Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Клинико-вирусологические варианты течения хронических вирусных гепатитов и персонифицированная противовирусная терапия

На правах рукописи

Громова Наталья Ивановна

КЛИНИКО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ И ПЕРСОНИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТИВОВИРУСНАЯ ТЕРАПИЯ

14.01.09.- инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

6 ДЕК 2012

Москва-2012

005056811

005056811

Работа выполнена в ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» РАМН

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Л.Ю. Ильченк

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских

наук, профессор М.И. Михайло

Официальные оппоненты:

Сторожаков Г.И. доктор медицинских наук, профессор, академик РАМ]

Президент ГБОУ ВПО «Российский национальн] исследовательский медицинский университет имени Н. Пирогова», заведующий кафедрой госпитальной терапии ^

Беляева Н.М. доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДГ

РМАПО Минздрава Роса заведующая кафедрой инфекционных болезн

Климова Е.А. доктор медицинских наук профессор, ГБОУ ВП

«Московский государственный медико-стоматологическ университет имени А.И. Евдокимов; профессор кафедры инфекционных болезн(

Ведущая организация - ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановског Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «27» декабря 2012 г. в «10-00» часов на заседай] диссертационного совета Д 208.071.02 при ГБОУ ДПО «Российская медицинская академ; последипломного образования» Минздрава России (123995, Москва, ул. Баррикаднг д.2/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ДПО «Российская медицине» академия последипломного образования» Минздрава России (123445, Москва, у Беломорская, д. 19).

Автореферат разослан « ^^ » /-60 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

В.Я. Кица]

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Появление новых методов вирусологической диагностики в конце XX века позволило доказать единую природу острых и хронических вирусных гепатитов, представляющих собой фазы общего инфекционного процесса. Стало очевидным, что инфицирование гепатотропными вирусами является одной из основных причин хронических заболеваний печени, которые остаются важной медико-социальной проблемой здравоохранения [Соринсон С.Н., 1998]. Высокий уровень заболеваемости вирусными гепатитами, их хрониогенный потенциал с возможным исходом в цирроз и первичный рак печени, частое поражение лиц молодого возраста определяют актуальность и важность дальнейшего изучения этой проблемы.

По данным ВОЗ почти треть населения земного шара (2 млрд. человек) имели контакт с вирусом гепатита В (ВГВ), из них у 400 млн. человек HBV-инфекция приобретает хроническое течение [Абдурахманов Д.Т., 2010, Ghendon YZ., 1993]. Ежегодно от заболеваний, связанных с ВГВ, умирает 1 млн. человек, при этом HBV-инфекция занимает 10 место среди всех причин смерти. Естественное течение HBV-инфекции зависит от особенностей иммунного ответа организма и влияния таких факторов, как генетическая вариабельность вируса, иммуносупрессия, коинфекция вирусом гепатита D, употребление алкоголя и других токсических веществ. В настоящий момент совершенствование методов диагностики позволило выявить новую форму заболевания - латентную HBV-инфекцию, которая характеризуется наличием ДНК HBV в ткани печени при отсутствии HBsAg в крови. Изучение латентной HBV-инфекции затруднено необходимостью исследования молекулярно-биологическими методами биоптатов печени «благополучных» HBsAg-негативных пациентов, у которых отсутствуют показания к биопсии печени. Однако такие исследования необходимы не только для понимания патогенеза и характеристики выздоровления при HBV-инфекции, но также для определения понятия выздоровления с позиций современной молекулярной биологии и вирусологии при вирусных заболеваниях в целом.

Коинфицирование или суперинфицирование пациентов с HBsAg в крови вирусом гепатита D, существенно ухудшает прогноз заболевания в связи с его необычно высоким хрониогенным потенциалом. В случае присоединения HDV-инфекции быстро нарастает фиброз печени, а сроки формирования цирроза печени существенно сокращаются [Smedile A et al., 2002, Шахгильдян И.В. с соавт., 2003].

Вирусом гепатита С в мире по мнению разных авторов заражено от 130 до 200 млн. человек, распространенность HCV-инфекции имеет географические различия [Esteban JI et al., 2008, Shepard CW et al., 2005]. Естественное течение HCV-инфекции характеризуется развитием у 50-90% инфицированных лиц хронического гепатита с медленными темпами последующего прогрессирования заболевания [Afdhal N., 2004]. По мнению большинства авторов у 25% больных хроническим гепатитом С развивается цирроз печени, а у 1-5% из них - гепатоцеллюлярная карцинома. Вместе с тем, при HCV-инфекции, как и при других инфекционных заболеваниях, имеют место случаи спонтанного выздоровления, которые выпадают из поля зрения врачей и не находят отражения в медицинской литературе.

Появление возможности тестирования крови больных на недавно открытые вирусы G и ТТ ставит научный вопрос об их этиологической роли в патологии печени и других органов человека. В настоящий момент значение виремии HGV и TTV продолжает изучаться.

Наиболее эффективным методом лечения больных хроническими вирусными гепатитами является комбинированная интерферонотерапия с использованием пегилированных интерферонов в сочетании с различными препаратами противовирусного действия. Эффективность монотерапии аналогами нуклеоз(т)идов при ХГВ ограничена высокой частотой рецидивов после окончания лечения, что ведет к необходимости неопределенно долгой продолжительности противовирусной терапии. Кроме того, на фоне длительного лечения АН развивается лекарственная устойчивость к применяемым препаратам. Эффективность лекарственных препаратов при

НВУ-, НВУ/НБУ-инфекции, а также у пациентов с 1 генотипом ВГС не удовлетворяет ожидания врачей и пациентов. В связи с этим во всем мире продолжается поиск методов совершенствования этиотропной терапии хронических вирусных заболеваний печени, а также критериев оценки эффективности проведенного лечения.

Таким образом, можно выделить ряд актуальных направлений научных исследований обусловленных проблемами клинической практики и тактическими вопросами ведения пациентов с хроническими вирусными гепатитами. Это изучение клиническо-вирусологических вариантов течения и исходов хронических вирусных гепатитов; разработка критериев реконвалесценции; изучение закономерностей персистенции вирусов В и С в организме человека при естественном течении и после ПВТ; изучение факторов резистентности к лекарственным препаратам; изучение темпов прогрессирования заболевания и формирования фиброза у больных хроническими вирусными гепатитами; оптимизация противовирусной терапии. Актуальность нерешенных клинических проблем хронических вирусных гепатитов позволила сформулировать цели и задачи данного исследования.

Цель исследования.

Оптимизировать выбор персонифицированной противовирусной терапии на основе определения и клинико-вирусологической характеристики вариантов течения хронических вирусных гепатитов.

Задачи исследования:

1. Выявить клинические варианты течения хронических вирусных гепатитов В, С и Б и провести их сравнительную оценку с учетом вирусологических особенностей возбудителя, уровня активности процесса и стадии заболевания.

2. Определить частоту выявления латентного гепатита В среди больных с хроническими поражениями печени и реконвалесцентов НВУ-инфекции.

3. Характеризовать клиническое течение гепатита В в сочетании с дельта-вирусом и другими гепатотропными вирусами (в, ТТ).

4. Выявить особенности естественного течения и частоту формирования цирроза печени при хронической НВУ- и НСУ-инфекциях.

5. Оценить особенности микст-инфекции вирусами гепатитов й и ТТ у больных хроническим гепатитом С.

6. Оценить распространенность первичной лекарственной резистентности вируса гепатита В к аналогам нуклеоз(т)идов.

7. Обосновать выбор персонифицированной терапии больных хроническими вирусными гепатитами с учетом клинической картины болезни, особенностей возбудителя, вида лекарственных препаратов и схем терапии.

Научная новизна исследования

С помощью современных молекулярно-биологических технологий на большой когорте пациентов выделены клинико-вирусологические варианты течения хронических вирусных заболеваний печени с определением их состава.

Впервые обосновано выделение формы хронической НВУ-инфекции с нормальным уровнем трансаминаз в т. ч. в группе, так называемых, «носителей НВбАц».

Выявлена низкая частота латентной формы НВУ-инфекции у больных с хроническими заболеваниями печени, характеризующаяся минимальными клинико-биохимическими изменениями, низким уровнем виремии и отсутствием в структуре НВзА§ значимых аминокислотных замен. Иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методами с применением электронной микроскопии доказано, что после вирусного гепатита В в клетках печени сохраняются вирусные частицы и антигены вируса.

Установлено преобладание больных с наличием микст-инфекций (НВУ/ВДУ, НВУ/ТТУ, НВУ/НОУ, НСУ/ШУ, НСУ/ТТУ) среди

обследованной когорты пациентов. Выявлено, что вирусы в и ТТ не оказывают влияния на течение ХГВ, ХГС и эффективность противовирусной терапии, а моноинфицирование вирусами в и ГГ в половине случаев приводит к стеатозу печени. Установлено подавление виремии НОУ и ТТУ на фоне интерферонотерапии с последующим возобновлением репликации после отмены препаратов интерферона.

Среди пациентов с НВУ-инфекцией впервые определена частота мутаций, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью к аналогам нуклеоз(т)идов. При многолетнем наблюдении за больными с хронической НВУ- и НСУ-инфекцией получены новые данные частоты формирования цирроза печени и ГЦК.

Усовершенствованы подходы к выбору персонифицированной противовирусной терапии больных с хроническими вирусными гепатитами. Впервые показана клиническая значимость определения содержания HBsAg для оценки эффективности противовирусной терапии хронического гепатита В. Получены новые данные эффективности комбинированной ПВТ препаратами интерферона и аналогами нуклеоз(т)идов в сравнении с монотерапией аналогами нуклеоз(т)идов у больных ХГВ.

Практическая значимость.

Современные серологические и молекулярно-биологические методы исследования в комплексе с лабораторно-инструментальными способами оценки фиброза позволяют выделить новые клинические формы вирусных заболеваний печени, провести сравнительный анализ течения и исходов болезни.

Клиническое выздоровление после НВУ-инфекции сопровождается персистенцией возбудителя в клетках печени на фоне авиремии, что делает реконвалесцентов заболевания потенциально опасными при донорстве тканей и органов.

Исследование большой когорты пациентов свидетельствуют о преобладании больных с наличием микст-инфекций (НВУ/ШУ, НВУ/ТТУ, НВУ/НБУ, НСУ/ШУ, НСУ/ТТУ).

Использование метода ПЦР с высокой чувствительностью у, так называемых, «носителей НВвАд» и выявление низких концентраций ДНК НВУ позволяет рассматривать данную клиническую форму, как хроническую НВУ-инфекцию с нормальным уровнем трансаминаз.

Высокий уровень виремии НВУ соответствует более высоким показателям цитолитической активности у больных хроническим гепатитом В.

Отсутствие в крови РНК НСУ при наличии антител к НСУ класса в подтверждающем тесте, нормальная активность трансаминаз, нормальные размеры печени и селезенки являются основанием для выделения группы спонтанных реконвалесцентов НСУ-инфекции.

Персонифицированный метод выбора противовирусных препаратов при хронических вирусных гепатитах В, С и Б позволяет повысить эффективность лечения. Сочетание препаратов интерферона и аналогов нуклеоз(т)идов по сравнению с монотерапией аналогами нуклеоз(т)идов увеличивает частоту сероконверсии НВБАд у больных хроническим гепатитом В.

Применение индукционного метода лечения интерферонами «короткого действия» и рибавирином при хроническом гепатите С увеличивает частоту устойчивого вирусологического ответа. Коинфицирование вирусами в и ТТ не оказывает влияния на эффективность противовирусной терапии у больных хроническим гепатитом С.

Внедрение в практику и учебно-педагогический процесс.

Результаты проведенных исследований применяются при обследовании и лечении больных хроническими вирусными гепатитами в клинических отделениях ФГБУ «Поликлиника №1» и инфекционных отделениях ФГБУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента РФ, а также в клинических отделениях ФГБУ МСЧ №165 ФМБА

России. Материалы диссертации используются в преподавании курса инфекционных болезней студентам факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, на кафедре микробиологии и вирусологии медицинского факультета Российского Университета Дружбы Народов, а также при чтении лекций врачам и ординаторам лечебно-профилактических учреждений УД Президента РФ.

Личное участие автора

Автором лично проведено обследование и клиническое наблюдение 907 больных с хроническими вирусными заболеваниями печени. Личное участие автора состоит в непосредственной организации работы на всех этапах исследования: при формулировании цели и задач исследования, при разработке методических подходов и организации исследования, наборе и обработке статистического материала, анализе и интерпретации полученных данных, а также в подготовке материалов к публикациям по теме диссертации. Автором лично подготовлены рисунки (52) и таблицы (53), документально подтверждающие полученные результаты. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Использование комплекса современных высокочувствительных серологических и молекулярно-биологических методов исследования позволяет определить состав больных при различных клинико-вирусологических вариантах течения хронических вирусных гепатитов.

2. Выздоровление после перенесенного вирусного гепатита В представляет собой не полную элиминацию вируса, а формирование состояния контроля иммунной системы над возбудителем заболевания, при котором вирусные частицы длительно сохраняются в гепатоцитах, но отсутствуют в крови.

3. Среди больных с хроническими вирусными гепатитами преобладают пациенты с микст-инфекций ИВУ/НвУ, НВУ/ТТУ, НВУ/НОУ, НСУ/ШУ, НСУ/ТТУ.

4. Хроническая HCV-инфекция в сравнении с хронической HBV-инфекцией характеризуется более высоким уровнем воспаления и фиброза.

5. Среди пациентов с ХГВ, проживающих в Москве и Московской области частота мутаций первичной лекарственной резистентности к аналогам нуклеоз(т)идов выше, чем в других регионах РФ.

6. Применение персонифицированной противовирусной терапии, основанной на индивидуальном подходе к выбору лекарственных препаратов с учетом молекулярно-биологической характеристики возбудителя, особенностей организма больного, активности и стадии заболевания позволяет повысить эффективность лечения.

Апробация работы

Диссертация обсуждена и рекомендована к защите на межлабораторном совете Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН совместно с сотрудниками кафедры инфекционных болезней РМАПО 28.05.12 г.

Материалы диссертационной работы доложены на 3 Национальном конгрессе терапевтов в Москве (2008г), 10 и 11 международном СлавяноБалтийском научном форуме в Санкт-Петербурге (2008г, 2009г), 13 Международном симпозиуме «Viral Hepatitis and Liver Disease» в Вашингтоне, США (2009г), XVI и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» в Москве (2009г, 20 Юг). Кроме того, результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на VIII и IX Российской конференции с международным участием «Вирусные гепатиты -эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (2009г, 2011 г), XVI Российском конгрессе «Гепатология сегодня» (2011г), научно-практической конференции ЛПУ УД Президента РФ «Хронические заболевания печени как междисциплинарная проблема» (26 мая 2011 г), а также на кафедре инфекционных болезней ГБОУ ДПО РМАПО (29.03.12г).

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 265 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 6 глав - обзора литературы, описания материалов и методов, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, который содержит 248 источников, из них 30 -отечественных и 218 - иностранных. Диссертация иллюстрирована 52 рисунками, 53 таблицами, документирована 12 выписками из историй болезни.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 31 печатная работа, из них 15 - в российских рецензируемых научных журналах из перечня ведущих периодических изданий, рекомендованных ВАК.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В исследование включено 907 больных хроническими вирусными гепатитами. Критериями включения в исследование были обнаружение маркеров вирусов В, С, Ц в, ТТ у пациентов 18 лет и старше с хроническими гепатитами, подписавшими информированное согласие. Критериями исключения являлись - ВИЧ-инфекция, продолжающееся употребление психоактивных веществ и алкоголя за 6 месяцев до включения в исследование, онкологические и онкогематологические заболевания, беременность, лактация, декомпенсированные соматические заболевания, отсутствие информированного согласия на участие в исследовании.

Исследуемая группа состояла из 278 больных хроническим гепатитом В, 574 больных хроническим гепатитом С и 55 больных, в крови которых обнаруживали только ДНК ТТУ или РЖ НвУ в отсутствие маркеров НВУ-и НС У-инфекции (рис. 1, табл. 1).

Среди эпидемиологических факторов инфицирования преобладали операции или роды (у женщин) -350 чел.(38,59%). Все пациенты исследуемой группы хотя бы один раз посещали стоматолога, но 266 чел. (29,33%) отрицали какие-либо другие парентеральные манипуляции, кроме лечения зубов. Только третьей по численности оказалась группа пациентов,

получавших парентерально вводимые психотропные вещества - 130 чел. (14,33%). Переливания крови и кровезаменителей в период, предшествовавший заболеванию, получали 117 чел. (12,90%). У 29 больных (3,20%) в анамнезе имели место татуировки или пирсинг; 15 больных (1,65%) связывали свое заболевание со случайными половыми связями.

Хронические вирусные гепатиты

Рис. 1. Состав исследуемой группы.

Таблица 1. Распределение больных хроническими вирусными гепатитами по возрасту, продолжительности заболевания и наблюдения.

Показатели хгв (п=278) хгс (п=574) ТТУ и НйУ (п=55)

Средний возраст (годы) 50,05 38,71 45,22

Средняя длительность заболевания (годы) 11,89 (±7,3) 10,39 (±7,27) 5,55 (±4,06)

Средняя длительность наблюдения (годы) 7,18 (±6,38) 5,37 (±4,06) 2,45 (±2,01)

У 409 больных исследуемой группы (45,09%) отсутствовали какие-либо жалобы, заболевание было выявлено случайно при обследовании перед плановыми операциями, на фоне беременности (у женщин) или при диспансеризации. У остальных больных клинические проявления болезни были представлены: астеническим синдромом у 34,40% больных (п=312);

диспепсическими явлениями (сниженный аппетит, горечь во рту, тяжесть в правом подреберье) у 30,65% (п=278); болями в правом подреберье и эпигастральной области у 12,46% пациентов (п=113).

В исследуемой группе у трети пациентов (33,52%) уровень AJIT был в норме, у 28,67% уровень АЛТ не превышал 2-х норм, еще у трети больных (30,43%) - активность АЛТ была от 2 до 6 раз выше нормы. Только у 7,39% пациентов имел место выраженный цитолиз - АЛТ в 6 и более раз выше N.

Для решения поставленных перед исследованием задач всем 907 больным хроническими вирусными гепатитами проводился мониторинг клинических и биохимических анализов крови, общего анализа мочи, определение гормонов щитовидной железы, альфафетопротеина, факторов свертывания. Пациентам исследуемой группы проведено около 6700 молекулярно-генетических исследований включающих качественное и количественное определение нуклеиновых кислот вирусов, генотипирование и выявление мутантных форм возбудителя, а также более 10 000 серологических анализов крови. Исследование проводилось в течение 9 лет и включало в себя несколько этапов - изучение естественного течения HBV- и HCV-инфекдии, анализ моно- и коинфицирования вирусами G и TT, анализ результатов ПВТ.

Биохимические исследования крови выполнялись на автоматическом биохимическом анализаторе Cobac Mira Plus (Hoffman-LaRoche, Швейцария).

Молекулярно-биологические и серологические методы исследования проводились в лаборатории этиологии, диагностики, эпидемиологии и профилактики вирусных гепатитов ФБГУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова» РАМН (зав. лабораторией - к.б.н. Кюрегян К.К.) и в Центре молекулярной диагностики НИИ эпидемиологии (зав. лабораторией - к.м.н. Шипулин Г.А.).

Серологические маркеры инфицирования вирусами гепатитов В, С, D определялись методом ИФА с использованием диагностических тест-систем в соответствии с инструкцией производителя: «ДС-ИФA-HBsAg-0,01», «ДС-ИФА-анти-НВс», «ДС-ИФА-анти-HCV» и «ДС-ИФА-анти-HDV» (НПО

«Диагностические системы», г. Нижний Новгород). Количественное определение HBsAg (ME/мл) в сыворотке крови проводили методом иммунофлюоресценции с использованием набора Elecsys HBsAg II Kit и Diluent for HBsAg quantification на автоматическом анализаторе ELECSYS 2010 (Roche, Швейцария).

Выделение нуклеиновых кислот из образцов сывороток крови проводили методом экстракции фенол-хлороформом с помощью набора для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови по протоколу производителя (ООО НПФ «ЛИТЕХ»),

Определение ДНК ВГВ проводили в ПЦР с праймерами к консервативному участку перекрывающихся генов S и Р, кодирующих поверхностный белок и ДНК-полимеразу ВГВ. Чувствительность выявления ДНК ВГВ методом ПЦР составляла не менее 100 копий/мл по результатам тестирования серии предельных разведений образцов с известной концентрацией ДНК ВГВ.

ДНК TTV выявляли в образцах сыворотки крови методом ПЦР с праймерами к консервативному участку 5'-нетранслируемой области вирусного генома, предложенными Leary T. et. al., 1999г. Детекцию полученых в ПЦР ампликонов проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле.

Для выделеной РНК HGV проводили обратную транскрипцию с помощью набора «Реверта-L» производства ООО «ИнтерЛабСервис». Полученую кДНК амплифицировали в ПЦР с вложенными праймерами, специфичными к 5' нетранслируемой области генома HGV.

Определение РНК HCV методом ПЦР (качественно и количественно с генотипированием), проводили на амплификаторе Cobas Amplicor (Roche, Швейцария) с использованием тест-систем Abbot Amplcor (США), Вектор-бест и Ampli-sens (Россия).

Комплексное обследование пациентов, получавших ПВТ, проводилось до начала лечения, на фоне ПВТ (на 2, 4, 8, 12, 24, 36 и 48 неделях лечения), а

также через 24 и более недель после окончания лечения. Всем пациентам проводили ультразвуковое исследование органов брюшной полости и щитовидной железы на аппарате Sonoline Versa Plus и Sonoline Elegra (Германия).

Морфологические методы. С целью определения стадии фиброза 310 пациентам выполнены биопсия или фиброэластометрия печени. Чрезкожная пункционная биопсия печени проводилась аспирационным методом под местной анестезией иглой Menghini. Степень активности процесса в печени определялась с помощью индекса гистологической активности (ИГА) в баллах по Knodell и индекса фиброза в баллах по МЕТА VIR. Биопсия печени осуществлялась при подписании пациентами информированного согласия.

Биопсийный материал с соответствующей подготовкой был использован для проведения патогистологического, иммуногистохимического, электронно-микроскопического и ПЦР-исследования в лаборатории ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» (зам. директора института по научной работе - д.м.н., проф. Морозов И.А., зав. лабораторией - к.б.н. Кюрегян К.К.). Для иммуногистохимического выявления HBsAg, HBcAg и белка HCV использовали стандартные моноклональные антитела и современные системы визуализации фирмы «Novocastra» на парафиновых срезах по протоколам паспортов к антителам.

Электуонномикроскопическое иммуноиитохгшическое исследование биоптатов печени осуществлялось на ультратонких срезах, смонтированных на никилиевых сетках в соответствии с методиками, детально описанными в двухтомном методическом руководстве под редакцией Hayat М.А. «Colloidal Gold - principles, metods, applications» (издательство Academic Press.inc., 1989r, 536 стр.). Использовался метод Protein A - Gold postembedding immunoelectron microscopy, разработанный Bendayan M.

Статистическая обработка цифровых величин производилась с использованием программы Statistica 7.0 (StatSoft, Inc., США). Результаты представлены в виде среднего и его дисперсии М (SD) для количественных

переменных, имевших нормальное распределение, и в виде медианы и квартилей - для переменных имевших распределение, отличное от нормального. В некоторых случаях с целью характеристики величины изменения показателей результаты представлены в виде среднего и 95% доверительного интервала (95% ДИ). Степень достоверности различий между сравниваемыми величинами определяли по критерию Стьюдента (для переменных с нормальным распределением), методом Холмогорова-Смирнова (Kolmogorov-Smirnov) - для количественных переменных, имевших распределение, отличное от нормального, U-теста Манна-Уитни (Mann-Whitney) - для порядковых переменных, критерию х2 (с поправкой Йетса) - для сравнения пропорций. Критерий знаков применяли при сравнении двух связанных групп. Двусторонний точный критерий Фишера применяли при сравнении частот в малых выборках. Различия считались статистически значимыми, если значение р было менее 0,05.

Прогноз эффективности лечения проводился с помощью статистического метода дискриминантного анализа. Для статистического анализа полученных результатов использовались параметрические и непараметрические методы: коэффициенты корреляции (Пирсона, Spearman, Kendall Tau, Gamma), методы оценки достоверности различия средних в независимых выборках (по Стьюденту, Mann-Whitney, ранговый тест Wald-Wolfowitz, Kolmogorov-Smirnov).

Препараты противовирусной терапии. Противовирусные препараты назначались в зависимости от вида возбудителя. Применялись: 1) препараты стандартного интерферона «короткого» действия: реаферон - 3 млн МЕ для п/к введения; Россия; роферон А - Roche 3-5 млн МЕ для п/к введения; Швейцария; интрон А - MSD 3-5 млн МЕ; США; реальдирон - TEVA 3 млн МЕ; Израиль; 2) пегилированные препараты интерферона: ПЕГ-ИФН-альфа-2а (Пегасис), 135-180 мкг 1 р/нед. п/к; Roche, Швейцария; ПЕГ-ИФН - альфа-2Ь (Пегинтрон) 1,5 мкг/кг 1 р/нед. п/к; MSD, США.

При лечении больных ХГС комбинированная противовирусная терапия включала в себя препараты рибавирина в дозе 13-15 мг/кг: ребетол -копегус — Roche, Щвейцария; рибавирин-Медуна — Германия; рибапег - Макиз - Фарма, Россия. Для лечения больных ХГВ применялись препараты группы аналогов нуклеоз(т)идов: ламивудин - (эпивир, zeffix, Glaxo Smith Kline, Великобритания) 100 мг/сут., ингибитор обратной транскриптазы; адефовир дипивоксил (гепсера, Gilead Sciences, США) 10 мг/день, аналог нуклеотидов; энтекавир (baraclude, Bristol-Myers Squibb, США) 0,5 - 1мг в день, аналог нуклеозидов; телбивудин (себиво, Novartis, Швейцария) 600 мг/день, аналог нуклеозидов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Естественное течение HBV-инфекции. С целью оценки особенностей естественного течения HBV-инфекции были обследованы 240 пациентов с HBsAg в крови, из них 153 мужчины и 87 женщин.

В изучаемой группе 234 пациента (96,82%) являлись HBeAg-негативными. Анти-HBcor IgM были обнаружены в крови у 20 больных (8,33%). По результатам определения ДНК HBV методом ПЦР пациенты были разделены на 2 группы. В 1 группу вошли больные ХГВ, в крови которых обнаружены ДНК HBV и HBsAg (189 чел.), во 2 группу - т.н. «носители HBsAg», в крови которых обнаруживался HBsAg в отсутствии ДНК HBV (51 чел.). Обследование «носителей HBsAg» высокочувствительными методами ПЦР позволило в 31,08% случаев (у 23 больных из 74) выявить в крови низкий уровень виремии и перевести их в группу больных ХГВ, низкой активности.

Все HBeAg-позитивные пациенты, составлявшие лишь 2,5% (п=6), были выявлены среди больных ХГВ (1 группа), причем их средний возраст был достоверно ниже, чем у HBeAg-негативных больных (33,5 и 47,3 года соответственно), что подтверждает мнение о более ранней стадии HBV-инфекции у HBeAg-позитивных пациентов. С другой стороны это не может объяснить географических различий распространенности HBeAg-негативных форм заболевания.

У больных ХГВ имел место значительный диапазон колебаний уровня вирусной нагрузки - от 300 до 1 млрд. коп/мл, средняя вирусная нагрузка составила 25,06 млн. коп/мл. У большинства больных ХГВ выявлен низкий уровень репликации вируса (рис.2).

44,09%

х

Т~ 1

\у ет

]/ щ 23,66%

У 1а щ

К ет

8,07%

Щ рщ 3,76%4,84% ь'45%

3 щ 1— |

10*2 10*3 10*4 10*5 10*6 10*7 10*8 10*9

Рис. 2. Распределение больных ХГВ в зависимости от уровня вирусной нагрузки (п=189).

С целью оценки влияния репликации возбудителя на активность воспалительных изменений в печени был проведен раздельный анализ клинико-биохимических показателей у пациентов с низкой - 103 коп/мл и меньше (I группа) и высокой - 106 коп/мл и выше вирусной нагрузкой (II группа). Активность АЛТ и ГГТП в группе пациентов с высокой вирусной нагрузкой была достоверно выше, а увеличение размеров печени и селезенки встречалось в этой группе достоверно чаще (табл. 2).

Количественное определение уровня HBsAg было проведено у 52 больных ХГВ, полученный результат колебался от 160 до 1 млн МЕ/мл, средний уровень HBsAg составил 102 610 МЕ/мл. У большинства пациентов (80,78%) уровень НВзА§ был 10 000 МЕ/мл и ниже (рис.3).

На маркеры НГ) У-инфекции были обследованы 182 пациента, выявлено 16 больных вирусным гепатитом В+О (8,79%), из них у 3 пациентов в крови обнаруживались анти-НОУ в отсутствии РНК НОУ. Полученная частота выявления маркеров НОУ-инфекции у больных с НВзА§ в крови соответствует уровню заболеваемости в не эндемичных регионах.

Таблица 2. Клинико-биохимические показатели у больных ХГВ с низкой и высокой вирусной нагрузкой.

Показатели I группа п=105 II группа п=27 Статистическая достоверность различий

Вирусная нагрузка 103 и меньше 10б и больше -

Астенический синдром (%) 29,52 40,74 р>0,05

Диспепсические явления (%) 36,19 40,74 р>0,05

Средняя длительность заболевания (годы) 12,14 11,52 -

Средняя АЛТ (Е/л) 47,23 135,56 р<0,005

Средняя ГГТП (Е/л) 40,14 59,16 р<0,05

Увеличение печени (п/%) 11 (11,58%) 9 (33,33%) р<0,005

Увеличение селезенки (п/%) 9 (9,47%) 7 (26,92%) р<0,005

Фиброз 2-4 балла 47,1% 53,5% р<0,05

10*6 р 1,92%

10*5

17,31%

10*4 Е

10*3 Е

10*2 'С

3! 32,70%

28,85%

0% 10%

Ш!| 19,23% 20% 30%

40%

Рис.3. Распределение больных ХГВ в зависимости от уровня HBsAg (п=52).

Результаты сравнительной оценки клинико-биохимических показателей у больных ХГВ без дельта-агента и больных с ШЗУ-инфекцией свидетельствует о достоверно более высоком уровне активности воспаления в группе больных, коинфицированных вирусами ЯВУ и НОУ (рис.4).

N

г 60%

0%

20%

40%

>6Н НВУ

Рис.4. Уровень активности АЛТ у больных НВУ- и ГОУ-инфекцией.

Развитие цирроза печени имело место у 11 из 16 больных ХГВ+Э (68,75%), умер один больной, у которого на фоне цирроза печени была выявлена гепатоцеллюлярная карцинома. Вместе с тем, в группе больных ХГВ без дельта-агента цирроз печени сформировался лишь у 6 пациентов (3,62%), а гепатоцеллюлярная карцинома была обнаружена у 4-х больных (2,41%), т.е. всего ЦП и ГЦК - у 10 больных (6,02%). Причем у одного из больных с ГЦК отсутствовали признаки цирроза печени, что свидетельствует о необходимости наблюдения за пациентами, инфицированными вирусом гепатита В, с настороженностью к онкологическим заболеваниям печени. У двух пациентов из 240 произошла спонтанная сероконверсия НВБАд, что составило 0,83%. Таким образом, при выделении в отдельную группу пациентов с сочетанным инфицированием вирусами гепатитов В и Б становится очевидным, что они имеют значительно большую частоту формирования цирроза печени по сравнению с больными вирусным гепатитом В без дельта-агента (рис.5).

Интерес к проблеме латентного (скрытого, оккультного) гепатита В обусловлен значением этой формы инфекции для оценки степеш заразности пациентов, в крови которых имеются маркеры, указывающие на наличие в прошлом контакта с вирусом гепатита В. С целью обнаружения латентной НВУ-инфекции проведено исследование маркеров ВГВ в группе больных (п=216) с ХГС, не получавших противовирусную терапио, у которых при повторных исследованиях НВ5А£ в крови не обнаруживав.

хгв

6,02%

ШЫщ

хгв+о

Рис.5. Частота формирования цирроза печени и ГЦК у больных ХГВ и

В исследуемой группе у 88 пациентов (40,74%) маркеры НВУ-инфекции в крови отсутствовали. У 55 человек (25,46%) были обнаружены анти-НВэ и анти-НВсоге «Изолированные» анти-НВсоге (в отсутствии анти-НВв) выявлены у 50 больных (23,15%). У 23 человек (10,65%) в крови определялись только анти-НВз. При исследовании крови высокочувствительным методом ПЦР ни у одного пациента этой группы ДНК ВГВ обнаружена не была. Поскольку клинические показания к биопсии печени у пациентов данной группы отсутствовали, исследование ДНК ВГВ в ткани печени этих больных не проводилось.

Исследование было продолжено в группе, состоявшей из 60 пациентов гастроэнтерологического отделения с хроническими заболеваниями печени, в крови которых при серологическом исследовании выявлены анти-тела к НВсогА§. Сыворотки больных были обследованы высокочувствительным методом ИФА (чувствительность - 0,01 нг) на HBsAg и методом ПЦР с чувствительностью 75 коп/мл на ДНК НВУ, при этом ни у одного больного ДНК НВУ не была обнаружена. В результате выделена группа из 35 больных, наблюдавшихся с диагнозами - ХГС, хронический алкогольный гепатит, неалкогольная жировая болезнь печени и хронический гепатит неустановленной этиологии, у которых в крови определялись анти-НВсог при отсутствии НВзА§ и которым по показаниям, связанным с основным заболеванием была выполнена биопсия печени.

ХГВ+О.

Биопсийный материал 35 исследуемых пациентов с соответствующей подготовкой был использован для проведения патогистологического, иммуногистохимического, электронно-микроскопического и ПЦР-исследования. При исследовании биоптатов печени методом ПЦР в 1 случае из 35 у больной с неалкогольным стеатогепатитом была обнаружена ДНК HBV. Вирус относился к генотипу D, синонимических нуклеотидных замен в участках рамок считывания S- и Р-генов выявлено не было. При морфологическом исследовании ткани печени определен низкий индекс гистологической активности А-1, индекс фиброза F-1 (по МЕТА VIR). Таким образом, при исследовании ДНК HBV в сыворотке крови скрытая HBV-инфекция не была выявлена ни у одного из HBsAg-негативных анти-НВсог-позитивных пациентов, однако при исследовании биоптатов печени этих больных методом ПЦР удалось обнаружить ДНК HBV в 1 случае из 35.

Далее проведено иммуногистохимическое исследование биопсийного материала с моноклоиальными антителами к HBsAg и HBcAg с положительным и отрицательным контролями, при котором во всех 35 биоптатах обнаружена положительная реакция на HBsAg и HBcAg (рис.6).

N =Э - : -V

1 ■

Рис.6. Иммуногистохимическое исследование биоптата печени: а) HBsAg в гепатоцитах в фазе накопления (х 200); б) небольшое количество НВсогА£ при гепатите минимальной активности и слабой репликации вируса (х 400).

При электрон номикроскопическом изучении биопсийного материала у всех больных установлено наличие вирионов HBV в цитоплазме гепатоцитов. Вирусные частицы представляли собой сферические образования умеренной электронной плотности, с фестончатыми краями и слабовыраженным гликокаликсом. Средний диаметр вирионов составил 49,281±2,637 nm, что несколько больше, чем при негативном контрастировании (42 nm) уранилацетатом или фосфорно-вольфрамовой кислотой, перекрывающих фестончатый край и гликокаликс вирионов. Вид вирионов в цитоплазме гепатоцитов напоминал «эффект рассыпанного гороха». Принадлежность этих вирионов к HBV подтвержден электронномикроскопической иммуноцитохимической реакцией с моноклональными антителами к HBsAg и использованием комплекса Protein А - Colloidal Gold для визуализации реакции антиген-антитело (рис.7).

Рис.7, а) Множественные HBV-вирионы в цитоплазме гепатоцита больной со скрытым гепатитом В (х 20 ООО); б) Продукт иммуноцитохимической реакции с моноклональными антителами к HBsAg и комплексом Protein А -Colloidal Gold 15 нМ на вирионах (х50000).

Выявленные случаи «скрытой» HBV-моноинфекции характеризовались минимальными клинико-биохимическими и морфологическими

изменениями, а также отсутствием в структуре НВэЛ§ аминокислотных замен, способных повлиять на эффективность его детекции в ИФА.

Следующей частью изучения латентного гепатита было исследование сывороток группы «условно здорового» населения Республики Тыва (п=360), в которых обнаруживались анти-НВсог и отсутствовал НВвАд. Методом ПЦР с чувствительностью 75 коп/мл ДНК НВУ была обнаружена у 2 пациентов из 360 (0,56%). Таким образом, проведенное исследование подтверждает факт персистенции вируса гепатита В в гепатоцитах после перенесенного в клинически выраженной или субклинической форме гепатита В, поэтому диагностика т.н. «латентного» гепатита требует морфологического и молекулярно-биологического исследования биоптатов печени.

Спонтанное выздоровление и неблагоприятные исходы при естественном течении НСУ- инфекции. Под наблюдением находились 254 пациента с маркерами НСУ-инфекции, по разным причинам никогда не получавших ПВТ, в том числе лечение препаратами интерферона и рибавирина. У 194 больных в крови обнаруживали РНК НСУ и антитела к НСУ, у 60 пациентов на фоне нормального уровня трансаминаз выявлялись только антитела к НСУ при отсутствии РНК НСУ в трех исследованиях.

Проведена сравнительная оценка клинико-лабораторных показателей в группах больных ХГС и РНК НСУ-негативных «носителей анти-НСУ». Поскольку астенический синдром, увеличение размеров печени и селезенки, повышение уровня АЛТ, ГТТП, альфафетопротеина встречались статистически достоверно реже в группе «носителей анти-НСУ», полученные данные подтверждают спонтанное клинико-вирусологическое выздоровление у пациентов этой группы и позволяют считать их реконвалесцентами НСУ-инфекции. Анализ исходов заболевания в сравниваемых группах показал, что среди больных ХГС формирование цирроза печени имело место у 27 больных из 254, т.е. в 10,63% случаев. У двух пациентов с циррозом печени

была выявлена ГЦК (0,79%). Среди реконвалесцентов НСУ-инфекдии случаев развития цирроза и рака печени не зарегистрировано.

Сравнительная оценка клинико-лабораторных показателей у пациентов с ХГС и ЦП НСУ-этиологии позволила выявить сроки формирования необратимых изменений печени в исследуемой группе больных (табл.3).

Таблица 3. Сравнительная характеристика больных ХГС и циррозом печени НСУ-этиологии.

Показатели ХГС п(%) ЦП НСУ-этиологии п(%) Статистическая достоверность

АУ-АУ* К-Б** м-и***

Число больных (п) 167 27

Средний возраст больных (годы) 40,41+14,55 65,26+15,02 р<0,05 р<0,05 р<0,05

Средняя длительность заболевания (годы) 10,87+7,59 18,85+10,59 р<0,05 р<0,05 р<0,05

Средняя длительность наблюдения (годы) 4,8+3,46 9+6,07 р<0,05

1 генотип РНК НСУ 93 (55,69%) 20 (74,07%) р<0,05

- метод Вальд-Вольфовиц; **К-Б - метод Колмогоров-Смирнов; ***М - и - метод Манна-Унтни

Полученные результаты позволяют сделать вывод о развитии необратимых изменений в печени у больных ХГС в среднем через 18,85 лет от начала заболевания в возрасте 50 лет и старше (в среднем - 65,26 лет).

Сравнительная оценка активности воспаления и фиброза при ХГВ и ХГС. Проведен анализ клинико-лабораторных данных 852 больных, среди которых 278 - больные с НВУ-инфекцией и 574 - с НСУ-инфекцией.

Средний уровень АЛТ у больных ХГВ и ХГС - 57,66 и 109,07 Ед/л соответственно. В группе больных ХГВ преобладали пациенты с нормальным уровнем АЛТ (67,97%), тогда как среди больных с ХГС лишь у 12,01% пациентов уровень АЛТ был в норме. Вместе с тем уровень АЛТ - в 2 и более раз выше нормы определялся лишь у 13,42% больных ХГВ против 53,15% больных ХГС. Это позволяет сделать вывод о более высокой активности заболевания и более выраженном цитолизе у больных ХГС по

сравнению с больными ХГВ. Полученные различия статистически достоверны (р<0,001) (рис.8).

Оценка частоты формирования цирроза печени и ГЦК проведена в группах естественного течения болезни - у 217 больных ХГВ и 277 больных ХГС.

Полученные результаты частоты формирования ЦП у пациентов с ХВГ оказались ниже, чем в доступных нам литературных источниках и составили 6,45% (14/217) у больных ХГВ и 10,11% (28/277) у больных ХГС.

Нарастание числа случаев ЦП и ГЦК в старших возрастных группах демонстрирует различные темпы прогрессирования заболевания при ХГВ, ХГС и коинфицировании вирусами В+О (рис.9).

Рис.9. Распределение числа случаев ЦП и ГЦК в возрастных группах.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что НВУ-инфекция характеризуется преобладанием вариантов течения заболевания с низкой активностью воспаления и нормальным уровнем трансаминаз по сравнению с больными с НСУ-инфекцией. В большинстве случаев

прогрессирование заболевания идет медленными темпами, которые, тем не менее, нарастают у больных в возрасте 60 лет и старше.

Влияние инфицирования вирусами гепатитов G и ТТ на течение и эффективность лечения больных хроническими вирусными гепатитами.

С целью оценки частоты выявления HGV и ДНК TTV у больных с ХГВ и ХГС, а также изучения влияния HGV- и TTV-инфекции на течение вирусных гепатитов и эффективность комбинированной ПВТ были обследованы 712 больных с хроническими вирусными гепатитами различной этиологии. Из них: 479 больных с HCV-инфекцией, 178 больных с HBV-инфекцией и 55 пациентов, в крови которых обнаруживались только РНК HGV и/или ДНК TTV в отсутствие маркеров ВГВ и ВГС. Выявлены достоверные различия обнаружения ДНК TTV и РНК HGV: ДНК TTV обнаружена у 52,10%, а РНК HGV — только у 14,75%) пациентов исследуемой группы (р<0,05) (табл.4).

Таблица 4. Частота обнаружения РНК HGV и ДНК TTV у больных ХГВ и ХГС (*р<0,05).

Заболевания Число больных Частота выявления РНК HGV (п, %) Частота выявления ДНК TTV (п, %)

ХГВ 178 24 (13,48%)* 105 (60,34%)*

ХГС 479 67 (13,99%)* 196 (44,24%)*

HGV и/или TTV 55 14 (из них 6 - HGV/TTV) 41 (+6 HGV/TTV)

Всего 712 105 (14,75%)* 348 (52,10%)*

Исследование клинико-лабораторных показателей у моноинфицированых НСУ и коинфицированых НСУ/НОУ показало достоверно более частое повышение уровня АЛТ и более высокий средний уровень АЛТ в группе пациентов с коинфекцией по сравнению с пациентами с моноинфекцией НСУ (126,07 и 98,27 Е/л соответственно). Вместе с тем отсутствовали достоверные различия эффективности ПВТ в группах больных моноинфицированных НСУ и коинфицированных НСУ/НСУ (70,14% и 76,19% соответственно).

Несмотря на то, что ТТУ является гепатотропным вирусом, до сих пор не установлена прямая связь ТТУ-инфекции с развитием острого и хронического гепатита, гепатоцеллюлярной карциномы или другими заболеваниями. Важным фактором изучения распространенности и патогенеза ТТУ-инфекции является чувствительность метода выявления вирусной ДНК. В нашем исследовании обнаружение ДНК ТТУ зависело от используемого метода ПЦР и существенно отличалось при тестировании сывороток в разных лабораториях, причем расхождения результатов исследования методом ПЦР имели место почти в половине случаев (134/276). Применение праймеров к консервативному участку 5'НТО ТТУ, для которых ранее была подтверждена высокая чувствительность детекции различных вариантов ТТУ, позволило практически в два раза повысить частоту выявления ТТУ по сравнению с праймерами к участку открытой рамки считывания 1 (ОРС1), используемыми для ПЦР в лаборатории сравнения.

Статистический анализ влияния обнаружения ТТУ у больных ХГС на результаты комбинированной интерферонотерапии не выявил достоверных различий эффективности лечения в группах больных с моноинфекцией НСУ и ко-инфекцией НСУ и ТТУ (73,97% и 72% соответственно).

Результаты трехкратного обследования на ДНК ТТУ и РНК НвУ у пациентов с ХВГ, получавших комбинированную интерферонотерапию, показали, что интерферон подавляет репликацию ТТУ и НОУ в 68,97% и 76,66% соответственно, на что указывает исчезновение вирусной ДНК и РНК в сыворотке крови на фоне лечения. Однако устойчивый вирусологический ответ (отсутствие ДНК ТТУ и РНК НОУ в сыворотке крови после окончания ПВТ) наблюдался нами только в 18,97% и 23,33% случаев соответственно. У половины пациентов на фоне терапии интерфероном происходило подавление репликации ТТУ и НвУ с последующим её восстановлением после окончания лечения. Вместе с тем, у 31,03% и 23,33% пациентов влияние ПВТ на репликацию ТТУ и НвУ отсутствовало. Наблюдаемое нами

временное или постоянное подавление виремии ТТУ во время лечения, свидетельствует о противовирусном действии ИФН на ТТУ и НОУ.

Из 907 наблюдаемых больных у 55 пациентов в крови обнаруживались только РНК НОУ и/или ДНК ТТУ (6,06%) в отсутствии маркеров вирусных гепатитов В, С и Б. У лиц с моноинфекцией НОУ и ТТУ клиническая симптоматика инфицирования была скудной. Однако у 70,37% пациентов (п=38) этой группы, несмотря на молодой и средний возраст, отмечалось повышение уровня холестерина и явления стеатоза печени по данным УЗИ. Повышение уровня АЛТ имело место у 36 больных (65,46%), средний уровень АЛТ в группе составил 66,95 Е/л. У пациентов этой группы обращает на себя внимание преобладание повышения уровня ГТТП (средний уровень ГТТП - 111,25 Е/л). Полученные результаты исследования указывают на влияние репликации вирусов О и ТТ на процесс формирования жирового гепатоза.

Первичная лекарственная резистентность к аналогам нуклеоз(т)идов. Длительное персистирование вируса гепатита В и высокая частота развития спонтанных мутаций в вирусном геноме являются основой для селекции мутантных вариантов НВУ, ассоциированных с формированием лекарственной устойчивости к ингибиторам обратной транскриптазы. Некоторые спонтанно происходящие мутации генома НВУ получают селективное преимущество на фоне ПВТ. Однако мутации, связанные с лекарственной резистентностью, могут возникать и сохраняться в геноме НВУ до начала проведения ПВТ ИОТ. Раннее выявление вариантов НВУ с мутациями в гене полимеразы (Р-ген), ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости, является важным для больных, нуждающихся в терапии АН.

С целью изучения распространенности вариантов ВГВ с наличием мутаций лекарственной устойчивости к АН среди лиц, инфицированных ВГВ, ранее не получавших ПВТ, были исследованы образцы сывороток

крови 241 пациента с НВУ-моноинфекцией из регионов РФ с различной степенью интенсивности циркуляции ВГВ (табл.5).

Таблица 5. Частота выявления первичной лекарственной резистентности ВГВ

Регионы РФ Число больных Частота выявления мутаций в Р-гене ВГВ, п(%)

Московская обл. 60 9/60 (15%)*

Тамбовская обл. 79 1/79 (1,3%)*

Саратовская обл. 43 3/43 (7%)

Республика Саха 15 0/15 (0%)

Республика Тыва 44 2/44 (4,6%)* .. .

*р<0,01 - статистически значимые различия

При анализе аминокислотных последовательностей гена полимеразы ВГВ были выявлены 2 группы мутаций: значимые аминокислотные замены (мутации, описанные в литературе как обуславливающие развитие лекарственной устойчивости к терапии АН) и замены в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в литературе. Данные мутации рассматриваются как потенциально значимые, поскольку находятся в позициях Р-гена, имеющих решающие значение для диагностики лекарственной устойчивости.

Общая частота выявления мутаций ВГВ, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью в данной когорте пациентов составила 6,2%. Выявлены различия частоты первичной лекарственной резистентности в регионах РФ с различным уровнем циркуляции НВУ и интенсивностью применения АН.

Лечение больных ХГВ препаратами интерферона и аналогами нуклеот(з)идов. Проведен анализ результатов противовирусной терапии 61 пациента, получавших как препараты интерферона, так и АН. Больные ХГВ были разделены на две группы - пациенты I группы (п=31) получали комбинированную терапию с использованием препаратов интерферона и АН,

пациенты II группы (п=30) получали монотерапию АН. Несмотря на то, что на фоне ПВТ у 86,89% больных ХГВ был достигнут вирусологический ответ (ВО), сопровождавшийся нормализацией уровня трансаминаз, после окончания лечения у 89,4% из них развился рецидив заболевания. Устойчивого вирусологического ответа удалось добиться лишь в 14,82% случаев при использовании препаратов интерферона и АН и в 5% случаев при монотерапии АН у пациентов молодого возраста с небольшими сроками заболевания.

Лечение больных ХГС. С целью оценки возможностей индукционного метода комбинированной ПВТ по сравнению со стандартной терапией ИФН короткого действия и рибавирином проведен анализ результатов лечения 72 больных ХГС (46 - мужчин и 26 женщин). Из них 34 пациента получали стандартный курс ПВТ «короткими» ИФН и рибавирином, а 38 больным проведено лечение препаратами ИФН в сочетании с рибавирином в режиме ежедневного введения ИФН в течение первых 12-24 недель лечения (табл.6).

Таблица 6. Сравнительная эффективность противовирусной терапии у больных ХГС стандартным и индукционным методами (*р<0,005).

Группы стандартная ПВТ (п=34) индукционный метод ПВТ (п=38)

Эффективность лечения (все генотипы) 47,1% 60,5%

Эффективность лечения больных с 1 генотипом НСУ 35,3% 31,6%

Эффективность лечения больных с 2 и 3 генотипами НСУ 58,8%* 89,5%*

Полученные результаты ПВТ закономерно зависели от генотипа НСУ. Эффективность ПВТ у пациентов с 1 генотипом РНК НСУ в I и II группах больных была одинаково низкой, тогда как у больных с 2 и 3 генотипами РНК НСУ эффективность лечения была выше во II группе больных, в которой лечение проводилось индукционным методом, полученные различия достоверны. Таким образом, результаты исследования позволяют

рекомендовать применение индукционного метода ПВТ стандартными ИФН больным ХГС с 2 и 3 генотипами возбудителя.

Сравнительная эффективность лечения пегилированными иитерфероиами альфа-2а и альфа-2Ь в сочетании с рибавирином.

Проведен анализ результатов лечения 207 пациентов, получивших курс ПВТ ПЕГ-ИФН альфа 2а (ПЕГАСИС - Roche, Швейцария) и альфа 2b (MSD, США). Эффективность ПВТ без учета генотипа возбудителя в сравниваемых группах составила 77,98% и 74,49% соответственно (полученные различия были статистически достоверны методом Вальда-Вольфовица - р<0,001).

Однако у пациентов с 1 генотипом HCV эффективность лечения исследуемыми препаратами достоверных различий не имела - 66,07% и 60% соответственно (р>0,5). В группе больных с 2 и 3 генотипами HCV эффективность ПВТ была существенно выше и составила 90,57% у больных ХГС, получавших ПЕГ ИФН альфа-2а и 93,02% у больных, получавших ПЕГ ИФН альфа 2Ь (р<0,0001).

Исследование зависимости частоты формирования УВО от сроков достижения вирусологического ответа в ходе лечения свидетельствовало о достоверных различиях в группах больных ХГС с развитием ВО через 4,12 и более 12 недель ПВТ (рис.10).

4нед. (п=143)

эффективность

89,51% (п=128)

Сроки вирусологического ответа калечение

4-12 нед. : (п=44)

эффективность

63,64% (п=28)

—> более 12 еед. (п 20) ' - эффективность^ 10% (п=2)

Рис. 10. Эффективность лечения больных ХГС в зависимости от сроков развития БВО на фоне комбинированной ПВТ.

Лечение больных ХГС с нормальным уровнем трансамииаз. С целью оценки значения исходного уровня трансаминаз для течения заболевания и

формирования УВО при назначении препаратов интерферона и рибавирина, было проведено наблюдение и исследование сравнительной эффективности ПВТ в группах больных ХГС с нормальным и повышенным уровнем АЛТ. В исследование было включено 279 больных ХГС, из них у 45 пациентов (16,13%) уровень АЛТ был в норме.

Проведенный сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей свидетельствовал о меньшей выраженности проявлений заболевания у больных ХГС с нормальным уровнем трансаминаз. В этой группе реже встречались увеличение печени и селезенки, повышение уровня билирубина, ГГТП, сывороточного железа и альфафетопротеина, а при биопсии и эластографии печени реже выявлялся фиброз 2 балла и более. Таким образом, при равной средней длительности заболевания в сравниваемых группах, у больных ХГС с нормальным уровнем трансаминаз имела место более легкая форма заболевания (табл.7).

Таблица 7. Сравнительный анализ клинико-лабораторных данных у больных ХГС с нормальным и повышенным уровнем АЛТ.

Показатели Больные ХГС

АЛТ-К (Л, %) АЛТЖ (п, %)

Число больных 45 234

Общий билирубин >Ы (20,5 мкмоль/л) 4 (8,89%) 53 (22,65%)

ГГТП >42 Ед/л 8 (17,78%) 123 (52,56%)

Вирусная нагрузка > 2 млн МЕ/мл 12 (26,67%) 59 (25,21%)

Увеличение размеров печени 5 (11,11%) 63 (26,92%)

Увеличение размеров селезенки 6 (13,33%) 50 (21,37%)

Фиброз 2 балла и более при биопсии или эластографии печени 2/11 (18,18%) 11/37 (29,73%)

Исследование сравнительной эффективности ПВТ в группах больных ХГС с нормальным и повышенным уровнем АЛТ показало, что у больных, получавших интерфероны «короткого» действия и рибавирин эффективность

лечения составляла 52,24% и 53,33% соответственно. Достоверные различия между сравниваемыми группами отсутствовали. Среди пациентов получавших пегилированные интерфероны и рибавирин, эффективность лечения была выше и составила 83,33% в группе больных ХГС с нормальным уровнем AJIT и 76,05% у больных с повышенным уровнем AJIT (полученные различия в этой группе были статистически достоверны).

Таким образом, проведенное исследование позволяет рекомендовать назначение ПВТ больным ХГС вне зависимости от исходного уровня трансаминаз.

Эффективность укороченного курса противовирусной терапии больных хроническим гепатитом С. С целью изучения возможности сокращения длительности ПВТ и персонификации лечения, нами проведено исследование сравнительной эффективности стандартного и укороченного курсов ПВТ у больных ХГС. В исследование были включены 280 больных ХГС, получивших курс комбинированной ПВТ препаратами интерферона и рибавирина. Пациенты были разделены на две группы в зависимости от длительности курса ПВТ - пациенты I группы (190 человек) получили стандартный курс лечения, который зависел только от генотипа возбудителя и продолжался 48 недель у больных с 1' генотипом HCV и 24 недели у пациентов с 2 и 3 генотипами вируса. Во вторую группу (п=90) были включены пациенты, у которых курс ПВТ был сокращен в связи с развитием вирусологического ответа на 4 неделе лечения (БВО). При 1 генотипе HCV средняя продолжительность сокращенного курса лечения составила - 29 недель (стандартное отклонение - 6,76 недели), при 2 и 3 генотипах HCV- 19 недель (стандартное отклонение - 3,68 недели).

Полученные результаты убедительно свидетельствуют о том, что при лечении больных ХГС интерферонами «короткого» действия в сочетании с рибавирином сокращение курса ПВТ приводит к снижению эффективности лечения в 2 раза. В то же время у больных, получавших пегилированные интерфероны и рибавирин, эффективность лечения не зависела от

длительности курса ПВТ и составляла 77,86% в группе стандартной длительности лечения и 77,94% - в группе больных ХГС с укороченным курсом ПВТ. С целью определения оптимального уровня исходной вирусной нагрузки для принятия решения о сокращении курса ПВТ был проведен сравнительный анализ эффективности лечения в зависимости от этого показателя. Полученные данные позволяют считать оптимальным исходным уровнем для назначения укороченного курса ПВТ 400 тыс. МЕ/мл.

Заключение

Интерес к проблемам вирусных гепатитов обусловлен высоким хрониогенным потенциалом гепатотропных вирусов, преимущественно вирусов В, С и О. Прогрессирование заболевания до терминальных стадий поражения печени у больных вирусными гепатитами заставляет продолжать изучение клинико-вирусологических вариантов течения болезни, а также этиотропных методов лечения с целью повышения их эффективности и оптимизации результатов ПВТ. Совершенствование методов серологической и молекулярной диагностики, появление высокочувствительных лабораторных тестов позволяет существенно расширить представления об этапах инфекционного процесса при вирусных заболеваниях печени, клинико-вирусологических вариантах течения болезни, а также делает более объективным контроль эффективности противовирусного лечения.

Изучение естественного течения вирусных гепатитов на основе новых лабораторных методов привело к выделению новой формы НВУ-инфекции, которая получила название «латентного», «скрытого» гепатита, характеризующегося обнаружением ДНК НВУ в ткани печени или клетках крови HBsAg-нeгaтивныx пациентов. Однако частота выявления данной формы заболевания крайне низка, что удалось показать и в нашем исследовании. Мы обнаружили ДНК НВУ высокочувствительным методом ПЦР в сыворотке крови 2 из 360 НВзАд-негативных и анти-НВсог-позитивных пациентов (0,56%) в группе «условно здорового» населения Республики Тыва и в 1 биоптате из 35 (HBsAg-нeгaтивныx и анти-НВсог-

позитивных больных с хроническими заболеваниями печени). Выявленные случаи «скрытой» НВУ-инфекции характеризовались минимальными клинико-биохимическими и морфологическими изменениями.

Однако продолжение исследования с использованием иммуногистохимического метода и иммуноцитохимического метода с электронной микроскопией для изучения биоптатов печени НВбА§-негативных и анти-НВсог-позитивных больных позволило обнаружить в гепатодитах всех 35 исследуемых биоптатов как антигены вируса гепатита В (НВвА§ и НВсА§), так и сами вирусные частицы. Это, а также факты реактивации вирусных гепатитов на фоне иммуносупрессии, например, после трансплантации органов у лиц, перенесших вирусные заболевания печени в прошлом, приводит к заключению, что «латентный», «скрытый» гепатит является лишь формой завершения НВУ-инфекции, диагностика которой ограничена возможностями современной ПЦР-диагностики. Тогда как другие, технологически более сложные и малодоступные в практике методы, такие, как метод электронной микроскопии, свидетельствуют о значительно большей частоте персистенции вирусов гепатитов В, С, а также других вирусов в гепатоцитах реконвалесцентов вирусных заболеваний печени.

До настоящего времени у врача и пациента представление о выздоровлении после инфекционного заболевания ассоциируется с полной элиминацией возбудителя. Однако проведенные нами исследования позволяют сделать вывод о том, что выздоровление после вирусной инфекции представляет собой не столько элиминацию вируса, сколько развитие состояния устойчивого контроля иммунной системы над данным возбудителем, когда последний заключен в клетке печени, а, возможно, и в других клетках при отсутствии маркеров его репликации в крови. Вероятно, вирус может кратковременно находиться в кровеносном русле только в момент апоптоза клетки, но затем в течение короткого времени подвергается эррадикации клетками иммунной системы.

Анализ публикаций отечественных и зарубежных исследователей показывает, что частота выявления «скрытого» гепатита В увеличивается с повышением чувствительности методов детекции ДНК вируса гепатита В и снижается при повышении чувствительности тест-систем для HBsAg. Отсутствие детектируемого уровня ДНК вируса В в сыворотке крови не является фактом, исключающим наличие «скрытой» инфекции. С другой стороны, отсутствие НВбА§ в крови может быть вызвано рядом причин, которые могут действовать одновременно: влияние провоспалительных цитокинов на вирусную транскрипцию, приводящую к снижению уровня репликации и экспрессии НВзА§ и ДНК НВУ; формирование иммунных комплексов между НВзА§ и апй-НВз, не определяемых современными методами; появление мутаций в «а»-детерминанте Б-гена, приводящих к аминокислотным заменам в главной гидрофильной петле НВбА§ и невозможности обнаружения НВэАц с помощью используемых в настоящий момент методов его детекции, а также коинфекция вирусами НОУ, НСУ и другими, приводящая к снижению уровня репликации ВГВ и синтеза HBsAg.

Присутствие стабильно определяемых антител к HBcAg в отсутствии HBsAg обычно рассматривается как свидетельство перенесенной инфекции с элиминацией вируса и ремиссией заболевания. Однако у всех пациентов с антителами к HBcAg нами было установлено наличие вируса гепатита В в ткани печени методами световой и электронной микроскопии, в т.ч. у больных ХГС. Это позволяет сделать вывод о том, что анти-НВсог, длительно сохраняющиеся в сыворотке крови HBsAg-нeгaтивныx пациентов, могут рассматриваться, как суррогатный маркер продолжающейся вирусной репликации.

С другой стороны многолетнее наблюдение за пациентами, перенесшими НВУ- инфекцию свидетельствует о крайне редких случаях реактивации заболевания в клинической практике. Мы не наблюдали реактивации НВУ-инфекции, а реактивация НСУ-инфекции имела место лишь в одном из, более, чем 500 наблюдений у пациента с ХГС через 2 года после

эффективного курса комбинированной противовирусной терапии с возобновлением репликации РНК НСУ. Хорошо известно, что после перенесенной НВУ-инфекции в большинстве случаев наступает устойчивое, пожизненное клиническое выздоровление. Таким образом, выявленное в нашем исследовании длительное сохранение возбудителя заболевания в ткани печени у реконвалесцентов заболевания является формой выздоровления и характеризует выздоровление, как состояние иммунного контроля организма над вирусом. В этом случае находят объяснение данные о реактивации НВУ-инфекции только на фоне иммуносупрессии у пациентов, получающих иммуносупрессивную терапию, в т.ч. реципиентов донорских органов и ВИЧ-инфицированных больных.

Представленная концепция выздоровления при вирусных заболеваниях печени имеет важное практическое значение для оценки состояния здоровья доноров в трансфузиологии и трансплантологии, т.к. позволяет рекомендовать их обязательное обследование не только на НВэАе, но и на антитела к НВсогАд с исключением анти-НВсог-позитивных пациентов из донорства, особенно донорства органов. Представляется необходимым продолжение изучения этого вопроса при других вирусных болезнях человека, в т.ч. при НСУ-инфекции с постановкой биологических опытов заражения экспериментальных животных и использованием для этой цели экстракта биоптата печени реконвалесцентов заболевания.

Среди больных с НВУ-инфекцией заслуживает внимания группа пациентов с диагнозом «носительство НВэАд». Длительное наблюдение за пациентами этой группы свидетельствует с одной стороны об отсутствии у них признаков активности и прогрессирования заболевания. С другой стороны, в трети случаев обследование высокочувствительными методами ПЦР позволяет выявить у них ДНК НВУ с очень низким уровнем репликации и отнести их на этом основании к категории больных ХГВ низкой активности с нормальным уровнем трансаминаз. Очевидно, что дальнейшее повышение чувствительности метода ПЦР и появление новых методов вирусологической

диагностики приведет к выявлению вируса гепатита В у всех, так называемых «носителей НВзА§». Уже сейчас хорошо известна возможность инфицирования и заболевания при контакте с кровью и другими биологическими материалами пациентов этой группы.

Проведенный анализ клинико-лабораторных данных больных ХГВ с низкой и высокой вирусной нагрузкой выявил коррелятивную связь между уровнем виремии и активностью воспалительных изменений в печени. Тем не менее, среди «носителей HBsAg», имеющих крайне низкий, неопределяемый современными методами лабораторной диагностики уровень виремии, нами зарегистрирован случай развития ГЦК, связь которой с НВУ-инфекцией прослежена в целом ряде исследований. Таким образом, несмотря на отсутствие каких-либо клинических проявлений хронического гепатита, пациенты этой группы требуют наблюдения с настороженностью к развитию онкологических заболеваний печени.

Алгоритм диагностики вирусных гепатитов начинается с исследования сыворотки крови пациента методом ИФА, и несмотря на то, что при НСУ-инфекции РНК НСУ обнаруживается только у 2/3 пациентов с анти-НСУ в крови, выявление анти-НСУ практически является синонимом диагноза «вирусного гепатита С». Это приводит к исключению из внимания врачей и пациентов группы естественных реконвалесцентов НСУ-инфекции, которые, безусловно, имеются при данном заболевании, как и при других вирусных болезнях человека. В нашем исследовании из 277 больных с анти-НСУ в крови, у 66 пациентов (23,83%) при трехкратном повторном исследовании крови методом ПЦР РНК НСУ не обнаруживалась. Полученные сравнительные данные клинико-лабораторных показателей в группах больных ХГС и анти-НСУ-позитивных, РНК НСУ-негативных пациентов подтверждают спонтанное клинико-вирусологическое выздоровление у реконвалесцентов НСУ-инфекции. Вместе с тем, наличие в крови пациентов, перенесших НСУ-инфекцию, антител класса в течение многих

десятилетий также может указывать на сохранение РНК НСУ вне периферической крови.

Частота формирования цирроза печени при естественном течении НСУ- и НВУ-инфекции в исследуемой когорте больных ХВГ была ниже, чем в медицинской литературе и составила 6,45% у больных ХГВ и 10,11% у больных ХГС. Полученные результаты по нашему мнению связаны с тем, что в поле зрения врача-инфекциониста амбулаторной практики попадает весь спектр пациентов с вирусными заболеваниями печени (как больные с начальными проявлениями болезни и низкой активностью патологических изменений в печени, так и пациенты в исходе инфекционного процесса). Тогда как врачи-гастроэнтерологи сталкиваются преимущественно с больными, имеющими продвинутые формы заболевания при формировании цирроза и рака печени, что влияет на статистические показатели исходов болезни в исследованиях, проводимых на базе гастроэнтерологических, терапевтических и гепатологических отделений.

Поскольку продолжается изучение роли вирусов НОУ и ТТУ в развитии заболеваний печени и других органов нами проведено обследование более 700 больных ХГВ и ХГС методом ПЦР на ДНК и РНК этих вирусов. В нашем исследовании частота обнаружения РНК ШУ у больных с хроническими вирусными гепатитами была в 3,5 раза ниже, чем частота обнаружения ДНК ТТУ и составляла 14,75% и 52,10% соответственно. Проведенное исследование показало отсутствие влияния инфицирования НвУ и ТТУ на течение и эффективность ПВТ больных ХВГ. С другой стороны, выявлено подавление репликации РНК ШУ и ДНК ТТУ на фоне интерферонотерапии, которое в большинстве случаев носит временный характер.

Арсенал лекарственных препаратов для лечения хронического гепатита В расширяется и требует совершенствования знаний в этой области, а также исследования возможностей повышения эффективности его применения, поскольку лечение больных ХГВ остается трудной задачей. Проведенное исследование сравнительной эффективности ПВТ больных ХГВ препаратами

интерферона в сочетании с аналогами нуклеоз(т)идов и монотерапии аналогами нуклеоз(т)идов показало преимущество схем лечения, включающих препараты интерферона.

Эффективность ПВТ больных ХГС в нашем исследовании была значительно выше, особенно при использовании препаратов ПЕГ ИФН и рибавирина. Однако их высокая стоимость ведет к необходимости применения в части случаев препаратов ИФН «короткого действия». Использование нами индукционного метода лечения стандартными интерферонами позволило повысить эффективность лечения больных ХГС с 47,1% до 60,5% и рекомендовать ежедневное введение препаратов ИФН «короткого» действия в течение первых 12 недель лечения.

В наблюдаемой нами группе больных ХГС у 16,13% пациентов уровень АЛТ был в норме. Проведенный сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей больных ХГС с нормальным и повышенным уровнем АЛТ свидетельствовал о меньшей выраженности проявлений заболевания у больных ХГС с нормальным уровнем АЛТ. Сравнительный анализ эффективности ПВТ у больных ХГС с нормальным и повышенным уровнем АЛТ показал отсутствие достоверных различий эффективности лечения в этих группах, что позволяет рекомендовать проведение ПВТ больным ХГС вне зависимости от исходного уровня АЛТ.

Принципы лечения больных ХГС продолжают совершенствоваться на основе изучения факторов, влияющих на частоту формирования УВО. При выборе длительности курса ПВТ к таким факторам относятся исходная вирусная нагрузка и развитие ВО на 4 неделе лечения. Вместе с тем, остается не доказанным, какое пороговое значение следует использовать для оценки исходного уровня РНК НСУ (400 или 800 тыс. МЕ/мл). Проведенный анализ эффективности ПВТ в зависимости от исходного уровня вирусной нагрузки показал, что оптимальной для назначения укороченного курса лечения является вирусная нагрузка до 400 тыс. МЕ/мл.

Таким образом, проведенное исследование вариантов естественного течения хронических вирусных гепатитов В, С и Б позволило оптимизировать и персонифицировать этиотропную терапию больных с хроническими вирусными гепатитами, максимально использовав возможности имеющихся в настоящее время противовирусных препаратов.

Выводы

1. Установлено, что в исследуемой группе больных хронические вирусные гепатиты представлены многообразием клинических форм с различным уровнем виремии (от неопределяемого до высокого) и активности трансаминаз (от нормальной до постоянно повышенной), среди которых преобладают микст-инфекции (НВУ/ШУ, НВУ/ТТУ, ИВУ/НОУ,

нсу/шу, нсу/тту).

2. Выявление случаев скрытой НВУ-инфекции при использовании комплекса молекулярных методов детекции нуклеиновых кислот вируса, а также электронно-микроскопических методов исследования биоптатов печени свидетельствует о возможности персистенции вируса гепатита В в гепатоцитах после спонтанной реконвалесценции и ПВТ и позволяет утверждать, что при НВУ-инфекции выздоровление представляет собой не полную элиминацию вируса, а состояние контроля иммунной системы организма над возбудителем. Относительно малое количество случаев «скрытой» НВУ-инфекции объясняется высокой эффективностью применяемых методов определения НВзА§ (чувствительность метода -0,01 нг) и технологическими ограничениями применяемых методов ПЦР. Скрытый гепатит В характеризуется отсутствием в структуре НВзА§ значимых аминокислотных замен.

3. Впервые установлено, что среди НВУ-инфицированных пациентов, проживающих на территории РФ, первичная лекарственная резистентность вируса гепатита В составляет 6,2%. При анализе аминокислотных последовательностей фермента полимеразы вируса

гепатита В определены 2 группы мутаций: клинически значимые аминокислотные замены и потенциально-значимые мутации.

4. При естественном течении НВУ-инфекции уровень активности воспалительных изменений в печени коррелирует с уровнем вирусной нагрузки; присоединение ШУ увеличивает частоту формирования цирроза печени с 6,45% до 68,75%. НВУ-инфекция в сравнении с НСУ-инфекцией характеризуется преобладанием вариантов течения заболевания с низкой активностью воспаления. При естественном течении НСУ-инфекции цирроз печени развивается у 10,11% больных в среднем через 18,9 лет от момента инфицирования, а в 23,83% случаев имеет место спонтанное выздоровление.

5. Доказано, что персонифицированная терапия, основанная на индивидуальном выборе лекарственных средств с учетом молекулярно-биологической характеристики возбудителя и его чувствительности к противовирусным препаратам повышает эффективность лечения хронических вирусных гепатитов В, С и О и является основой современной терапевтической тактики при этих заболеваниях.

6. Эффективность ПВТ больных ХГВ низкая, однако использование препаратов интерферона в комбинации с аналогами нуклеоз(т)идов повышает эффективность лечения в сравнении с монотерапией аналогами нуклеоз(т)идов.

7. При лечении больных ХГС стандартными интерферонами «короткого» действия и рибавирином применение индукционного метода ПВТ с ежедневным введением ИФН повышает частоту стойкого вирусологического ответа с 47,1% до 60,5%.

8. Найдены доказательства сопоставимой эффективности укороченного и стандартного курсов ПВТ пегилированными интерферонами в сочетании с рибавирином в случае низкого исходного уровня РНК НСУ (400 ООО МЕ/мл и ниже) и развития ВО до 4 недели лечения. Установлено, что частота формирования УВО у больных ХГС с нормальным и повышенным

уровнем трансаминаз не имеет различий, поэтому ПВТ рекомендована больным ХГС вне зависимости от исходного уровня АЛТ.

9. Впервые установлено, что среди больных с хроническими вирусными заболеваниями печени моноинфекция ТТУ и/или ШУ составляет 6,06%. Более чем у половины моноинфицированных пациентов с ВДУ и ТТУ обнаружены проявления метаболического синдрома.

10. Установлено, что коинфицирование вирусами в и ТТ не влияет на эффективность противовирусной терапии больных ХГС и ХГВ. Интерферонотерапия приводит к подавлению репликации ШУ и ТТУ, однако этот эффект носит временный характер, после отмены лечения РНК НвУ и ДНК ТТУ вновь определяются в крови.

Практические рекомендации

1. Возможность развития ГЦК у больных ХГВ, в т.ч. без признаков цирроза печени, указывает на необходимость наблюдения за пациентами с НВУ-инфекцией с настороженностью к онкологическим заболеваниям печени.

2. Выявление латентной формы гепатита В у пациентов с анти-НВсог в сыворотке крови ставит вопрос о целесообразности обследования доноров органов не только на НВзА§, но и на анти-НВсог с исключением анти-НВсог-позитивных пациентов из донорства, особенно донорства органов.

3. С целью повышения эффективности противовирусной терапии больных хроническим гепатитом В рекомендовано использование комбинации препаратов интерферона и аналогов нуклеоз(т)идов.

4. Применение индукционного метода противовирусной терапии больных хроническим гепатитом С препаратами интерферона «короткого действия» целесообразно для повышения эффективности лечения.

5. Сопоставимая эффективность лечения больных хроническим гепатитом С с нормальным и повышенным уровнем трансаминаз позволяет рекомендовать проведение комбинированной противовирусной терапии больным ХГС вне зависимости от уровня АЛТ.

6. У больных ХГС курс ПВТ пегилированными ИФН и рибавирином может быть сокращен до 29 недель при 1 генотипе возбудителя и до 19 недель при 2 и 3 генотипах без снижения эффективности лечения в тех случаях, когда исходный уровень РНК HCV 400 ООО ME/мл и ниже, а вирусологический ответ развивается на 4 неделе лечения.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Громова Н.И., Ильченко Л.Ю. Эффективность лечения больных вирусным гепатитом С препаратами интерферона и рибавирина. //Сборник трудов ГУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» 2007, с. 171 - 174.

2. Громова Н.И., Богомолов Б.П.' Сравнительная эффективность и побочные реакции при комбинированной противовирусной терапии больных ХГС. //Клиническая медицина - 2008 - №9, с. 43 - 46.

3. Лопаткина Т.Н., Громова Н.И., Попова E.H., Краснова М.С., Осипенко В.И., Розина Т.П. Редкие нежелательные явления противовирусной терапии ХГС: саркоидоз. // Клиническая гепатология 2008 - №3, стр.3 - 7.

4. Громова Н.И., Ильченко Л.Ю. Эффективность комбинированной противовирусной терапии больных хроническим гепатитом С. //Материалы 10 Славяно-Балтийского научного форума в журнале Гастроэнтерология Санкт-Петербурга 2008-№2-3-М28.

5. Гордейчук И.В., Громова Н.И., Ганина A.A., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю. Латентный гепатит В в клинической практике (уровень распространения в различных группах населения). // Сборник материалов 3 Национального конгресса терапевтов, М., 2008 с. 54—55.

6. Громова Н.И., Богомолов Б.П., Ильченко Л.Ю., Кюрегян К.К, Михайлов М.И. Сравнительная оценка эффективности и безопасности комбинированной противовирусной терапии хронического гепатита С. //Материалы 11 Славяно-Балтийского научного форума в журнале Гастроэнтерология Санкт-Петербурга - 2009 - №2-3 - М23 - А77.

7. Гордейчук И.В., Громова Н.И., Кюрегян К.К, Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Частота латентной HBV-инфекции у пациентов, инфицированных вирусами гепатитов С, G и ТТ. //Материалы 11 Славяно-Балтийского научного форума в журнале Гастроэнтерология Санкт-Петербурга 2009 -№2-3 М20 — А68.

8. Громова Н.И., Гордейчук И.В., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Эффективность комбинированной интерферонотерапии у больных хроническим гепатитом С, коинфицированных TTV и GBV-C. // Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек, и лекарство», М., 2009 - с. 77 -78.

9. Ilchenko L Y, Gromova N I, Kyuregyan К К, Gordeichuk IV, Mikhailov M I. // Influence of combined IFN-a therapy on virological response in patients with CHC co-infected with TTV/GBV-C. 13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease Washington, DC USA March 20-24, 2009 Poster presentation, A134.

10. Isaeva О V, Gromova N I, Kyuregyan К К, Kozhanova T V, Gordeichuk I V, Malinnikova E Y, Mikhailov M I, Tsikina M N, Potenina L P, Pronin A Y. Prevalence of primary HBV resistance to nucleot(s)ide analogues in HBV infected and HBV/HIV coinfected patients. //13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease Washington, DC USA March 20-24, 2009 OP-34.

11. Гордейчук И.В., Громова Н.И., Исаева O.B., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Распространенность скрытой ВГВ-инфекции среди пациентов с хроническими заболеваниями печени. //Материалы VIII Российской конференции «Вирусные гепатиты», Мир вирусных гепатитов, 2009 - №2 -А25.

12. Гордейчук И.В., Громова Н.И., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Вирусологический ответ на комбинированную терапию интерфероном-альфа у пациентов с хроническим гепатитом С, коинфицированных TTV/GBV-C. //Материалы VIII Российской конференции «Вирусные гепатиты», Мир вирусных гепатитов - 2009 -№2 - А27.

13. Исаева О.В., Гордейчук И.В., Громова Н.И., Кожанова Т.В., Кюрегян К.К., Малинникова Е.Ю., Пронин А.Ю., Потенина Л.П., Цыкина М.Н., Михайлов М.И. Распространенность первичной устойчивости ВГВ к терапии нуклеотидными/ нуклеозидными аналогами среди пациентов с моноинфекцией ВГВ //Материалы VIII Российской конференции «Вирусные гепатиты», Мир вирусных гепатитов - 2009 - №2 - А48.

14. Громова Н.И., Гордейчук И.В., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Клинико-эпидемиологические аспекты латентной HBV-иифекции. //Кремлевская медицина - 2010 - №3, стр. 25 - 28.

15. Громова Н.И., Лопаткина Т.Н. Внелегочный саркоидоз при комбинированной противовирусной терапии ХГС. //Эпидемиология и инфекционные болезни - 2010 - №6, с. 42 - 44.

16. Ильченко Л.Ю., Гордейчук И.В., Громова Н.И., Морозов И.А., Исаева О.В., Кюрегян К.К., Федоров И.Г., Михайлов М.И. Возможности современной диагностики латентной ВГВ-инфекции. // Материалы XVII Российского Национального конгресса «Человек и лекарство», М., 2010 — с. 122.

17. Кожанова Т.В., Исаева О.В., Клушкииа В.В., Ооржак Н.Д., Саян P.M., Громова Н.И., Знонко О.О., Цыкина М.Н., Ильченко Л.Ю., Кюрегян К.К., Михайлов М.И. Распространенность первичной лекарственной резистентности вируса гепатита В к аналогам нуклеозидов и

нуклеотидов у инфицированных пациентов в различных регионах России. //Эпидемиология и Вакцинопрофилактика - 2011 - №1 (56), с.17-21.

18. Громова Н.И., Гранкова Т.М., Гордейчук И.В., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Влияние инфицирования вирусом TT на течение и эффективность лечения хронических вирусных гепатитов. //Инфекционные болезни - 2011 - №1, с. 14 -18.

19. Громова Н.И. Применение индукционного метода комбинированной интерферонотерапии для лечения больных ХГС. //Иммунопатология. Аллергология. Инфектология - 2011 - №2, с. 36 - 40.

20. Кожанова Т.В., Исаева О.В., Громова Н.И., Ильченко Л.Ю., Кюрегян К.К., Михайлов М.И. Первичная лекарственная резистентность вируса гепатита В. //Материалы 16 Российского конгресса «Гепатология сегодня» Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии 2011, №1 -Т21-С. 97.

21. Кожанова Т.В., Исаева О.В., Клушкина В.В., Ооржак Н.Д., Саян P.M., Алексеева М.Н., Миронова Н.И., Громова Н.И., Знойко О.О., Цыкина М.Н., Ильченко Л.Ю., Кюрегян К.К., Михайлов М.И. Распространенность первичной лекарственной резистентности вируса гепатита В к аналогам нуклеоз(т)идов у ВГВ-инфицированных пациентов в различных регионах РФ. //Дальневосточный журнал инфекционной патологии - 2011 - № 18, с.41-47.

22. Громова Н.И. Эффективность противовирусной терапии у больных хроническим гепатитом С, протекающим с нормальным уровнем АЛТ. //Инфекционные болезни - 2011 - том 9 - №4 - с. 5-10.

23. Громова Н.И. Эффективность укороченного курса противовирусной терапии у больных хроническим гепатитом С. //Иммунопатология, аллергология, инфектология - 2011 - №4 - с. 67-73.

24. Громова Н.И. Эффективность противовирусной терапии больных ХГВ. //Инфекционные болезни - 2012 - том 10 - №1, с. 15-20.

25. Громова Н.И., Гордейчук И.В., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Клиническая значимость выявления РНК HGV у больных вирусными гепатитами. //Эпидемиология и инфекционные болезни - 2012 - №2, с. 35-40.

26. Громова Н.И. Роль хронических вирусных гепатитов в формировании цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. // Иммунопатология, аллергология, инфектология -2012 - №1 - с.37-44.

27. Громова Н.И. Спонтанное выздоровление и неблагоприятные исходы при естественном течении HCV-инфекции. //Клиническая медицина -2012-№4-с. 52-56.

28. Громова Н.И., Гордейчук И.В., Зубков Ю.П., Кожанова Т.В., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Естественное течение

хронической HBV-инфекции. //Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии - 2012 - №3 - с. 10-18.

29. Морозов И.А. Ильченко Л.Ю., Громова Н.И., Фёдоров И.Г., Гордейчук И.В., Княженцева А.К., Зверкова Е.А., Михайлов М.И. Проблемы скрытой инфекции, вызванной вирусом гепатита В. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2012 - №4, с. 58-65.

30. Громова Н.И., Ильченко Л.Ю., Кожанова Т.В. Особенности течения и опыт противовирусной терапии больных хронической дельта-инфекцией. //Кремлевская медицина - 2012 - №1 - с. 180-185.

31. Громова Н.И. Сравнительная эффективность лечения больных хроническим гепатитом С пегилированными интерферонами альфа-2а и альфа-2Ь в сочетании с рибавирином. //Доказательная гастроэнтерология -2012-№2-с. 3-8.

Список сокращений

АЛТ - аланиновая аминотрансфераза АН - аналоги нуклеоз(т)идов

анти-НВс IgG - антитела к cor - антигену вируса гепатита В Yg класса G

анти-НВс IgM - антитела к cor - антигену вируса гепатита В Yg класса M

анти-НВе — антитела к антигену е вируса гепатита В

анти-HBs — антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В

анти-HCV IgG - антитела к вирусу гепатита С иммуноглобулинов класса G

анти-НС V IgM - антитела к вирусу гепатита С иммуноглобулинов класса M

HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В

HBcAg - капсидный белок вируса гепатита В

HBeAg - антиген е вируса гепатита В

11 111 - гаммаглутамилтранспептидаза

ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН - интерферон

ПВТ - противовирусная терапия

ПЕГ ИФН - пегилированный интерферон

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

УВО - устойчивый вирусологический ответ

ХВГ - хронический вирусный гепатит HB V - вирус гепатита В

ХГВ - хронический гепатит В ХГС - хронический гепатит С ХГЕ) - хронический гепатит Б ЦП - цирроз печени

НСУ - вирус гепатита С НОУ - вирус гепатита Б НОУ - вирус гепатита й ТТУ - вирус ТТ

Заказ № 261. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.(499)250-92-06 www.postator.ru

Актуальность проблемы

Появление новых методов вирусологической диагностики в конце XX века позволило доказать единую природу острых и хронических вирусных гепатитов, представляющих собой фазы общего инфекционного процесса. Стало очевидным, что инфицирование гепатотропными вирусами является одной из основных причин хронических заболеваний печени, которые остаются важной медико-социальной проблемой здравоохранения [25]. Высокий уровень заболеваемости вирусными гепатитами, их хрониогенный потенциал с возможным исходом в цирроз и первичный рак печени, частое поражение лиц молодого возраста определяют актуальность и важность дальнейшего изучения этой проблемы.

По данным ВОЗ почти треть населения земного шара (2 млрд. человек) имели контакт с вирусом гепатита В, из них у 400 млн. человек НВУ-инфекция приобретает хроническое течение [1,103]. Ежегодно от заболеваний, связанных с ВГВ, умирает 1 млн. человек, при этом НВУ-инфекция занимает 10 место среди всех причин смерти.

Естественное течение НВУ-инфекции зависит от особенностей иммунного ответа организма и влияния таких факторов, как генетическая вариабельность вируса, иммуносупрессия, коинфекция вирусом гепатита Э, употребление алкоголя и других токсических веществ. До недавнего времени выделяли 4 клинико-серологических варианта НВУ-инфекции -HBeAg-пoзитивнyю инфекцию с нормальным уровнем трансаминаз, HBeAg-позитивный гепатит, НВеА§-негативный гепатит и «носительство» HBsAg [1]. В настоящий момент совершенствование методов ПЦР-диагностики позволило выявить еще одну форму заболевания - латентную НВУ-инфекцию, которая характеризуется наличием ДНК НВУ в ткани печени в минимальных количествах при отсутствии НВ8А§ в крови. Латентная НВУ-инфекция может являться причиной посттрансфузионного гепатита и реактивации заболевания на фоне иммуносупрессии, в том числе при пересадке органов [116, 168]. Изучение этой формы заболевания затруднено необходимостью исследования молекулярно-биологическими методами биоптатов печени «благополучных» HBsAg-нeгaтивныx пациентов, у которых отсутствуют показания к биопсии печени. Однако такие исследования необходимы не только для понимания патогенеза НВУ-инфекции и клинико-вирусологической характеристики выздоровления при этом заболевании, но также для определения понятия выздоровления при вирусных заболеваниях в целом с позиций современной молекулярной биологии и вирусологии.

Коинфицирование или суперинфицирование пациентов с HBsAg в крови вирусом гепатита Б, существенно ухудшает прогноз заболевания в связи с его необычно высоким хрониогенным потенциалом. В случае присоединения ЬГОУ-инфекции быстро нарастает фиброз печени, а сроки формирования цирроза печени существенно сокращаются. По данным медицинской литературы у 80% пациентов с вирусным гепатитом О развивается цирроз печени [1,28,215].

Вирусом гепатита С (ВГС) в мире по мнению разных авторов заражено от 130 до 200 млн. человек, а распространенность НСУ-инфекции имеет географические различия [83,208]. Естественное течение НСУ-инфекции характеризуется развитием у 50-90% инфицированных лиц хронического гепатита с медленными темпами последующего прогрессирования заболевания [32]. По мнению большинства авторов у 25% больных хроническим гепатитом С (ХГС) развивается цирроз печени, а у 1-5% из них - гепатоцеллюлярная карцинома. Темпы прогрессирования заболевания нарастают с увеличением возраста пациентов. Поскольку ХГС в большинстве случаев протекает бессимптомно, пациенты, как правило, не знают о своем заболевании и возможных исходах инфекции с необратимыми изменениями в печени. ХГС часто выявляется при случайном обследовании или плановой подготовке к оперативному вмешательству. Вместе с тем, при НСУ-инфекции, как и при других инфекционных заболеваниях, имеют место случаи спонтанного выздоровления, которые выпадают из поля зрения врачей и не находят отражения в медицинской литературе.

Появление возможности тестирования крови больных на недавно открытые вирусы ТТ и О ставит научный вопрос об этиологической роли этих вирусов в патологии печени и других органов человека. В настоящий момент значение виремии НОУ и ТТУ у больных хроническими вирусными гепатитами и здоровых лиц требует дальнейшего изучения.

Наиболее эффективным методом лечения больных хроническими вирусными гепатитами является комбинированная интерферонотерапия с использованием пегилированных интерферонов в сочетании с различными препаратами противовирусного действия: при хроническом гепатите В (ХГВ) применяются прпараты интерферона и аналоги нуклеоз(т)идов, при ХГС -препараты интерферона и рибавирин. Эффективность монотерапии аналогами нуклеоз(т)идов (АН) при ХГВ ограничена высокой частотой рецидивов после окончания . лечения, что ведет к необходимости неопределенно долгой продолжительности курса противовирусной терапии (ПВТ). Кроме того, на фоне длительного лечения АН развивается лекарственная устойчивость к применяемым препаратам [1]. Монотерапия препаратами интерферона используется при хроническом гепатите О (ХГБ). Однако эффективность применяемых в настоящее время методов лечения, особенно у пациентов с 1 генотипом ВГС, а также при НВУ- и НВУ/НОУ-инфекции не удовлетворяет ожидания врачей и пациентов. В связи с этим во всем мире продолжается поиск способов совершенствования методов этиотропной терапии хронических вирусных заболеваний печени, а также критериев оценки эффективности проведенного лечения.

Таким образом, можно выделить ряд актуальных направлений научных исследований обусловленных проблемами клинической практики и тактическими вопросами ведения пациентов с хроническими вирусными гепатитами: это изучение клиническо-вирусологических вариантов течения и исходов хронических вирусных гепатитов; разработка критериев реконвалесценции; изучение закономерностей персистенции вирусов В и С в организме человека при естественном течении и после ПВТ; изучение факторов резистентности к лекарственным препаратам; изучение темпов прогрессирования заболевания и формирования фиброза у больных хроническими вирусными гепатитами; оптимизация противовирусной терапии. Актуальность нерешенных клинических проблем хронических вирусных гепатитов позволила сформулировать цели и задачи данного исследования.

Цель и задачи исследования

Оптимизировать выбор персонифицированной противовирусной терапии на основе определения и клинико-вирусологической характеристики вариантов течения хронических вирусных гепатитов.

Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:

1. Выявить клинические варианты течения хронических вирусных гепатитов В, С и О и провести их сравнительную оценку с учетом вирусологических особенностей возбудителя, уровня активности процесса и стадии заболевания.

2. Определить частоту выявления латентного гепатита В среди больных с хроническими заболеваниями печени и реконвалесцентов НВУ-инфекции.

3. Характеризовать клиническое течение гепатита В в сочетании с дельта-вирусом и другими гепатотропными вирусами (в, ТТ).

4. Выявить особенности естественного течения и частоту формирования цирроза печени при хронической НВУ- и НСУ-инфекциях.

5. Оценить особенности микст-инфекции вирусами гепатитов О и ТТ у больных хроническим гепатитом С.

6. Оценить распространенность первичной лекарственной резистентности вируса гепатита В к аналогам нуклеоз(т)идов.

7. Обосновать выбор персонифицированной терапии больных хроническими вирусными гепатитами с учетом клинической картины болезни, особенностей возбудителя, вида лекарственных препаратов и схем терапии.

Научная новизна работы

1. С помощью современных молекулярно-биологических технологий на большой когорте пациентов выделены клинико-вирусологические варианты течения хронических вирусных заболеваний печени с определением их состава.

2. Впервые обосновано выделение формы хронической НВУ-инфекции с нормальным уровнем трансаминаз в т.ч. в группе, так называемых, «носителей НВ8А§».

3. Выявлена низкая частота латентной формы НВУ-инфекции у больных с хроническими заболеваниями печени, характеризующаяся минимальными клинико-биохимическими изменениями, низким уровнем виремии и отсутствием в структуре HBsAg значимых аминокислотных замен.

4. Иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методами с применением электронной микроскопии доказано, что после вирусного гепатита В в клетках печени сохраняются вирусные частицы и антигены вируса.

5. Установлено преобладание больных с наличием микст-инфекций (ИВУ/ШУ, НВУ/ТТУ, НВУ/НБУ, НСУ/ШУ, НСУ/ТТУ) среди обследованной когорты пациентов. Выявлено, что вирусы О и ТТ не оказывают влияния на течение ХГВ, ХГС и эффективность противовирусной терапии, а моноинфицирование вирусами О и ТТ в половине случаев приводит к стеатозу печени.

6. При многолетнем наблюдении за больными с хронической НВУ- и НСУ-инфекцией получены новые данные частоты формирования цирроза печени и ГЦК.

7. Среди пациентов с НВУ-инфекцией впервые определена частота мутаций, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью к аналогам нуклеоз(т)идов.

8. Усовершенствованы подходы к выбору персонифицированной противовирусной терапии больных с хроническими вирусными гепатитами.

9. Впервые показана клиническая значимость определения содержания НВбА§ для оценки эффективности противовирусной терапии хронического гепатита В.

10. Получены новые данные эффективности комбинированной ПВТ препаратами интерферона и аналогами нуклеоз(т)идов в сравнении с монотерапией аналогами нуклеоз(т)идов у больных ХГВ.

11. Установлено подавление виремии НОУ и ТТУ на фоне интерферонотерапии с последующим возобновлением репликации после отмены препаратов интерферона.

Практическая значимость

1. Современные серологические и молекулярно-биологические методы исследования в комплексе с лабораторно-инструментальными способами оценки фиброза позволяют выделить новые клинические формы хронических вирусных заболеваний печени, провести сравнительный анализ течения и исходов болезни.

2. Клиническое выздоровление после НВУ-инфекции сопровождается персистенцией возбудителя в клетках печени на фоне авиремии, что делает реконвалесцентов заболевания потенциально опасными при донорстве тканей и органов.

3. Проведенные исследования большой когорты пациентов свидетельствуют о преобладании больных с наличием микст-инфекций (НВУ/ЬЮУ, НВУ/ТТУ, НВУ/НБУ, НСУ/ШУ, НСУ/ТТУ).

4. Использование метода ПЦР с высокой чувствительностью у, так называемых, «носителей НВ8А§» и выявление низких концентраций ДНК НВУ позволяет рассматривать данную клиническую форму, как хроническую НВУ-инфекцию с нормальным уровнем трансаминаз.

5. Высокий уровень виремии НВУ соответствует более высоким показателям цитолитической активности у больных хроническим гепатитом В.

6. Отсутствие в крови РНК НСУ при наличии антител к НСУ класса 1^0 в подтверждающем тесте, нормальная активность трансаминаз, нормальные размеры печени и селезенки являются основанием для выделения группы спонтанных реконвалесцентов НСУ-инфекции.

7. Персонифицированный метод выбора противовирусных препаратов при хронических вирусных гепатитах В, С и Э позволяет повысить эффективность лечения.

8. Сочетание препаратов интерферона и аналогов нуклеоз(т)идов по сравнению с монотерапией аналогами нуклеоз(т)идов увеличивает частоту сероконверсии НВ8А§ у больных хроническим гепатитом В.

9. Применение индукционного метода лечения интерферонами «короткого действия» и рибавирином при хроническом гепатите С увеличивает частоту устойчивого вирусологического ответа.

10. Коинфицирование вирусами О и ТТ не оказывает влияния на эффективность противовирусной терапии у больных хроническим гепатитом С.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Использование комплекса современных высокочувствительных серологических и молекулярно-биологических методов исследования позволяет определить состав больных при различных клинико-вирусологических вариантах течения хронических вирусных гепатитов.

2. Выздоровление после перенесенного вирусного гепатита В представляет собой не полную элиминацию вируса, а формирование состояния контроля иммунной системы над возбудителем заболевания, при котором вирусные частицы длительно сохраняются в гепатоцитах, но отсутствуют в крови.

3. Среди больных с хроническими вирусными гепатитами преобладают пациенты с микст-инфекций НВУ/ШУ, НВУ/ТТУ, НВУ/НЭУ, нсу/шу, нсу/тту.

4. Хроническая НСУ-инфекция в сравнении с хронической НВУ-инфекцией характеризуется более высоким уровнем воспаления и фиброза.

5. Среди пациентов с ХГВ, проживающих в Москве и Московской области частота мутаций первичной лекарственной резистентности к аналогам нуклеоз(т)идов выше, чем в других регионах РФ.

6. Применение персонифицированной противовирусной терапии, основанной на индивидуальном подходе к выбору лекарственных препаратов с учетом молекулярно-биологической характеристики возбудителя, особенностей организма больного, активности и стадии заболевания позволяет повысить эффективность лечения.

Внедрение результатов работы

Результаты проведенных исследований применяются при обследовании и лечении больных хроническими вирусными гепатитами в клинических отделениях ФГБУ «Поликлиника №1» и инфекционных отделениях ФГБУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента РФ, а также в клинических отделениях ФГБУ МСЧ №165 ФМБА России. Материалы диссертации используются в преподавании курса инфекционных болезней студентам факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, кафедры микробиологии и вирусологии медицинского факультета Российского Университета Дружбы Народов, а также при чтении лекций врачам и ординаторам учреждений УД Президента РФ.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на 3 Национальном конгрессе терапевтов в Москве (2008г), 10 и 11 международном СлавяноБалтийском научном форуме в Санкт-Петербурге (2008г, 2009г), 13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease в Вашингтоне (DC USA (2009г), XVI и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» в Москве (2009г, 20 Юг). Кроме того, результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на VIII и IX Российской конференции с международным участием «Вирусные гепатиты -эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (2009г, 2011 г), XVI Российском конгрессе «Гепатология сегодня» (2011 г), научно-практической конференции ЛПУ УД Президента РФ «Хронические заболевания печени как междисциплинарная проблема» (26 мая 2011 г), а также на кафедре инфекционных болезней ГБОУ ДПО РМАПО (29.03.12г).

Апробация диссертации состоялась 28.05.12 г. на межлабораторном совете Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 31 печатная работа, из них 15 - в российских рецензируемых научных журналах из перечня ведущих периодических изданий, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 265 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 6 глав - обзора литературы, описания материалов и методов, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, который содержит 248 источников, из них 30 - отечественных и 218 -иностранных. Диссертация иллюстрирована 53 таблицами, 52 рисунками, документирована 12 выписками из историй болезни.

Выводы

1. Установлено, что в исследуемой группе больных хронические вирусные гепатиты представлены многообразием клинических форм с различным уровнем виремии (от неопределяемого до высокого) и активности трансаминаз (от нормальной до постоянно повышенной), среди которых преобладают микст-инфекции (ИВУ/ШУ, НВУ/ТТУ, НВУ/НБУ, НСУ/ЬЮУ, НСУ/ТТУ).

2. Выявление случаев скрытой НВУ-инфекции при использовании комплекса молекулярных методов детекции нуклеиновых кислот вируса, а также электронно-микроскопических методов исследования биоптатов печени свидетельствует о возможности персистенции вируса гепатита В в гепатоцитах после спонтанной реконвалесценции и ПВТ и позволяет утверждать, что при НВУ-инфекции выздоровление представляет собой не полную элиминацию вируса, а состояние контроля иммунной системы организма над возбудителем. Относительно малое количество случаев «скрытой» НВУ-инфекции объясняется высокой эффективностью применяемых методов определения HBsAg (чувствительность метода - 0,01 нг) и технологическими ограничениями применяемых методов ПЦР. Скрытый гепатит В характеризуется отсутствием в структуре НВзА§ значимых аминокислотных замен.

3. Впервые установлено, что среди НВУ-инфицированных пациентов, проживающих на территории РФ, первичная лекарственная резистентность вируса гепатита В составляет 6,2%. При анализе аминокислотных последовательностей фермента полимеразы вируса гепатита В определены 2 группы мутаций: клинически значимые аминокислотные замены и потенциально-значимые мутации.

4. При естественном течении НВУ-инфекции уровень активности воспалительных изменений в печени коррелирует с уровнем вирусной нагрузки; присоединение НОУ увеличивает частоту формирования цирроза печени с 6,45% до 68,75%. НВУ-инфекция в сравнении с НСУ-инфекцией характеризуется преобладанием вариантов течения заболевания с низкой активностью воспаления. При естественном течении НСУ-инфекции цирроз печени развивается у 10,11% больных в среднем через 18,9 лет от момента инфицирования, а в 23,83%) случаев имеет место спонтанное выздоровление.

5. Доказано, что персонифицированная терапия, основанная на индивидуальном выборе лекарственных средств с учетом молекулярно-биологической характеристики возбудителя и его чувствительности к противовирусным препаратам повышает эффективность лечения хронических вирусных гепатитов В, С и Э и является основой современной терапевтической тактики при этих заболеваниях.

6. Эффективность ПВТ больных ХГВ низкая, однако использование препаратов интерферона в комбинации с аналогами нуклеоз(т)идов повышает эффективность лечения в сравнении с монотерапией аналогами нуклеоз(т)идов.

7. При лечении больных ХГС стандартными интерферонами «короткого» действия и рибавирином применение индукционного метода ПВТ с ежедневным введением ИФН повышает частоту стойкого вирусологического ответа с 47,1% до 60,5%.

8. Найдены доказательства сопоставимой эффективности укороченного и стандартного курсов ПВТ пегилированными интерферонами в сочетании с рибавирином в случае низкого исходного уровня РНК НСУ (400 ООО МЕ/мл и ниже) и развития ВО до 4 недели лечения. Установлено, что частота формирования УВО у больных ХГС с нормальным и повышенным уровнем трансаминаз не имеет различий, поэтому ПВТ рекомендована больным ХГС вне зависимости от исходного уровня АЛТ.

9. Впервые установлено, что среди больных с хроническими вирусными заболеваниями печени моноинфекция ТТУ и/или ЬЮУ составляет 6,06%. Более чем у половины моноинфицированных пациентов с НвУ и ТТУ обнаружены проявления метаболического синдрома.

10. Установлено, что коинфицирование вирусами в и ТТ не влияет на эффективность противовирусной терапии больных ХГС и ХГВ. Интерферонотерапия приводит к подавлению репликации НвУ и ТТУ, однако этот эффект носит временный характер, после отмены лечения РНК НОУ и ДНК ТТУ вновь определяются в крови.

Практические рекомендации

1. Возможность развития ГЦК у больных ХГВ, в т.ч. без признаков цирроза печени, указывает на необходимость наблюдения за пациентами с НВУ-инфекцией с настороженностью к онкологическим заболеваниям печени.

2. Выявление латентной формы гепатита В у пациентов с анти-НВсог в сыворотке крови ставит вопрос о целесообразности обследования доноров органов не только на HBsAg, но и на анти-НВсог с исключением анти-НВсог-позитивных пациентов из донорства, особенно донорства органов.

3. С целью повышения эффективности противовирусной терапии больных хроническим гепатитом В рекомендовано использование комбинации препаратов интерферона и аналогов нуклеоз(т)идов.

4. Применение индукционного метода противовирусной терапии больных хроническим гепатитом С препаратами интерферона «короткого действия» целесообразно для повышения эффективности лечения.

5. Сопоставимая эффективность лечения больных ХГС с нормальным и повышенным уровнем трансаминаз позволяет рекомендовать проведение комбинированной противовирусной терапии больным ХГС вне зависимости от уровня АЛТ.

6. У больных ХГС курс ПВТ пегилированными ИФН и рибавирином может быть сокращен до 29 недель при 1 генотипе возбудителя и до 19 недель при 2 и 3 генотипах вируса без снижения эффективности лечения в тех случаях, когда исходный уровень РНК НСУ - 400 ООО МЕ/мл и ниже, а вирусологический ответ развивается на 4 неделе лечения.