Автореферат и диссертация по медицине (14.00.47) на тему:Клинико-молекулярные механизмы течения и исходов хронических заболеваний печени, ассоциированных с вирусом гепатита В

Шапиро Изяслав Яковлевич

КЛИНИКО-МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ТЕЧЕНИЯ И ИСХОДОВ ХРОНИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПЕЧЕНИ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВИРУСОМ ГЕПАТИТА В

14.00.47 - гастроэнтерология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

™РГ 111111111111

003158369

Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им И И Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Шабров Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Успенский Юрий Павлович Парфенов Асфольд Иванович Иванов Алексей Алексеевич

Ведущая организация:

ГОУВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И П Павлова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится «11» октября 2007 года в_часов на заседании

Диссертационного Совета Д 208 086 01 ГОУВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им И И Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр, 47

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им ИИ Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан «_»_2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор МС Команденко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хронические заболевания печени, ассоциированные с вирусом гепатита В, представляют собой одну из актуальных проблем внутренней медицины Уровень заболеваемости хроническим гепатитом В в последние годы имеет тенденции к росту и в 2005 году составил 13,9 на 100 ООО населения (Вирусные гепатиты в Российской Федерации аналитический обзор, 2006) У лиц, инфицированных вирусом гепатита В, возможна трансформация с развитием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы в 15-30% случаев Учитывая, что в настоящее время возраст заболевших гепатитом В составляет преимущественно от 15 до 29 лет, специалисты прогнозируют значительное повышение частоты неблагоприятных отдаленных исходов заболевания в будущем (Ивашкин В Т, 1998, Шуппан Д , 2001, Lok ASF, 2000)

В прогнозировании летальности характер течения цирротической стадии хронического гепатита В имеет определяющее значение При компенсированном циррозе 10-летняя выживаемость составляет 47%, а при декомпенсации процесса 5-летняя выживаемость - только — 16% В перечне причин смерти от онкологических заболеваний гепатоцеллюлярная карцинома занимает третье место у мужчин и седьмое место - среди женщин (Буеверов А 0 , 2002)

Таким образом, актуальность хронических заболеваний печени, ассоциированных с вирусом гепатита В, обусловлена высоким уровнем заболеваемости, неблагоприятными исходами и значительной летальностью на определенных этапах развития патологического процесса

К настоящему времени большинство исследователей считают, что патологические состояния, вызываемые вирусом гепатита В, можно рассматривать как единый процесс — от острого гепатита через хронический гепатит и цирроз печени к гепатоцеллюлярной карциноме (Ивашкин В Т, 1997) Несмотря на преимущественно общие клинико-биохимические симптомы и синдромы, для каждого из этапов патологического процесса характерны особенности клинического течения С точки зрения патофизиологической сущности рассматриваемых нозологических форм (хронический гепатит, цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома), объединяющим для них является вирус гепатита В и хроническое воспаление печени, в основе которого лежит повреждение, пролифера-

ция и фиброгенез Вместе с тем, для каждой клинической формы заболевания характерно преобладание одного из перечисленных процессов Для цирроза печени характерно постоянное повреждение, непрерывная регенерация и несбалансированный фиброгенез В основе канцерогенеза лежит нарушение регуляции клеточного роста Вместе с тем, патогенез гепатоцеллюлярной карциномы и цирроза печени на молекулярном уровне изучен недостаточно

Современные достижения в области фундаментальной иммунологии позволяют изучать и оценивать основные молекулы, участвующие в реализации процессов повреждения, регенерации и фиброгенеза печеночной ткани, способствуют совершенствованию и созданию новых методов диагностики

Выявление на молекулярном уровне факторов, приводящих к несбалансированности фиброгенеза, позволило бы определить механизмы цирротизации процесса, его раннюю диагностику и прогноз Наряду с этим отсутствие эффективных фармакологических средств антифибротической направленности является одной из основных проблем гепатологии

До настоящего времени отсутствуют молекулярные тесты, способствующие диагностике (в том числе ранней) гепатоцеллюлярной карциномы Объектом углубленного изучения до сих пор является преимущественно опухолевая ткань, в то время как ткань, окружающая опухоль, остается за рамками исследования Молекулярный уровень исследований способствует более глубокому и обоснованному пониманию характера клинических изменений При этом молекулярная диагностика имеет определяющее значение при разработке методов молекулярного лекарственного воздействия Работы этого направления представляются актуальными в связи с созданием рекомбинантных цитокинов и разработкой методов цитокиновой и антицитокиновой терапии, особенно в таких интенсивно развивающихся областях как инфекционные и онкологические заболевания (Пальцев М А , 2003)

Указанные обстоятельства определили цель и задачи настоящей работы Цель исследования: выделение информативного комплекса клинико-биохимических, иммунологических и иммуногистохимических показателей для диагностики и прогнозирования течения и исходов хронических заболеваний печени, ассоциированных с вирусом гепатита В

Задачи исследования:

1 Изучить клинико-биохимические, иммунологические и морфологические особенности течения у больных хроническим гепатитом В, циррозом печени В и гепатоцеллюлярной карциномой, ассоциированной с вирусом гепатита В

2 Оценить особенности пролиферативной активности гепатоцитов и синусо-идных клеток печени на всех этапах течения и исходов хронического гепатита В

3 Определить активность фиброгенеза и степень выраженности фиброза в печеночной ткани у больных хроническим гепатитом В на разных стадиях процесса

4 Уточнить характер клеточного состава воспалительного инфильтрата в печени на различных этапах течения и исходов хронического гепатита В

5 Выявить особенности экспрессии про- и антиапоптозного генов в лимфоцитах печени при различных вариантах течения и исходов хронического гепатита В

6 Выявить взаимосвязи иммуногистохимических показателей с особенностями клинико-биохимического и морфологического характера течения и исходов хронического гепатита В

7 Изучить иммунный и цитокиновый статус у больных циррозом печени В и его взаимосвязь с характером течения процесса

8 Выделить наиболее информативный комплекс клинико-биохими-ческих, иммуногистохимических и иммунологических показателей для диагностики и прогноза течения и исходов хронического гепатита В

Научная новизна. Впервые изучена пролиферативная активность гепатоцитов и синусоидных клеток печени при различных вариантах течения и исходов хронического гепатита В и выявлена экспрессия гладкомышечного актина (а-БМА) в ядрах гепатоцитов при различных стадиях процесса

Определена взаимосвязь факторов, участвующих в хроническом повреждении, регенерации и фиброгенезе печени, с учетом морфологических и клини-ко-биохимических характеристик патологического процесса и выполнена комплексная оценка разнонаправленных процессов в печени (повреждение, регенерация и фиброгенез) на всех этапах течения и исходов хронического гепатита В

Впервые показана прогностическая значимость содержания С014+ (рецептора к липополисахариду) в периферической крови у больных циррозом печени В для определения тяжести процесса

Получены новые данные о взаимосвязи выраженности факторов иммунитета, уровня про- и противовоспалительных цитокинов с особенностями течения цирротического процесса

Впервые установлена взаимосвязь эндогенной продукции цитокинов с иммунологическими, биохимическими и гематологическими показателями крови Показано, что комплексная оценка показателей отличается более высокой информативностью в определении характера процесса, чем их отдельное исследование у больных цирротической стадией хронического гепатита В

Практическая значимость. Выделен комплекс диагностически значимых критериев для прогноза течения и тяжести цирроза печени Наиболее информативными тестами для раннего определения активности процесса являются высокий уровень ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-10 (>30 пг/мл), у-глобулинов (>24%), тимоловой пробы (>5 ед), для раннего выявления декомпенсации - повышение уровня ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-6 (>0,5 пг/мл), С014% (>13%), ЦИК (>120 у е)

Выявленные иммуногистохимическим методом отличия в способности гепатоцитов к экспрессии а-БМА-молекул у больных хроническим гепатитом В позволяют использовать этот тест в качестве диагностического Цирротическая стадия хронического гепатита В характеризуется отсутствием гепатоцитов, экспрессирующих молекулы а-8МА

Показано, что выраженная экспрессия Раз-антигена на лимфоцитах цирротической печени является показателем высокого риска вероятной малигниза-ции, что может быть использовано для ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы

Личное участие автора. Отбор и курация пациентов, участвующих в настоящем исследовании, выполнение диагностических и инструментальных исследований (пункционная биопсия печени, эзофагогастродуоденоскопия), участие в иммуноморфометрических исследованиях, обобщение и анализ полученных данных

Основные положения, выносимые на защиту:

1 При хроническом гепатите В пролиферативная активность гепатоцитов взаимосвязана с уровнем содержания сывороточных АлАТ, выраженностью индекса гистологической активности, а также с вирусной активностью

2 Отношение FasL к Fas и к bcl-2 (IFbcl) отражает степень повреждения печеночной ткани и готовность лимфоцитов к апоптозу При хроническом гепатите В с выраженной клинико-морфологической активностью воспалительного процесса характерно снижение индекса готовности к апоптозу лимфоцитов печени

3 При циррозе печени В и гепатоцеллюлярной карциноме, ассоциированной с вирусом гепатита В, величина отношения FasL к Fas и к bcl-2 (IFbcl) отражает умеренную степень повреждения печеночной ткани и высокую степень готовности к апоптозу лимфоцитов печени с максимальным значением его в опухолевой ткани, что может явиться одним из механизмов снижения контроля регуляции клеточного роста

4 Уровень экспрессии a-SMA на непаренхиматозных клетках печени не взаимосвязан с гистологическим индексом стадии заболевания и активностью воспаления у больных хроническим гепатитом В и циррозом печени В Оценка уровня экспрессии a-SMA в ядрах гепатоцитов оказалась наиболее информативной для раннего выявления цирротического процесса и взаимосвязана с тяжестью фиброза и активностью воспаления у больных хроническим гепатитом В Нарастание активности воспаления и степени фиброза сопровождается снижением содержания a-SMA в ядрах гепатоцитов и исчезновением ее экспрессии на цирротической стадии хронического гепатита В

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на X Всероссийском съезде инфекционистов (Санкт-Петербург, 2004) и V съезде научного общества гастроэнтерологов (Москва, 2005), Пятой Российской Гастроэнтерологической Неделе (Москва, 1999), Седьмой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2002), 4-ом Российском научном форуме с международным участием (Санкт-Петербург - Гастро-2002), 6-ом Славяно-Балтийском научном форуме («Санкт-Петербург - Гастро-2004»), Девятой Российской конференции «Гепа-

тология сегодня» (Москва, 2004), Десятой Российской конференции «Гепатоло-гия сегодня» (Москва, 2005 Диплом за лучший научный доклад)

Внедрение. Результаты исследования внедрены в работу Центральной медико-санитарной части № 122 Федерального медико-биологического агентства (Санкт-Петербург), Федерального государственного агентства «Северо-западный окружной медицинский центр Росздрава» (Санкт-Петербург), городской клинической больницы №1 г Тольятти, а также в учебных курсах и циклах, проводимых на кафедре госпитальной терапии СПбГМА им И И Мечникова Разработаны пособие для врачей «Особенности течения гемоконтактных вирусных гепатитов в зависимости от состояния внешней среды» (утв председателем секции Ученого Совета МЗ РФ А В Истоминым Протокол № 8 от 01 12 03 г, соавт Сологуб Т В , Романцов M Г, Ледванов M Ю и др (СПб, 2004 - 93 с ) и «Способ диагностики аутоиммунных поражений печени» патент на изобретение №2247387 (соавторы Шабров АВ, Карев ВЕ, Сологуб ТВ) Предложен «Способ диагностики цирротической стадии хронического вирусного гепатита» заявка на изобретение № 2005139428 (соавторы Шабров А В , Кареев В Е , Сологуб Т В , Горелов А И )

Получен диплом № 155 на открытие «Закономерность изменения глубинной температуры печени человека при ее заболеваниях», 27 октября 2000 г

Публикации. По материалам диссертации опубликована 41 научная работа, из них 12 работ в ведущих рецензируемых изданиях

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 302 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 408 источников, в том числе 137 отечественных и 271 зарубежных авторов Работа содержит 91 таблицу, 48 рисунков и 7 схем

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии СПбГМА им И И Мечникова, Центральной медико-санитарной части № 122 ФМБА России,

31 больницы и городской инфекционной больнице им С П Боткина Санкт-Петербурга в период с 1999 по 2006 годы

В соответствии с целью и задачами исследования обследовано 179 человек с хроническим гепатитом В 140 мужчин (78%) и 39 женщин (22%) Возраст больных в среднем составил 48,2 года Все больные в течение ряда лет, предшествующих данным исследованиям, находились под диспансерным наблюдением в поликлинике по поводу хронических заболеваний печени, связанных с вирусом гепатита В В зависимости от вирусной активности больные были разделены на две группы 74 человека с наличием положительного ДНК НВУ и 105 человек с отсутствием ДНК НВУ в сыворотке крови

Для выяснения особенностей клинико-биохимических проявлений в зависимости от морфологической активности процесса и для проведения иммуно-гистохимических исследований были отобраны биоптаты печени 29 больных хроническим гепатитом В с различной степенью гистологической активности, а также изучены данные анамнеза и клинико-лабораторные показатели по историям болезни (больные были направлены военкоматом по поводу хронического гепатита В в городскую инфекционную больницу им С П Боткина для обследования и вынесения экспертного решения) Средний возраст пациентов составил 21,50+2,67 лет Характер течения ЦП В изучался у 50 больных Из них 28 человек — мужчины (56%) и 22 человека - женщины (44%) в возрасте от 30 до 69 лет (средний возраст 58,6 лет) Контрольную группу составили 10 практически здоровых человек в возрасте 25-30 лет без клинико-биохимических признаков патологии печени

Для выделения больных активным и неактивным циррозом печени В были использованы количественные критерии мезенхимально-воспалительного синдрома (Подымова С Д , 1993) Повышение содержания у-глобулина до 30% и тимоловой пробы до 8 ЕД рассматривалось как подтверждение малоактивного, более значительные сдвиги - как активного цирроза печени Отсутствие измененных показателей мезенхимально-воспалительного синдрома оценивалось как проявление неактивного цирроза печени Согласно изложенным критериям активности воспалительного процесса были сформированы 3 группы больных неактивный (1-ая группа - 21 пациент), малоактивный (2-ая группа - 13 чело-

век) и активный цирроз печени (3-ая группа — 16 человек)

На основе оценки степени выраженности портальной гипертензии (асцит, отечно-асцитический синдром, венозные коллатерали, выраженная спленомега-лия, варикозное расширение вен пищевода, эпизоды кровотечений из варикозно расширенных вен) было выделено 24 больных декомпенсированной стадией цирроза печени Поскольку компенсированный НВУ-цирроз печени может быть установлен только морфологически при целенаправленном обследовании «групп риска» (прежде всего больных хроническим гепатитом В в фазе репликации), а также для уточнения соответствия лабораторных критериев активности воспаления (у-глобулин и тимоловая проба) индексу гистологической активности, была проведена пункционная биопсия печени 26 больным (52%)

Несоответствие результатов морфологической и клинической оценки степени активности цирроза печени было отмечено лишь в 5 случаях У 3-х больных морфологически вьивлена высокая степень активности воспалительного процесса (ИГА=13—14 б ) Но их клиническое состояние было вполне удовлетворительное, а биохимические параметры крови в пределах нормы У одного больного с клиническими проявлениями портальной гипертензии морфологически активность процесса определялась как слабо выраженная (ИГА=7 б) Лабораторные показатели в этом случае также не были изменены У другого больного с активным циррозом печени по клинико-лабораторным показателям морфологическая активность процесса была оценена как слабо выраженная В остальных 21 случаях (80,8%) наблюдалась корреляция между биохимическими и морфологическими критериями активности патологического процесса, что отражало высокую информативность функциональных тестов Преимущественное совпадение данных морфологического исследования с клинической оценкой процесса явилось основанием для оценки в дальнейшем критериев активности воспалительного процесса печени по С Д Подымовой (1993)

По архивным материалам (истории болезни и протоколы патологоанато-мических вскрытий) изучены 15 случаев гепатоцеллюлярной карциномы, ассоциированной с вирусом гепатита В, и 25 случаев цирроза печени В, которые составили группу сравнения Из них у 5 умерших от гепатоцеллюлярной карциномы и 5 умерших от осложнений цирроза печени в образцах печени, получен-

ных при аутопсии, а также в биоптатах печени у 29 больных хроническим гепатитом В исследовались иммуногистохимические показатели в лаборатории им-муногистохимии Центрального научно-исследовательского рентгенорадиоло-гического института Росздрава (заведующий лабораторией д м н, проф К M Пожарисский)

Больным проводилось углубленное комплексное обследование клинический осмотр по органам и системам, общеклинические анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, исследование крови на специфические маркеры вирусных гепатитов, УЗИ органов брюшной полости и фиброэзофаго-гастродуоденоскопия При биохимическом исследовании крови определялись содержание билирубина и его фракций, общего белка, альбумина, глобулинов, активность АлАТ и АсАТ, щелочной фосфатазы, титр тимоловой пробы (унифицированным методом Мак-Лагана), протромбиновый индекс (по Квику в модификации В H Туголукова) и содержание белковых фракций методом электрофореза с определением альбумино-у-глобулинового коэффициента

Определение специфических маркеров ВГ (анти-HAV IgM, HBsAg, анти-HBs, анти-НВс, анти-НВс IgM, HBeAg, анти-НВе, анти-HCV) проводилось в ИФА с использованием как отечественных (СПНИИЭМ им Пастера, ЗАО «Век-тор-Бест»), так и импортных тест-систем («Organon Teknika» Голландия, «Murex» Великобритания, «Orgenics» Израиль) Большинство серологических исследований осуществлялось совместно с лабораторией вирусных гепатитов СПНИИЭМ им Пастера (рук лаборатории - д м н , проф С JI Мукомолов)

Выявление ДНК вируса гепатита В методом ПЦР в сыворотке крови, а также в парафиновых срезах биоптатов печени проводилось в лаборатории мо-лекулярно-биологических исследований 31-ой городской больницы (заведующий - канд мед наук А В Лыщов) Изучение клеточного иммунитета включало определение субпопуляционного состава лимфоцитов и маркера моноцитов методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител серии «Дако» (Дания) к СДЗ+, СД4+, СД8+, СД71+ , HLA-DR4", СД14+ к клеткам Гуморальный иммунитет изучен по содержанию СД20+, иммуноглобулинов классов A, M, G методом радиальной иммунодиффузии (Манчини, 1965) Определение сывороточного уровня цитокинов ФНО-а, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-

10 и ИЛ-12 проводилось методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител фирмы «Иммунотех» (Франция)

Аспирационная биопсия печени проводилась слепым чрезкожным методом по Менгини после изучения функции свертывающей системы крови и УЗИ органов брюшной полости Гистологические исследования выполнялись по изготовленным парафиновым срезам, окрашенным гемотоксилин-эозином и пик-рофусином по Ван-Гизону Определялись ИГА по RG Knodell et al (1981) и ГИС по V J Desmet et al (1994)

Иммуногистохимические исследования выполнялись в срезах фрагментов ткани печени, изготовленных из парафиновых блоков Окрашивание срезов производилось с использованием стрептавидин - биотинового метода (тест-система Envision, DAKO, США), согласно рекомендациям изготовителя Использовались мышиные моноклональные антитела к CD4 (в разведении 1/40), CD8 (в разведении 1/40), CD68 (в разведении 1/80), Ki-67 (в разведении 1/200), a-SMA (в разведении 1/50), Fas (в разведении 1/80), FasL (в разведении 1/50), bcl-2 (в разведении 1/80) производства Novocastra Laboratories Ltd, а также кроличьи поликлональные антитела к HBcorAg (в разведении 1/700) производства «DAKO» (США) При проведении иммуногистохимического исследования использовался негативный контроль Количественная оценка иммуногистохими-ческих показателей проводилась с помощью компьютерной системы анализа видеоизображений «Видео-Тест Морфология 4 0» («ИСТА-ВидеоТест» Россия), позволяющая определять как геометрические показатели, так и удельный объем тех или иных структур в срезе ткани. Измерения осуществлялись в 6 полях зрения при увеличении х400 по каждому исследованному маркеру (по 3 разных поля центролобулярных отделов печеночных долек и 3 разных поля па-рабазальных отделов печеночных долек) Учитывался общий результат по им-муногистохимическому препарату (складывающийся как среднее арифметическое в 6 полях зрения) В наблюдениях гепатоцеллюлярной карциномы дополнительно проводились количественные измерения экспрессии изучаемых антигенов в опухолевой ткани (в 3-х разных полях) Оценка экспрессии Ki-67 в ткани печени осуществлялась путем вычисления индекса пролиферации с определением процентного соотношения Ki-67-позитивных гепатоцитов к общему

числу гепатоцитов В наблюдениях гепатоцеллюлярной карциномы дополнительно проводились измерения еще в 3 полях зрения - в опухолевой ткани Расчет индекса пролиферации производился в пересчете на 200 гепатоцитов В соответствие с представленной методикой дополнительно оценивался индекс пролиферации синусоидных клеток, расположенных внутри печеночных долек в пересчете на 200 клеток

Подсчет CD4, CD8 -позитивных клеток производился в 6 полях зрения (по 3 поля из центролобулярных отделов и по 3 поля из парабазальных отделов разных печеночных долек) увеличении х400 Подсчитывалось абсолютное содержание позитивных клеток, а также соотношение С04-позитивных или CD8-позитивных клеток ко всем внутридольковым лимфоцитам

Подсчет экспрессии CD68 осуществлялся посредством вычисления среднего процента С068-позитивной площади в 3-х полях зрения из центролобулярных и парабазальных отделов печеночных долек

Количественный подсчет степени выраженности экспрессии a-SMA в ткани печени осуществлялся путем определения среднего процента a-SMA-позитивной площади в 6 полях зрения (по 3 поля из центролобулярных отделов и по 3 поля из парабазальных отделов разных печеночных долек) Из общей а-SMA-позитивной площади внутри печеночных долек вычиталась площадь а-SMA-позитивных ядер гепатоцитов, полученный результат отражал степень активации звездчатых ретикулоэндотелиоцитов

Оценка экспрессии bcl-2, Fas и FasL осуществлялась путем вычисления процентного соотношения позитивных лимфоцитов по отношению к общему числу лимфоцитов в 6 полях зрения (по 3 поля из центролобулярных отделов, и по 3 поля из парабазальных отделов разных печеночных долек) при увеличении х400 В наблюдениях гепатоцеллюлярной карциномы дополнительно проводились измерения еще в 3 полях зрения в опухолевой ткани

Определялось отношение HBcorAg - позитивных лимфоцитов ко всем внутридольковым лимфоцитам, выраженное в процентах

В качестве контроля при проведении иммуногистохимического исследования использовались образцы ткани печени 5 умерших от различных заболеваний Критерием отбора контрольной группы являлось отсутствие клинико-биохи-

мических, серологических и морфологических признаков поражения печени

Статистическая обработка Достоверность различий между сравниваемыми параметрами оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента Корреляциионные зависимости определялась непараметрическим критерием Спирмана При обработке материала использовался пакет компьютерных программ STATISTIKA 5 5

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Клинико-молекулярные механизмы течения хронического гепатита В

Клинические проявления хронического гепатита В характеризуются преимущественно мапосимптомным вариантом и не выраженностью биохимических изменений В то же время вирусная активность определяет частоту и выраженность клинико-биохимических и морфологических изменений у больных ХГ В Таким образом, характер течения хронического гепатита В зависит от вирусной активности, определяющей выраженность клинико-морфологических изменений Наши данные согласуются с результатами большинства исследователей (Григорьев П Я и соавт, 1984, Яковенко Э П, 1991, Яковенко Э П , Григорьев П Я, 1991)

В патогенезе поражения печени при HBV-инфекции в качестве главной детерминанты рассматривается взаимодействие факторов хозяина и вируса (Серов В В , Мухин Н А , 2000) Вирусная активность ассоциирована с изменением содержания CD8, CD4, CD 16 Полученные нами данные указывают на участие цитотоксических клеток, Т-хелперов, естественных киллеров и моноцитов в иммунопатогенезе вирусной инфекции у больных хроническим гепатитом В Повышенный уровень HLA-DR4- и CD28+-KJieTOK у больных свидетельствует об активации лимфоцитов и антигенпредставляющих клеток Поскольку обострение процесса ассоциировано с более высоким относительным содержанием С04+-клеток в сочетании с повышенной продукцией иммуноглобулинов и ЦИК, можно предположить о развитии иммунного ответа у этих больных по Th2 типу, обусловленной недостаточной функцией Thl типа

Независимо от фазы процесса инфицирование вирусом гепатита В сопровождается повышением уровней ИЛ-10 и ФНО-а по сравнению с показателями здоровых людей Нарастанию активности вируса соответствовало повышение

содержания ФНО-а и снижение концентрации ИЛ-10 Выявленные различия в показателях иммунного статуса у больных хроническим гепатитом В в фазе репликации и нерепликации служат подтверждением гетерогенности патогенетических механизмов формирования патологического процесса в печени и их тесной взаимосвязи с характером иммунного ответа, ассоциированным с биологическим циклом вируса Репликация вируса гепатита В сочетается с более выраженной активностью печеночного процесса Если при минимальной и слабой степени активности патологического процесса ДНК HBV в ткани печени выявлялся в 45,5% и 42,9% соответственно, то при умеренной и тяжелой степени активности - ДНК HBV обнаруживался в 100% случаев Корреляционный анализ подтвердил зависимость от вирусной активности основных клинических и кле-точно-морфологических параметров, а также их тесную взаимосвязь (получена прямая корреляционная зависимость между АлАТ и ИГА, а также влияние ДНК HBV биоптата печени, сывороточного HBsAg, тканевых макрофагов и лимфоцитов на показатели клинической и морфологической активности процесса) Нарастание выраженности патологических изменений в печени отличается достоверным увеличением количества тканевых макрофагов и лимфоцитов Исключением явились CD4- и CD8- Т-лимфоциты зависимости от клинической, морфологической и вирусной активности не выявлено Мы намеренно оценивали лимфоциты и их субпопуляции (CD4 и CD8) внутри дольки печени, поскольку ставили задачу выяснить их влияние на пролиферацию и повреждение гепатоцитов и синусоидных клеток В связи с этим мы изучили молекулярно-генетический аппарат внутридольковых лимфоцитов (уровень экспрессии про-и антиапоптозного генов) Сравнительный анализ содержания про- и антиапоп-тозного генов на лимфоцитах печени у больных хроническим гепатитом Вив образцах здоровой печени показал достоверные отличия в уровнях экспрессии Fas (24,34±3,36% против 6,93±3,03%, р<0,05) и FasL (5,85±1,21% против 9,75±0,79%, р<0,05) Содержание bcl-2 было примерно одинаковым (18,09±3,01% при хроническом гепатите и 24,34±3,42% в контроле) В ткани печени больных хроническим гепатитом В при активной репликации вируса существенных отличий от альтернативной группы в экспрессии молекул Fas, FasL и bcl-2 на внутрипеченочных лимфоцитах не выявлено Вместе с тем, об-

ращает на себя внимание достоверное снижение величины индекса готовности к апоптозу внутридольковых лимфоцитов печени (1РЬс1) при наличии в крови HBeAg Нарастание клинической и морфологической активности воспаления соответствовало выраженному снижению экспрессии антиапоптозного гена Ьс1-2 (22,98±5,43% при минимальном цитолизе против 10,65±2,92% при выраженном цитолизе, р<0,05 и 21,05±7,11% при ИГА 1-3 балла против 14,62+2,97% при ИГА 13-18 баллов, р<0,05) При этом величина индекса готовности к апоптозу внутридольковых лимфоцитов (РазЬ/Ра8/Ьс1-2) снижалась при нарастании как клинической, так и морфологической активности патологического процесса (0,26±0,12 при АлАТ<40 и 0,11±0,03 при АлАТ>100 ед/л , при р<0,05)

Выраженность пролиферации клеток печени находится в зависимости от вирусной, а также клинической и морфологической активности патологического процесса (табл 1, 2) Наиболее значимое повышение пролиферативной активности гепатоцитов и синусоидных клеток (в диапазоне от 5,27±1,33% до 14,65±5,67%) отмечалось у больных с наличием в крови и ткани печени маркеров репликации вируса - НВзА§, НВсогАЬ_1§М и ДНК НВУ, р<0,05 Пролифе-ративная активность гепатоцитов и синусоидных клеток у лиц с отсутствием маркеров вирусной репликации колебалась в диапазоне от 0,9+0,34% до 2,67+0,67%, была достоверно ниже, чем у пациентов с вирусной активностью (р<0,05) и практически не отличалась от показателя активности пролиферации гепатоцитов в контроле (1,14+0,57%)

Таблица 1

Взаимосвязь пролиферативной активности гепатоцитов и синусоидных клеток печени с выраженностью активности АлАТ у больных хроническим гепатитом В

АлАТ Ед/л Индекс пролиферативной активности, % М±т

п гепатоцитов Синусоидных клеток

<40 14 1,23+0,36' 2,84±0,58*'

40-100 5 2±0,772 3,65+1,29*

> 100 7 10,14±2,04' 2* 10,60+3,72*'

контроль 5 1,14+0,57 0,0+0,0

Индексы 1 2 указывают на достоверные различия между сравниваемыми группами, * - указывает на достоверные отличия от контроля, (р<0,05)

Таблица 2

Взаимосвязь пролиферативной активности гепатоцитов и еинусоидных клеток печени с тяжестью патологического процесса (ИГА по Кпо<1е11) у больных хроническим гепатитом В

ИГА п Индекс пролиферативной активности, % М±т

гепатоцитов синусоидных клеток

1-3 (минимальная) 11 0,77±0,19 1234 3,34±0,64*

4-8(слабая) 7 1,71±0,565 2,27±1,06*

9-12 (умеренная) 5 7,0±3,29 1,2 3 9,2±5,42*

13-18 (тяжелая) 6 8,0+1,77 4 5 * 6,48±2,18*

контроль 5 1,14+0,57 0,0±0,0

Индексы 1 2 указывают на достоверные различия между сравниваемыми группами, * — указывает на достоверные отличия от контроля, (р<0,05)

Таким образом, достоверное повышение способности клеток к пролиферации ассоциировалось с усилением репликации HBV, а также с нарастанием активности воспалительного процесса Корреляционный анализ выявил наличие прямой корреляционной зависимости между активностью пролиферации гепатоцитов и синусоидных клеток, пролиферирующими гепатоцитами и лимфоцитами, а также с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CD8) и макрофагами (CD68) Выявленные закономерности позволяют утверждать, что при хроническом гепатите В существуют межклеточно-молекулярные взаимосвязи Анализ взаимосвязи состояния клеток печени с показателями тяжести заболевания хронического гепатита В, определяемыми по вирусной активности, уровню АлАТ и ИГА, позволил сделать следующее заключение (табл 3)

Для больных с наличием в крови и ткани печени маркеров репликации вируса - HBsAg, HBcorAb IgM и ДНК HBV характерно повышенное содержание внутрипеченочных лимфоцитов и макрофагов, высокая пролиферативная активность гепатоцитов и синусоидных клеток, сниженное по сравнению с контролем содержание FasL, низкий индекс готовности к апоптозу (табл 3) Обращает на себя внимание высокая экспрессия Fas Ag у пациентов с низкой ин-фекционностью

Та 6лица S

Иммуногистохимические особенности различных вариантов течения ХГВ

Иммунологические параметры Выраженность лабораторных показателей

HBsAg АлАТ ИГА

+ - + - + -

Содержание лимфоцитов t i t t

Содержание макрофагов t î 4- t i

С04+-лимфоциты N N N N N N

СТ>8+-лимфоциты N N N N N N

Пролиферативная активность клеток î t t

Экспрессия Fas Ag t tt t tt t tt

Экспрессия FasL l N N l N i

Экспрессия bcl-2 N N i N i N

IF/bel i N l N 1 N

IndF i 4 i i 4 4

Условные обозначения N - нормальные значения показателей, 4-Т - выше или ниже нормы

Для больных хроническим гепатитом В в состоянии клинической ремиссии с минимальной тяжестью патологического процесса характерно низкое содержание лимфоцитов и макрофагов, неизмененное количество СС4- и СЭ8-клеток, низкий уровень пролиферативной активности гепатоцитов и синусоид-ных клеток, наиболее высокая экспрессии FasAg, и наиболее низкая - БавЬ, нормальное содержание Ьс1-2-позитивных лимфоцитов, сниженный индекс МБ и не отличающийся от нормы индекс 1Р/Ьс1 Возможно, что чрезмерное повышение количества активированных лимфоцитов, наряду с низким уровнем ан-тиапоптозного гена, приводит к утяжелению процесса и повреждению ткани печени

Клинико-молекулярные механизмы течения цирроза печени В

Целью данного раздела исследования явилось определение взаимосвязи клинико-биохимических показателей, характеризующих активность и стадию процесса, с параметрами иммунитета и выделение наиболее информативного для диагностики и прогноза цирроза печени комплекса биохимических и иммунологических показателей

Оценка клинико-биохимических данных у пациентов различных групп показала наличие существенных изменений в их состоянии, отличающихся по степени выраженности патологического процесса У пациентов с неактивным циррозом печени клиническая симптоматика была скудная У 42,9% больных клинические проявления заболевания вообще отсутствовали Гематологические показатели у всех больных были в пределах нормы Показатели биохимического спектра крови у большинства больных не были изменены У пациентов с малоактивным циррозом печени клинические изменения встречались достоверно чаще В 23,1% случаев была зарегистрирована желтуха, в 38,5% - болевой синдром, в 62% - астенический синдром и в 69,3% - проявления портальной ги-пертензии Однако у 38,5% отмечалось бессимптомное течение заболевания Изменения гематологических и биохимических показателей крови определялись достоверно чаще и были более выраженными, чем у больных с неактивным циррозом

Активный цирроз печени отличался наиболее яркой клинической симптоматикой В этой группе пациентов не было зарегистрировано ни одного случая бессимптомного течения заболевания Клинические проявления астенического синдрома отмечены в 100% случаев, гепатоспленомегалия в 62,5% случаев Отечно-асцитический синдром зарегистрирован в 42,9%, геморрагический в 62,5% случаев У 75 % больных отмечены системные проявления заболевания Степень отклонения гематологических и биохимических параметров от нормы была значительно выше таковой у больных с неактивным и малоактивным процессом

Изучение клинико-лабораторных показателей у лиц с различной стадией цирроза печени также показало, что изменения этих параметров у больных с декомпенсированным процессом аналогичны тем, которые отмечались у пациентов с активным циррозом, а у пациентов с компенсированным процессом соответствовали изменениям этих показателей при неактивном циррозе Отмеченный факт согласуется с данными большинства исследователей (Сорин-сонСН, 1996, Подымова С Д , 1998, Белозеров ЕС, Иоанниди Е А , 2004) Однако этот параллелизм не абсолютен «Например, при так называемом «выгоревшем» циррозе печени воспалительный процесс позади, признаки активно-

сти отсутствуют, а декомпенсация, в частности признаки портальной гипертен-зии выражены резко» (Соринсон С Н, 1996) В пользу данного утверждения свидетельствует полученное нами отсутствие достоверных различий в уровне активности АлАТ у больных с компенсированным и декомпенсированным циррозом печени (0,9±0,03 и 0,9±0,02 мккат/л)

Сравнительный анализ биохимических и гематологических показателей у больных в соответствии с прогностической шкалой СМё-Р^И показал, что по мере утяжеления патологического процесса (класс В и С) при наличии асцита, неврологической симптоматики и снижении альбумина <30-35 г/л нарастает анемия, лейкоцитоз, лимфопения, СОЭ, гипоальбуминемия, гипохолестерине-мия, активность сывороточных трансаминаз, щелочной фосфатазы и уровень билирубина, снижается содержание протромбина и глюкозы Наиболее значительные изменения отмечены у больных класса С

Таким образом, клинико-лабораторный анализ различных групп больных циррозом печени свидетельствует о том, что по мере нарастания активности патологического процесса увеличивается клиническая симптоматика с вовлечением других органов и систем При невыраженной активности патологического процесса присутствует высокий процент бессимптомного течения болезни, что демонстрирует ограниченность возможностей только клинической характеристики течения цирроза печени Нарастание активности цирроза и степени компенсации заболевания согласуется с ухудшением функции печени и проявляется существенными изменениями биохимических и гематологических показателей

Изучение биохимических и гематологических показателей у больных с активным циррозом в стадии компенсации и декомпенсации, неактивным - в стадии компенсации и декомпенсации, а также у пациентов с компенсированным активным и неактивным процессом (или декомпенсированным активным и неактивным циррозом печени) показало, что значительные сдвиги лабораторных параметров отмечаются при нарастании декомпенсации лишь у больных с активным циррозом печени При неактивном процессе эти сдвиги были минимальными, независимо от стадии заболевания Полученные данные указывают на определяющую роль активности, но не стадии процесса в изменении клини-ко-биохимических показателей крови Максимально выраженные отклонения

от нормы комплекса биохимических параметров на фоне выраженной анемии, моноцитоза и существенного ускорения СОЭ (>30) свидетельствуют о развитии декомпенсации у больных активным циррозом печени Сочетание высокого уровня гемоглобина, эритроцитов с невысоким числом моноцитов, незначительно повышенной СОЭ и умеренным увеличением глюкозы является признаком декомпенсации неактивного цирротического процесса

Установлено, что нарастание активности цирроза как при компенсированном, так и при декомпенсированном процессе сопровождается значительными однотипными нарушениями гематологического и биохимического статуса больных Однако более глубокие и обширные изменения отмечены у лиц с декомпенсиро-ванным процессом Наличие моноцитоза в сочетании с низким уровнем холестерина и глюкозы является отличительным признаком высокой активности процесса у больных с декомпенсированным циррозом в отличие от компенсированного

Наличие прямых и обратных корреляций гематологических и биохимических показателей с особенностями клинического течения цирроза печени подтверждает данные о соответствии прогрессирования заболевания выраженным изменениям функциональных проб печени Выявленные отклонения лабораторных показателей являются характерными признаками наличия декомпенсации или нарастания активности цирроза на ранних стадиях развития указанных процессов Результаты проведенного иммунологического исследования показали наличие существенных изменений в иммунном статусе больных циррозом печени Наиболее выраженные отклонения от нормы по всем параметрам иммунного статуса отмечены у лиц с высокой степенью активности процесса Наименее выраженными они были при неактивном циррозе печени При изучении факторов клеточного иммунитета установлено снижение абсолютного числа изученных субпопуляций практически у всех больных, что объясняется имеющейся у них выраженной лимфопенией Это наблюдение согласуется с данными С Д Подымовой и соавт (1994), связывающей это явление с перераспределением лимфоцитов в печень Кроме того, выявлено повышение относительного содержания маркеров активации Т-клеток (НЬА-ОЛ+) и маркера моноцитов (СЭ14+) По мере нарастания активности увеличивалась недостаточность клеточного звена иммунитета и дисбаланс иммунокомпетентных клеток

Снижение относительного числа зрелых Т-лимфоцитов (СОЗ+), цитотокси-ческих клеток (СЭ8+), рецептора трансферрина (С071+), повышение числа акти-вационных молекул (НЬА-ОЯ4), маркера моноцитов (С014+) и иммунорегулятор-ного индекса (С04/СВ8) бьшо наиболее выраженным у лиц с высокой степенью активности процесса (соответственно 67,9±0,52%, 19,2±0,31%, 4,7±0,4%, 17,3±0,35%, 11,7±0,27, 2,85) Аналогичные изменения зарегистрированы у пациентов с декомпенсированным циррозом При неактивном циррозе, как и у больных в стадии компенсации, относительное количество СЭЗ+ и С08+ существенно увеличивается, превышая даже контрольные значения (74,9+0,47%, 24,9±0,41%), а содержание НЬА-ОЯ+, С014+ и С04/СЭ8 достоверно ниже, чем у больных с активным процессом (16,6+0,45%, 9,2+0,35%, 2,24, р<0,05)

Еще более значительные изменения показателей клеточного иммунитета той же направленности выявлены при нарастании активности у больных с декомпенсированным циррозом и при развитии декомпенсации на фоне активного процесса в сравнении с больными с неактивным декомпенсированным циррозом и компенсированным активным Нарастание активности у лиц с деком-пенсированной стадией заболевания сопровождалось наиболее резко выраженным снижением содержания СЭЗ+, С08+- Т-лимфоцитов (66,3+0,71, 17,7+0,32) и значительным повышением экспрессии С014+ и НЬА-ОЯ+ (соответственно 12,4+0,37% и 17,9+0,5%) У пациентов с активным, но компенсированным циррозом печени отмечалось достоверно более высокое содержание СОЗ+ и С08+ -Т-лимфоцитов (73,7+0,32% и 24,7+2,28%) В количестве СБ4+ - Т-лимфоцитов и СЭ20+ - В-лимфоцитов достоверных различий при активном компенсированном и декомпенсированном циррозе печени не было Больные с неактивным декомпенсированным процессом отличались наиболее высокой концентрацией СБЗ+- Т-лимфоцитов, а также С04+-, С08+-, СБ 14+-клеток по сравнению со всеми другими пациентами и с контрольной группой (соответственно 84,2+1,29%, 57,2+1,34, 28,2+0,69, 13,7+2,53 против 71,8±0,б1%, 50,3±0,55, 22,5+0,55, 7,6+0,32 в контроле, р<0,05)

Полученные данные свидетельствуют о существенной роли факторов клеточного иммунитета в патогенезе ЦП Наиболее тяжелые формы цирроза печени характеризуются недостаточностью клеточного звена иммунитета, проявляющей-

ся снижением уровня Т-лимфоцитов, цитотоксических клеток, наряду с повышением экспрессии рецепторов антигенов HLA II класса и моноцитов Низкая концентрация в крови С08+-клеток, возможно, связана с их миграцией в патологический очаг с последующим повреждением гепатоцитов Достаточно высокое содержание С04+-лимфоцитов, высокий иммунорегуляторный индекс, по-видимому, объясняется наличием аутоиммунного компонента в развитии заболевания у этих больных Повышение активационных маркеров указывает на высокую степень активности воспалительного процесса и, по данным ряда авторов, согласуется с усилением экспрессии Fas-антигена и индукцией апоптоза Thl Последнее приводит к накоплению Th 2 и подавлению Т-клеточного ответа (Zhang X et al, 1997) Согласно нашим данным у больных циррозом печени концентрация молекул Fas, экспрессированная на лимфоцитах печени, была достоверно ниже, чем у больных хроническим гепатитом Количество FasL— позитивных лимфоцитов, посылающих сигналы для развития апоптоза, достоверно превышала таковую в ткани печени больных хроническим гепатитом Содержание bcl-2-позитивных лимфоцитов не отличалось от их концентрации при хроническим гепатите Соответственно этим изменениям были выявлены различия в величине индексов FasL/Fas (IF) и FasL/Fas/bcl (IFbcl), отражающих степень готовности лимфоцитов к апоптозу У больных циррозом печени указанные индексы были достоверно выше таковых у пациентов с хроническим гепатитом В (4,06±1,68 и 5,60±1,78 против 0,46±0,14 и 0,16±0,05 при хроническом гепатите, р<0,05) Соответственно этому уровень содержания сывороточного АлАТ у больных циррозом печени В был достоверно ниже, чем у больных хроническим гепатитом В (248,4+95,0 и 965,2+269,0, р<0,05)

Менее тяжелые формы цирроза - неактивный декомпенсированный или активный, но компенсированный - характеризуются повышением зрелых Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических клеток и маркеров моноцитов Усиление выраженности клеточного иммунитета при более благоприятном течении цирроза характеризует состояние напряженности иммунной системы Соответствие повышенной экспрессии рецепторов моноцитов развитию декомпенсации при ЦП может свидетельствовать об активном участии моноцитов/макрофагов в процессах фиброгенеза (Тотолян А А , Фрейдлин И С , 1999)

При изучении факторов гуморального иммунитета выявлена четкая взаимосвязь показателей состояния системы В-клеток с остротой процесса Больные с высокой степенью активности, выраженной декомпенсацией, характеризуются и более высокими показателями гуморального иммунитета в сравнении с лицами с менее выраженными клиническими проявлениями заболевания Нарастание активности заболевания соответствовало резкое увеличение синтеза 1§А, и ЦИК При этом максимальные значения 1§А и ЦИК наблюдались при появлении декомпенсации у больных активным циррозом печени (7,0±0,42 г/л и 171,5±5,26 у е против 3,0±0,28 г/л и 92,5±5,99 у е при активном, но компенсированном процессе, р<0,05) Увеличение уровня соответствовало увеличению активности процесса независимо от стадии болезни (20,9±1,85 г/л и 21,9±0,51 г/л у лиц с активным компенсированным и декомпенсированным против 13,1±0,64 г/л и 16,1±1,44 г/л у больных соответственно с неактивным компенсированным и декомпенсированным процессом, р<0,05) При неактивном процессе достоверных отличий в показателях гуморального иммунитета в зависимости от наличия или отсутствия декомпенсации не определялось Очевидно, что гиперпродукция в основном отражает активность процесса, а максимальное нарастание и ЦИК соответствует развитию декомпенсации

Проведенный анализ показателей иммунного статуса показал, что сохранение или даже увеличение количества иммунокомпетентных клеток в сочетании с невысоким синтезом иммуноглобулинов и ЦИК отражает адекватную реакцию организма на цирротическую трансформацию печени и способствует длительной ремиссии заболевания

Определение содержания ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-12, ИЛ-4 и ИЛ-10 в сыворотке крови больных циррозом печени позволило установить значительное (более чем в 10 раз) повышение уровня ФНО -а и ИЛ-10 у 89,7% и 93,1% больных соответственно, а ИЛ-6 — у 58,6% Повышение содержания ИЛ-4 и ИЛ-12 в сыворотке крови больных активным циррозом определялось лишь у 2-х больных, состояние которых было крайне тяжелым У этих же больных зарегистрирована наиболее высокая концентрация сывороточного ИЛ-10 и ФНО-а (51,8 и 790,0 пг/мл) Вместе с тем следует отметить, что в работе АС Логинова и соавт (2001) представлены данные, свидетельствующие об обнаружении ИЛ-4 в сыворотке крови больных

циррозом печени Возможно, имеющиеся противоречия связаны с использованием различных тест-систем для определения цитокинов или с обследованием неидентичных групп больных Продукция цитокинов оказалась различной в зависимости от характера патологического процесса Высокое содержание ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-10 в сыворотке крови больных соответствовало большей выраженности клинических проявлений заболевания (активности, декомпенсации) У больных класса С по С1п1с1-РидЬ уровень ФНО-а соответствовал 356,9±62,6 пг/мл, (в контроле 4,2±0,51 пг/мл), ИЛ-6 - 1,9+0,49 пг/мл, (в контроле 0,0±0,0 пг/мл), ИЛ-10 -44,98±1,02 пг/мл (в контроле 1,79+0,19 пг/мл) Развитие декомпенсации сопровождается наиболее резким повышением концентрации ИЛ-6 Умеренное повышение уровня сывороточных цитокинов отмечено при неактивном, компенсированном циррозе (у больных класса А уровень ФНО-а - 23,4+2,0 пг/мл, ИЛ-6 -0,16+0,01 пг/мл, ИЛ-10 - 20,1+0,64 пг/мл)

Установленные связи между уровнями продукции ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-10 с клинико-биохимическими и иммунологическими показателями свидетельствуют о роли цитокинов в патогенезе цирроза печени Полученные в работе данные согласуются с имеющимися представлениями о биологическом действии цитокинов (Кетлинский С А и соавт, 1992, Фрейдлин И С , Тотолян А А, 2001) При длительном хроническом воспалении именно ФНО-а является одним из медиаторов повреждения тканей Активация фиброгенеза, выраженная при циррозе, также может быть связана со способностью ФНО-а индуцировать пролиферацию фибробластов и депозицию коллагена Высокая концентрация ФНО-а влечет за собой хроническое воспаление, деструкцию и способствует неблагоприятному течению патологического процесса Повышенный синтез ТЫБ-а приводит к лихорадке, похуданию, анорексии, лейкопении и в результате к снижению устойчивости к инфекциям В ряде работ последних лет представлен вклад ФНО-а в реализацию иммунного воспаления в печени (Царегородцева Т М, Серова Т И , 2003) Наряду с повышенной продукцией ФНО-а у больных с активным циррозом печени резко усилена продукция ИЛ-10, что, возможно, обусловлено высокой концентрацией иммунных комплексов, которые, как известно, действуя на макрофаги, индуцируют секрецию многих цитокинов, в том числе ИЛ-10 Резкое усиление продукции ИЛ-10 на фоне низкого содержания ИЛ-12 ве-

дет к снижению противоинфекционной защиты, развитию иммуносупрессии, нарушению репаративных процессов, вследствие смещения баланса в сторону Т-хелперов 2 типа (Фрейдлин И С , Кузнецова С А , 1999)

Уровень ИЛ-6 в сыворотке коррелирует с тяжестью цирроза Значительно более высокое нарастание уровня ИЛ-6 по сравнению с ИЛ-10 и ФНО-а при развитии декомпенсации подтверждает имеющиеся в литературе сведения о вовлечении ИЛ-6 в патогенез многих заболеваний, сопровождающихся фиброзом (Choi I et al, 1994) Сходные данные о высоком синтезе ИЛ-6 при циррозе печени, полученные в работах В Т Ивашкина и соавт (2001) и А С Логинова и соавт (2001), по мнению авторов, отражают смещение цитокинового баланса в сторону факторов с противовоспалительной и пролиферативной активностью

Известно, что течение и исход заболевания определяется не просто повышением или снижением уровня цитокинов, а соотношением про- и противовоспалительных цитокинов Отсутствие ИЛ-4, способного ограничить воспалительный процесс, и ИЛ-12, необходимого для усиления клеточного иммунного ответа, в сочетании с высоким уровнем ФНО-а и ИЛ-10 свидетельствуют о разбалансиро-ванности механизмов иммунной системы у больных циррозом печени

Показано, что чрезмерное повышение продукции ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-10 на фоне дефицита Т-лимфоцитов, активации гуморального звена иммунитета усугубляет прогрессирующий характер воспаления и деструкцию ткани печени Умеренное повышение продукции цитокинов на фоне усиления клеточных механизмов защиты и нерезко выраженных гуморальных факторов иммунитета характерно для адекватного иммунного ответа и соответствует благоприятному течению цирроза печени

Результаты проведенного корреляционного анализа свидетельствуют, что нарушения иммунитета и других показателей гомеостаза не возникают изолированно, а характеризуются тесной взаимозависимостью

Отмечена прямая взаимосвязь эндогенной продукции ФНО-а, ИЛ-10, ИЛ-6 с выраженностью гуморального иммунитета, СОЭ и биохимическими показателями, характеризующими активность патологического процесса в печени, и обратная взаимосвязь — с показателями клеточного иммунитета, числом эритроцитов и биохимическими параметрами, отражающими функциональную состоятель-

ность печени Очевидно, что чрезмерное повышение эндогенной продукции ФНО-а, ИЛ-10, ИЛ-6 на фоне дефицита Т-лимфоцитов усугубляет прогрессирующий характер воспаления, приводя к дальнейшей деструкции ткани печени Выявленные изменения в оценке иммунной системы в зависимости от тяжести течения цирроза печени нашли подтверждение в иммуногистохимических параметрах больных высокоактивным декомпенсированным циррозом печени В

Сопоставление показателей содержания в ткани печени больных циррозом печени лимфоцитов, С04- и С08-клеток, макрофагов (С068-клеток) с аналогичными показателями в ткани интактной печени выявило значительное повышение количества Т-хелперов (СБ4) (7,16±3,27% против 0,88±0,73% в контроле, р<0,05) Следствием этого явилось некоторое увеличение при циррозе печени соотношения СЭ4/С08 (р>0,05) Количество остальных изученных клеток, участвующих в обеспечении локального иммунного ответа, не отличалось от контрольной группы При сравнении этих же параметров с клеточным составом лимфоидного инфильтрата печени больных хроническим гепатитом В отмечено достоверно более низкое содержание лимфоцитов в ткани печени больных циррозом печени (12,83±3,2 и 37,71±7,61 при хроническом гепатите), наряду с выраженным повышением количества С04-лимфоцитов (7,16±3,27% против 0,95±0,42% при хроническом гепатите, р<0,05) Выявленное преобладание в цирротической ткани печени Т-хелперов на фоне снижения общего числа лимфоцитов указывает на возникновение выраженных сбоев в иммунной системе больных тяжелым циррозом печени Высокий уровень С04-лимфоцитов у больных циррозом может быть связан с развитием у них аутоиммунного характера процесса, усугубляющего дальнейшее прогрессирование заболевания Это предположение подтверждается представленным выше фактическим материалом о высокой активации гуморального звена иммунитета, гиперпродукции иммуноглобулинов, ЦИК и высокой эндогенной продукции ФНО-а, ИЛ-10, ИЛ-6 при большей выраженности клинических проявлений

На основе полученных результатов выделен комплекс прогностических значимых критериев для прогноза течения, оценки тяжести цирроза печени и целесообразности назначения иммунокорригирующих препаратов Наибольшей клинической значимостью для раннего определения активности цирроза явля-

ются высокий уровень ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-10 (>30 пг/мл), для раннего выявления декомпенсации - повышение уровня ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-6 (>0,6 пг/мл), СОЫ+ (>13%), ЦИК (>120 у е) Повышение СЭ14+ (>13%) является отличительным признаком только декомпенсированного процесса независимо от степени его активности

Клинико-молекулярные механизмы фиброгенеза печени у больных хроническим гепатитом В и циррозом печени В

По мнению большинства специалистов (Ассела Т, Бойер Н и соавт, 2003), степень выраженности фиброза в печени находится в прямой зависимости от активности воспаления Эти сведения согласуются с полученными в работе данными о высокой корреляционной зависимости при ХГ В между индексом гистологической активности и гистологическим индексом стадии процесса (г= 0,87 при р=0,00001), что предполагает общность клинико-биохимических и клеточно-молекулярных факторов (схема 1)

<( СЭ68 )[>

К1-67

Схема 1. Корреляционные взаимосвязи между индексом гистологической активности и гистологическим индексом стадии процесса при ХГ В

Обнаружена прямая взаимосвязь указанных морфологических критериев активности и стадии процесса с клиническим признаком повреждения печени (АлАТ), вирусной активностью, а также с пролиферативной активностью гепа-тоцитов и уровнем экспрессии С068 (тканевых макрофагов)

Звездчатые клетки (ЗК, клетки Ито) играют ключевую роль в процессе фиброгенеза В отличие от покоящихся клеток Ито, активированные ЗК экс-прессируют гладкомышечный актин (а-8МА) (Наи1екее1е МЬ й а1, 1997) Эта экспрессия а-БМА была использована нами для идентификации ЗК Следует отметить, что дифференцировка ЗК в а-БМА-позитивный фенотип не обязательно приводит к фиброзу а-БМА-позитивные ЗК наблюдаются и при заболеваниях печени, не связанных с развитием фиброза, таких как парацетамол-индуцированное повреждение (МаЙ1е\у 1 й а1, 1994) и ишемия печени (11иЬ-ЬшЬгапсК Ь й а1, 1997) Более того, в нормальной печени здорового человека число позитивных а-БМА-клеток отличается у разных авторов, от единичных значений (8с1ншН-Сга£Г А й а1, 1991) до значительных (Епгап Н е1 а1, 1994) Разброс результатов может объясняться недостаточно корректным подбором контрольной группы и различной чувствительностью используемых методик Полученное нами значение а-БМА-позитивных ЗК в образцах ткани печени контрольной группы незначительно отличалось от такового при хроническом гепатите и циррозе печени (0,72±0,28%, 0,54±0,07%, 0,89±0,30% соответственно) Таким образом, появление активированных ЗК, экспрессирующих а-8МА, само по себе еще не является свидетельством запуска процесса фиброгенеза В пользу этого аргумента могут служить следующие факты наличие позитивных а-БМА-звездчатых клеток в печеночной ткани контрольной группы, несоответствие уровня экспрессии а-БМА-позитивных ЗК степени тяжести фиброза (0,52±0,09% при ГИС 0-4 и 0,57±0,03% при ГИС 9-12), отсутствие взаимосвязи уровня экспрессии а-БМА в звездчатых клетках с активностью воспаления (0,70±0,12% при ИГА 1-3 и 0,59±0,13% при ИГА 13-18, 0,61±0,11% при АлАТ < 40 и 0,52±0,13% при АлАТ > 100)

Анализ уровня изменений а-БМА-позитивной ткани печени у больных хроническим гепатитом и циррозом печени показал, что в цирротической ткани печени % а-8МА-позитивной ткани был выше, чем при хроническом гепатите

(5,40±0,47% и 2,64±0,37%, р<0,05) Вместе с тем, при хроническом гепатите изменение уровня % a-SMA-позитивной площади ткани печени не зависит от активности воспаления и стадии процесса Полученные результаты согласуются с данными большинства исследователей (Levy М Т et а1, 2002) Следует отметить, что в ткани печени способностью к экспрессии молекул a-SMA, наряду со звездчатыми клетками, обладают фибробласты, фиброциты, истинные миофиб-робласты, в большом количестве локализованные в портальных трактах печеночной дольки, а также миофибробласты центральных дольковых вен (Enzan Н et al, 1994) Таким образом, учет всей позитивной- a-SMA ткани, включая и портальные тракты, отражает экспрессию молекул a-SMA на многих клеточных популяциях, способных экспрессировать данный белок, что нивелирует диагностическую значимость данного маркера

Неожиданным было обнаружение экспрессии молекул a-SMA в ядрах ге-патоцитов Особенно с учетом того обстоятельства, что аналогичные свидетельства не освещались раннее во всех известных исследованиях Согласно современным представлениям гепатоцитам в патогенезе фиброгенеза отводится роль активатора звездчатых клеток продуктами повреждения (активные формы кислорода, протеазы и т д ) (Friedman S L, 2000)

Сопоставление уровня экспрессии a-SMA в ядрах гепатоцитов у больных хроническим гепатитом и циррозом печени выявило отсутствие a-SMA-позитивных гепатоцитов на цирротической стадии хронического гепатита (1,16±0,28% и 0% соответственно) Отмеченный факт имеет большое диагностическое значение, поскольку биопсия печени в силу так называемых «ошибок попадания» может дать ложное представление о характере изменений в печени, что обусловливает вариабельность получаемого образца от 15 до 65% от истинного состояния (Пинцани М, 2002) Анализ изменения уровня экспрессии а-SMA в ядрах гепатоцитов у больных хроническим гепатитом в зависимости от активности воспаления показал, что при нарастании ИГА и содержания сывороточной АлАТ уровень позитивных a-SMA-гепатоцитов достоверно снижается (1,67±0,49% при ИГА 1-3 и 0,21±0,08% при ИГА 13-18, р<0,05, 1,37±0,39% при АлАТ < 40 и 0,33±0,17% при АлАТ > 100, р<0,05) Уровень экспрессии а-SMA в ядрах гепатоцитов, по-видимому, отражает функциональную состоя-

тел!.ность клетки. При хроническом гепатите В наблюдается соответствие между уровнем пролиферации ной активности гепатоцитов и количеством в(»5МА позитивных ядер гепатоцитов. На цнрротнческой стадии процесса значительное снижение пролиферативной активности гепатоцитов соответствует отсутствию экспрессии К-5МА молекул в ядрах этих клеток (рис. 1). Выявленная прямая корреляция между звездчатыми клетками и г епатоцитами, экс премирующими а-БМ А при хроническом гепатите В (г=0,63 при р=0,002), свидетельствует о тесной межклеточно-молекулярной взаимосвязи. 11а цирротичсской стадии хронического гепатита В указанная корреляционная зависимость отсутствует, что свидетельствует о нарушении меж клеточно-м Опеку л ярн ых взаимосвязей.

ХГ ЦП

Рис. I. Сопоставление уровня содержания a-SMA-иознтивных ядер гепатоцитов к индекса «ролнфератнщой активности гепатоцитов при хроническом гепатите и циррозе печени при одинаковой активности патологичеевого процесса (ИГА У-3 Н).

Клетки и ткань печени, позитивные но наличию молекул ct-SMA, при хроническом гепатите В находятся в тесной взаимосвязи между собой, а также с содержанием внутридольковых CD8'-лимфоцитов {схема 3). Получена обратная корреляционная зависимость CQ&+-лимфоцитов с клетками и тканью, позитивными по a-SMA и положительная - между Fas-позитивными лимфоцитами и SMA-позитивными звездчатыми клетками и SMA-позитивной тканью печени.

Таким образом, цитотоксические лимфоциты на этапе хронического гепатита являются сдерживающими факторами в развитии фиброза. Объяснением этому могут быть интерфероны, продуцируемые цитотоксическими лимфоцитами, В ряде работ, при изучении влияния интерферонов на течение фиброза, отмечено снижение пролиферативной активности звездчатых клеток и увеличение продукции и секреции ингибиторов фиброгепеза - металлонротсипаз

□ %SMA гепэтоцкты ■ Ki-67 гепатецигы

(Ма11а1 Б 1995, ЗоЬеэку Я а1, 1999, БМйпапМЬ «Л а1, 1999) При де-компенсированной стадии цирроза печени мы наблюдаем совершенно иную картину (схема 4) Обнаружена высокая корреляционная положительная зависимость между БМА-позитивной тканью (те фиброзной тканью) и внутри-дольковыми СБ4+-лимфоцитами

г= - 0,42 р= 0,02

Сй8

Гепатоцит N

вМА У

(■= - 0,45 р= 0,01 ИГА

1= 0,78 р= 0,0001

ЗК ЭМА

1=0,81 р- 0,0001

У

г= - 0,39 р=0,03

г= 0,42 р=0,02

фиброзная ткань ЭМА

Схема 2 Межклеточно-молекулярные взаимосвязи вМА-позитивных клеток при хроническом гепатите В.

Схема 3. Межклеточно-молекулярные взаимосвязи вМА-позптивных клеток при циррозе печени В.

Аналогичные данные получены при анализе сывороточных иммунологических показателей у больных циррозом печени, распределенных согласно критериям Chlld-Pugh (табл 4)

Таблица 4

Взаимосвязь показателей гемограммы, биохимических и иммунологических параметров с характером процесса по классификации ОиМ-Р^Ь

Параметры Классы

А В С

п М±т п М+т п М+т

CD3 % 21 74,0±0,37* ** 10 66,4+1,24* 5 68,8+2,0**

CD3a 21 1,31+0,02* ** 10 0,73+0,04* 5 0,77+0,17**

CD4% 23 49,8±0,46 10 50,7+0,96 5 51,8+2,03

CD4a 22 0,9+0,01* ** 10 0,55+0,03* 5 0,58+0,13**

CD8% 23 24,7+0,32*' ** 10 18,8+0,46* 5 16,2+1,42**

CD8a 22 0,43+0,01* ** 10 0,2+0,01* 5 0,18+0,03**

CD 14% 21 9,38+0,26* 9 12,56+0,6* 5 11,6+1,4

CD 14a 21 0,22+0,01 9 0,19+0,02 5 0,36±0,09

HLA-DR% 21 16,3+0,33* 9 19+0,84* ** 4 15,75+1,2**

HLA-DR a 21 0,38+0,01* 9 0,29+0,02* 4 0,31+0,07

CD20% 23 9,17+0,2* 10 10,7+0,57* 5 11,0+1,56

CD20a 22 0,18+0* ** 10 0,12+0,01* 5 0,1+0,01**

IgM 24 2,16+0,07* 11 2,05+0,11** 5 3,24+0,4*' **

IgG 24 16,2+0,39*' ** 11 20,75+0,78* 5 21,4+2,32**

IgA 24 3,41+0,13* ** 11 5,99+0,55* 5 7,48+1,8**

ЦИК 25 101,6+2,7* ** 10 153,2+7,85* 5 145,2+8,47**

ФНО-а (пг/мл) 18 23,4+2,01*'** 6 138,0+17,2* *** 5 356,9+62,6** ***

ИЛ-6 (пг/мл) 18 0,16+0,01*'** 6 1,78+0,52* 5 1,9+0,49**

ИЛ-10 (пг/мл) 18 20,1+0,64* ** 6 32 4+1 4* *** 5 44,98+1,02** ***

* ** *** — разница между сравниваемыми группами достоверна (р<0,05)

Увеличению тяжести фиброза (группа С) соответствовало достоверное уменьшение числа цитотоксических лимфоцитов (С08+-клеток) СБ4+-лимфоциты на стадии декомпенсации цирроза печени (особенно группа С) представлены в основном Т-хелперами 2 типа Аргументом в пользу данного утверждения является значительное нарастание факторов гуморального звена иммунитета, а также достоверное увеличение содержания наряду с провоспали-тельными цитокинами (ИЛ-6, ФНО-а) и противовоспалительного - ИЛ-10 Хотя в литературе имеются сведения о способности ИЛ-10 снижать интенсивность

фиброзирования в печени при XT (Nelson D R, 2000), на цирротической стадии одновременно высокие уровни содержания про- и противовоспалительных ци-токинов свидетельствуют о разбалансировании звеньев иммунной системы А чрезмерно высокий уровень содержания ИЛ-10 может указывать на развитие анергии иммунной системы

Таким образом, на процесс фиброгенеза при хроническом гепатите В оказывает влияние множество факторов уровень содержания сывороточных АлАТ, пролиферативная активность гепатоцитов, активность печеночных макрофагов, морфологическая активность воспаления, наличие сывороточного поверхностного антигена вируса гепатита В, а также уровень содержания позитивных a-SMA-гепатоцитов, цитотоксических лимфоцитов и уровень экспрессии проапоптозных белков на лимфоцитах Изменение уровня указанных параметров оказывает регулирующее влияние на процесс фиброгенеза Нарастание роли гуморального звена иммунитета, количества С04+-лимфоцитов, снижение содержания цитотоксических клеток, а также нарушение взаимосвязей между гепатоцитами и ЗК свидетельствуют о несбалансированности фиброгенеза При этом гепатоциты в процессе фиброгенеза выступают не только как активаторы ЗК продуктами своего повреждения, но и являются клетками-продуцентами одного из белков (a-SMA) фиброгенеза

Полученные данные указывают на существенную роль состояния гепатоцитов в патогенезе цирроза печени Наличие тесной взаимосвязи между гепатоцитами и ЗК, экспрессирующими молекулы a-SMA на этапе хронического гепатита является основой сбалансированного фиброгенеза Циррозу печени соответствует нарушение межклеточно-молекулярных взаимосвязей, характеризующихся полным отсутствием экспрессии молекул a-SMA на гепатоцитах при резком увеличении (>5%) a-SMA — позитивной ткани печени Отмеченные различия в содержании a-SMA — позитивных ядер гепатоцитов у больных хроническим гепатитом и циррозом печени могут быть положены в основу иммуно-гистохимических критериев ранней диагностики цирроза печени и оценки тяжести фиброза

Клинико-молекулярные механизмы формирования гепатоцеллюлярной карциномы, ассоциированной с вирусом гепатита В

Исходя из концепции вероятной связи состояний «вирусный гепатит -цирроз печени - гепатоцеллюлярный рак» был проведен сравнительный анализ клинических симптомов и синдромов гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), ассоциированной с вирусом гепатита В, с циррозом печени В (ЦП В) и хроническим гепатитом В (ХГ В) одинаковой активности воспалительного процесса (ИГА 9-18 баллов) Сопоставление частоты проявлений основных симптомов и синдромов между гепатоцеллюлярной карциномой и циррозом печени не выявило принципиальных отличий Для хронического гепатита той же степени активности патологического процесса обращало внимание значительное снижение выраженности клинической симптоматики, а также отсутствие асцита и отечно-асцитического синдрома Анализ основных параметров клинического анализа крови показал достоверные отличия по ряду показателей при гепатоцеллюлярной карциноме и циррозе печени по сравнению с хроническим гепатитом (снижение эритроцитов (х1012/л) - 3,58±0,28, 3,60+0,20 и 4,44±0,15, р<0,05, уменьшение гемоглобина - 113,4±9,4 г/л, 116,0±7,34 г/л и 145+4,64 г/л, р<0,05, снижение лимфоцитов - 19,6±4,2%, 18,2+2,7%, и 32,5±3,1%, р<0,05, увеличение СОЭ - 49,8+6,2 мм/ч, 32,8+9,5 мм/ч и 7,5±3,5 мм/ч, р<0,05) Сравнительный анализ основных биохимических показателей также не выявил различий между гепатоцеллюлярной карциномой и циррозом печени, за исключением уровня содержания щелочной фосфатазы (467,4±94,1 мккат/л и 212,7+15,8 мккат/л соответственно, р<0,05) По сравнению с хроническим гепатитом при гепатоцеллюлярной карциноме и циррозе печени наблюдаются наиболее выраженные изменения биохимических показателей снижение белково-синтетической функции по содержанию альбумина - 29,8+1,3 г/л при ГЦК, 30,8±3,3 г/л при ЦП и 40,5±2,0 г/л при ХГ, р>0,05, протромбина - 62,8+5,4% и 66,0+7,0% при ГЦК и ЦП и 75,3±6% при ХГ, р>0,05, уменьшение содержания глюкозы - 3,8+0,38 ммоль/л и 3,86±0,49 ммоль/л при ГЦК и ЦП, 5,1+0,23 ммоль/л при ХГ, р<0,05, усиление мезенхимально-воспалительного синдрома (содержание у-глобулина и тимоловой пробы 28,2+6%, 10,7±3,7 у е и 32,1±9,9%, 9,84±3,0 уе при ГЦК и ЦП и 19,9+1,7%, 6,5+1,35 уе при ХГ,

р>0,05), уменьшение содержания АлАТ при ГЦК и ЦП по сравнению с ХГ -109,4±20,3 ед/л и 248,4±95 ед/л и соответственно 965,2±269 ед/л, р<0,05, нарастание общего билирубина (мкмоль/л) при ГЦК и ЦП - 211,6+56,5 и 153,7±69,9 по сравнению с ХГ - 84,8±28,9 при р>0,05

Морфологических особенностей и отличий неопухолевой ткани у больных гепатоцеллюлярной карциномой, ассоциированной с вирусом гепатита В, от ткани печени больных циррозом печени В нами также не выявлено Микроскопически - характер перестройки ткани печени в обеих группах был сходен, преобладала мелкоузловая перестройка (соответственно - в 80% в группе умерших от гепатоцеллюлярной карциномы и в 84% в группе умерших от цирроза печени) В обеих группах отмечен высокий уровень дисплазии гепатоци-тов до 100% при гепатоцеллюлярной карциноме и 83,4% в ткани печени больных циррозом печени

Таким образом, схожесть клинико-биохимических симптомов и синдромов, примерная частота их проявлений, отсутствие морфологических особенностей и отличий неопухолевой ткани при гепатоцеллюлярной карциноме от ткани печени больных циррозом печени - представляет серьезную диагностическую проблему для раннего выявления гепатоцеллюлярной карциномы, что требует изучения механизмов и поиска диагностических тестов на клеточно-молекулярном уровне

Сопоставление активности пролиферации гепатоцитов и синусоидных клеток при хроническом гепатите, циррозе печени и гепатоцеллюлярной карциноме показало, что если на этапе хронического гепатита определяются примерно равные значения индекса пролиферации указанных клеток, то в ткани печени больных циррозом печени и в окружающей опухоль ткани при гепатоцеллюлярной карциноме низкие значения индекса пролиферации синусоидных клеток соответствуют резко сниженной активности пролиферации гепатоцитов В опухолевой ткани на фоне максимально сниженной активности пролиферации синусоидных клеток мы наблюдаем выраженную пролиферацию атипичных клеток (рис 2)

Kl-67

I'nc. 2. Сопоставление пролифератнвиой активности клеток печени на iscc\ Этапах патоло№ чес кого !1роиссся

Проведенный корреляционный анализ выявил положительную корреляционную зависимость между индексом пролиферативнон активности гепатоци-тов и синусоидных клеток при хроническом гепатите (г=0,46 при р=0,01) и ее отсутствие при циррозе печени и гепатацеллюлярнай какрщшойё. Это свидетельствует» межклеточно-молекулярной взаимосвязи при хроническом гепатите и отсутствие таковой при декомпилированной стадии цирроза печени и ге-патоцеллюлярной карциноме.

Известно, что лимфоциты являются ключевой фигурой в обеспечении клеточного гомеостаза, осуществление которого происходит в результате как участия в регенерации соматических клеток, так и в реализации программы повреждения этих клеток путем апоптоза. Сравнительный анализ CD4-позитивных лимфоцитов в ткани печени на вссх этапах патологического процесса выявил минимальное его содержание в печеночной ткани больных хроническим гепатитом с достоверным нарастанием при циррозе печени и гепато-целлюлярной карциноме (неопухолевой ткани и опухоли) (0,95±0,42, 7,1 б±3,27, 17,64±7,79 и 23,40±7,13 соответственно, р<0,05). Для в ну три дольковых CDs-позитивных лимфоцитов совершенно иная картина. Максимальное его содержание выявлено у больных хроническим гепатитом (49,91±9,20), минимальное — в опухолевой ткани гепатоцеллюлярной карциномы (28,80±7,12). По аналогии с механизмом подавления аплотрансплатата печени можно предположить, что в опухолевой ткани больных гепатонеллюлярной карциномы срабатывает такой же механизм, позволяющий подавить иммунный ответ на опухолевые антиге-

ны Максимально выраженное содержание CD4 Т-клеток в опухолевой ткани с повышенной секрецией противовоспалительных цитокинов является одним из элементов механизма избегания иммунного надзора за опухолевыми клетками Ряд исследователей отмечают, что при некоторых онкологических заболеваниях гиперпродукция IL-10 становится фактором роста злокачественных клеток, снижая синтез важных в противоопухолевой защите цитокинов (ФНО-а, ИЛ-2, ИФН-у) (ГрачеваЛА, 1996, ШичкинВП, 1998, ЛихванцеваВГ и соавт, 1999)

Для определения функциональной состоятельности лимфоидных клеток мы оценили уровень экспрессии про- и антиапоптозного генов на внутридоль-ковых лимфоцитах печени и опухолевой ткани Исследование системы Fas/FasL и экспрессии гена Вс1-2 в неопухолевой ткани больных гепатоцеллюлярной карциномы показало достоверное увеличение содержания Fas- и FasL-позитивных лимфоцитов по сравнению с показателями в интактной печени (соответственно 47,3± 17,63 % и 39,44±17,6 % против 6,93±3,03% и 9,75±0,79% в контроле, р<0,05) При этом величина экспрессии FasL отчетливо превышала таковую у больных хроническим гепатитом В (39,44±17,6% и 7,67±2,36 %, р<0,05), не отличаясь от среднего показателя при циррозе печени (39,44±17,6% и 17,07±2,23 %, р>0,05) Интенсивность экспрессии Fas-рецептора, напротив, у больных гепатоцеллюлярной карциномой была значительно выше, чем у больных циррозом печени (47,3±17,63 % и 6,69±3,62 %, р<0,05) и колебалась в тех же пределах, что и у пациентов хроническим гепатитом В (47,3±17,63 % и 21,89±4,75%, р>0,05) В экспрессии гена Вс1-2 достоверных отличий ни от контрольной группы лиц, ни от больных циррозом печени В и хроническим гепатитом В не было Следствием указанных изменений явилось резкое снижение индексов готовности к апоптозу лимфоцитов в неопухолевой ткани печени больных гепатоцеллюлярной карциномой по сравнению показателями индексов IF и IFBCL при циррозе печени (соответственно 0,69±0,19 и 0,68±0,37 против 4,06±1,68 и 5,60±1,78, р<0,05) При сравнении величин указанных индексов с показателями у больных хроническим гепатитом В существенных различий не обнаружено

В ткани опухоли наблюдалась иная картина Содержание Fas- и FasL- позитивных лимфоцитов в ткани опухоли не отличалось от контроля, и было зна-

чительно меньше, чем в неопухолевой ткани печени этих же больных (8,28±4,65%, 8,74±3,8% против 47,3±17,63 %, 39,44±17,6 % соответственно) Так же было снижено число bcI-2-позитивных лимфоцитов (10,52+8,74% против 23,3±14,4% в не опухолевой ткани) Содержание bcl-2-позитивных лимфоцитов в опухолевой ткани у 4-х из 5 больных было низкое или отсутствовало (в среднем 2,92+2,76%) Высокая экспрессия bcl-2 (40%) выявлена у одного пациента (с ИГА-8) при полном отсутствии в опухолевой ткани экспрессии молекул FasL и FasAg Величина индекса готовности лимфоцитов к апоптозу (IF) в опухолевой ткани у остальных больных была выше, чем в цирротической ткани печени (в среднем 1,36 против 0,68±0,37) В связи с резким снижением экспрессии bcl-2 (до 0%) у большей части больных значительно возрос коэффициент готовности лимфоцитов к апоптозу (IFbcl) по сравнению с показателями в неопухолевой ткани Представить эти данные в цифровом отображении не представляется возможным, так как у ряда больных экспрессия гена bcl-2 и/или FasAg была равна 0 Определить значение индекса IFbcl оказалось возможным лишь в одном случае, где IFbcl был равен 9 у е против 1,58 у е в неопухолевой ткани этого же больного

Таким образом, для больных гепатоцеллюлярной карциномой характерно нарастание экспрессии молекул Fas и FasL в неопухолевой ткани печени, что свидетельствует об активации лимфоцитов Обращает на себя внимание максимальный уровень экспрессии Fas-рецептора на лимфоцитах печеночной ткани больных гепатоцеллюлярной карциномой по сравнению с хроническим гепатитом и циррозом печени (47,3+17,63, 21,89+4,75 и 6,69+3,62 соответственно, р<0,05) Косвенно значимость Fas-антигена в развитии канцерогенеза подтверждается работой S Jodo et al (1998) - уровень в плазме крови растворенной фракции FAS (sFAS) коррелировал с развитием очагов гепатоцеллюлярной карциномы и снижался после оперативного лечения (Sun В et al, 2000) В ткани опухоли, напротив, интенсивность экспрессии про- и антиапоптозных генов была низкая В ряде случаев bcl-2 вообще не определялся, и вероятность апоп-тоза лимфоцитов в опухолевой ткани резко возрастала Сопоставление индекса готовности к апоптозу лимфоцитов (IF и IFbcl) у больных хроническим гепатитом с активностью сывороточной АлАТ показало закономерное соответствие

низкой степени готовности к апоптозу лимфоцитов выраженному цитолизу (по содержанию АлАТ) При циррозе печени — высокий уровень индекса готовности к апоптозу лимфоцитов соответствовал низкому содержанию АлАТ В неопухолевой ткани при гепатоцеллюлярной карциноме отмечена разнонаправ-ленность действия низкий индекс готовности к апоптозу лимфоцитов не соответствовал уровню выраженности цитолиза

Если предположить, что неопухолевая ткань при гепатоцеллюлярной карциноме является местом формирования мутантных клеток, то становится понятным активация лимфоцитов и снижение их готовности к апоптозу А несоответствие содержания сывороточных АлАТ низкому индексу готовности к апоптозу лимфоцитов отражает, по-видимому, их функциональную несостоятельность

Одной из причин нарастания индекса готовности к апоптозу лимфоидных клеток печени при циррозе печени и гепатоцеллюлярной карциноме, ассоциированных с вирусом гепатита В, является персистенция в них вируса (в виде экспрессии НВсогА§) В отличие от хронического гепатита В, где нами не выявлена экспрессия НВсогА^ в лимфоцитах печени, при циррозе печени и гепатоцеллюлярной карциноме отмечалось нарастание уровня содержания указанного антигена с максимальным значением в опухолевой ткани (10,02±6,74% в опухоли против 6,02±4,02% в цирротической ткани и 9,17±2,82% в неопухолевой ткани) По нашим данным, активированные печеночные лимфоциты в неопухолевой ткани не способны осуществлять надзорную функцию (об этом говорит несоответствие низкой активности пролиферации гепатоцитов и содержания АлАТ умеренной степени готовности к апоптозу лимфоцитов) А выраженная экспрессия Раз-рецептора на лимфоцитах ткани цирротической печени может быть использована в качестве диагностического теста для ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы

ВЫВОДЫ

1 Больные хроническим гепатитом В в фазе репликации характеризуются высокой пролиферативной активностью гепатоцитов наряду со снижением готовности к апоптозу лимфоцитов печени

2 При хроническом гепатите В установлена достоверная прямая взаимосвязь пролиферативной активности гепатоцитов с содержанием цитотоксиче-ских лимфоцитов печени и клинико-биохимическими, морфологическими и вирусологическими параметрами активности процесса

3 Декомпенсированная стадия цирроза печени В отличается высокой степенью готовностью к апоптозу лимфоцитов, повышенным содержанием Т-хелперов и низкой пролиферативной активностью гепатоцитов

4 Чрезмерная продукция ФНО-а, ИЛ-10 и ИЛ-6 с преимущественной недостаточностью факторов клеточного иммунитета характерна для тяжелых прогрессирующих форм цирроза печени Сочетание умеренного повышения концентрации цитокинов с выраженным клеточным ответом и невысоким гуморальным указывает на благоприятное течение процесса

5 Выделен комплекс диагностически значимых критериев для прогноза течения и тяжести цирроза печени для раннего определения активности процесса характерно высокий уровень ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-10 (>30 пг/мл), у-глобулинов (>24%), тимоловой пробы (>5 ед), для раннего выявления декомпенсации - повышение уровня ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-6 (>0,5 пг/мл), СО 14% (>13%), ЦИК(>120уе)

6 При хроническом гепатите В установлена отчетливая взаимосвязь тяжести процесса с экспрессией БМА-а в ядрах гепатоцитов и отсутствие таковой с экспрессией ЯМА-а на непаренхиматозных клетках печени Нарастание активности воспаления и степени фиброза сопровождается снижением содержания а-БМА в ядрах гепатоцитов и исчезновением ее экспрессии в цирротической ткани больных циррозом печени В Оценка уровня экспрессии БМА-а в ядрах гепатоцитов является информативным показателем для раннего выявления цирроза печени

7 Для больных гепатоцеллюлярной карциномой, ассоциированной с вирусом гепатита В, характерно сочетание умеренной степени готовности к апоптозу лимфоцитов в неопухолевой ткани, выраженной экспрессией Раз-рецептора, повышенным содержанием Т-хелперов печени и низкой пролиферативной активностью гепатоцитов

8 В опухолевой ткани при гепатоцеллюлярной карциноме выявлена высокая степень готовности к апоптозу лимфоцитов, выраженное повышение со-

держания Т-хелперов, интенсивная пролиферация опухолевых клеток и низкая пролиферативная активность стромальных клеток Высокая степень готовности к апоптозу лимфоидных клеток в опухолевой ткани обусловлена репликацией вируса гепатита В в лимфоцитах и может являться одним из механизмов нарушения контроля регуляции клеточного роста

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Для раннего определения активности цирротического процесса необходимо использование ряда показателей ФНО-а (>35 пг/мп), ИЛ-10 (>30 пг/мл), у-глобулинов (>24%), тимоловой пробы (>5 ед), для раннего выявления декомпенсации - повышение уровня ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-6 (>0,5 пг/мл), CD14% (>13%), ЦИК (>120 у е )

2 Для ранней диагностики цирроза печени рекомендовано определение экспрессии a-SMA в ткани печени в ядрах гепатоцитов иммуногистохимиче-ским методом Цирротическая стадия хронического гепатита характеризуется отсутствием гепатоцитов, экспрессирующих молекулы a-SMA

3 Для ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы может быть использовано определение выраженной экспрессии Fas-антигена на лимфоцитах ткани печени, что является показателем высокого риска вероятной малиг-низации

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1 Шапиро И Я Опыт применения комбинированной интерферонотерапии при лечении хронических гепатитов В и С / И Я Шапиро, Ю А Севрук, Ю А Грухин, В П Лисовский // Человек и лекарство материалы V Российского национального конгресса -1998 -С 185

2 Шапиро И Я. Изменение уровней полиплоидии и гипертрофии гепатоцитов цирротически измененной печени крыс / И Я Шапиро, ЕН Сек, А Ю Барановский // Материалы 1 Всероссийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро - 1999» - СПб, 1999 - С 14

3 Шапиро И Я Влияние препарата «Вилон» на показатели регенерации цирротически измененной печени крыс / И Я Шапиро, О С Сек, А Ю Барановский, Б Н Кудрявцев // Материалы 1 Всероссийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро - 1999» - СПб, 1999 -С 15

4 Шапиро И Я Изменение межклеточных взаимодействий при хроническом гепатите В / И Я Шапиро, О С Сек, А Ю Барановский, А А Лыщев // Материалы 1 Всероссийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро- 1999» - СПб, 1999 -С 184

5 Шапиро И Я Цитокиновая система и хронический гепатит В / И Я Шапиро, А Ю Барановский // Рос журн гастроэнтерологии, гепато-логии, коло проктологии - 1999 - Т 9, № 5 Прилож 8 - С 82

6 Шапиро И Я Цитокинокоррегирующая терапия в лечении хронического гепатита В / И Я Шапиро // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии- 1999 -Т9,№5 Прилож 8 -С 103

7 Шапиро И Я Влияние препарата «Вилон» на функциональную активность гепатоцитов циррозной печени крыс / А Ю Барановский, О С Сек, И Я Шапиро, М В Кудрявцева, Б Н Кудрявцев // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии — 1999 - Т 9, № 5 Прилож 8 - С 134

8 Шапиро И Я Активность гидролитических ферментов тонкой кишки у крыс с экспериментальным циррозом печени при лечении «Вилоном» / А Ю Барановский, И Я Шапиро, П В Михайлов // Сочетанные гастроэнтерологические заболевания Взаимосвязанные поражения ротовой полости и органов пищеварения труды 27-й конференции / под ред ЕИ Зайцевой - Смоленск, 1999 - С 14-16

9 Шапиро И Я Стандарты диагностики и лечения заболеваний печени, желчевыводящих путей и поджелудочной железы / А Ю Барановский, И Я Шапиро//Российский семейный врач - 1999 — №4 —С 55-64

10 Шапиро И Я Показатели регенерации цирротически измененной печени крыс при лечении дипептидным препаратом «Вилон» / А Ю Барановский, И Я Шапиро, О С Сек // Перспективные направления в изучения патогене-

за Новые технологии диагностики и лечения в гастроэнтерологии труды 28 конференции / под ред Е И Зайцевой - Смоленск, 2000 -С 210-213

11 Шапиро И Я Изменение внутриорганной температуры при хронических заболеваниях печени / И Я Шапиро, О С Сек // Перспективные направления в изучения патогенеза Новые технологии диагностики и лечения в гастроэнтерологии труды 28-й конференции / под ред Е И Зайцевой -Смоленск, 2000 - С 181-184

12 Шапиро И Я Значение уровня экспрессии адгезивной молекулы 1САМ-1 (СБ54) на иммунокомпетентных клетках периферической крови при хроническом гепатите В / И Я Шапиро, А Ю Барановский, О С Сек // Перспективные направления в изучения патогенеза Новые технологии диагностики и лечения в гастроэнтерологии труды 28-й конференции / под ред ЕИ Зайцевой. - Смоленск, 2000 -С 184-187

13 Шапиро И Я Опыт применения синтетического дипептидного препарата «Вилон» в терапии больных циррозом печени / А Ю Барановский, О С Сек, И Я Шапиро // Рос журн гастроэнтерологии, гепатолологии, колопроктологии - 2000 — Т 10, №1 Прилож 9 - С 18

14 Шапиро И Я Значение уровня экспрессии костимулирующих молекул (С028 и СЭ86) на иммунокомпетентных клетках периферической крови при хронических заболеваниях печени / И Я Шапиро, А Ю Барановский, О С Сек // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии -2000 -Т 10,№ 1 Прилож 9 -С 23

15 Шапиро И Я Внутриорганная температурная реакция как показатель мак-рофагальной активности при хронических заболеваниях печени / И Я Шапиро, А Ю Барановский, О С Сек // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2000 - Т 10, № 1 Прилож 9 - С 31

16.Шапиро И Я Влияние препарата «Вилон» на цирротически измененную печень крыс Регенерация печени и состояние гликогенобразовательной функции гепатоцитов / М В Кудрявцева, Н Н Безбородкина, Е Н Сек,

И Я Шапиро, А Ю Барановский, Б Н Кудрявцев // Цитология - 2000 -Т 42, № 8 - С 758-764

17 Шапиро И Я Молекулярные механизмы повреждения при аутоиммунном гепатите / И Я Шапиро, О С Сек // Рос журн гастроэнтерологии, гепато-логии, колопроктологии-2001 -Т 11,№1 Прилож 12 -С 20

18 Шапиро И Я Молекулярные механизмы течения и исходов хронического гепатита В / И Я Шапиро, О С Сек // Рос журн гастроэнтерологии, гепа-тологии, колопроктологии - 2001 -Т 11,№1 Прилож 12 - С 20

19 Шапиро И Я Цитокиновая активность при циррозе печени / ОС Сек, И Я Шапиро // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии-2001 -Т 11, № 1 Прилож 12 - С 28

20 Шапиро И Я Закономерность изменения глубинной температуры печени человека при ее заболеваниях / И Я Шапиро, О С Сек, А Я Грошев // Научные открытия (Сборник кратких описаний, 2000 г ) - М , 2001 - С 24— 26

21 Шапиро И Я Закономерность изменения глубинной температуры печени при ее заболеваниях / И Я Шапиро, О С Сек, А Я Грошев // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2001 - Т 11, № 1 Прилож 12 —С 31

22 Шапиро И Я , Особенности иммунного ответа и цитокиновый статус при различных вариантах течения цирроза печени / И Я Шапиро, Ок Сун Сек, Б Е Кноринг // Медицинская иммунология - 2002 - Т 4, № 4-5 -С 545-552

23 Шапиро И Я Роль цитокинов в повреждении и регенерации печени / И Я Шапиро // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им ИИ Мечникова - СПб,2002 -№3 -С 103-106

24 Шапиро И Я Клинико-иммунологические особенности течения цирроза печени / И Я Шапиро, А В Шабров, А И Горелов // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им И И Мечникова - СПб , 2002 - № 3 - С 106-111

25 Шапиро И Я Клинико-прогностическая значимость показателей иммунного и цитокинового статуса при циррозе печени вирусной этиологии / И Я Шапиро, О С Сек, Б Е Кноринг // Медицинская иммунология -2002 -Т 4,№2 -С 169

26 Шапиро И Я Роль питательной поддержки при циррозе печени / И Я Шапиро, О С Сек, Г А Пронина // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии-2002 -Т 12,№1 Прилож 16 -С 22

27 Шапиро И Я. Иммунологические особенности течения цирроза печени / О С Сек, И Я Шапиро // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2002 -Т 12, №1 Прилож 16 - С 27

28 Шапиро И Я Цитокиновый статус при различных вариантах течения цирроза печени /ОС Сек, И Я Шапиро // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2002 -Т 12,№1 Прилож 16 -С 28

29 Шапиро И Я Особенности течения гемоконтактных вирусных гепатитов в зависимости от состояния внешней среды Пособие для врачей, утвержденное председателем секции Ученого Совета МЗ РФ А В Истоминым Протокол №8 от 0112 03 г / ТВ Сологуб, M Г Романцов, M Ю Ледванов, В Г Маймулов, В В Нечаев, И Я Шапиро и др - СПб, 2004 -93 с

30 Шапиро И Я Экспрессия SMA-a в печени при различных вариантах течения и исходах хронического гепатита В / И Я Шапиро, А В Шабров, Т В Сологуб и др // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2004 -Т 14, № 1 Прилож 22 - С 30

31 Шапиро И Я Регенераторная способность печени при различных вариантах течения и исходах ХГ В / И Я Шапиро, А В Шабров, Т В Сологуб и др // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2004 -Т 14, № 1 Прилож 22 - С 65

32 Шапиро И Я Клинико-молекулярные взаимосвязи хронического гепатита и гепатоцеллюлярного рака, ассоциированных с вирусом гепатита В / И Я Шапиро, А В Шабров, В Е Карев и др // Архив патологии - 2005 -Т 67, № 2 - С 6-10

33 Шапиро И Я , Патогенетические аспекты хронического гепатита и гепато-целлюлярной карциномы, ассоциированных с вирусом гепатита В / И Я Шапиро, А В Шабров, Т В Сологуб и др // Инфекционные болезни -2005 -Т 3,№2 -С 62-65

34 Шапиро И Я Современные перспективные направления в изучении патогенеза хронического вирусного гепатита / В А Карев, В А Цинзерлинг, И Я Шапиро и др // Медицина XXI век - 2006 - №2 - С 48-51

35 Шапиро И Я Цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома, ассоциированная с HBV-инфекцией клинико-морфологические аспекты / И Я Шапиро, В Е Карев // Материалы V съезда научного общества гастроэнтерологов России и XXXII сессии Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии - М, 2005 - С 253

36 Шапиро И Я Патогенетические аспекты фиброгенеза у больных с хронической HBV-инфекцией / И Я Шапиро, В Е Карев // Материалы V съезда научного общества гастроэнтерологов России и XXXII сессии Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии - М, 2005 - С 318

37 Способ диагностики аутоиммунных поражений печени у больных хроническими гепатитами пат 2247387 РФ / И Я Шапиро [и др ], Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им ИИ Мечникова - 2003115886/15, заявл 27 05 2003, опубл 27 02 2005 Бюл 6

38 Шапиро И Я , Шабров А В, Карев В Е Роль гепатоцитов в процессе фиброгенеза у больных хроническим гепатитом В / И Я Шапиро, А В Шабров, В Е Карев // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии —2005 -Т 15, №1 Прилож 26 - С 57

39 Шапиро И Я Клинико-молекулярные механизмы течения и исхода хронического гепатита В / И Я Шапиро, А В Шабров, Т В Сологуб и др // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии — 2006 — Т 16, № 1 Прилож 27 - С 29

40 Шапиро И Я и др Особенности регенераторной способности клеток печени при ХГ В и С / В Е Карев, А В Шабров, Т В Сологуб, И Я Шапиро и др // Рос журн гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии -2006 - Т 16, № 1 Прилож 27 - С 32

41 Шапиро И Я Гепатоцеллюлярная карцинома, ассоциированная с НВУ (Особенности эпидемиологии, клиники и морфологии Клеточно-молекулярные аспекты патогенеза и диагностики) Монография

/ И Я Шапиро, В Е Карев, науч ред А В Шабров - М Триада, 2007 - 167с

ЛР №020365

Подписано в печать 03 09 2007 г Заказ № 1091 Формат бумаги 60x84 Тираж 100 экз уел пл 1,5

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им И И Мечникова Типография ООО «КАРО» Санкт-Петербург, Красногвардейская пл , д 3

Актуальность проблемы. Хронические заболевания печени, ассоциированные с вирусом гепатита В, представляют собой одну из актуальных проблем внутренней медицины. Уровень заболеваемости хроническим гепатитом В в последние годы имеет тенденции к росту и в 2005 году составил 13,9 на 100 ООО населения [19]. У лиц, инфицированных вирусом гепатита В, возможна трансформация с развитием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы в 15-30% случаев. Учитывая, что в настоящее время возраст заболевших гепатитом В составляет преимущественно от 15 до 29 лет, специалисты прогнозируют значительное повышение частоты неблагоприятных отдаленных исходов заболевания в будущем [40, 132,298, 299].

В прогнозировании летальности характер течения цирротнческой стадии хронического гепатита В имеет определяющее значение. При компенсированном циррозе 10-летняя выживаемость составляет 47,%, а при декомпенсации процесса 5-летняя выживаемость - только - 16%. В перечне причин смерти от онкологических заболеваний гепатоцеллюлярная карцинома занимает третье место у мужчин и седьмое место - среди женщин [16].

Таким образом, актуальность хронических заболеваний печени, ассоциированных с вирусом гепатита В, обусловлена высоким уровнем заболеваемости, неблагоприятными исходами и значительной летальностью на определенных этапах развития патологического процесса.

К настоящему времени большинство исследователей считают, что патологические состояния, вызываемые вирусом гепатита В, можно рассматривать как единый процесс - от острого гепатита через хронический гепатит и цирроз печени к гепатоцеллюлярной карциноме [37]. Несмотря на преимущественно общие клинико-биохимические симптомы и синдромы, для каждого из этапов патологического процесса характерны особенности клинического течения. С точки зрения патофизиологической сущности рассматриваемых нозологических форм (хронический гепатит, цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома), объединяющим для них является вирус гепатита В и хроническое воспаление печени, в основе которого лежит повреждение, пролиферация и фиброгенез. Вместе с тем для каждой клинической формы заболевания характерно преобладание одного из перечисленных процессов. Для цирроза печени характерно постоянное повреждение, непрерывная регенерация и несбалансированный фиброгенез.

В основе канцерогенеза лежит нарушение регуляции клеточного роста. Вместе с тем, патогенез гепатоцеллюлярной карциномы и цирроза печени на молекулярном уровне изучен недостаточно.

Современные достижения в области фундаментальной иммунологии позволяют изучать и оценивать основные молекулы, участвующие в реализации процессов повреждения, регенерации и фиброгенеза печеночной ткани, способствуют совершенствованию и созданию новых методов диагностики.

Выявление на молекулярном уровне факторов, приводящих к несбалансированности фиброгенеза, позволило бы определить механизмы цирро-тизации процесса, его раннюю диагностику и прогноз. Наряду с этим отсутствие эффективных фармакологических средств антифибротической направленности является одной из основных проблем гепатологии.

До настоящего времени отсутствуют молекулярные тесты, способствующие диагностике (в том числе ранней) гепатоцеллюлярной карциномы. Объектом углубленного изучения до сих нор является преимущественно опухолевая ткань, в то время как ткань, окружающая опухоль, остается за рамками исследования. Молекулярный уровень исследований способствует более глубокому и обоснованному пониманию характера клинических изменений. При этом молекулярная диагностика имеет определяющее значение при разработке методов молекулярного лекарственного воздействия. Работы этого направления представляются актуальными в связи с созданием реком-бпнантных цитокипов и разработкой методов цитокниовой и антицитокиновой терапии, особенно в таких интенсивно развивающихся областях как инфекционные и онкологические заболевания [17, 69].

Указанные обстоятельства определили цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования: выделение информативного комплекса клинико-биохимических, иммунологических и иммуногистохимических показателей для диагностики и прогнозирования течения и исходов хронических заболеваний печени, ассоциированных с HBV.

Задачи исследования.

1. Изучить клинико-биохимические, иммунологические и морфологические особенности течения у больных ХГ В, ЦП В и ГЦК, ассоциированной с IIBV-инфекцией.

2. Оценить особенности пролиферативной активности гепатоцитов и синусоидных клеток печени па всех этапах течения и исходов ХГ В

3. Определить активность фиброгенеза и степень выраженности фиброза в печеночной ткани у больных ХГ Вна разных стадиях процесса.

4. Уточнить характер клеточного состава воспалительного инфильтрата в печени на различных этапах течения и исходов ХГ В.

5. Выявить особенности экспрессии про- и антиапоптозных генов в лимфоцитах печени при различных вариантах течения и исходов ХГ В.

6. Выявить взаимосвязи иммуногистохимических показателей с особенностями клинико-биохимического и морфологического характера течения и исходов ХГ В.

7. Изучить иммунный и цитокиновый статус у больных ЦП В и его взаимосвязь с характером течения процесса.

8. Выделить наиболее информативный комплекс клинико-биохими-ческих, иммуногистохимических и иммунологических показателей для диагностики и прогноза течения и исходов ХГ В.

Положения, выносимые на защиту.

1. При ХГ В нролиферативная активность гепатоцитов зависит от уровня содержания сывороточных АлАТ, выраженности индекса гистологической активности, а также от наличия HBV ДНК в биоптатах печени и серологических маркеров репликации вируса гепатита В.

2. Отношение FasL к Fas и к bcl-2 (IFbcl) отражает степень готовности к апоптозу лимфоцитов. При ХГ В с выраженной клинико-морфологической активностью воспалительного процесса характерно снижение индекса готовности к апоптозу лимфоцитов печени.

3. При ЦП В и ГЦК, ассоциированной с вирусом гепатита В, величина отношения FasL к Fas и к bcl-2 (IFbcl) отражает умеренную степень повреждения печеночной ткани и высокую степень готовности к апоптозу лимфоцитов печени с максимальным значением его в опухолевой ткани, что может явиться одним из механизмов снижения контроля регуляции клеточного роста.

4. Уровень экспрессии a-SMA на непаренхиматозных клетках печени не взаимосвязан с гистологическим индексом стадии заболевания и активнетыо воспаления у больных хроническим гепатитом В и циррозом печени В. Оценка уровня экспрессии a-SMA в ядрах гепатоцитов оказалась наиболее информативной для раннего выявления цирротического процесса и взаимосвязана с тяжестью фиброза и активностью воспаления у больных хроническим гепатитом В. Нарастание активности воспаления и степени фиброза сопровождается снижением содержания a-SMA в ядрах гепатоцитов и исчезновением ее экспрессии на цирротической стадии хронического гепатита В.

Научная новизна.

Впервые изучена нролиферативная активность гепатоцитов и синусоид-ных клеток печени при различных вариантах течения и исходов хронического гепатита В и выявлена экспрессия гладкомышечного актина (a-SMA) в ядрах гепатоцитов при различных стадиях процесса.

Определена взаимосвязь факторов, участвующих в хроническом повреждении, регенерации и фиброгенезе печени, с учетом морфологических и кли-нико-биохимических характеристик патологического процесса и выполнена комплексная оценка разнонаправленных процессов в печени (повреждение, регенерация и фиброгенез) на всех этапах течения и исходов хронического гепатита В.

Впервые показана прогностическая значимость содержания CD14+ (рецептора к липополисахариду) в периферической крови у больных циррозом печени В для определения тяжести процесса.

Получены новые данные о взаимосвязи выраженности факторов иммунитета, уровня про- и противовоспалительных цитокинов с особенностями течения цирротического процесса.

Впервые установлена взаимосвязь эндогенной продукции цитокинов с иммунологическими, биохимическими и гематологическими показателями крови. Показано, что комплексная оценка показателей отличается более высокой информативностью в определении характера процесса, чем их отдельное исследование у больных цирротической стадией хронического гепатита В.

Практическая значимость. Выделен комплекс диагностически значимых критериев для прогноза течения и тяжести цирроза печени. Наиболее информативными тестами для раннего определения активности процесса являются высокий уровень ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-10 (>30 пг/мл), у-глобулинов (>24%), тимоловой пробы (>5ед); для раннего выявления декомпенсации - повышение уровня ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-6 (>0,5 пг/мл), CD14% (>13%), ЦИК (>120 у.е.).

Выявленные иммуногистохимическим методом отличия в способности гепатоцитов к экспрессии a-SMA-молекул у больных ХГ, позволяют использовать этот тест в качестве диагностического. Цирротическая стадия ХГ харастеризуется отсутствием гепатоцитов, экспрессирующих молекулы а-SMA.

Показано, что выраженная экспрессия Fas-антигена на лимфоцитах цнрротической печени является показателем высокого риска вероятной ма-лигнизации, что может быть использовано для ранней диагностики ГЦК.

Апробация н реализация работы. Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на X Всероссийском съезде инфекционистов (Санкт-Петербург, 2004) и V съезде научного общества гастроэнтерологов (Москва, 2005), Пятой Российской Гастроэнтерологической Неделе (Москва, 1999); Седьмой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2002); 4-ом Российском научном форуме с международным участием (Санкт-Петербург - Гастро-2002); 6-ом СлавяноБалтийском научном форуме («Санкт-Петербург - Гастро-2004»); Девятой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2004); Десятой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2005. Диплом за лучший научный доклад).

Результаты исследования внедрены в работу Центральной медико-санитарной части № 122 Федерального медико-биологического агентства, Федерального государственного агентства «Северо-западный окружной медицинский центр Росздрава», городской клинической больнице №1 г. Тольятти, а также в учебных курсах и циклах, проводимых на кафедре госпитальной терапии СПбГМА им. И.И. Мечникова. Разработано пособие для врачей «Особенности течения гемоконтактных вирусных гепатитов в зависимости от состояния внешней среды», утв. председателем секции Ученого Совета МЗ РФ А.В.Истоминым. Протокол № 8 от 01.12.03 г., соавт. СологубТ.В., Роман-цов М.Г., Ледванов M.IO. и др. (СПб, 2004. - 93 с.) и способ диагностики аутоиммунных поражений печени. Патент на изобретение № 2247387, соавторы: Шабров А.В., Карев В.Е., Сологуб Т.В. Предложен способ диагностики цнрротической стадии хронического вирусного гепатита, заявка на изобретение №

2005139428, соавторы: ШабровА.В., Кареев В.Е., Сологуб Т.В., Горелов А.И. Получен диплом № 155 на открытие «Закономерность изменения глубинной температуры печени человека при ее заболеваниях», 27 октября 2000 г.

По материалам диссертации опубликовано 41 научных работ, из них 12 в ведущих рецензируемых изданиях.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 302 страницах машинописного текста, состоит из введения, 8 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 408 источников, в том числе 137 отечественных и 271 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 91 таблицами, 48 рисунками и 7 схемами.

259 ВЫВОДЫ

1. Больные хроническим гепатитом В в фазе репликации характеризуются высокой пролиферативной активностью гепатоцитов наряду со снижением готовности к апоптозу лимфоцитов печени.

2. При хроническом гепатите В установлена достоверная прямая взаимосвязь пролиферативной активности гепатоцитов с содержанием цитоток-сических лимфоцитов печени и клинико-биохимическими, морфологическими и вирусологическими параметрами активности процесса.

3. Декомпенсированная стадия цирроза печени В отличается высокой степенью готовностью к апоптозу лимфоцитов, повышенным содержанием Т-хелперов и низкой пролиферативной активностью гепатоцитов.

4. Чрезмерная продукция ФНО-а, ИЛ-10 и ИЛ-6 с преимущественной недостаточностью факторов клеточного иммунитета характерна для тяжелых прогрессирующих форм цирроза печени. Сочетание умеренного повышения концентрации цитокинов с выраженным клеточным ответом и невысоким гуморальным указывает на благоприятное течение процесса.

5. Выделен комплекс диагностически значимых критериев для прогноза течения и тяжести цирроза печени: для раннего определения активности процесса характерно высокий уровень ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-10 (>30 пг/мл), у-глобулинов (>24%), тимоловой пробы (>5 ед); для раннего выявления декомпенсации - повышение уровня ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-6 (>0,5 иг/мл), CD 14%) (>13%), ЦИК (>120 у.е.).

6. При хроническом гепатите В установлена отчетливая взаимосвязь тяжести процесса с экспрессией SMA-a в ядрах гепатоцитов и отсутствие таковой с экспрессией SMA-a на непаренхиматозных клетках печени. Нарастание активности воспаления и степени фиброза сопровождается снижением содержания a-SMA в ядрах гепатоцитов и исчезновением ее экспрессии в цирротической ткани больных циррозом печени В. Оценка уровня экспрессии SMA-a в ядрах гепатоцитов является информативным показателем для раннего выявления цирроза печени.

7. Для больных гепатоцеллюлярной карциномой, ассоциированной с вирусом гепатита В, характерно сочетание умеренной степени готовности к апоптозу лимфоцитов в неопухолевой ткани, выраженной экспрессией Fas-рецептора, повышенным содержанием Т-хелперов печени и низкой пролифе-ративной активностью гепатоцитов.

8. В опухолевой ткани при гепатоцеллюлярной карциноме выявлена высокая степень готовности к апоптозу лимфоцитов, выраженное повышение содержания Т-хелперов, интенсивная пролиферация опухолевых клеток и низкая пролиферативная активность стромальных клеток. Высокая степень готовности к апоптозу лимфоидных клеток в опухолевой ткани обусловлена репликацией вируса гепатита В в лимфоцитах и может являться одним из механизмов нарушения контроля регуляции клеточного роста.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выделен комплекс диагностических значимых критериев для прогноза течения и тяжести цирроза печени. Наиболее информативными тестами для раннего определения активности процесса являются высокий уровень ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-10 (>30 пг/мл), у-глобулинов (>24%), тимоловой пробы (>5 ед); для раннего выявления декомпенсации - повышение уровня ФНО-а (>35 пг/мл), ИЛ-6 (>0,5 пг/мл), CD14% (>13%), ЦИК (>120 у.е.).

2. Выявленные иммуногистохимическим методом отличия в способности гепатоцитов к экспрессии a-SMA-молекул у больных ХГ, позволяют использовать этот тест в качестве диагностического. Цирротическая стадия ХГ характеризуется отсутствием гепатоцитов, экспрессирующих молекулы a-SMA.

3. Выраженная экспрессия Fas-антигена на лимфоцитах цирротической печени является показателем высокого риска вероятной малигнизации, что может быть использовано для ранней диагностики ГЦК.