Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Комплексный морфоденситометрический анализ структурно-метаболических изменений печени при перитоните (на материале операционных биопсий)

ЦТ) СП

с 22

> МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 1 РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕН1ШЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ УДК 61636-008.64-072.4-076.1.3-543.074

ЕВСТИГНЕЕВА Маргарита Константиновна

КОМПЛЕКСНЫЙ МОРФОДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ПЕЧЕНИ ПРИ ПЕРИТОНИТЕ (на материале операционных биопсий)

14.00.15 - патологическая анатомия 14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1995

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

О.Д.Мишнев

доктор медицинских наук, профессор Э.М.Коган

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук Ю.А.Романов

академик АЕН, доктор медицинских наук Г.Г.Автандилов

Ведущее учреждение, диссертации:

дающее отзыв о научно-практической ценности Институт биологии развития РАН

Защита диссертации состоится <____>.............1995 г.

в......часов на заседании Специализированного Ученого Совет«

(Д-084.14.04) при Российском государственном медицинском университете по адресу: 1117869, Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Государственного медицинского института (ул. Островитянова, д.1).

Автореферат разослан <____> ................1995 г.

Ученый секретарь

Специализированного Совета Д-084.14.04 доктор медицинских наук, профессор

А.Н. Тихомиров

- 2 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования. Проблема острого перитонита (Oil) является объектом пристального внимания клиницистов и патологоанатомов, поскольку частота этого тяжелого хирургического осложнения не уменьшается и составляет при острых воспалительных заболеваниях и травматических повреждениях органов брюшной полости от 3 до 43Х (Савельев В.С.,1989, Панцырев Ю.М. и др., 1990; Beger H.G. et al.,1988, Gunter К. et al., 1988). В настоящее время продолжает оставаться высокой летальность при ОП, достигая, в зависимости от этиологии перитонита, от 6 до 587. (Ерюхин И.А., 1986, Гостищев В,К. и др., 1992; Щуркалин Б.К. и др., 1993; Wittmann D.N. et al., 1985). В последние годы разработана патогенетическая концепция ОП, согласно которой основным звеном патогенеза заболевания считается эндотоксикоз (Струков А.И., Петров В.И., Пауков В.И.,1987; Гостищев В.К. с соавт., 1992; Fvlleuk et al., 1985).. Одной из главных причин увеличения степени эндогенной интоксикации является срыв барьерной функции печени - основного дезинтоксикационного органа (Пермяков Н.К. и др., 1989; Арцимович Н.Г. и др., 1992; Маянский Д.Н. и др. 1992; van Bossayt Н. et al.,1987). Поэтому оценка структурно-метаболического состояния печени имеет важное диагностическое и прогностическое значение.

Имеющиеся в настоящее время клинико-лабораторные тесты функционального состояния печени (по биохимическим показателям крови) не всегда обеспечивают своевременное выявление нарушения функции печени (Хазанов А.И., 1988; Vary Т.С. et al., 1989). Положение осложняется тем, что данные о взаимосвязи биохимических показателей крови и структурных изменений в печени противоречивы, а устойчивые взаимосвязи между ними не выявлены ( Гальперин Э.И. и др., 1978).

Для объективной оценки наррения функции печени при (Ж необходима комплексная количественная структурно-метаболическая характеристика обнаруживаемых изменений с обязательным учетом гетерогенности гепатоцитов в печеночных ацинусах (Мишнев О.Д. и др. 1988, 1992). Однако, традиционные количественные показатели структурно-метаболической организации ацинусов печени не всегда бывают достаточно информативны, поскольку морфологические и функциональные показатели состояния печени оцениваются раздельно, а именно: геометрические характеристики печеночной ткани -морфометрическими методами (Автандилов Г.Г.,1990), а оценка

функциональной активности проводится микрофотометрически (Щего-лев А.И. и др., 1988).

В настоящее время при решении научно-практических задач гистологии, цитологии и патологической анатомии показана информативность количественных показателей для анализа изображений микрообъектов, полученных с помощью компьютерных систем анализа изображения, учитывающих специфику цитологических и гистологических объектов (Коган Э.М. и др., 1986; Жукоцкий A.B.,1992; Martin E.D., 1994). Сложившаяся ситуация диктует необходимость применения новых методов для количественного изучения структурно-метаболических изменений печени, характеризующих уровень компенсаторных ресурсов и степень нарушения функции органа при остром перитоните.

На основании вышеизложенного сформулированы следующие цель и задачи исследования.

Цель исследования: на основании комплексного количественного изучения структурно-метаболических изменений в биоптатах печени больных перитонитом, используя компьютерные системы анализа изображений, получить новые, более информативные показатели, 'позволяющие объективизировать морфологическую диагностику нарушения печеночной функции при перитоните.

Задачи исследования.

1. При помощи гистологических и гистохимических методик изучить на материале операционных биопсии особенности морфологических изменений печени при остром перитоните.

2. При помощи гистоэнзиматических методик на этом же материале изучить характер распределения активности ЛИГ, СДГ, ГДГ, БДГ, Г-6-ФДГ, НАД-, ВДФ-диафораз в печеночных ацинусах в зависимости от их зональной локализации.

3. Разработать интегральные оптико-геометрические (морфо-денститометрические) количественные показатели пространственной организации печеночных ацинусов для объективизации структурно-метаболических изменен^ печени при перитоните.

4. На основе метода компьютерной морфоденситометрии (ВДМ) провести сравнительный информационный анализ гистоэнзиматическо-го профиля гепатоцитов при остром перитоните для выявления патогенетического значения его изменения в нарушении функции печени при перитоните.

5. Провести корреляционно-регрессионный анализ взаимосвязи между биохимическими показателями плазмы крови трех. источников (воротной, печеночной и локтевой вен) и морфоденситометрическими

(ЬЩМ ) показателями печени для установления взаимосвязи между ними и выявления информативного источника крови, наиболее объективно отражающего изменения функции печени при перитоните.

Научная новизна.

- В работе впервые проведено морфоденситометрическое исследование результатов гистоэнзиматических реакций в биоптатах печени больных перитонитом и получены новые, более информативные количественные показатели структурно-метаболических изменении печени при перитоните.

- Впервые, благодаря применению нового метода ЩМ для анализа результатов гистоэнзиматических реакций на ЛДГ, СДР, ГДГ, БДГ, Г-б-ФДГ, НАД-, НАДФ-диафоразы в гепатоцитах с последующим информационным анализом, обнаружена иерархичность масштаба структурно-метаболических изменений в печеночных ацинусах, что подтверждает общебиологическое явление фрактальности, т.е. закономерности в масштабе пространственных изменений биологических объектов: обнаружены внутризональные (микрозональные) и межзональные структурно-метаболические изменения в печеночных ацинусах при перитоните.

- На базе ВДМ проведено количественное изучение стереологи-ческой гетерогенности структурно-метаболической организации печеночных ацинусов и построены новые интегральные количественные критерии для оценки структурно-метаболического состояния печени при перитоните.

- Впервые установлена взаимосвязь между биохимическими показателями плазмы крови трех источников (воротной, печеночной и локтевой венами) и новыми МДМ показателями для анализа ГЭР в печени. Количественно доказано преимущество биохимических показателей плазмы крови из печеночной вены, наиболее информативно отражающей функцию печени, по сравнению с другими источниками крови.

Практическая ценность работы определяется комплексным количественным подходом к изучению структурно-метаболических изменений печени при перитоните на биопсийном материале. Полученные результаты позволяют:

- уточнить структурно-метаболическую гетерогенность гепато-цитов не только на межзональном, но и на внутризональном уровне;

- использовать новый метод компьютерного морфоденситометри-ческого изучения операционных биоптатов печени для оценки ее структурно-метаболических изменений при перитоните;

- учитывать данные по объективизации нарушений пространс-

твенной структурно-метаболической организации печеночных ацину-сов в научных исследованиях, посвященных проблеме нарушения функции печени при острой хирургической патологии.

Апробация диссертационного материала. Основные положения и выводы диссертации доложены и обсуждены на совместных научных конференциях кафедры патологической анатомии лечебного факульте-тета РГМУ, иммуно-морфологического отдела НИИ ФХМ и патоло-гоанатомического отделения 1-ой ГКБ им. Н.И.Пирогова (1990, 1991,1993, 1995 гг), на ежегодной научной конференции Научно-исследовательского института физико-химической медицины (1994 г.), на XI Всероссийской научно-практической конференции "Морфо-метрия в диагностике болезней" (Москва, 1993 г), на 3-й конференции Европейского Общества по аналитической целлюлярной патологии (Гренобль, Франция, 1994 г), на 2-ом Европейском конгрессе по телепатологии (Париж, Франция, 1994 г), на 22-ом Европейском конгрессе по цитологии (Амстердам, Нидерланды, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 174 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы, содержащей результаты работы и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Содержание работы иллюстрировано 23 рисунками (микрофотографии, графики), количественные данные представлены в 28 таблицах. Библиографический указатель содержит 114 работ отечественных и 102 источника зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом настоящей работы явились результаты комплексного структурно-метаболического исследования операционных биоптатов печени 43 больных с острым перитонитом (ОИ), оперированных в клинике факультетской хирургии им. С.И.Спасокукоцкого (директор клиники - академик РАМН, проф. В.С.Савельев) в период с 1985 по 1988 годы. Настоящее исследование является составной частью комплексного изучения патогенеза печеночной недостаточности при острой абдоминальной патологии, проводимого кафедрой патологической анатомии лечфака РГМУ (отв. - доц. А.П.Ракша). Компьютерный морфоденситометрический анализ проведен в научно-методическом отделе фирмы "ДизМорф"(Россия) и в лаборатории цитологии НИИ ФХМ (рук. лаб.- проф. Э.М.Коган).

В исследование включались пациенты, у которых течение основ-

ного заболевания сопровождалось развитием Ш и выраженными системными нарушениями (сердечно-сосудистой, дыхательной, печеноч-но-почечной недостаточностью), являвшимися показанием к обширным санационным вмешательствам.

Среди обследованных больных было 29 (67%) мужчин и 14 (337.) женщин. Распределение больных по полу, возрасту и исходу заболевания представлено в табл.1, а по основному заболеванию, характеру распространения воспалительного процесса в брюшной полости и стадиям Ой - в табл.2. При группировке биопсийного материала печени учитывались характер распространения воспалительного процесса в брюшной полости, стадии ОП (Симонян К.С., 1971; БМЭ, 1982), а такие исход заболевания. При анализе историй болезни изучаемых случаев мы классифицировали перитониты в зависимости от характера распространения воспаления по брюшине соответственно классификации ВОВ (БМЭ; 1982) на отграниченные и распространенные (диффузные). С клинической точки зрения в зависимости от времени возникновения и темпа нарастания патофизиологических изменений в организме больного в соответствии с рекомендациями ВОЗ (БМЭ, 1982) выделяли реактивную стадию (первые 24 ч), токсическую стадию (24 - 72 ч) и терминальную стадию (свыше 72 ч).

Структурно-метаболическое исследование ткани печени включало комплексное гистологическое, гистохимическое, гистоэнзиматичес-кое, информационно-морфометрическое изучение материала в сочетании с биохимическими показателями плазмы крови из 3-х источников.

Во время операции после вскрытия брюшной полости и определения основного патологического процесса из правой доли печени хирургами производилась краевая биопсия. Биоптат, 0.8 см в диаметре, фрагментировался на две части, одну из которых для гисто-энзиматического и гистохимического исследования замораживали в петролейном эфире, охлажденном сухим льдом. Вторую часть биопта-та для гистологического исследования фиксировали в забуференном

Табл.1.Распределение больных по полу, возрасту и исходу заболевания.

Возраст, (в годах) Благоприятный исход Неблагоприятный исход Итого

муж. жен. всего муж. жен. всего

старшего I , ¡ 1 1 | 1

Всего 12 4 16 17 10 27 43

Табл.2.3. Распределение больных по основному заболеванию, характеру распространения воспалительного процесса в брюшной полости и стадиям перитонита (1 - реактивная стадия, 2 - токсическая стадия, 3 - терминальная стадия).

Основное заболевание и его осложнение Отг] эаниченный Расп] эостраненный Итого

1 2 3 1 2 3

1.Язвенная болезнь желудка и 12-ти перстнои кишки с 2.тоаШтич. разрыв желудка ЗЛравмат.раашв тонкой к-ки 4.травмат.разжв толст.кишки 5.Остр.кишечн.непроходимость 6.Флегм.-гангрен, холецистит „ с перфарациеи стенки 7.Флегм.-гангрен, аппендицит 8 8а§Що1«^оз стенки §ИнтаЬкт кишечника 10 шовар ? 1 1 1 } 1 8 5 3 1 1 9 3 f

всего больных 4 2 2 2 21 12 43

по Лилли 10% нейтральном растворе формалина, проводили по спиртам возрастающей концентрации и заливали в парафин.

Для морфологической характеристики состояния печени применяли окраску препаратов гематоксилином и эозином, импрегнацию серебром по Gordon, Sweet для выявления ретикулина (Э.Прис, 1962), окраски на фибрин по Н.З.Слинченко (1964), резорцин-фуксином Вейгерта на эластические волокна, смесью кислотного фуксина и пикриновой кислоты на коллагеновые волокна по методу Ван-Ги80на. Применяли гистохимические методики: окраска на нейтральные жиры Суданом III и IV,на фосфолипиды - Суданом черным В; выявление гликогена по методу Веста (Пирс Э., 1962). •

Изучение основных путей метаболизма* проводили путем определения уровня активности его ключевых ферментов с помощью стандартных методик по прописям Пирса Э.(1962). Криостатные срезы, толщиной 10 мкм, получали при температуре -18 - -20°С. В последующем замороженные срезы одновременно оттаивали и сушили под

* Гистологическая, гистохимическая, гистознвиматичеекая обработки биоптатов печени проведены совместно с сотрудниками кафедры патологической анатомии лечфака РГМУ - к.м.н.А.П.Рагапой и к.м.н.А.ИДеголевым.

вентилятором при температуре +20-+24°С, что позволяет, по рекомендации Р.А.Прочуханова (1978), избежать грубых структурных изменений ткани при т.н. "миграционной" кристаллизации. Далее в соответствии с рекомендациями Ю.К.Елецкого (1965) срезы, предназначенные для выявления активности дегидрогеназ, в целях предупреждения образования продуктов неспецифического (неэнзимати-ческого) восстановления солей тетразолия, помещали на 60 сек в охлажденный до -10°С ацетон. Выраженность процессов окисления в цикле лимонной кислоты определяли по активности сукцинатдегидро-геназы (СДР), для оценки состояния энергообеспечения синтетических процессов, а также для характеристики транспорта электронов изучали активность НАД-, НАДФ-диафораз, анаэробный гликолиз исследовали с помощью лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Изучали активность глутаматдегидрогеназы (ГДГ), характеризующей обмен белков и аминокислот, з-оксибутиратдегидрогеназы (БДГ), характеризующей обмен жирных кислот, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), маркера петнозофосфатного шунта.

Количественное гистоэнзиматическое исследование проводили при помощи метода компьютерной морфоденситометрии (КШЩ) (Жукоц-кий A.B., 1992) на компьютерной телевизионной установке "Диа-Морф" (фирма "ДиаМорф", Россия) по специально разработанной для этого программе оптико-геометрического анализа морфологических объектов.

Количественное исследование активности избранных дегидрогеназ проведено на биоптатах печени 24-х наблюдений в двух обучающих выборках. Обучающие выборки были сформированы на основе принципа сравнения групп (дихотомии) по характеру распространения воспалительного процесса в.брюшной полости и для определения прогностической ценности изученных показателей. В первом варианте дихотомии (19 человек) проводилось сравнение больных с распространенным ОП в зависимости от стадии его течения: токсическая стадия (13 человек) и терминальная (6 человек). Во втором варианте дихотомии проводилось сравнение больных по исходу заболевания: благоприятный исход (9 человек) и неблагоприятный исход (15 человек).

Для клинико-лабораторной оценки функционального состояния печени больных при ОП в лаборатории биохимии кафедры факультетской хирургии РГМУ (зав. - гл.н.с., д.м.н. Н.А.Сергеева) проводили исследование плазмы крови, полученной во время операции из трех источников (воротной, печеночной и локтевой вен) с помощью биохимического анализатора "Impact - 400" (Gilford, USA). Биохи-

мическое исследование плазмы крови включало определение концентраций альбумина, общего белка, азота мочевины, холестерина, кре-атинина, глюкозы, общего, прямого и непрямого билирубина, активности аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), т-глутамилтрансферазы (ГГТ), холинэстеразы, щелочной фосфатазы. На основании полученных данных рассчитывался коэффициент де Ритиса. Кровь воротной вены получали через интраоперационно установленный катетер. Пробы крови печеночных вен забирали по катетеру, установленному под ангиос-копическим контролем через подключичную вену и правое предсердие в устье одной из печеночных вен*.

Компьютерный информационный анализ цифрового материала проводился с помощью пакета прикладных программ (ППП) для статистического анализа "ИПСО" (новый интегральный 1ШП для статистического анализа, разработанный программистами фирмы "ДиаМорф" и максимально приспособленный к специфике количественной морфологии) . Весь полученный цифровой материал обработан методами вариационной статистики с использованием критериев Стыодента, Куль-бака, Фишера, информационного и корреляционно-регрессионного анализа и методов многомерной статистики по компьютерной технологии, разработанной А.В.Жукоцким (1991) и реализованной в ППП "ИПСО"(Фирма "ДиаМорф", Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Микроскопическое исследование биоптатов печени больных при ОП выявило, что морфологические изменения печени не являются специфическими и характеризуются нарушениями кровообращения в системе микроциркуляторного русла, повреждениями гепатоцитов и воспалительными инфильтратами в паренхиме и строме, степень выраженности которых находится в прямой зависимости от характера распространения воспалительного процесса в брюшной полости и стадий ОП. В реактивной стадии ОП расстройства кровообращения характеризовались сужением просвета артерий, неравномерным полнокровием печеночных венул и синусоидов с агрегацией в них эритроцитов, что, видимо, приводило к общему замедлению кровотока"в печени и артериовенозному шунтированию. Это, наряду с выраженной токсемией, являлось пусковым механизмом в прогрессировании даль-

* Хирургический раздел исследования проведен ассистентом кафедры факультетской хирургии РГМУ, к.м.н. Д.В.Матвеевым, которому мы приносим искреннюю благодарность.

нейших структурных изменений печени (Garrison R.N. et al., 1982; Manenti A. et al., 1990).

Замедление кровотока в результате внутриорганного депонирования крови способствовало нарушению метаболизма ткани печени в результате ее гипоксии, что, наряду с токсемией, приводило к повреждению гепатоцитов (Аверьянов Ю.А. и др., 1994; Townsend М.С. et al., 1986; Hampton W.A. et al., 1987). Повреждения гепа-тоцитов в реактивной стадии были представлены "зернистой", вакуольной дистрофией и пылевидной жировой дистрофией, а также моно-целлюлярными некрозами гепатоцитов, возникающими преимущественно в 3-х зонах печеночных ацинуссв. Большая уязвимость именно этих зон печеночных ацинусов объясняется особенностями микроциркуляции, а также гетерогенностью гепатоцитов в них (Rappaport A.M., 1982; Teutsch H.F., 1981; GummicioJ., Miller D., 1982).

В токсической и терминальной стадиях Ш отмечались признаки значительных расстройств кровообращения, происходило увеличение очагов повреждений печеночной паренхимы в виде зональных и субмассивных некрозов гепатоцитов, которые имели преимущественную локализацию в 3-х и 2-х зонах печеночных ацинусов.

При исследовании биоптатов печени больных с ОП, в анамнезе которых отмечались хронические заболевания (язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, хронический холецистит, хронический панкреатит), нами обнаруживались воспалительные инфильтрты портальных трактов и печеночной паренхимы макрофагами, лимфоцитами с примесью нейтрофильных гранулоцитов, что расценивалось как проявление неспецифического реактивного гепатита (НРГ) и подтверждалось перигепатоцеллюлярным, очаговым и портальным фиброзом. Сравнение воспалительных изменений в зависимости от стадий СП выявило некоторую закономерность в прогрессировании воспалительных изменений от портального НРГ, свойственного реактивной стадии ОП, к лобулярной и смешанной его формам НРГ, свойственных токсической и терминальной стадиям ОП, что согласуется с литературными данными (Глумов В.Я. и др., 1993). Необходимо отметить, что воспалительные изменения в терминальной стадии ОП обнаруживались не только в печени больных с предшествующими хроническими заболеваниями, для которых НРГ патогномоничен, но и у больных без предшествующей хронической патологии. Воспалительные изменения в последнем случае расценивались нами как закономерные проявления в ответ на деструкцию печеночной паренхимы в течение достаточно длительного промежутка времени, характерного для терминальной стадии ОП. Развитие НРГ при ОП закономерно, так как

- и -

решающее значение в его возникновении придают токсическому воздействию метаболитов, образующихся при заболеваниях различных органов брюшной полости, а также повреждению при этом печени бактериями и токсинами (Серов В.В., Лапиш К., 1989; Popper Н., Schaffner F., 1971, Echard M.et al., 1982). Нарастание воспалительных изменений в печени в зависимости от стадий ОП закономерно сочеталось с увеличением степени расстройств кровообращения, а также количества поврежденных гепатоцитов и нарушением метабо-лизирующей функции печени.

О нарушении метаболизирующей функции печени свидетельствовали биохимические показатели плазмы крови, указывающие на гепато-депрессию: снижение синтетических функций (общего белка, альбумина, холестерина, холинэстеразы), увеличение индикаторов гепа-тоцитолиза (AJIT, ACT, ДЦГ, ГГТ). Также косвенно свидетельствовали о нарушении метаболизирующей функции печени при ОН результаты микроскопического гистоэнзиматического исследования в виде выявления неоднородности распределения продукта гистознзиматической реакции (ГЭР) на избранные дегидрогеназы в гепатоцитах в соответствии с их зональной локализацией в печеночных ацинусах. При исследовании результатов ГЭР выявления активности избранных де-гидрогеназ, характеризующих основные пути метаболизма (СДГ, ДГ, ГДГ, Г-6-ФДГ, БДГ, НАД-, НАДФ-диафораз), в гепатоцитах мы обнаруживали изменения в виде очагового и распространенного снижения или повышения их активности в 1-х и 3-х вонах печеночных ацину-сов. Однако, визуальная оценка этих изменений, а также количественное исследование активности дегидрогеназ, с помощью традиционных гистофотометрических показателей не позволили выявить объективные критерии степени нарушения метаболизма в печени в токсической и терминальной стадиях ОП, а также при различном прогнозе заболевания.

Этим обстоятельством была обусловлена разработка новой методики оценки результатов ГЭР в гепатоцитах на основе метода компьютерной телевизионной морфоденситометрии (Коган Э.М. и др., 1986; Кукоцкий A.B., 1992). Преимущество этого метода в оценке результатов ГЭР в гепатоцитах заключалось в том, что оценивалось не только количество продукта тетраэолиевой реакции путем измерения оптической плотности в избранном участке с помощью традиционных гистофотометрических показателей, но и количественно оценивалось распределение этого продукта внутри вон печеночных ацинусов с помошью разработанных новых топологических морфодек-ситометрических (МДМ) показателей. Измерение разработанных коли-

чественных показателей для оценки результатов ГЭР в гепатоцитах осуществлялось раздельно в 1-х и 3-х зонах ацинусов, поскольку метаболическая специализация гепатоцитов этих зон наиболее гете-рогенна (David H., Reinke P., 1988), и приобретает решающее значение в раннем выявлении дискоординации метаболических систем печени при патологических воздействиях (Мишнев О.Д., 1988). Некоторые этапы разработанной новой компьютерной видеотехнологии количественной оценки результатов ГЭР в гепатоцитах представлены на рис. 1. Измерения проводились в соответствии с результатами предварительно проведенного планирования необходимого объема выборок* в 7 печеночных ацинусах (в 2-х - 4-х дольках), обычно обнаруживаемых на срезах операционных биоптатов печени. Далее строились векторные показатели, т.е. рассчитывались градиенты традиционных и ЫДМ показателей, а именно: соотношение их между перипортальными и перивенулярными зонами ацинуса. Определения и классификация количественных показателей для оценки результатов ГЭР в гепатоцитах приведены в табл.3, табл.4.

Оценка информативности морфоденситометрических показателей результатов гистознзиматических реакций в гепатоцитах проведена на 24 биоптатах печени больных с ОП. Исследование проведено на примере анализа активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в гепатоцитах. Выбор этого фермента был обусловлен следующими обстоятельствами. Как известно, ЛДГ - фермент конечного этапа анаэробного гликолиза, катализирующего переход лактата в пируват, что особенно значимым становится при гипоксии (Журавлева Т.В., Прочуха-нов P.A., 1978; Ленинджер А., 1985), в условиях которой находится печень при ОП (Аверьянов Ю.А.и др., 1994). ЛДГ является регу-ляторным ферментом, обеспечивающим мобильность реакций печени на внешние воздействия (Ленинджер А., 1985). ЛДГ относится к классу индикаторов цитолитического синдрома и распределен в основном в цитоплазме клетки (Хазанов А.П., 1988).

Для проведения информационного статистического анализа нами были сформированы обучающие выборки 4-х дихотомических групп больных. В 1-ом варианте дихотомии больные были разделены в зависимости от исхода заболевания (благоприятный исход - 9 больных и летальный исход - 15 больных). Во 2-ом варианте больные в токсической стадии распространенного (диффузного) ОП были разделены также в зависимости от исхода заболевания (благоприятный

Планирование необходимого объема выборок проведено совместно с В.В. Красновым (кафедра медицинской кибернетики РГМУ).

Рис.1.Этапы компьютерной видео-технологии количественной оценки результатов гистоэнзиматических реакций в печени:

1 - электронное увеличение области ацинуса и интерактивное выделение перипортальной (РР) и перивенулярной (РУ) его зон;

2 - компьютерная сегментация перипортальной (РР) и перивенулярной (РУ) зон ацинуса: в результате выполнения этого этапа остальные участки печеночной дольки исключаются из дальнейшего анализа;

3 - анализ перипортальной зоны печеночного ацинуса и гистограмма распределения оптических плотностей в этой зоне;

А- морфоденситометрический анализ полей высокой оптической плотности перипортальной зоны ацинуса, характеризующих внутризональное распределение продукта гистоэнзиматической реакции выявления активности ЛДГ в гепатоцитах.

¡¡¡¡ЦоиМогрЫ-Ю

1!Ш!1;!!|1

Табл.3. Определения количественных показателей для оценки результатов гистоэнэиматических реакций в печени при перитоните.

Показатель

Морфоденситометрическое определение показателя

Р1

?г

ЯЗ Я4

Р5

Р6

Я8

Р9

Р10

Р11

Р12

Р13

Р14

Р15

Р1 в

Р17

Р18

Р19

Р20

Р21

Р22

Р23

Р24

Р25

Р26

Р27

средняя оптическая плотность в перипортальной зоне ацинуса

средняя оптическая плотность в перивенулярной зоне ацинуса

средняя оптическая плотность по ацинусу межзональный градиент оптической плотности в ацинусе - абсолютный

межзональный градиент оптической плотности в ацинусе-алгебраический перипортально-перивенулярный индекс отношение количества положительных градиентов оптической плотности к количеству ацинусов вариабельность оптической плотности внутри поля высокой оптической плотности - перипортальная вариабельность оптической плотности внутри поля высокой оптической плотности - перивенулярная число полей с низкой оптической плотностью в перипортальной зоне ацинуса число полей с низкой оптической плотностью в перивенулярной зоне ацинуса межзональный градиент числа полей с низкой оптической плотностью - абсолютный межзональный градиент числа полей с низкой оптической плотностью - алгебраический средняя площадь одного поля с низкой оптической плотностью в перипортальной зоне ацинуса средняя площадь одного поля с низкой оптической плотностью в перивенулярной зоне ацинуса межзональный градиент средней площади одного поля с низкой оптической плотностью - абсолютный межзональный градиент средней площади одного поля с низкой оптической плотностью - алгебраический средний периметр одного поля с низкой оптической плотностью а перипортальной зоне ацинуса средний периметр одного поля с низкой оптической плотностью в перивенулярной зоне ацинуса межзональный градиент периметра поля с низкой оптической плотностью - абсолютный межзональный градиент периметра поля с низкой оптической плотностью - алгебраический максимальная ширина поля с низкой оптической плотностью в перипортальной зоне максимальная ширина поля с низкой оптической плотностью в перивенулярной зоне межзональный градиент максимальной ширины поля низкой оптической плотностью - абсолютный межзональный градиент максимальной ширины поля с низкой оптической плотностью - алгебраический суммарная площадь полей с низкой оптической плотностью,нормированная на площадь выделенного участка в перипортальной зоне суммарная площадь полей с низкой оптической плотностью,нормированная на площадь выделенного участка в перивенулярной зоне

Таблица 3. (продолжение). Р28 Р29 ЯЗО Р31

езг язз

Р34 Я35 Р36 Р37 язв Р39 Я40 Р41 Р42

Р43

Р44

Р45

Табл. 4. Классификация МДМ параметров для оценки результатов гистоэнэиматических реакций в печени при перитоните.

Количественные классы МДМ параметров

скалярные векторные (градиентные)

оптические (зональные) топологические (полевые) оптические (зональные) топологические (полевые)

1 И; Г2; РЗ Р10; Р15; Р18 Р22; Р23 Р27; РЗО Р34; Р35 РЗ»; Р42 Р14; Р19; Р2в; Р31 ; Р38; Р43 Р4; Р5; Рв; П; Рв; Р9 Р12 Р17 Р24 Р29 РЗб Р41 Р13; Р16; Р20; Р21; Р25; Р28; Р32; РЗЗ; Р37; Р40; Р44; Р45

Примечание: определения МДМ параметров см. табл.3.

межзональный градиент суммарной площади полей с низкой оптической плотностью - абсолютный межзональный градиент суммарной площади полей с низкой оптической плотностью - алгебраический суммарный периметр полей с низкой оптической плотностью в перипортальной зоне суммарный периметр полей с низкой оптической плотностью в перивенулярной зоне межзональный градиент суммарного периметра полей с низкой оптической плотностью - абсолютный межзональный градиент суммарного периметра полей с низкой оптической плотностью - алгебраический число полей с высокой оптической плотностью в перипортальной зоне ацинуса число полей с высокой оптической плотностью в перивенулярной зоне ацинуса межзональный градиент числа полей с высокой оптической плотность» - абсолютный межзональный градиент числа полей с высокой оптической плотностью - алгебраический средняя площадь одного поля с высокой оптической плотностью в перипортальной зоне ацинуса средняя площадь одного поля с высокой оптической плотностью в перивенулярной зоне ацинуса межзональный градиент средней площади одного поля с высокой оптической плотностью - абсолютный межзональный градиент средней площади одного поля с высокой оптической плотностью - алгебраический суммарная площадь полей с высокой оптической плотностью,нормированная на площадь выделенного участка в перипортальной зоне суммарная площадь полей с высокой оптической плотностью, нормированная на площадь выделенного участка в перивенулярной зоне

межзональный градиент суммарной площади полей с высокой оптической плотностью - абсолютный межзональный градиент суммарной площади полей с высокой оптической плотностью - алгебраический

исход - 7 больных и летальный исход - 6 больных). В 3-ем варианте дихотомии больные с распространенным ОП были разделены в зависимости от стадии ОП (токсическая - 13 больных, терминальная -6 больных). 4-й вариант дихотомии составили больные с распространенным ОП и летальным исходом, разделенные в зависимости от стадии ОП (токсическая - 6 больных и терминальная - 6 больных). Средние значения традиционных и информативных МДМ показателей по каждой из этих групп приведены в табл.5.

Для объективизации сравнения межгрупповых различий нами был построен интегральный критерий информативности, сформированный на основе информационных критериев Кульбака и Фишера (Ллойд с соавт., 1990). Наиболее информативные из них представлены на рис.2 , где длина столбиков характеризует степень информативности при распознавании групп больных по этим показателям, жирной чертой отделены традиционные показатели для оценки результатов ГЭР в гепатоцитах от предложенных новых МДМ показателей. Из анализа графиков видно, что информативность предложенных новых МДМ показателей значительно выше информативности традиционных гисто-фотометрических показателей. Звездочками отмечены достоверности различий по Ь - критерию Стьюдента. Результаты информационного анализа, представленные на рис.2, позволили нам сформулировать утверждение о более высокой информативности МДМ показателей, характеризующих пространственное распределение продукта гистознзи-матических реакций в гепатоцитах 1-х и 3-х зон ацинусов, по сравнению с оценкой количества продукта ГЭР в гепатоцитах этих зон, т.е. нами обнаружена большая информативность векторных МДМ (оптико-геометрических) показателей для анализа рузультатов ГЭР в гепатоцитах по сравнению со скалярными оптическими (традиционными) показателями.

Полученные результаты согласуются с полученными на нашей кафедре данными об использовании показателей изменения пространственной организации печеночных ацинусов для объективизации состояния метаболических систем гепатоцитов в качестве признаков ранних нарушений функции печени (Мишнев О.Д.и др, 1992).

Подтверждением высокой информативности новых МДМ показателей активности ЛИГ в гепатоцитах стало обнаружение достоверных корреляций (р<0.01+0.05) их с биохимическими показателями плазмы крови, ранее не выявленных с помощью традиционных методов анализа активности ферментов (Гальперин Э. И. и др., 1978; Хазанов А.И., 1988). Всего проанализировано 1344 корреляционные пары.

Табл.5. Количественные показатели (Р) выявления активности ЛДГ в гепатоцитах в 4-х вариантах дихотомии больных с ОП.

1-й Благоприятный исход (п-9) Неблагоприятный исход (п-15)

р х ± ш мин макс вар х ± т мин макс вар%

I1 '2 ;з ;7. ;э Р24 1 12 1 1 ||1 1? ¡.52 1

2-й вариант Токсическая стадия распространенного ОП

Благоприятный исход (п-7) Неблагоприятный исход (п-6)

Р х ± т мин макс варХ X 1 ш мин макс вар%

Ед ;з ;э пг Л | ¡1 1 | и 1 II

3-й вариант распространенный ост рый перитонит

токсическая стадия 0П(п=13) терминальная стадия 0П(п=6)

? х ± ш мин макс вар% х 1 т мин макс вар%

и ;э ;7 Г23 || 1 1 )4.4 |з 1 1 ■ 1

4-и вариант распространенный ост рый перитонит

токсическая стадия Ш (п-6) терминальная стадия Ш(п-б)

Р х ± т мин макс вар% х ± ш мин макс вар%

;г ;з ;гз ;27 ;гэ "31 в 48^1 i 7 8? |е ш и ♦ п ( (1 1 44 р 5 1 1

МДМ показатели м

МДМ показатели п

100

МДМ показатели

г»

• 1У Р»

ц

ш,-

тЯАИноЛли жое*

■

«е.»

II Рв

»Тма

момммх

47.4

ав.в

юо 1ео интегральные критерии

го 40 ев во юо интегральные критерии

МДМ показатели га

интегральные критерии #. р<00б

20 40 «О ВО 100

интегральные критерии

Рис. 2. Интегральные критерии информативности показателей выявления активности ЛДГ в гепатоцитах при распознавании групп больных:

А - с ОП в зависимости от исхода заболевания (1-й вариант дихотомии обучающей выборки);

Б - с распространенным ОП в зависимости от исхода заболевания (2-й вариант дихотомии обучающей выборки);

В - в токсической и терминальной стадиях распространенного ОП (3-й вариант дихотомии обучающей выборки).

Г - в токсической и терминальной стадиях распространенного ОП при неблагоприятном исходе заболевания (4-й вариант дихотомии обучающей выборки).

Анализ включал расчет коэффициента корреляции и оценку достоверности тесноты связи, построение диаграмм рассеяния и линий регрессии, расчет показателя силы взаимосвязи (Любищев А.А., 1985; АШ1 А., 1982). Выявлена закономерность силы (I) взаимосвязи количественных показателей активности ЛДГ в гепатоцитах с биохимическими показателями плазмы крови в зависимости от источника, а именно: печеночная вена (1-2.52)> воротная вена (1-2.4)> локтевая вена (1-0.72). Достоверных корреляций между традиционными гистофотометрическими показателями для оценки результатов ГЭР в гепатоцитах и биохимическими показателями плазмы крови не было обнаружено, что, на наш взгляд, и ограничивало применение в диагностике печеночной недостаточности гистоэнзиматических методов исследования. Полученные результаты могут быть объяснимы, исходя из особенностей топографо-анатомического положения венозных источников по отношению к печени. Печеночная вена, собирающая оттекающую от печени кровь, по силе связи с печенью среди исследуемых венозных источников занимает первое место среди двух других источников крови. Воротная вена содержит венозную кровь, притекающую к печени от органов спланхнической области, следовательно, концентрации веществ, храктеризующих функцию печени, в. ней по отношению к печеночной вене на цикл кровообращения меньше. Локтевая вена - самая удаленная по отношению к печени венозный источник, подвержена влянию гораздо большего количества сторонних (непеченочных) факторов, чем другие исследуемые венозные источники.

Компьютерная морфоденситометрия активности исследованных де-гидрогеназ в гепатоцитах, проведенная на биоптатах печени 24 больных при помощи телевизионного гистоанализатора изображения "ДиаМорф" в 2-х вариантах дихотомии, позволила с высокой достоверностью (Р<0.05*0.01) объективизировать структурно-метаболические изменения печеночных ацинусов в токсической и терминальной стадиях распространенного ОП (1-й вариант дихотомии), а также при благоприятном и неблагоприятном исходах заболевания (2-й вариант дихотомии). Информационный анализ количественных показателей выявления активности исследованных дегидрогеназ в 2-х вариантах дихотомии выявил большую информативность (в 8 раз) показателей активности ЛДГ, СДР, НАД-, НАДФ-диафораз по сравнению с соответствующими параметрами ГДГ, БДГ, Г-6-ФДГ. При ОП установлен различный характер реагирования ферментных систем в гепатоцитах: цикла Кребса (СДГ) и гликолиза (ЛДГ) по отношению к ци-топлазматическому и митохондриальному энергообеспечению (НАДФ-,

НАД-диафораз). Первые реагируют путем изменения межзонального соотношения степени своей активности, вторые - путем ее межзонального "перераспределения" при как бы неизменной общей активности. Второй способ реагирования ферментных систем мы определили как структурную модуляцию метаболического ответа гепатоцитов на патологическое воздействие. В рамках теории рекомбинационных преобразований (Саркисов Д.С., 1992, 1993), второй способ является более экономичным в процессе адаптации живых систем в нормальных и патологических условиях.

При сравнительном МДМ анализе структурно-метаболических изменений печени в токсической и терминальной стадиях распространенного ОП выявлены новые количественные показатели, характеризующие как возможное состояние компенсации метаболических систем гепатоцитов, так и показатели дизадаптации метаболизма печени при Ш. Показателем частичной компенсации метаболических систем в печени может рассматриваться обнаруженное нами снижение пери-портально-перивенулярного градиента активности ЛДГ (р<0.05), а также СДГ(р<0.05) за счет снижения их активности в гепатоцитах 1-х зон ацинусов и высокой их активности в сохранных гепатоцитах 3-х зон, что может быть направлено на сохранение энергообеспечения процессов детоксикации продуктов, элиминированных иэ брюшной полости. Частичной компенсацией энегрообеспечения метаболизма в интактных гепатоцитах 3-х зон ацинусов является и обнаруженное нами незначительное повышегае активности БДГ в терминальной стадии распространенного ОП по сравнению с токсической, что указывает на увеличение катаболизма жирных кислот в сохранных гепатоцитах 3-х зон ацинусов, в результате которого увеличивается высвобождение ацетил-КоА, представляющего собой один из основных источников энергии (Ленинджер А., 1985).

Показателями дизадаптации метаболизма в гепатоцитах служат увеличение в терминальной стадии Ш значений показателей относительной микрогетерогенности СДГ, ЛДГ СРв.Рд), доли инвертированных зональных градиентов активности этих ферментов р<0.01+0.05), а также увеличение перипортально-перивенуляр-ных градиентов полевых ЩМ показателей активности СДГ, ЛДГ, ГДГ, Г-6-ФДГ, НАД- и НАДФ-диафорав (Р40, Р36, Р37, Р45> Р13,

р<0.05), что свидетельствует о нарастании разобщенности метаболизма 1-х и 3-х зон печеночных ацинусов при перитоните вследствие повреждения гепатоцитов преимущественно в 3-х зонах печеночных ацинусов и увеличения повреждений паренхимы органа.

Анализ количества достоверных различий в классах информативных МДМ и традиционных гистофотометрических показателей активности исследованных дегидрогеназ в гепатоцитах в 2-х вариантах дихотомии больных выявил следующую закономерность классов показателей: микрогетерогенности (25%)>градиентно-топологические (24%)> градиентно-оптические (14%)>топологические (13%)оптические (0). Это позволило подтвердить обобщение о большей информативности векторных количественных показателей активности дегидрогеназ в гепатоцитах по сравнению со скалярными оптическими, а также сделать вывод об иерархичности масштаба структурно-метаболических изменений в печеночных ацинусах, в которых обнаружены внутризональные (микрозональные) и межзональные структурно-метаболические изменения. Это подтверждает общебиологическое явление фрактальности, т.е. закономерности в масштабе пространственных изменений биообъекта.

Таким образом, резюмируя результаты комплексного изучения активности исследованных дегидрогеназ в гепатоцитах на основе метода КМДМ, нами разработаты информативные количественные показатели для оценки структурно-метаболических изменений печени при ОП. Количественно доказано мнение некоторых авторов о том, что терминальная стадия ОП - это состояние организма на границе обратимости (Струков А.И., Петров В.И., Пауков B.C., 1987). В результате, особенное значение приобретает задача своевременного выявления нарушений функции печени при Ш для ее коррекции, чему могут способствовать новые количественные показатели состояния некоторых метаболических систем гепатоцитов, разработанных в настоящем исследовании.

ВЫВОДЫ

1. При микроскопическом изучении биоптатов печени больных, оперированных по поводу острого перитонита различной этиологии, обнаружены неспецифические морфологические изменения, представленные расстройствами кровообращения, гидропической и жировой дистрофией, моноцеллюлярными и очаговыми некрозами гепатоцитов, а также клеточными воспалительными инфильтратами, характерными для неспецифического реактивного гепатита. Эти изменения выражены в различной степени в зависимости от распространенности и стадий перитонита.

2. При гистоэнзиматическом исследовании активности СДГ, ДЦГ, ГДГ, БДГ, Г-6-ФДГ, НАД- и НАДФ-диафораз в гепатоцитах на биоп-

сийном материале обнаружен сложный комплекс структурно-метаболических изменений в виде очагового и распространенного снижения или повышения активности изученных дегидрогеназ в 1-х и 3-х зонах печеночных ацинусов, свидетельствующих о нарушении метабо-лизирующей функции печени при перитоните, информативная оценка которой при помощи традиционных методов исследования активности ферментов в гепатоцитах оказалась неэффективной.

3. Применение компьютерной морфоденситометрии позволило получить интегральные количественные показатели, позволяющие дать комплексную оценку структурно-метаболических изменений печени на биопсийном материале. Установлена наибольшая чувствительность векторных (оптико-геометрических) показателей по сравнению со скалярными (традиционными оптическими) показателями, что объективизирует представление о тяжести нарушений структурно-метаболической организации печеночных ацинусов при перитоните.

4. При сравнительном морфоденситометрическом анализе информативности результатов гистоэнзиматических реакций на изученные дегидрогеназы в гепатоцитах при остром перитоните установлена большая информативность (в 8 раз) показателей активности Ш, СДГ, НАД- й НАДФ-диафораз по сравнению с соответсвующими параметрами ГДГ, ЕДГ и Г-6-ФДГ, что обосновывает перспективность построения диагностического гистоэнзиматического спектра для количественной оценки морфофункционального состояния печени при перитоните.

5. При помощи морфоденситометрического анализа выявлены два типа нарушений пространственной структурно-метаболической организации ацинусов печени при перитоните: 1) изменение соотношения количества продукта гистоэнзиматических реакций на ЛДГи СДГ между 1-й и 3-й зонами ацинуса; 2) внутризональное изменение топологии продукта гистоэнзиматических реакций на НАД- и НАДФ-диафораз, что позволяет объективизировать степень морфологических и функциональных нарушений печени при перитоните.

6. Установлено, что увеличение показателей микрогетерогенности СДГ, ДЦГ, доли инвертированных градиентов активности этих ферментов, а также увеличение перипортально-перивенулярных градиентов полевых показателей активности СДГ, ДЦГ, ГДГ, Г-6-ФДГ, НАД- и НАДФ-дегидрогеназ, являются важными признаками нарастания разобщенности метаболизма в гепатоцитах 1-х и 3-х зон печеночных ацинусов, что наиболее выражено в терминальную стадию распространенного перитонита.

7. Выявлена наибольшая информативность и сильная взаимосвязь

морфоденситометрических показателей активности изученных дегид-рогеназ в гепатоцитах с биохимическими показателями плазмы крови печеночных вен по сравнению с соответствующими показателями воротной и локтевой вен, что необходимо учитывать при поиске объективных диагностических морфофункциональных маркеров нарушения функции печени при остром перитоните.

Практические рекомендации. Полученные данные морфологического исследования печени необходимо учитывать при изучении патогенеза печеночной недостаточности и танатогенеза у больных с ОП различной этиологии.

Разработанные новые интегральные критерии оценки структурно-метаболического состояния гепатоцитов при исследовании биоп-сийного материала могут быть использованы для проведения клини-ко-морфологических сопоставлений с целью выявления ранних диагностических признаков печеночной недостаточности при ОП.

Результаты оценки структурно-метаболических изменений печеночных ацинусов при ОП необходимо учитывать при разработке медикаментозных и инструментальных методов коррекции нарушения функции печени.

Внедрение в практику. В результате проведенного исследования получены новые сведения о структурно-метаболических изменениях печени при остром перитоните, которые используются:

- в учебном процессе и научной работе кафедр патологической анатомии и гистологии РГМУ;

- научной работе лаборатории цитологии НШ физико-химического института;

- в практической работе патологоанатомического отделения Городской клинической больницы N 1 им. Н.И.Пирогова г. Москвы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

1. Мишнев О.Д., Евстигнеева М.К. Компьютерный анализ морфоденситометрических показателей функционального состояния печени в исследовании печеночной недостаточности при перитоните // Де-понир. во ВИНИТИ, Москва - 1994. - N 473-В 94. - 29 с.

2. Евстигнеева М.К., Краснов В.В., Ракша A.n., Жукоцкии A.B., Мишнев О.Д., Коган Э.М. Корреляционно-регрессионный анализ взаимосвязи морфоденситометрических показателей функционального состояния печени и биохимических показателей крови у больных с печеночной недостаточностью при перитоните // Депонир. во ВИНИТИ, Москва - 1994. - N 1342-В 94. - 15 с.