке со стандартным (диплоидным) набором хромосом постоянно и не зависит от большинства факторов. Коэффициент преломления для всех компонентов клеточных

¡Ahceil

структур в среднем равен 1,088 и может меняться в небольших пределах при изменении конформационного состояния молекул - чем меньше размер комплекса белков, ДНК и РНК, тем меньше коэффициент преломления. Таким образом, фазовая высота любой мононуклеарной клетки зависит в первую очередь от степени упаковки хроматина в ядре и активности процессов белкового синтеза. То есть данная величина позволяет косвенно оценить активность лимфоцита. Является очевидным, что морфометрические параметры количественно отражают качественные изменения клеток крови, могут считаться высокочувствительными и объективными критериями оценки различных нарушений гомеостаза организма человека.

Таким образом, фазовая высота - объективный количественный параметр, отражающий степень активации лимфоцитов и позволяющий регистрировать процесс в самой ранней фазе.

Использованный нами в данной работе метод компьютерной фазометрии позволил осуществить экспресс-диагностику степени изменения витального морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови соматически здоровых лиц и больных. Функциональная активность ядра как критерий активации лимфоцитов, характеризует конформационное состояние нуклеолярных белков и степень деконденсации хроматина, что отражается на фазово-интерференционных портретах Т- и В-лимфоцитов периферической крови человека.

Снижение уровня анизотропии ядра лимфоцита может интерпретироваться как показатель, свидетельствующий о переходе гетерохроматина в эухроматин, что указывает на биологическую активацию хроматина, и является предпосылкой для появления матричной активности ДНК.

Следовательно, ядерный полиморфизм циркулирующей популяции лимфоцитов может быть охарактеризован с использованием показателя функциональной активности ядра (РА) как величина обратно

пропорциональная фазовой высоте (РН) каждой клетки в выборке по формуле:

РА=(3*Пз+2*пг+п,+0*п0)/п,

где И А — функциональная активность ядра; пз - количество клеток с РН

<1,5мкм; п2 - с РН >1,5, но <2мкм; 111 - с РН >2, но <2,5мкм; п0 - с РН >2,5; п

— число клеток в выборке.

Фазометрия ядерных структур лимфоцитов здоровых добровольцев и больных ТХПН на стадип заместительной почечной

терапии

Установлено, что у практически здоровых лиц значение Б А составило 1,83±0,1 для Т- и 1,85±0,1 для В-лимфоцитов. Полученные высокие показатели связаны с преобладанием лимфоцитов со средним и низким значениями фазовой высоты, т.е. функционально активных клеток. Значения функциональной активности ядер Т- и В- лимфоцитов больных ТХПН и практически здоровых лиц (доноров) представлены в таблице 1.

Таблица 1

РА Т- и В-лимфоцитов больных ТХПН (М±о)

Группы Значение Б А Т-лимфоцитов Значение РА В-лимфоцитов

Доноры (N=30) 1,83±0,1 1,85±0,1

Больные ТХПН (N=36) 1,56±0,15* 1,54±0,2*

Примечание: достоверность различий р<0,05; *- отличается от контроля

Как для Т-, так и для В- лимфоцитов больных ТХПН характерно достоверное уменьшение функциональной активности ядер клеток. На основании полученных результатов можно предположить, что в Т- и В-звене иммунитета имеются признаки функциональной недостаточности, связанной, очевидно, с подавлением клеточной активации. В то же время полученные данные не позволяют оценить пролиферативный потенциал лимфоцитов, а лишь характеризуют изменение состояния иммунореактивности пациентов с терминальной стадией ХПН.

Морфометрический анализ ядерных структур лимфоцитов у реципиентов почечного трансплантата с неосложненным послеоперационным течением

Известно, что организм пациента после трансплантации почки подвергается целому комплексу воздействий. К ним относятся: антигенное влияние трансплантата, иммуносуирессия, наличие посттрансплантационных осложнений и т.д. Поэтому исследование изменений состояния клеточного звена иммунитета крайне важно для оценки иммунологического статуса реципиентов почечного трансплантата.

Проанализированы результаты проспективного обследования 18 больных в раннем послеоперационном периоде после аллотрансплантации трупной почки с первичной функцией трансплантата. Данная группа представлена 55,6% женщин (п =10) и 44,5% мужчин (п=8). Средний возраст пациентов составил 41,9±7,3 лет. Причинами, приведшими к терминальной стадии хронической почечной недостаточности, явились: хронический гломерулонефрит- 67% (п=12), хронический пиелонефрит-22% (п=4) и подагра 11% (п=2).

Методом заместительной почечной терапии у реципиентов почечного трансплантата в данной группе был перитонеальный диализ у 33,3%(п=6), гемодиализ у 66,7%(п=12). Средний срок нахождения на диализе до трансплантации почки составил 34,2±17,2 мес.

При подборе пары донор-реципиент совпадение по системе тканевой гистосовместимости составило по 3 антигенам - 22% (п=4), по 2 - 56% (п=10), по 1 - 22% (п=4). Таким образом, среднее совпадение в данной группе составило по 2±0,44 антигенам. Время холодовой ишемии донорских органов состазпло 2'. ,1=2,6 часа. Аллотрансплантация почки у всех пациентов выполнена на фоне отсутствия предсуществующих антител.

Срок нормализации диуреза в данной группе составил 1,7± 0,7 суток, снижение креатинина плазмы до нормальных значений наступало на 7,4±1,9 сутки.

Результаты мониторинга ядерной активности Т- и В-лимфоцитов периферической крови у реципиентов почечного трансплантата с неосложненным течением ' раннего послеоперационного периода представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты мониторинга ядерной активности Т- и В-лимфоцитов периферической крови реципиентов реналыюго трансплантата (М±о)

FA До Сутки после АТТП

АТТП 5 8 13 21 28

Т- лимфоциты 1,6±0,2 1,2±0,3* 1,3±0,2* 1,4±0,2* 1,4±0,3* 1,4±0,2*

В- лимфоциты 1,6±0,1 1,3±0,2* 1,4±0,2 1,4±0,11* 1,4±0,3* 1,4±0,1*

Примечание: достоверность различий р<0,05 по отношению к контролю

На 4-5 сутки зарегистрированы наименьшие значения ядерной активности лимфоцитов, что, вероятно, связано с проведением интенсивной иммуносупрессии в эти сроки, а также реакцией организма на оперативное вмешательство. К 8-10 суткам наблюдается рост и стабилизация показателя ядерной активности в связи с адаптационными процессами перестройки морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток при реализации реакции трансплантационного иммунитета.

Морфометрический анализ ядерных структур лимфоцитов у реципиентов АТТП с отсроченной функцией трансплантата

Доминирующей причиной отсутствия начальной функции трансплантата является ишемическое повреждение, возникающее в результате различных нарушений гемодинамики в организме донора, а также времени тепловой и холодовой ишемии. В то же время, отсутствие начальной функции трансплантата может быть клинической картиной и других патологических состояний, таких как артериальная окклюзия и венозный тромбоз ПАТ, нефротоксичность лекарственных препаратов, гемолитико-уремический синдром, внутрисосудистое депонирование жидкости, обструкция мочеточника, сверхострое и ускоренное острое отторжение. Как

правило, только исключение данных патологических состояний позволяет в дальнейшем считать причиной отсутствия начальной функции ПАТ ишемическое повреждение, морфологическим субстратом которого является острый канальциевый некроз.

Высокая частота развития острого отторжения, несомненно, связана с усилением иммуногенности трансплантата при ишемическом и реперфузионном повреждении. Причем, частота развития отторжения на фоне отсроченной функции трансплантата достигает 57%, в то время как, при немедленной его функции этот показатель значительно ниже. Таким образом, диагностика криза отторжения при отсроченной функции трансплантата является важной, но сложной задачей, что связано с отсутствием возможности ориентироваться на динамику биохимических показателей (креатинина и мочевины) и на количество мочи, в связи с анурией или олигоанурией.

Проведено проспективное обследование 12 больных в раннем послеоперационном периоде после аллотрансплантации трупной почки с отсроченной функцией трансплантата.

Данная группа представлена 33,3% женщин (п =4) и 66,7% мужчин (п=8). Средний возраст пациентов составил 43±8,8 лет.

Причинами, приведшими к терминальной стадии хронической почечной недостаточности, явились: хронический гломерулонефрит- 50% (п=6), хронический пиелонефрит-33% (п=4) и синдром Альпорта -17% (п=2).

Методом заместительной почечной терапии у реципиентов почечного трансплантата в данной группе был перитонеальный диализ у 17%(п=2), гемодиализ у 83%(п=10). Средний срок нахождения на диализе до трансплантации почки составил 26,8±10,1 мес.

При подборе пары донор-реципиент совпадение по системе тканевой гистосовместимости составило по 3 антигенам - 50% (п=6), по 2 - 50% (п=6). Время холодовой ишемии донорских органов составило в среднем 23,3±2,4 часа. Аллотрансплантация почки у всех пациентов выполнена на фоне отсутствия предсуществующих антител.

Срок нормализации диуреза в данной группе составил 14,7± 3,7 суток, снижение креатищша плазмы до нормальных значений наступало на 21,8±5,8 сутки.

Проведенное исследование ядерной активности Т- и В-лимфоцитов периферической крови методом компьютерной фазовой морфометрии у реципиентов почечного трансплантата с отсроченной функцией представлено в таблице 3.

Таблица 3

Результаты мониторинга ядерной активности Т- и В-лимфоцитов периферической крови реципиентов ренального трансплантата с отсроченной функцией (М±а)

FA До Сутки после АТТП

АТТП 5 8 13 21 28

Т- лимфоциты 1,6±0,2 1,2±0,2* 1,2±0,3* 1,3±0,1* 1,3±0,15* 1,2±0,2*

В- лимфоциты 1,5±0,1 1,5±0,3 1,4±0,1* 1,4±0,12* 1,5±0,1 1,3±0,2*

Примечание: достоверность различий р<0,05

Таким образом, выявлена функциональная гетерогенность ядер

циркулирующих лимфоцитов в послеоперационном периоде у реципиентов с

отсроченной функцией трансплантата. При этом уменьшение ядерной

активности связано с началом интенсивной иммуносупрессии, что наглядно

представлено на рис. 3. 1,6

- В-лимфоциты при первичной функции трансплантата

8

13

21

28

—»- - В-лимфоциты при

отсроченной функции

Ж Т-лимфоциты при первичной функции

—•• - Т-пимфоциты при

отсроченной функции

сутки после АТТП

Рис.3. Ядерная активность Т- и В-лимфоцитов периферической крови с первичной и отсроченной функцией трансплантата

Из представленных данных видно, что у реципиентов почечного трансплантата происходит достоверное уменьшение функциональной активности ядер Т- и В- лимфоцитов, что характеризует степень подавления иммунореактивности пациентов в процессе иммуносупрессии. При этом не выявлено достоверно значимых различий снижения иммунореактивности при первичной и при отсроченной функцией трансплантата (без иммунологического конфликта).

Витальная компьютерная фазометрня в диагностике острого отторжения почечного аллотрансплантата

Проанализированы результаты проспективного обследования 6 больных, у которых в раннем послеоперационном периоде выявлен криз отторжения трансплантата. Данная группа представлена 67% женщин (п =4) и 33% мужчин (п=2). Средний возраст пациентов составил 34,7±11,2 лет.

Причинами, приведшими к терминальной стадии хронической почечной недостаточности, явились: хронический гломерулонефрит- 67% (п=4) и хронический тубуло-интерстициальный нефрит 33% (п=2). Методом заместительной почечной терапии у всех реципиентов почечного трансплантата в данной группе был перитонеальный диализ. Средний срок нахождения на диализе до трансплантации почки составил 22±7 мес.

При подборе пары донор-реципиент совпадение по системе тканевой гистосовместимости составило по 2 антигенам. Время холодовой ишемии донорских органов составило в среднем 24,1±3,4 часа.

Аллотрансплантация почки у всех пациентов выполнена на фоне отсутствия высокого титра предсуществующих антител.

У всех реципиентов нефротрансплантата использовали следующий протокол иммуносупрессии: Циклоспорин 2.5 мг/кг массы тела, Селлсепт 1,5-2г/сут, Преднизолон 0,5 мг/кг. Зенапакс !мг/кг массы тела вводился в/в перед операцией, на 14, 28 и 42 дни, метилпреднизолон в/в перед включением почки в кровоток, на 2-е и 4-е сутки.

Для оценки адекватности получаемой дозы ГДсА всем больным после трансплантации почки определялась концентрация ЦсА в цельной крови иммуноферментным методом. 1Диклоспорин дозировали по его концентрации в пробе крови натощак, уровень препарата поддерживали в пределах от 150 до 200 нг/мл.

Проведен мониторинг ядерной активности Т- и В-лимфоцитов. При ОРО отмечено значительное увеличение функциональной активности ядер Т- и/или В-клеток в зависимости от типа реакции отторжения (рис.4).

и здоровые

И больные на диализе

□ после АТТП без криза

отторжения В при кризе отторжения

Рис.4. Мониторинг ядерной активности Т- и В-лимфоцитов.

В данной группе у реципиентов почечного трансплантата при наличии острого отторжения по клеточному типу наблюд&чся подъем ядерной активности Т- лимфоцитов до 1,71 ±0,05, т.е. на 25,7% по сравнению с пациентами с неосложненным течением раннего послеоперационного периода. При кризе отторжения по сосудистому типу показатель ядерной активности составил ].88±0,1, что на 35% выше, чем в группе с течением послеоперационного периода без иммунологического конфликта.

Внедрение и использование в клинической практике показателя функциональной активности ядер лимфоцитов позволило своевременно диагностировать развитие острого отторжения на доклинической стадии и начать соответствующее лечение.

Морфометрическая характеристика ядерных структур лимфоцитов в оценке эффективности антикризовой терапии

В данное исследование включены результаты проспективного обследования 6 больных, у которых в раннем послеоперационном периоде выявлен криз отторжения трансплантата.

Острое отторжение почечного трансплантата купировали "пульсами" метилпреднизилона до общей дозы 3,0 г. При стероидрезистентных кризах применялся аптитимоцитарный глобулин - АТГ (Фрезениус). При остром отторжении сосудистого или смешанного типа в комплексное лечение включали плазмаферез.

Проведен мониторинг ядерной активности Т- и В- лимфоцитов на фоне проводимой противокризовой терапии.

Результаты мониторинга ядерной активности Т- и В-лимфоцитов периферической крови реципиентов ренального трансплантата представлены в таблице 4 и на рисунке 5.

Таблица 4

Результаты мониторинга ядерной активности Т- и В-лимфоцитов периферической крови реципиентов ренального трансплантата (М±о)

FA При неосложненном течении При кризе отторжения После проведения противокризовой терапии

Т- лимфоцитов 1,36±0,1 1,71±0,05 0,97±0,2

в- лимфоцитов 1,39±0,1 1,88±0,1 1,3±0,2

Из представленных данных видно, что на фоне проводимой противокризовой терапии как для Т-, так и для В- лимфоцитов характерно достоверное уменьшение функциональной активности ядер клеток. РА достигает значений, сопоставимых с показателями в группе с неосложненным течением и даже ниже.

2fi

□ при неосложненном течении раннего поел еопе рацион ного периода

и при кризе отторжения

а после проведения противокризовой терапии

Т-лимфоциты В-лимфоциты

Рис.5. Ядерная активность Т- и В-лимфоцитов периферической крови у реципиентов почечного трансплантата в раннем послеоперационном периоде.

Таким образом, показатель функциональной активности ядер Т- и В-лимфоцитов характеризует степень подавления иммунореактивности пациентов в процессе иммупосупрессии при лечении острого отторжения почечного трансплантата.

Определение ядерной активности циркулирующих лимфоцитов позволило провести оценку эффективности противокризовой терапии. При выявлении стероидрезистентного криза отторжения своевременно проводилось лечение препаратами поликлональных антител. Благодаря ранней диагностике острого отторжения и адекватно проведенной терапии потерь трансплантатов не наблюдалось.

1. В экспериментах in vitro установлены дозо- и времязависимые эффекты изменения денситометрических показателей ядер лимфоцитов человека, активированных митогеном фитогемагглютинином. Фазовая высота живой клетки отражает особенности ядерного полиморфизма, предшествует динамике других ее морфометрических показателей и может

ВЫВОДЫ

рассматриваться в качестве раннего критерия пролиферативной активности лимфоцита.

2. Среднепопуляционные показатели функциональной активности ядер (РА) Т- и В-лимфоцитов больных с терминальной стадией ХПН отражают снижение пролиферативного потенциала циркулирующих клеток и составляют 1,56 и 1,54, против 1,83 и 1,85, установленных у здоровых лиц.

3. В посттрансплантационном периоде у пациентов без криза отторжения отмечается подавление функциональной активности циркулирующих лимфоцитов: величина РА Т- и В- клеток снижается до 1,21 и 1,35, соответственно, как при первичной, так и при отсроченной функции трансплантата

4. При развитиии острой реакции отторжения трансплантата на фоне базовой иммуносупрессии наблюдается прогрессирующее увеличение функциональной активности лимфоцитов: величина РА составляет >1,8±0,1.

5. Эффективность противокризовой терапии может быть количественно оценена по динамике значений показателя функциональной активности ядер лимфоцитов: снижение Б А до 1,4, свидетельствует об эффективности проводимого лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки иммунологического статуса реципиентов почечного трансплантата целесообразно применять компьютерную фазовую морфометрию, как малоинвазивный, оперативный и информативный скрининговый метод экспресс-оценки морфофункционального состояния ядерных структур лимфоцитов периферической крови.

2. Для контроля за иммунореактивностыо реципиентов почечного трансплантата целесообразно определять показатель ядерной активности лимфоцитов в раннем послеоперационном периоде каждые 3-4 дня.

3. Повышение показателя ядерной активности является показанием для проведения тщательного лабораторно- инструментального обследования, направленного на подтверждение острой реакции отторжения трансплантата.

4. Во время проведения противокризовой терапии следует определять показатель ядерной активности лимфоцитов каждые 2 дня для контроля эффективности проводимого лечения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морфометрические параметры иммунекомпетентных клеток как критерии ранней диагностики отторжения ренального трансплантата // Тезисы докладов в материалах научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной клинической медицины». - Пенза. -2006. - С.58. (Ватазин A.B., Василенко И.А., Валов АЛ., Астахов П.В., Метелин В.Б., Геращенко М.А., Степанов В.А., Цалман АЛ.)

2. Когерентная фазовая микроскопия для оценки активации лимфоцитов реципиентов почечного трансплантата (клинико-экспериментальное исследование) // Тезисы докладов в материалах IV Всероссийского съезда трансплантологов. - Москва. - 2008. - С.172-173. (Цалман А.Я., Метелин В.Б., Игнатьев П.С., Тычинский В.П., Вышенская Т.В., Валов А .Л.)

3. Витальная компьютерная морфометрия лимфоцитов как неинвазивный метод диагностики острого отторжения почечного аллотрансплантата // Альманах клинической медицины. - 2009. - №20. - С.77-82. (Валов А.Л., Василенко И.А., Ватазин A.B., Троянский И.В., Метелин В.Б., Цалман АЛ., Вышенская Т.В.)

4. Использование индекса активации иммунокомпетентных клеток в доклинической диагностике острого отторжения почечного трансплантата // Тезисы докладов в материалах научно-практической конференции Центрального федерального округа РФ «Актуальные вопросы гемафереза,

хирургической гемокоррекции и диализа». Москва. - 2009. - С.74. (Степанов В.А., Василенко И.А.,Ватазин A.B., Крстич М.Д., Валов A.JL, Цалман А.Я.)

5. Функциональное состояние хроматина лимфоцитов как критерий диагностики острого отторжения реиального аллотрансплантата // Тезисы докладов в материалах научно-практической конференции Центрального федерального округа РФ «Актуальные вопросы гемафереза, хирургической гемокоррекции и диализа». - Москва. - 2009. - С.87. (Цалман А.Я., Метелин В.Б., Валов А.Л., Ватазин A.B., Василенко И.А.)

6. Витальная компьютерная морфометрия лимфоцитов в диагностике острого отторжения почечного аллотрансплантата. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2009. - №4. - С. (Ватазин A.B., Василенко И.А., Валов А.Л., Метелин В.Б., Цалман А.Я.)

Подписано в печать:

10.11.2009

Заказ № 2974 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru