Автореферат и диссертация по медицине (14.01.05) на тему:Коксаки-аденовирусный рецептор и показатели воспаления у больных с нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии сердечно-сосудистой системы

На правах рукописи

Гупало Елена Михайловна

КОКСАКИ-АДЕНОВИРУСНЫЙ РЕЦЕПТОР И ПОКАЗАТЕЛИ ВОСПАЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ С НАРУШЕНИЯМИ ПРОВОДИМОСТИ СЕРДЦА БЕЗ ПРИЗНАКОВ ОРГАНИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ

14.01.05 - кардиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 СЕН 2014

МОСКВА - 2014 0055524^'

005552407

Работа выполнена в отделе клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма сердца НИИ клинической кардиологии им. АЛ. Мясникова и в лаборатории клеточной адгезии Института Экспериментальной Кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения РФ

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Голицын Сергей Павлович

Научный консультант:

Доктор биологических наук, в.н.с. Бурячковская Людмила Ивановна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинский наук, профессор, академик РАМН, зав. кафедрой внутренних болезней и кафедрой факультетской терапии ГБОУ ВПО «Российский Университет Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы»

Федерального агентства по образованию Моисеев Валентин Сергеевич

Доктор медицинский наук, профессор, зав. кафедрой терапии, кардиологии и функциональной диагностики с курсом нефрологии ФГБУ «Учебно-научный медицинский центр»

Управления Делами Президента РФ Сидоренко Борис Алексеевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский Государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» МЗ РФ

Защита состоится v/j"»¿¿PJfi^p-014 года в 1330 на заседании диссертационного совета Д 208.073.04 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения РФ по адресу: 121552, г. Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15 А. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ « РКНПК» МЗ РФ.

Автореферат разослан « » 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Полевая Татьяна Юльевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

pi-АР - pl-адренорецептор

АВ - атриовентрикулярная

БЛНПГ - блокада левой ножки пучка Гиса

БПНПГ - блокада правой ножки пучка Гиса

ВЖ — внутрижелудочковая

ВИ — взвешенные изображения

ВПГ1-2 - вирус простого герпеса 1-2 типа

ВЭБ — вирус Эпштейна-Барр

ГБ - гипертоническая болезнь

ДКМП - дилатационная кардиомиопатия

ЖТ - желудочковая тахикардия

ЖЭ - желудочковая экстрасистолия

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИЛ - интерлейкин

ИФА — иммуноферментный анализ

КАГ - коронароангиография

КАР - коксаки-аденовирусный рецептор

КДР ЛЖ - конечный диастолический размер левого желудочка КМП — кардиомиопатия

КСР ЛЖ - конечный систолический размер левого желудочка

М2-ХР - М2-холинорецептор

М2-ХР - М2-холинорецептор

МРТ - магнитно-резонансная томография

ОП - оптическая плотность

ПК — позднее контрастирование

ПСС - проводящая систем сердца

ПЦР — полимеразная цепная реакция

РК - раннее контрастирование

СДЛА — систолическое давление в легочной артерии

ССС - сердечно-сосудистая система

ТЗСЛЖ - толщина задней стенки левого желудочка

ТРФ-pi — трансформирующий ростовой фактор бета 1

ФВ ЛЖ - фракция выброса левого желудочка

ФНОа — фактор некроза опухоли альфа

ХМ-ЭКГ - холтеровское мониторирование ЭКГ

ЦМВ — цитомегаловирус

ЧСС — частота сердечных сокращений

ЭМБ — эндомиокардиальная биопсия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Патология проводящей системы сердца (ПСС) привлекает внимание

исследователей на протяжении столетия. За столь длительный период времени

сформировались устоявшиеся представления об этиологии различных вариантов

поражения ПСС. На сегодняшний день известно, что причинами развития

атриовентрикулярных (АВ) и внутрижелудочковых (ВЖ) блокад может быть широкий

спектр кардиологических заболеваний, в связи с чем подразумевается, что нарушения

проводимости сердца являются вторичными по отношению к основному заболеванию

сердца. У значительного количества больных причина нарушений проводимости остается

неясной. Эндомиокардильная биопсия (ЭМБ), выполненная у больных с подобными

«идиопатическими» нарушениями проводимости сердца, в ряде случаев позволяет

обнаружить воспалительную клеточную инфильтрацию (Lecomte D. и соавт. 1993, Strain и

соавт. 1983, Sugrue D. и соавт. 1984). Хорошо известно, что поражаться в ходе воспаления

может не только рабочий миокард, но и ткань проводящей системы сердца с развитием

нарушений проводимости сердца. Однако участию воспалительных процессов в

формировании идиопатических нарушений проводимости сердца в литературе уделяется

гораздо меньше внимания. Связано это в первую очередь с отсутствием полноценных

периферических маркеров, способных отражать воспаление в тканях сердца.

Инфильтрирующие миокард клетки активно секрегируют различные цитокины: фактор

некроза опухоли - (ФНОа), интерлейкин-ip (ИЛ-10), ИЛ-6, трансформирующий ростовой

фактор - (ТРФ-Р1) и многие другие биологически активные вещества. Под влиянием

медиаторов воспаления развивается отек в очаге воспаления, происходит значительное

изменение свойств кардиомиоцитов, запуск аутоиммунных процессов. Хорошо известна

возможность аутоиммунного повреждения ПСС в результате воздействия различных

аутоантител, в том числе к мембранным рецепторам - р 1 -адренорсцептору ф1-АР) и М2-

холинорецептору (М2-ХР) (Lazzerini Р. и соавт. 2008, Goin J. и соавт. 1999). В отделе

клинической электрофизиологии ИКК им. А.Л.Мясникова ФГУ РКНПК в течение ряда

лет проводились работы по изучению периферических аутоиммунных и воспалительных

маркеров у больных идиопатическими нарушениями ритма сердца (Д.С. Грачева 2002г.,

Т.Я. Антидзе 2003 г., Н.В. Лоладзе 2004, М.С. Бекбосынова и др. 2007г.). Кроме того,

совместно с лабораторией синтеза пептидов под руководством Беспаловой Ж.Д.,

лабораторией иммунохимии под руководством Ефремова Е.Е, лаборатории генной

инженерии под руководством Бибилашвили Р.Ш. Института экспериментальной

кардиологии РКНПК были разработаны высокочувствительные диагностические системы

4

для детекции аутоантител к ßl-адренорецептору и М2-холинорецептору. Полученные диагностические системы позволили установить, что у 25% пациентов с идиопатическими желудочковыми аритмиями диагностировано повышение уровня антител к ßl-адренорецептору и М2-холинорецептору (Рогова М.М. 2013).

Инициатором воспалительного повреждения миокарда зачастую являются различными вирусы. Среди вирусов-возбудителей миокардитов наиболее изучены аденовирусы и вирусы Коксаки, путь проникновения которых в клетки опосредован специальным белком, Коксаки-аденовирусным рецептором (КАР). В миокарде КАР, белок плотных контактов, локализован преимущественно на мембранах клеток проводящей системы, а также на вставочных дисках (Bergelson J. и соавт 1997, Lim В. и соавт. 2008). Именно на вставочных дисках расположено множество межклеточных контактов, осуществляющих электромеханическое сопряжение в сокращающемся сердце. Однако помимо физиологической роли в формировании межклеточных контактов, было доказано, что КАР принимает участие в развитии Коксаки ВЗ-индуцированного миокардита, приводящего к кардиомиопатии (Knowlton К. 2008). Более того, неопровержимые данные свидетельствуют об участии КАР и в AB проведении (Lira В. и соавт. 2008). Расположение этого белка в структурах проводящей системы и участие в воспалительном поражении сердца позволяет предположить, что он играет роль в развитии нарушений проводимости воспалительной этиологии. Совсем недавно КАР был обнаружен на клетках крови — тромбоцитах, клетках, способных напрямую реагировать на появление в крови инфекционных агентов и на увеличение концентрации воспалительных факторов.

Золотым стандартом диагностики воспалительных поражений миокарда на сегодняшний день является эндомиокардиальная биопсия (ЭМБ) с последующим гистологический анализом, дополненным иммуногистохимическими критериями. Однако из-за потенциального риска осложнений, в том числе жизнеугрожающих, применение ЭМБ ограничено рядом клинических ситуаций, характерных, скорее, для фульминантных форм воспалительных поражений миокарда (Cooper L и соавт. 2007). В случае же «идиопатических» нарушений проводимости сердца единственно возможной альтернативой ЭМБ при необходимости проведения дифференциального диагноза между воспалительными и иными формами поражения миокарда является магнитно-резонансная томография (МРТ) сердца. Именно с ее помощью в отдельных случаях изолированных нарушений проводимости сердца удается установить их истинную причину, которой зачастую бывает миокардит (Mahmod М. и соавт. 2012, Prochnau D. и соавт. 2012). Однако, больших исследований по оценке возможностей МРТ сердца у подобной группы больных, не проводилось.

Анализ публикаций, посвященных возможностям диагностики латентного воспалительного поражения в миокарде у больных с нарушениями проводимости сердца, показал, что поиск периферических маркеров не дал результатов. В то же время, неустановленная вовремя причина нарушений проводимости может приводить к необратимому прогрессированию патологического процесса в миокарде и развитию более тяжелых сердечных заболеваний с развернутой клинической картиной. В этой связи сохраняется необходимость выявления дополнительных периферических маркеров латентного воспалительного процесса у больных с идиопатическими нарушениями проводимости сердца, а также оценки возможности использования уже имеющихся методов диагностики.

Цель исследования: изучить экспрессию коксаки-аденовирусного рецептора и диагностические возможности показателей воспаления у больных с нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии сердечно-сосудистой системы.

Задачи исследования:

1. Определить уровни аутоантител к мембранным рецепторам кардиомиоцитов ф1-адренорецептору и М2-холинорецептору) и цитокинов (ФНОа, ТРФ01 и ИЛ-6) у больных с нарушениями проводимости сердца без органического процесса в миокарде.

2. Изучить в сравнении экспрессию коксаки-аденовирусного рецептора на тромбоцитах у лиц с нарушениями проводимости без органического поражения сердца и у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии.

3. Проанализировать взаимосвязь между признаками воспаления в миокарде (по данным ЭМБ), вирусной персистенцией и экспрессией КАР у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии.

4. Оценить возможность МРТ в выявлении воспаления миокарда у больных с нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии сердца и у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии.

5. Дать оценку выраженности фиброза миокарда по данным МРТ у больных с идиопатическими нарушениями АВ и ВЖ проводимости и у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии.

Научная новизна

Впервые у больных идиопатическими нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии миокарда исследованы показатели периферических

маркеров воспаления и аутоиммунных процессов, оценены данные МРТ сердца с в/в контрастированием.

Продемонстрирована высокая диагностическая значимость аутоантител IgM к М2-холинорецепторам, а также впервые введенного экспериментального показателя -процента КАР-позитивных тромбоцитов в выявлении воспаления в миокарде.

Впервые показано, что процент тромбоцитов, экспрессирующих КАР, напрямую связан с аутоиммунными (антитела IgG к pi-адренорецептору и М2-холинорептору) и провоспалительными (ФНО-а и ИЛ-6) показателями у больных идиопатическими нарушениями проводимости, а также у больных с клиническим синдром дилатационной кардиомиопатии

Работа впервые продемонстрировала повышенное содержание ТРФ-pi в сыворотке пациентов с идиопатическими нарушениями проводимости сердца.

Впервые выявлено, что повышенная экспрессия КАР на мембранах кардиомиоцитов связана с более тяжелым функциональным классом сердечной недостаточности, наличием поражения правых отделов сердца, а низкая экспрессия КАР в миокарде ассоциирована с замедлением ВЖ проводимости у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии.

Впервые исследован вклад очагового фиброза в развитие нарушений проводимости как у больных без органического поражения миокарда, так и у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии.

Впервые показано, что сочетание двух МРТ феноменов - отека и гиперемии -может быть наиболее перспективным в диагностике латентного воспалительного поражения миокарда у больных с нарушениями проводимости сердца. Практическая значимость работы

На основании выполненного исследования определен круг диагностических маркеров, сочетание которых позволяет предполагать воспалительную этиологию нарушений проводимости сердца у пациентов без органической патологии. Показано, что для оценки прогноза развития заболевания у больных с идиопатическими нарушениями проводимости необходимо дополнительное исследование уровня аутоантител IgM к М2-холинорецептору, уровня экспрессии КАР тромбоцитами, а также проведение МРТ сердца с целью выявления или исключения отека и гиперемии.

Выявленный воспалительный и аутоиммунный компонент у пациентов с идиопатическими нарушениями проводимости может быть использован для определения показаний к применению специфической терапии, а также служить убедительным обоснованием более тщательного наблюдения за подобными пациентами.

7

Внедрение

Результаты исследования внедрены в научную и практическую работу отдела клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма сердца НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» Министерства здравоохранения РФ. Апробация работы

Материалы доложены на межотделенческой конференции НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова «РКНПК» Министерства здравоохранения РФ по апробации кандидатских диссертаций 12.05.2014 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ. Материалы диссертации были представлены на:

1. Международном Конгрессе по Тромбозу и гемостазу 2011 год, Киото, Япония

2. Международном Конгрессе по Тромбозу и гемостазу 2009 год, Бостон, США

3. 9ом Международном конгрессе по ишемической болезни сердца, 2011 год, Венеция, Италия

4. Европейском конгрессе по Сердечной недостаточности, Лиссабон, Португалия, 2013 год

5. Европейском кардиологическом конгрессе Амстердам, Нидерланды, 2013,

6. Международном конгрессе по тромбозу и гемостазу, Амстердам, Нидерланды, 2013

7. Московском Международном Форуме Кардиологов, Москва, 2013 год.

8. Конгрессе по тромбозу, Ницца, Франция 2012 год

9. 23 Международном конгрессе по тромбозу, Валенсия, Испания 2014г

10. Европейском кардиологическом конгрессе, Барселона, Испания 2014

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 174 публикации отечественных и иностранных авторов. Работа содержит 15 таблиц и 21 рисунков. Материал и методы исследования

Для решения поставленных задач были сформированы три группы обследуемых. В первую группу вошли 38 пациентов с нарушениями АВ и ВЖ проводимости (14 мужчин и 24 женщины, средний возраст 39,3±11,0 лет, группа «блокады»), у которых в процессе предварительного клинико-инструментального и лабораторного обследования не было выявлено признаков органического заболевания ССС. Предварительное клинико-инструментальное и лабораторное обследование включало в себя общеклинический и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, определение концентрации Т4 и ТТГ

в сыворотке крови, регистрацию ЭКГ в 12ти отведениях, эхокардиографическое исследование, суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру, велоэргометрию по стандартному протоколу Брюса, в некоторых случаях коронароангиографию (КАТ).

Вторую группу исследования, группу кардиомиопатий, («КМП»), сформировали 23 больных (10 мужчин и 13 женщин, средний возраст 40,5±10,5 лет), данные предварительного клинико-инструментального обследования которых соответствовали клиническому диагнозу дилатационной кардиомиопатии (наличие дилатированных камер сердца, снижение сократительной функции левого желудочка). Протокол обследования был аналогичен таковому для группы «блокады» (таблица 1).

Таблица 1. Клинико-инструментальные характеристики групп больных, включенных в исследование

Группа «блокады» п=38 Группа «КМП» п=23

Средний возраст, лет 39,3±11,0 40,5±10,5

Мужской пол — п (%) 14 (36,8) 10(43,5)

Длительность заболевания от момента клинического дебюта до включения в исследование от 2 недель 1,25[0,69; 4,85]

СН, ФК (ЫУНА) 0 2,4±1,44

Данные ЭХОКГ КДР ЛЖ (в см) 4,8±0,46 7,2±0,84

КСР ЛЖ (в см) 3,5±0,54 5,2±1,1

ФВ ЛЖ (в %) 63,2±3,4 31,9±8,2

ТМЖП (в см) 0,9±0,15 0,9±0,25

ТЗСЛЖ (в см) 0,9±0,13 0,8±0,13

Размер правого желудочка (в см) 2,5±0,3 3,2±0,9

СДЛА (мм рт.ст.). 25,7±2,3 31,9±8,2

Данные, ЭКГ ХМЭКГ ЧСС средняя 67±14,6 71,5±10,0

ЧСС максимальная 127,8±31,7 119,5±22,4

ЧСС минимальная 47,0±11,5 49,8±8,3

Общее количество ЖЭ 0,5[0;14,5] 1601[117;4231]

Количество эпизодов ЖТ 0 2,5[1,0;5,0]

Устойчивый синусовый ритм - п (%) 38(100) 23 (100)

Нарушение АВ проводимости- п (%) 14 (36,8) 5 (21,7)

Нарушение ВЖ проводимости - п (%) • БЛНПГ • БПНПГ 24 (63,2) 9 7 12 (52,2) 12 0

Терапия иАПФ/БАР- п (%) - 21 (91,3)

бета-блокаторы- п (%) - 20 (86,9)

Диуретики- п (%) - 18 (78,3)

AMP- п (%) - 18(78,3)

Амиодарон— п (%) - 0

Дигоксин- п (%) - 0

Примечания: Данные представлены как М (±о), как Ме [25; 75] или как количество больных (в%).

СИ - сердечная недостаточность, ФК - функциональный класс, КДР ЛЖ - конечно-диастолический размер левого желудочка, КСР ЛЖ - конечно-систолический размер левого желудочка, ТМЖП - толщина межжелудочковой перегородки; ТЗСЛЖ - толщина задней стенки левого желудочка ФВ ЛЖ - фракция выброса левого желудочка, СДЛА - систолическое давление в легочной артерии, ЧСС - частота сердечных сокращений, БЛИПГ -блокада левой ножки пучка Гиса, БПНПГ - блокада правой ножки пучка Гиса, ЖЭ - желудочковые экстрасистолы, ЖТ - желудочковые тахикардии, ЖЭ - желудочковые экстрасистолы, ЖТ - желудочковая тахикардия, иАПФ - ингибиторы ангиотензин превращающего фермента, БАР - блокаторы ангиотензиновых рецепторов, AMP - антагонисты минералкортикоидных рецепторов.

Критериями исключения из исследования являлись: 1) ИБС; 2) гипертоническая болезнь более 2 степени по классификации ВОЗ от 2008г.; 3) дисфункция синусового узла; 4) имплантированный ЭКС; 5) пороки сердца (врожденные и приобретенные); 6) острые инфекционные и воспалительные процессы и/или хронические воспалительные процессы в стадии обострения; 7) злокачественные новообразования на момент исследования; 8) коллагенозы: ревматизм, системная красная волчанка, склеродермия и др.; 9) заболевания почек с нарушением их функций - развитие признаков почечной недостаточности (снижение клубочковой фильтрации < 60 мл/мин); 10) заболевания печени с нарушением ее функций - развитие признаков печеночной недостаточности (повышение уровня печеночных ферментов в 3 раза и более); 11) заболевания эндокринной системы; 12) заболевания органов дыхательной системы: бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких и др. 13) заболевания пищеварительной системы, в том числе язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки; 14) заболевания мочеполовой системы; 15) психические расстройства, алкоголизм, заболевания центральной нервной системы.

Всем пациентам, включенным в исследование, помимо стандартного клинико-инструментального обследования определялись концентрации воспалительных цитокинов ФНОа, ИЛ-6, ТРФ-ßl, уровни антител к ßl-AP, М2-ХР, проводилась оценка экспрессии КАР на мембранах тромбоцитов, а также выполнялось МРТ сердца с контрастированием. Третья группа была сформирована из 12 здоровых добровольцев. Она являлась группой сравнения при исследовании концентрации воспалительных цитокинов, уровня аутоантител и экспрессии КАР на мембранах тромбоцитов.

Всем больным группы «КМП» выполняли КАТ с последующей эндомиокардиальной биопсией (ЭМБ), в ходе которой проводился забор 3-4 биоптатов правого или левого желудочка размером 1 мм3. Показания для выполнения ЭМБ определяли в четком соответствии с пунктами Консенсуса Европейского кардиологического общества (ESC), Американской Ассоциации сердца (AHA), Американского колледжа кардиологов (АСС) 2007 [Cooper L. и соавт. 2007]. Помимо рутинного гистологического анализа проводилось иммуногистохимическое исследование количественного и качественного состава иммунных клеток CD3+, CD4+, CD8+, CD68+, CD45RO в биоптатах, а также присутствия КАР на мембранах кардиомиоцитов. Для иммуногистохимической реакции использовался иммуногистостейнер BenchMark® XT фирмы «Ventana» (Roche, Франция), в процессе окраски использовались антитела фирм «Abcam Biochemicals», Великобритания «MP Biomedicals», Германия, «Сорбент», Россия, «SantaCruzBiotechnology», США. Иммуногистохимическая окраска препаратов ЭМБ с

Ю

последующим анализом выполнялась ст.н.с. отдела сердечно-сосудистой патологии к.м.н. Чумаченко П.В. Количественный анализ фиброза миокарда на препаратах ЭМБ, окрашенных трихромом по Массону, а также оценка интенсивность окраски клеточных мембран на КАР автоматически по трехбальной шкале выполняли с помощью Apeno Scan Scope CS (Apeno Technologies Inc, США).

Исследование образцов ЭМБ на наличие вирусов. Во всех эндомиокардиальных биоптатах изучали наличие вируса герпеса 1-2 типов (ВПГ1-2), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), вируса герпеса 6 типа (ВГЧ6), парвовируса В19 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР в реальном времени для определения ДНК герпесвирусов и парвовируса В19 проводили с помощью тест-систем фирмы «Интерлабсервис»: «АмплиСенс EBV/CMV/HHV-6- скрин-FL», «Ампли Сенс HSV1-2», «Ампли Сенс Parvovirus B19-FL». Для ПЦР-РВ использовали прибор «Rotor Gene 3000» и программное обеспечение к нему - «Rotor-Gene 6.0». Для выделения ДНК из биоптатов использовали реагенты фирмы «Интерлабсервис» - «ДНК-Сорб Б». Исследование наличия вируса Коксаки ВЗ методом ПЦР проводилось в НИИ Институт Вирусологии РАМН имени Д.И. Ивановского в лаборатории онтогенеза вирусов под руководством проф. Носика H.H.

Определение концентрации ФНОа, ТРФ-ßl, ИЛ-6 в сыворотке крови проводили стандартным непрямым иммуноферментным методом (ELISA) на планшетном фотометре Anthos-2020 (Anthos Labtec, Австрия) с помощью наборов «Human TNF-alpha Platinum ELISA», «HumanTGF-ßl Platinum ELISA», «Human IL-6 Platinum ELISA» («eDioscience -Bender Medsystems», США-Австрия).

Для выявления в сыворотке больных аутоантител к ßl-AP и М2-ХР использовались синтезированные в лаборатории синтеза пептидов Института экспериментальной кардиологии РКНПК под руководством Беспаловой Ж.Д. полипептидные фрагменты ß8 HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR и ß25 I^CWRAESDEARR.CYNDPK.CSDSV^K (197-222 ßl-AP) а также MRIYTVIGYWPLGVVCDL (83 - 98 М2-ХР) и MRI-MRIVYTVIGYWPLGVVCDL-VEDGECYIQFFS (83-98)-(171-182 М2-ХР).

Определение аутоантител было выполнено в лаборатории иммунохимии, под руководством Ефремова Е.Е. методом непрямого ИФА, с использованием ранее синтезированных пептидных последовательностей, моделирующих различные участки ßl-AP и М2-ХР. Учет результатов реакции ИФА осуществляли на спектрофотометре «Immunorech LMA01» при длине волны А = 450 нм. Уровень аутоантител определяли как отношение оптической плотности - ОП450 иммуноферментной реакции исследуемого образца к рассчитанной критической плотности - ОП крит, где ОП крит= ОП сред +

11

удвоенное стандартное отклонение, где ОП сред - среднеарифметический результат по всем исследуемым сывороткам пациентов. Положительными считали образцы, отношение ОП которых к ОП крит было больше или равно 1,0.

МРТ сердца выполнялась на сверхпроводящем магнитно-резонансном томографе "Magnetom Avanto" (Siemens, Германия) с полем 1,5 Тл, с поверхностной радиочастотной катушкой для грудной клетки. МРТ сердца проводилась при синхронизации с ЭКГ по следующим методикам: 1) "Turbo Spin Echo" для оценки анатомии исследуемой области. Получали Т1-взвешенные изображения (Т1-ВИ) с TR, равным интервалу R-R ЭКГ, ТЕ, равным 25 мс, матрицей 128 х 256 элементов, толщиной среза 8 мм, полем изображения 35-38, двумя усреднениями и числом срезов, равным 10—12;2) сегментированной последовательности triple inversion-recovery для получения Т2-ВИ и подавлением сигнала от жира (T2-STIR, TR/TE = 2210/81) для выявления отека в миокарде ЛЖ;3) кино-МРТ для расчета массы миокарда и объемных показателей ЛЖ (True FISP), TR = 40 мс, ТЕ = 6 мс, угол отклонения вектора намагниченности 40°, поле изображения 35 см, толщина среза 8 мм, число кадров в кинопетле от 12 до 16 в зависимости от частоты сердечных сокращений. Для проведения исследования с контрастированием сразу после выполнения кино-МР-последовательностей внутривенно вводили контрастный препарат гадолиний-ДТПА ("Магневист", фирма Schering, Германия) в дозе 0,15 ммоль/кг или 0,3 мл/кг веса тела. Сразу после введения первой дозы контрастного препарата для исследования раннего контрастирования (РК) получали Т1-ВИ, для чего применяли импульсную последовательность "Turbo Spin Echo" со следующими параметрами: TR < (RR - 50 мс), ТЕ = 1,2 мс, угол отклонения вектора намагниченности 8°, толщиной среза 10 мм, матрицей 128 х 80 элементов и полем изображения 30 см. Следующим этапом была оценка позднего контрастирования (ПК), для чего использовалась специальная сегментированная последовательность inversion-recovery (IR). Для оптимальной контрастности изображения у каждого пациента перед исследованием ПК индивидуально подбиралось время инверсии (TI), с помощью специальной программы TI-Scout. Значение TI составляло, как правило, 260-300 мс. Исследование выполняли через 10 минут после введения общей дозы контрастного препарата с помощью двух программ сканирования на задержке дыхания в течение 8 с. (TR=207 мс, ТЕ=4 мс, угол отклонения вектора намагниченности 40, матрица 128x256, поле изображения 30 и 35 см, толщина среза 8 мм, количество усреднений 8; TrueFISPTR/TE=700/l .2, FA=10).

Присутствие отека миокарда, а также РК и ПК оценивали в каждом из 17 сегментов миокарда ЛЖ на 3 срезах по короткой оси ЛЖ: в его базальном отделе (6 сегментов), на

уровне папиллярных мышц, где выделялось 6 сегментов, на уровне верхушки (4 сегмента) и непосредственно верхушечный сегмент по Cerqueira M.D. и соавт. (2002).

Выявление сегментов с признаками отека миокарда проводилось при сопоставлении интенсивности сигнала (ИС) миокарда на Т2-ВИ и ИС от скелетной мышцы. Значение относительного содержания воды в сегменте более 2 указывало на наличие отека миокарда. Выявление гиперемии миокарда с исследованием РК проводилось в каждом из 17 сегментов на Т1-ВИ до и после введения контраста. Сегмент считался накопившим контраст в раннюю фазу исследования при увеличении ИС после введения контраста в 4 и более раз по сравнению с исходной. При этом оценка увеличения ИС проводилась с учетом увеличения ИС скелетной мышцей после введения контраста (использовалась ИС от т. erector spinae). Для количественной оценки ПК миокарда на каждом срезе в двухкамерной проекции по короткой оси ЛЖ с помощью ручной обводки определяли площадь контрастированного миокарда, результаты по каждому срезу затем суммировались. Полученный результат умножался на толщину среза миокарда и таким образом вычислялся объем миокарда с поздним контрастированием гадолинием. Затем определялся процент пораженного миокарда по соотношению объема пораженного миокарда к общему объему миокарда, вычисленному по результатам кино-МРТ.

Оценка экспрессии КАР на мембранах тромбопитов. Из крови, взятой в раствор цитрата натрия центрифугированием при 180 g в течение 17 минут получали обогащенную тромбоцитами плазмы (ОТП).1 мл ОТП фиксировали в 1 мл 4% раствора формальдегида 10 минут при комнатной температуре, отмывали фосфатным буфером (ФБ) рН 7,4 с помощью центрифугирования (5 мин при 2000 g). Осадок ресуспендировали в 0,4 % растворе казеина или бычьего сывороточного альбумина (БСА) на ФБ и инкубировали 30 минут при 37СС. Полученную взвесь тромбоцитов инкубировали 30 мин при 37°С с моноклональными антителами к КАР Н-300 фирмы «Santa Cruz Biotechnology», США. После инкубации тромбоциты отмывали 3 раза ФБ центрифугированием при 2000 g по 5 мин и метили вторыми антителами (фикоэритрин-коньюгат козьих антител к иммуноглобулину кролика, разведение 1:1000 30 мин) при 37°С для введения флуоресцентной метки к первым антителам с последующей отмывкой ФБ 3 раза при тех же условиях. Осадок наносили на каплю заключающей среды (желатин) на предметном стекле, накрывали покровным стеклом и для стабилизации образца помещали на 10 минут в холодильную камеру при +4°С.Полученные образцы анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии с компьютерной регистрацией изображения на микроскопе Leica DM 5000 В при увеличении в 1000 раз. Процент КАР-

положительных тромбоцитов определялся подсчетом окрашенных клеток в 10 и более полях зрения при суммарной оценке 2000 клеток в каждом препарате.

Статистическая анализ полученных результатов включал методы описательной статистики: вычисление средних, стандартных отклонений, а также медианы и 25й и 75й перцентилей, определение критериев значимости - тест Манна-Уитни и F-критерий Фишера. Сравнение групп осуществлялось критерием Стьюдента для нормальных распределений, а также критерием Крускала-Уоллиса для ненормальных распределений и U-тест Манн-Уитни для сравнения непрерывных величин. Корреляционный анализ между переменными проводился по методу Спирмена. Для сопоставления диагностической ценности различных показателей применялся «ROC-анализ» (Receiver Operating Characteristic). Ввод данных, их редактирование и статистический анализ осуществлялся с помощью статистического пакета Статистика 8, SPSS 20.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для оценки возможных воспалительных изменений в миокарде у пациентов обеих группы была проведена МРТ по трем стандартным методикам: исследование отека миокарда на Т2-ВИ, гиперемии миокарда (РК) и ПК. Отек на Т2-ВИ выявлялся у 4 (18,2%) пациентов группы «блокады» и у 8 (36,4%) больных группы «КМП». Признаки отека выявлялись в сегментах различной локализации. При оценке РК на Т1-ВИ усиление интенсивности MP-сигнала определялось у 7 (31,8%) пациентов группы «КМП» и у 7 (31,8%) - группы «блокады». У пациентов группы «блокады» зоны гиперемии располагались преимущественно в перегородочной и боковой стенке, у пациентов группы «КМП» зоны гиперемии выявлялись с одинаковой частотой в различных сегментах миокарда ЛЖ. В некоторых случаях зона гиперемии совпадала с зонами отека или ПК. В фазу ПК у лиц группы «блокады» зоны патологического накопления гадолиния обнаружены не были. В противоположность этому у 12 пациентов группы «КМП» присутствовали очаги ПК, что свидетельствовало о наличии фиброзно-некротических очагов в миокарде. Количество пораженных сегментов у ПК-положительных больных колебалось от 2 до 17, процент пораженного миокарда составлял от 6,5 до 59% , в среднем 26,6 [12,3;41,7] %. Согласно Лейк-Луизским критериям (наличие >2 положительных феноменов) данные МРТ могут указывать на активное воспаление у 2 (9,1%) больных группы «блокады» и у 7 (31,8%) больных группы «КМП».

В ходе следующего этапа исследования была проанализирована концентрация периферических маркеров воспаления ФНОа, ИЛ-6 и ТРФ-01 в периферической крови у больных групп «блокады», «КМП» и в контрольной. Среди пациентов группы «КМП» ФНОа выявлялся в крови 60,8% больных, повышенный уровень ИЛ-6 у 26,1%, что было достоверно чаще, чем среди пациентов группы «блокады», у которых ФНОа определялся

14

в 21,1 % случаев, а ИЛ-6 - в 5,3% (р=0,024, 0,016). Концентрации ФНОа и ИЛ-6 у пациенты группы «КМП» были достоверно выше, чем у лиц группы контроля (3,54[0;86,68] против 0[0;0] пг/мл для ФНОа, р=0,0195 и 2,64[0,19;12,79] против 0,095[0;1,75] пг/мл, р=0,019 для ИЛ-6 соответственно). В тоже время различия в значениях ФНОа и ИЛ-6 между группами «блокады» и «КМП» были недостоверны. Факт выявления пациентов с повышенным уровнем провоспалительных цитокинов среди больных группы «блокады», возможно, указывает на воспалительную этиологии идиопатических нарушений проводимости сердца у части больных этой группы. Кроме того, среди пациентов группы «блокады» достоверно чаще наблюдалось высокое содержание профибротического цитокина ТРФ-Р1 (в 44,7 % случаев по сравнению с 17,4% в группе «КМП», р=0,012), его концентрация у больных этой группы была достоверно выше, чем у здоровых лиц (3567 [0;21545] против 0[0;0], р=0,019), что может указывать, как на прогрессирующий интерстициальный фиброз миокарда, так и на изолированное поражение проводящей системы сердца у этих пациентов.

Исследование уровня аутоантител к мембранным рецепторам позволило установить, что у пациентов группы «КМП» достоверно чаще, чем у пациентов группы "блокады" и у здоровых добровольцев выявляются антитела 1§0 к Р1-АР. Повышенный титр антител к Р1-АР (Р8) определялся у 73% больных, что достоверно чаще, чем среди больных группы «блокады» и у лиц контрольной группы (р=0,035, 0,004 соответственно). Повышенный титр антител к Р1-АР (р25) наблюдали у 39,1% больных этой группы. В свою очередь, антитела к М2-ХР, в частности, 1£М к МЫ-МЫУ выявлялись чаще у пациентов группы «блокады» (55,3% против 34,7% в группе «блокады» и 8,3% в группе контроля, р=0,04, 0,024 соответственно). Это наблюдение может указывать на важную роль аутоиммунных механизмов в развитии и поддержании, как воспалительных заболеваний миокарда, так и нарушений проводимости сердца у лиц без признаков органического поражения ССС.

При анализе эндомиокардильных биоптатов больных группы «КМП» у 14 (60,9%) из 23 больных количество иммунных клеток в ЭМБ превышало 14 на 1 мм2, что соответствует общепринятым критериям активного миокардита. Сопоставление клинико-инструментальных характеристик у больных с активностью воспаления в миокарде не позволило выявить значимых закономерностей. В дальнейшем все биоптаты были проанализированы на наличие вирусов. Вирусы ВПГ1-2, ВЭБ, ЦМВ не были обнаружены во всех 23 биоптатах. Отдельно в биоптатах 15 больных была исключена персистенция вируса Коксаки. Единственным обнаруженным вирусом в 9 биоптатах из 23 больных (39,1%) был парвовирус В19 в количестве от 87 до 250 000 копий ДНК на 1 мл лизата. В одном случае наличие парвовируса было ассоциировано с вирусом герпеса 6 типа в количестве 106 копий на 1 мл лизата. Сопоставление клинико-инструментальных данных

больных с персистирующей парвовирусной инфекцией и без нее не выявило различий по таким показателям, как длительность заболевания, функциональный класс сердечной недостаточности, эхокардиографические данные, данные ХМЭКГ. Достоверных отличий у больных с диагностированной вирусной инфекцией, при сопоставлении результатов анализа эндомиокардиальных биоптатов также не было обнаружено. Более того, персистенция вируса в ЭМБ не всегда сопровождалась гистологическим диагнозом активного миокардита (р=0,49) (рис. 1А-Е).

Рисунок 1. Сопоставление клеточной инфильтрации и наличия вирусов в миокарде. А, В, Д -окраска срезов ЭМБ гематоксилин-эозином; Б,Г,Е - иммуногистохимическая окраска на наличие иммунных клеток. Ядра клеток докрашены гематоксилином. (Б - окраска пероксидазным методом, Г - окраска щелочной фосфатозой, Е — двойная метка). AJB - препарат ЭМБ с полным отсутствием воспалительной инфильтрации в миокарде. Количество парвовируса В 19 - 250 тыс копий на 1 мл лизата миокарда. В, Г -препарат ЭМБ с диффузной клеточной инфильтрацией. Вирусы в препарате не обнаружены. Д, Е - препарат ЭМБ с выраженной очаговой клеточной инфильтрацией миокарда. Е - иммуногистохимическая окраска двойной меткой: пероксидазный способ окраски - CD3+ лимфоциты (коричневый цвет), окраска щелочной фосфатазой - CD68+ макрофаги (розовый цвет). Количество парвовируса В 19 в миокарде больного - 3,5 тыс копий на 1 мл лизата.

Отсутствие в биоптатах персистенции вируса Коксаки ВЗ сделало интересным

исследование его специфического рецептора на мембранах кардиомиоцитов - КАР. По

интенсивности иммуногистохимической окраски на КАР все образцы были разделены на

3 подгруппы (рис. 2). У больных, отнесенных к первой подгруппе КАР-экспрессии

16

(минимальная КАР-экспрессия, п=3), отмечалось еле заметное прокрашивание на КАР мембран кардиомиоцитов (рис. 2Г). Для второй степени КАР-экспрессии (п=14) было характерно слабое окрашивание клеточных мембран, гомогенное окрашивание цитоплазмы клеток, четкое окрашивание вставочных дисков (рис. 2В). Для больных с максимальной (третьей) степенью экспрессии КАР (п=6) было характерно плотное окрашивание в области вставочных дисков, а также по всей поверхности мембраны кардиомиоцитов, что наблюдалось и на поперечных, и на продольных срезах (рис. 2 А,Б). Сопоставление клинико-инструментальных характеристик исследованных больных позволило выявить следующие закономерности: больные с максимальной интенсивностью окраски (третья степень) отличались наличием дилатации правого желудочка (р=0,012) и большим функциональным классом сердечной недостаточности (р=0,048), чем больные с умеренной (второй) и низкой (первой) степенью КАР-экспрессии, что может отражать структурное ремоделирование кардиомиоцитов у больных с более тяжелым поражением миокарда.

Рисунок 2. Иммуногистохимическая окраска на КАР срезов ЭМБ. Ядра клеток докрашены гематоксилином. А, Б — препараты ЭМБ больного, относящегося к 3-ей подгруппе по степени интенсивности окраски на КАР. А - продольный срез кардиомиоцитов. Отмечается интенсивное окрашивание вставочных дисков, умеренное латеральных мембран и интерстициального пространства (стрелками указаны вставочные диски). Б - поперечный срез. Интенсивное равномерное окрашивание мембран кардиомиоцитов, интерстициального пространства, меди интрамурального сосуда (указано стрелкой). В - ЭМБ больного из 2-ой подгруппы по степени интенсивности окраски на КАР. Визуализируется слабое окрашивание мембран клеток, умеренное окрашивание цитоплазмы, интерстиция, вставочных дисков (указаны стрелкой). Г - ЭМБ больного из 1-ой подгруппы по степени интенсивности окраски на КАР. Отмечается еле заметное окрашивание мембран клеток (указано стрелкой).

Среди больных с низкой КАР-экспрессией чаще встречались больные с широким комплексом (ЗЯБ, что подтвердил корреляционный анализ: чем интенсивней была экспрессия КАР на мембранах кардиомиоцитов, тем меньше была вероятность БЛНПГ (г=-0,44, р<0,05), что, вероятно, указывает на роль этого рецептора в миокардиальной проводимости. В ходе анализа было обнаружено, что у больных с уровнем ИЛ-6, превышающим референсные значения, интенсивность экспрессии КАР на мембранах кардиомиоцитов достоверно выше, чем у больных с нормальными значениями этого показателя (2,5±0,55 против 2,0±0,43, р=0,036).

В рамках поиска дополнительного маркера, способного определять воспаление в миокарде у пациентов с идиопатическими нарушениями проводимости, нами был проанализирован уровень экспрессии КАР тромбоцитами у пациентов обеих групп и здоровых добровольцев. У здоровых добровольцев количество КАР-экспрессирующих тромбоцитов колебалось в пределах от 0,2 до 6.4%, в среднем 1,75 [0,75 ;3,4] %, при этом рецептор распределялся гомогенно по всей поверхности клетки (рис. ЗА,Б).

Ш мм ■ • • \ч,Мг • ш 1 * ' {ьшшятшш

ЁШЯ i Ш'-^Т г ФФ-Щ [ТШНВШМШ

Рисунок 3. Иммунофлуоресцентная окраска тромбоцитов на КАР здорового добровольца (А, Б) и больного группы «КМП» (В, Г). А - образец обогащенной тромбоцитами плазмы здорового добровольца. Б — то же поле, окраска тромбоцитов на КАР. КАР распределен гомогенно по всей цитоплазме клеток. В -образец обогащенной тромбоцитами плазмы больного группы «КМП». Тромбоциты объединены в микроагрегаты. Г - то же поле, окраска тромбоцитов на КАР. Повышенная экспрессия КАР определяется в местах межклеточных контактов. А, В - световая микроскопия. Б, Г — иммунофлуоресцентная микроскопия, увеличение хЮОО.

В обеих группах больных число КАР-положительных тромбоцитов было достоверно выше, чем в группе здоровых добровольцев (рис. 4), и составило 4,5 [2,0;8,9]%

в группе «блокады» (р=0,039) и 8,0 [4,0; 19,0]% (р=0,0002) в группе «КМП», при этом КАР локализовался в местах межклеточных контактов (рис. 3 В,Г ).

60%

к 40%

3 л

§ зоч

з: |

| 20% (L

х 104

Я о

С ^

Рисунок 4. Процент КАР-положительных тромбоцитов в группах «блокады» (п=38), «КМП» (п=23) и в контрольной группе (п=12). Данные представлены как медиана и 25-й и 75-й перцентиль, Min -минимальное значение показателя; Мах - максимальное значение показателя.

Для установления факторов, определяющих высокую концентрацию КАР на мембранах тромбоцитов, был проведен дополнительный анализ. Для выполнения этого анализа была специально сформирована группа со значением КАР-экспрессии, превышающим уровень КАР-экспрессии у здоровых добровольцев. В эту группу (КАР-позитивные) были отобраны 15 пациентов труппы "КМП" и 13 больных группы "блокады". Оставшиеся 33 пациента сформировали группу КАР-негативных. Сопоставление значений периферических показателей позволило обнаружить достоверно более высокий уровень аутоантител IgG к ßl-AP (ß25) и М2-ХР, а также концентраций ИЛ-6 и ФНОа в сыворотке крови подгруппы КАР-позитивных больных (таблица 2)

Таблица 2. Сравнение периферических маркеров воспаления у КАР-позитивных (более Т/о тромбоцитов, п=28) и КАР-негативных (менее 7% тромбоцитов, п=33) больных групп «КМП» и «блокады»

Периферические показатели КАР-негативиые больные (п=33) КАР-позитивные больные (п 2S) Р

Антитела IgG к ßl-AP (ß25) 0,68+0,21 1,099±0,73 0,009

Антитела IgG к М2-ХР (MR1) 0,67±0,12 0,97±0,36 0,026

ФНОа 0[0;3,54] 4,94Г0;75,П 0,0001

ИЛ-6 0,19[0;0,97] 3,75 Г0,19; 13,581 0,024

Примечания: Данные представлены как М (±а) или как Ме [25;75] /?¡-АР - /?1-адренорецептор, М2-ХР - М2-холинорецептор, ФНОа - фактор некроза опухоли, ИЛ- итерлейкин

В ходе ЯОС-анапиза была подтверждена определяющая значимость обозначенных 4 периферических сывороточных показателей (аутоантител к Р1-АР (|325) Э =0,889, антител ДО ДО к М2-ХР (МШ) 8=0,722, ИЛ-6 5=0,746, ФНО-а 8=0,698), а также Лейк-

19

Тест Крусхал«-Уоялиса: р=0,0005

♦ Медиане л 26-75 пвсцемткпо X МЫИах

8,0

&

1,75

Группа Группа

«блокады» «КМП»

Группа контроля

Луизских критериев воспаления по данным МРТ сердца. Наличие двух и более положительных МРТ-феноменов, указывающих на воспаление в миокарде, продемонстрировало высокую значимость (S=0,75) для повышения КАР экспрессии. Можно заключить, что экспрессия КАР на тромбоцитах тесно взаимосвязана с аутоиммунными и провоспалительными показателями. Подобная взаимосвязь свидетельствует о вероятной роли этого рецептора в сложных механизмах хронического воспаления и позволяет нам предложить использовать экспрессию КАР на тромбоцитах в качестве одного из периферических маркеров субклинических воспалительных поражений миокарда, проявляющихся нарушениями проводимости сердца.

По данным МРТ сердца очаговый фиброз миокарда (наличие очагов ПК) был выявлен нами у 12 (54,5%) из 22 больных группы «КМП». Сопоставление клинико-лабораторных показателей у ПК- позитивных и ПК- негативных пациентов позволило обнаружить, что больные с очаговым фиброзом миокарда характеризуются большим общим количеством ЖЭ (3643 [255;8500] против 659 [64;2403], р=0,04). Кроме того, эти пациенты характеризовалась большим уровнем IgG к (325 (1,16 [0,71 ;2,05] против 0,69 [0,54;0,93] соответственно, р=0,019) (рис. 5).

о X

0000

m 3

н »

о S

m et

о 2 -ЮОЭ

♦ Медиана й 25 - 75 перцвлиль

V Медиана g 25 - 75 перцентнль Т Min-Max

Рисунок 5. Результаты сопоставления значений желудочковой экстрасистолии (ЖЭ) и уровня антител IgG к ßl-AP (ß25) у больных группы «КМП» с зонами позднего контрастирования гадолинием (ПК) и без них. Данные представлены как медиана и 25-й и 75-й перцентиль, Min -минимальное значение показателя; Мах - максимальное значение показателя.

Полученные данные побудили к проведению корреляционного анализа, в ходе которого была подтверждена ассоциация повышенного уровня антител IgG к ßl-AP (ß25) с общим количеством ЖЭ, наличием ЖТ, а также долей миокарда с очаговым фиброзом (г=0,71; 0,55; 0,60 соответственно, р<0,05, рис. 6).

0.0 t-0

4000 8000 12000 16000

2000 6000 10000 14000

Количество желудочковых экстрасистол за сутки

10 20 30 40 50

Количество эпизодов ЖТ за сутки

О 10 20 30 *0 50 60 70 Доля объема миокарда с ПК (в %)

Рисунок 6. Взаимосвязь между уровнем антител IgG к рИ-АР (Р25), количественными проявлениями желудочковой эктопической активности и процентом объема миокарда ЛЖ с ПК по данным МРТ у больных группы «КМП».

В рамках работы были отдельно рассмотрены результаты МРТ у 12 больных с блокадой левой ножки пучка Гиса группы "КМП". Очаговый фиброз миокарда (зоны ПК) выявлялся у половины больных этой подгруппы. Из них всего у двух больных очаги фиброза располагались в межжелудочковой перегородке. Эндомиокардиальная биопсия, выполненная из этих зон, подтвердила наличие крупноочагового фиброза. Эти данные вместе с результатами МРТ у пациентов с нарушением ВЖ проводимости группы "блокады" позволяют предположить, что очаговый фиброз межжелудочковой перегородки не всегда является необходимым условием для формирования нарушений ВЖ проводимости как у больных с органическим поражением сердца, так и у больных без признаков поражения ССС.

Сопоставление показателей воспаления внутри группы "блокады" продемонстрировало, что у лиц с АВ-блокадой были зарегистрированы достоверно более высокие значение ФНО-а (0,5[0;36,3] против 0[0;0] пг/мл, р=0,044) и КАР-положительных тромбоцитов (7,0[5,0;8,9] против 3,0[2,0;4,0]%, р=0,032), чем у пациентов с идиопатическими нарушениями ВЖ проводимости. Это может указывать на большую значимость воспалительных механизмов у больных с АВ блокадами.

Важным этапом исследования было определение лабораторных и инструментальных показателей, наиболее точно соответствующих выявляемым по результатам ЭМБ признакам воспалительного поражения миокарда, с целью их дальнейшего использования в диагностике субклинического воспаления у пациентов с

21

идиопатическими нарушениями проводимости. Для поиска наиболее диагностически значимых признаков, связанных с воспалением в миокарде, проводился ROC-анализ, в ходе которого использовались данные, полученные в результате исследования показателей больных группы «КМП». В результате ROC-анализа из спектра исследованных параметров были отобраны следующие показатели: МРТ-критерии воспаления (S=0,750), антитела IgM к М2-ХР (MRI-MRIV, S=0,881 и MRI, S=0,766), а также процент КАР-положительных тромбоцитов (S=0,723). При этом разработанный нами экспериментальный показатель - процент КАР-положительных тромбоцитов -обладал максимальной чувствительностью (64,3 %) при специфичности 66,7%, что делает его возможным периферическим маркером при диагностике воспаления в миокарде. Для двух из выбранных показателей - Лейк-Луизских МРТ критериев и титра антител IgM к М2-ХР (MRIMRIV) была характерна максимальная специфичность - 100%. Учитывая возможность связи антител к М2-ХР с активностью воспаления в миокарде, дополнительно был проведен корреляционный анализ, подтвердивший прямую ассоциацию уровня антител IgM к М2-ХР (MRIMRIV) с воспалительными клетками CD3+, CD4+, CD8+ и CD68+ в составе инфильтратов в миокарде (г = 0,54, 0,72, 0,67, 0,75 соответственно, при р<0,05 рис. 7).

- о _

Уровень антител IgM к М2-холинорецептору ^Уровень антител 1дМ к М2-холинорецептору

Рисунок 7. Взаимосвязь между уровнем антител ^М к последовательностям МШ, МЯ1МРЛУи количеством воспалительных клеток различных популяций в эндомиокардиальных биоптатах больных группы «КМП».

На основании полученных в ходе работы результатов можно предполагать, что воспалительные реакции, в том числе имеющие субклинический характер, могут играть определенную роль в патогенезе идиопатических нарушений проводимости сердца.

выводы

1. Больные с идиопатнческимн нарушениями проводимости сердца отличаются достоверно большей концентрацией ТРФ-pi в сыворотке крови по сравнению со здоровыми добровольцами. Повышенный уровень ТРФ-pi, вероятно, отражает прогрессирующее фиброзирование проводящей системы сердца у подобных больных.

2. У больных идиопатическими нарушениями проводимости сердца в 55,3% случаев определяется повышенный титр аутоантител IgM к М2-холинорецептору. Исследование этого же показателя у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии позволило установить, что уровень аутоантител IgM к М2-холинорецептору ассоциирован с количественными проявлениями клеточной воспалительной инфильтрации миокарда.

3. Введенный экспериментальный показатель - уровень КАР-экспрессии тромбоцитов - напрямую связан с аутоиммунными (антитела IgG к pi-АР и М2-ХР) и провоспалительными (ФНО-а и ИЛ-6) показателями как у больных идиопатическими нарушениями проводимости, так и у больных с клиническим синдром дилатационной кардиомиопатии. Экспрессия КАР на тромбоцитах обладает 64,3% чувствительностью и 66,7% специфичностью при диагностике воспаления в миокарде.

4. Результаты работы не обнаружили прямой связи крупноочагового фиброза миокарда по данным МРТ с нарушениями проводимости как у больных без органического поражения миокарда, так и у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии.

5. Очаговый фиброз миокарда по данным МРТ совместно с выявлением аутоантител IgG к pi-АР тесно ассоциируется с возникновением желудочковых нарушений ритма сердца у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии.

6. Повышенная экспрессия КАР на мембранах кардиомиоцитов у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии характерна для больных с более тяжелым поражением миокарда, что может отражать структурное ремоделирование кардиомиоцитов в условиях патологии. Низкая концентрация КАР на мембранах кардиомиоцитов у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии характерна для больных с широким комплексом QRS, что может быть обусловлено прямым вкладом функций этого рецептора в миокардиальную проводимость.

7. Экспрессия КАР на клетках миокарда у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии напрямую ассоциирована с повышенной концентрацией ИЛ-6, но не зависит от персистенции вирусов или активности клеточной инфильтрации в миокарде.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для проведения дифференциального диагноза у пациентов с нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии сердечно-сосудистой системы в диагностический алгоритм, помимо стандартного клинического обследования, целесообразно включить исследование уровня антител IgM к М2-ХР, экспрессии тромбоцитами КАР рецептора, а также выполнение МРТ сердца с в/в контрастированием.

2. Выявление антител IgM к М2-ХР, повышенной экспрессии КАР на тромбоцитах, а также сочетания двух МРТ феноменов - отека и гиперемии - указывает на возможный воспалительный генез нарушений проводимости сердца.

3. Для оценки тяжести поражения миокарда у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии по данным эндомиокардиальной биопсии недостаточно подтверждения наличия клеточной воспалительной инфильтрации и вирусов в миокарде. Необходимо дополнительное определение экспрессии КАР на мембранах кардиомиоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Gupalo Е, Buriachkovskaia L, Othman M. Human platelets express CAR with localization at the sites of intercellular interaction // Virol J. - 2011. - vol. 8. - p. 456.

2. Гупало E.M., Миронова H.A., Рогова М.М., Чумаченко П.В., Ткачев Г.А., Наумова М.А., Нарусов О.Ю., Герасимова В.В., Бакалов С.А., Самко А.Н., Бурячковская Л.И., Терещенко С.Н., Голицын С.П. Исследование клинико-инструментальных и морфологических показателей, а также экспрессии Коксаки-аденовирусного рецептора у больных воспалительными заболеваниями миокарда // Кардиология - 2014. - №5. - с. 8-15.

3. Гупало Е.М., Стукалова О.В., Миронова H.A., Нарусов О.Ю., Величко Л.В., Чумаченко П.В., Самко А.Н., Голицын С.П. Возможности МРТ сердца в выявлении воспаления у больных с идиопатическими нарушениями проводимости сердца и у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии// Вестник Аритмологии — 2014. - № .-с.

4. Гупало Е.М., Стукалова О.В., Рогова М.М., Миронова H.A., Малкина Т.А., Шарф Т.В., Ефремов Е.Е, Герасимова В.В., Бакалов С.А., Голицын С.П. Взаимосвязь очагового фиброза миокарда по данным МРТ, аутоантител к мембранным рецепторам кардиомиоцитов и желудочковых нарушений ритма у больных дилатационной кардиомиопатией//Кардиология. - 2014. - № .-с .

5. Сумароков А.Б., Бурячковская Л.И., Учитель И.А., Широкова Т.Е., Гупало Е.М. Габрусенко С.А., Наумов В.Г.. Нарушения первичного звена гемостаза у больных дилатационной кардиомиопатией // Кардиология. - 2009. - № 9. - с.51-56.

6. Gupalo Е., Kuk С., Qadura М., Buriachkovskaia L., Othman М. Platelet-adenovirus vs. inert particles interaction: effect on aggregation and the role of platelet membrane receptors // Platelets. - 2013. - vol.24(5). - p.383-91.

7. Gupalo E.M., Buryachkovskaya L.I., Mironova NA. Platelets' CAR in normal and cardiovascular pathology// Journal of Thrombosis and Haemostasis - 2011. - 9. - Issue Supplement 2, - p. 967.

8. Gupalo E.M., Kuk C., Qadura M, Buryachkovskaya L.I., Othman M. Platelets participation in host defense; the role of platelet membrane receptors in platelet interaction with foreign particles //Journal of Thrombosis and Haemostasis - 2011. - 9. - Issue Supplements 2. - p. 314.

9. Gupalo E.M., Buryachkovskaya L.I, Sumarokov A.B. Platelets ability to phagocytosis depends on their functional activity and GPIIB/II1A // Journal of Thrombosis and Haemostasis. -2009. - vol. 7. - Supplement 2. - PP-WE-058.

10. Gupalo E.M., Buriachkovskaya L.I., Sumarokov A.B, Mironova N.A. Zykov K.A. Inflammatory dilated cardiomyopathy (DCMI) is accompanied by platelet activation and subsequent viruses internalization by them // Abstract book of 9th International Congress on Coronary Artery Disease. - 2011. - Suppl 1 (1). - 64.

11. Gupalo E.M., Buryachkovskaya L.I., Naumova M.A., Mironova N.A., Golitsyn S.P. Coxsackie-adenovirus receptor (CAR) in patients with cardiomyopathy of inflammatory and non-inflammatory etiology // European Journal of Heart Failure. - 2013. supplement 1 (15). - p. 602 (123).

12. Gupalo E.M., Buryachkovskaya 1.1., Uchitel I.A., Chumachenko P.V., Mironova N.A. Changes of platelet status in patients with inflammatory cardiac pathology// Journal of Thrombosis and Haemostatsis. - 2013. - vol. 11.- Suppl 2. - 793 PB2.68-4

13. Gupalo E., Buryachkovskaya L., Chumachenko P.V., Mironova N.A. Platelets coxsackie adenovirus receptor (CAR) in normal and inflammatory cardiac pathology // Thrombosis Research 2012. - vol.130. - Suppl 2, - p. 173.

Формат 60x90/16. Заказ 1772. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96