Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Клинико-морфологическая оценка печени у посмертных доноров и ишемическое консервационно-реперфузионное повреждение трансплантированной печени

На правах рукописи с

ШКАЛОВА ЛЮБОВЬ ВЛАДИМИРОВНА

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПЕЧЕНИ У ПОСМЕРТНЫХ ДОНОРОВ И ИШЕМИЧЕСКОЕ КОНСЕРВАЦИОННО-РЕПЕРФУЗИОННОЕ ПОВРЕЖДЕНИЕ ТРАНСПЛАНТИРОВАННОЙ ПЕЧЕНИ

14.01.24 - трансплантология и искусственные органы 14.03.02 - патологическая анатомия

005011062

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

- 1 идр 2012

Москва 2012

005011062

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрав-соцразвития РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук Цирульникова Ольга Мартеновна

доктор медицинских наук, профессор Ильинский Игорь Михайлович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Рябоштанова Елена Ивановна доктор медицинских наук, профессор Чжао Алексей Владимирович

Ведущее учреждение:

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Защита диссертации состоится «....»______________ 2012 года в

___часов на заседании Диссертационного Совета (Д.208.055.01) ФГБУ

«ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика

В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития России, по адресу: 123182, г. Москва, ул. ІЦукинская, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат диссертации разослан «....»..........2012 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.208.055.01 доктор медицинских наук, профессор

Шевченко Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время трансплантация печени в России осуществляется в 11 трансплантологических Центрах и составляет от 1 до 1,5 трансплантаций на 1 млн. населения в 2009-2010 гг. (С.В. Готье, 2011). В то же время потребность в пересадке печени ежегодно возникает у 10-20 человек на 1 млн. (Е.Б. Ярошенко с соавт., 2010). Очевидно, что столь низкие показатели выполняемых в год трансплантаций не удовлетворяют существующие потребности.

На пути расширения донорского пула при изъятии печени были пересмотрены допустимые критерии донора и приняты так называемые «расширенные критерии» (С.В. Готье с соавт., 2008; Я.Г. Мойсюк с соавт., 2010; М. Gastaca, 2009; Н.М. Noujaim et al., 2009), включающие: возраст донора старше 50 лет, пребывание в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) более семи суток, острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) как причина смерти, высокий уровень инотропной поддержки (дофамин более 15 мкг/кг/мин), патологическое ожирение (индекс массы тела более 30 кг/рост, м2), наличие вирусной и бактериальной инфекций, натрий сыворотки крови более 160 ммоль/л, время Холодовой ишемии более 15 часов и гистологические признаки жирового гепатоза (более 50%). Использование «расширенных критериев» позволило увеличить количество выполняемых трансплантаций, однако привело к повышению риска операций из-за неудовлетворительного качества донорских органов (В.Е. Загайнов с соавт., 2009; М.Г. Минина с соавт., 2010; R.S. Mangus et al., 2010; J.C. Lai et al., 2011).

Данный факт определяет особое значение морфологической экспресс-диагностики печени потенциального посмертного донора, которая могла бы предоставить объективную информацию о состоянии органа в кратчайшие сроки (M.I. Minervini et al., 2009; J.H. Lefkowitch, 2010). Однако данных о па-

тогистологических критериях при морфологическом определении пригодности печени для трансплантации в литературе не представлено.

В раннем послеоперационном периоде основной патологией, влияющей на начальную функцию трансплантированной печени, является ишемическое консервационно-реперфузионное повреждение (ИКРП). Тяжёлая степень ИКРП трансплантата сопровождается потерей его функции почти у 50% пациентов (С.В. Готье с соавт., 2008). На сегодняшний день ишемическое повреждение трансплантированной печени клинически оценивают в соответствие с разработанной шкалой выраженности цитолиза (О.М. Цирульникова, 2004). В то же время вопросы морфологии ИКРП трансплантированной печени изучены не достаточно. Имеющиеся немногочисленные публикации по данной теме (Б.А. Константинов с соавт., 1996; Н.Н. Бабенко с соавт., 2004; М.М. Морозова с соавт., 2005; Б.А. Се11ег, Ь.М. Рейхтс, 2004; Б. Ка1аШап е! а1., 2007) не однозначны в интерпретации и не содержат чётких морфологических критериев ИКРП по степени тяжести, что предполагает дальнейшие исследования в данном направлении. Все эти вопросы определили цель и задачи данного исследования.

Цель исследования: разработка патогистологических критериев оценки донорской печени и изучение морфологии ишемического консервационно-реперфузионного повреждения трансплантированной печени.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ основных клинико-лабораторных показателей у эффективных и неэффективных посмертных доноров печени.

2. Охарактеризовать морфологические изменения в биоптатах печени у эффективных и неэффективных посмертных доноров.

3. Оценить корреляционные связи между клиническими и морфологическими показателями у потенциальных посмертных доноров печени.

4. Изучить морфологические изменения в трансплантатах печени при ишемическом консервационно-реперфузионном повреждении.

Научная новизна исследования. Впервые в сравнительном аспекте изучены основные клинико-лабораторные показатели у эффективных (ЭД) и неэффективных (НД) посмертных доноров печени.

Впервые изучены морфологические и иммуногистохимические изменения в печени у ЭД и НД; определены патогистологические критерии оценки донорской печени; и разработан протокол, позволяющий охарактеризовать имеющиеся изменения в баллах. Показана значимость экспресс-биопсии печени у потенциальных посмертных доноров при комплексной оценке пригодности органа для трансплантации.

Впервые разработаны морфологические критерии оценки различной степени тяжести ИКРП в трансплантированной печени.

Практическая ценность исследования. Комплексная оценка ряда клинико-лабораторных показателей (индекса массы тела; уровней АСТ, АЛТ, общего билирубина и натрия в сыворотке крови; дозы вазопрессоров, применяемой для инотропной поддержки; а также показателей ЦВД и систолического АД на момент собственно констатации смерти мозга) может быть использована в качестве объективного критерия при отборе потенциальных посмертных доноров печени.

При морфологическом определении пригодности донорской печени для трансплантации кроме стеатоза и фиброза могут быть использованы и другие значимые критерии (белковая дистрофия и некроз гепатоцитов; эндотелиит центральных вен, эндартериит, флебит и воспалительная инфильтрация в портальных трактах). При этом адекватная комплексная оценка пригодности органа для трансплантации не возможна без гистологического исследования экспресс-биоптата печени потенциального посмертного донора.

Морфологическая градация ИКРП трансплантированной печени с разделением его на три степени может применяться при гистологическом исследовании биоптатов печени в раннем пострансплантационном периоде. Положения, выносимые на защиту.

1. Эффективные и неэффективные потенциальные посмертные доноры печени достоверно различаются по ряду клинико-лабораторных показателей (индексу массы тела; уровню трансаминаз, общего билирубина и натрия в сыворотке крови; а также по дозе дофамина, используемой для инотропной поддержки).

2. Эффективные и неэффективные потенциальные посмертные доноры печени достоверно различаются по ряду морфологических показателей (стеатозу, белковой дистрофии и некрозу гепатоцитов; степени фиброза в печени; степени эндотелиита в центральных венах; степени эндартериита, флебита и воспалительной инфильтрации в портальных трактах).

3. Морфологическая оценка печени посмертного донора с использованием разработанного протокола позволяет оценить имеющиеся изменения в баллах и прогнозировать степень тяжести ишемического консервационно-реперфузи-онного повреждения в раннем посттрансплантационном периоде.

4. Морфологическое исследование экспресс-биоптатов печени потенциальных посмертных доноров предоставляет объективную информацию о состоянии органа, уточняет и дополняет данные визуальной оценки и ультразвукового исследования.

5. Разработанная морфологическая градация ишемического консервационно-реперфузионного повреждения трансплантированной печени по степени тяжести позволяет чётко интерпретировать данную патологию в биоптатах раннего посттрансплантационного периода.

Реализация результатов исследования. Результаты исследования нашли клиническое применение в отделениях пересадки почки и печени, абдоминальной хирургии и трансплантации ФГБУ ФНЦТиИО МЗиСР РФ, а также в хирургическом отделении трансплантации органов ФБУЗ ПОМЦ ФМБА России. Основные результаты исследования включены в программу обучения студентов старшего курса лечебного факультета кафедры «Трансплантология и искусственные органы» Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.

Апробация работы. Материалы и основные положения работы были доложены и обсуждены на Всероссийской конференции «Трансплантация печени в России: 20 лет спустя» - Москва (2010), III Международной научнопрактической конференции «Высокие технологии в медицине» - Нижний Новгород (2010), V Всероссийском Съезде по трансплантологии и искусственным органам - Москва (2010), совместной научно-практической конференции отделений и лабораторий «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ -27.10.2011 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из общей характеристики работы, четырёх глав (обзор литературы, материал и методы исследования, две главы собственных исследований и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций, указателя использованной литературы и трёх приложений. Работа изложена на 146 страницах машинописи, иллюстрирована 13 таблицами и 60 рисунками. Список литературы включает 75 названий на русском и 151 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования. Проведено ретроспективное гистологическое исследование 35 биоптатов печени от потенциальных мультиорганных доноров со смертью мозга и 29 биоптатов трансплантированной печени в раннем послеоперационном периоде из ФГБУ ФНЦТИО им. В.И. Шумакова МЗиСР РФ, а также 25 экспресс-биоптатов печени от потенциальных мультиорганных доноров со смертью мозга из Приволжского Координационного Центра органного и тканевого донорства (ПКЦОД). Анализируемый период с 2004 по 2011 гг.

Методы исследования.

Оценка клинико-лабораторных показателей включает анализ данных паспорта трупной печени, материала историй болезни и индивидуальных карт реципиентов.

Гистологические методы. Образцы биоптатов ткани печени фиксировали в 10% забуференном формалине (pH 6,8-7), обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, заливали в парафиновые блоки, из которых готовили срезы толщиной 4 мкм с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином, трихромом по Массону с анилиновым синим и проведением PAS-реакции. В 25 наблюдениях (экспресс-биопсии печени потенциальных посмертных доноров из ПКЦОД) использовали замороженные гистологические срезы, полученные с помощью криостата Thermo scientific Microm НМ 525.

Иммуногистохимический метод. Иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) проводили модифицированным непрямым иммунопероксидаз-ным методом (А.П. Киясов, 2004) с восстановлением антигенной специфичности путём воздействия на ткань нагреванием на водяной бане. Для ИГХИ использовали моноклональные антитела: CD3 клон LN10 (Novocastra), CD20 клон L26 (Dako), CD15 клон ММА (Cell Marque) и CD68 клон Кр-1 (Cell

Marque). Иммуногистохимически определяли клеточный состав воспалительного инфильтрата в портальных трактах и паренхиме печени у потенциальных посмертных доноров: Т- и В-лимфоциты - по экспрессии CD3 и CD20, полиморфно-ядерные лейкоциты (ПМЯЛ) - по экспрессии CD15, клетки Купфера - по экспрессии CD68.

Морфометрический метод. Подсчёт количества гепатоцитов в состоянии стеатоза, белковой дистрофии, некроза и холестаза; количества Т- и В-лимфоцитов, ПМЯЛ и клеток Купфера в каждом биоптате печени потенциального посмертного донора проводили при помощи автоматизированной системы ImageScope М и микроскопа Leica DM 5000. Результат выражали в процентах.

Статистический метод. Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью лицензионной программы «STATISTICA/W», программного обеспечения StatEx-2004.2, электронных таблиц Excel. Данные представлены как среднее арифметическое и стандартное отклонение (М±а). Большинство исследуемых в работе показателей не отвечало требованиям нормального распределения, поэтому статистическую обработку проводили методами непараметрической статистики с использованием критериев Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни. Корреляционные связи между признаками изучали при помощи критерия Пирсона (г). Достоверность различий оценивали по критерию р (статистически значимыми считали значения р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ПЕЧЕНИ У ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПОСМЕРТНЫХ ДОНОРОВ (I группа)

Результаты исследования клинико-лабораторных показателей у посмертных доноров печени. Проведено исследование клинико-лабораторных показателей у 60 мультиорганных доноров со смертью мозга (41 - мужчины, 19 -женщины) в возрасте от 19 до 69 лет (средний возраст 45,73±12,55 года). Причиной смерти у 37 человек было острое нарушение мозгового кровообращения, у 23 - черепно-мозговая травма. Потенциальные посмертные доноры печени были разделены на две подгруппы: эффективные (ЭД) - 30 и неэффективные (НД) - 30. Подгруппы НД и ЭД сформированы с минимальными различиями (р>0,05) по возрасту, полу и причине смерти. В проведённом исследовании длительность искусственной вентиляции лёгких (ИВЛ) во всех наблюдениях совпадала с длительностью пребывания в ОРИТ и не превышала семи суток. При сравнении индекса массы тела (ИМТ) между подгруппами НД и ЭД получено статистически достоверное (р<0,001) различие. ИМТ в подгруппе НД у трёх (10%) соответствовал нормальным значениям (до 24,99 кг/м2); у 27 (90%) отмечали ожирение различной степени: I степени (ИМТ 25-29,99 кг/м2) - у 13 (43,3%), II степени (ИМТ 30-34,99 кг/м2) - у 10 (33,3%), Ш степени (ИМТ 35 кг/м2 и выше) - у четырёх (13,4%). У восьми (26,7%) НД был алкогольный анамнез с выявлением маркёров алкогольного поражения печени при гистологическом исследовании. У ЭД самый высокий показатель ИМТ превысил верхнюю границу нормы на 32,4% и составил 33,1 кг/рост, м2, не было ожирения III степени и алкогольного анамнеза.

При сравнении основных лабораторных показателей у НД по сравнению с ЭД выявлены достоверно выше уровни трансаминаз (р<0,001), общего билирубина (р=0,006) и натрия (р=0,009) в сыворотке крови. При этом у НД в пяти (17%) наблюдениях ACT и в двух (7%) AJIT - превышали пять норм, в

восьми (27%) - общий билирубин соответствовал трём нормам. У ЭД указанные показатели не выходили за рамки двух норм. У НД в 19 (63,3%) наблюдениях уровень натрия в сыворотке крови составил от 164 до 189 ммоль/л (в среднем 176,37±9,69 ммоль/л), из них у десяти (34%) - был выше 180 ммоль/л (в среднем 184,8±3,26 ммоль/л). У 11 (36,7%) НД уровень натрия в сыворотке крови не превышал 160 ммоль/л (в среднем 141,91±15,97 ммоль/л). У ЭД в пяти (16,7%) наблюдениях уровень натрия в сыворотке крови составил от 163 до 171 ммоль/л (в среднем 16б,6±4,04 ммоль/л), у 25 (83,3%) - не превышал 160 ммоль/л (в среднем 146,24±7,61 ммоль/л).

При сравнении основных показателей гемодинамики между НД и ЭД на момент начала процедуры констатации смерти мозга, совпадающей с разъединительным тестом, достоверных различий не отмечено (р>0,05). У НД и ЭД в периоде кондиционирования применяли инотропную поддержку с использованием различных препаратов: в 36 (60%) наблюдениях - дофамином, в восьми (13,3%) - дофамином в комбинации с адреналином, в четырёх (6,7%) -дофамином в комбинации с мезатоном. В 11 (18,3%) наблюдениях применяли только адреналин. У одного (1,7%) НД использовали комбинацию мезатона и адреналина на фоне травматического шока крайней степени тяжести. Для стабилизации состояния НД потребовалось применить большую дозу вазо-прессоров (дофамина) по сравнению с ЭД (р=0,006). На момент собственно констатации смерти мозга, в результате проводимой терапии, состояние доноров в обеих исследуемых подгруппах удавалось стабилизировать; получены достоверные различия по показателям ЦВД (р=0,027) и систолического АД (р=0,03) между НД и ЭД.

Результаты гистологического исследования печени у потенциальных посмертных доноров. Проведено гистологическое исследование инци-зионных биоптатов печени у 30 НД и 30 ЭД. Все биопсии были выполнены до

перфузии (при сохранённом кровотоке). На основании собственного опыта был выбран блок морфологических параметров, включающий оценку: стеато-за, белковой дистрофии, некроза и холестаза гепатоцитов; степени флебита, эндартериита, воспалительной инфильтрации и фиброза стенок печёночных артерий в портальных трактах; степени эндотелиита в центральных венах; стадии фиброза в печени.

В подгруппе НД процент стеатоза, белковой дистрофии и некроза гепатоцитов были достоверно (р<0,001) выше по сравнению с подгруппой ЭД. Стеатоз в печени у НД и ЭД всегда был смешанным (макро- и микровезику-лярным) и в изолированной виде не наблюдался. Однако у НД прослеживали тенденцию к преобладанию макровезикулярного стеатоза. Белковая дистрофия гепатоцитов у ЭД в 28 (93%) наблюдениях была очаговой, в двух (7%) -диффузной; у НД в 21 (70%) наблюдении - диффузной вплоть до гидропиче-ской, в девяти (30%) - очаговой. Некроз гепатоцитов у ЭД отметили в 10 (33,3%) наблюдениях в виде единичных некротизированных клеток или мо-ноцеллюлярных некрозов; у НД - в 24 (80%) биоптатах печени в виде моно-целлюлярных или центролобулярных некрозов. При сравнении холестаза между подгруппами НД и ЭД значимых различий не выявлено (р=0,9).

Для характеристики в печени посмертных доноров ряда гистологических показателей (степени флебита, эндартериита, воспалительной инфильтрации и фиброза стенки печёночных артерий в портальных трактах; а также степени эндотелиита в центральных венах) была разработана морфологическая шкала, на основании которой указанные показатели были определены полуколичественно в баллах от 0 до 3 (отсутствие, лёгкий, умеренный, тяжёлый). У НД по сравнению с ЭД достоверно выше были: степень воспалительной инфильтрации (р<0,001), степень флебита и эндартериита в портальных трактах (р=0,03); степень эндотелиита в центральных венах (р=0,026). Фиброз

стенки печёночных артерий в обеих исследуемых подгруппах доноров встречали редко; при статистической обработке результатов достоверных различий между НД и ЭД по данному показателю не выявлено (р=0,5).

В обеих исследуемых подгруппах доноров выявили прямо пропорциональную зависимость: степени воспалительной инфильтрации в портальных трактах от степени флебита и эндартериита в портальных трактах (у НД г=0,5, р=0,006; у ЭД г=0,6, р<0,001); степени воспалительной инфильтрации в портальных трактах от степени эндотелиита в центральных венах (у НД г=0,54, р=0,002; у ЭД г=0,8, р<0,001).

Для оценки фиброза в биоптатах печени у ЭД и НД использовали систему МЕТАУЖ, так как она считается наиболее достоверной и воспроизводимой (Т.П. Некрасова, 2007). У НД стадия фиброза печени была достоверно (р<0,001) выше по сравнению с ЭД.

Результаты иммуногистохимнческого исследования. В воспалительных инфильтратах портальных трактов доноров исследуемых подгрупп преобладали Т-лимфоциты, их количество у НД по сравнению с ЭД было статистически достоверно (р<0,001) выше. В-лимфоциты в портальных трактах НД и ЭД встречали в виде единичных клеток. Количество ПМЯЛ в паренхиме печени ЭД и НД статистически значимо не различалось (р=0,5). Количество клеток Купфера в паренхиме печени у НД было достоверно (р<0,001) выше по сравнению с ЭД.

Протокол морфологической оценки печени посмертного донора создан на основании разработанных патогистологических критериев, выраженных в баллах; позволяет при комплексном суммировании баллов определить патологию донорской печени: сумма баллов от 0 до 10 - патология лёгкой степени, от 11 до 15 - умеренной и от 16 до 25 - тяжёлой (табл. 1).

Таблица 1. Протокол морфологической оценки печени посмертного донора.

№ п/ п Морфологи- ческие признаки Б а л л Критерии

1 Стеатоз гепатоцитов (0-3 балла) 0 отсутствует

1 1 степень (до 33%)

2 2 степень (до 66%)

3 3 степень (более 66%)

2 Белковая дистрофия гепатоцитов (0-3 балла) 0 отсутствует

1 лёгкой степени (очаговая)

2 умеренной степени (очагово-диффузная)

3 тяжёлой степени (диффузная гидропическая)

3 Некроз гепатоцитов (0-3 балла) 0 отсутствует

і единичные клетки

2 очаговый

3 обширный центролобулярный

4 Эндотелиит центральных вен (0-3 балла) 0 отсутствует

1 лёгкий/умеренный (воспаление до 25% периметра поперечного сечения вены)

2 тяжёлый (воспаление более 25% периметра поперечного сечения вены)

3 некроз стенки центральной вены и/или трансмуральный эндотелиит

5 Фиброз портальных трактов (0-4 балла) 0 отсутствует

1 Р1

2 ¥2

3 РЗ

4 Р4

6 Воспалитель- ная инфильтрация в портальных трактах (0-3 балла) 0 отсутствует

1 лёгкой степени (преимущественно лимфоцитарное воспаление в меньшей части триад)

2 умеренной степени (смешанный воспалительный инфильтрат из лимфоцитов, ПМЯЛ в большей части триад)

3 тяжёлой степени (то же, что для умеренной степени, с вовлечение перипортальных зон)

7 Эндартериит в портальных трактах (0-3 балла) 0 отсутствует

1 лёгкий/умеренный (воспаление до 25% периметра поперечного сечения артерии) '

2 тяжёлый (воспаление более 25% периметра поперечного сечения артерии)

3 некроз стенки печёночной артерии и/или трансмуральный эндартериит с некрозом стенки

8 Флебит в портальных трактах (0-3 балла) 0 отсутствует

1 лёгкий/умеренный (воспаление до 25% периметра поперечного сечения вены)

2 тяжёлый (воспаление более 25% периметра поперечного сечения вены)

3 некроз стенки печёночной вены и/или трансмуральный флебит

Целью разработки протокола морфологической оценки печени посмертных доноров явилось не только создание единой схемы описания патологических изменений в биоптатах. Мы стремились к тому, чтобы критерии, получающие наивысший балл, обладали прогностической значимостью при использовании общего подхода, и чтобы протокол был достаточно гибким для будущих дополнений.

Анализ 16 наблюдений из ПКЦОД показал, что при трансплантации с патологией в донорской печени умеренной и тяжёлой степени, у реципиентов в раннем посттрансплантационном периоде существует высокий риск развития умеренного и тяжёлого ИКРП в трансплантате. При наличии у донора патологии лёгкой степени (п=3) наблюдали лёгкое ИКРП; при патологии умеренной степени (п=11) - у девяти реципиентов отмечали умеренное ИКРП, у двух - тяжёлое ИКРП; при патологии тяжёлой степени (п=2) - тяжёлое ИКРП. Во всех наблюдениях (п=16): время Холодовой ишемии составило 378,75±120,78 мин.; ОТП была выполнена по методике piggy back; веновенозный обход не применялся; время агепатического периода 57±3,74 мин.; время тепловой ишемии 35±11,69 мин.; появление жёлчи после пуска кровотока - во всех случаях; хследохо-холедохоанастомоз - во всех случаях; общее время операции 248,13±38,68 мин.; кровопотеря 965,63±471,42 мл. Ранний послеоперационный период по клинико-лабораторным данным (без морфологического подтверждения результатами одночасовой биопсии) у всех реципиентов сопровождался развитием ИКРП различной степени.

В проведённом исследовании (п=16) не выявлено статистически достоверной зависимости выраженности синдромов цитолиза и холестаза у реципиентов от уровней показателей трансаминаз, общего билирубина и натрия в сыворотке крови у ЭД (г=0,1-0,21; р>0,05). Однако, между лабораторными показателями реципиентов и морфологическими изменениями в печени ЭД,

получены достоверно значимые прямые корреляции: уровень ЩФ (г=0,25; р<0,001) и общего билирубина (г=0,31; р<0,001) в сыворотке крови реципиентов статистически достоверно коррелировал с выраженностью холестаза в печени ЭД; уровень показателей АСТ, АЛТ, ЛДГ и у-ГТП (г=0,64-0,67; р<0,001) у реципиентов - с инфильтрацией ПМЯЛ в печёночной дольке и стенках центральных вен у ЭД; умеренное ИКРП (г=0,62, р=0,01) у реципиентов - с лёгкой степенью воспалительной инфильтрации в портальных трактах печени у ЭД; тяжёлое ИКРП (г=0,63, р=0,02) у реципиентов - с умеренной степенью воспалительной инфильтрации в портальных трактах печени у ЭД.

Результаты исследования корреляционных связей между клиническими и морфологическими показателями у потенциальных посмертных доноров печени. У НД выраженность стеатоза в печени прямо пропорционально зависела от ИМТ донора (г=0,9, р<0,001). Так как у ЭД значения ИМТ были приближены к норме, а стеатоз в печени не превышал 30%, взаимосвязь между стеатозом и ИМТ оказалась не достоверной (г=0,2, р=0,3).

Изучение в подгруппах НД и ЭД зависимости ряда других клиниколабораторных показателей (уровня трансаминаз, общего билирубина и натрия в сыворотке крови; а также длительности ИВЛ) от выраженности морфологических изменений в печени (стеатоза, белковой дистрофии и некроза гепато-цитов; степени выраженности воспалительных изменений в портальных трактах и стенках сосудов) показало статистически не достоверную взаимосвязь (г=0,1-0,2, р>0,05). Полученные результаты, вероятно, обусловлены тем, что морфологические изменения в печени приводят к развитию комплекса клинико-лабораторных изменений, а не отдельно взятого клинико-лабораторного показателя; а также небольшим количеством наблюдений.

По паспорту трупной печени у НД проанализированы причины отказа от трансплантатов. В семи (23,4%) наблюдениях причиной отказа послужило

сочетание нестабильной гемодинамики, гипернатриемии и возраста донора старше 60 лет с необходимостью применения высоких доз вазопрессоров и неудовлетворительной визуальной оценкой трансплантата. Указанные факторы многие исследователи (М. Ravaioli et al., 2009; G.A. Franklin et al., 2010) рассматривают в качестве неблагоприятных для выживаемости трансплантата. В одном (3,2%) наблюдении диагностирована почечно-клеточная карцинома; в двух (6,7%) - гепатит С, что является противопоказанием для трансплантации (Р. Розенталь, 2005). Однако в 20 (66,7%) наблюдениях в качестве причины отказа от трансплантатов печени указывалась неудовлетворительная оценка органа по данным визуального осмотра и ультразвукового исследования (УЗИ).

В 25 наблюдениях из ПКЦОД выполняли экспресс-биопсию органа до перфузии; гистологическое заключение выдавали в течение 20 мин. с момента поступления материала в патологоанатомическое отделение; сопоставляли с данными визуальной оценки и УЗИ печени; учитывали в принятии решения о пригодности органа для трансплантации. У трёх (12%) доноров по данным УЗИ определили резко повышенную эхогенность печени и не рекомендовали органы для трансплантации. Однако при гистологическом исследовании экс-пресс-биоптатов печени патология у данных доноров соответствовала умеренной степени (11-12 баллов) с очагово-диффузной белковой дистрофией и стеатозом до 20%. По результатам экспресс-биопсий органы были определены как пригодные для трансплантации.

Заключение

Подгруппы НД и ЭД статистически достоверно (р<0,05) различались по ряду клинико-лабораторных (ИМТ; уровню трансаминаз, общего билирубина и натрия в сыворотке крови; дозе дофамина, используемой для инотропной поддержки, показателям систолического АД и ЦВД на момент собственно

констатации смерти мозга) и морфологических (стеатозу, белковой дистрофии и некрозу гепатоцитов; фиброзу в печени; эндотелииту в центральных венах; эндартерииту, флебиту и воспалительной инфильтрации в портальных трактах) показателей. ЭД в отличие от НД по всем параметрам находились в рамках установленных «расширенных критериев». Морфологическое и ИГХИ исследования показали, что у доноров обеих исследуемых подгрупп в печени имелись хронические воспалительные изменения, что может быть связано с перенесённым в течение жизни субклиническим неспецифическим гепатитом, реакцией на лекарственные препараты, аллергены и т.д. В то же время, в печени у НД, по сравнению с ЭД, отмечалась более высокая воспалительная активность (р<0,001). Определены статистически значимые патогистологические критерии для оценки печени посмертного донора и разработан протокол, позволяющий не только определить патологию донорской печени в баллах, но и с высокой долей вероятности прогнозировать степень тяжести ИКРП в раннем постгрансплантационном периоде. У НД установлена достоверная корреляционная связь (г=0,86, р<0,001) между ИМТ и стеатозом в печени, что предполагает использовать показатель ИМТ донора для прогнозирования выраженности стеатоза в печени при комплексной оценке пригодности органа для трансплантации. Морфологическое исследование экспресс-биоптатов печени у ЭД и НД показало, что предоставляемая информация о состоянии органа является объективной, уточняет и дополняет данные визуальной оценки и УЗИ.

РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКОГО

ИССЛЕДОВАНИЯ ИШЕМИЧЕСКОГО КОНСЕРВАЦИОННО-РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ТРАНСПЛАНТИРОВАННОЙ

ПЕЧЕНИ (II группа).

Проведено гистологическое исследование 29 биоптатов трансплантированной печени от 26 реципиентов в возрасте от 27 до 62 лет (средний возраст 43,33 ± 1,84 года; 14 - мужчин, 12 - женщин). Среди исследованных биопсий одночасовые составили 22 (76%); биопсии, взятые на вторые и третьи сутки после операции - три (10,3%); на седьмые - три (10,3%); на 11 - одна (3,4%). У 23 реципиентов биопсия бралась один раз; у трёх - два раза.

При морфологическом исследовании биоптатов трансплантированной печени во всех наблюдениях отмечали микроциркуляторные нарушения, дистрофию и некроз гепатоцитов, признаки вакуолизации цитоплазмы и ядер ге-патоцитов, неравномерное распределение гликогена в цитоплазме гепатоцитов. Повреждение в большей степени касалось перивенулярных зон ацинусов печени.

В зависимости от выраженности морфологических изменений, биоптаты были распределены по гистологическому диагнозу: ИКРП лёгкой степени -10 (34,5%), умеренной - 10 (34,5%), тяжёлой - девять (31%).

Биоптаты с ИКРП лёгкой степени (п=10) были получены через один час и на седьмые сутки после операции (протокольная биопсия); ранний послеоперационный период протекал гладко; устойчивую тенденцию к нормализации цитолитических ферментов отмечали к 14 суткам после ОПТ. Морфологические изменения были незначительными и, преимущественно, выражались в виде нарушений в микроциркуляторном русле.

Биоптаты с ИКРП умеренной степени (п=10) были получены через один час и на 11 сутки после операции; в раннем послеоперационном периоде с

первых суток во всех наблюдениях отмечали дисфункцию трансплантата, что потребовало у трёх реципиентов проведения нескольких сеансов молекулярной адсорбирующей рециркулирующей системы (МАРС-терапия) для лечения печёночной недостаточности, у одного - нескольких сеансов гемодиафильтрации с целью купирования почечной недостаточности; устойчивую тенденцию к нормализации цитолитических ферментов у девяти реципиентов этой подгруппы отмечали к 15-20 суткам после ОТП. Умерла одна пациентка на 20 сутки после ретрансплантации. Причиной смерти послужило развитие тяжёлого инфекционного поражения сочетанного генеза (бактериальное, вирусное и грибковое) на фоне тяжёлой дисфункции двух трансплантатов (больной была выполнена ретрансплантация на 20-е сутки) в условиях массивной иммуносупрессии. Гистологически, в отличие от ИКРП лёгкой степени, белковая дистрофия приобретала характер гидропической, макро- и мик-ровезикулярный стеатоз наблюдали во всех зонах ацинусов, отмечали моно-целлюлярные некрозы гепатоцитов, умеренно выраженную лимфоцитарную и нейтрофильную инфильтрацию, умеренный и тяжёлый центральный эндоте-лиит.

Биоптаты с ИКРП тяжёлой степени (п=9) были получены через один час, на вторые, третьи и седьмые сутки после операции; в раннем послеоперационном периоде во всех наблюдениях с первых суток отмечали дисфункцию трансплантата, что потребовало медикаментозной коррекции. Устойчивую тенденцию к нормализации цитолитических ферментов у восьми реципиентов этой подгруппы отмечали к 15-34 суткам после ОТП. Умерла одна больная на 30 сутки после операции. Причиной смерти послужило развитие развёрнутого синдрома полиорганной недостаточности (энцефалопатия, острая сердечно-сосудистая недостаточность, острая печёночно-почечная недостаточность, коагулопатия), нижнедолевой правосторонней пневмонии и инфек-

ционно-токсического шока на фоне тяжёлой дисфункции трансплантата печени. Морфологические изменения при ИКРП тяжёлой степени характеризовались: дискомплексацией печёночных балок, диффузной гидропической дистрофией гепатоцитов, отёком и кровоизлияниями в паренхиме печени, очаговым и диффузным макровезикулярным стеатозом во всех зонах ацину-сов, моноцеллюлярными и центролобулярными некрозами гепатоцитов, диффузным расширением пространств Диссе с полнокровием синусоидов, диффузной инфильтрацией ПМЯЛ в портальных трактах и паренхиме печени; тяжёлым центральным эндотелиитом.

Данные по времени Холодовой и тепловой ишемии, а также агепатиче-ского периода в ходе ОТП у реципиентов с различной степенью ИКРП представлены в таблице 2.

Таблица 2, Продолжительность холодовоп и тепловой пшемпп; агепатического периода в ходе ортотопнческой трансплантации печени у реципиентов с различной сте-пеиью ишемического консерваппонно-реперфузионного повреждения (\1±гг).________

Показатели (мин.) Ишемическое консервациошю-реперфузиоииое повреждение

Легкая степень (п=10) Умеренная степень (п=10) Тяжёлая степень (п=9)

Холодовая ишемия 416,6 ±52,96 430,0 Г330 - 4701 504,8±95,14 537,0 Г388 - 6301 439,44±48,25 460,0 [330 - 4751

Тепловая ишемия 45,6 ±7,79 45,0 Г36 - 571 42,5±2,55 42,0 [40 - 481 45,67±5,29 44,0 Г40 - 551

Агепатический период 53,4 ± 12,43 52,0 Г40 - 701 57,8±2,2 58,0 [55 - 601 82,67±17,85 78,0 [75 - 1301

На момент взятия биопсии у всех реципиентов исследуемой группы отмечали повышение активности АСТ, АЛТ и ЛДГ в сыворотке крови (табл. 3).

Таблица 3. Показатели ACT, АЛТ, ЛДГ при различной степени ишемического кон-сервационпо-реперфузиоипого повреждения трансплантата печеии (М±а).____________

Ферменты Ишемическое консервационно-репер( узионное повреждение

Легкая степень (п-10) Умеренная степень (п=Ю) Тяжелая степень (п=9)

ACT, Ед/л 842,4±74,44 2651,2±223,06 4890,33±1214,31

АЛТ, Ед/л 508,3±126,83 1171,14*246,22 2012,22±691,96

ЛДГ, Ед/л 854,25±69,07 3507,4±503,22 8952,14±1364,09

Различия по показателям ACT, АЛТ и ЛДГ между подгруппами с различной степенью ИКРП (лёгкой / умеренной, лёгкой / тяжёлой и умеренной / тяжёлой) статистически достоверные (р<0,01). Выраженность цитолитическо-го синдрома оказалась прямо пропорциональной степени ИКРП трансплантата печени, что соответствует данным литературы (О.М. Цирульникова, 2004; С.В. Готье с соавт., 2008) и подтверждает продемонстрированные выше результаты морфологического исследования. Установлена достоверная прямая корреляционная связь повышения активности ACT (г=0,93, р<0,001), АЛТ (г=0,84, р<0,001) и ЛДГ (г=0,95, р<0,001) от глубины повреждения органа.

В результате проведённого исследования были разработаны морфологические критерии лёгкого, умеренного и тяжёлого ИКРП (табл. 4).

Таблица 4. Морфологические критерии лёгкой, умеренной и тяжёлой степени ишемического консервацяоняо-реперфузионного повреждения трансплантированной печени.

Лабораторно- морфологические критерии Лёгкая степень Умеренная степень Тяжёлая степень

ACT (Ед/л) до 1000 свыше 1000 до 3000 более 3000

АЛТ (Ед/л) до 1000 свыше 1000 до 3000 более 3000

Структура печени не изменена дискомплексация печеночных балок (+) дискомплексация печёночных балок (++И+++)

Белковая дистрофия очаговая и диффузная (+) диффузная, до очаговой гидропической (++) диффузная гидро-пическая (+++)

Жировая дистрофия очаговая, преимущественно микровезикулярная в 1-й зоне ацинусов очаговая и диффузная, микро- и макровезику-лярная во всех зонах ацинусов диффузная, преимущественно мак-ровезикулярная во всех зонах ацинусов

Отёк паренхимы + ++ -н- и 1 1 1

Кровоизлияния + ++ +4-И-Н-+

Некрозы единичные клетки (+) моноцеллюлярные (++) моноцеллюлярные (++) и центролобу-лярные (+++)

Центральный эндотелиит + И++ ++И+++ +++

Инфильтрация портальных трактов Лимфоциты, единичные пмял. Воспалительная Лимфоциты и ПМЯЛ. Воспалительная инфильтрация охватывает Лимфоциты и ПМЯЛ. Воспалительная инфильт-

инфильтрация охватывает меньшую часть триад (+) большую часть триад (++) рация охватывает большую часть триад и переходит на перипортальную паренхиму (+++)

Инфильтрация паренхимы очаговая, ГТМЯЛ . (+) очагово-диффузная, ПМЯЛ (++) диффузная, ПМЯЛ (+++)

+ легкий, ++ умеренный, +++ тяжёлый

Заключение

Независимо от выраженности ИКРП морфологические изменения в трансплантатах печени были однотипными и имели характер острого альтера-тивно-экссудативного воспалительного процесса, что свидетельствует о неспецифическом характере ответа на гипоксию. ИКРП лёгкой степени не влияло на раннюю функцию и прогноз выживания трансплантата печени, умеренное и тяжёлое - всегда сопровождалось обширными некрозами и ней-трофильной инфильтрацией и приводило к выраженной дисфункции органа. Установлено, что наиболее значимыми лабораторными показателями у реципиентов, отражающими тяжесть ИКРП, являются АСТ, АЛТ и ЛДГ. В результате проведённого исследования разработаны морфологические критерии лёгкого, умеренного и тяжёлого ИКРП трансплантированной печени, которые позволяют практическому морфологу чётко интерпретировать данную патологию в материале биоптатов раннего постгрансплантационного периода.

ВЫВОДЫ

1. У неэффективных по сравнению с эффективными потенциальными посмертными донорами печени статистически достоверно выше были следующие клинико-лабораторные показатели: индекс массы тела (р<0,001); уровень трансаминаз (р<0,001), общего билирубина (р=0,006) и натрия (р=0,009) в сыворотке крови; доза дофамина (р=0,006), используемая для инотропной поддержки; показатели систолического артериального давления (р=0,03) и цен-

трального венозного давления (р=0,027) на момент собственно констатации смерти мозга.

2. У неэффективных по сравнению с эффективными потенциальными посмертными донорами печени статистически достоверно выше были следующие морфологические показатели: стеатоз (р<0,001), белковая дистрофия (р<0,001) и некроз (р<0,001) гепатоцитов; фиброз в печени (р<0,005); эндотелиит в центральных венах (р=0,026); эндартериит (р=0,029), флебит (р=0,029) и воспалительная инфильтрация в портальных трактах (р<0,001).

3. У неэффективных посмертных доноров печени установлена статистически достоверная корреляционная связь (г=0,86, р<0,001) между индексом массы тела и стеатозом в печени. Поэтому показатель индекса массы тела донора может использоваться для прогнозирования выраженности стеатоза в печени при комплексной оценке пригодности органа для трансплантации. Морфологическое исследование экспресс-биоптатов печени у потенциальных посмертных доноров предоставляет объективную информацию о состоянии органа, уточняет и дополняет данные визуальной оценки и ультразвукового исследования.

4. Независимо от тяжести ишемического консервационно-реперфу-зионного повреждения трансплантированной печени морфологические изменения в ней по своему проявлению являются однотипными, что свидетельствует о неспецифическом характере ответа на гипоксию, и проявляются нарушением микроциркуляции, дистрофическими и некротическими, а также воспалительными изменениями в печени. Ишемическое консервационно-реперфузионное повреждение лёгкой степени не влияет на раннюю функцию и прогноз выживания трансплантата. Умеренное и тяжёлое ишемическое консервационно-реперфузионное повреждение трансплантированной печени всегда сопровождается некрозами, нейтрофильной инфильтрацией и приводит к выраженной дисфункции органа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется выполнять экспресс-биопсию печени потенциального посмертного донора с целью морфологической верификации состояния органа. Результаты морфологического исследования следует учитывать при комплексной оценке пригодности донорской печени для трансплантации.

2. При направлении биоптата донорской печени на гистологическое исследование рекомендуется предоставлять клинико-лабораторные данные по донору, отражённые в разработанном бланке направления. Сопоставление указанных данных с морфологическими изменениями в биоптате необходимо для правильной интерпретации выявленной патологии.

3. Гистологическое исследование биоптата печени потенциального посмертного донора рекомендуется проводить по протоколу морфологической оценки печени посмертного донора. При комплексном суммировании баллов определять патологию донорской печени: сумма от 0 до 10 - патология лёгкой степени, от 11 до 15 - умеренной и от 16 до 25 - тяжёлой.

4. Для оценки степени тяжести ишемического консервационно-реперфу-зионного повреждения трансплантированной печени в раннем послеоперационном периоде практическому морфологу рекомендуется использовать как лабораторные данные (ACT, АЛТ, ЛДГ), так и разработанные морфологические критерии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шкалова Л.В., Минина М.Г., Можейко Н.П., Куренкова Л.Г., Ильинский И.М., Погребниченко И.В., Мойсюк Я.Г., Цирульникова О .М., Г отье

С.В. Морфология кадаверной донорской печени. Материалы конференции «Трансплантация печени в России: 20 лет спустя» // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2010.- Т. ХП.- № 2- С. 24-25.

2. Ильинский И.М., Шкалова Л.В., Минина М.Г., Можейко Н.П., Куренкова Л.Г., Амосов А.А., Мойсюк Я.Г., Цирульникова О.М., Готье С.В. Морфология печени у потенциальных живых доноров сегмента печени. Материалы конференции «Трансплантация печени в России: 20 лет спустя» // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2010.- Т. XII.- № 2 — С. 26-27.

3. Шкалова Л.В., Минина М.Г., Ильинский И.М., Мойсюк Я .Г., Цирульникова О.М., Готье С.В. Ишемическое повреждение в биоптатах аллотранс-плантированной печени // Мат. III Международной научно-практической конференции «Высокие технологии в медицине». Современные технологии в медицине.- 2010.- № 1,- С. 20-21.

4. Iljinsky I., MogeikoN., Kurenkova L., Schkalova L., Minina М., Ammosov A., Moysyuk Y., Tsirulnikova O., Gautier S. Liver morphology of potential live donors of segments of liver // XXIII International Congress of The Transplantation Society. - Vancouver, Canada.- 15-19.08.2010.- P36.05

5. Шкалова Л.В., Минина М.Г., Можейко Н.П., Ильинский И.М., Мойсюк Я.Г., Цирульникова О.М., Готье С.В. Морфология ишемического повреждения аллотрансплантированной печени по данным исследования пункци-онных биоптатов // Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2010,- Т. 12,-№3,- С. 16-23.

6. Шкалова Л.В., Ильинский И. М., Цирульникова О.М. Морфология ишемического повреждения аллотрансплантированной печени // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2010.- Т. 12.- № 3.- С. 106-111.

7. Шкалова Л.В., Загайнов В.Е., Васенин С.А., Минина М.Г., Ильинский И.М., Цирульникова О.М. Патоморфологические критерии оценки состояния печени у потенциальных мультиорганных доноров со смертью мозга // Современные технологии в медицине. - 2011. - № 4. - С. - 7-13.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АД артериальное давление

АЛТ аланинаминотрансфераза

АСТ аспартатаминотрансфераза

Г-ГТП гаммаглутамил-транспептидаза

ИВЛ искусственная вентиляция лёгких

ИГХИ иммуногистохимическое исследование

ИМТ индекс массы тела

ИКРП ишемическое консервационно-реперфузионное повреждение

лдг лактатдегидрогеназа

НД неэффективный посмертный донор печени

ОНМК острое нарушение мозгового кровообращения

ОРИТ отделение реанимации и интенсивной терапии

ОТП ортотопическая трансплантация печени

пкцод Приволжский Координационный Центр органного и тканевого донорства

ПМЯЛ полиморфно-ядерные лейкоциты

УЗИ ультразвуковое исследование

цвд центральное венозное давление

чмт черепно-мозговая травма

ЩФ щелочная фосфатаза

эд эффективный посмертный донор печени

Подписано в печать 31.01.2012 г. Формат 60*84 1/16.

Тираж 150 экз. Объем 1,75 п.л. Заказ № 78 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии “АШрппГ. 603057, Россия, г.Н.Новгород, пр.Гагарина, 104, Тел.:(831)291-52-00