Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Количественное определение аутоантител к антигенам органов репродукции и его применение для диагностики органоспецифичных аутоиммунных заболеваний

На правах рукописи

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АУТОАНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ ОРГАНОВ РЕПРОДУКЦИИ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОРГАНОСПЕЦИФИЧНЫХ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14 00 46 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург -2007

003161788

Работа выполнена в Государственном учреждении «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им Д О Отта Российской академии медицинских наук»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Калинина Наталья Михайловна Официальные оппоненты:

доктор биологический наук Кравцов Вячеслав Юрьевич (ФГУЗ ВЦЭРМ им А М Никифорова МЧС России) доктор медицинских наук профессор Симбирцев Андрей Семенович (ФГУП ГосНИИ особочистых биопрепаратов ФМБА России)

Ведущая организация

ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию МЗСР РФ

Защита состоится 14 ноября 2007 г в 15 00 часов на заседании диссертационного совета Д 205 001 01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им А М Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул Лебедева, 4/2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им А М Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул Лебедева, 4/2)

Автореферат разослан « //» октября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

С С Алексанин

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Аутоиммунные синдромы сопровождают ряд заболеваний репродуктивной системы С аутоиммунными синдромами связывают значительный процент случаев невынашивания беременности, бесплодия, других нарушений репродуктивной функции мужчин и женщин

Среди расстройств репродуктивной системы женщин важное место занимают нарушения функции яичников Чаще других заболеваний отмечают синдром преждевременного «истощения» яичника и синдром поликистозных яичников В ряду акушерских патологий значительный процент заболеваний женщин репродуктивного возраста составляет привычное невынашивание беременности [Плужникова с соавт, 2006] К проблеме бесплодных браков относятся также вопросы репродуктивного здоровья мужчин

Как известно, причиной бесплодия у женщин и мужчин нередко бывает аутоиммунное поражение гонад, которое встречается как самостоятельное заболевание [Потин с соавт, 2000, Айламазян Э К с соавт, 2002,], а также в форме аутоиммунного полиэндокринного синдрома [Abonen Р et al, 1987, Betterle С, et al, 1996,] К аутоиммунным заболеваниям относят хронический эндометрит и эндометриоз [Анциферова Ю С, Сотникова НЮ с соавт, 2005] Среди нарушений половой и эндокринной сфер мужчин важное место занимает аутоиммунный орхит [Алиева ДА, 1995, Гладкова Н А с соавт, 2004]

Одним из наиболее распространенных методически простых, быстрых и эффективных методов диагностики аутоиммунных заболеваний является определение циркулирующих в периферической крови органоспецифических аутоантител Для диагностики органоспецифичных аутоиммунных заболеваний успешно применяют иммуноферментные тест-системы для определения аутоантител к тиреоглобулину, тиреопероксидазе,

микросомальной фракции щитовидной железы, островковым клеткам поджелудочной железы, коллагену, эластину и т д [Тотолян А А с соавт, 2002]

Использование определения аутоантител как рутинного метода лабораторной диагностики в практике гинекологии и андрологии носит более ограниченный характер Это можно отчасти объяснить неполнотой данных об антигенности клеточных и тканевых структур репродуктивных органов [Monnier-Barbarmo Р et al 2005] Отсутствие универсальных методов определения аутоантител приводит к большому расхождению данных, полученных в разных условиях, и затрудняет сравнительные исследования контингентов больных

Существует успешный опыт иммунодиагностики патологии репродукции В частности, в качестве метода диагностики аутоиммунного оофорита хорошо зарекомендовало себя определение аутоантител методом непрямой иммунофлюоресценции [Colls J et al, 1995], есть попытки применения иммуноферментного анализа с использованием гомогенатов тканей в качестве антигенов-мишеней [Luborsky J J , 2002]

Попытки выявить связь между наличием органоспецифических аутоантител и нарушениями фертильности согласно данным литературы многочисленны и неоднозначны В источниках литературы описан широкий спектр молекул и клеточных и тканевых фракций, которые использовались в качестве антигенов для связывания циркулирующих аутоантител, при этом разные авторы использовали в диагностике антитела, направленные к различным аутоантигенам [Monnier-Barbanno Р et al, 2005] Из данных литературы следует, что диагностика различных аутоиммунных заболеваний органов репродукции связана с обнаружением широкого спектра антигенов, к которым направлены специфические антитела

Все вышесказанное определило актуальность разработки количественных методов определения антител к антигенам яичника, тканей

эндометрия и тестикул для диагностики аутоиммунных заболеваний органов репродукции

Цель исследования: Разработать иммуноферментные методы для количественного определения органоспецифичных аутоантител к антигенам яичника, тканей эндометрия и тестикул и оценить диагностическую значимость метода в выявлении аутоиммунных заболеваний органов репродукции

Задачи исследования:

1 Определение антигенной активности фракций органов-мишеней и получение стандартизованных антигенов для иммуноферментного определения органоспецифичных аутоантител

2 Определение внутренних стандартов органоспецифичных антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител

3 Создание иммуноферментных диагностикумов на основе отобранных антигенов и откалиброванных антител

4 Проведение оценки качества разработанных иммуноферментных диагностикумов

5 Определение диагностической эффективности определения органоспецифичных аутоантител разработанным иммуноферментным методом при аутоиммунных заболеваниях органов репродукции

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Предложенный способ фракционирования биологического материала, полученного из гонад и эндометрия, позволил разработать иммуноферментные диагностикумы для количественного определения органоспецифических антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител, которые представляют собой информативные методы лабораторной диагностики аутоиммунных заболеваний органов репродукции

2 Результаты количественного иммуноферментного определения антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител коррелирует с клиническими диагнозами и другими параметрами клинико-лабораторной диагностики

3 Выявление антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител в динамике является важным диагностическим критерием при мониторинге эффективности проводимой терапии

Научная новизна и теоретическая значимость исследования. В

результате использования новых методов получения антигенов разработаны иммунохимические диагностикумы для количественного определения антител к овариальному, эндометриальному и тестикулярному антигенам Использование разработанных иммунохимических тест-систем позволило уточнить патогенез нарушений фертильности у супружеских пар и повысить эффективность диагностики аутоиммунных заболеваний органов репродукции

Практическая значимость исследования. В результате исследования разработаны иммуноферментные диагностикумы для количественного определения органоспецифичных антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител, которые применяются в диагностике аутоиммунных заболеваний органов репродукции Применение количественного иммуноферментного метода определения органоспецифичных аутоантител к антигенам органов репродукции позволило определить нормальные уровни антител, свойственные фертильным женщинам и мужчинам Превышение установленных в работе пороговых уровней циркулирующих органоспецифических аутоантител является лабораторно-диагностическим свидетельством соответственно аутоиммунного оофорита, аутоиммунного орхита и аутоиммунных реакций при хроническом эндометрите и эндометриозе Результаты выявления

антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител используются в практической деятельности врачей, занимающихся патологией репродукции и позволяют повысить рождаемость

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на 26-й научной сессии, посвященной 100-летию кафедры акушерства и гинекологии СПбГМУ им акад И П Павлова, 1999 г , на 4-й всероссийской конференции эндокринологов, 2001 г, на Научно-практической конференции, посвященной 70-летию НИЦ здоровья матери и ребенка, Ереван, 2001 г, на 6-й Всероссийской научной конференции «Дни иммунологии в Санкт-петербурге», 2002 г, на 5-м российском форуме «Мать и дитя», 2002 г, на 1-й междисциплинарной конференции по акушерству, гинекологии и неонатологии «Здоровая женщина - здоровый ребенок», 2006 г, на 2-й российской конференции «Иммунология репродукции теоретические и клинические аспекты»

Публикации по теме работы. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, среди них статья в журнале по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 4 методических пособия для врачей, авторское свидетельство и 2 патента на изобретения, 4 статьи и 5 тезисов докладов и статей

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения на 28 страницах Текст диссертации содержит 19 таблиц и 23 рисунка, приложение - 11 таблиц и 15 рисунков Список литературы включает 74 названия работ отечественных авторов и 191 название работ иностранных авторов

Основное содержание работы.

Материалы и методы исследования. Образцы тканей яичников получали в ходе процедуры диагностической лапароскопии, образцы эндометрия - путем взятия биопсийного материала Не использованные в ходе диагностических процедур образцы тканей яичника и эндометрия использовали для получения соответствующих антигенов Образцы тканей тестикул получали в ходе хирургических операций по изменению пола Для выделения антигенов использовали методы дифференциального и высокоскоростного центрифугирования и физико-химические методы деструкции клеток

Для оценки полученных клеточных фракций, отбора контрольных образцов и стандартов и оптимизации ИФА применяли непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) антигенов и антител

Статистическую обработку количественных показателей проводили с использованием пакетов прикладных программ «NCSS Statistical and Data Analysis 2004» и «Statistica 6,0» Расчет статистических критериев был реализован в модулях «Nonlinear regression», «Nonparametrics/Disturb», «Multiple regression» и «ANOVA/MANOVA» При статистическом анализе сравнивали концентрацию в периферической крови антиэндометриальных антител (АЭАТ) и количественные показатели клеточного иммунитета Оценивали следующие субпопуляции клеток CD3+, CD+HLADR+, CD4+, CD3+CD8+, CD4+CD8+, CD4+HLADR+, CD3-CD8+, CD 16+, CD56+, CD16+CD56+, CD20+, CD25+, CD95+

Результаты собственных исследований и их обсуждение. Результаты собственных исследований включали фракционирование образцов тканей, оценку связывания фракций с контрольными сыворотками, определение оптимальных параметров проведения иммуноферментных реакций и оценку диагностической ценности определения аутоантител

Для выявления антиовариальных антител формирование основной группы больных, которые в дальнейшем были включены в исследование согласно критериям включения и исключения проводилось по результатам предварительного обследования 2220 женщин в возрасте от 17до 45 лет с нормогонадотропной недостаточностью яичников, проявлявшейся ановуляцией или лютеиновой недостаточностью В ходе стандартного клинического обследования, включавшего оценку данных анамнеза, объективного осмотра, результатов гормонального, эхографического и рентгенологического исследования были исключены внегонадные причины развития недостаточности функции яичников у этих больных

Определение антиэндометриальных антител проведено в рамках комплексного обследования пациенток поликлинического отделения НИИАГ им Д О Отта Всего проведено 355 комплексных обследований, которому подвергнуто 216 пациентов Обследованным пациентам поставлены следующие клинические диагнозы эрозия, эндометрит, гормональная недостаточность яичников, преждевременные роды, аборты доЗ недель, аборты 3-10 нед, аборты 10-12 нед, аборты позже 12 нед, выкидыши до 12 нед, выкидыш позже 12 нед, экстрагенитальные аутоиммунные заболевания, хламидиоз в анамнезе, уреоплазмоз в анамнезе, резекция яичников, внематочная беременность, миомэктомия, эндометриоз, сальпингоофорит

Для изучения аутоиммунных заболеваний органов репродукции мужчин обследовано 268 пациентов в возрасте от 22 до 47 лет с нарушениями сперматогенеза различной степени выраженности Причиной обращения за андрологической помощью являлось планирование беременности в браке, либо установленное бесплодие Из числа этих больных в дальнейшем была сформирована основная группа больных в соответствии с критериями включения/ исключения Средний возраст больных составил 30,7±0,3 года В ходе стандартного клинического

обследования, включавшего оценку данных анамнеза, объективного осмотра, результатов гормонального, эхографического и рентгенологического исследования были исключены внегонадные причины развития недостаточности функции яичек у этих больных

Проведенное исследование заключалось в выявлении антигенов, к которым направлены специфические антитела, при аутоиммунном оофорите, хроническом эндометрите с аутоиммунном синдромом у женщин и аутоиммунном орхите у мужчин

В основе предложенного иммуноферментного метода определения аутоантител лежит оригинальный способ выделения клеточных фракций и их использование в качестве антигенов Целевые антигены (овариальный, эндометриальный и тестикулярный) были выделены путем получения смешанных клеточных суспензий с помощью ферментативного гидролиза Из смешанной суспензии клеток путем центрифугирования в градиенте плотности были получены однородные суспензии клеток, которые подвергали процедуре «замораживания-оттаивания» параллельно с воздействием ультразвуком Ядерную и митохондриальную фракции клеточных гомогенатов отделяли центрифугированием, после чего осаждали микросомальную фракцию высаливанием

Образцы антигенов анализировали с пулированными образцами сывороток, полученных от пациентов с нарушениями фертильности и с сыворотками здоровых женщин и здоровых мужчин, и после проведения цветной ИФА-реакции оценивали показатель ее специфичности ОПполож /ОПотриц, где ОПполож - реакция с сыворотками пациентов с нарушением фертильности, ОПотриц - здоровые люди В качестве оптимального антигена отбирали те антигены, где показатель ОПполож/ОПотриц был максимальным Реакцию считали специфичной, если показатель ОПполож /ОПотриц превышал 10

и

Образец ткани

I

Смешанная суспензия клеток

Однородная суспензия клеток

Ферментативный гидролиз

Центрифугирование в градиенте плотности

Деструкция клеток

Суспензия

органелл

Скоростное центрифугирование и высаливание

Фракция микросом

Фракция цитозоля

Высаливание

Антиген

Рис 1 Принципиальная схема фракционирования образцов тканей органов репродукции

В качестве овариального антигена была отобрана микросомальная фракция фолликулярных клеток, в качестве эндометриального антигена -микросомальная фракция стромальных клеток и в качестве тестикулярного антигена - микросомальная фракция клеток Лейдига

Отсутствие стандартизованных контрольных препаратов антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител заставило прибегнуть к применению внутренних стандартов на основе использования сывороток женщин и мужчин с нарушениями фертильности и фертильных женщин и мужчин и введению условной единицы концентрации специфических антител

Стандартный препарат антител готовили из предварительно отобранных сывороток крови пациентов, у которых были выявлены антитела к соответствующему антигену (овариальному, эндометриальному, тестикулярному), демонстрирующие в ИФА оптическую плотность не менее 0,9 Отобранные образцы сывороток крови человека соединяли вместе (пулировали) и выделяли иммуноглобулиновую фракцию путем прямой ионообменной хроматографии согласно общепринятой методике выделения антител

Оптическая плотность реакции контрольных положительных сывороток с иммобилизованными выделенными фракциями находилась в интервале от 0,475 до 1,386 (рис 2)

На основе выделенных антигенов разработаны иммуноферментные диагностикумы, действующие по принципу непрямого ИФА антител по схеме иммобилизация антигена на твердой фазе—»испытуемая сыворотка—»иммуноферментный конъюгат —»хромоген

* 2 3 4 5 6 7

Фракции яичника

0 мул сывороток фертильных женщин

£9 пул сывороток женщин с нарушениями фертильности

I

! - гомошнат яичника

2 - фракция Гранулезных клеток фолликула

3 - ядерно-митохондриальнам фракция клеток фолликула

4 - микросомапьная фракция клеток фолликула

5 - фракция стромы яичника

6 - ядерно-митохондриальная фракция стропы

7 - мнкросомалъная фракция стромы

Рис. 2. Интенсивность ИФА-реакции антител с фракциями яичника.

Зависимость оптической юютыееги (0/7) цветной иммуш »ферме; 1тиой реакции от концентрации антигена выявлялась в интервале концентраций от 15 нг/мл до 16 мкг/мл (рис. 5). При этом ход кривой зависел от разведения контрольных и испытуемых сывороток. При разведении испытуемой сыворотки в 200 и более раз зависимость ОП от концентрации АГ практически не наблюдалась и достоверно не отличалась от холостой пробы. При разведении сыворотки 1 /50 наблюдался участок

пропорциональной зависимости в диапазоне концентраций АГ от 125 нг/мл до 2 мкг/мл. При разведениях 1/20 и слабее кривая имела «крутой» подъем в области низких концентраций АГ до 60 нг/мл и пропорциональный участок не был выражен.

-0.4 -

коггие|[Т[Ш[ня амт[|геи2 [шчп) —С—p^iwje]!)^ /¿(I " О разведение !''Ж1 —й разведем«

Рис.3. Зависимость ИФ А-реакции от концентрации иммобилизованного овариального антигена.

Для оценки чувствительности метода (чувствительности тест-системы) был использован показатель минимальной концентрации анализируемого лиганда, которая достоверно отличается от нулевой («blank») пробы, или минимальную регистрируемую разницу концентраций лиганда (аналита) в двух образцах Чувствительность выражали в единицах концентрации, а именно в нанограммах на миллилитр (нг/мл) антител. Минимальную определяемую концентрацию аутоаититсл в образцах оценивали как наименьшую статистически достоверно отличную от холостой пробы при уровне значимости не выше 0,01.

Для оценки точности анализа было принято статистическое рассеяние

показателей оптического поглощения (ОП) при повторных определениях одного опытного образца Точность выражали в виде показателя коэффициента вариации в процентах (СУ%) Вычисляли коэффициент вариации согласно формуле СУ=а/х*100%, где "х" - среднее значение величины оптического поглощения (ОП), а - "о" - стандартное отклонение

Оценку специфичности антител проводили по отношению к сходным по структуре антигенам В качестве количественной оценки специфичности иммуноферментной реакции использовали отношение показателя цветной реакции - оптическое поглощение (ОП) со специфичными антителами к показателю реакции с неспецифичными антителами в той же концентрации согласно формуле

Специфичность ИФА реакции 5=ОПспецифичн /ОПнеспецифичн

В качестве показателя надежности метода принимали "смещенность" или систематическую ошибку полученного результата от истинного значения концентрации антител в образце В качестве количественного показателя надежности анализа использовали "процент открытия" Р = ОП

образца/ОП стандарта 100%

Чувствительность разработанного иммуноферментного метода определения антиовариальных антител составила 16-20 нг/мл специфических антител Уровень неспецифических реакций с иммуноглобулинами не превышал 6,5 %, а неспецифических антигенов с аутоантителами - 8 % Анализ рассеяния измерений между пробами составил СУ=13,1 % Чувствительность иммуноферментного метода определения антиэндометриальных антител составила 20-25 нг/мл специфических антител Уровень неспецифических реакций с иммуноглобулинами составил 7,2 %, аутоантител с неспецифическими антигенами - 7,9 % Рассеяние измерений между пробами составило 14,2 % Всем больным с первичной яичниковой недостаточностью проводилось определение антиовариальных антител в крови с использованием

твердофазного иммуноферментного метода Повышенное содержание антиовариальных антител в крови было выявлено у 620 (27,9%) больных с первичной яичниковой недостаточностью

Табл 1

Количественные характеристики чувствительности метода определения антиовариальных антител (АОАТ)

п Концентрация Ауто антител (нг/мл) Среднее оптическое поглощение (ОП) Р< (у2 Пирсона)

15 0 0,065±0,008 ...

15 5 0,068±0,011 —

15 10 0,071±0,009 ...

15 20 0,069±0,010 ...

15 40 0,086±0,012 <0,05

15 80 0,098±0,009 <0,01

15 160 1,225±0,Ю5 <0,01

Среднее содержание антиовариальных антител в крови больных этой группы составило 732,0±13,0 Е/мл, что с высокой достоверностью (р<0,001) превышало этот показатель у больных с нормогонадотропной первичной яичниковой недостаточностью неясной этиологии (140,0±1,9Е/мл) и у здоровых женщин (120,8±9,1 Е/мл)

Измерение уровня антиовариальных антител у группы здоровых фертильных женщин показало, что средняя величина уровня антител составила 210 Е/мл, а значение 260 Е/мл нужно считать пороговым при

постановке диагноза. У пациепток с аутоиммунным оофоритом уровень антиоварнальных антител находился в интервале от 350 до 3000 Е/мл, среднее значение составило 732^13,0 Е/мл. {рис. 4).

3000,00

2250,00

1500,00

750,00

0,00

I 2 3

I - фунпа больных с аутоиммунным оофоритом 2- фуииа больных, у которых не был

диагногностирован аутоиммунный оофорит 3 - контрольная группа здоровых женщин (по оси ординат - уровень АОАТ)

Рис.4. Распределение уровня антиовариалъных антител у разных фупп обследованных больных

Для антиэндометриальных антител выделено два пороговых значения соответственно 210 и 265 Е/мл. Превышение нижнего значения указывает на возможность, а превышение верхнего - на высокую вероятность аутоиммунного заболевания. При уровне аутоантитсл между верхними и нижними значениями антиэндометриальных антител для подтверждения

1Е_

аутоиммунного заболевания желательна дополнительная лабораторная диагностика, в частности определение параметров клеточного и гуморального иммунитета

При проведении корреляционного анализа (МКК) между параметрами клеточного иммунитета, уровнем АЭАТ у женщин с невынашиванием и хроническим эндометритом показано, что наиболее высокая корреляция отмечена между уровнем АЭАТ с невынашиванием (г=0,847) При сравнении уровня АЭАТ с бесплодием, невынашиванием беременности и привычным невынашиванием беременности выявлена довольно высокая корреляция с бесплодием (г=0,9608) и умеренная корреляция с привычным невынашиванием (г=0,5752) (рис 5) На диаграмме в факторном пространстве выборка группируется вдоль одной средней с отдельно лежащими точками

При сравнении уровня АЭАТ с количеством нормальных киллеров с фенотипами СО 16, СБ56, С016С056 и их цитотоксической активностью выявлен наибольший коэффициент корреляции (г=0,801) и между количеством клеток С016СЭ56 (г=0, 960) и уровнем антиэндометриальных антител

Между уровнем АЭАТ и отдельными классами иммуноглобулинов существенная корреляция отмечена для 1§А - 0 6358 и для ^Е - 0 6892 - с привычным невынашиванием Для 1§М и э^А корреляция практически не выражена

Чувствительность определения антитестикулярных антител составила 18-24 нг/мл Уровень реакций с неспецифическими иммуноглобулинами составил 8,5 %, неспецифических антигенов с аутоантителами - 9,0 % Рассеяние результатов между пробами составило 13,8 % Как показало обследование контингента здоровых мужчин, пороговое значение антитестикулярных антител соответствует 310 Е/мл

По результатам этого исследования у 37(13,8%) из 268 больных с

нормогонадотропным гипогонадизмом было выявлено повышенное содержание антитестикулярных антител в крови Их среднее значение в крови составило 738,7±47,1 Е/мл и статистически достоверно (р<0,001) превышало уровень антитестикулярных антител как у остальных больных с нормогонадотропным гипогонадизмом, так и у здоровых мужчин

:

—I—I—I—I—I—Г" 2,00 -0,50

"1-1-1-1-1-1-1-1-г~

1,0 2,50

4,00

Рис 5 Диаграмма канонической корреляции между уровнем АЭАТ, бесплодием и привычным невынашиванием

Таким образом, использование разработанных иммунохимических тест-систем позволило уточнить патогенез нарушений фертильности у супружеских пар

Измерение антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител у пациентов с нарушениями фертильности, проведенное на базе научно-поликлинического отделения НИИАГ им Д О Отта РАМН, с позиций доказательной медицины подтвердило необходимость включения вышеперечисленных исследований в комплекс лабораторных методов, используемых при установлении причин нарушения фертильности у женщин и мужчин

Выводы:

1 При аутоиммунных заболеваниях органов репродукции наиболее часто встречаются аутоантитела, направленные к микросомальной фракции стероидогенных клеток гонад и микросомальной фракции стромальных клеток эндометрия

2 Количественное определение аутоантител к микросомальным фракциям фолликулярных клеток яичника, стромальных клеток эндометрия и клеток Лейдига тестикул представляет собой достоверные критерии лабораторной диагностики соответственно аутоиммунного оофорита, аутоиммунного синдрома при хроническом эндометрите и эндометриозе и аутоиммунного орхита

3 Разработанные количественные иммуноферментные методы определения органоспецифичных аутоантител соответствует требованиям, предъявляемым к методам клинико-лабораторной диагностики по специфичности, точности и воспроизводимости

4 Предложенные методы ИФА-определения аутоиммунных антител при различной патологии репродуктивной системы позволяют верифицировать характер аутоиммунных нарушений и осуществлять лабораторный мониторинг проводимой терапии

5 Проведенные клинико-лабораторные исследования позволили определить нормальные уровни антиовариальных, антиэндометриальных и

антитестикулярных антител у фертильных женщин и мужчин и установить интервалы значений аутоантител, свидетельствующие об аутоиммунном заболевании

Практические рекомендации

1 Рекомендовать гинекологам и андрологам для пациентов с подозрением на аутоиммунный оофорит, аутоиммунный орхит, на аутоиммунный синдром при эндометрите и эндометриозе включать в алгоритм лабораторных исследований количественное определение соответственно антиовариальных, антитестикулярных и антиэндометриальных антител

2 Рекомендовать включать количественные иммуноферментные методы определения антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител в комплекс клинико-лабораторных исследований иммунного статуса пациентов с нарушениями фертильности

3 Рекомендовать гинекологам и андрологам рассматривать величины антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных циркулирующих антител выше пороговых как диагностический критерий соответственно аутоиммунного оофорита, аутоиммунного синдрома при хроническом эндометрите и эндометриозе и аутоиммунного орхита

Список публикаций автора по теме диссертационного исследования:

Статьи в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, учебно-методические пособия:

1. Хохлов П.П. Применение эстрогенов и гестагенов при аутоиммунном оофорите. / К.А.Габелова, А.М.Гзгзян, М.Н.Богданова, В.В.Потин, П.П.Хохлов // Журнал акушерства и женских болезней,-2003.- Т.52.-№ 1. -С. 49-54.

2 Хохлов П П Иммунохимический метод количественного определения антител к эндометриальному антигену в сыворотке крови Пособие для

врачей / Е К Комаров, Е А Михнина, П П Хохлов // Под ред акад РАМН, проф Э К Айламазяна СПб Изд-во «Н-Л», 2007 25 с

3 Хохлов П П Иммунохимический метод количественного определения антител к антигенам стероид-продуцирующих клеток в сыворотке крови Пособие для врачей / В В Потин, А М Гзгзян, Т Г Иоселиани, П П Хохлов // Под ред акад РАМН, проф Э К Айламазяна СПб Изд-во «Н-Л», 2007 27 с

4 Хохлов П П Иммунохимический метод количественного определения антител к овариальному антигену в сыворотке крови Пособие для врачей / В В Потин, А М Гзгзян, Т Г Иоселиани, П П Хохлов // Под ред акад РАМН, проф Э К Айламазяна СПб Изд-во «Н-Л», 2007 7 с

5 Хохлов П П Иммунохимический метод количественного определения антител к тестикулярному антигену в сыворотке крови Пособие для врачей / В В Потин, А М Гзгзян, П П Хохлов // Под ред акад РАМН, проф Э К Айламазяна СПб Изд-во «Н-Л», 2007 7 с

Авторские свидетельства и патенты на изобретения:

6 Хохлов П П Способ получения конъюгата антител для иммуноферментного анализа / П П Хохлов и др , указанные в описании// А с № 1602195 приоритет от 5/08/1988

7 Хохлов П П Способ количественного определения концентрации антител, специфичных к антигенам стероид-продуцирующих клеток человека, в биологических жидкостях человека, содержащих специфические антитела / В В Потин, А М Гзгзян, П П Хохлов, Н В Ворохобина // Патент на изобретение № 2216742, приоритет от 11 01 2002

8 Хохлов П П Способ количественного определения концентрации антител, специфичных к антигену стромальных клеток эндометриальной ткани человека в биологических жидкостях человека, содержащих специфические антитела / Е А Михнина, Е А Комаров, П П Хохлов //

Патент на изобретение № 2303267 Приоритет от 8 06 2005г

Статьи, тезисы докладов и статей:

9 Хохлов П П Определение циркулирующих антиовариальных аутоантител в диагностике аутоиммунного оофорита / Т Г Иоселиани, П П Хохлов // Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщины Мат 26-й научн сессии, посвящ 100-летию каф акуш гинекол СПбГМУ им акад И П Павлова (ред акад Э К,Айламазян) - СПб - 1999 - С 201-204

10 Хохлов П П Распространенность аутоиммунного поражения тестикул у больных с различными формами мужского гипогонадизма /АЛ Ярных, П А Сильницкий, Н В Ворохобина, П П Хохлов, А М Гзгзян // «Актуальные проблемы современной эндокринологии» М-лы 4-го всеросс конгресса эндокринологов МЗ РФ РАМН, 1-5 июня 2001 г -СПб - 2001 - С 567

11 Хохлов П П Влияние комбинированного применения этинилэстрадиола и дезогестрела на течение аутоиммунного оофорита / К А Габелова, А М Гзгзян, В В Потин, П П Хохлов // «Актуальные вопросы акуш гинекол» М-лы научно-практич конф посвященной 70-летию НИЦ здоровья матери и ребенка - Ереван -2001 - С 71-72

12 Хохлов П П Гидролитические ферменты в терапии аутоиммунного оофорита / В В Потин, К А Габелова, А М Гзгзян, В В Рулев, П П Хохлов // Системная энзимотерапия (ред Репина М А , Кнорринг Г Ю) - СПб «Человек»-2002 - С 91-95

13 Хохлов ПП Иммуноферментный метод определения аутоантител к микросомальной фракции клеток Лейдига человека (тестикулярному антигену) для диагностики аутоиммунного орхита / АЛ Ярных, В Н Ворохобина, П П Хохлов, А М Гзгзян // М-лы 6-ой всеросс научн конференции с междун участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»

Мед иммунол-2002-Т 4-№ 2 - С 217-218

14 Хохлов П П Системная энзимотерапия аутоиммунного оофорита / К А Габелова, А М Гзгзян, В В Потин, П П Хохлов // Новые горизонты гинекологической эндокринологии Сб тезисов конф М 9-12 сент 2002 М - Б и -2002

15 Хохлов П П Иммунологические аспекты хронического воспаления эндометрия / Е А Михнина, Е К Комаров, П П Хохлов, В Н Эллиниди, О А Добротворцева, Н В Аникеева, Н М Калинина, Н И Давыдова // Мат 5-го Росс Форума «Мать и дитя» - М - 2003 - С 399-400

16 Хохлов П П Планирование беременности у женщин с невынашиванием в анамнезе и наличием аутоантител к белкам эндометрия /ТА Плужникова, Т Н Шляхтенко, Е А Алябьева, П П Хохлов // Сб м-лов 1-ой междисциплинарн конф по акуш, гинекол, неонат «Здоровая женщина-здоровый ребенок» - СПб - 2-4 ноября 2006 С 140-142

17 Хохлов П П Значение иммуноферментного определения аутоантител для диагностики заболеваний репродуктивной системы / П П Хохлов, Е А Михнина, Н М Калинина, Н И Давыдова, А М Гзгзян, Е К Комаров // М-лы 2-й Российской Конф «Иммунология репродукции теоретические и клинические аспекты» Russian J Immunol - 2007 - V 9 Suppl 4 - pp 144-145

Отпечатано в цифровом копировальном центре «Восстания-1» Печать лазерная Тираж 100 экз Подписано в печать 09 10 2007г Заказ №359

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Аутоиммунные синдромы сопровождают ряд заболеваний репродуктивной системы. С аутоиммунными синдромами связывают значительный процент случаев невынашивания беременности, бесплодия, других нарушений репродуктивной функции мужчин и женщин.

В настоящее время, согласно данным литературы, доля бесплодных браков в нашей стране достигает 15 %. Среди расстройств репродуктивной системы женщин важное место занимают нарушения функции яичников. Чаще других заболеваний отмечают синдром преждевременного «истощения» яичника и синдром поликистозных яичников. В ряду акушерских патологий значительный процент заболеваний женщин репродуктивного возраста составляет привычное невынашивание беременности [50]. К проблеме бесплодных браков относятся также вопросы репродуктивного здоровья мужчин.

Как известно, причиной бесплодия у женщин и мужчин нередко бывает аутоиммунное поражение гонад, которое встречается как самостоятельное заболевание [2, 17, 18], а также в форме аутоиммунного полиэндокринного синдрома [89, 90, 93]. К аутоиммунным заболеваниям относят хронический эндометрит и эндометриоз [6, 50]. Среди нарушений половой и эндокринной сфер мужчин важное место занимает аутоиммунный орхит [5, 19, 29, 73].

Одним из наиболее распространенных методически простых, быстрых и эффективных методов диагностики аутоиммунных заболеваний является определение циркулирующих в периферической крови орга-носпецифических аутоантител. Для диагностики широкого круга заболеваний существуют стандартизованные коммерческие наборы иммунореагентов для полуколичественного и количественного определения специфических аутоантител. Наиболее точными и чувствительными методами определения аутоантител справедливо считают радиоиммунный и иммуноферментный методы. Для диагностики органоспецифичных аутоиммунных заболеваний успешно применяют иммуноферментные тест-системы для определения аутоантител к тиреоглобулину, тиреоперокси-дазе, микросомальной фракции щитовидной железы, островковым клеткам поджелудочной железы, коллагену, эластину и т.д. [38, 66].

Использование определения аутоантител как рутинного метода лабораторной диагностики в практике гинекологии и андрологии носит более ограниченный характер. Это можно отчасти объяснить неполнотой данных об антигенности клеточных и тканевых структур репродуктивных органов [18, 176]. Отсутствие универсальных методов определения аутоантител приводит к большому расхождению данных, полученных в разных условиях, и затрудняет сравнительные исследования кон-тингентов больных.

Существует успешный опыт иммунодиагностики патологии репродукции. В частности в качестве метода диагностики аутоиммунного оофорита хорошо зарекомендовало себя определение аутоантител методом непрямой иммунофлюоресценции [105], есть попытки применения иммуноферментного анализа с использованием гомогенатов тканей в качестве антигенов-мишеней [172, 176,177].

Попытки выявить связь между наличием органоспецифических аутоантител и нарушениями фертильности согласно данным литературы многочисленны и неоднозначны. В источниках литературы описан широкий спектр молекул и клеточных и тканевых фракций, которые использовались в качестве антигенов для связывания циркулирующих аутоантител, при этом разные авторы использовали в диагностике антитела, направленные к различным аутоантигенам [193]. Из данных литературы следует, что диагностика различных аутоиммунных заболеваний репродуктивной сферы связана с обнаружением широкого спектра антигенов, к которым направлены специфические антитела.

Все вышесказанное определило актуальность разработки количественных методов определения антител к антигенам яичника, тканей эндометрия и тестикул для диагностики аутоиммунных заболеваний органов репродукции.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Разработать иммуноферментные методы для количественного определения оргаиоспецифичных аутоантител к антигенам яичника, тканей эндометрия и тестикул и оценить диагностическую значимость метода в выявлении аутоиммунных заболеваний органов репродукции.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определение антигенной активности фракций оргапов-мишеней и получение стандартизованных антигенов для иммуноферментного определения оргаиоспецифичных аутоантител.

2. Определение внутренних стандартов оргаиоспецифичных антиовари-альных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител.

3. Создание иммуноферментных диагностикумов на основе отобранных антигенов и откалиброванных антител.

4. Проведение оценки качества разработанных иммуноферментных диагностикумов.

5. Определение диагностической эффективности определения оргаиоспецифичных аутоантител разработанным иммуноферментным методом при аутоиммунных заболеваниях органов репродукции.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ В результате использования новых методов получения антигенов разработаны иммунохимические диагностикумы для количественного определения антител к овариальному, эндометриальному и тестику-лярному антигенам. Использование разработанных иммунохимиче-ских тест-систем позволило уточнить патогенез нарушений фертиль-ности у супружеских пар и повысить эффективность диагностики аутоиммунных заболеваний органов репродукции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ В результате исследования разработаны иммуноферментные диагностикумы для количественного определения органоспецифичпых анти-овариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител, которые применяются в диагностике аутоиммунных заболеваний органов репродукции. Применение количественного иммуноферментного метода определения органоспецифичных аутоантител к антигенам органов репродукции позволило определить нормальные уровни антител, свойственные фертильным женщинам и мужчинам. Превышение установленных в работе пороговых уровней циркулирующих органоспецифических аутоантител является лабораторно-диагностическим свидетельством соответственно аутоиммунного оофорита, аутоиммунного орхита и аутоиммунных реакций при хроническом эндометрите и эндометриозе. Результаты выявления антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител используются в практической деятельности врачей, занимающихся патологией репродукции и позволяют повысить рождаемость.

5. Выводы.

1. При аутоиммунных заболеваниях репродуктивной сферы наиболее часто встречаются аутоантитела, направленные к микросомальной фракции стероидогенных клеток гонад и микросомальной фракции стромальных клеток эндометрия.

2. Определение аутоантител к микросомальной фракции стероидогенных клеток гонад представляет собой достоверный критерий лабораторной диагностики аутоиммунных синдромов при оофоритах, орхитах и хроническом эндометрите и эндометриозе.

3. Созданные иммуноферментные тест-системы для определения аутоантител соответствует требованиям, предъявляемым к методам кли-нико-лабораторной диагностики специфичности, точности, воспроизводимости.

4. Предложенные методы ИФА-определения аутоиммунных антител при патологиях репродуктивной системы позволяют верифицировать характер аутоиммунных нарушений и осуществлять лабораторный мониторинг проводимой терапии.

4. Заключение.

Аутоиммунные синдромы сопровождают ряд заболеваний репродуктивной системы. С аутоиммунными синдромами связывают значительный процент случаев невынашивания беременности, бесплодия, других нарушений репродуктивной функции мужчин и женщин.

Попытки использования результатов определения аутоантител для диагностики нарушений фертильности согласно данным литературы многочисленны и разнообразны. В литературных источниках встречен широкий спектр молекул и клеточных и тканевых фракций, которые использовались в качестве антигенов для связывания циркулирующих аутоантител, при этом разные авторы использовали в диагностике антитела, направленные к различным аутоантигенам. На основании литературных данных следует сделать вывод о том, что исследования диагностики различных аутоиммунных заболеваний репродуктивной сферы были связаны с обнаружением широкого спектра антигенов, к которым направлены специфические антитела. Данные литературы подтверждают наличие корреляции между клиническими проявлениями заболевания и наличием аутоантител.

Проведенное нами исследование было направлено на выявление нарушения фертильности с помощью разработки методов лабораторной диагностики.

Первым этапом было выявление антигенов, к которым направлены аутоантитела путем дифференциального центрифугирования, обработки клеток ультразвуком и многократной процедуры «замораживания-оттаивания».

Проведенное исследование заключалось в выявлении антигенов, к которым направлены специфические антитела, при аутоиммунном оофорите, хроническом эндометрите с аутоиммунном синдромом у женщин и аутоиммунном орхите у мужчин.

Был предложен оригинальный способ выделения клеточных фракций и использование их в качестве антигенов. Лабораторный диагностический материал, взятый у женщин с нарушениями фертильности, был успешно использован в качестве источника для выделения овариального и эндометриального антигенов. Послеоперационный материал, полученный в результате хирургического вмешательства по изменению пола, был использован в качестве источника для выделения тестикулярного антигена.

В основе предложенного иммуноферментного метода определения аутоантител лежит оригинальный способ выделения клеточных фракций и их использование в качестве антигенов. На основе выделенных антигенов разработаны иммуноферментные диагностикумы, действующие по принципу непрямого ИФА антител по схеме: иммобилизация антигена на твердой фазе—^испытуемая сыворотка—>иммуноферментный конъюгат —^хромоген.

В работе показано, что для диагностики аутоиммунного оофорита действенным методом лабораторной диагностики является определение уровня антиовариальных антител, причем в качестве овариального антигена должна быть использована микросомальная фракция фолликулярных клеток.

Отсутствие стандартизованных контрольных препаратов антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител заставило прибегнуть к применению внутренних стандартов на основе использования сывороток женщин и мужчин с нарушениями фертильности и фертильных женщин и мужчин и введению условной единицы концентрации специфических антител.

Чувствительность разработанного иммуноферментного метода определения антиовариальных антител составила 16-20 нг/мл специфических антител. Уровень неспецифических реакций с иммуноглобулинами не превышал 6,5 %, а неспецифических антигенов с аутоантителами - 8 %. Анализ рассеяния измерений между пробами составил CV=13,1 %.

Измерение уровня антиовариальных антител у группы здоровых фертильных женщин показало, что средняя величина уровня антител составила 209 Е/мл, а значение 260 Е/мл нужно считать пороговым при постановке диагноза. У пациенток с аутоиммунным оофоритом уровень антиовариальных антител находился в интервале от 350 до 3000 Е/мл, среднее значение составило 732±13,0 Е/мл.

Чувствительность иммуноферментного метода определения анти-эндометриальных антител составила 20-25 нг/мл специфических антител. Уровень неспецифических реакций с иммуноглобулинами составил 7,2 %, аутоантител с неспецифическими антигенами - 7,9 %. Рассеяние измерений между пробами составило 14,2 %.

Для антиэндометриальных антител выделено два пороговых значения соответственно 210 и 265 Е/мл. Превышение нижнего значение указывает на возможность, а превышение верхнего - на высокую вероятность аутоиммунного заболевания. При уровне аутоантител между верхним и нижним значениями желательна дополнительная лабораторная диагностика, в частности определение субпопуляций лимфоцитов.

Для диагностики аутоиммунного орхита эффективно количественное определение антитестикулярных антител, при этом в качестве тести-кулярного антигена применяется микросомальная фракция клеток Лейдига.

Чувствительность определения антитестикулярных антител составила 18-24 нг/мл специфических антител. Уровень реакций с неспецифическими иммуноглобулинами составил 8,5 %, неспецифических антигенов с аутоантителами - 9,0 %. Рассеяние результатов между пробами составило 13,8 %. Как показало обследование контингента здоровых мужчин, пороговое значение антитестикулярных антител соответствует 310 Е/мл Среднее значение уровня тестикулярных антител у больных с аутоиммунных орхитом составило 738,7±47,1 Е/мл.

Измерение антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител, проведенное на контингенте пациентов с нарушениями фертильности на базе научно-поликлинического отделения НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН, с позиций доказательной медицины подтвердило необходимость включения таких измерений в стандартный комплекс лабораторных методов, используемых при установлении причин нарушения фертильности у женщин и мужчин.

В качестве итога проведенного исследования можно сформулировать следующие практические рекомендации:

1. Рекомендовать гинекологам и андрологам для пациентов с подозрением на аутоиммунный оофорит, аутоиммунный орхит, на аутоиммунный синдром при эндометрите и эндометриозе включать в алгоритм лабораторных исследований количественное определение соответственно антиовариальных, антитестикулярных и антиэндометриальных антител.

2. Рекомендовать включать количественные иммунофермент-ные методы определения антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных антител в комплекс клинико-лабораторных исследований иммунного статуса пациентов с нарушениями фертильности.

3. Рекомендовать гинекологам и андрологам рассматривать величины антиовариальных, антиэндометриальных и антитестикулярных циркулирующих антител выше пороговых как диагностический критерий соответственно аутоиммунного оофорита, аутоиммунного синдрома при хроническом эндометрите и эндометриозе и аутоиммунного орхита.