Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Клинико-патогенетические особенности естественного течения вирусного гепатита С и оптимизация лабораторно-диагностических критериев исходов заболевания

На правах рукописи

зноико

Ольга Олеговна

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЕСТЕСТВЕННОГО ТЕЧЕНИЯ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С И ОПТИМИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ КРИТЕРИЕВ ИСХОДОВ ЗАБОЛЕВАНИЯ

14 00 10 - инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

□031ТТ7Б0

Москва - 2008

003177760

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский Государственный Медико-стоматологический Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ющук Николай Дмитриевич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук, профессор

Пак Сергей Григорьевич

завкаф ГОУ ВПО ММА им ИМ Сеченова Росздрава*

Никитин Игорь Геннадьевич

каф госпитальной терапии ГОУВПОРГМУ Росздрава

Шабалина Светлана Васильевна

вед не ФГУН"ЦНИИэпидемиологии" Роспотребнадзора

Ведущее учреждение - ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М П Чумакова РАМН

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук профессор

Защита диссертации состоится <Л> А* 2008'г в « » часов на заседании

диссертационного совета Д 208 114 01 ФГУН' «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (111123, Москва, ул Новогиреевская, д 3-а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Л 4 ¿fcaJ/?Л- 2007 Г-

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

HCV-инфекция - одна из ведущих причин хронической патологии печени В мире насчитывается более 175 миллионов человек, инфицированных вирусом гепатита С (около 1%) В большинстве развитых стран хронический гепатит С составляет четвертую часть в структуре всех хронических гепатитов, а хронический гепатит С с исходом в цирроз занимает первое место в структуре смертности от заболеваний печени (Kim W R, 2002, Tanaka Y, 2006, Poynard T, 2003, Berry V, 2005, Yim C£ ,2001) По данным ВОЗ 2002 года, в 2001 году хронические заболевания печени были причиной 1,4 млн смертей, включая 796 тыс случаев смерти от цирроза и 616 тыс - от рака печени Как минимум 20% этих смертей (более 280 ты с ) связывают с гепатитом С (Poynard Т et al , 2003) Острая инфекция вирусом гепатита С у иммунокомпетентных людей только в 15-20% случаев заканчивается выздоровлением, а, в большинстве случаев (80-85%), приводит к формированию хронической инфекции (Wright Т et al 2004, Национальный Институт Здоровья США, 2002) Установлено, что через 10 лет от момента инфицирования у 5-10% больных хроническим гепатитом С формируется цирроз печени, а через 20-30 лет - уже у 20%-25% больных Известно, что вирусный гепатит С с исходом в цирроз печени является наиболее частым показанием к проведению трансплантации печени в Европе и США, в связи с чем, для большинства стран мира вирусный гепатит С является большой медицинской, социальной и экономической проблемой (Poynard Т et al, 2003, Saadeh S et al 2001, Никитин И Г, Сторожаков Г И, 2003) К сожалению, даже в развитых странах из-за неадекватной диагностики и лечения смертность -от хронического гепатита С продолжает оставаться высокой (Poynard Т et al, 2006) Начиная с 1989г, когда появилась возможность диагностики гепатита С и до настоящего времени, в изучении патогенеза и естественного течения HCV-инфекции достигнуты значительные успехи сформированы основные представления о механизме репликации вируса, показано, что в исходе острой инфекции ключевую роль играет клеточный иммунный ответ (Nakamoto Y etal, 2001), а в исходе хронической инфекции - скорость и интенсивность развитая фиброза печени (Poynard Т, et al, 1999, 2002, 2006) Доказано, что HCV обладает высокой степенью генетической изменчивости и антитела, образующиеся к поверхностным антигенам HCV, не обладают вируснейтрализующими свойствами, достаточными для элиминации вируса (Bassett SБ,1996) В течение последнего десятилетия быстрыми темпами развивались генные методы диагностики HCV-инфекции, позволившие добиться определения генетического материала вируса в минимальных концентрациях и доказать способность его репликации в лимфоцитах крови и других тканях, помимо ткани печени Благодаря

разработке высокочувствительных методов идентификации нуклеиновых кислот и применению этих методов для уточнения исходов вирусного гепатита С, была сформирована концепция о новой форме инфекции вирусом гепатита С - скрытой или "оккультной" HCV-инфекции и был поставлен вопрос о принципиальной возможности реконвалесценции от этой инфекции как спонтанной, так и в результате противовирусной терапии (Carreco V, 2006, Pan Yan-Feng, 2005, 2007, Castillo I, 2007) Наконец, за последние 10 лет разработано достаточно эффективное лечение комбинацией пегиллированного интерферона и рибавирина, позволяющее добиться устойчивого вирусологического ответа у 50-60% больных ХГС (Poynard Т , 2006, Ивашкин В Т с соавт, 2002, 2004, Блохина НП с соавт, 2002, Никитин ИГ, 2003) Однако, в связи с недостаточной эффективностью современного противовирусного лечения, в основе которого лежит опосредованное через иммунную систему организма действие интерферона, интенсивно изучаются функциональные особенности белков вируса гепатита С и особенности репликационного комплекса, который они образуют с целью разработки новых лекарственных препаратов, воздействующих на НСУ. (Lechmann М, 2000)

Несмотря на большие достижения в изучении иммунопатогенеза гепатита С, остается много нерешенных вопросов в области диагностики, профилактики и лечения данного заболевания К сожалению, до настоящего времени не разработана профилактическая вакцина, предупреждающая заражение вирусом гепатита С, не разработаны критерии реконвалесценции этого заболевания, существует проблема непреодолимой резистентности к основному противовирусному препарату -интерферону, не внедрены в широкую клиническую практику методы диагностики скрытой HCV-инфекции и неинвазивные методы мониторинга фиброза печени

В связи с этим, можно выделить ряд актуальных направлений научных исследований, которые обусловлены проблемами клинической практики и тактическими вопросами ведения пациентов с вирусным гепатитом С изучение клинической картины, исходов и вариантов течения вирусного гепатита С в сочетании с факторами неспецифического и специфического гуморального и клеточного ответа организма человека в ответ на внедрение вируса гепатита С, без чего невозможна разработка профилактических и лечебных вакцин, создание новых противовирусных препаратов и разработка критериев реконвалесценции, изучение закономерностей персистенции РНК HCV в различных субстратах организма человека в отсутствие лечения и после лечения интерфероном, изучение факторов резистентности к интерферону, таких как генетическая вариабельность генома HCV и рекомбинация фрагментов генома HCV,

изучение механизмов и скорости формирования фиброза у больных хроническим гепатитом С и разработка методов неинвазивного мониторинга фиброза печени для оценки рисков прогрессии заболевания, эффективности лечения и прогнозирования исходов заболевания Исходя из актуальности нерешенных клинических проблем, касающихся HCV-инфекции, были сформулированы цели и задачи данного исследования

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обосновать возможность прогнозирования исходов инфекции вирусом гепатита С на основании оценки диагностической значимости сывороточных маркёров фиброза печени, изучения факторов резистентности к интерферонотерапии и определения параметров специфического и неспецифического иммунного ответа для совершенствования тактики наблюдения и лечения больных гепатитом С

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Изучить выраженность фиброза печени у больных с репликативной формой ХГС при различной степени биохимической активности и давности заболевания в сопоставлении с наличием или отсутствием систематического употребления алкоголя в анамнезе

2 Определить роль сывороточных маркеров фиброза - гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа в диагностике различных стадий фиброза печени у больных хроническим гепатитом С и значимость этих маркеров при оценке эффективности интерферонотерапии

3 Оценить частоту выявления аутоантител (ANA, SMA, AMA, анти-LKM-l, анти-LC-1, анти-LSP) у больных ХГС на фоне нормальной и повышенной активности АлАТ и больных ХГС, резистентных к интерферонотерапии

4 Определить клиническое значение персистенции РНК HCV в лейкоцитах крови больных ХГС в зависимости от ответа на интерферонотерапию

5 Выявить варианты генетической изменчивости ISDR региона гена NS5A генотипа Ib вируса гепатита С у больных ХГС, резистентных к интерферонотерапии

6 Установить степень распространения рекомбинантного интергенотипического варианта вируса гепатита С - RFl_2k/lb среди больных ХГС и оценить эффективность лечения интерфероном больных, инфицированных этим вариантом

7 Исследовать особенности естественного течения и исходов гепатита С при различных формах заболевания в сопоставлении с показателями специфического и неспецифического иммунного ответа пациента

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Выполненное исследование посвящено клинической роли и прогностическому значению комплекса параметров ответа организма человека на внедрение вируса гепатита С, а так же особенностям изменчивости вирусного генома, выделенного из крови больных хроническим гепатитом С с различным ответом на интерферонотерапию

Установлено, что среди больных ХГС с давностью заболевания 1-5 лет в 17,9% случаев регистрируется быстрое формирование фиброза печени 3-й стадии по критериям Кпо<М1 Впервые изучено содержание сывороточных маркеров фиброза печени -гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа у больных ХГС с различными стадиями фиброза печени и различным ответом на интерферонотерапию и проведено сопоставление содержания этих маркеров в крови у больных ОГС, больных фиброзом легких и здоровых людей Установлено, что средние значения СЬ-Р/ после отмены интерферонотерапии различаются в группах больных с достижением УВО и без ответа на терапию, и выше в группе больных, не ответивших на лечение, а доля лиц с ухудшением показателей СХ-ГУ и превышающих норму существенно выше в группе больных, не ответивших на лечение Впервые показано, что концентрация СИУ может служить маркером активно продолжающегося фиброгенеза в печени у части больных без достижения УВО после противовирусной терапии и может применяться для мониторинга фиброза печени у данной категории больных Уточнены закономерности персистенции РНК НО/ в лейкоцитах крови у больных различными формами ХГС и установлено, что персистенция РНК НСУ в лейкоцитах крови регистрируется у большинства больных ХГС, присутствует изолированно в лейкоцитах крови у 13,7% больных ХГС и регистрируется у 6,6% пациентов с развитием биохимической ремиссии после окончания курса интерферонотерапии Изучена и уточнена взаимосвязь биохимической активности гепатита и наличием комплекса аутоиммунных антител у больных ХГС при длительном наблюдении (от 1 года до 4-х лет) Показано отсутствие выраженного аутоиммунного компонента в группе больных ХГС, полностью резистентных к лечению интерфероном Впервые изучена генетическая изменчивость КОЯ региона гена Ш5А генотипа 1Ь в нуклеотвдных последовательностях геномов НСУ, выделенных из крови больных ХГС Московского региона, полностью резистентных к лечению интерфероном Установлен низкий уровень генетической изменчивости 18Б11 региона или полное отсутствие изменчивости этого региона по сравнению с изолятом НСУ-1 у данной группы больных Впервые изучено распространение рекомбинантного интергенотипического варианта РНК НСУ (субтип МЧ_2к/1Ь) среди больных ХГС Московского региона, установлен факт его

выявления у 3,1% обследованных, а так же отсутствие влияния этого варианта на эффективность интерферонотерапии Впервые оценена прогностическая роль параметров специфического гуморального ответа на 26 антигенов HCV в сочетании с иммунным статусом у больных различными формами вирусного гепатита С и различными исходами заболевания Установлены различия по спектру специфических и неспецифических иммунных реакций в ответ на инфекцию вирусом гепатита С групп больных ХГС с постоянно нормальным уровнем AJIT и реконвалесцентов ВГС с давностью заболевания более 3-х лет от группы больных ХГС с постоянно повышенной активностью АлАТ Впервые сделано заключение о неоднородности группы реконвалесцентов ВГС с давностью заболевания более 3-х лет на основании наличия или отсутствия в крови антител к белку NS5A HCV, и показаны существенные различия в спектре антител к другим антигенам HCV в зависимости от этого показателя

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Показано, что в популяции больных ХГС существует группа лиц с быстрым формированием фиброза печени, в связи с чем, необходимо проведение пункционной биопсии печени больным ХГС даже с известной небольшой длительностью заболевания (1-5 лет) для исключения выраженного фиброза печени и выработки лечебной тактики

В связи с тем, что не получено различий в частоте регистрации фиброза печени стадии 2-3 по МЕТА VIR. среди больных ХГС ПНАТ и больных ХГС ПЛАТ, а также, учитывая тот факт, что у большинства больных хронический гепатит С является единственной причиной формирования выраженного фиброза печени вне зависимости от систематического употребления алкоголя по данным анамнеза, рекомендуется проведение биопсии печени больным ХГС даже с невысоким риском прогрессии фиброза печени (постоянно нормальный уровень АлАТ и отсутствие злоупотребления алкоголем в анамнезе)

Ценность морфологической диагностики стадии фиброза печени повышается при оценке биоптата печени одновременно по двум критериям (Knodell и шкала МЕТА VIR), так как возможны расхождения в оценке выраженной стадии фиброза печени по различным критериям, а также - выявление пациентов с прогрессирующим фиброзом -стадия F2 по шкале МЕТА VIR

Определение уровня CL-IV в сыворотке крови у больных ХГС, не ответивших на интерферонотерапию, позволяет выявлять группу больных с прогрессирующим фиброзом печени для назначения повторных курсов противовирусной терапии, не используя инвазивные методы диагностики фиброза печени

Детекция РНК HCV в лейкоцитах крови дополнительно позволяет выявлять виремию у части предполагаемых реконвалесцентов ВГС и больных ХГС с отсутствием РНК HCV в плазме крови после завершения курса противовирусной терапии

Отсутствие airra-NS5A IgG у предполагаемых реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения более 3 лет может служить дополнительным критерием реконвалесценции, а выявление анти-NSSA IgG у больных ОГС в остром периоде заболевания является маркером перехода ВГС в хроническую форму

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Диссертация апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО «МГМСУ Росздрава» 30 июня 2007г (протокол № 52) Материалы диссертации доложены на II, Ш, IV, V и VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, Д и G - проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики» (1997, 1999, 2001, 2003 и 2007ir), II Всероссийской конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» (1998г), III, VHI, XI Российской конференции «Гепатология сегодня» (1998, 2002, 2006гг ), научно-практической конференции «Гепатит С (Российский консенсус)» в 2000г, Третьей Международной ассамблеи «Новые медицинские технологии» (2001г), Московской научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (2003, 2004, 2006, 2007rrJ, на заседании общества врачей-инфекционистов г Москвы (2003г), на проблемной учебно-методической комиссии по инфекционным болезням на базе Всероссийского научно-методического центра по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию при МЗ России (Москва, 2002г ), совещании в рамках «New Visby Program» в Шведском институте по контролю над заболеваемостью (Центр Микробиологии и биологии опухолей Каролинского Института, Стокгольм, 2003г), на международной конференции «HCV 2005 Visby Program Workshop HCV infection - factors associated with persistence, clearance and protection», (Мальмо, Швеция, 200бг), конференции с международным участием «Клиническая и экспериментальная вирусология HCV-инфекции» в Биомедицинском учебном и исследовательском центре Латвийского университета (Рига, Латвия, 2005г ), на конференции практических врачей «Аюуальные вопросы гепатологии» Главного клинического госпиталя МВД России (Москва, 2004г), научно-практической конференции «Вопросы инфекционной патологии Урала» (Тюмень, 2004г ), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2004г ), конференции «Хронические вирусные гепатиты в практике лечебных учреждений военно-медицинского

управления ФСБ России актуальность проблемы, возможности диагностики и лечения» (Москва, 2005г), первом международном Конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2006г), Российском медицинском форуме (Москва, 2006г), на VII съезде научного общества гастроэнтерологов России, посвященном 40-летию со дня основания Всесоюзного НИИ гастроэнтерологии - Центрального НИИ гастроэнтерологии (Москва, 2007г), VII Российском съезде инфекционистов «Итоги "и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных» (Нижний Новгород, 2007г ) Материалы диссертации доложены в виде постерных докладов на международных конференциях и симпозиумах XVI всемирном конгрессе эпидемиологов (Монреаль, 2002г), IX Объединенной Европейской Гастроэнтерологической неделе (Амстердам, 2001г), XI симпозиуме «Гепатит С» (Гейдельберг, 2004г), Всемирном конгрессе по гастроэнтерологии (г Монреаль, 2005г), 12-ом Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и болезням печени (Париж, 2006г), Первой конференции по вопросам ВИЧ/СПИД в Восточной Европе и Центральной Азии (Москва, 2006г), 3-ей Интернациональной конференции по ВИЧ и HCV/ВИЧ коинфекции (Париж, 20.07г ), 4-ом Интернациональном симпозиуме по гепатиту С (Глазго, 2007г )

ПУБЛИКАЦИИ

Основные положения диссертации изложены в 64 печатных работах, опубликованных в период с 1996г по 2006г, из них - 15 в центральной печати

Основные положения, проведенных исследований вошли в методические рекомендации «Вирусные гепатиты Клиника, диагностика, лечение» (2000г), «Противовирусная терапия хронических вирусных гепатитов В и С у ВИЧ-инфицированных» (2006г), «Алгоритм диагностики и лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных потребителей инъекционных наркотиков» (2006г) и другие инструктивно-методические документы Основные положения диссертации вошли также в «Лекции по инфекционным болезням» под редакцией академика РАМН, профессора Ющука НД (1999г) Результаты настоящего исследования используются в учебном процессе Московского государственного медико-стоматологического университета по подготовке студентов, интернов, клинических ординаторов, врачей - слушателей курсов на факультете постдипломного обучения в лекционных материалах и при проведении семинарских занятий Результаты диссертационной работы внедрены в практическую работу Инфекционной клинической больницы №1 г Москвы

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 340 страницах машинописного текста, включает в себя введение, обзор литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждение и выводы, 53 таблицы, 30 рисунков, 3 клинических примера Обзор литературы составлен на основании анализа 70 источников на русском и 348 - на иностранном языках

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Объём, характер и методы проведённых исследований Для решения поставленных в настоящей работе задач были проведены следующие клинико-лабораторные исследования

1 Клиническое обследование (данные физикального осмотра и оценка жалоб пациентов) с последующей формулировкой основных клинических синдромов и определения степени их выраженности проводилось у 150 больных острым-гепатитом С и 380 больных хроническим гепатитом С, наблюдаемых в ИКБ №1 г Москвы в 1996-2006гг Анализ морфологии пунктата печени в зависимости от степени биохимической активности и давности заболевания проводился у 307 больных с репликативной формой ХГС, включая больных с постоянно нормальной активностью трансаминаз - ХГС ПНАТ в течение 1 года - 5 лет и больных с постоянно повышенной или волнообразной активностью АлАТ -ХГС ПЛАТ, которым была выполнена ПБП Эффективность монотерапии интерфероном (в стандартных дозах 3 млн ME 3 раза в неделю) больных хроническим гепатитом С оценивалась при наблюдении за 160 больными

Исследование клинико-диагностической роли сывороточных маркеров фиброза -гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа проводилось у 88 больных ХГС, 28 пациентов с циррозом печени, 13 больных желтушной формой ОГС, у которых в последующем сформировался ХГС, 19 пациентов с фиброзом легких (ФЛ) и у 32 здоровых добровольцев Оценка частоты выявления аутоантител (ANA, SMA, AMA, анти-LKM-l, анти-LC-l, анти-LSP) проводилась у 26 больных ХГС с предполагаемым аутоиммунным компонентом, включая 9 пациентов, резистентных к интерферонотерапии Клиническое значение персистенции РНК HCV в лейкоцитах крови больных ХГС оценивалось у 104 пациентов с наличием анти-HCV в крови (включая 24 пациента со спонтанной клинико-биохимической ремиссией, 30 с ремиссией на фоне терапии интерфероном и 24 больных, резистентных к интерферонотерапии) Выявление вариантов генетической изменчивости ISDR региона гена NS5A генотипа lb вируса гепатита С у больных ХГС проводилось у 16 пациентов, резистентных к интерферонотерапии, и 3-х пациентов с достижением вирусологического ответа Степень распространения рекомбинантного интергенотипического варианта вируса

и

гепатита С - RFl_2k/lb изучалась в труппе из 63 больных ХГС, включая 49 пациентов, получавших монотерапию интерфероном Исследование особенностей естественного течения и исходов гепатита С при различных формах заболевания в сопоставлении с показателями специфического (гуморального) и неспецифического (иммунный статус) иммунного ответа пациентов осуществлялось в группе больных, включавшей 150 больных ОГС (из них - 30 с известным исходом заболевания), 45 больных ХГС (из них - 20 с ХГС ПЛАТ и 23 с ХГС ПНАТ), 12 рековалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет и 30 здоровых людей контрольной группы Острый вирусный гепат С диагностировался в случае клинической картины острого гепатита с обязательным наличием желтухи, изменениями функциональных проб печени (пшербилирубинемия более 20 мкмоль/л, превышение АпАТ более 10 норм AJIT), при наличии в крови анти-HCV, РНК HCV и исключения маркеров других острых гепатитов Хронический вирусный гепатит С диагностировали в случае длительности заболевания более б месяцев, наличия анти-HCV и РНК HCV в крови Диагноз ЦП устанавливался на основании клинико-лабораторных и инструментальные исследований (снижение протромбинового индекса, общего количества тромбоцитов, альбумина, признаки портальной гипертензии при ультразвуковом исследовании, эзофагогастродуоденоскопии с оценкой состояния вен пищевода и кардиального отдела желудка)

2 Всем пациентам изучаемых групп выполнялось биохимическое исследование крови, включавшие фракционное количественное определение уровня билирубина методом Йендрашика, определение уровня активности аспартатаминотрасферазы, аланинаминотрансферазы методом IFCC на автоматическом биохимическом анализаторе «Cobas Mira Plus» («Hoffinan-La-Roche», Швейцария), показателей тимоловой пробы модифицированным методом Mac-Lagan, протромбинового индекса, активности щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы, количества общего холестерина, бета-липопротеидов, общего белка и белковых фракций методом электрофореза

3 Клиническое исследование периферической крови с подсчётом форменных элементов в единице объема на автоматической гематологической системе «ADIVA 60-СТ» выполнялось от 20 до 40 раз всем больным, включенным в исследование

4 Определение в сыворотке крови маркеров вирусных гепатитов Специфическая диагностика вирусных гепатитов проводилась в лаборатории ИКБ №1 г Москвы методом ИФА при помощи различных коммерческих диагностических тест-систем (HBsAg -«Organon tekmka», анти-HBcore IgM, IgG - «Диагностические системы» или «La Roche»,

«Вектор-Бест», анти-HCV - «Органон», «ГепаСкан, «La Roche», иммуноблотинг «Deciscan»)

5 Ультрасонографическое исследование органов брюшной полости проводилось на аппарате «Esaote Megas»

6 Пункционная биопсия печени проводилась чрезкожно при помощи пункнионной иглы «Hepafix» (типа Menghmi) диаметром 1,2 - 1,6 мм под местной анестезией Морфологическое исследование лункгата печени заключалось в оценке некрозовоспалительной активности гепатита, выраженности фиброза и проводилось полуколичественным методом с использованием критериев Knodell и шкалы METAVIR, в 41 случае - дополнительно по критериям Ishak

7 Полимеразная цепная реакция и определение генотипа HCV качественное и количественное определение РНК HCV осуществляли с использованием набора «finol DNA Sequencing Kit» фирмы «Promega» Экстракцию нуклеиновых кислот и выявление РНК HCV в клинических образцах (плазмы крови и лейкоцитарной фракции) проводили с использованием коммерческого набора «Полигеп С» НПФ «Литех» Генотипирование HCV проводили с помощью SSCP анализа ампликонов, полученных при детекции РНК HCV в исследуемых клинических образцах, с использованием системы типоспецифичных праймеров, предложенной Н Okamoto и путем прямого секвенирования NS5A области генома HCV Определение генотипов и субтипов HCV для выявления рекомбинантных субтипов было проведено методом филогенетического анализа, секвенированных NS5B-, 5'UTR- и соге-фрагментов генома HCV Детекцию РНК HCV методом ПЦР с предварительным получением кДНК методом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) осуществляли с помощью коммерческой тест-системы «Гепатоген С» НПФ «ДНК-Технология» ОТ-ПЦР проводили с использованием флуоресцентных зондов, и результаты оценивали после прохождения реакции по уровню флуоресценции, измеряемого ПЦР-детектором В качестве мишени для постановки ОТ-ПЦР была выбрана 5' нетранслируемая область РНК HCV

8 Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей NS5A фрагмента генома вируса гепатита С был проведен с использованием йрограммы «Sequence Navigator software» («Biosystems Inc», Foster City, CA) Аминокислотная последовательность (позиции HCV NS5A 2209-2248) исследуемых образцов была сопоставлена с интерферон-чувствительным фрагментом генома вируса гепатита С (HCV ISDR NS5A 2209-2248) референсного изолята вируса гепатита С (HCV-J) Количественное определение РНК HCV проводили с помощью набора «Amphcor HCV monitor test» фирмы «Roche»

9 Исследование аутоиммунных антител ANA, SMA, AMA анти-LKM-l выявляли методом иммунофлюоресценции, антитела к печеночному цитозолу (LC-1), антитела к специфическому печеночному липопротеину (LSP) - методом ИФА с использованием лабораторных тест - систем (разработка «Speciality Laboratory», USA) Всего проведено 602 исследования с 86 образцами сывороток крови

10 Гуморальный ответ к HCV изучался с применением лабораторных тест-систем, позволяющих раздельно выявлять анти-HCV класса IgM и IgG к различным белкам HCV методом ИФА и содержащих рехомбинантные белки и синтетические пептиды, моделирующие иммунодоминантные эпитопы структурных (core и его пептиды с аминокислотными последовательностями аа 1-20, аа 13-33, аа 61-87, El, Е2, включая HVR-N и HVR-C) и неструктурных белков HCV (NS3 и его 18 пептидов, входящие в состав 7 пулов) , NS4, мозаичный NS5A, а так же синтетические пептиды, моделирующие иммунодоминантные участки аминокислотной последовательности различных белков HCV core-16 (аа 3-116), NS4-20 (аа 1921-1940), NS5A-23 (аа 2295-2317) Пептиды и белок core синтезированы в лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза Института вирусологии им Д И Ивановского РАМН, рекомбинантные полипептиды NS3, NS4, NS5A - разработка НПО «Диагностические системы» г Нижний Новгород

11 В изучаемых группах ОГС, ХГС ПЛАТ, ХГС ПНАТ, реконвалесценты ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет, контрольной группы, проводилось исследование следующих показателей иммунного статуса CD3+, CD4+, CD8+, CD4/CD8, CD16+, CD20+, HLA-DR+CD3+, CD95+, О-лимфоцитов Определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов осуществлялось с помощью метода проточной цитофлюориметрии

12 Концентрацию гиалуроновой кислоты (ГК) в сыворотке крови определяли с применением стандартных коммерческих наборов «HYALURONIC ACID (НА) QUANTITATIVE TEST KIT» фирмы «Corgemcs Inc » на основе одноступенчатого ИФА, для исследования концентрации CL - IV использовали стандартные коммерческие наборы «CL - IV PLATE KIT» фирмы «DAIICHI FINE CHEMICALCO, LTD» на основе двухступенчатого ИФА

Часть статистической обработки результатов осуществлялась с помощью программы «Microsoft Excel» (версия 7,0 для Windows 98 и 2000) Были определены процентное содержание ряда полученных данных (%), средняя арифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (т) Для проверки гипотезы о различии выборок (групп больных) применялся критерий Стьюдента Основной статистический анализ результатов

клинических исследований проводился с помощью программы «Statistica for Windows 6,0» Однородность групп оценивалась с применением теста на нормальный закон распределения (критерий Колмогорова-Смирнова), корреляционные связи оценивались в соответствии с коэффициентом Спирмена Для определения влияния индекса фиброза по Knodell, МЕТА VIR, Ishak на изучаемые факторы (уровень коллагена и гиалуроновой кислоты в крови) использовали однофакгорный дисперсионный анализ - ANOVA Зависимость средних значений и дисперсий оценивали по критериям Стьюдента, Уэлча, Фишера Критерий Фишера использовали при сравнении дисперсий изучаемых величин, при их (дисперсий) равенстве использовали t (критерий Стьюдента), при их неравенстве использовали Т (критерий Уэлча) Результаты описаны в виде среднего значения ± средняя ошибка средней (М±т) Для оценки значимости различий качественных признаков в группах использовали критерий хи-квадрат Для определения достоверности разности малых долей использовали метод <р (ФИ) Для оценки значимости корреляционной связи между лабораторными показателями применялся параметрический корреляционный анализ Спирмена (г)

Работа выполнена на кафедре инфекционных болезней и эпидемиологии в ГОУ ВПО «Московский Государственный Медико-стоматологический Университет Росздрава» (ректор - прфессор О О Лнушевич, президент- академик РАМН, профессор Н Д Ющук) на базе ГУЗ г Москвы ИКБ№1 ДЗ г Москвы (гл врач - д м н, проф Малышев Н А, зав консультативным специализированным гепатологическим отделом - д м н , проф Блохина НП) В выполнении отдельных фрагментов работы принимали участие сотрудники лаборатории диагностики вирусных гепатитов и отдела молекулярной вирусологии НИИ вирусологии им ДИ Ивановского РАМН, Specialty Laboratories (США), Шведского института по контролю над заболеваемостью (Swedish Institute for Infectious Disease Control), г Стокгольм, лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГУ «НИИ Физико-химической медицины Росздрава», ИКБ №1 ДЗ г Москвы, ЗАО НПФ "ДНК-технологии", лаборатории клинической биохимии ГУ РОНЦ им НН Блохина РАМН, НИЙЭМ им Пастера, г Санкт-Петербург, и кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ (к м н Яшина Т Л, д б н, проф Говорун В М, к б н Ильина Е Н , д б н Круглое ИВ, ст н с Исагулянц М Г, к б н Мальков ИГ, вне Любимова HB, дбн Кушлинский НЕ, к б н Калинина OB, к м н Брагинский Д М, Келли Е И , д м н Климова Е А, к м н Огиенко О Л , к м н Сафиуллина Н X, к м н Дудина KP), которых искренне благодарю за помощь

Приношу глубокую благодарность заслуженному деятелю науки РФ, президенту Московского государственного медико-стоматологического университета, заведующему кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии, академику РАМН, профессору Николаю Дмитриевичу Ющуку за большую научно-консультативную помощь, оказанную при проведении настоящей работы

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Клииико-эпидемиологические особенности больных ХГС с различными стадиями фиброза печени С целью определения степени активности и стадии процесса в печени, выработки лечебной тактики было обследовано 307 больных хроническим гепатитом С (94 женщины (30,6%) и 213 мужчин (69,4%) в возрасте от 16 до 65 лет) У большинства больных (179 (58,3%) из 307) выявлялся 1-й генотип НСУ Наиболее представительной была группа пациентов в возрасте от 21 года до 31 года (42,7%) У большинства пациентов (96,7%) антитела к вирусу гепатита С обнаружили при диспансеризации или при обследовании по поводу других заболеваний Только у 10 (3,3%) больных поводом для обследования на наличие антител к НСУ явилось изменение самочувствия и появление жалоб на снижение толерантности к физической нагрузке или дискомфорта в правом подреберье Точно установить длительность заболевания было возможно у. 8,8% пациентов, перенесших желтушную форму ОГС (27/307) Они перенесли ОГС, в среднем, за 3,02±0,7 года (огг 0,5 до 17 лет) до проведения пункционной биопсии печени Предположительную давность заболевания у части пациентов можно было определить по дате гемотрансфузии (40 пациентов - 13%) и начала внутривенного введения наркотических средств (87 пациентов - 28,4%) У части больных (153 пациента - 49,8%) установить давность заболевания не представлялось возможным Длительность заболевания у 154 (50,2%) больных ХГС с известной и предположительной давностью инфицирования до момента проведения ПБП составила, в среднем, 6,86±5,6 лет и варьировала в широких пределах (от 0,5 до 30 лет)

При морфологическом исследовании пунктата печени стадия фиброза по критериям КпойеН была установлена у 307 больных По двум критериям (КпоёеЦ и МЕТАVIII) были оценены пунктаты печени 192 больных и получены данные, представленные в таблице 1

Таблица 1

Распределение больных в зависимости от стадии фиброза печени при оценке пункгата печени по критериям Knodell и шкале МЕТА VIR

Стадии фиброза Морфологическое исследование пункгата по критериям Knodell (п-307) Морфологическое исследование пунктата по критериям Knodell и шкале METAVIR (п-192)

F0 2 % (6/307) METAVIR-1% (2/192) Knodell - не выявлено

Fl 82,7% (254/307) METAVIR - 76% (146/192) Knodell - 82,8% (159/192)

F2 - METAVIR - 7,8% (15/192)

F3 13% (40/307) METAVIR -12% (23/192) Knodell-14,6% (28/192)

F4 2,3% (7/307) METAVIR - 3,1% (6/192) Knodell - 2,6% (5/192)

Результаты, представленные в таблице, демонстрируют, что оценка пункгата печени по критериям Knodell позволила выявить в группе из 307 пациентов наличие выраженного фиброза (F3+F4) у 47 (15,3%) больных При оценке выраженного фиброза печени одновременно по критериям Knodell и шкале МЕТА VIR выявлены расхождения по наличию стадий F3-F4 у 6 (3,1%) из 192 больных Дополнительно по шкале МЕТА VIR удалось выявить наличие фиброза 2 стадии у 15 (7,8%) пациентов

Группа больных с фиброзом печени 3-4 стадии была представлена 37-ю (79,7%) мужчинами и 10-ю (21,3%) женщинами, средний возраст составлял 35 ± 4,7 лет У 7 (8,5%) из 47 больных данной группы диагностирована 4 стадия фиброза печени Среди пациентов с 4-й стадией фиброза печени было 2 женщины (28,6%) и 5 мужчин (71,4%) Среди больных ХГС с выраженным фиброзом печени значительная часть была представлена пациентами в возрасте 41-50 лет (36,2%), однако, группа пациентов моложе 30 лет составляла приблизительно такую же долю - 38,3%

Поскольку важным фактором, влияющим на степень поражения печени при ХГС, является употребление алкоголя, целесообразно было * определить количество лиц, злоупотребляющих алкоголем, в целом, по группе - оно составило 34 человека (11,1%) 21 пациент с ХГС Fl и 13 пациентов с ХГС F3 по критериям Knodell К группе лиц, злоупотребляющих алкоголем, были отнесены больные без признаков тяжелой алкогольной болезни (как лабораторных, так и клинических) и, представляющие 4 группу по классификации Э Е Бехтель (1986) систематически пьющие лица - употребляющие 200-300 мл (до 500 мл) водки 1-2 раза в неделю Большинство этих больных указывали на регулярное употребление алкоголя (1-2 раза в неделю) в значительных дозах (200-500гр), в основном, за счет крепких алкогольных напитков (водка, коньяк, виски) Доля таких

больных в группе ХГС F0-F1 составила 8%±1,7 (21/260), а в группе ХГС F3- F 4 доля таких больных была уже существенно большей - 27,7±6,5% (13/47), р=0,002, в тоже время, большинство 72,3% (34/47) пациентов с выраженным фиброзом печени не злоупотребляли алкоголем Среди больных ХГС с 3-4 стадией фиброза печени доля пациентов, злоупотребляющих алкоголем, достоверно выше по сравнению с таковой среди больных, не злоупотребляющих алкоголем (38,2±8,3% (13/34) и 12,5±2,0% (34/273), соответственно, р=0,004) Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о значительном влиянии систематического употребления алкоголя на формирование выраженного фиброза печени у больных ХГС Однако, большая доля пациентов с фиброзом печени F3-4 не злоупотребляла алкоголем, и хронический гепатит С оставался единственной причиной формирования фиброза печени у этой группы больных

Исследуемая группа из 307 больных ХГС была проанализирована также при делении на 2 подгруппы по признаку биохимической активности гепатита 43 (14%) больных ХГС ПНАТ и 264 (86%) больных ХГС ПЛАТ Данные группы отличались только по половому составу в груше ХГС ПНАТ по сравнению с ХГС ПЛАТ преобладали женщины -62,8±7,4% (27/43) и 25,4±2,7% (67/264), соответственно, р=0,003 Давность заболевания можно было установить у 124 больных ХГС ПЛАТ и у 14 больных ХГС ПНАТ Среди больных ХГС с известной давностью заболевания не было выявлено пациентов с фиброзом 4 стадии У части больных с известной давностью заболевания наблюдалась очень быстрая прогрессия до стадии фиброза 3 7 (17,9 %) из 39 человек с давностью заболевания 1-5 лет В группе ХГС ПНАТ не выявлено стадии фиброза 3 по Knodell среди больных с давностью заболевания 1-5 лет Не выявлено достоверных различий по частоте регистрации фиброза печени более, чем 1-й стадии (суммарно по Knodell и МЕТ А VIR), среди больных ХГС ПЛАТ и больных ХГС ПНАТ (17,4 ± 2,3% (46/264) и 11,6 ± 4,9% (5/43), соответственно, р>0,05)

В исследование по изучению диагностического значения определения сывороточных маркеров фиброза печени (гиалуроновой кислоты - ГК и коллагена IV типа - CL-IV) было включено 88 больных ХГС ПЛАТ с различными стадиями фиброза печени, 28 пациентов с циррозом печени (ЦП) 11 больных с ЦП класса А по Чайльд-Пью, 9 - с ЦП класса В и 8 - с ЦП класса С, у 11 (39,3%) - ЦП HCV-этиологии, у 7 (25 %) - ЦП смешанной этиологии (ВГС + алкоголь) и 10 (35,7%) - ЦП алкогольной этиологии, 13 больных желтушной формой ОГС, у которых в последующем сформировался ХГС, группа сравнения - 19 пациентов с фиброзом легких (ФЛ), контрольная группа (КГ) - 32 практически здоровых человека Распределение исследуемых групп по полу и возрасту представлено в таблице 2

Таблица 2

Распределение по полу и возрасту в группах больных ХГС 1ШАТ,ЦП,ОГС,ФЛ и КГ

Группа,п ХГС F1, п-63 ХГС F3, п-25 ЦП, п-28 ОГС, п-13 ФЛ, п-19 КГ, п-32

Возраст от до, среди от 18 до 59, 26,7±1,1 от 17 до 59, 32,5±2,3 от 28 до 62, 46,5±1,7 от 17 до 52, 29,3 ±2,9 от 36 до 82, 69,8±2,7 от16 до 69, 36,3±2,4

Мужчины 46 (73%) 19 (76 %) 20(71,4%) 7 (53,8%) 17(89,5%) 11(34,4%)

Женщины 17 (27%) 6(24%) 8 (28,6%) 6 (46,2%) 2 (10,5%) 21 (65,6%)

Морфологическое исследование биоптатов печени проводилось одним патоморфологом с использованием полуколичественных методов оценки в баллах выраженности фиброза и активности гепатита по двум шкалам (R G Knodell и METAVIR) Количество портальных трактов в исследуемых образцах составляло, в среднем, 7±0,3 (от 4 до 17) Так как при сравнении частоты регистрации, различных стадий фиброза у больных ХГС по критериям R G Knodell и METAVIR не получено существенных различий, в дальнейшем, сравнительный анализ полученных данных по сывороточным маркерам фиброза и морфологии печени проводили, используя критерии R G Knodell

Больные ХГС, у которых при морфологическом исследовании ткани печени выявлена стадия фиброза F4 (п-4), были включены в группу больных ЦП класса А по Чайлд - Пью Таким образом, у 4 (14,3%) из 28 пациентов с циррозом печени диагноз ЦП явился неожидаемой гистологической находкой, тк у этих больных не было клинических, лабораторных данных и УЗ-признаков, указывающих на ЦП Остальным 24 больным ЦП (85,7%) диагноз поставлен на основании клинико-лабораторных данных и УЗ-признаков, биопсия печени не проводилась

У больных ХГС F1 регистрировался ХГ со слабовыраженной (42,9%) и умеренной активностью (57,1%) У больных ХГС F3 зарегистрирован гепатит умеренной (64%) и выраженной активности (36%) При морфологическом исследовании ткани печени больных ХГС F1 и ХГС F3 отсутствие воспалительного процесса (ИГА=0) и минимальная степень активности (ИГА=1-3) не выявлены Сравниваемые группы (ХГС FI и ХГС F3) не различались по частоте выявления умеренного хронического гепатита (р>0,05), однако, гепатит выраженной активности (ИГА=9-12) зарегистрирован только у больных ХГС F3 , а слабовыраженный хронический гепатит (4-8) - только у больных ХГС F1

В связи с тем, что наибольшие трудности в клиническом аспекте представляет дифференциальный диагноз фиброза 1 и 3 стадий, а также фиброза 4 стадии без клинических проявлений ЦП, был проведён сравнительный анализ клинико-лабораторных данных больных ЦП класса А по шкале Child-Pugh и больных ХГС F1 и ХГС F3

По доле лиц с наличием жалоб и тех или иных клинических проявлений группы больных ХГС Р1 и ХГС РЗ не различались не предъявляли жалоб на момент обследования (68,3% и 64% больных, соответственно), в то время как, среди больных ЦП (А) жалобы отсутствовали лишь у 2 (18,2%, р<0,01) больных У больных ЦП (А) по сравнению с больными ХГС Р1 и ХГС БЗ существенно чаще встречались астеновегетативный (72,7%, 17,4% и 24%, соответственно, р>0,05), диспептический (81,8%, 14,3% и 12%, соответственно, р<0,01) синдромы и тяжесть в правом подреберье (72,7%, 15,9% и 16%, соответственно, р<0,01) Достоверно чаще у больных ЦП (А) по сравнению с пациентами с ХГС Б1, ХГС РЗ наблюдалась гепатомегалия (100%, 60,3%, 68%, соответственно, р>0,01) и спленомегалия (63,6%, 14,3%, 16%, р>0,01) Желтуха зарегистрирована у 3 (27,3%) пациентов с ЦП (А) и ни у одного больного ХГС Р1 и ХГС БЗ Вторичные печеночные знаки выявлялись у 54,5% больных ЦП (А) и не зарегистрированы у пациентов с ХГС Р1 и ХГС РЗ Также у больных ЦП (А) в отличие от больных ХГС Р1 и ХГС РЗ регистрировалась энцефалопатия (36,4%) У больных ЦП (А) присутствовали геморрагический синдром (носовые кровотечения и кровоточивость десен - у 27,3% больных) и снижение массы тела на 1-3 кг за последние 1-3 года (44,4%), которые не зарегистрированы у пациентов с ХГС Р1 и ХГС РЗ По данным УЗИ печени у больных ХГС Р1 и ХГС БЗ одинаково часто выявлялись следующие признаки гиперэхогенность и неоднородность эхоструктуры печени (55/63 - 87,3% и 22/25 - 88% соответственно, р>0,05), гепатомегалия (60,3% и 68%, соответственно, р>0,05) и спленомегалия (14,3% и 16%, соответственно, р>0,05), а у больных ЦП (А), наряду с изменением эхоструктуры печени, увеличением размеров печени и селезенки, отмечалось увеличение диаметра портальной и селезеночной вен у 7 (63,6 %) пациентов

Сравнительный анализ биохимических показателей крови больных ХГС Р1 с ХГС РЗ и ХГС РЗ с ЦП (А) не выявил существенных различий по среднему уровню активности АлАТ, АсАТ, ГГТП, ЩФ, соотношения АсАТ/АлАТ, значений тимоловой пробы, билирубина, общего белка, альбумина и глобулинов, ПТИ, тромбоцитов Сравнительная характеристика лабораторных показателей больных ХГС Р1 и ХГС РЗ представлена в таблице 3 У пациентов с ЦП (А) по сравнению с -больными ХГС Р1 выявлены существенно более высокие средние значения только по активности АсАТ (161,2±28 и 69,4-±4,4 мкмоль/(мин л), р<0,01), соотношения АсАТЛАлАТ (1,2±0,2 и 0,6±0,03, р<0,01) и значениям тимоловой пробы (14,4±2,2 и 8,1±0,4 Ед, р<0,01) У пациентов с ЦП (класс А) по сравнению с больными ХГС РЗ и ХГС Р1 достоверно ниже был средний показатель количества тромбоцитов в крови (126,2±20,1, 228,9±10,7 и 227,5±6,8х103/тт3,

соответственно, р<0,01) Доля лиц с тромбоцитопенией была больше среди пациентов с ЦП (А) (63,6%), чем среди больных ХГС И (15,9%) и ХГС РЗ (12%), р<0,01 По результатам сравнительного анализа клинических и лабораторных данных было сделано заключение, что по результатам клинико-лабораторного обследования невозможно провести дифференциальный диагноз ХГС стадий фиброза П и РЗ

Таблица 3

Сравнительная характеристика лабораторных показателей больных ХГС Пи ХГС РЗ

Лабораторные показатели ХГСР1 " ХГС РЗ

Билирубин (мкмоль/л) 15,4 ±1,0 15,8 ±2,2

АсАТ (мкмоль/мин л ) 69,4 ± 4,4 104,3 ±21,4

АлАТ (мкмоль/ мин л ) 125,5 ± 8,0 144,5 ±18,6

АсАТ/АлАТ/мин л 0,6 ± 0,03 0,8 ± 0,1

ГГТП (мкмоль/мин л ) 80,5 ± 24,1 114,8 ±31,8

ЩФ (мкмоль/мин л л) 84,3 ± 5,2 93,7 ±7,9

Общий белок (г/л) 77,6 ±0,8 75,9 ±1,3

Альбумины (г/л) 47,9 ± 1,1 48,6 ±1,4

Глобулины (г/л) 29,7 ± 0,5 27,2 ± 0,6

ПТИ(%) 86,6 ± 0,8 86,8 ± 1,5

Тромбоциты (хШ^мм3) 227,5± 6,8 228,9 ± 10,7

--V-

р>0,05

Содержание гвалуроновой кислоты (ГК) и коллагена IV типа (СЬ - IV) в сыворотках крови больных ХГС П, ХГС ЖЗ, ЦП, ОГС, ФЛ и здоровых лиц

Средний уровень ГК в сыворотке крови больных ОГС, пациентов контрольной группы и больных ФЛ, не превышал значений нормы (100 нг/мл) и не было выявлено различий в концентрациях ГК среди больных ХГС и ХГС РЗ Средняя концентрация ГК в сыворотке больных ЦП (А) (249,2±40,9 нг/мл) была достоверно выше, чем у больных ОГС (53,9±19,9 нг/мл), ХГС (21,9±2,8 нг/мл), ХГС БЗ (40,7±13,4 нг/мл), пациентов с ФЛ (50,3±7,8) и здоровых лиц (22,9±3,4 нг/мл), р<0,01 С прогрессированием ЦП от класса А к классу В концентрация ГК в сыворотке крови нарастала при ЦП (В) (504,4±132,9 нг/мл) была достоверно выше, чем у пациентов с ЦП (А) (249,2±40,9 нг/мл), р<0,01, а при ЦП (С) (823,5±117,2 нг/мл), значительно выше, чем у пациентов с ЦП (В), р<0,01

В используемой в исследовании коммерческой тест-системе по определению в сыворотке крови коллагена IV типа (СЬ-1У) значения нормы рассчитываются по контрольной группе В соответствии с правилами такого расчета суммировали средний показатель по КГ и два средних квадратичных отклонения по КГ (99,6 + 2 х 20,7 =141) За норму были приняты значения СЫТУ от 0 до 141 нг/мл

Тест-система обладала наиболее высокими показателями чувствительности (68%) и специфичности (100%) при концентрации СЬ-ГУ более 141 нг/мл для диагностики фиброза 3 стадии, но для разграничения фиброза 3 стадии от фиброза 1 стадии оптимальными были концентрации СЬ-1У более 196 нг/мл (чувствительность метода - 88%, специфичность метода - 58,7%). Ни у одного больного ХГС Н уровень СЬ-1У не превышал значений 196 нг/мл. У 32% (п-8) больных ХГС РЗ концентрация СЬ-1У была выше 196 нг/мл, у остальных 68% (п-17) больных - ниже 196 нг/мл. Концентрация СГ-1У более 280 нг/мл позволяла разграничить ЦП от фиброза 3 стадии со специфичностью 88% и чувствительностью теста 100%.

Средние концентрации СНУ в сыворотках крови больных ОГС, ХГС Р1, ХГС БЗ, ЦП (А), ФЛ и у здоровых лиц представлены на рисунке 1.

в кг а фл и ore и хгс fi а хгс f3 ■ цп

**-*** р<0,01 достоверность различий групп ХГС F3 и ЦП (А); *-** р<0,01 достоверность различий групп ХГС F1 и ХГС F3. Рисунок 1. Средние концентрации CL-IV (нг/мл) в сыворотке крови больных ОГС, ХГС F1, ХГС F3, ЦП (А), ФЛ и у здоровых лиц Средний уровень CL-IV в сыворотке крови больных ФЛ не превышал значений нормальных показателей и достоверно не отличался по сравнению с контрольной группой (92,4±8,3 и 99,6±3,9 нг/мл, соответственно, р>0.05). Средняя концентрация CL-IV у

больных ХГС 1'3 была существенно выше, чем у больных ХГС Р1 (201,3±27,7 и 116,9±2,4 нг/мл, соответственно, 1 = 3,04, р < 0,01), а у пациентов с ЦП (А) достоверно больше, чем у больных ХГС БЗ (471,5±73,4 и 201,3±27,7 нг/мл, соответственно, 1 = 3,4, р < 0,01)

Сравнительный анализ степени активности гепатита (ИГА) и концентрации СЬ-1У в сыворотке крови больных ХГС показал, что уровень СЬ-1У в сыворотке крови достоверно выше у пациентов с выраженной активностью гепатита (ИГА 13 -18 баллов) - 251,2±72,5 нг/мл, по сравнению с группами больных с умеренной активностью (ИГА 9-11 баллов) -134,3±7,5 нг/мл, р<0,01, и слабовыраженной активностью (ИГА 4-8 баллов) -117+/-4,4 нг/мл, р<0,01 С прогрессированием ЦП отмечалось увеличение уровня СЬ-1У в сыворотке крови (ЦП (А) - 471,5±73,4, ЦП (В) - 684,2±108,8, ЦП (С) - 1369,8±354,5 нг/мл), разница не достоверна

При сравнении среднего уровня СЬ-ГУ у больных ОГС и ХГС с различными стадиями фиброза (Б1 и РЗ) достоверных различий не выявлено (161,7±24,7, 116,9±2,4, 201,3±27,7, нг/мл, соответственно, р>0,05) Однако, средняя концентрация С1ЛУ в сыворотке больных ОГС была достоверно ниже, чем у больных ЦП (А) Для определения степени изменения уровня СЬ~Р/ от острого периода гепатита С до стадии сформировавшегося ХГС оценивался его уровень у больных ОГС в первые 1-15 дней желтушного периода и через 6 - 16 месяцев после острой НСУ-инфекции Средние концентрации СЬ-ГУ у больных ОГС в эти периоды заболевания достоверно не различались (161,7+/-24,7 и 143,8+/-17,2 нг/мл, соответственно, р>0,05) Содержание коллагена IV типа (СЬ~1У) и гиалуроноврй кислоты (ГК) в сыворотке крови пациентов ХГС до начала лечения интерфероном и после его окончания Среди больных хроническим гепатитом С выделена группа, получавшая ионотерапию интерфероном после подписания информированного согласия об участии в клинических испытаниях Критериями включения в исследование были наличие репликативной фазы ХГС, повышение уровня АлАТ более 1,5 норм, выполнение ПБП и морфологическое исследование пункгата печени до включения в исследование (по критериям Мак), отсутствие данных за цирроз печени, возраст от 18 до 69 лет, отсутствие лечения интерфероном в анамнезе, отсутствие аутоантител (АНФ) в сыворотке крови, нормальные показатели общего билирубина и мочевой кислоты до включения в исследование Больные, включенные в исследование (41 человек), * получали терапию альфа-2-интерфероном в стандартной дозе 3 млн МЕ 3 раза в неделю в течение 48 недель независимо от генотипа НСУ Лечение продолжалось 48 недель при условии достижения РВО - отрицательного результата на наличие РНК НСУ в крови на 12-й неделе лечения

Если РВО не был достигнут, больные выводились из исследования на 16-й неделе лечения У всех пациентов, включенных в исследование, анализ сыворотки крови на содержание СЬ-ГУ и ПС проводился до включения в исследование и сразу после его отмены в том случае, если лечение проводилось 48 недель Если лечение длилось 16 недель, то определение маркеров фиброза проводилось через 6 месяцев после отмены лечения ПБП проводилась не более, чем за 12 месяцев до начала лечения, и в течение 3-х дней после отмены терапии, если пациент получал лечение 48 недель Пациентам, исключенным из исследования, повторная биопсия печени не проводилась В исследование было включено 10 женщин и 31 мужчина, 33 пациента (80,4%) были в возрасте до 30 лет У 24-х человек из 41 (58,5%) получен устойчивый вирусологический ответ на лечение, у 17-та (41,5%) -вирусологический ответ не достигнут Группы пациентов с ответом на лечение и без достижения УВО не отличались по возрастному и половому составу, а так же по предположительной давности заболевания Большинство пациентов употребляли психоактивные вещества внутривенно за 1-5 лет до включения в исследование В группе больных, не ответивших на лечение, 1 генотип был выявлен у 41,2% (7/17) пациентов, в то время как, абсолютное большинство больных, ответивших на лечение интерфероном, были инфицированы генотипом За - 87,5% (21/24) До начала лечения в группе больных ХГС с последующим достижением УВО фиброз 3 стадии по шкале кИак регистрировался у 11 (45,8%) из 24 пациентов, в группе, не ответивших на лечение, у 5 (29,4%) из 7 больных, различия не достоверны (р> 0,05)

При анализе значений ГК и СЬ-1У до и после терапии в зависимости от достигнутого ответа на лечение интерфероном получены следующие данные значения ГК не отличались от нормы у абсолютного большинства пациентов как до лечения, так и после, не превышали нормы в изучаемых группах и существенно не менялись в зависимости от ответа на лечение, значения С1ЛУ были повышены до лечения у 5 (20,8%) из 24 больных, ответивших на терапию, и у 4 (23,5%) из 17 пациентов без ответа на лечение После отмены терапии доля лиц с повышенными значениями СИЛУ в группе больных с УВО уменьшилась с 20,8% до 8,3% (2/24), а в группе без УВО выросла с 23,6% до 41,2 % (7/17) Таким образом, доля больных с ухудшением показателей СЬ-ГУ после отмены терапии стала существенно большей в группе больных без достижения УВО по сравнению с группой больных с достижением УВО (41,2%±12,3 и 8,3%±5,6, соответственно, 1=2,4, р<0,05)

В группе больных с достижением УВО средние значения СЬ-1У до начала терапии (127,6±6,8) и после нее (116,8±6,7) не различались и не превышали нормальные

показатели Среднее значение СЬ-1У до начала терапии у больных без достижения УВО (125,9±1,48 нг/мл) так же не превышало нормальные показатели и не отличалось от такового до лечения в группе с достижением УВО (127,6±6,8 нг/мл), но после отмены терапии стало существенно более высоким, превышало нормальные значения, а так же было достоверно выше, чем в группе пациентов с достижением УВО после отмены лечения (146,7±1,2 и 116,8 ±6,7 нг/мл, соответственно, 1=4,4, р<0,01) Закономерности персистенции НСУ в лейкоцитах и плазме крови больных ХГС до и

после лечения интерфероном В исследование включено 104 пациента с наличием антител к НСУ в крови 58 мужчин и 46 женщин в возрасте от 15 до 72 лет У 24 (23,0%) человек была диагностирована клинико-биохимическая ремиссия длительностью от 12 месяцев до 4-х лет (отсутствие жалоб, внепеченочных проявлений НСУ-инфекции и стойко нормальные показатели уровня активности АлАТ) Пациенты этой группы никогда не получали терапию генноинженерными интерферонами (ИФН) и ремиссия у них носила спонтанный характер У 80 (76,9%) человек наблюдался постоянно повышенный или волнообразный уровень активности АлАТ на протяжении 6-60 месяцев Среди всех РНК-позитивных образцов сывороток крови в 76,6 % (76/99) случаев выявлялся генотип 1Ь, в 6,9 % (7/99) -генотип 1а, в 4,0 % (4/99) - генотип 2а, в 2,0% (2/99) случаев - генотип За У 10 пациентов одновременно выявлялось несколько генотипов 5 (5,0%) пациентов - генотип 1Ь+1а, 3 (3,0%) пациента - генотип 1Ь+2а, 2 (2,0%) пациента - генотип 1Ь+За У больных с клинико-биохимической ремиссией генотип 1Ь был выявлен в 92,3 % случаев, у больных ХГС с гиперферментемией - в 86,3% случаев

В результате обследования 24 человек в фазе спонтанной клинико-биохимической ремиссии РНК НСУ была выявлена в лейкоцитах у 11 (45,8%) пациентов, в плазме - у 13 (54,1%) больных. При этом у 6 (25%) больных РНК НСУ обнаружена только в лейкоцитах, у 8 (33,4%) - только в плазме, а у 5 (20,8%) - одновременно в плазме и лейкоцитах В итоге РНК НСУ выявлялась у 19 (79,2%) из 24 больных У 5 (20,8%) пациентов в фазе спонтанной клинико-биохимической ремиссии РНК НСУ не выявлялась ни в плазме, ни в лейкоцитах При обследовании 80 больных ХГС с наличием гиперферментемии РНК НСУ в лейкоцитах была выявлена у 76 (95,3%), в плазме - у 69 (86,3%), только в лейкоцитах - у 11 (13,7 %), только в плазме - у 4 (5%), одновременно в плазме и лейкоцитах - у 65 (81,3%) человек В целом, РНК НСУ выявлена у всех 80 (100%) пациентов Таким образом, в группе пациентов со спонтанной клинико-биохимической ремиссией по сравнении) с 1руппой больных ХГС существенно реже выявляется РНК НСУ как в плазме (54,1 ±10,4%

(13/24) и 86,3 ±3,8% (69/80) , так и в лейкоцитах (45,8±10,4% (11/24) и 95,3±2,4% (76/80), р<0,01), в то время как, доля пациентов с переистенцией РНК НСУ изолированно в лейкоцитах не отличается в той и другой группах

Лечение препаратами рекомбинантного интерферона в дозе 3 млн ЕД 3 раза в неделю проводилось 54-м пациентам с постоянно повышенным или волнообразным уровнем АлАТ в течение 6-ти месяцев Через 6 месяцев лечения больные были обследованы на наличие РНК НСУ в плазме и лейкоцитах Определение РНК НСУ в плазме и лейкоцитах проведено 22 больным до лечения и~через 6 месяцев после отмены терапии У 14 пациентов обследование проводилось до лечения, сразу после отмены терапии и через 6 месяцев после отмены лечения, 32 пациента были обследованы непосредственно после отмены терапии Среди пациентов, получавших терапию, у 46 (85,2%) был выявлен первый генотип НСУ Из 54 пациентов, получавших лечение, 24 (44,4%) оказались резистентны к проводимой терапии, т е у данной группы больных не происходило снижения или нормализации активности АлАТ и исчезновения РНК НСУ в сыворотке крови на фоне лечения в течение 6 месяцев У 30 (55,6%) больных ХГС на фоне лечения произошла биохимическая ремиссия - нормализация уровня АлАТ и, в дальнейшем, нормальные показатели аминотрансфераз сохранялись в течение 4-6 месяцев Из 14 человек, обследованных до, после отмены лечения и через 6 месяцев после отмены терапии, у 12 на фоне лечения ИФН была отмечена биохимическая ремиссия У всех 12 (100%) пациентов РНК НСУ выявлялась в лейкоцитах до лечения и у 5 (41,6%) человек - после лечения У 11 (91,6%) пациентов РНК НСУ выявлялась в плазме до лечения, у 4 (33,3%) человек - после лечения У 4 (33,3%) больных после лечения РНК НСУ выявлялась как в плазме, так и в лейкоцитах Всего РНК НСУ была выявлена у 5 (41,6%) из 12 пациентов на фоне нормальных показателей АлАТ после лечения ИФН и выявлялась достоверно реже, чем до лечения (41,6±14,9% (5/12) и 100% (12/12), соответственно, 1=3,93, р<0,01) Из 30 больных ХГС с развитием биохимической ремиссии на фоне терапии (обследованных до и после лечения), РНК НСУ выявлена у 12 (40%) из 30 пациентов У 10 (33,3%) пациентов РНК НСУ обнаружена только в плазме, у 6 (20%) человек - как в лейкоцитах, так и в плазме, у двух пациентов - только в лейкоцитах (6,6%) После окончания периода наблюдения наличие УВО регистрировалось только у 15 (27,7%) из 54-х пациентов У 9 из 15 (60%) пациентов, достигших УВО, до лечения определялся 1-й генотип НСУ и, таким образом, только у 9 (19,5%) из 46 больных с первым генотипом НСУ был достигнут УВО

Анализ частоты выявления РНК НСУ в лейкоцитах среди больных с нормальными показателями АлАТ показал, что РНК НСУ выявлялась в лейкоцитах в 45,8±10,4% (11/24) случаев у пациентов со спонтанной клинико-биохимической ремиссией и только в 20±7,3% (6/30) случаев у больных с ремиссией после лечения (данные различия достоверны - 1=2,03, р<0,05) Важно отметить, что по частоте выявления РНК НСУ в плазме среди обсуждаемых групп различий не выявлено Таким образом, среди больных со спонтанной ремиссией достоверно чаще выявляется персистенция НСУ в лейкоцитах по сравнению с больными ХГС с ремиссией после лечения

Анализ частоты выявления РНК НСУ в различных субстратах крови в группе больных, резистентных к лечению интерфероном, показал наличие виремии у 100% больных через 6 месяцев лечения У 17 (70,8%) из 24 пациентов без биохимической ремиссии на фоне терапии РНК НСУ была обнаружена в лейкоцитах и плазме, у всех 24 (100%) человек - в плазме При сравнительном анализе частоты выявления РНК НСУ в различных субстратах крови у больных с биохимической ремиссией после лечения ИФН и в группе пациентов без биохимической ремиссии обнаружены существенные различия по частоте выявления РНК НСУ одновременно в лейкоцитах и в плазме - 20±7,3% (6/30) и 70,8±9,5% (17/24), соответственно, 1=4,2, р<0,01, в плазме - 33,3±8,6% ( 10/30) и 100% (24/24), соответственно, 1=7,6, р<0,01, суммарно в плазме и лейкоцитах - 40±8,9% (12/30) и 100% (24/24), соответственно, 1=6,74, р<0,01 В начале исследования среди больных ХГС (п=80), не получавших лечение интерфероном, РНК НСУ была выявлена изолированно в лейкоцитах у 13,7±3,8% (11/80) пациентов, а, в целом, у 95,3±2,3% (76/80) больных В группе больных ХГС (п=54), получивших противовирусную терапию, через 6 месяцев интерферонотерапии РНК НСУ была выявлена в лейкоцитах у 42,6±6,7% (23/54) пациентов, причем, изолированно в лейкоцитах - у 3,7±2,6% (2/54) пациентов Выявленные различия в группах достоверны в отношении выявления РНК НСУ в лейкоцитах в целом ^7,2, р<0,01) и в отношении выявления РНК НСУ изолированно в лейкоцитах (1=2,2, р<0,05) Частота выявления РНК НСУ в лейкоцитах крови у больных ХГС, не получавших лечение интерфероном, и больных ХГС, получивших лечение интерфероном в течение 6 месяцев, представлена в таблице 4

Таблица 4

Частота выявления РНК НСУ в лейкоцитах крови у больных ХГС, не получавших лечение интерфероном, и больных ХГС, получивших лечение интерфероном в течение 6 месяцев и обследованных после окончания лечения

Выявление РНК НСУ Больные ХГС, не получавшие лечение п=80 Больные ХГС, получившие лечение интерфероном в течение 6 месяцев и обследованные после окончания лечения п=54

Всего в лейкоцитах крови 76/80 95,3±2,3 %* 23/54 42,6±6,7%*

Исключительно в лейкоцитах крови 11/80 13,7±3,8%** 2/54 3,7±2,6%**

*- * t=7,2 р<0,01, **- ** t=2,2, р< 0,05

Таким образом, лечение интерфероном существенно уменьшает долю больных ХГС с персистенцией в лейкоцитах крови С другой стороны, сам факт персистенции РНК HCV в лейкоцитах крови не препятствовал развитию биохимической ремиссии у 55,6% (30/54) пациентов из группы больных, получавших лечение Изолированная персистенция в лейкоцитах регистрировалась только у 6,6% (2/30) больных в этой группе При этом, в группе больных, резистентных к интерферону (п=24), вообще не регистрировалась изолированная персистенция РНК HCV в лейкоцитах крови после лечения

Факт выявления персистенции РНК HCV в лейкоцитах у абсолютного большинства больных ХГС (95,3%) не позволяет считать наличие РНК HCV в лейкоцитах фактором, влияющим на резистентность к лечению интерфероном Факт изолированной персистенции РНК HCV в лейкоцитах регистрируется только у 13,7% больных ХГС и не регистрируется у больных ХГС без биохимической ремиссии на фоне лечения, что так же не позволяет считать изолированную персистенцию РНК HCV в лейкоцитах фактором резистентности к лечению ИФН Клиническое значение выявления аутоиммунных антител LKM-1, LSP, SMA, LC-1, ANA и AMA в сыворотке крови больных ХГС, с предполагаемым аутоиммунным компонентом и резистентных к интерферонотерапии Было обследовано 26 больных ХГС (12 женщин и 14 мужчин) в возрасте от 24 до 60 лет (средний возраст 38,8±7,8 лет) в динамике заболевания Из 104 больных ХГС с подтвержденной вирусемией, наблюдавшихся в течение 4-5 лет, было выделено 26 пациентов по следующим критериям наличие непостоянных, но повторяющихся жалоб на миалгии или артралгии в отсутствии лечения или на фоне лечения интерфероном, повышенное значение ревматоидного фактора в крови даже однократно в период наблюдения, до начала лечения интерфероном Указанные критерии позволяли

предположить, с одной стороны, наличие аутоиммунного компонента на фоне ХГС и, с другой стороны, усугубление степени выраженности аутоиммунного компонента на фоне лечения интерфероном и развитие резистентности к лечению Исследовалось от 2-х до 9-ти образцов крови от каждого пациента (всего 86 образцов от 26 больных) 17 больных, не получавшие лечение, и 9 больных, получавшие лечение интерфероном в дозе 3 млн ЕД 3 раза в неделю в течение 6-12 месяцев, были обследованы с интервалами в 1-2 года Группа из 9 больных, получавших лечение, была представлена семью пациентами, инфицированными субтипом 1Ъ HCV, резистентными к терапии интерфероном (без УВО и биохимической ремиссии) и двумя пациентами, инфицированными субтипом 1b HCV с достижением УВО и биохимической ремиссии Анти-LCl и анти-LKM не регистрировались в крови ни у одного больного ХГС как до так и после лечения интерфероном В образцах сывороток крови, полученных до начала лечения интерфероном, чаще всего регистрировались ANA (в 18 образцах от 8-ми пациентов), при этом, приблизительно, с одинаковой частотой - в образцах с повышенным и нормальным уровнем АлАТ (31,3% и 20%, р>0,05) На фоне лечения интерфероном ANA выявлялись только у 1 больного из 7 (1 из 14 исследованных образцов - 7,1%) Необходимо отметить, что во всех 19 образцах, положительных на наличие ANA, определялись минимальные значения положительной реакции (8 sp) После завершения лечения интерфероном ANA не выявлялись в крови ни у одного из обследованных- пациентов Остальные виды аутоиммунных антител регистрировались в крови больных ХГС с частотой от 1,2% до 20% и также на уровне минимальных положительных значений В целом, аутоантитела выявлялись у 14 (53,8%) из 26 больных ХГС с предполагаемым аутоиммунным компонентом, при этом, только у 4-х (15,4%) пациентов выявлялись 2 вида аутоиммунных антител Только в 4-х из 17 образцов сывороток крови выявлялись одновременно два вида аутоиммунных антител У 2-х из 7-ми пациентов, резистентных к лечению интерфероном, выявлялись аутоиммунные антитела (SMA или ANA в минимальных значениях), при этом только в одном случае на фоне лечения интерфероном (1 из 14 образцов на фоне лечения) Клиническое значение изменчивости NS5A региона HCV (ISDR) у больных ХГС, инфицированных генотипом 1Ь и устойчивых к лечению генноинженерным интерфероном Из 19 больных ХГС, инфицированных генотипом 1Ь, была выделена группа из 16 человек, у которых на фоне лечения интерфероном в дозе 3 млн ЕД три раза в неделю в течение 6 месяцев не было получено как биохимического, так и вирусологического ответа У 3-х (15,8%) из 19 пациентов был достигнут биохимический и вирусологический ответ на

терапию через 24 недели лечения, они продолжили терапию интерфероном до 48 недель и, впоследствии, у них был зафиксирован УВО через 24 недели после отмены терапии

Группа больных, резистентных к лечению интерфероном, была представлена 10 мужчинами и 6 женщинами в возрасте от 26 лет до 61 года, У шести пациентов была точно известна давность заболевания, так как они перенесли острый гепатит С за 6 - 48 месяцев до начала лечения У девяти пациентов давность заболевания можно было предполагать, так как у них в анамнезе было переливание крови за 12 - 72 месяца до начала терапии У шести пациентов была выполнена ПБП и диагностирован фиброз первой стадии по критериям Кпо<1е11 У остальных семи пациентов клинико-лабораторная картина, давность заболевания и результаты УЗИ печени позволяли исключить наличие цирроза печени У всех пациентов до начала лечения уровень АлАТ превышал нормальный в 2 и более раза (от 86 до 314 мкмоль/мин л), и, в среднем, составлял 193,0±20,9 мкмоль /мин л до лечения и 156,9±18,5 мкмоль/мин л после лечения Регистрируемый уровень вирусной нагрузки находился в диапазоне от 52 ООО до 1 799 270 копий/мл и достоверно не различался до и после отмены терапии (737 356±230 058,6 и 751 487,6±185 286,1, соответственно, р>0,05)

У 4-х (25%) из 16 пациентов, резистентных к лечению интерфероном, не было выявлено изменений аминокислотных последовательностей в регионе КОЯ Данный регион генома НСУ генотипа 1Ь у этих больных соответствовал последовательностям нуклеотидов, кодирующих соответствующие аминокислоты, как было описано N Ка1:о (1990) в отношении изолята НСУ-.Г, впоследствии охарактеризованного N Епото!» (1996) как «дикий» вариант У 10-ти (62,5%) из 16 пациентбв были выявлены изменения аминокислотных последовательностей только в одной из следующих позиций 2248, 2218, 2219, 2227 или 2244 У двух (12,5%) пациентов были выявлены замены аминокислотных последовательностей в двух и более позициях 2218 и 2227, 2218 и инсерции 4ак и 2ак в позиции 2237 Таким образом, у 12 (75%) из 16 пациентов были выявлены замены аминокислотных последовательностей в 1-3 позициях Результаты выявления мутационной изменчивости региона КБЯ у 19-ти пациентов исследуемой группы представлены на рисунке 2

Рисунок 2. Варианты мутационной изменчивости региона ISDR у 19-ти больных ХГС

Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента NS5A региона генома HCV (ISDR) проводился как до лечения, так и по его окончании, и в группе пациентов, резистентных к интерферону, в геноме HCV не было выявлено новых замен аминокислотных последовательностей после окончания лечения. Среди трех пациентов, достигших УВО в результате терапии интерфероном у двух (66,6%), пациенты №17, №18 (рис.2), были инфицированы вариантом HCV, идентичным изоляту HCV-J. У одной (33,3%) из трех пациенток, достигших УВО после курса интерферонотерапии (пациентка №19), выявлена замена в позиции 2218 до лечения (замена гисгидина на аргинин) и затем в позиции 2219 после лечения (замена гистидина на аргинин), в то время как, позиция 2218 стала соответствовать "дикому" варианту HCV-J.

Распространение и клиническое значение рекомбинантого варианта HCV у больных ХГС Московского региона В исследование было включено 63 пациента с диагнозом ХГС, не получавших противовирусную терапию: 48 мужчин и 15 женщин в возрасте от 19 лет до 63-х лет (ср.28,52±9,65 лет), наблюдавшихся в КГСО ИКБ1 г. Москвы в 2002-2005гг. В сыворотках пациентов, включенных в исследование, выделялась РНК HCV и затем проводилось генотипирование с использованием в качестве праймеров зондов, типоспецифических для 1 генотипа, информация о которых расположена в 5'UTR- и соге-регионах. На втором этапе исследования образцы РНК HCV из сывороток крови всех 63 пациентов, полученные до начала терапии, были подвергнуты филогенетическому аиализу после проведения прямого секвенирования регионов NS5B, 5'UTR и core генома HCV.

Лечение (монотерапия стандартным альфа-2а-интерфероном в дозе 3 млн ЕД подкожно 3 раза в неделю) получали 49 человек В группе из 63 пациентов было установлено следующее распределение генотипов у 19 (30,2%) человек выявлен генотип 1, субтип 1Ь, у 1-го (1,6%) - генотип 2, субшп 2а, у 43-х (65,0%) - 3-й генотип, субтип За Два образца РНК НСУ от двух пациентов (3,1% - 2/63) после проведения филогенетического анализа идентифицированы как рекомбинантные (2к/1Ь) и полностью соответствовали выявленному ранее в популяции Санкт-Петербурга рекомбинантному субтипу КР1_2к/1Ь Среди 49 пациентов, получивших лечение, генотипы распределились таким образом у 10 пациентов выявлялся генотип 1, субтшт 1Ь, у 36 пациентов - генотип 3, субтип За, у 1 больного - генотип 2, субтип 2а, у 2-х пациентов - рекомбинантный вариант РНК НСУ В группе больных, получавших лечение и с наличием РВО, доля рекомбинантного варианта составила 3,7% (1/27), а в группе с отсутствием РВО - 4,5% (1/22), р>0,05

Необходимо отметить, что из 63 пациентов, включенных в исследование, только 2 человека были эпидемиологически связаны друг с другом (муж и жена), и именно они были инфицированы рекомбинантным вариантом НСУ Данные результаты позволяют констатировать возможность передачи половым путем рекомбинантного субтипа 1У?1_2к/1Ь Из 2-х пациентов, инфицированных рекомбинантным вариантом НСУ, у одного пациента регистрировалась резистентность к лечению монотерапией интерфероном и отсутствие, в дальнейшем, вирусологического ответа на комбинированную терапию интерфероном и рибавирином в течение 3-х месяцев, в то время как, во втором случае получен УВО в ответ на монотерапию интерфероном в течение года

Сравнительная характеристика показателей иммунного статуса у пациентов с различными вариантами течения ХГС, ОГС с различными исходами заболевания и реконвалесцентов ОГС с длительностью наблюдения 3-10 лет У больных с различными вариантами течения ХГС, реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет и больных ОГС было определено процентное содержание и абсолютное количество 9 показателей иммунного статуса СОЗ+, С04+, С04/8, СЛ8+, СО 16+, С020+, НЬА 01!+СВЗ+, СБ95+, 0-лимфоциты

При анализе процентного содержания в крови 9 исследуемых параметров иммунного статуса у больных ХГС ПЛАТ, ХГС ПНАТ, реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет и больных ОГС статистически достоверных различий с контрольной группой не выявлено Не выявлено статистически достоверных различий и по содержанию абсолютного количества В-лимфоцигов, КК и средних показателей иммунорегуляторного

индекса у больных ХГС ПЛАТ, ХГС ПНАТ, реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет, больных ОГС при сравнении с группой контроля При анализе средних показателей абсолютного количества СВ95+-лимфоцитов статистически достоверные различия с контрольной группой (164±41) были выявлены только у больных ОГС с различными исходами и только на 12 месяце от начала заболевания ОГС с предполагаемой реконвалесценцией - 272±16, ОГС с последующей хронизацией - 332±63, р<0,05 Содержание абсолютного количества популяциц, СОЗ+Т-лимфоцитов, которая отражает общий уровень Т-лимфоцитов периферической крови, было достоверно выше, чем в контрольной группе (949±117), у пациентов с ХГС ППАТ с давностью заболевания 3-10 лет (1428±117, р<0,01), у больных ОГС с предполагаемой реконвалесценцией в первые 10 дней желтушного периода (1585±250, р<0,01), на 3 и 12 месяцах от начала заболевания (1322±113, р<0,05, 1472±187, р<0,05, соответственно), у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода (1441±127, р<0,01), на 3 месяце (1314±111, р<0,05), 6 и 12 месяцах от начала заболевания (1276±113, 1575±159, р<0,01) Анализ средних показателей абсолютного количества С04+Т-лимфоцитов (Т-хелперов) в изучаемых группах выявил статистически достоверные различия с контрольной группой (563±70) у больных ОГС с последующей реконвалесценцией в первые 10 дней желтушного периода (880±123, р<0,05), на 3-м (799±108, р<0,01) и 12-м месяцах от начала заболевания (873±137, р<0,05), у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода, на 3, 6 и 12 месяцах от начала заболевания (905±104, 840±66, 837±77, 100Ш05, р<0,01), у больных ХГС с длительностью наблюдения 3-10 лет (849±75, р<0,01) Достоверные различия по сравнению с контрольной группой (368±64) в абсолютном количестве СВ8+Т-лимфоцитов, оказывающих цитотоксическое и супрессорное действие, а также играющих ведущую роль в противовирусном иммунитете, были выявлены только у больных ХГС с повышенным уровнем АлАТ с давностью заболевания 3-10,лет (567±53, р<0,05)

Средние значения абсолютного количества О-лимфоцитов, обладающих низкой функциональной активностью, было достоверно выше по сравнению с группой контроля (135±25) у больных ХГС с длительностью наблюдения 3-10 лет (231±41, р<0,05), у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода (244±34, р<0,01), на 3 и 6 месяцах ет начала заболевания (230±33, 237±43, соответственно р<0,05), что говорит о повышенном содержании лимфоцитов с низкой функциональной активностью у больных с формирующимся хроническим гепатитом и у больных с уже сформировавшимся хроничесшш гепатитом С (ХГС ППАТ)

Средние значения абсолютного количества активированных Т-лимфоцитов (НЬА-В1М-СОЗ+) было достоверно выше, чем в группе контроля (35±14) у пациентов с ХГС ПЛАТ и ХГС ПНАТ (155±33, 95±14, соответственно, р<0,01), у реконвалесценгов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет (98±15, р<0,01), у больных ОГС с последующей реконвалесценцией в первые 10 дней желтушного периода (187±69, р<0,05) и на 3 месяце от начала заболевания (100±22, р<0,01), у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода (104±15, р<0,01), на 3 (104±14, р<0,01) и 12 месяцах от начала заболевания (85±20, р<0,05)

Таким образом, при комплексном анализе показателей иммунного статуса было выявлено, что абсолютные количества СБЗ+-, СБ4+-, НЬА-[Ж+СВЗ+-субпопуляций Т-лимфоцитов были повышены как у больных ХГС ППАТ с длительностью наблюдения 3-10 лет, так и в двух подгруппах ОГС У больных ХГС ППАТ, кроме вышеуказанных показателей, были достоверно выше абсолютные количества С08+-субпопуляции Т-лимфоцитов

Наиболее важным результатом при анализе иммунного статуса у пациентов изучаемых групп является факт регистрации отличий группы ХГС ППАТ от группы ХГС ПНАТ Группа ХГС ПНАТ отличается от группы ХГС ППАТ и ОГС по спектру выявленных различий в показателях иммунного статуса и не отличается от реконвалесценгов ВГС с давностью заболевания 3-10 лет У больных ХГС ПНАТ и реконвалесценгов ВГС с длительностью наблюдения более 3 лет выявлены достоверные отличия от контрольной группы только по одному показателю - НЬД-ОЯ, что может косвенно отражать адекватный иммунный контроль над инфекцией вирусом гепатита С у данной категории пациентов В отличие от ХГС ПНАТ, в группе больных ХГС ППАТ выявлены достоверные отличия от контрольной группы абсолютных значений СВЗ+-лимфоцитов, С04+-Т-хелперов, СВ8+лимфоцитов и 0-лимфоцитов Клиническое значение специфического гуморального ответа у больных ХГС и ОГС Специфический гуморальный ответ изучался в группах больных ОГС и ХГС (ХГС ППАТ и ХГС ПНАТ) На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ спектра антител класса к синтетическим пептидам структурных и неструктурных белков НСУ у больных различными вариантами ХГС и у больных ОГС в течение первых 6-ти месяцев от начала заболевания и проанализирована диагностическая и прогностическая значимость выявленных различий между группами без учета исходов ОГС Группа пациентов с острым гепатитом С была представлена 136-ю больными 101 (74,26%) мужчина и 35 (25,74%) женщин в возрасте от 15 до 60 лет (ср 22,51±0,66 лет),

группа ХГС ПЛАТ - 20-ю больными 18 (90%) мужчин и 2 (10%) женщины в возрасте от 17 до 72 лет (ср 32,05±3,36 лет), группа ХГС ПНАТ - 23 пациентами 8 (32%) мужчин и 15 (68%) женщин в возрасте от 19 до 67 лет (ср 38,04±2,76 лет) Сравнительные результаты по выявлению анти-core, 3Hra-NS4, amn-NS5A у больных ХГС ПЛАТ, ХГС ПНАТ и ОГС показали, что в сыворотках крови пациентов с ХГС ПЛАТ, в подавляющем большинстве случаев, выявляются антитела ко всем изучаемым антигенам HCV одновременно анти-core, awra-NS4 и анти-Ш5А и данный спектр выявляется достоверно чаще, чем у больных ХГС ПНАТ (85±8,2% и 39,1±10,4%, р<0,01) и ОГС в первые 10 дней желтушного периода (85±8,2% и 32,4±4,5%, р<0,01)

На втором этапе исследования был проведен сравнительный анализ спектра антител класса IgG к генноинженерным белкам HCV и синтетическим пептидам, моделирующим иммунодоминантные эпитопы структурных и неструктурных белков HCV у больных ОГС с учетом исхода заболевания и реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет Группа больных ОГС включала 18 (60%) мужчин и 12 (40%) женщин в возрасте от 16 до 60 лет (ср 28±5,3лет), группа реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет - 5 (41,6%) мужчин и 7 (58,4%) женщин в возрасте от 23 до 64 лет (ср 36,6±4,3 лет) В результате проведенного сравнительного исследования гуморального ответа у больных ОГС с различными исходами и реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет на структурные (анти-core, антитела к пептидам core) и не структурные белки (анти-NS3 и антитела к пептидам белка NS3, airra-NS4, анти NS5A) получены следующие данные единственным маркером гуморального ответа на антигены HCV, связанным с реконвалесценцией, является отсутствие affra-NS5A в сыворотке крови пациентов Среди изученных 29 параметров гуморального ответа на различные антигены HCV только реактивность на белок NS5A можно считать прогностическим маркером исхода ОГС Реактивность на белок NS5A HCV (aHTH-NS5A IgG) у реконвалесцентов ОГС не регистрируется в 1-3-6 месяц от начала заболевания и выявляется только у 25% больных на 12-м месяце заболевания, в то время как, у больных ОГС с последующей хронизацией реактивность на NS5A HCV выявлялась на уровне 29% -77% -71% - 83% в течение 1-3-612 месяцев, соответственно, р<0,05 Достоверных различий в частоте регистрации анти-NS5A IgG реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет и больных ОГС с различными исходами не выявлено, однако, частота регистрации анти-NSS у реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет не превышает 50%, в то время как, у больных ОГС с исходом в ХГС составляет 83%

Сравнительная характеристика динамики появления и частоты выявления антител класса ^О к белку №5А НСУ у больных ОГС с различными исходами и у реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет представлена на рисунке 3.

Ш ОГС-реконвалесценты

ЕЗ ОГС-хронизация

О Реконвалесценты ВГС со сроком наблюдения 3- 10 лет

*-** - достоверные различия между фуппами ОГС с различными исходами.

Рисунок 3. Частота выявления антител класса к белку N85А НСУ у больных ОГС с различными исходами заболевания в течении 12 месяцев наблюдения и у реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет Корреляционный анализ показал, что на 3-ем и 6-ом"месяцах от начала заболевания наличие РНК ВГС в крови коррелирует только с присутствием анти-№5А (11=0,75) и не коррелирует с наличием анти-И84 и анти-ЫБЗ. Результаты сравнительного анализа гуморального ответа на антигены НСУ в группах реконвалесцентов ВГС (с наличием и отсутствием анти-№5А) представлены на рисунке 4.

100% 80% 60% 40% 20% 0%

1 3 6 12

месяц месяц месяц месяц

3-10 лет

т №

№ т,

о%

1

^ ^ ^ " # ^ * # ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^

1Рег^вэлеяептыгаср«оынэ6мии«иЗ-10лети55» □Рв|;аимп«ц(ктыиср«оика6гм*еммЗ-10пегМ55-

*- различия по группам, р<0,01, **- различия по группам, р<0,05. Рисунок 4. Частота выявляемых антител на структурные и неструктурные белки и пептиды НСУ в группах реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет в зависимости от наличия анти-№5А в крови

Сравнительный анализ гуморального ответа в группах реконвалесценгов с наличием и отсутствием amu-NS5A в крови показал, что у реконвалесценгов ВГС с наличием анти-NS5A в крови достоверно чаще выявляются антитела на большинство белков и пептидов HCV по сравнению с пациентами, негативными по наличию airra-NS5A в крови Исключение составляют только белки и пептиды core, а так же 1, 2, 4, 5 и 11 пулы белка NS3 Таким образом, у реконвалесценгов ВГС, позитивных по наличию анти-NSSA в крови, сохраняется выраженный гуморальный ответ как на структурные, так и неструктурные белки HCV, а гуморальный ответ на белки оболочки HCV регистрируется, исключительно, у анти-Ш5 позитивных пациентов

ВЫВОДЫ

1 В результате изучении характера поражения печени у больных с репликативной формой ХГС при различной степени биохимической активности не выявлено достоверных различий по частоте регистрации фиброза печени стадии 2-3 по МЕТА VIR среди больных ХГС ПНАТ и больных ХГС ПЛАТ

2 В результате изучения частоты регистрации выраженного фиброза печени (по критериям Knodell) у больных, систематически употребляющих алкоголь установлено, что фиброз печени 3-4 стадии выявляется достоверно чаще среди больных, злоупотребляющих алкоголем (38,2±8,3% и 12,5±2%, соответственно, р=0,004), однако, у большинства (72%) больных ХГС с наличием фиброза печени 3-4 стадии хронический гепатит С является единственной причиной формирования выраженного фиброза печени

3 При изучении характера поражения печени у больных с репликативной формой ХГС в зависимости от давности и биохимической активности заболевания установлено, что среди больных ХГС с давностью заболевания 1-5 лет в 17,9% случаев регистрируется быстрое формирование фиброза печени 3-й стадии по критериям Knodell, в то время как, в группе ХГС ПНАТ среди пациентов с известной давностью заболевания (1-5 года и 6-10 лет) не выявлено больных с быстрым формированием фиброза печени 3-й стадии

4 Оценка биоптата печени по шкале МЕТА VIR позволяет дополнительно выявить долю пациентов с выраженной стадией фиброза - F2 в 7,8% случаев, расхождения между двумя критериями (Knodell и МЕТА VIR) в оценке выраженной стадии фиброза печени регистрируются в 3,1% случаев

5 При определении роли маркеров фиброза - гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа в диагностике различных стадий фиброза печени получены данные о существенно более высокой средней концентрации коллагена IV типа в крови у больных ХГС с наличием

стадии фиброза печени 3 (критерии Knodell) по сравнению больными ХГС с наличием стадии фиброза печени 1 (201,3±27,7 и 117,0±2,4 нг/мл, соответственно, р<0,01)

6 Средние значения концентрации коллагена IV типа после курса интерферонотерапии достоверно различаются в группах больных с различным вирусологическим ответом на лечение и выше в ipynne с отсутствием вирусологического ответа (146,7±1,2 и 116,8±6,7 нг/мл, соответственно, р<0,05) Доля больных ХГС с нарастанием концентрации коллагена IV типа в крови и превышением нормального уровдя после проведенного курса интерферонотерапии существенно выше в группе пациентов без достижения вирусологического ответа по сравнению с группой больных достигших вирусологического ответа на лечение (41,2 % и 8,3%, соответственно, р<0,05) Показатели концентрации гиалуроновой кислоты не превышали нормы в группах больных с различными стадиями фиброза печени и существенно не менялись в зависимости от ответа на лечение

7 При оценке диагностического и прогностического значения аутоантител (ANA, SMA, AMA, анти-LKM-l, анти-LC-l, анти-LSP) в крови больных ХГС, получающих интерферонотерапию, не получено данных за наличие выраженного аутоиммунного компонента и преобладания какого-либо одного варианта аутоантител в группе больных ХГС, полностью резистентных к лечению интерфероном Анти-LC-l и анти-LKM не регистрировались в крови ни у одного больного ХГС как до, так и после лечения интерфероном

8 При определении клинического значения персистенции вируса гепатита С в лейкоцитах крови больных ХГС, получавших и не получавших лечение интерфероном, получены данные о существенно более редкой регистрации в группе больных прошедших курс интерферонотерапии, персистенции РНК HCV как в лейкоцитах, в целом, (42,6% и 95,3%, соответственно, р<0,01), так и, исключительно, в лейкоцитах (3,7% и 13,7%, соответственно, р<0,05) В группе больных без достижения биохимической ремиссии и с сохраняющейся виремией на фоне лечения не выявлено изолированной персистенции РНК HCV в лейкоцитах, в то время как, у больных с развитием биохимической ремиссии на фоне лечения изолированная персистенция РНК HCV в лейкоцитах регистрируется в 6,6% случаев

9. При определении вариантов генетической изменчивости ISDR региона гена NS5A Ib генотипа HCV у больных ХГС Московского региона, полностью резистентных к интерферонотерапии, установлено, что геном вируса гепатита С в 25% не имеет мутаций в ISDR регионе и в 75% случаев представляет собой «промежуточный» тип мутационной изменчивости (1-3 аминокислотные замены)

10 При анализе частоты выявления рекомбинантного интергенотипического варианта РНК ВГС (субтип ИП_2к/1Ь) среди больных ХГС Московского региона установлено, что рекомбинантный геном НСУ выявлен у 3,1% пациентов В группе с наличием РВО на фоне лечения интерфероном доля рекомбинантного варианта составила 3,7%, в группе с отсутствием РВО - 4,5% (р>0,05), что не позволяет считать инфицирование рекомбинантным вариантом ЛР1_2к/1Ь фактором резистентности к интерферонотерапии

11 При анализе исходов гепатита С в сопоставлении с показателями неспецифического иммунного ответа пациента выявлен сходный иммунный профиль групп больных ХГС ПНАТ и реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения более 3 лет данные группы пациентов отличаются от контрольной группы только по одному показателю -абсолютному значению маркера активации лимфоцитов (Н11,АТЖ+) Группа больных ХГС ПЛАТ достоверно отличается от контрольной группы по абсолютному значению содержания в крови СВЗ+-, С04+-, С08+-Т-лимфоцитов, НЬА-В11+- и 0-лимфоцитов

12 При анализе исходов гепатита С в сопоставлении с показателями специфического гуморального ответа пациента установлено, что в группе больных ХГС с постоянно нормальным уровнем АлАТ достоверно реже регистрируется полный спектр антител к антигенам структурных и не структурных белков (соге , N84 и N85) в сыворотке крови по сравнению с группой больных ХГС с постоянно повышенным уровнем АлАТ (85% и 39,1%, соответственно, р<0,01)

13 При исследовании особенностей специфического гуморального иммунного ответа пациента при естественном течении гепатита С с учетом исхода заболевания выявлено, что наличие РНК НСУ в гфови на 3-ем и 6-ом месяцах от начала заболевания у больных ОГС коррелирует с единственным показателем гуморального ответа - присутствием анга-Ш5А

Реактивность на белок №5А (анти-№5А не регистрируется в первые 6 месяцев от начала заболевания только у больных ОГС с последующей реконвалесценцией

14 При детальном анализе специфического гуморального иммунного ответа реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения > 3 лет показано, что данная группа неоднородна У реконвалесцентов ВГС, позитивных по наличию ант№№!5А, достоверно чаще в крови регистрируется гуморальный ответ на неструктурные белки НСУ, а гуморальный ответ на белки оболочки НСУ регистрируется, исключительно, у анти-Ы85-позитивных пациентов Полученные данные о различной реактивности на белок №5А у больных ОГС с различными исходами, корреляции РНК НСУ с наличием анти-Ш5А

и выявленные различия в спектре антител у реконвалесцентов со стажем в зависимости от

выявления airra-NS5A IgG позволяют рассматривать отсутствие aimi-NS5A IgG в 1фови как дополнительный маркер реконвалесценции при вирусном гепатите С

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Учитывая наличие в популяции больных ХГС лиц с быстрым формированием фиброза печени, рекомендуется проведение ПБП больным ХГС даже с известной небольшой длительностью заболевания (1-3 года) для исключения выраженного фиброза печени и выработки лечебной тактики

2 Рекомендовано проведение оценки биоптата печени одновременно по двум критериям Knodell и METAVIR для исключения расхождений в оценке стадии фиброза печени у больных ХГС

3 Целесообразно определение уровня CL-IV в сыворотке крови у больных ХГС, не ответивших на интерферонотерапию или с противопоказаниями к выполнению ПБП, для осуществления неинвазивного мониторинга фиброза печени и выявления лиц с прогрессирующим фиброзом печени

4 Тестирование РНК HCV в лейкоцитах крови может быть рекомендовано в качестве дополнительного метода обследования, так как позволяет выявлять виремию у части предполагаемых реконвалесценгов ВГС и больных ХГС с отсутствием РНК HCV в плазме крови после завершения курса противовирусной терапии

5 Рекомендовано динамическое тестирование крови больных ОГС в остром периоде заболевания на наличие airra-NS5A IgG в качестве дополнительного критерия возможного формирования хронической HCV-инфекции У предполагаемых реконвалесценгов ВГС со сроком наблюдения более 3-х лет (анти-НСУ-позитивных и РНК HCV-негагивных) отсутствие анти-NSSA IgG в крови можно рассматривать как дополнительный критерий реконвалесценции

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Rôle of HGV infection m the etiology of acute попе A-E hepatitis / T L Yashma, M О Favorov, Y E Khydyakov, О О Znoïko, and ets // IX Tnennial international symposium on viral hepatitis and liver disease - Rome 1996 - Abstract 202 p 254

2 Климова E A, Знойко О О Гепатит С // В ки «Лекции по инфекционным болезням» - M, 1996 - С 153-161

3 Dynamic study of antibodies to immunodominant région of NS4 HCV protem / Znoïko О О, Ogienko О L , Kruglov IV and ets // Abstracts of Fifth International conférence «AIDS, cancer and related problems » - St Petersburg May 25-30 1997- с 66

4 Клинико-биохимическая картина острого и хронического гепатита С и ее связь с наличием антител к различным антигенным детерминантам вируса гепатита С / О О Знойко, О Л Огиенко, И В Круглое и др // Гепатит B,C,D,G - проблемы изучения,

диагностики, лечения и профилактики Тезисы докладов П-й Российской научно-практической конференции с международным участием, 14-16 октября 1997г - стр 81

5 Роль полимеразной цепной реакции в диагностике клинического варианта и оценке эффективности лечения у больных с хроническим гепатитом С / А Е Гущин, О О Знойко ИПГорбарец и др // Гепатит B,C,D,G - проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики Тезисы докладов П-й Российской научно-практической конференции с международным участием, 14-16 октября 1997г - стр 60

6 Диагностическая значимость метода ПЦР при обследовании больных с HCV-инфекцией / Н Д Ющук, О О Знойко, Е А Климова и др // Материалы П Всероссийской научно-практической конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» - Москва, 1998 - С 71-78

7 Эпидемиологическая характеристика HCV-инфекции у медработников / О Л Огиенко, О О Знойко, Е А Климова и др // Проблемы неотложной хирургии (сборник научных работ) К 90-летию со дня рождения академика В И Стручкова - Том VI - Москва 1998 - Стр 155-156

8 Спектр антител к антигенным детерминантам HCV у больных гепатитом С / Н Д Ющук, О О Знойко, О Л Огиенко, и др // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колонопроктологии - Том VIII, №5 - 1998 - с 35-39

9 Выявление полиморфизма геномной РНК вируса гепатита С / Е Н Ильина, А Е Гущин, В М Говорун, Е А Климова, О О Знойко и др // Тезисы докладов Пятого Российского съезда врачей инфекционистов - Москва, 1998 - С 128

10 Спектр выявляемых аутоиммунных антител у больных с хроническим гепатитом С / О О Знойко, О О Огиенко, Г Н Кареткина, и др // Тезисы докладов V всероссийского съезда врачей-инфекционистов - Москва, 1998г - с 114-115

11 Биохимическая картина желтушной формы ОГС у больных с различным спектром серологических маркеров и результатов ПЦР-анализа / Н Д Ющук, О Л Огиенко, О О Знойко, и др // Тезисы докладов V всероссийского съезда врачей-инфекционистов -Москва, 1998 - с 158

12 Знойко О О Вирусные гепатиты / Методические рекомендации «Инфекционные болезни» часть 5 Тестовый контроль по темам методического пособия «Инфекционные болезни» (части 1 - 4) Под редакцией НДЮщука, Н Н Островского, ЮЯВенгерова ВУНМЦ МЗ РФ - Москва, 1998 - Утверждено МЗ РФ - с 71-76

13 Ющук НД Знойко 0 0 Новое в диагностике и лечении вирусных гепатитов У/ Врачебная газета № 2, ноябрь 1999 - С 24-25

14 Современные аспекты изучения вирусных гепатитов / Н Д Ющук, О О Знойко, Е А Климова, Г Н Кареткина // Сборник научных трудов к 70-летию со дня рождения академика В И Покровского «Патогенетические основы лечения острых инфекционных заболеваний» - Москва, 1999 - С 265-274

15 Частота встречаемости антител к антигенам белков соте, NS4, NS5 вируса гепатита С в сыворотках крови больных острым гепатитом С в первые 10 дней желтушного периода / О Л Огиенко, И В Круглов, О О Знойко, и др // Гепатит В, С, Д, - проблемы диагностики, лечения и профилактики Тезисы докладов Ш Российской научно-практической конференции с международным участием 22-24 июня, Москва, 1999 - с 174

16 Характер морфологических изменений в печени у больных с HCV-инфекцией в зависимости от уровня активности АЛТ / Н Д Ющук, О О Знойко, Е А Климова и др // Тезисы докладов симпозиума «Человек и лекарство» -1999 - С 264

17 Персистенция HCV в плазме и лейкоцитах больных с хронической HCV-инфекцией до и после лечения / Н Д Ющук, О О Знойко, Е А Климова и др // Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» - Москва, 1999 -С 260

18 Оценка генетической гетерогенности РНК вируса гепатита С Возможность прогнозирования течения заболевания / ЕН Ильина, А Е Гущин, В М Говорун, О О Знойко и др // Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» - Москва, 1999 -С 88-89

19 Выявление геномной РНК вируса гепатита С в сыворотке, лимфоцитах и печени больных гепатитом С / ЕН Лакина, Е Н Самохвалов,-О Г Левченко, ОВМосалова, Е А Климова, О О Знойко и др // Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» - Москва, 1999 -С 125

20 Новый подход в генотипировании вируса гепатита С / Е И Ильина, А Г Гущин, В М Говорун, О О Знойко и др // Эпидемиология и инфекционные болезни -1999 - №5 -С 23-26

21 Климова Е А , Знойко О О Гепатит С / Лекции по инфекционным болезням - М,

1999 Т2-С 30-38

22 Клиника, диагностика, лечение и диспансеризация вирусных гепатитов у взрослых и детей Методическое пособие- приложение к Приказу КЗ г Москвы от 06 07 2000г №283 / Н П Блохина, Н А Малышев, С Г Чешик, Н Д Ющук, О О Знойко и др -М, 2000 -44 с

23 Выявление позитивных (геномных) и негативных (репликативных) цепей РНК вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах и ткани печени больных хроническим гепатитом С с помощью полимеразной цепной реакции /ЕЙ Лакина, Е И Самохвалов, О Г Левченко, О В Масалова, Е А Климова, О О Знойко и др // Вопросы вирусологии -

2000 -№4 - С 37-41

24 Знойко О О, Климова Е А, Предварительные результаты 2 фазы испытаний Максамина™(гистамина дигидрохлорида) в комбинации с Интроном-А® (интерфероном а-2Ь) при лечении хронического гепатита С Анализ 48 недель лечения //Тезисы докладов научно-практической конференции «Гепатит С (Российский консенсус)» - Москва, 2000 -С 64-66

25 Клиническое значение выявления РНК вируса гепатита С в различных субстратах у больных хроническим гепатитом С / Н Д Ющук, Е А Климова, О Г Пылева, О О Знойко и др // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонопроктологии -2001 -Т XI №1 - Приложение №12 - Материалы Шестой Российской конференции «Гепатология сегодня» - Москва, 2001 - С 21

26 Серологическое исследование эпитопов белка NS5 вируса гепатита С и их значение для клиники и диагностики /ИВ Круглов, О О Знойко, М П Финогенова и др // Вопросы вирусологии -2000 №1 С 14 - 17

27 Закономерности персистенции HCV в плазме и лейкоцитах при хронической HCV-инфекции / Ющук НД, Знойко ОО, Климова ЕАи др // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колонопроктологии -2000 №4 -С 59-64

28 Вирусные гепатиты Клиника, диагностика, лечение Методические рекомендации / Н Д Ющук, Н П Блохина, О О Знойко и др // Москва ВУНМЦ МЗ РФ 2000, - 44 с

29 Histological Status m Asymptomatic Chronic HCV Infection"/ N D Yushuk, IV Maev, О О Znoiko and et al // Gut, Vol 49 (suppl III ), November 2001, Abstracts of 9-th United Europian Gastroenterology Week 6-10 October 2001, Amsterdam, abstract no 1263

30 Значение современных лабораторных методов в диагностике острых вирусных гепатитов / Ющук Н Д, Гаджикулиева М М, Знойко О О и др // Тезисы докладов IV Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики» - Москва, 2001 - С 407-408

31 Значение выявления РНК вируса гепатита С в различных субстратах у больных хроническим гепатитом С / Н Д Ющук, Е А Климова, О О Знойко и др // Клиническая медицина - 2001 №12 - С 67-71

32 Пункционная биопсия печени и возможности неинвазивного мониторинга фиброза при хроническом вирусном гепатите С / Н Д Ющук, О О Знойко, Н X Сафиуллина, и др // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии -2002 №1 -С 9-16

33 Спектр антител к различным антигенам HCV при разных вариантах течения хронической HCV- инфекции /ИВ Круглое, О О Знойко, О JI Огиенко и др // Вопросы вирусологии -2002 №2 -С 11-16

34 Диагностическая значимость определения антител к различным антигенам вируса гепатита С у пациентов с острой и хронической HCV-инфекцией / НДЮщук, OJI Огиенко, И В Круглое, О О Знойко и др. // Терапевтический архив -2002 №4 - С 18-22

35 Проблемы ранней диагностики острых вирусных гепатитов, актуальные для стационаров хирургического профиля / К Р Дудина, О О Знойко, И В Круглов и др // Неотложная помощь в клинических условиях» (Сборник научных работ), том IX Под редакцией Э В Луцевича и Г Н Проскурникова Издательство УПЦ «Талант» МЗ РФ, МЗ МО -2002 С 138-140

36 Etiological Structure of Viral Hepatitis m Moscow / Znoyko О О, Michailov MI, Dudina К R, Kruglov I V, Widell A, Isaguliants M // Final Programme and Book of Abstracts IEA World Congress of Epidemiology m Montreal, Canada, August 18-21, 2002, Supplement to the International Journal of Epidemiology International Epidemiological Association WP10

37 Возможности лабораторной диагностики острого гепатита С / К Р Дудина, О О Знойко, И Г Мальков, и др // Материалы VI-го Российского съезда инфекционистов, 29-31 октября 2003 -С 117

38 Сравнительная характеристика биохимических и морфологических показателей у больных ХГС с постоянно нормальной и волнообразной активностью трансаминаз / О О Знойко, НДЮщук, Е А Климова и др // Тезисы докладов V Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики» - Москва, 2003 - С 112

39 Исследование сероконверсии к различным антигенам вируса гепатита С у больных гепатитом С с различными исходами /ИВ Круглов, О Л Огиенко, О О Знойко и др // Вопросы вирусологии -2003 №2 С 36-40

40 Выявление РНК вируса гепатита С методом ОТ-ПЦР в острую и хроническую фазу инфекции / Знойко О О, Дудина К Р, Мальков и др // Гепатология, приложение к журналу «Экспериментальная и клиническая гастротерология» -2003 №2 -С 16-19

41 Клинические особенности дельта гепатита у ВИЧ- инфицированных/ С Л Максимов, А В Кравченко, О О Знойко и др // Эпидемиология и инфекционные болезни -2003 № 2 -С 26-29

42 Znoiko О О , Yuschuk N D , Invasive and Non-invasive Monitoring of Hepatitis С Virus-Induced Liver Fibrosis Alternatives or Complements // Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003 ,4, p 195-209

43 Выявление типоспецифических анти-НСЫ84-антител у больных гепатитом С методом иммуноферментного анализа /ИВ Круглов, О О Знойко, Е А Климова и др // Вопросы вирусологии -2003 №3 -С 32-36

44 Дудина К Р, Знойко О О Острый гепатит С - аспекты диагностики и прогноза // Материалы научно-практической конференции "Инфекционные болезни и антибактериальные средства" Москва, 6-7 октября 2003 -С 10-12

45 Хронический гепатит С рациональная противовирусная терапия / Е А Климова, О О Знойко, С Л Максимов и др // Фарматека -2003 №7 (70) - С 10-16

46 Оценка возможного влияния клинико - биохимических и вирусологических параметров на первичный ответ при монотерапии интерфероном больных ХГС / Сафиуллина НХ, Знойко ОО, Климова ЕЛ, и др // Материалы IV съезда врачей инфекционистов Санкт-Петербург, 29-31 октября 2003 -С 340-341

47 Современные методы лабораторной диагностики острых вирусных гепатитов / Е А Климова, ММГаджикулиева, ООЗнойко и др //.В кн Тезисы докладов VI Российского съезда врачей-инфекционистов - СПб, 2003 - С 449

48 Определение гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа в сыворотке крови больных гепатитом С - неинвазивный метод диагностики фиброза печени / Сафиуллина H X, О О Знойко, Климова Е А и др // Материалы научно-практической конференции "Инфекционные болезни и антимикробные средства" Москва, 6-7 октября 2003 -С 20-21

49 Знойко О О, Ющук H Д Оценка выраженности фиброза печени у больного ХГС -ключевой вопрос в прогнозировании течения болезни // Материалы научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» Москва, 6-7 октября 2003 -С 13-14

50 Возможности и проблемы применения иммуноблота в качестве подтверждающего теста при детекции анти-ВГС в ИФА и в клинических исследованиях / КузинаЛЕ, Садикова H В , Малышев H А, Николаев В Л, Знойко О О и др // Успехи современного естествознания -2004 №6, приложение №1. -С 56-159

51 Знойко ОО, Сафиуллина НХ, Ющук H Д,_ Возможности неинвазивного мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом С // Инфекционные болезни 2004 -Т 2 №3 -С 61-67

52 Диагностическая роль выявления коллагена IVrana и гиалуроновой кислоты в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С для определения стадии фиброза печени / Ющук H Д Знойко О О, Сафиуллина H X и др // Терапевтический архив -2005 №4 -С 50-55

53 Острый гепатит С аспекты диагностики и прогноза / Дудина К Р, Знойко О О , Климова и др // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колонопроктологии -2005 - Т XV №2 - С 47-5054 Острый вирусный гепатит неуточн&нной этиологии факты и предположения / К Р

Дудина, О О Знойко, ИГ Мальков и др//Медицинская помощь -2005 №1-С 19-23

55 Результаты комбинированной терапии хронического гепатита С отечественными препаратами / Б А Климова, О О Знойко, С Л Максимов, H Д Ющук // Материалы 5-ой Восточно-Сибирская гастроэнтерологическая конференция с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этно-экологаческие проблемы заболеваний органов пищеварения» - Красноярск, 2005 - С 194-199

56 Иммунный статус больных с различными исходами острого гепатита С / Ющук H Д, Дудина К Р, Знойко О О и др // Терапевтический архив -2005 № 11 -С 32-37

57 Противовирусная терапия хронических вирусных гепатитов В и С у ВИЧ-инфицированных пациентов // Методическое письмо // H Д Ющук, Ю В Мартынов, Е А Климова Знойко О О и др - M ,2006 -38 с

58 Anti-HCV immune response in healthy individuals in contact with chronic HCV carriers / Znoiko O, Petrakova N, Rechkina and al // Abstracts of the 12th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, Paris, July 1-5, 2006 J Clm Virol 2006, 36(suppl 2), 103, P 140

59 Т-клеточный и гуморальный ответы у анти-HCV позитивных лиц в зависимости от исхода острого гепатита / Дудина К Р , Знойко О О , Исагулянц M Г, Ющук H Д // Тезисы докладов IV научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» Москва, 5-6 октября 2006 - С 18

60 Spread of the natural hepatitis С virus recombinant outside Russia / Kalinina О , Jern С , Tallo T, Thcakhanan V , Gusev D , Znoiko О and et al // Abstracts of the 12th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, Pans, July 1-5, 2006 J Clm Virol 2006, 36(suppl 2), 120-121

61 Алгоритм диагностики и лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных потребителей инъекционных наркотиков Методические рекомендации для врачей-инфекционистов и

психиатров наркологов / Ющук Н Д, Мартынов Ю В , Климова Е А, Знойко О О и др -Москва, 2006 -С 28

62 Н Д Ющук, О О Знойко Вирусный гепатит С и реконвалесценция что известно и что предстоит узнать // Тезисы VII Российского съезда инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» Нижний Новгород, 26 октября 2006 - С 200

63 Viral hepatitis co-infections m human immunodeficiency virus positive patients recorded by Moscow Infectious Disease hospital during 2006 / Znoyko О О, Dudma KR, Shutko SA, Isaguliants MG // 3rd International Workshop on HIV and Hepatitis Co-infection Pans, France 7-9 June, 2007 Program & Abstracts, Abstract 28, page 24

64 Diagnosing acute hepatitis of unknown origin / Znoyko O, Tsyganova E , Petrakova N, Isaguliants M // 4th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses, 9th to 13th September 2007, Glasgow, Scotland, UK, abstract P-100

Заказ №719. Объем 2 п. л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г Москва, ул. Палиха-2а, тел 250-92-06 www.postator.ru

HCV-инфекция - одна из ведущих причин хронической патологии печени. В мире насчитывается более 175 миллионов человек, инфицированных вирусом гепатита С (около 1%). В большинстве развитых стран хронический гепатит С составляет четвертую часть в структуре всех хронических гепатитов, а хронический гепатит С с исходом в цирроз занимает первое место в структуре смертности от заболеваний печени [225, 376, 314, 320, 296, 412, 372, 95, 41].

По данным ВОЗ 2002 года, в 2001 году хронические заболевания печени были причиной 1,4 млн. смертей, включая 796 тыс. случаев смерти от цирроза и 616 тыс. - от рака печени. Как минимум 20% этих смертей (более 280 тыс.) связывают с гепатитом С [328, 143, 103, 314]. Острая инфекция вирусом гепатита С у иммунокомпетентных людей заканчивается выздоровлением только в 15-20% случаев, а, в большинстве случаев (80-85%), приводит к формированию хронической формы инфекции. [30, 237, 254]. Установлено, что через 10 лет от момента инфицирования у 5-10%) больных хроническим гепатитом С формируется цирроз печени, а через 20-30 лет - уже у 20%-25% больных [65, 59, 60, 30].

Известно, что вирусный гепатит С с исходом в цирроз печени является наиболее частым показанием к проведению трансплантации печени в Европе и США, в связи с чем для большинства стран мира вирусный гепатит С является большой медицинской, социальной и экономической проблемой [2, 42, 338, 370, 66, 64, 63,47, 46].

К сожалению, даже в развитых странах смертность от хронического гепатита С продолжает оставаться высокой (Poynard Т., 2006). Начиная с 1989г, когда появилась возможность диагностики гепатита С, и до настоящего времени, в изучении патогенеза и естественного течения НСУ-инфекции достигнуты значительные успехи: сформированы основные представления о механизме репликации вируса, показано, что в исходе острой инфекции ключевую роль играет клеточный иммунный ответ [285], а в исходе хронической инфекции скорость и интенсивность развития фиброза печени [276].

Доказано, что HCV обладает высокой степенью генетической изменчивости и антитела, образующиеся к поверхностным антигенам HCV, не обладают вируснейтрализующими свойствами, достаточными для элиминации вируса [90]. В течение последнего десятилетия быстрыми темпами развивались генные методы диагностики HCV-инфекции, позволившие добиться определения генетического материала вируса в минимальных концентрациях и доказать способность его репликации в лимфоцитах крови и других тканях, помимо ткани печени. Благодаря разработке высокочувствительных методов идентификации нуклеиновых кислот и применению этих методов для уточнения исходов вирусного гепатита С, была сформирована концепция о новой форме инфекции вирусом гепатита С - скрытой или «оккультной» HCV-инфекции, и был поставлен вопрос о принципиальной возможности реконвалесценции от этой инфекции, как спонтанной, так и в результате противовирусной терапии [107, 111].

Наконец, за последние 10 лет разработано достаточно эффективное лечение комбинацией пегиллированного интерферона и рибавирина, позволяющее добиться устойчивого вирусологического ответа у 50-60% больных ХГС [20, 281, 259, 201, 171, 170].

Однако, в связи с недостаточной эффективностью современного противовирусного лечения, в основе которого лежит опосредованное через иммунную систему организма действие интерферона [132], интенсивно изучаются функциональные особенности белков вируса гепатита С и особенности репликационного комплекса, который они образуют с целью разработки новых лекарственных препаратов, воздействующих на HCV [239, 288, 72].

Несмотря на большие достижения в изучении иммунопатогенеза гепатита С, остается много нерешенных вопросов в области диагностики, профилактики и лечения данного заболевания. К сожалению, до настоящего времени не разработана профилактическая вакцина, предупреждающая заражение вирусом гепатита С, не разработаны критерии реконвалесценции этого заболевания, существует проблема непреодолимой резистентности к основному противовирусному препарату - интерферону, не внедрены в широкую клиническую практику методы диагностики скрытой НСУ-инфекции и неинвазивные методы мониторинга фиброза печени.

В связи с этим, можно выделить ряд актуальных направлений научных исследований, которые обусловлены проблемами клинической практики и тактическими вопросами ведения пациентов с вирусным гепатитом С: изучение как механизмов, так и скорости формирования фиброза у больных хроническим гепатитом С и разработка методов неинвазивного мониторинга фиброза печени для оценки рисков прогрессии заболевания, эффективности лечения и прогнозирования исходов заболевания; изучение клинической картины, исходов и вариантов течения вирусного гепатита С в сочетании с факторами неспецифического и специфического гуморального и клеточного ответа организма человека в ответ на внедрение вируса гепатита С, без чего невозможна разработка профилактических и лечебных вакцин; разработка критериев реконвалесценции; изучение закономерностей персистенции РНК НСУ в различных субстратах организма человека в отсутствие лечения и после лечения интерфероном; изучение факторов резистентности к интерферону, таких как генетическая вариабельность генома НСУ и рекомбинация фрагментов генома НСУ. Исходя из актуальности нерешенных клинических проблем, касающихся НСУ-инфекции, были сформулированы цели и задачи данного исследования.

Цель исследования

Обосновать возможность прогнозирования исходов инфекции вирусом гепатита С на основании оценки диагностической значимости сывороточных маркёров фиброза печени, изучения факторов резистентности к интерферонотерапии и определения параметров специфического и неспецифического иммунного ответа для совершенствования тактики наблюдения и лечения больных гепатитом С.

Задачи исследования:

1. Изучить выраженность фиброза печени у больных с репликативной формой ХГС при различной степени биохимической активности и давности заболевания в сопоставлении с наличием или отсутствием систематического употребления алкоголя в анамнезе;

2. Определить роль сывороточных маркеров фиброза - гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа в диагностике различных стадий фиброза печени у больных хроническим гепатитом С и значимость этих маркеров при оценке эффективности интерферонотерапии;

3. Оценить частоту выявления аутоантител (ANA, SMA, AMA, анти-LKM-1, анти-LC-l, анти-LSP) у больных ХГС на фоне нормальной и повышенной активности АлАТ и больных ХГС, резистентных к интерферонотерапии;

4. Определить клиническое значение персистенции РНК HCV в лейкоцитах крови больных ХГС в зависимости от ответа на интерферонотерапию;

5. Выявить варианты генетической изменчивости ISDR региона гена NS5A генотипа Ib вируса гепатита С у больных ХГС, резистентных к интерферонотерапии;

6. Установить степень распространения рекомбинантного интергенотипического варианта вируса гепатита С - КР12к/1Ь среди больных ХГС и оценить эффективность лечения интерфероном больных, инфицированных этим вариантом;

7. Исследовать особенности естественного течения и исходов гепатита С при различных формах заболевания в сопоставлении с показателями специфического и неспецифического иммунного ответа пациента.

Научная новизна исследования

Выполненное исследование посвящено клинической роли и прогностическому значению комплекса параметров ответа организма человека на внедрение вируса гепатита С, а так же особенностям изменчивости вирусного генома, выделенного из крови больных хроническим гепатитом С с различным ответом на интерферонотерапию.

Установлено, что среди больных ХГС с давностью заболевания 1-5 лет в 17,9% случаев регистрируется быстрое формирование фиброза печени 3-й стадии по критериям Кпос1е11. Впервые изучено содержание сывороточных маркеров фиброза печени - гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа у больных ХГС с различными стадиями фиброза печени и различным ответом на интерферонотерапию и проведено сопоставление содержания этих маркеров в крови у больных ОГС, больных фиброзом легких и здоровых людей. Установлено, что средние значения СЬ-1У после отмены интерферонотерапии различаются в группах больных с достижением УВО и без ответа на терапию и выше в группе больных, не ответивших на лечение, а доля лиц, с ухудшением показателей СЬ-1У и превышающих норму, существенно выше в группе больных, не ответивших на лечение. Впервые показано, что концентрация СЬ-IV может служить маркером активно продолжающегося фиброгенеза в печени у части больных без достижения УВО после противовирусной терапии и может применяться для мониторинга фиброза печени у данной категории больных.

Уточнены закономерности персистенции РНК НСУ в лейкоцитах крови у больных различными формами ХГС и установлено, что персистенция РНК НСУ в лейкоцитах крови регистрируется у большинства больных ХГС, присутствует изолированно в лейкоцитах крови у 13,7% больных ХГС и регистрируется у 6,6% пациентов с развитием биохимической ремиссии после окончания курса интерферонотерапии. Изучена и уточнена взаимосвязь биохимической активности гепатита и наличием комплекса аутоиммунных антител у больных ХГС при длительном наблюдении (от 1 года до 4-х лет). Показано отсутствие выраженного аутоиммунного компонента в группе больных ХГС, полностью резистентных к лечению интерфероном.

Впервые изучена генетическая изменчивость КОЯ региона гена К85А генотипа 1Ь в нуклеотидных последовательностях геномов НСУ, выделенных из крови больных ХГС Московского региона, полностью резистентных к лечению интерфероном. Установлен низкий уровень генетической изменчивости ^БЯ региона или полное отсутствие изменчивости этого региона по сравнению с изолятом НСУ-1 у данной группы больных. Впервые изучено распространение рекомбинантного интергенотипического варианта РНК НСУ (субтип КП2к/1Ь) среди больных ХГС Московского региона, установлен факт его выявления у 3,1% обследованных, а так же отсутствие влияния этого варианта на эффективность интерферонотерапии. Впервые оценена прогностическая роль параметров специфического гуморального ответа на 26 антигенов НСУ в сочетании с иммунным статусом у больных различными формами вирусного гепатита С и различными исходами заболевания. Установлены различия по спектру специфических и неспецифических иммунных реакций в ответ на инфекцию вирусом гепатита С групп больных ХГС с постоянно нормальным уровнем АлАТ и реконвалесцентов ВГС с давностью заболевания более 3-х лет от группы больных ХГС с постоянно повышенной активностью АлАТ. Впервые сделано заключение о неоднородности группы реконвалесцентов ВГС с давностью заболевания более 3-х лет на основании наличия или отсутствия в крови антител к белку №5А НСУ и показаны существенные различия в спектре антител к другим антигенам НСУ в зависимости от этого показателя.

Практическая значимость

Показано, что в популяции больных ХГС существует группа лиц с быстрым формированием фиброза печени, в связи с чем, необходимо проведение пункционной биопсии печени больным ХГС даже с известной небольшой длительностью заболевания (1-5 лет) для исключения выраженного фиброза печени и выработки лечебной тактики.

В связи с тем, что не получено различий в частоте регистрации фиброза печени стадии 2-3 по METAVIR среди больных ХГС ПНАТ и больных ХГС ПЛАТ, а также, учитывая тот факт, что у большинства больных хронический гепатит С является единственной причиной формирования выраженного фиброза печени вне зависимости от систематического употребления алкоголя по данным анамнеза, рекомендуется проведение биопсии печени больным ХГС даже с невысоким риском прогрессии фиброза печени (постоянно нормальный ' уровень АлАТ и отсутствие злоупотребления алкоголем в анамнезе).

Ценность морфологической диагностики стадии фиброза печени повышается при оценке биоптата печени одновременно по двум критериям (Knodell и шкала METAVIR), так как возможны расхождения в оценке выраженной стадии фиброза печени по различным критериям, а также -выявление пациентов с прогрессирующим фиброзом . - стадия F2 по шкале METAVIR.

Определение уровня CL-IV в сыворотке крови у больных ХГС, не ответивших на интерферонотерапию, позволяет выявлять группу больных с прогрессирующим фиброзом печени для назначения повторных курсов противовирусной терапии, не используя инвазивные методы диагностики фиброза печени.

Детекция РНК HCV в лейкоцитах крови дополнительно позволяет выявлять виремию у части предполагаемых реконвалесцентов ВГС и больных ХГС с отсутствием РНК HCV в плазме крови после завершения курса противовирусной терапии.

Отсутствие aHTH-NS5A IgG у предполагаемых реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения более 3 лет может служить дополнительным критерием реконвалесценции, а выявление анти-NSSA IgG у больных ОГС в остром периоде заболевания является маркером перехода ВГС в хроническую форму.

Апробация работы и внедрение в практику

Диссертация апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО «МГМСУ Росздрава» 30 июня 2007г. (протокол № 52). Материалы диссертации доложены на:

II, III, IV, V и VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, Д и G - проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики» (1997, 1999, 2001, 2003 и 2007);

II Всероссийской конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» (1998); III, VIII, XI Российской конференции «Гепатология сегодня» (1998, 2002, 2006);

Научно-практической конференции «Гепатит С (Российский консенсус)»,

2000;

Третьей Международной ассамблеи «Новые медицинские технологии» (2001);

Московской научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (2003, 2004, 2006, 2007;;

Заседании общества врачей-инфекционистов г. Москвы (2003);

Проблемной учебно-методической комиссии по инфекционным болезням на базе Всероссийского научно-методического центра по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию при МЗ России (Москва, 2002);

Совещании в рамках «New Visby Pro gram» в Шведском институте по контролю над заболеваемостью (Центр Микробиологии и биологии опухолей Каролинского Института, Стокгольм, 2003);

Международной конференции «HCV 2005 Visby Program Workshop: HCV infection - factors associated with persistence, clearance and protection» (Мальмо, Швеция, 2006);

Конференции с международным участием «Клиническая и экспериментальная вирусология HCV-инфекции» в Биомедицинском учебном и исследовательском центре Латвийского университета (Рига, Латвия, 2005);

Конференции практических врачей «Актуальные вопросы гепатологии» Главного клинического госпиталя МВД России, (Москва, 2004);

Научно-практической конференции «Вопросы инфекционной патологии Урала» (Тюмень, 2004);

Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2004);

Конференции «Хронические вирусные гепатиты в практике лечебных учреждений военно-медицинского управления ФСБ России: актуальность проблемы, возможности диагностики и лечения» (Москва, 2005);

Первом международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2006);

Российском медицинском форуме (Москва, 2006);

На VII съезде научного общества гастроэнтерологов России, посвященном 40-летию со дня основания Всесоюзного НИИ гастроэнтерологии - Центрального НИИ гастроэнтерологии (Москва, 2007);

VII Российском съезде инфекционистов «Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных» (Нижний Новгород, 2007).

Материалы диссертации доложены в виде постерных докладов на международных конференциях и симпозиумах: XVI всемирном конгрессе эпидемиологов (Монреаль, 2002), IX Объединенной Европейской

Гастроэнтерологической неделе (Амстердам, 2001), XI симпозиуме «Гепатит С» (Гейдельберг, 2004), Всемирном конгрессе по гастроэнтерологии (Монреаль, 2005), 12-ом Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и болезням печени (Париж, 2006), Первой конференции по вопросам ВИЧ/СПИД в Восточной Европе и Центральной Азии (Москва, 2006), 3-ей Интернациональной конференции по ВИЧ и НСУ/ВИЧ коинфекции (Париж, 2007), 4-ом Интернациональном симпозиуме по гепатиту С (Глазго, 2007).

Основные положения диссертации изложены в 64 печатных работах, опубликованных в период с 1996г. по 2006г., из них - 15 в центральной печати.

Основные положения, проведённых исследований вошли в методические рекомендации «Вирусные гепатиты. Клиника, диагностика, лечение» (2000), «Противовирусная терапия хронических вирусных гепатитов В и С у ВИЧ-инфицированных» (2006), «Алгоритм диагностики и лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных потребителей инъекционных наркотиков» (2006) и другие инструктивно-методические документы. Основные положения диссертации вошли также в «Лекции по инфекционным болезням» под редакцией академика РАМН, профессора Ющука Н.Д. (1999). Результаты настоящего исследования используются в учебном процессе Московского государственного медико-стоматологического университета по подготовке студентов, интернов, клинических ординаторов, врачей — слушателей курсов на факультете постдипломного обучения в лекционных материалах и при проведении семинарских занятий. Результаты диссертационной работы внедрены в практическую работу Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.

Личный вклад автора

Личное участие автора в получении научных результатов заключалось в изучении клинических, лабораторных и морфологических данных, характерных для течения гепатита С, изучении результатов генетического анализа, проведенного с вирусологическим материалом, полученным от больных гепатитом С до, на фоне и после противовирусной терапии. Автором проведено многолетнее наблюдение большого количества больных острым и хроническим гепатитом С и изучены исходы заболевания. Сформирован банк сывороток крови больных гепатитом С с различными формами заболевания. Проведено курсовое лечение противовирусными препаратами пациентов изучаемых групп с оценкой эффективности терапии. Автором осуществлялся подбор оптимальных диагностических тестов для неинвазивной диагностики фиброза печении и сопоставление результатов с данными пункционной биопсии печени, а также проведена апробация новых диагностических тестов для изучения специфического гуморального ответа на инфекцию вирусом гепатита С (выполнение ИФА). Выполнен статистический анализ полученных данных и проведено сопоставление с данными научной литературы.

Структура и объём диссертации

ВЫВОДЫ

1. В результате изучении характера поражения печени у больных с репликативной формой ХГС при различной степени биохимической активности не выявлено достоверных различий по частоте регистрации фиброза печени стадии 2-3 по МЕТА VIR среди больных ХГС ПНАТ и больных ХГС ПЛАТ.

2. В результате изучения частоты регистрации выраженного фиброза печени (по критериям Knodell) у больных ХГС, систематически употребляющих алкоголь установлено, что фиброз печени 3-4 стадии выявляется достоверно чаще среди больных, злоупотребляющих алкоголем, по сравнению с больными, не злоупотребляющими алкоголем (38,2±8,3% и 12,5±2%, соответственно, р=0,004), однако, у большинства (72%) больных ХГС с наличием фиброза печени 3-4 стадии хронический гепатит С является единственной причиной формирования выраженного фиброза печени.

3. При изучении характера поражения печени у больных с репликативной формой ХГС в зависимости от давности и биохимической активности заболевания установлено, что среди больных ХГС с давностью заболевания 1 -5 лет в 17,9% случаев регистрируется быстрое формирование фиброза печени 3-й стадии по критериям Knodell, в то время как, в группе ХГС ПНАТ среди пациентов с известной давностью заболевания (1-5 лет и 6-10 лет) не выявлено больных с быстрым формированием фиброза печени 3-й стадии.

4. Оценка биоптата печени по шкале METAVIR позволяет дополнительно выявить долю пациентов с выраженной стадией фиброза - F2 в 7,8% случаев, расхождения между двумя критериями (Knodell и METAVIR) в оценке выраженной стадии фиброза печени регистрируются вЗД% случаев.

5. При определении роли маркеров фиброза - гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа в диагностике различных стадий фиброза печени получены данные о существенно более высокой средней концентрации коллагена IV типа в крови у больных ХГС с наличием стадии фиброза печени 3 (критерии Knodell) по сравнению больными ХГС с наличием стадии фиброза печени 1 (201,3±27,7 и 117,0±2,4 нг/мл, соответственно, р<0,01).

6. Средние значения концентрации коллагена IV типа после курса интерферонотерапии достоверно различаются в группах больных с различным вирусологическим ответом на лечение и выше в группе с отсутствием вирусологического ответа (146,7±1,2 и 116,8±6,7 нг/мл, соответственно, р<0,05). Доля больных ХГС с нарастанием концентрации коллагена IV типа в крови и превышением нормального уровня после проведенного курса интерферонотерапии существенно выше в группе пациентов без достижения вирусологического ответа по сравнению с группой больных достигших вирусологического ответа на лечение (41,2 % и 8,3%, соответственно, р<0,05). Показатели концентрации гиалуроновой кислоты не превышали нормы в группах больных с различными стадиями фиброза печени и существенно не менялись в зависимости от ответа на лечение.

7. При оценке диагностического и прогностического значения аутоантител (ANA, SMA, AMA, анти-LKM-l, анти-LC-l, анти-LSP) в крови больных ХГС, получающих интерферонотерапию, не получено данных за наличие выраженного аутоиммунного компонента и преобладания какого-либо одного варианта аутоантител в группе больных ХГС, полностью резистентных к лечению интерфероном. Анти-LC-l и анти-LKM-l не регистрировались в крови ни у одного больного ХГС как до, так и после лечения интерфероном.

8. При определении клинического значения персистенции вируса гепатита С в лейкоцитах крови больных ХГС, получавших и не получавших лечение интерфероном, получены данные о существенно более редкой регистрации в группе больных прошедших курс интерферонотерапии, персистенции РНК HCV как в лейкоцитах, в целом, (42,6% и 95,3%, соответственно, р<0,01), так и, исключительно, в лейкоцитах (3,7% и 13,7%, соответственно, р<0,05). В группе больных без достижения биохимической ремиссии и с сохраняющейся виремией на фоне лечения не выявлено изолированной персистенции РНК HCV в лейкоцитах, в то время как, у больных с развитием биохимической ремиссии на фоне лечения изолированная персистенция РНК HCV в лейкоцитах регистрируется в 6,6% случаев.

9. При определении вариантов генетической изменчивости ISDR региона гена NS5A lb генотипа HCV у больных ХГС Московского региона, полностью резистентных к интерферонотерапии, установлено, что геном вируса гепатита С в 25% случаев не имеет мутаций в ISDR регионе и в 75% случаев представляет собой «промежуточный» тип мутационной изменчивости (1-3 аминокислотные замены).

10. При анализе частоты выявления рекомбинантного интергенотипического варианта РНК HCV (субтип RFl2k/lb) среди больных ХГС Московского региона установлено, что рекомбинантный геном HCV выявлен у 3,1% пациентов. В группе с наличием РВО на фоне лечения интерфероном доля рекомбинантного варианта составила 3,7%, в группе с отсутствием РВО - 4,5% (р>0,05), что не позволяет считать инфицирование рекомбинантным вариантом RFl2k/lb фактором резистентности к интерферонотерапии.

11. При анализе исходов гепатита С в сопоставлении с показателями неспецифического иммунного ответа пациента выявлен сходный иммунный профиль групп больных ХГС ПНАТ и реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения более 3 лет: данные группы пациентов отличаются от контрольной группы только по одному показателю — абсолютному значению маркера активации лимфоцитов (HLA-DR+). Группа больных ХГС ПЛАТ достоверно отличается от контрольной группы по абсолютному значению содержания в крови CD3+-, CD4+-, СБ8+-Т-лимфоцитов, HLA-DR+- и 0-лимфоцитов.

12. При анализе исходов гепатита С в сопоставлении с показателями специфического гуморального ответа пациента установлено, что в группе больных ХГС с постоянно нормальным уровнем АлАТ достоверно реже регистрируется полный спектр антител к антигенам структурных и не структурных белков (core , NS4 и NS5) в сыворотке крови по сравнению с группой больных ХГС с постоянно повышенным уровнем АлАТ (85% и 39,1%, соответственно, р<0,01).

13. При исследовании особенностей специфического гуморального иммунного ответа пациента при естественном течении гепатита С с учетом исхода заболевания выявлено, что наличие РНК HCV в крови на 3-ем и 6-ом месяцах от начала заболевания у больных ОГС коррелирует с единственным показателем гуморального ответа - присутствием анти-NSSA IgG. Реактивность на белок NS5A (анти-NSSA IgG) не регистрируется в первые 6 месяцев от начала заболевания только у больных ОГС с последующей реконвалесценцией. 14. При детальном анализе специфического гуморального иммунного ответа реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения > 3 лет показано, что данная группа неоднородна. У реконвалесцентов ВГС, позитивных по наличию анти-NSSA, достоверно чаще в крови регистрируется гуморальный ответ на неструктурные белки НСУ, а гуморальный ответ на белки оболочки НСУ регистрируется, исключительно, у анти-М85А-позитивных пациентов. Полученные данные о различной реактивности на белок NS5A у больных ОГС с различными исходами, корреляции РНК НСУ с наличием анти-NSSA IgG и выявленные различия в спектре антител у реконвалесцентов со стажем в зависимости от выявления анти-NSSA IgG позволяют рассматривать отсутствие анти-NSSA IgG в крови, как дополнительный маркер реконвалесценции при вирусном гепатите С.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Учитывая наличие в популяции больных ХГС лиц с быстрым формированием фиброза печени, рекомендуется проведение ПБП больным ХГС даже с известной небольшой длительностью заболевания (1-3 года) для исключения выраженного фиброза печени и выработки лечебной тактики.

2. Рекомендовано проведение оценки биоптата печени одновременно по двум критериям Knodell и МЕТА VIR для исключения расхождений в оценке стадии фиброза печени у больных ХГС.

3. Целесообразно определение уровня CL-IV в сыворотке крови у больных ХГС, не ответивших на интерферонотерапию или с противопоказаниями к выполнению ПБП, для осуществления неинвазивного мониторинга фиброза печени и выявления лиц с прогрессирующим фиброзом печени.

4. Тестирование РНК НСУ в лейкоцитах крови может быть рекомендовано в качестве дополнительного метода обследования, так как позволяет выявлять виремию у части предполагаемых реконвалесцентов ВГС и больных ХГС с отсутствием РНК НСУ в плазме крови после завершения курса противовирусной терапии.

5. Рекомендовано динамическое тестирование крови больных ОГС в остром периоде заболевания на наличие анти-№5А в качестве дополнительного критерия возможного формирования хронической НСУ-инфекции. У предполагаемых реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения более 3-х лет (анти-НСУ-позитивных и РНК НСУ-негативных) отсутствие анти-КБ5А в крови можно рассматривать как дополнительный критерий реконвалесценции.