Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Количественное моделирование связи между старением, стрессом и смертностью в популяциях лабораторных животных

На правах рукописи

СЕМЕНЧЕНКО Анна Валентиновна

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СВЯЗИ МЕЖДУ СТАРЕНИЕМ, СТРЕССОМ И СМЕРТНОСТЬЮ В ПОПУЛЯЦИЯХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

14.00.53 — геронтология и гериатрия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург — 2004

Работа выполнена в лаборатории развития статистических методов Института демографических исследований Общества Макса Планка (г. Росток, Германия) и лаборатории онкогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Анисимов Владимир Николаевич

Консультант:

доктор физико-математических наук, профессор Яшин Анатолий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Сафарова Гаянэ Левоновна доктор биологических наук, профессор Воробцова Ирина Евгеньевна

Ведущее научное учреждение:

Институт физиологии имени И.П. Павлова РАН

Защита диссертации состоится "_"_2004 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу 197110, Санкт-Петербург, просп. Динамо, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Автореферат разослан "___"_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Л. С. Козина

Общая характеристика работы Актуальность темы исследования

Непрерывное увеличение продолжительности жизни в экономически развитых странах является одной из причин увеличения доли пожилых в общей численности населения [Оерреп, Vaupel,

2002]. Это привело к увеличению общественного и научного интереса к проблемам теоретической и экспериментальной геронтологии [На^ск, 2000; Kirkwood, Austad, 2000; Анисимов,

2003].

Ряд вопросов о механизмах старения и выживания в различных условиях, например, под действием стрессорных нагрузок и/или фармакологических препаратов, можно исследовать, только проводя эксперименты на животных. Значение лабораторных животных, особенно мышей, круглых червей и плодовых мушек, как модельных систем для изучения старения и болезней у людей, а также для разработки терапевтических подходов к их лечению было подчеркнуто в недавних публикациях [Carey, 2003; Heltand, 2002; Johnson et al., 2000, 200].

Ряд стрессорных воздействий приводит к увеличению продолжительности жизни. Это явление получило название гормезис долгожительства. Несмотря на многочисленные экспериментальные подтверждения этого явления [Masoro, 1998, 2000; Verbeke et al., 2000; Calabrese, Baldwin, 2001], механизмы его возникновения изучены недостаточно [Neafsey, 1990; Minois, 2000; Rattan, 2000]. Исследование влияния фармакологических препаратов, увеличивающих продолжительность жизни (геропротекторов), вместе с тем оказывающих нормализующее воздействие на возрастные гормонально-метаболические и иммунологические изменения в организме, является одним из актуальных направлений в геронтологических исследованиях. К наиболее перспективным геропротекторам относят пептидный препарат мелатонин и пептид эпиталон, регулирующий функцию эпифиза [Анисимов, 2003; Хавинсон, 2002]. При этом количественные аспекты герметических и геропротекторных свойств стрессорных и фармакологических воздействий, проявляющиеся в изменениях популяционных характеристик выживаемости в различных возрастах, еще недостаточно изучены.

С ростом научного интереса к проблемам экспериментальной геронтологии появилось большое количество новых экспериментальных данных, для детального и глубокого анализа которых необходимо развитие методов, позволяющих связывать наблюдаемые в исследованиях характеристики. Актуальным и перспективным является развитие математических и компьютерных моделей в геронтологии [Новосельцев и др., 2003; Butov et al., 2001; Yashin et al., 2001, 2002; Mlchalski et al., 2001].

Стохастическая модель гормезиса [Yakovlev et al., 1993] и стохастическая модель стресса [Butov et al., 2001] основаны на предположениях о том, что основополагающим событием процесса старения является образование межклеточных повреждений, которые потенциально смертельны, но подвергаются ревизии и исправлению, благодаря репарационному процессу, инициированному стрессорным воздействием. Адаптационная модель стресса [Yashin et al., 2001] описывает зависимость вероятности гибели от некоторого физиологического показателя, изменения которого характеризуют гомеостатическую систему, вовлеченную в ответ организма на стрессорное воздействие. Однако, эти модели не учитывают гетерогенность наблюдаемых популяций. Первая работа по изучению стрессорного воздействия, принимающая во внимание популяционную неоднородность, тем не менее, не учитывает неоднородность реакции на

tfS-APOJ.

РОС.

НАЦИОНАЛЬНА* i БИБЛИОТЕКА j СП 09

да«

примененное воздействие [Michalski et al., 2001]. Кроме того, в основе этой модели лежат предположения о параметрической форме зависимости риска смерти от возраста, биологическое обоснование которых подвергается критике на протяжении уже нескольких десятилетий (Driver, 2001; Economos, 1979-1985; Piantanelli et al., 1986; Sacher, 1966; Witten, 1983-1988]. Изменения гетерогенности в популяциях лабораторных животных под действием стрессорного воздействия впервые были исследованы в предположении существования в популяции дискретных классов индивидов, различной подверженности смерти (сильных, нормальных и слабых) [Yashin et al., 2002]. Такая классификация идеализирует реальную ситуацию, однако, позволяет воспроизвести широкий спектр наблюдаемых паттернов кривых дожития.

Необходимо развитие моделей и методов анализа экспериментальных данных, которые позволяют избегать биологически необоснованных предположений, а также учитывают влияние условий эксперимента одновременно на риск смерти и гетерогенность наблюдаемых популяций. В связи с этим тема настоящей работы является актуальной.

Цель исследования

Настоящая диссертационная работа ставит целью развить существующие количественные модели и методы исследования характеристик выживаемости неоднородных популяций лабораторных животных в различных условиях проведения эксперимента. Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач:

1. Разработать количественные модели и методы анализа данных о смертности в неоднородных популяциях, позволяющие оценивать влияние изменения условий существования.

2. Разработать соответствующее программное обеспечение, позволяющее применять созданные модели и методы для статистического анализа экспериментальных данных.

3. Используя разработанные модели и методы анализа данных, изучить (а) влияние различных стрессоров (физиологического раствора, световой депривации, постоянного освещения) и геропротекторов (мелатонин, эпиталон) на выживаемость самок трансгенных мышей HER-2/neu; (б) влияние теплового шока различной продолжительности на выживаемость нематод Caenorhabditis elegans; (в) влияние содержания в условиях низкой относительной влажности и голодания различной продолжительности на выживаемость плодовых мушек Drosophila melanogaster различных возрастов; (г) влияние продолжительности неактивной жизни на выживаемость средиземноморских плодовых мушек Ceratitis capitata.

Научная новизна

Впервые развиты и апробированы модели и методы количественного анализа смертности в гетерогенных популяциях при воздействии стрессовых и фармакологических факторов, пригодные для анализа результатов геронтологических экспериментов и оценки риска развития возрастной патологии.

Впервые полупараметрическая модель смертности в гетерогенных популяциях применена для изучения влияния различных геропротекторов и стрессорных воздействий различной ин-

тенсивности на выживаемость трансгенных мышей HER-2/neu, нематод Caenorhabditis elegans, плодовых мушек Drosophila melanogaster; влияния продолжительности неактивной жизни на выживаемость средиземноморских плодовых мушек Ceratitis capitata.

Научно-практическая ценность работы

В работе теоретически обоснована количественная зависимость выживаемости от изменений базового риска смерти и характеристик гетерогенности популяции, происходящих под влиянием внешних воздействий. Практическая ценность работы состоит в том, что подобные модели и методы применимы для анализа экспериментальных данных, полученных на лабораторных животных. Они позволяют корректно интерпретировать результаты проведенных экспериментов и адекватно планировать новые, направленные на изучение механизмов действия пептидов, позволяющих предупреждать преждевременное старение и увеличивать активное долголетие. Предложенные модели и методы применимы также для оценки эффективности мер профилактики и лечения заболеваний, сцепленных со старением, в популяциях людей.

Положения выносимые на защиту

1. Разработаны и доведены до программной реализации методы анализа популяционных данных, основанные на применении модели смертности в гетерогенной популяции, позволяющие исследовать динамику выживаемости популяций лабораторных животных с учетом популяционной неоднородности в различных условиях проведения эксперимента.

2. С использованием этих методов получены оценки: (а) меры популяционной неоднородности и базового риска смерти в группах самок трансгенных мышей HER-2/neu под влиянием стрессоров (физиологического раствора, световой депривации, постоянного освещения) и геропротекторов (мелатонин, эпиталон); (б) меры популяционной неоднородности и базового риска смерти в группах нематод Caenorhabditis elegans под, влиянием теплового шока различной продолжительности; (в) меры популяционной неоднородности и базового риска смерти в группах плодовых мушек Drosophila melanogaster, подвергшихся содержанию в условиях низкой относительной влажности и голоданию различной продолжительности в различных возрастах; (г) меры популяционной неоднородности и базового риска смерти в группах средиземноморских плодовых мушек Ceratitis capitata с различной продолжительностью неактивной жизни.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Апробация работы

Работа поддержана стипендией Института демографических исследований Общества Макса Планка. Результаты работы доложены и обсуждены на объединенной научной конференции

Отдела канцерогенеза и онкогеронталогии, лаборатории эндокринологии, лаборатории онкоэко-логии и патологоанатомической лаборатории НИИ онкологии им. проф. Н Н. Петрова МЗ РФ, лаборатории онкогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН 29 июня 2004 г. на Всероссийской конференции с международным участием "Ней-роэндокринология 2003" (г. Санкт-Петербург, Россия, 23-25 сентября 2003 г), на международном семинаре "Вероятность, моделирование и статистика в здравоохранении" (Университет Виктора Сегалена Бордо 2, г. Бордо, Франция, 22-23 сентября 2003 г), на втором международном симпозиуме "Проблемы ритмов в естествознании" (г. Москва, Россия, 1-3 марта 2004 г.), на ежегодном заседании Популяционной ассоциации Америки (г. Бостон, США, 1-3 апреля 2004 г), на международной конференции "Долгожительство, старение и модели деградации в теории надежности, здравоохранении, медицине и биологии" (г. Санкт-Петербург, Россия, 7-Ю июня 2004 г), на международной конференции "Статистика в здравоохранении" (г Нант, Франция, 23-25 июня 2004 г.) на семинарах в Лаборатории выживаемости и долгожительства и Лаборатории развития статистических методов Института демографических исследований Общества Макса Планка (г. Росток, Германия)

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения, выводов и приложения, содержащего программный код для применения предложенных моделей и методов. Объем работы составляет 122 страницы Список литературы содержит 42 отечественных и 115 зарубежных источников Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 16 рисунками

Содержание работы

Материалы и методы исследования

В работе использованы данные опытов с 288 самками трансгенных мышей FVB/N, несущих ген рака молочной железы HER-2/neu (отдел канцерогенеза и онкогеронтологии НИИ онкологии им. проф. Н Н. Петрова МЗ РФ), 952 нематодами Caenorhabditis elegans линии TJ1060, spe-9, fer-15 (Institute Fr Behavioral Genetics, Boulder, USA), 100000 самцов плодовых мушек Drosophila melanogaster линии RI21 (University ol Minnesota, St Paul, USA), 203 самцами средиземноморских плодовых мушек Ceratttis capitata (Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece).

В опытах с мышами животные содержались в полипропиленовых клетках по 5-7 животных при стандартном режиме дня и ночи (12/12 часов, кроме опытов со световым режимом) при температуре 22±2 °С, получали стандартный лабораторный корм и питьевую воду ad libitum. Курсовое применение препаратов осуществлялось раз в месяц на протяжении 5 дней, постоянное — 5 дней в неделю на протяжении жизни. Животным вводили физиологический раствор (ФР) 0,1 мл (0,9% NaCl), эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly) 1.0 мкг в 0,1 мл ФР, мелатонин (Sigma, США). В возрасте 2-х месяцев мыши HER-2/neu были рандомизированно разделены на 11 групп, 10 из них подвергались воздействиям различных стрессоров или геропротекторов, груп-

па интактных мышей служила контролем. Мышам 1-й и 2-й групл вводился ФР курсами или постоянно, соответственно. Мышам 3-й и 4-й групп вводился курсами или постоянно эпиталон [Anisimov et al., 2002]. 5-я и 6-я группы получали мелатонин курсами или постоянно в дозе 20 мг/л в ночное время (с 18:00 по 09.00 часов) с питьевой водой [Алимова, 2002]. Мыши 7-й группы подверглись хирургической световой депривации [Anisimov et al., 1994]. 8-я и 9-я группы мышей содержались в условиях постоянного освещения (ПО) 300 люкс или 2500 люкс. Мыши 10-й группы содержались при постоянном освещении (300 люкс) и постоянно получали мелатонин (20 мг/л) с питьевой водой [Батурин, 2003].

Нематоды линии TJ1060 (spe-9;fer-15) содержались в питательной среде при температуре 25,5°С в течение трех дней, в результате чего стали стерильными, но фенотипически сохранили нее свойства взрослых червей дикого типа. В возрасте трех дней нематоды были разделены на 6 групп, 5 из которых подверглись температурному шоку 35°С в течение 1, 2, 4, 6 и 8 часов. Немедленно после температурного шока нематодам был предоставлен покой в течение 24 часов при температуре 20°С в питательной среде. При этой температуре они содержались до конца эксперимента. Начиная с 4-го дня, ежедневно подсчитывалось число живых и мертвых нематод во всех группах [Michalski et al., 2001].

В опытах на девственных самцах плодовой мушки Drosophila melanogaster высоко инбред-ной линии RI21 было изучено влияние голодания и содержания в условиях низкой относительной влажности на смертность и продолжительность жизни. Мушки подверглись воздействию в возрасте 15 или 35 дней, причем его продолжительность была такова, что во время воздействия погибло 0%, 20%, 50% и 70% популяции. Для этого мушки в возрасте 15 дней подвергались воздействию в течение 5, 12, 20 и 26 часов, а в возрасте 35 дней — в течение 3, 8, 16 и 20 часов. На это время питание полностью прекращалось, мушки помещались в инкубатор с низкой относительной влажностью (40-50%). По завершении воздействия подсчитывалось количество павших мушек. Оставшиеся в живых получали полноценное питание и содержались при относительной влажности 60-70% до конца жизни. Дополнительно велось наблюдение за контрольной группой. Подсчет живых и павших мушек производился ежедневно.

Самцы средиземноморской плодовой мушки Ceratitis capitata в возрасте 1-го дня помещались в прозрачную пластиковую клетку со взрослым кормом (смесь белков и сахара) и водой, содержались в течение жизни при температуре 25±2°С, относительной влажности 65±5% и световом режиме 14:10 с началом фотофазы в 06.00. Бездеятельное поведение (временное положение навзничь) регистрировалось для каждой мушки с 10 минутным интервалом в течение 2-часового периода (с 12:00 до 14:00) ежедневно. Таким образом, количество баллов бездеятельности (зарегистрированного бездеятельного поведения) для каждой мушки находится в интервале от 0 до 12 [Papadopoulos et al., 2002].

Для каждой экспериментальной группы, включая контрольные группы, были рассчитаны непараметрические оценки Каплана-Майера условных функций дожития (Kalblleisch, Prentice, 1980; Kaplan, Meier, 1958). Для проверки гипотезы о том, что стрессорное воздействие или фармакологический препарат не повлияли на выживаемость в исследуемой популяции, был использован лог-ранк тест [Сох, Oakes, 1988]. Оценка параметров моделей проводилась методом максимального правдоподобия с использованием нелинейной оптимизационной процедуры [Fletcher, 1987]. Для интервального оценивания параметров моделей использовался "бутстрап"-метод [Davison, Hinkley, 1988]. Для определения модели, наилучшим образом соответству-

ющей экспериментальным данным, использовались тест отношения функций правдоподобия [Михальский, 2002] и информационный критерий Акаике [Akaike, 1973; Sakamoto et al., 1986].

Результаты и обсуждение

Полупараметрическая модель смертности в гетерогенной популяции

В однородных популяциях риск смерти одинаков для всех индивидов данного возраста. Предположение о гетерогенности (неоднородности) популяции означает, что популяция состоит из индивидов с различной уязвимостью (подверженностью смерти). Под уязвимостью будем понимать обобщенную индивидуальную характеристику, влияющую на риск смерти. Во всех опытах регистрировалась продолжительность жизни лабораторных животных, однако индивидуальная уязвимость не всегда может быть определена и измерена. Модель смертности в гетерогенной популяции [Vaupel et a!., 1979] позволяет учитывать скрытую неоднородность популяции при анализе данных о выживаемости, благодаря предположению о вероятностном распределении в популяции ненаблюдаемой случайной величины — уязвимости.

Пусть Т и // суть продолжительность жизни и уязвимость, такие, что условный риск смерти индивида при условии уязвимости равен .где — базовый риск смерти Под базовым риском смерти понимается риск смерти индивида, уязвимость которого равна 1. Предполагается, что случайная величина имеет гамма распределение со средним значением 1 и дисперсией сгг Это означает, что средняя уязвимость в популяции равна 1, а мера рассеивания — отклонения от среднего значения — <т2. Чем больше значение дисперсии, тем более гетерогенна популяция, т.е. она содержит индивидов, уязвимость которых намного отклоняется от среднего значения как в сторону больших, так и меньших значений.

Пусть II (я) = $ро (и) <1и — кумулятивный базовый риск смерти. Тогда наблюдаемая смерт-_ о

ность с учетом различной уязвимости индивидов может быть представлена в виде:

(1)

а безусловная (наблюдаемая) функция дожития 5 (ж) имеет вид:

(2)

При о2 = 0 и а7 0, = ^(х) в (!)• а S{x) ехр(-Я (.т)) в (2), что соответствует риску смерти и выживаемости в однородной популяции.

В дальнейших вычислениях использована методология, предложенная А.И. Яшиным [Yashin et al., 1996]. Рассматриваются две одинаковые гетерогенные популяции, шансы выживания в которых соответствуют модели пропорционального риска (1-2), и предполагается, что исходные значения уязвимости имеют гамма распределения. Одна популяция — контрольная — содержится в стандартных условиях, без каких-либо воздействий, в то время как вторая — подопытная — подвергается некоторому воздействию. Предполагается, что базовый риск смерти и распределение уязвимости в подопытной группе изменяются под влиянием примененного воздействия. Благотворное влияние воздействия может быть связано с уменьшением базового

риска смерти, а пагубное — с его увеличением. Изменения базового риска смерти могут как сохраняться в течение последующей жизни, так и ослабевать или усиливаться с возрастом. Изменения базового риска смерти характеризуют изменения интенсивности возникновения повреждений, обусловленных предложенным воздействием [Michalski et al., 2001]. Благотворное влияние предложенного воздействия может быть обусловлено также тем, что популяция в среднем стала менее уязвимой, т.е. индивидуальные свойства каждого представителя популяции в равной мере улучшились, что снизило их подверженность смерти. При пагубном влиянии воздействия все индивиды в популяции стали более уязвимыми. Однако, влияние воздействия может быть различным на представителей неоднородной популяции. Более сильные индивиды после предложенного воздействия могут стать еще более сильными, а слабые особи могут стать еще более слабыми, в результате этого популяция станет более гетерогенной, чем была до применения воздействия. Если же предложенное воздействие благотворно влияет на слабых индивидов, но пагубно на сильных, то популяция станет более гомогенной. Изменения индивидуальной уязвимости характеризуют возможности организма включать новые защитные или репарационные функции для противодействия или устранения повреждений, вызванных предложенным воздействием [Yashin et al., 2002].

В работе получено полупара метрическое представление функции дожития в подопытной группе, учитывающее изменения в базовом риске смерти и распределении уязвимости:

В представлении (3) используется наблюдаемая функция дожития в контрольной группе. В качестве .S'i (j.) возможно использование непараметрической оценки Каплана-Майера [Kaplan, Meier, 1958] функции дожития в контрольной группе или ее приближения непрерывными гладкими функциями [Thatcher et al., 1998].

Модель (3) имеет четыре параметра характеризующих влияние предложенного

воздействия на базовый риск смерти и распределение уязвимости в подопытной группе, а также параметр cJ, характеризующий скрытую гетерогенность контрольной группы.

Параметр — дисперсия распределения уязвимости в контрольной группе. Параметр

указывает на увеличение или уменьшение базового риска смерти, в зависимости от того а > О или а < 0, соответственно. Параметр ß характеризует усиление или ослабление изменений базового риска смерти с возрастом, в соответствии с тем ß > 0 или ß < 0. Параметр т > О указывает на изменение среднего значения распределения уязвимости в подопытной группе по сравнению с контрольной. Если < 1, то произошло уменьшение средней уязвимости, а если > 1, то популяция стала в среднем более уязвима. Параметр > 0 отражает увеличение

> 1) или уменьшение < 1) дисперсии уязвимости, что характеризует уменьшение или увеличение гетерогенности популяции.

На рисунке 1 графически представлены зависимости характеристик выживаемости от изменений базового риска смерти и параметров распределения уязвимости. Изменения базового риска смерти не оказывают влияния на "хвост" функции дожития (рис. la-в), за исключением увеличения базового риска, растущего с возрастом (рис. 1г). Параллельный сдвиг кривых дожития происходит при изменении средней уязвимости (рис. 1д-е). Изменение гетерогенности популяции влияет на изменение "хвоста" функции дожития (рис. 1ж-з).

н

«к

а

.-"¿/у

•*•*** // / — контроль ]

/ / «>0015

У' , 1 - - а-0 01

• | -- «*0005

о»-000в I

-«х»-0009 |

150 200

возраст

1О0 1 30 200

возраст

\ — контроль -- (=1 • - 1-2 -->=3

\ \ \ \

УМ1НЫ1ММИ( » бамаого риска \ с иар*стом о""®01 0»*0054

умличаиие бааоаого риск« V с возрастом 0*4-001 р»+ 011

г

возраст

50 100 150 200 250

возраст

в 13

I

Л 1

&

I

V 15

I — контроль •• гшОЛ • » г=08 -- г*€Я - - Г «1.3 г-2 — г»25

\ о

/ 'X / ''"■--л-хС^:--

9 0.5 1 1.5 2 2 6 уязвимость а »в 4

« 1 —■• контроль 7=01 -"ГОЛ -- у-0.7 - ♦ -р13 -у19

•

,7/ * Ф » »--ц г*.» ?«- * ^ 1|и «

«—> контроль -- (И -. м -- «»з

**» *

■ ■ \У \ умвнымнна ' у » ' средней уяаанмоети » \»» ,И у 1 |

средней уямимостм г»1* 51

е

&0 100 150 200 250 300

возраст

I"

— контроль

-- »и

- • ¡«2

уаеличани*

дисмрсии уяааимости

1 г1*м

уманшаниа • диспарсмм ртиаимости

34

3

уязвимость

возраст

Рис. 1: Зависимость характеристик выживаемости от изменений базового риска смерти и параметров распределения уязвимости

В геронтологических исследованиях часто используется модель Гомпертца [Gompertz, 1825], параметры которой интерпретируются как начальная смертность и скорость популяционного старения. Однако, такая интерпретация не подкреплена строгими биологическими обоснованиями [Driver, 2001; Vaupel, Yashin, 1987; Yashin et al., 2002]. В частности, только однородные, инбредные популяции, обитающие в хорошо контролируемых условиях, будут умирать, согласно распределению Гомпертца. Генетически разнородные популяции, популяции в неоднородной среде, или подверженные воздействию токсичных агентов, будут отклоняться от этого закона [Economos, 1985; Sacher, 1966; Vaupel et al., 1979].

Попытки исследовать выживаемость под влиянием сильных или хронических токсических воздействий [Boxenbaum, 1991; Boxenbaum et al., 1986, 1988; Neafsey et al., 1988, 1989] — это по сути попытки описать отклонение риска смерти от кривой Гомпертца, предполагая, что в отсутствие воздействий закон Гомпертца для популяционной смертности выполняется.

Дальнейшее развитие исследований выживаемости под действием стрессорных воздействий с использованием математических моделей [Butov et al., 2001; Yakovlev et al., 1993; Yashin et al., 2001] помогло связать биологические и физиологические механизмы, инициированные воздействием, со смертностью в популяции. Однако, эти модели не учитывают неоднородности реакции на предложенное воздействие.

Применение моделей пропорционального риска [Сох, 1972], широко используемых при анализе данных медико-биологических исследований, предполагает наблюдение ковариат, которые оказывают влияние на продолжительность жизни. В самом простом случае, когда такой ко-вариатой является сам факт применения стрессорного или фармакологического воздействия, эти модели позволяют оценить относительный риск смерти в подопытной группе по сравнению с контрольной В случае ненаблюдаемых факторов, влияющих на выживаемость, применение моделей смертности в гетерогенных популяциях [Vaupel et al., 1979] становится более предпочтительным. Однако, этот подход требует дополнительных предположений о параметрической форме базового риска смерти [Michalski et al., 2001], которые также биологически необосно-ваны из-за невозможности его наблюдать. Это приводит к неидентифицируемости модели, в том смысле, что оценки меры популяционной неоднородности зависят от выбора параметрической формы базового риска смерти. Полупараметрическое представление модели, которое использутся в настоящей работе, позволяет избежать такой неидентифицируемости. Более того, оценив меру гетерогенности контрольной группы, можно оценить базовый риск смерти и соответствующую ему функцию дожития.

Главным отличием предложенной модели от других моделей смертности в гетерогенных популяциях с гамма распределенной уязвимостью [Klein, 1992; Michalski et al., 2001; Nielsen et al., 1992; Vaupel et al., 1979] является возможность оценить влияние предложенного воздействия одновременно на базовый риск смерти и на распределение уязвимости в популяции.

Изменения в распределении уязвимости в популяциях лабораторных животных под действием стрессорного воздействия впервые были исследованы при помощи модели дискретных классов уязвимости [Yashin et al., 2002]. Модель основана на предположении неоднородности популяции, а именно, на том, что она состоит из трех субпопуляций индивидов: слабых, нормальных и сильных. Под действием стрессора принадлежность индивида к тому или иному калссу может изменяться. При пагубном влиянии воздействия сильные индивиды становятся нормальными, нормальные слабыми, слабые умирают. Эффект гормезиса обусловлен тем, что

слабые индивиды под действием стрессора могут окрепнуть и перейти в категорию нормальных, а нормальные могут стать сильными Часто наблюдаемый эффект неполного гормезиса, при котором происходит пересечение кривых дожития, обусловлен тем, что некоторые индивиды из категории нормальных могут стать слабыми, в то время как другие пополнят субпопуляцию сильных. Эта идея легла в основу изменений распределения уязвимости популяции под влиянием стрессорного воздействия, включенных в полупараметрическую модель смертности в гетерогенных популяциях. Ее развитие состоит в замене дискретных классов непрерывным распределением уязвимости, что представляется более реалистичным.

Различные спецификации полупараметрической модели смертности в гетерогенной популяции могут быть получены при фиксированных значениях одного или нескольких параметров на уровне контрольной группы. Таким образом, можно рассматривать различные гипотезы о влиянии предложенного воздействия на гетерогенную популяцию, а затем сравнивать их при помощи статистических тестов.

В настоящей работе было рассмотрено три спецификации модели для каждого набора экспериментальных данных. Первая спецификация основана на предположении, что выживаемость в подопытной группе под влиянием предложенного воздействия обусловлена изменением среднего значения распределения уязвимости. Вторая учитывает эффекты изменения базового риска смерти, в дополнение к изменениям средней уязвимости. В третьей спецификации модели изменения гетерогенности популяции сопровождают изменения средней уязвимости индивидов и базового риска смерти Оценка параметров проводилась одновременно для всех подопытных групп каждого эксперимента, для того чтобы оценить дисперсию распределения уязвимости в конторльной группе

Опыты с трансгенными мышами ИЕК-2/пеи.

Сведения о продолжительности жизни (ПЖ) самок мышей ИЕЯ-2/пеи, а также достоверность различий в функциях дожития под влиянием различных стресоров и геропротекторов приведены в таблице 1. К данным экспериментов полупараметрическая модель смертности в гетерогенной популяции была применена в предположении, что все возможные изменения в базовом риске смерти и индивидуальных уязвимостях произошли на временном интервале от 60 дней (2 месяца) до 150 дней, что позволяет использовать условные функции дожития при условии дожить до 150 дней.

Из рассмотренных спецификаций модели, согласно тесту отношения функций правдоподобия, наилучшим образом экспериментальным данным соответствует модель, основанная на предположении, что предложенное воздействие влияет одновременно на базовый риск смерти и на оба параметра распределения уязвимости (р < 0,01). Оценки параметров этой спецификации модели указаны в таблице 2. Полученная характеристика дисперсии уязвимости в контрольной группе трансгенных мышей (параметр в табл. 2) позволяет оценить условный базовый риск смерти и соответствующую ему функцию дожития, которая представлена на рисунке 2. Увеличение "хвоста" наблюдаемой кривой дожития обусловлено гетерогенностью контрольной популяции. Эмпирические и соответствующие им модельные условные функции дожития представлены на рисунке 3.

Курсовое введение ФР оказало герметический эффект на долгожительство мышей (табл 1, рис. За) по сравнению с контрольной группой. Этот эффект обусловлен уменьшением средней

Таблица 1: Сведения о влиянии различных стрессоров и геропротекторов на ПЖ самок мышей HER-2/neu_

К-во СПЖ мПЖ МПЖ СПЖ 10% V

ИК 30 281 ±8,1 223 391 372±11,6

ФР курс 29 309±10,4* 224 431 406±12,7* 0,023

ФР пост. 24 289±9,3 190 360 350±10,0" 0,606

ЭТ курс 25 271±8,5 180 376 347±14,4 0,356

ЭТ пост. 24 328±6,6* 290 410 395±15,0 0,002

МЛТ курс 27 271±7,9 212 376 354±20,2 0,335

МЛТ пост. 22 244±9,4" 165 327 314±13,5" 0,005

световая депривация 24 321±11,5* 230 473 452±21,0* 0,008

ПО 300 люкс 28 320±16,0* 198 657 494±81,7* 0,009

ПО 2500 люкс 28 361±24,2* 260 737 676±55,4' 0,001

ПО 300 люкс & МЛТ пост. 27 288±1!,4 174 397 395±1,0* 0,063

ИК - интактный контроль, ФР - физиологический раствор, ЭТ - эпиталон. МЛТ - мелатонин, ПО -постоянное освещение, сПж -средняя ПЖ, мПЖ- минимальная ПЖ, МПЖ - максимальная ПЖ, СПЖ 10% - СПЖ последних 10% мышей, р - достоверность различий в выживаемости (лог-ранк тест), * достоверное увеличение (р<0,01), •* достоверное уменьшение (р<0,01).

Таблица 2: Оценки параметров полупараметрической модели смертности в гетерогенных популяциях для групп трансгенных мышей HER-2/neu, подвергшихся воздействию различных стрессоров и геропротекторов

а х Ю-3 /3 х 10"3 г х 10-' 7

ФР курс 0,31 (0,28, 0,32) 1,4 (1,3, 1,5) 3,5 (2,9. 4,1) 0,93 (0,92, 0,94)

ФР пост 4,2 (3.9. 4,6) 31 (28, 35) 0,6 (0,4, 0.8) 1,01 (1.01, 1,02)

ЭТ курс 2,9е-8 (2е-8, Зе-8) 101 (77, 121) 11.4 (11,2, 11,5) 0,95 (0,94, 0.96)

ЭТ пост. -34,5 (-40, -30) -1.6 (-1.8, -1,4) 4 (3, 5) 1,01 (1.0!, 1,02)

МЛТ курс -70,1 (-82, -57) -63 (-71, -54) 9,58 (9,5, 9,6) 0,95 (0,94, 0,96)

МЛТ пост. 1,5 (1,4е, 1,7) -28 (-30, -26) 18(17.21) 0,56 (0,53, 0,58)

световая депрнвания -14 (-15, -13) -16 (-18, -15) 3,7 (2,9, 4,9) 1,65 (1.58, 1.71)

ПО 300 люкс -0,2 (-0,23, -0.17) -49 (-54; -45) 4,1 (3,3, 5,1) 2,2 (1,91, 2.35)

ПО 2500 люкс -480 (-512, -455) -30 (-35, -31) 0,23 (0,22,0.27) 8,2 (7,7, 8,5)

ПО 300 л. & МЛТ пост. -1,2 (-1,3, -1,1) -4529 (-4892, -4217) 8,3 (8.1. 8.4) 1,97 (1,85. 2.17)

а1 =0,39 (0.37; 0,41) для всех групп

ФР - физиологический раствор, ЭТ - эпиталон, МЛТ - мелатонин, ПО - постоянное освещение.

уязвимости (табл. 2). При постоянном введении благоприятный эффект нивелируется — распределения ПЖ в подопытной и контрольной группах одинаковы, хотя "хвост" распределения в группе постоянного введения ФР статистически достоверно короче, чем в контрольной. Это обусловлено сильным, растущим с возрастом, увеличением базового риска смерти-(табл. 2). Влияние ФР на выживаемость мышей ранее не рассматривалось» т.к. групппы, подвергавшиеся введению ФР, служили контролем для групп, получавших эпиталон (Anisimov et al., 2002]. Эффект гормезиса долгожительства, наблюдавшийся при курсовом введении, и отсутствие его при постоянном введении соответствуют описанному в литературе положительному влиянию малых доз стрессорных воздействий [Calabrese, Baldwin, 2000; Minois, 2000].

Курсовое введение эпиталона не оказало влияния на выживаемость, постоянное введение привело к увеличению выживаемости короткоживущих индивидов (табл. 1, рис. 36). В недавних исследованиях было показано, что эпиталон увеличивает ПЖ у двух линий плодовых мушек

возраст

Рис. 2: Оценка функции дожития, соответствующей условному базовому риску смерти для контрольной группы трансгенных мышей HER-2/neu, по сравнению с оценками наблюдаемой функции дожития (* — функция дожития в контрольной группе приближена моделью гамма-Гомперша с параметрами а = 4е-4 (Зе-4; 5е-4), ß = 3,7е-2 (3,5е-2; 3,8е-2) и а1 = 9,Зе-1 (9,2е-1; 9.4е-!))

[Khavinson et al., 2000; Mylnikov, 2000] и у самок мышей СВА и SHR [Anisimov et al., 2001. 2003], а также ингибирует спонтанный канцерогенез у мышей [Anisimov et al., 2002]. Положительное влияние постоянного введения эпиталона на выживаемость самок трансгенных мышей HER-2/neu обусловлено снижением базового риска смерти в возрастах до 300 дней и уменьшением средней уязвимости (табл. 2). Следует отметить зависимость влияния препарата от дозы. При постоянном введении эпиталон оказывает геропротекторное влияние, противодействующее пагубному влиянию постоянного введения ФР. Возможно, эпиталон в малых дозах оказывает пагубное влияние, которое компенсируется герметическим эффектом, вызванным курсовым введением ФР.

Курсовое потребление мелатонина несколько ухудшило выживаемость, а постоянное применение препарата достоверно уменьшило шансы мышей на выживание во всех возрастах (табл. 1, рис. Зв), хотя уменьшило частоту и размеры опухолей молочной железы (ОМЖ), а также частоту возникновения метастазов в легких {Anisimov et al., 2003]. Пагубное влияние препарата на выживаемость обусловлено увеличением средней уязвимости и уменьшением гетерогенности популяции (табл. 2). Возможно, что такое действие препарата связано непосредственно с особенностями используемой трансгенной модели, т.к. среди мышей HER-2/neu часты случаи поликистоза почек. Исследования геропротекторных свойств мелатонина показали, что он увеличивает ПЖ и устойчивость к действию оксидантов у плодовых мушек [Boniila et al., 2002], тормозит развитие ОМЖ in vitro и in vivo (Bartsch et al., 2001; Blask, 1993; Cos, 2000; Musatov et al., 1999]. Однако, недавние эксперименты на самках мышей SHR показали, что ге-ропротекторные свойства мелатонина зависят от дозы [Anisimov et al., 2003], а у самок мышей СВА применение препарата одновременно с увеличением ПЖ вызывает увеличение случаев лейкозов.

Световая депривация и ПО оказали благотворное влияние на выживаемость в популяциях трансгенных мышей (табл. 1, рис. Зг). Горметический эффект этих стрессорных воздействий обусловлен уменьшением средней уязвимости и увеличением неоднородности популяций, а в случае световой депривации и ПО 2500 люкс еще и уменьшением базового риска смерти в возрастах до 225 дней (табл. 2). Уменьшение уязвимости при ПО происходит с увеличе-

Рис. 3: Эмпирические и соответствующие им модельные условные функции дожития в группах трансгенных мышей ИЕЯ-2/пеи, подвергшихся воздействиям различных стрессоров и геропро-текторов (* — функция дожития в контрольной группе приближена моделью гамма-Гомперща (см. рис. 2))

нием освещенности. Группа, содержавшаяся при наибольшей освещенности, стала наиболее гетерогенной среди всех наблюдавшихся, благодаря чему' в ней наблюдалась самая большая максимальная ПЖ. Подавление ночного пика секреции мелатонина при ПО стимулирует развитие ОМЖ и сокращает ПЖ, в то время как световая депривация подавляет канцерогенез и увеличивает выживаемость [Амятоу, 2002, 2003]. Благотворный эффект ПО на ПЖ, наблюдаемый в экспериментах на самках мышей ИЕЯ-2/пеи, возможно, обусловлен особенностями трансгенной модели — стрессорное воздействие ПО увеличивает выработку глюкокортикоидов надпочечниками и противодействует поликистозу почек [Батурин, 2003].

При ПО 300 люкс и постоянном потреблении мелатонина также наблюдался гормезис дол-

гожительства, выраженный в увеличении продолжительности жизни долгоживущих индивидов (табл. 1, рис. Зд-е). В ряде исследований на крысах, мышах и плодовых мушках было показано, что мелатонин, обладая геропротекторными свойствами, противодействует стрессорному влиянию изменений режима освещенности [Li, Xu, 1997]. Однако, для некоторых видов лабораторных животных, в частности, для хомяков CMHs, подавление, а не стимуляция функции эпифиза благотворно влияет на выживаемость [Natelson et al., 1997, 1996]. Это согласуется с результатами наблюдений в группах трансгенных мышей, постоянно получавших мелатонин или содержавшихся при ПО. При одновременном применении этих воздействий сильный герметический эффект ПО компенсировался негативным влиянием постоянного потребления мелато-нина на выживаемость трансгенных мышей. Под влиянием смешанного воздействия произошло уменьшение средней уязвимости и увеличение популяционной гетерогенности (табл. 2).

Опыты с нематодами Caenorhabditis elegans

Сведения о ПЖ в группах нематод Caenorhabditis elegans, подвергшихся тепловому шоку различной продолжительности, представлены в таблице 3. Короткий тепловой шок (1-2 часа) оказал герметическое влияние на выживаемость нематод, в то время как длительный (6-8 часов) ухудшил ее.

Таблица 3: Сведения о ПЖ в группах нематод Caenorhabditis elegans, подвергшихся тепловому

шоку различной длительности_

длительность нагрева

контроль 1 час_2 часа_4 часа 6 часов 8 часов

СПЖ, сут. 19,47 (±0,5) 21,58 (±0.6) 20,64 (±0,5) 18,58 (±0,6) 10,54 (+0.6) 7,15 (±0,3) дисперсия 4,91 5,57 5,11 6,06 5,42 2,56

мПЖ, сут. 6 7 6 4 4 4

МПЖ, сут. 36 36 34 27 33 25

_р_0,002 0,015 0,023 0,001 0,001

СПЖ - средняя ПЖ, мПЖ - минимальная ПЖ, МПЖ - максимальная ПЖ. р - достоверность различий в выживаемости (лог-ранк тест).

Полупараметрическая модель смертности в гетерогенной популяции применена для анализа экспериментальных данных с использованием условных функций дожития при условии пережить стресс в возрасте 4 дней. Наблюдаемой в эксперименте выживаемости наилучшим образом соответствует спецификация модели, учитывающая одновременно изменения гетерогенности популяции и базового риска смерти (р < 0,01). Оценки параметров этой модели представлены в таблице 4. Полученная характеристика дисперсии уязвимости в контрольной группе нематод (параметр в табл. 4) позволяет оценить условный базовый риск смерти, который представлен на рисунке 4а. Очевидно, что он отклоняется от модели Гомпертца в старших возрастах. Эмпирические и соответствующие им модельные условные функции дожития представлены на рисунке 46.

С целью проверить предсказательные возможности модели оценка параметров проводилась сначала для групп, подвегшихся нагреванию в течение 1, 4 и 8 часов. Согласно модели, увеличение выживаемости после 1 часа нагрева (табл. 3, рис. 4) обусловлено уменьшением средней уязвимости, хотя этот эффект сопровождался увеличением базового риска смерти в возрастах до 17 дней и уменьшением гетерогенности популяции (табл. 4). Эффект неполного гормезиса

Таблица 4: Оценки параметров полупараметрической модели смертности в гетерогенных популяциях для групп нематод СаепогкаЪйШ е^ат, подвергшихся тепловому шоку различной продолжительности_

Рис. 4. (а) Оценки условного базового риска смерти для контрольной группы нематод СаепогИаЪ/ИШ elegans по сравнению с оценками наблюдаемого риска смерти; (Ь) эмпирические и соответствующие им модельные условные функции дожития в группах нематод, подвергшихся тепловому шоку различной продолжительности (* — функция дожития в контрольной

группе приближена моделью гамма-Гомпертца с параметрами а = 4,4е-4 (Зе—4, 5е-4), ¡) = 0,42 (0,4; 0,43), и а* =0,83(0,81,0,85))

(пересечение кривых дожития в контрольной и подопытной группе), наблюдавшийся в группе 4-часового теплового шока (табл. 3, рис. 4), был обусловлен более сильным увеличением базового риска смерти в младших возрастах, уменьшением средней уязвимости (меньшим, чем в первой группе) и уменьшением гетерогенности популяции (также меньшим, чем в первой группе) (табл. 4). Группа, подвергшаяся самому длительному нагреву, стала в среднем наименее уязвимой и наиболее гетерогенной, хотя длительный нагрев не только увеличил базовый риск смерти во всех возрастах, но и увеличил скорость его роста с возрастом (табл. 4). Комбинация этих эффектов обусловила вогнутую форму кривой дожития и ее длинный "хвост" (табл. 3, рис. 4).

Исходя из этого, было сделано предположение, что после 2- и 6-часового нагрева среднее значение и дисперсия распределения уязвимости, а также базовый риск смерти будут находится в интервалах между значениями, характеризующими соответствующие эффекты в группах 1, 4 и 8 часов нагрева. Повторная оценка параметров модели, проведенная для всех групп одновременно (табл. 4), подтвердила предположение о том, что с увеличением длительности нагрева от 1 до 8 часов происходит увеличение базового риска смерти. Короткий тепловой шок делает популяцию нематод менее уязвимой и менее гетерогенной. С увеличением длительности нагрева до 4 часов средняя уязвимость и ее дисперсия увеличиваются, оставаясь при этом

меньшими, чем в контрольной группе. Дальнейшее увеличение длительности нагрева до 8 часов уменьшает среднюю уязвимость, увеличивая одновременно гетерогенность по сравнению с контрольной группой. Тот факт, что дисперсия распределения уязвимости после 6 часов нагрева была оценена большей, чем после 8-часового нагрева, дает основания предполагать еще большее увеличение длительности нагрева будет уменьшать гетерогенность популяции.

Предыдущие работы, в которых анализировались данные этого эксперимента, предполагали определенные биологические механизмы возникновения эффектов гормезиса, неполного горме-зиса и дебилитации (вызванные стрессорным воздействием повреждения, уменьшающие шансы выживания). Эти механизмы состояли в возникновении и репарации повреждений, адаптации и восстановлении гомеостаза [Butov et a!., 2001; Yashin et al., 2001], однако при анализе данных не учитывалась гетерогенность популяций. Другой подход, основанный на модели, описывающей старение организма, как уменьшение количества жизненных ресурсов, необходимых для противодействия стрессорным воздействиям в течение жизни [Strehler, Mildvan, I960], одновременно учитывающий ненаблюдаемую индивидуальную уязвимость [Vaupel et al., 1979], не предполагал изменения популяционной неоднородности под влиянием теплового шока [Michalski et al, 2001] Третий подход учитывал изменение распределения неоднородности, но не предполагал изменений базового риска смерти [Yashin et al., 2002]. Подход, предложенный в настоящей работе, не противоречит результатам предыдущих исследований, т к. отражает иную сторону явления Тот факт, что одновременно несколько гипотез о сути явлений одинаково хорошо соответствуют экспериментальным данным, говорит лишь о том, что необходимы новые постановки экспериментов, которые дадут дополнительную информацию о наблюдаемых явлениях, с помощью которой можно будет либо связать различные подходы, либо выбрать наилучший.

Опыты с плодовыми мушками Drosophila melanogaster

Характеристики влияния голодания и содержания при низкой относительной влажности на ПЖ плодовых мушек представлены в таблице 5. Средняя ПЖ (СПЖ) мушек, в том числе последних 10% (долгоживущих) индивидов, подвергшихся стрессорному воздействию в обоих возрастах, увеличилась (статистически достоверно (р<0,001), кроме СПЖ в группе, подвергшейся самому короткому стрессу в возрасте 35 дней). Различия между группами мушек разных возрастов с равной долей павших во время стрессорного воздействия достоверны, кроме двух случаев: СПЖ в группах с 20% павших и СПЖ последних 10% мушек в группах с 50% павших. Улучшение выживаемости после стресса более выражено в группах молодых мушек. Однако в группах легкого воздействия (0% и 20%), примененного в возрасте 35 дней, продление жизни последних 10% индивидов было значительно большим, чем в группах той же пропорции павших в возрасте 15 дней.

Полупараметрическая модель смертности в гетерогенной популяции применена к данным о выживаемости плодовых мушек с использованием условных функций дожития при условии пережить голодание и содержание в условиях низкой относительной влажности в возрасте 15 и 35 дней. Наилучшим образом соответствует экспериментальным данным модель, в которой предполагается, что под влиянием воздействия произошли изменения в базовом риске смерти и в распределении уязвимости в популяции (р < 0,0001). Оценки параметров этой спецификации модели представлены в таблице 6. Полученная характеристика дисперсии уязвимости

Таблица 5: Сведения о ПЖ в группах плодовых мушек ВтоюрННа melanogaster, подвергшихся голоданию и содержанию в условиях низкой относительной влажности в различных возрастах

доля павших во время стресса

_Контроль 0% 20% 50% 70%

стресс на 15-й день жизни, пережили возраст 15 суток

Количество СПЖ, сут.

Ст.Откл. МПЖ, сут. СПЖ 10%, сут.

8299

48,13

(±0,14)

12,55

90

65,54 (±0.11)

4276

48,99

(±0,19)

12,67

79

65,95 (±0,12)

4613 50,30 (±0.17) 11,43 88

66,15 (±0,20)

3716

56,32

(±0,19)

11,42

96

70,77 (±0.19)

3682

55,38

(±0,21)

12,85

97

72,33 (±0,22)

стресс на 15-й день жизни, пережили возраст 35 суток

Количество СПЖ, сут.

Ст.Откл. МПЖ, сут. СПЖ 10%, сут.

6802 52,73 (±0,10) 8,30 90 66,16 (±0.12)

3539 53,60 (±0,14) 8,06 79

66,46 (±0,14)

4041

53,48

(±0,13)

7,99

88

66,62

(±0,21)

3441 58,64

(±0.14)

8,15 96

71,00 (±0.20)

3321

58,52

(±0,15)

8,87

97

72,76

(±0.24)

стресс на 35-й день жизни, пережили возраст 35 суток

Количество СПЖ, сут,

Ст.Откл. МПЖ, сут. СПЖ 10%, сут.

6802 52,73 (±0.10) 8,30 90 66,16 (±0,12)

3426 52,82 (±0,16) 9,16 85

67,85 (±0,18)

2894

53.56 (±0.17) 8,90 91

68.57 (±0,23)

2626

55,73

(±0.17)

8,94

94

69,83 -(±0,26)

2141

57,82

(±0.19)

8,78

83

70,56 (±0,19)

СПЖ - средняя ПЖ, Ст Откл - стандартное отклонение, МПЖ - максимальная ПЖ, СПЖ 10% - СПЖ последних 10% мушек

в контрольной группе мушек (параметр о в табл 6) позволяет оценить условный базовый риск смерти и соответствующую ему функцию дожития (рис. 5). Эмпирические и "модельные условные функции дожития для различных групп мушек представлены на рисунке 6

Увеличение базового риска смерти было сильнее в группах, подвергшихся стрессорному воздействию в возрасте 35 дней С увеличением стрессорной нагрузки в группах молодых мушек увеличение базового риска смерти становилось меньше, но его увеличение с возрастом происходило быстрее. Не обнаружено динамики изменения увеличения базового риска смерти с увеличением стрессорной нагрузки в группах, подвергшихся стрессу в возрасте 35 дней По-видимому, эта характеристика достигла своих "критических" значений Мушки, подвергшиеся воздействию в возрасте 35 дней, не выжили бы при большем базовом риске смерти, в силу уменьшения жизнеспособности к этому возрасту. Возможное объяснение различия в паттернах увеличения базового риска смерти при изменении стрессорной нагрузки состоит в уменьшении устойчивости к стрессорному воздействию с возрастом. Воздействие, примененное в обоих возрастах, привело к уменьшению средних значений распределения уязвимости в популяциях, причем наименьшая средняя уязвимость наблюдалась в группах, подвергшихся голоданию и содержанию в условиях низкой относительной влажности в старшем возрасте. Произошло это не только за счет устранения слабых индивидов во время стрессорного воздействия, но и

Таблица 6: Оценки параметров полупараметрической модели смертности в гетерогенных популяциях для групп плодовых мушек Лго®орШ1а melanogaster, подвергшихся голоданию и содержанию в условиях низкой относительной влажности в различных возрастах

доля павших во время стресса

0% 20% 50% 70%

стресс на 15-й день жизни

а 2,5е-3 (2,4е-3; 2,бе-3) 3,1е-5 (Зе-5; З.Зе-5) 8,1е-9 (7,9е-9; 8,Зе-9) 8,7е-10 (8,Зе-10; 8,9е-10)

Р 0,07 (0,06; 0.08) 0,21 (0.2; 0,23) 0,4 (0,39; 0,42) 0,46 (0,44; 0,47)

г 0,6 (0,58; 0,61) 0,63 (0,62; 0,65) 0,35 (0,33; 0.37) 0,51 (0,5; 0,53)

7 0,58 (0,55; 0,59) 1,44 (1,41; 1,46) 3,17 (3.1; 3,24) 4,98 (4,66; 5)

стресс на 35-й день жизни

а 0,04 (0,03; 0,04) 0,02 (0,02; 0,03) 0,02 (0,02; 0,03) 0,02 (0,01; 0,02)

Р 0,07 (0.06; 0.09) 0,11 (0,1; 0,13) 0,11 (0,1; 0,12) 0,09 (0,08; 0.1)

г 0,34 (0,33; 0,35) 0,38 (0.36; 0.39) 0,22 (0,19; 0.23) 0,21 (0,2; 0,23)

7 0,56 (0,54; 0,57) 1,01 (1; 1.02) 0,64 (0,62; 0,65) 0,28 (0,26; 0,29)

~Р для всех групп 0,36 (0.34; 0,37)

возраст, сутки возраст, сутки

Рис. 5: Оценки условного базового риска смерти и соответствующей ему функции дожития для контрольной группы плодовых мушек Юго8орНИа melanogaster по сравнению с оценками соответствующих наблюдаемых характеристик

за счет благоприятного влияния воздействия на индивидуальные характеристики уязвимости. Самая малая стрессорная нагрузка уменьшила дисперсию распределения уязвимости в обоих возрастах. Голодание и содержание в условиях низкой относительной влажности, убившее 20% мушек в обоих возрастах, увеличило дисперсию распределения уязвимости, но это увеличение было более выражено в группе молодых мушек. Длительное воздействие оказало различное влияние на молодую и старую популяции. Группы, подвергшиеся стрессорным воздействиям в возрасте 15 дней, в результате которых пало 50% и 70% популяции, стали более гетерогенными. Эти группы содержат как самых слабых, так и самых сильных мушек, наблюдавшихся в опыте. Именно в этих группах наблюдалось наибольшее количество долгоживущих индивидов, а также наибольшая СПЖ и МПЖ. Популяции, подвергшиеся стрессорному воздействию, убившему 50% и 70% популяции, в возрасте 35 дней стали в среднем менее уязвимыми и более однородными. После воздействия в них остались крепкие и сильные мушки, шансы на выживание которых значительно выше, чем в контрольной группе и в группах, подвергшихся малым стрессорным нагрузкам в этом возрасте.

возраст, сутки возраст, сутки

а. стресс на 15-й день жизни б. стресс на 35-й день жизни

Рис. 6 Эмпирические и соответствующие им модельные условные функции дожития в группах плодовых мушек Drosophila tnelanogaster, подвергшихся голоданию и содержанию в условиях низкой относительной влажности в различных возрастах

Устойчивость к стрессорным воздействиям является важным биомаркером старения, т.к. способность сопротивляться пагубному влиянию воздействия в большинстве случаев снижается с возрастом [Verbeke et al., 2001]. Эксперименты, проведенные на самках плодовых мушек Drosophila tnelanogaster, показали, что в условиях различной гравитации устойчивость к действию холода и содержания при низкой относительной влажности снижается с возрастом [Minois, Le Bourg, 1999]. Устойчивость самок и самцов плодовых мушек Drosophila tnelanogaster, несущих дополнительные копии гена hsp70, к влиянию голодания и действию параквата с возрастом также снижается [Minois, 2001]. В исследовании влияния теплового шока на молодых и старых крыс линии Fischer 344 было показано, что синтез белков теплового шока, в частности Hsp72, уменьшается с возрастом [Locke, Tanguay, 1996]. Это приводит к ухудшению стрессорного ответа у пожилых животных по сравнению с молодыми. Иммобили-зационный стресс у самцов крыс линии Wistar различных возрастов также сопровождается снижением эфективности свободно-радикальных процессов у пожилых животных [Davydov, Shvets, 2003]. Исследование влияния стрессорного воздействия различной продолжительности, примененного в различных возрастах, ранее не проводилось. В настоящей работе показано, что динамика изменения базового риска смерти и распределения уязвимости в популяции с увеличением продолжительности стрессорного воздействия различна в гетерогенных популяциях молодых и старых мушек.

Наблюдения за поведением плодовых мушек Ceratitis capitata

Первое проявление бездеятельного поведения отмечает окончание активной жизни мушки [Papadopoulos et al., 2002]. Таким образом, период после первого наблюдения положения навзничь рассматривается как период неактивной жизни, даже если мушка была активна (не была замечена в положении навзничь) в течение некоторых дней этого периода.

Для того, чтобы изучить связь выживаемости плодовых мушек с продолжительностью неактивной жизни (ПНЖ), которая коррелирует (р = 0,5563) с продолжительностью всей жизни (ПЖ), популяция мушек была разделена на три приблизительно равные группы. К 1-й группе

были отнесены насекомые, ПНЖ которых составляет не более 10 суток. Во 2-ю группу вошли мушки с ПНЖ более 10, но не более 20 суток. 3-ю группу составили индивиды, которые начали проявлять бездеятельное поведение более чем за 20 суток до смерти. Сведения о ПЖ и поведении в этих группах приведены в таблице 7. Улучшение выживаемости происходит с уве-личенеим ПНЖ. Различие в группах статистически достоверно (р < 0,01). Продолжительность активной жизни (ПАЖ) одинакова в двух первых группах и статистически достоверно меньше в группе с максимальной ПНЖ. Количество баллов бездеятельности, а также количество бездеятельных дней увеличивается, а доля бездеятельных дней в неактивном периоде жизни уменьшается с увеличением ПНЖ.

Таблица 7: Сведения о ПЖ и бездеятельном поведении в группах плодовых мушек Ceratitis capitata с различной ПНЖ

группа 1 группа 2 группа 3

количество 77 65 51

СПЖ, сут. 53,4 (±2,3) 62,7 (±2) 72,4 (±3,4)

мПЖ, сут. 8 35 36

МПЖ, сут. 98 108 151

до возраста дожило 10%, сут. 78 85 100

СПЖ 10%, сут. 89,4 (±2.9) 92,6 (±2,8) 127,4 (±7.1)

СПАЖ, сут. 47,8 (±2,2) 46,6 (±1.9) 36 (±2.2)

среднее кол-во баллов 27,4 (±2,2) 43,8 (±3,8) 67,9 (±9,8)

макс, кол-во баллов 75 128 292

среднее кол-во бездеятельных дней 3,9 (±0,2) 7,4 (±0,5) 10,8 (±1,1)

макс, кол-во бездеятельных дней 9 16 36

% бездеятельных дней в ПНЖ 74 (±3) 50 (±3) 33 (±3)

СПЖ - средняя ПЖ. мПЖ - минимальная ПЖ. МПЖ - максимальная ПЖ. СПЖ 10% - СПЖ последних 10% мушек. СПАЖ - средняя продолжительность активной жизни

Сглаженные по методу "скользящего среднего" возрастные траектории бездеятельного поведения в трех группах представлены на рисунке 7а Траектории рассчитаны усреднением количества баллов бездеятельности в день по всем живым на этот день мушкам в группе. Очевидно, что во всех трех группах число баллов на живую мушку с возрастом увеличивается. На рисунке 76 представлены средние интенсивности бездеятельного поведения, также сглаженные "скользящим средним", в течение последних 30 дней жизни мушек. Эти интенсивности были расчитаны усреднением числа баллов бездеятельности в каждой группе по всем индивидам для каждого дня из 30-ти дневного периода, предшествовавшего естественной гибели насекомых. Наибольшая интенсивность бездеятельного поведения, а также более медленное увеличение ее со временем, наблюдались в группе с наибольшей ПНЖ. В группе с наименьшей ПНЖ проявление бездеятельного поведения начиналось незадолго до гибели, однако интенсивность этого поведения увеличивалась стремительно.

Чтобы исследовать влияние экстремальной (наибольшей и наименьшей) ПНЖ на выживаемость плодовых мушек, полупараметрическая модель смертности в гетерогенной популяции была применена в предположении, что примененным воздействием явилось содержание диких мушек в лабораторных условиях. Группа с ПНЖ от 10 до 20 суток использовалась в качестве контрольной. Гипотеза о том, что содержание мушек дикого типа в лабораторных условиях' приводит к изменению базового риска смерти и, одновременно, влияет на параметры распреде-

Рис. 7: (а) Возрастные траектории бездеятельного поведения и (б) интенсивности бездеятельного поведения в течение последних 30 дней жизни в группах плодовых мушек с различной ПНЖ

ления уязвимости в группах с экстремальной ПНЖ, наилучшим образом соответствует экспериментальным данным (р < 0,01). Оценки параметров этой спецификации модели приведены в таблице 8. Полученная оценка дисперсии распределения уязвимости в контрольной группе (параметр crJ в табл. 8) позволила оценить базовый риск смерти и соответствующую ему кривую дожития, которая представлена на рисунке 8а. Условные эмпирические и модельные функции дожития для групп с различной ПНЖ представлены на рисунке 86.

Таблица 8: Оценки параметров полупараметрической модели смертности в гетерогенных популяциях для групп плодовых мушек Ceratitis capitata с экстремальной ПНЖ параметр группа 1_группа 3_

а 0,001 (0.0008, 0.0013) -9,260 (-9,3, -9.24)

ß 0,036 (0.032,0,037) -0,254 (-0.27. -0,22)

Г 1,666 (1,62; 1,7) 0,016 (0,014, 0.017)

7_1,018 (1,01; 1.02)_1,757 (1,73, 1.78)

а2 0,98 (0,96, 0,99) для всех групп

Низкая выживаемость в группе мушек с малой ПНЖ обусловлена растущим с возрастом увеличением базового риска смерти и большой средней уязвимостью по сравнению с контрольной группой. Высокая выживаемость в группе с большой ПНЖ обусловлена низким риском смерти в младших возрастах, малой средней уязвимостью и большей гетерогенностью по сравнению с контрольной группой.

Поведенческие биомаркеры играют важную роль в исследовании процессов старения, т.к., в отличие от хронологического возраста, характеризуют состояние здоровья, или так называемый биологический возраст организма [Baker, Sprott, 1988; Markowska, Breckler, 1999; Minois, 2000]. Бездеятельное поведение является новой характеристикой, пополнившей репертуар показателей, наблюдаемых у насекомых [Papadopoulos et al.f 2002). Исследование бездеятельного поведения плодовых мушек, продолжительности активной и неактивной жизни может помочь в изучении динамики заболеваемости и инвалидности у людей [Fries, 1980, 2000; Helfand, 2002; Katz et al., 1983; Vita et al., 1998). Хотя природа бездеятельного поведения изучена недостаточно, результаты анализа данных с использованием модели смертности в гетерогенных популяциях позволяют предположить адаптивный характер этого поведения.

возраст, сутки возраст, сутки

Рис. 8: (а) Оценка условной функции дожития, соответствующей базовому риску смерти для контрольной группы плодовых мушек Ceratitis capitata, no сравнению с оценками наблюдаемой функции дожития; (б) эмпирические и соответствующие им модельные условные функции дожития в группах плодовых мушек с различной П Н ж (* — функция дожития в контрольной группе приближена моделью гамма-Вейбула с параметрами ос = 2,32е-9 (2,3е—9; 2,35е—9), ß = 4,18 (4.1, 4,2), и а3 = 0,37(0,35;0.38))

Выводы

1. Предложенные модели и методы, а также разработанное программное обеспечение оказались адекватными для решения поставленных экспериментальных задач, что позволило оценить влияние стрессорного и геропротекторного воздействия на популяцию лабораторных животных в терминах изменения базового риска смерти и неоднородности реакции на предложенное воздействие.

2. Увеличение выживаемости самок трансгенных мышей HER-2/neu под влиянием курсового введения физиологического раствора обусловлено уменьшением средней уязвимости, уменьшение выживаемости долгоживуших индивидов при постоянном введении физиологического раствора обусловлено сильным, растущим с возрастом, увеличением базового риска смерти. Различие в эффектах, произведенных геропротекторами, обусловлено уменьшением базового риска смерти и средней уязвимости при постоянном введении эпи-талона, а при постоянном потреблении мелатонина — увеличением средней уязвимости и уменьшением гетерогенности. Увеличение выживаемости под влиянием световой де-привации, постоянного освещения и смешанного воздействия (постоянного освещения и потребления мелатонина) обусловлено уменьшением средней уязвимости, увеличение выживаемости долгоживущих индивидов обусловлено увеличением популяционной гетерогенности. Увеличение выживаемости короткоживущих индивидов под действием световой депривации и постоянного освещения 2500 люкс обусловлено уменьшением базового риска смерти в младших возрастах.

3. В популяции нематод Caenorhabditis elegans уменьшение выживаемости после 1-4-часового теплового шока в младших возрастах обусловлено увеличением базового риска смерти. Увеличение выживаемости в старших возрастах без увеличения максимальной продолжительности жизни обусловлено уменьшением средней уязвимости и гетерогенности популяций, причем меньшая уязвимость, меньшая гетерогенность и большее увеличение базо-

вого риска смерти соответствуют меньшей длительности нагрева. Уменьшение выживаемости после длительного (6-8 часов) теплового шока обусловлено растущим с возрастом увеличением базового риска смерти. Наличие в этих группах долгоживущих индивидов обусловлено уменьшением средней уязвимости и увеличением гетерогенности.

4. Голодание и содержание в условиях низкой относительной влажности популяций плодовых мушек Drosophila melanogaster приводит к увеличению базового риска смерти и уменьшению средней уязвимости в обоих возрастах (15 и 35 дней). Большее увеличение базового риска смерти наблюдалось в популяции старых мушек, что обусловило их меньшую выживаемость по сравнению с молодыми мушками. С увеличением продолжительности периода голодания и обезвоживания популяции старых мушек становятся в среднем менее уязвимыми и более однородными, в то время как популяции молодых мушек становятся в среднем менее уязвимыми и более неоднородными, что позволяет объяснить увеличение максимальной продолжительности жизни в группах молодых мушек по сравнению со старыми.

5. Группа средиземноморских плодовых мушек Ceratitis capitata с самой короткой продолжительностью неактивной жизни отличается повышенным базовым риском смерти, большей уязвимостью и большей гетерогенностью, что обуславливает низкую выживаемость в этой группе во всех возрастах, кроме старших, по сравнению с группой, в которой неактивная продолжительность жизни соответствует средней популяционной. Группе плодовых мушек с самой большой продолжительностью неактивной жизни свойственны пониженный базовый риск смерти, малая уязвимость и большая гетерогенность, что позволяет объяснить увеличение выживаемости во всех возрастах и увеличение максимальной продолжительности жизни.

6. Результаты проделанной работы показали, что разработанные модели и методы могут быть успешно применены для исследования характеристик старения и стрессоустойчивости в популяциях лабораторных животных при различных условиях проведения эксперимента, а также для планирования научных экспериментов по выживаемости в неоднородных популяциях при широком спектре воздействующих факторов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Эпиталон замедляет старение и подавляет развитие аденокарцином молочной железы у трансгенных мышей HER-2/neu / В.Н. Анисимов, В.Х. Хавинсон, И.Н. Алимова, А.В. Семенченко, А.И. Яшин // Бюлл. эксперим. биол. и мед.-2ОО2.-Т.134, №2-С. 187-190.

2. Световой режим, продолжительность жизни и рак / В.Н. Анисимов, Д.А. Батурин, И.Н. Алимова, М.А. Забежинский, И.Г. Попович, Д.Ш. Бениашвили, К.Дж. Мэнтон, А.В. Семенченко, А.И. Яшин // Тезисы докладов международной конференции "Проблемы ритмов в естествознании", Москва, Россия.-2004.-С. 23-24.

3. Влияние световой депривации на показатели гомеостаза, продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей у трансгенных мышей Her-2/neu / Д.А. Батурин, И.Н. Алимова, И.Г. Попович, М А. Забежинский, А.В. Семенченко, А.И. Яшин, В.Н. Анисимов // Вопр. онкол.-2004.-Т. 50, №3.-С. 332-338.

4 The effect of melatonin treatment regimen on mammary adenocarcinoma development in HER 2/neu transgenic mice /V N Anisimov, I N Alimova, D A Baturin, I G Popovich, M A Zabezhinski, К G Manton, A.V. Semenchenko, A I Yashin//I nt J Cancer-2003-Vol 103 -P 300-305

5 Semi-parametric model of the stress in heterogeneous population Application to the experimental data on three species / A.V. Semenchenko, A I Yashin, A A Khazaeli, J W Curtsinger,

T Johnson, J Cypser, N Papadopoulos, J Carey // International workshop "Probability, modeling and statistics in public health,', University of Victor Segalen Bordeaux2, Bordeaux, France, 22-23 September -2003 -P 15-16

6 Relationship between cancer and aging Experimental evidence and mathematical modeling considerations /K.G Arbeev, A.V. Semenchenko, V N Anisimov, S V Ukramtseva, L S Arbeeva, A I Yashin // Annual Meeting of Population Association of Amenca.-Boston, USA, 1-3 April -2004 -P 145-146

7 Stress resistance declines with age Analysis of data from survival experiment with Drosophila Melanogaster//A.V. Semenchenko, A A Khazaeli, J W. Curtsinger, A I Yashin / Biogerontology -2004 -Vol 5, №1 -P 17-30

8 The model of heterogeneous mortality What do we learn about aging, longevity and supine behavior in medfhes?/A.V. Semenchenko, A Yashin, N Papadopoulos, J Carey//International conference "Longevity, Aging and Degradation models in Reliability, Public Health, Medicine and Biology", St Petersburg, Russia, 7-9 June-2004-P 201-202

9 Stressors and antistressors how do they influence survival in HER 2/neu transgenic mice' / A.V Semenchenko, A I Yashin, V N Anisimov // International conference "Statistics in health science", Nantes France, 23 25 June -2004 -P 123-125

10 Stressors and Antistresbors How do they influence life span in HER-2/neu transgenic mice' / Semenchenko, A.V., V N Anisimov, A I Yashin // Exp Gerontol -2004 - (в печати)

Семенченко А.В. Количественное моделирование связи между старением, стрессом и смертностью в популяциях лабораторных животных // Автореф. дис....канд. биол. наук: 15.00.53. - СПб. 2004 - 26 с.

Подписано в печать 24 09 2004 Тираж 100 экз Отпечатано с готового оригинал-макета издательство "Система"

И7815

РНБ Русский фонд

2005-4 16960

Актуальность темы исследования.

Непрерывное увеличение продолжительности жизни в экономически развитых странах является одной из причин увеличения доли пожилых в общей численности населения [Oeppen and Vaupel, 2002]. Это привело к увеличению общественного и научного интереса к проблемам теоретической и экспериментальной геронтологии [Hayflick, 2000; Kirkwood, Austad, 2000; Анисимов, 2003).].

Ряд вопросов о механизмах старения и выживания в различных условиях, например, под действием стрессорных нагрузок и/или фармакологических препаратов, можно исследовать, только проводя эксперименты на животных. Значение лабораторных животных, особенно мышей, круглых червей и плодовых мушек, как модельных систем для изучения старения и болезней у людей, а также для разработки терапевтических подходов к их лечению было подчеркнуто в недавних публикациях [Carey, 2003; Helfand, 2002; Johnson et al., 2000, 2002].

Ряд стрессорных воздействий приводит к увеличению продолжительности жизни. Это явление получило название гормезис долгожительства. Несмотря на многочисленные экспериментальные подтверждения этого явления [Calabrese, Baldwin, 2001; Masoro, 1998, 2000; Verbeke et al., 2000], механизмы его возникновения изучены недостаточно [Minois, 2000; Neafsey, 1990; Rattan, 2000а].

Исследование влияния фармакологических препаратов, увеличивающих продолжительность жизни (геропротекторов), вместе с тем оказывающих нормализующее воздействие на возрастные гормонально-метаболические и иммунологические изменения в организме, является одним из актуальных направлений в геронтологических исследованиях. К наиболее перспективным геропротекторам относят пептидный препарат мелатонин и пептид эпиталон, регулирующий функцию эпифиза [Anisimov et al., 2002, 2003; Khavinson, Anisimov, 2000; Khavinson et alM 2001]. При этом количественные аспекты герметических и геропротекторных свойств стрессорных и фармакологических воздействий, проявляющиеся в изменениях популяционных характеристик выживаемости в различных возрастах, еще недостаточно изучены.

С ростом научного интереса к проблемам экспериментальной геронтологии появилось большое количество новых экспериментальных данных, для детального и глубокого анализа которых необходимо развитие методов, позволяющих связывать наблюдаемые в исследованиях характеристики. Актуальным и перспективным является развитие математических и компьютерных моделей в геронтологии [Butov et al., 2001; Michalski et al., 2001; Yashin et al., 2001; Новосельцев и др., 2003].

Стохастическая модель гормезиса [Yakovlev et al., 1993] и стохастическая модель стресса [Butov et al., 2001] основаны на предположениях о том, что основополагающим событием процесса старения является образование межклеточных повреждений, которые потенциально смертельны, но подвергаются ревизии и исправлению, благодаря репарационному процессу, инициированному стрессорным1 воздействием.

Адаптационная модель стресса [Yashin et al., 2001] описывает зависимость вероятности гибели от некоторого физиологического показателя, изменения которого характеризуют гомеостатическую систему, вовлеченную в ответ организма на стрессорное воздействие. Однако, эти модели не учитывают гетерогенность наблюдаемых популяций.

Первая работа по изучению стрессорного воздействия, принимающая во внимание популяционную неоднородность, тем не менее, не учитывает неоднородность реакции на примененное воздействие [Michalski et al., 2001]. Кроме того, в основе этой модели лежат предположения о параметрической форме зависимости риска смерти от возраста, биологическое обоснование которых подвергается критике на протяжении уже нескольких десятилетий [Driver, 2001; Economos, 1979-1985; Piantanelli, 1986; Piantanelli et al., 1986; Sacher, 1966; Witten, 19831988].

Изменения гетерогенности в популяциях лабораторных животных под действием стрессорного воздействия впервые были исследованы в предположении существования в популяции дискретных классов индивидов, различной подверженности смерти (сильных, нормальных и слабых) [Yashin et al., 2002]. Такая классификация идеализирует реальную ситуацию, однако, позволяет воспроизвести широкий спектр наблюдаемых паттернов кривых дожития.

Необходимо развитие моделей и методов анализа экспериментальных данных, которые позволяют избегать биологически необоснованных предположений, а также учитывают влияние условий эксперимента одновременно на риск смерти и гетерогенность наблюдаемых популяций. В связи с этим тема настоящей работы является актуальной.

Цель исследования

Настоящая диссертационная работа ставит целью развить существующие количественные модели и методы исследования характеристик выживаемости неоднородных популяций лабораторных животных в различных условиях проведения эксперимента. Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач:

1. Разработать количественные модели-и методы анализа данных о смертности в неоднородных популяциях, позволяющие оценивать влияние изменения условий существования.

2. Разработать соответствующее программное обеспечение, позволяющее использовать созданные модели и методы для статистического анализа экспериментальных данных.

3. Используя разработанные модели и методы анализа данных, изучить (а) влияние различных стрессоров (физиологического раствора, световой депривации, постоянного освещения) и геропро-текторов (мелатонин, эпиталон) на выживаемость самок трансгенных мышей HER-2/neu; (б) влияние теплового стреса различной продолжительности на выживаемость нематод Caenorhabditis elegans-, (в) влияние содержания в условиях низкой относительной влажности и голодания различной продолжительности на выживаемость плодовых мушек Drosophila melanogaster различных возрастов; (г) влияние продолжительности неактивной жизни на выживаемость средиземноморских плодовых мушек Ceratitis capitata.

Научная новизна

Впервые развиты и апробированы модели и методы количественного анализа смертности в гетерогенных популяциях при воздействии стрессовых и фармакологических факторов, пригодные для анализа результатов геронтологических экспериментов и оценки риска развития возрастной патологии.

Впервые полупараметрическая модель смертности в гетерогенных популяциях применена для изучения влияния различных геропротек-торов и стрессорных воздействий различной интенсивности на выживаемость трансгенных мышей HER-2/neu, нематод Caenorhabditis elegans, плодовых мушек Drosophila melanogaster, влияния продолжительности неактивной жизни на выживаемость средиземноморских плодовых мушек Ceratitis capitata.

Научно-практическая ценность работы

В работе теоретически обоснована количественная зависимость выживаемости от изменений базового риска смерти и характеристик гетерогенности популяции, происходящих под влиянием внешних воздействий. Практическая ценность работы состоит в том, что подобные модели и методы применимы для анализа экспериментальных данных, полученных на лабораторных животных. Они позволяют корректно интерпретировать результаты проведенных экспериментов и адекватно планировать новые эксперименты, направленные на изучение механизмов действия пептидов, позволяющих предупреждать преждевременное старение и увеличивать активное долголетие. Предложенные модели и методы применимы также для оценки эффективности мер профилактики и лечения заболеваний, сцепленных со старением, в человеческих популяциях.

Апробация работы

Работа поддержана стипендией Института демографических исследований Общества Макса Планка. Результаты работы доложены и обсуждены на объединенной научной конференции отдела канцерогенеза и онкогеронтологии, лаборатории эндокринологии, лаборатории онко-экологии и патологоанатомической лаборатории НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова МЗ РФ, лаборатории онкогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН ДД.ММ.2004 г. на Всероссийской конференции с международным участием "Нейроэндокринология 2003" (г. Санкт-Петербург, Россия, 23-25 сентября 2003 г.), на международном семинаре "Вероятность, моделирование и статистика в здравоохранении" (Университет Виктора Сегалена Бордо 2, г. Бордо, Франция, 22-23 сентября 2003 г.), на втором международном симпозиуме "Проблемы ритмов в естествознании" (г. Москва, Россия, 1-3 марта 2004' г.), на ежегодном заседании Популяционной ассоциации Америки (г. Бостон, США, 1-3 апреля 2004 г.), на международной конференции "Долгожительство, старение и модели деградации в теории надежности, здравоохранении, медицине и* биологии" (г. Санкт-Петербург, Россия, 7-10 июня 2004 г.), на международной конференции "Статистика в здравоохранении" (г. Нант, Франция, 23-25 июня 2004 г.) на семинарах в Лаборатории выживаемости и долгожительства и Лаборатории развития статистических методов Института демографических исследований Общества Макса Планка (г. Росток, Германия).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения, выводов и приложения, содержащего программный код предложенных моделей и методов. Объем работы составляет 122 страницы. Список литературы содержит 28 отечественных и 258 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 16 рисунками.

Выводы

1. Предложенные модели и методы, а также разработанное программное обеспечение оказались адекватными для решения поставленных экспериментальных задач, что позволило оценить влияние стрессорного и геропротекторного воздействия на популяцию лабораторных животных в терминах изменения базового риска смерти и неоднородности реакции на предложенное воздействие.

2. Увеличение выживаемости самок трансгенных мышей HER-2/neu под влиянием курсового введения физиологического раствора обусловлено уменьшением средней уязвимости, уменьшение выживаемости долгоживущих индивидов при постоянном введении физиологического раствора обусловлено сильным, растущим с возрастом, увеличением базового риска смерти. Различие в эффектах, произведенных геропротекторами, обусловлено уменьшением базового риска смерти и средней уязвимости при постоянном введении эпиталона, увеличением средней уязвимости и уменьшением гетерогенности при постоянном потреблении мелатонина. Увеличение выживаемости под влиянием световой депривации, постоянного освещения и смешанного воздействия (постоянного освещения и потребления мелатонина) обусловлено уменьшением средней уязвимости, увеличение выживаемости долгоживущих индивидов обусловлено увеличением популяционной гетерогенности. Увеличение выживаемости короткоживущих индивидов под действием световой депривации и постоянного освещения 2500 люкс обусловлено уменьшением базового риска смерти в младших возрастах.

3. В популяции нематод Caenorhabditis elegans уменьшение выживаемости после 1-4-часового теплового шока в младших возрастах обусловлено увеличением базового риска смерти в этих возрастах. Увеличение выживаемости в старших возрастах без увеличения максимальной продолжительности жизни обусловлено уменьшением средней уязвимости и гетерогенности популяций, причем меньшая уязвимость, меньшая гетерогенность и большее увеличение базового риска смерти соответствуют меньшей длительности нагрева. Уменьшение выживаемости после длительного (6-8 часов) теплового шока обусловлено растущим с возрастом увеличением базового риска смерти, наличие в этих группах дол-гоживущих индивидов обусловлено уменьшением средней уязвимости и увеличением гетерогенности.

4. Голодание и содержание в условиях низкой относительной влажности популяций плодовых мушек Drosophila melanogaster приводит к увеличению базового риска смерти и уменьшению средней уязвимости популяции в обоих возрастах (15 и 35 дней). Большее увеличение базового риска смерти наблюдалось в популяции старых мушек, что позволяет объяснить их меньшую выживаемость по сравнению с молодыми мушками. С увеличением продолжительности периода голодания и обезвоживания популяции старых мушек становятся в среднем менее уязвимыми и более однородными, в то время как популяции молодых мушек становятся в среднем менее уязвимыми и более неоднородными, что позволяет объяснить увеличение максимальной продолжительности жизни в группах молодых мушек по сравнению со старыми.

5. Группа средиземноморских плодовых мушек Ceratitis capitata с самой короткой продолжительностью неактивной жизни отличается повышенным базовым риском смерти, большей уязвимостью и большей гетерогенностью, что позволяет объяснить низкую выживаемость в этой группе во всех возрастах, кроме старших, по сравнению с контрольной группой (в которой неактивная продолжительность жизни соответствует средней популяционной). Группе плодовых мушек с самой большой продолжительностью неактивной жизни свойственны пониженный базовый риск смерти, малая уязвимость и большая гетерогенность, что позволяет объяснить увеличение выживаемости во всех возрастах и увеличение максимальной продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой.

6. Результаты проделанной работы показали, что разработанные модели и методы могут быть успешно применены для исследования характеристик старения и стрессоустойчивости в популяциях лабораторных животных при различных условиях проведения эксперимента, а также для планирования научных экспериментов по выживаемости в неоднородных популяциях при широком спектре воздействующих факторов.