Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Клинико-лабораторный мониторинг за развитием повреждающего воздействия Staphylococcus aureus на лизосомальный и генетический аппараты лейкоцитов крови человека

Актуальность проблемы.

Одним из перспективных направлений в решении ряда важнейших иммунологических проблем медицины является изучение функционального состояния клеточного звена иммунитета. Контроль над интенсивностью процесса секреторной дегрануляции лейкоцитов в клинических условиях необходим для прогнозирования осложнений, связанных с генерализацией воспаления, а также для повышения эффективности проводимой терапии (Ко-зинец Г.И. с соавт., 2001; Alvarer-Barrientos et al., 2000).

Вдвое снизить показатель смертности от тяжелого стафилококкового сепсиса позволяет внутривенное введение ингибиторов лейкоцитарных про-теиназ, но для успешного применения ингибиторной терапии необходима информация о состоянии лизосомального аппарата лейкоцитов крови пациентов па различных стадиях патологического процесса (Сыновец А.С., Левицкий А.П., 1985; Carulli, 1996). Прежде всего, необходим мониторинг состояния системы эластаза-ипгибиторы, так как лейкоцитарная эластаза, играющая ключевую роль в деградации факторов вирулентности патогенных бактерий и в обеспечении эффективного киллинга их активными фагоцитами (Garcia et al., 1998; Qureshi et al., 1999; Weinrauch et al., 2002), обладает широкой субстратной специфичностью. При интенсивной азурофилыюй дегрануляции нейтрофилов в целом, развивающейся на стадии генерализации воспалительного процесса, она оказывает наиболее разрушительное действие на биологические структуры. Развитие полиорганной и/или дыхательной недостаточности, тромбо-геморрагического синдрома при перитоните и сентицемии объясняют резким повышением уровня активности эластазы в плазме крови пациентов (Вагапова Л.Б.Д987; Нешкова Е.А. с соавт., 1993; Доценко В.Л. с соавт., 1994, 2000, 2001; Aasen, Ohlsson, 1978; Lengas et al., 1994; Liou et al., 1995; Owen et al., 1995,1997; Fujie et al., 1999).

С другой стороны, причину развития у пациентов инфекционных осложнений, связанных с генерализацией воспалительного процесса, объясняют в настоящее время задержкой апоптоза иейтрофилов, которые не в состоянии реализовать свой мощный бактерицидный потенциал (дегрануляцию) на месте внедрения инфекционного агента (Маянский А.Н. с соавт., 1999; Cornelis et al., 1998), а также активацией бактериальными токсинами гибели лимфоцитов по типу индуцированного апоптоза (Ковальчук JI.B., Чередеев А.Н., 1998; Козинец Г.И. с соавт.,2001; Zychlinsky, Sansonetti, 1997). Поэтому, особую актуальность и практическую значимость приобретают исследования, направленные на выяснение механизмов, с помощью которых патогенные бактерии нарушают процесс генетически запрограммированной гибели клеток организма человека и животных, вызывая характерные для индуцированного апоптоза дегенеративные изменения в лизосомалыюм аппарате (дег-рануляция) и ядерном хроматине (деградация молекулы ДНК) лейкоцитов (Weinrauch, Zychlynsky, 1999; Cornelis et al., 1998; Kravtsov et al., 2001,2002; Талаев В.Ю. с соавт., 1999; Козинец Г.И. с соавт., 2001; Понякина И.Д., Лебедев К.А., 2002).

Реальный путь к решению актуальной проблемы количественной оценки интенсивности процессов дегрануляции и апоптоза лейкоцитов крови пациентов - это освоение и внедрение в клиническую практику современных автоматизированных методов цитологического анализа. Наряду с длительными и трудоемкими биохимическими методами оценки эластазной активности (в сыворотке крови и воспалительных экссудатах) и деградации ДНК лейкоцитов (в агарозном геле), для мониторинга состояния в лейкоцитах молекулы ДНК и лизосомальных гранул, содержащих эластазу, начинают применяться новые методы цитохимии нуклеиновых кислот и клеточной эн-зимологии, основанные на использовании флуоресцирующих красителей и преимуществ принципа импульсной проточной цитофлуориметрии отдельных клеток (Ковальчук JI.B., Чередеев А.Н., 1998; Хайдуков C.B., 1998; Ма-янский А.Н. с соавт., 1999; Abrams et al., 1983; Carulli, 1996; Alvarez-Barrientos et al., 2000). Экспериментально-методическая основа для автоматизации цитологических исследований создается в модельных экспериментах in vitro, где в качестве индукторов процессов секреторной дегрануляции и апоптоза лейкоцитов крови применяются различные виды бактерий, либо их очищенные факторы вирулентности и патогенности (Weinrauch, Zychlynsky, 1999; Кравцов A.JI. с соавт., 1999; ICravtsov A.L. et al., 2001, 2002).

Литературные данные свидетельствуют, что даже такой классический микробиологический объект как Staphylococcus aureus еще недостаточно изучен в качестве индуктора дегенеративных изменений в лейкоцитах крови человека. Установлена способность опсонизировапных клеток золотистого стафилококка вызывать in vitro секреторную дегрануляцию нейтрофилов с высвобождением лейкоцитарной эластазы (Ohlsson, Olsson, 1977; Figueredo et al., 1999). Получены данные о важной роли процесса дегрануляции и высвобождаемой при дегрануляции эластазы в запуске механизма гибели лейкоцитов по типу апоптоза (Peterszegi G. et al., 1999). Уже идентифицированы токсины стафилококка, запускающие апоптоз лейкоцитов в условиях in vivo и in vitro (Jenkinson E. et al.,1989; Kabelitz D. et al., 1992; Jonas D. et al., 1994). Однако процессы секреторной деграпуляции и деградации ДНК лейкоцитов в цельной крови человека, инфицированной in vitro клетками золотистого стафилококка, не изучались. В доступной нам литературе нет сведений о динамике и последовательности развития этих процессов при моделировании стафилококковой бактериемии т vitro, о зависимости их от жизнеспособности бактерий, исходной микробной нагрузки, а также от такого важнейшего показателя как фагоцитарная и бактерицидная активность лейкоцитов крови человека. Для получения этой важной информации совместно с микробиологическими методами оценки бактерицидного эффекта и биохимическими методами контроля эластазной активности не применялись современные автоматические методы проточно-цитофлуориметрического анализа, позволяющие осуществлять мониторинг состояния лизосомалыюго аппарата и ядерного хроматина десятков тысяч отдельных лейкоцитов непосредственно в цельной крови пациентов (Melamed et al., 1974; Carulli, 1996; Alvarez-Barrientos et al., 2000).

Цель работы

Целью-диссертационной работы явилось изучение процессов деграпуляции и деградации ДНК лейкоцитов в крови человека, инфицированной in vitro клетками Staphylococcus aureus и создание экспериментально-методической основы для прогнозирования исхода инфекционных осложнений у пациентов.

Задачи исследования

1) Изучить стабильность состояния лизосомального аппарата и ядерного хроматина лейкоцитов в различные сроки инкубации неинфицированной бактериями крови человека при 37°С в условиях in vitro.

2) Установить зависимость индуцируемых S.aureus изменений в лизосо-мальных гранулах и в молекуле ДНК лейкоцитов от жизнеспособности добавляемых в кровь микробных клеток.

3) Изучить зависимость эффективности киллинга S. aureus в крови человека от фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов, исходной микробной нагрузки и от срока инкубации клеток цельной инфицированной крови при 37°С.

4) Изучить динамику развития процессов деграпуляции и деградации ДНК лейкоцитов при различной эффективности киллинга опсонизирован-ных клеток S. aureus активными фагоцитами в крови с нормальной и инакти-вированной сывороткой.

5) Определить активность лейкоцитарной эластазы и активность сывороточных ингибиторов протеиназ при развитии индуцированной стафилококком секреторной дегрануляции нейтрофилов.

6) Получить информацию о состоянии лизосомального аппарата и ядерного хроматина лейкоцитов крови, а также об уровне активности лейкоцитарной эластазы в сыворотке крови у инфицированных новорожденных отделения реанимации, относящихся к группе риска с точки зрения реализации и исхода инфекционного процесса.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые за счет1 комплексного использования микробиологических, биохимических и автоматизированных цитохимических методов исследования изучены изменения в лизосомальном аппарате и ядерном хроматине лейкоцитов, развивающиеся in vitro при эффективном и неэффективном киллинге клеток Staphylococcus aureus в цельной дефибринированной крови человека. Получены новые данные о зависимости интенсивности и динамики развития этих изменений от фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов и исходной концентрации в крови живых микробных клеток, а также от уровня активности высвобождаемой из азурофильных гранул фагоцитов эластазьт.

Новыми являются данные биохимических и цитофлуориметрических исследований, свидетельствующие, что снижение фагоцитарной и бактерицидной активности лейкоцитов крови человека по отношению к опсонизи-рованным клеткам S. aureus (в присутствии инактивированной сыворотки), приводит в условиях in vitro к задержке повреждения лейкоцитов крови человека, к резкому снижению исходной микробной нагрузки, способной выз вать интенсивные дегенеративные изменения в лейкоцитах.

Впервые на модели S. aureus получена важная информация, что индикатором высвобождения молекул гидролитического фермента эластазьт из азурофильных гранул фагоцитов крови человека является утрата способности этих гранул аккумулировать в присутствии живых бактерий краситель акридиновый оранжевый. На основе этой информации разработан и предложен новый методологический подход к оценке азурофильной дегрануляции лейкоцитов крови человека методом проточной цитофлуориметрии, альтерна-» тивный биохимическому методу оценки секреторной дегрануляции, который открывает новые возможности для прогнозирования инфекционных осложнений у пациентов в клинических условиях.

Впервые методом проточной цитофлуориметрии проведено сравнительное исследование состояния лизосомального аппарата и ядерного хроматина лейкоцитов крови у инфицированных новорожденных отделения реанимации. Установлена прямая корреляция интенсивности дегенеративных изменений в лизосомалыгом аппарате и ядерном хроматине лейкоцитов крови новорожденных с уровнем активности в плазме крови лейкоцитарной элас-тазы, а также со степенью тяжести и исходом патологического процесса.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

По результатам работы составлены методические рекомендации «Оценка уровня азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека с использованием проточной цитометрии», которые одобрены Ученым Советом Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (протокол № 6 от 06.07.01) и утверждены директором РосНИП-ЧИ «Микроб».

В результате проведённых исследований установлена эффективность использования цитофлуориметричсского метода оценки состояния лизосомаль-ного и генетического аппаратов ПЯЛ на ранних этапах обследования новорождённых группы риска по развитию инфекционного процесса. Данный метод обеспечивает быстроту получения результатов при исследовании микрообъёмов крови, позволяет выявлять индивидуальные особенности, помогает ограничить круг детей, которым необходимо проведение биохимических исследований. Возможность динамического контроля за данными параметрами позволяет установить конкретные сроки проведения биохимических исследований активности эластазы и протеииазных ингибиторов в сыворотке крови больных, оцепить эффективность проводимой терапии, прогнозировать развитие осложнений и исход заболевания.

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения работы доложены на VI Российско-Итальяской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» 14-16 декабря 2000г. (Санкт-Петербург), международной конференции Saratov Fall Meeting'2000: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II, oct. 3-6, 2000 (Saratov, Russia), международной конференции Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III, oct. 2-5, 2001 (Saratov, Russia), научно-практической конференции с международным участием, посвящ. 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии СГМУ «Окружающая среда и здоровье» (2002).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Попадая в кровь человека, живые клетки S. aureus вызывают через 3-4 ч. высвобождение из азурофильных гранул фагоцитов эластазы с утратой способности лизосомального аппарата адсорбировать краситель акридиновый оранжевый. Такая дегрануляция развивается in vitro только в активных фагоцитах и сопутствует эффективному киллингу S. aureus. Она приводит к снижению общей аптитрипсической активности крови без повышения в нормальной сыворотке активности свободной лейкоцитарной эластазы.

2. Процесс деградации ДНК в активных фагоцитах, осуществляющих эффективный киллинг in vitro клеток S. aureus, начинается после завершения в них процесса дегрануляции и заканчивается к 6 ч. На остальные лейкоциты (лимфоциты и неактивные фагоциты) повреждающий эффект быстро погибающих в крови бактерий не распространяется и стафилококк в дозах менее 1 м.к./фагоциг не в состоянии вызвать интенсивное повреждение лейкоцитов, обладающих высокой фагоцитарной и бактерицидной активностью.

3. Снижение фагоцитарной активности нейтрофилов крови на 50 % нормы приводит к резкому снижению эффективности киллинга бактерий в условиях in vitro и, как следствие, к развитию интенсивных дегенеративных изменений в лейкоцитах по исследуемым параметрам с задержкой по времени. В таких условиях в 100 раз снижается доза инфекционного агента, вызывающая повреждение лейкоцитов крови.

4. Доля лейкоцитов крови пациентов, находящихся при инфекциях в состоянии азурофильной дегрануляции и несущих молекулу ДНК на стадии деградации, может служить показателем степени тяжести заболевания в клинических условиях. Быстрое определение данных параметров методом проточной цитофлуориметрии может бьпь использовано для прогнозирования у пациентов развития инфекционных осложнений, а также исхода патологического процесса.

14

ВЫВОДЫ

1. При отсутствии бактерий в крови человека в течение суток при 37°С в условиях in vitro сохраняется стабильное состояние лизосомального аппарата и ядерного хроматина лейкоцитов - дегрануляция азурофильных гранул с высвобождением эластазы и деградация ядерного хроматина лейкоцитов не развиваются.

2. Живые клетки S. aureus, попадая в кровь человека, вызывают интенсивную дегрануляцию активных фагоцитов с высвобождением из азурофильных гранул эластазы. Дегрануляция завершается к 4 ч развития фагоцитарной реакции, сопутствует эффективному киллипгу клеток S. aureus в условиях in vitro и, по данным проточной цитофлуориметрии, приводит к полной утрате исходной способности азурофильных гранул моноцитов и грануло-цитов крови человека аккумулировать большое количество молекул красителя акридинового оранжевого.

3. Через 2 ч после завершения процесса дегрануляции в активных фагоцитах начинается деградация молекулы ДНК, при полном сохранении исходного содержания ДНК в неактивных фагоцитах и лимфоцитах.

4. Клетки S. aureus, убитые перед добавлением в кровь человека нагреванием или антибиотиком, не вызывают азурофилыюй дегрануляции фагоцитов с высвобождением эластазы и развития дегенеративных изменений в ядерном хроматине лейкоцитов.

5. Живой стафилококк при исходных микробных концентрациях 1()7 м.к./ мл крови и выше в присутствии нормальной сыворотки вызывает азурофильную дсгрануляцию и деградацию ДНК около 100 % фагоцитов. При микробных нагрузках менее 1 м.к./ фагоцит доля поврежденных клеток уменьшается прямо пропорционально снижению микробной концентрации. Дозы ниже 105 м.к. /мл не в состоянии вызвать повреждение лизосом и молекулы ДНК более 5 % лейкоцитов крови человека даже через сутки инкубации.

6. Утрата способности 50 % гранулоцитов крови человека адсорбировать и поглощать живые опсопизированные клетки S. aureus (в присутствии ипактивированной сыворотки) в 30 раз снижает эффективность киллинга бактерий, что приводит к 100-кратному снижению исходной микробной нагрузки, способной вызвать с задержкой по времени интенсивные дегенеративные изменения в лейкоцитах крови по исследуемым параметрам (не только в фагоцитах, но и лимфоцитах).

7. При инактивации термолабильных сывороточных ингибиторов элас-тазы задержка развития интенсивной азурофильной дегрануляции нейтро-филов с высвобождением этого гидролитического фермента приводит к развитию дисбаланса в системе эластаза-ингибиторы и, как следствие, к достоверному повышению в сыворотке крови эластазпой активности.

8. У новорожденных внутриутробное инфицирование вызывает дегенеративные изменения в лизосомальном аппарате и ядерном хроматине лейкоцитов. Быстрое определение доли поврежденных лейкоцитов крови методом проточной цитофлуоримстрии может быть использовано для мониторинга и прогнозирования исхода патологического процесса у инфицированных новорожденных.

160

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В клинической практике одной из важнейших проблем является автоматизация цитологических исследований с целью быстрой детекции и количественной оценки изменений в ключевых биохимических показателях (содержание на клетку ДНК, РНК, суммарного белка, лизосомальпых гидролитических ферментов и т.д.), характеризующих стабильность клеток иммунной системы организма (КгиШ Н.8.,1982; Исаков В.Л. с соавт., 1988; Козипец Г.И. с соавт., 2001). Такой подход уже давно используется при диагностике и лечении лейкозов (В. Вагк^е е1 а1., 1976; Апс1гссГГ М. е1 а1., 1980), а благодаря открытию поддающегося регуляции механизма генетически контролируемой клеточной гибели (А. М. Маянский с соавт., 1997), он расширяет возможности в изучении патогенеза инфекционных заболеваний, возбудители которых обладают способностью нарушать механизм апоптоза, индуцируя в клетках иммунной системы организма хозяина деградацию молекулы ДНК и лизосомального аппарата (СотеНэ с! а1., 1998; \¥етгаис11, ZycЫintsky, 1999; АЬ^агег-ВатепШз е1 а1., 2000).

Известно, что адекватная количественная оттенка клеточных параметров инструментальными методами, учитывающими результат биохимических реакций, возможна только при использовании клеточных взвесей высокой концентрации (не менее 107 КЛСТОК В 1 МЛ), КОТОрЫе Не всегда удае'ГСЯ ПОЛучить в клинических условиях. Более того, биохимическими методами может быть получена только усредненная информация по всей гетерогенной популяции клеток в целом, что полностью исключает возможность обнаружения и оценки диагностически значимых функциональных сдвигов, происходящих в клетках на субпопуляциоипом уровне. Выделение клеток из крови и других биологических жидкостей связано с дополнительными затратами средств и времени, с большими клеточным потерями, а также с еще недостаточно изученными изменениями исходных клеточных параметров, что очень сложно учесть и проконтролировать (Kruth H., 1982; Abrains W. et al., 1983; Kell D. etal., 1991; Telford et al., 1994; Carulli.G, 1996).

Информация о содержании, структуре биологически активных веществ в отдельных клетках и о степени внутриклеточных функциональных сдвигов по исследуемым биохимическим параметрам может быть получена с использованием цитохимических, гистохимических методов анализа или современных методов клеточной энзимологии, определяющих внутриклеточную активность ферментов по скорости гидролиза специфических флуорогенных субстратов (Хайдуков C.B., 1998). Однако исследования на микроскопах, снабженных фотодетектором, либо сканирующих цитометрах, сопряжены с очень низкой производительностью труда и позволяют изучать небольшое число клеток (Исаков B.JI. с соавт.,1988).

Все эти проблемы неизбежно возникают, например, когда необходимо пе просто установить факт деградации внутриклеточной ДНК как основного биохимического признака гибели клетки, а быстро определить у конкретного пациента долю поврежденных лейкоцитов, несущих ДНК на стадии деградации (Telford et al., 1994; Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., 1998; Кози-пец Г.И. с соавт., 2001). Они возникают также при контроле за активностью биохимического маркера воспалительного процесса - лейкоцитарной элас-тазы (Abrains W. et al., 1983; Доценко В.Л. с соавт., 1994), которая в очень большом количестве присутствует в зрелых фагоцитах крови человека (около 67 ООО молекул на одну азурофильную гранулу) и высвобождается в процессе деграиуляции, индуцируемой патогенными бактериями, на поверхность лейкоцитов, а затем во внеклеточное пространство (Нешкова Е.А. с соавт., 1993; Liou et al., 1995; Owen et al., 1997; Weinrauch et al., 2002).

Сложность решения вышеперечисленных проблем традиционными методами исследования привела к созданию оборудования проточного типа, где используется принцип движения самих клеточных элементов при неподвижном фотоприемнике. Проточная цитометрия - это новая цитометричес-кая технология, которая впервые за историю развития биологии и медицины позволила объединить преимущества и исключить недостатки микроскопии и усредненного биохимического метода исследования (Muirhiad et al., 1985). В диссертационной работе данная технология применялась по той причине, что ее внедрение в практику открыло новый этап в развитии клинической биохимии (Kruth H.S., 1982; Хайдуков C.B., 1998), микробиологии (Lloyd D. et al., 1993; Alvarez-Barrientos et al., 2000) и иммунологии (Laerum О., Farsund T., 1981). Результат взаимодействия в системе "хозяип-микро-организм" в последние годы все чаще оценивается in vivo и in vitro путем измерения биохимических параметров в большом количестве отдельных клеток гетерогенной популяции и построения частотных распределений их по исследуемым биохимическим параметрам (Raubourne, Bunning, 1994).

Выбор параметров, контролируемых в диссертационной работе при мониторинге дегенеративных изменений в лизосомальном аппарате и ядерном хроматине лейкоцитов в инфицированной бактериями цельной крови человека, явился результатом анализа литературы по данной актуальной проблеме за последнее десятилетие. Этот анализ свидетельствует о повышенном интересе микробиологов и биохимиков к изучению механизмов высвобождения лейкоцитарной эластазьт из поврежденных гранул нейтро-филов крови при инфекциях (Доценко B.JL с соавт., 2000; .Liou et al., 1995; Owen et al., 1995,1997; Figueredö et al.,1999), а также к изучению механизмов развития индуцированного бактериями апоптоза (Weinrauch, Zychlynsky, 1999; Козинец Г.И. с соавт., 2001; Понякина И.Д., Лебедев К.А., 2002).

Дегрануляцию лейкоцитов крови человека в последние годы принято оценивать по уровню секретируемой из гранул фагоцитов эластазы (Döring, 1994; Lcngas et al., 1994; Вагапова Л.Б., 1987; Доценко В.Л., с соавт., 2000) по той причине, что именно лейкоцитарная эластаза выполняет функцию избирательной деградации факторов вирулентности патогенных бактерий (Weinrauch et al., 2002), образует лейкоцитарные антибиотики широкого спектра действия из лизосомальных белков предшественников (Scocchi et al., 1992; Panyutich et al., 1997), а при дисбалансе в системе эластаза-ингиби-торы, типичном для перитонитов и септицемий, может играть решающую роль в развитии в организме пациентов полиорганной недостаточности и тромбо-геморрагического синдрома (Aasen, Ohlsson, 1978; Fujic et al, 1999; Доценко В.Л., 2000). Интенсивность повреждения генетического аппарата лейкоцитов принято оценивать по интенсивности деградации в клетках молекулы ДНК и долю поврежденных лейкоцитов в крови пациентов определяют обычно методом проточной цитофлуориметрии (Telford et al, 1994; Ко-вальчук Л.В., Чередеев А.Н.,1998; Талеев В.Ю. с соавт., 1999; Маянский A.M. с соавт., 2000).

Однако процессы секреторной дех рануляции и деградации ДНК лейкоцитов в цельной крови человека, инфицированной in vitro S. aureus, в условиях различной эффективности киллиш а клеток этого микроорганизма активными фагоцитами крови с использованием современных цитохимических и биохимических методов анализа не изучались.

Работа в данном направлении была начата в РосНИПЧИ "Микроб" и на кафедре общей и биоорганической химии Саратовского Государственного медицинского университета в 1999 г. под руководством д.б.н. Кравцова А. Л (РосНИПЧИ "Микроб" ) и д.м.н, профессора [Куляша Ю.В.| (СГМУ). Ее основой явился опыт сотрудников института "Микроб" по использованию метода проточной цитофлуориметрии в изучении состояния лизосо-мального аппарата и ядерного хроматина лейкоцитов человека и животных при чумном вакцинном и инфекционном процессах (Кравцов А.Л. с соавт., 1994; 1997; 1999).

Для проведения микрофлуориметрических исследований использовали, имеющийся в институте "Микроб" проточный цитофлуориметр ICP -22 PHYWE (Германия), который является первым современным проточным клеточным анализатором, освоенным зарубежной промышленностью. Этот прибор, согласно литературным данным, обладает очень высокой чувствительностью и разрешающей способностью при измерении сдвигов в содержании ДНК и лизосомальных гранул в отдельных лейкоцитах крови человека и экспериментальных животных (Gohde W., 1973; Peters D. , 1979). В России и за рубежом он применяется в диагностических лабораториях с начала 70-х гг., причем использованные в диссертационной работе цитохимические методы исследования создавались в эти годы и впервые прошли широкую апробацию в клинических и лабораторных условиях именно на этом цитофлуориметрическом оборудовании (В. Barlogie et al., 1976; Исаков В.Л. с соавт., 1988; Кравцов А.Л.,1997).

Информацию о состоянии лизосомального аппарата и ядерного хроматина около 30 ООО лейкоцитов в объеме 0,05 - 0,1 мл цельной крови человека получали за промежуток времени не более 10 мин цитохимическим методом, основанным на измерении уровня адсорбции красителя АО в азуро-фильных гранулах с эластазной активностью (красная флуоресценция) и на молекуле ДНК (зеленая флуоресценция) отдельных клеток проточным ци-тофлуориметром (M.R. Melamed ct al., 1972-1974). Оба параметра измерялись в автоматическом режиме и в каждой из 30 000 отдельных клеток одновременно - путем оп тического разделения красной и зеленой флуоресценции на два различные фотодетектора (Кравцов А.Л., 1997). Мониторинг изменения исследуемых параметров в процессе инкубации крови при 37"С проводили за счет окраски и анализа микрообъемов крови (в опыте и контроле) в различные сроки инкубации.

Индикатором высвобождения из гранул молекул лейкоцитарной эласта-зы (дегрануляции) являлась утрата исходной способности этих гранул в процессе инкубации аккумулировать молекулы красителя АО и, как следствие, флуоресцировать в красной области спектра. Долю клеток, в которых развивалась деграпуляция (интенсивность дегрануляции), быстро определяли методом проточной цитофлуориметрии отдельных клеток согласно W.R. Abrams et al. (1983). Снижение уровня активности эластазы в экстрактах лизосомаль-ных гранул лейкоцитов подтверждали биохимическим методом исследования с использованием сукцинил - (аланип)3 - р- иитроапилида (САПНА) в качестве специфического хромогенного субстрата (Ashe, Zimmerman, 1982; Abrams et al., 1983). Этот же субстрат использовали для определения активности эластазы в сыворотке крови до и после развития регистрируемой цитометром дегрануляции по методу К.Н. Веремеенко с соавт.( 1991). Общую антитрипсическую активность крови определяли полуколичественным методом М.И. Рейдермана (1971). Относительное содержание ДНК в клетках для идентификации и подсчета поврежденных лейкоцитов (в апоптозе) определяли цитохимическим методом, основанным на использовании смеси двух специфических к ДНК флуоресцирующих красителей - митрамиципа и этидиум бромида (В. Barlogie et al., 1976; Кравцов A.JI. с соавт., 1994).

Благодаря комплексному использованию всех этих методов исследования в процессе выполнения диссертационной работы впервые была получена очень важная информация, свидетельствующая о том, что в отсутствии бактерий стабильное состояние лизосомального аппарата и ядерного хроматина лейкоцитов в цельной крови человека более длительное время сохраняется in vitro (в течение суток), чем в выделенной из крови популяции лейкоцитов, где к 24 ч нейтрофилы, в отличие от лимфоцитов, подвергаются спонтанному апоптозу с деградацией азурофильных гранул и молекулы ДНК. Таким образом, с точки зрения изучения динамики развития повреждающего эффекта бактерий в условиях in vitro исследование лейкоцитов в их естественной среде (в цельной крови человека) открывает новые, более широкие возможности.

После добавления S. aureus в кровь с нормальной или инактивирован-ной сывороткой бактерицидный эффект оценивали микробиологическим методом согласно Bassoe C-F., Solberg С. (1984). Было установлено, что при исходной микробной нагрузке 40 м.к./фагоцит в условиях активного фагоцитоза к 3 ч инкубации в крови погибает в 30 раз больше бактерий (бактерицидный эффект - 98,8 %), чем при пониженной на 50 % фагоцитарной активности гранулоцитов в присутствии инактивированной сыворотки (бактерицидный эффект - 65 %). Это полностью подтверждается ранее получеппыми данными норвежских (Bassoe C-F, Bjerknes R,1984) и американских ученых (Martin Е., Bhakdi S., 1992) , а также результатами применения современного микробиологического метода исследования, основанного па прямом подсчете числа живых и убитых бактерий внутри активных фагоцитов методом проточной цитофлуориметрии (Мазуров Д.В. с соавт.,2000). Таким образом, в микробиологических исследованиях была определена исходная микробная концентрация (107 м.к./мл крови или около 4 м.к./ фагоцит), при которой (и ниже которой) после 8 ч развития фагоцитарной реакции клетки золотистого стафилококка выживали in vitro только в условиях дефектного фагоцитоза в крови с инактивированной комплементом и полностью погибали в крови здоровых доноров с активным комплементом. Это позволило в дальнейшем установить принципиальное различие в динамике развития интенсив-пых дегенеративных изменений в лизосомалыюм аппарате и ядерном хроматине лейкоцитов, осуществляющих эффективный и неэффективный кил-липг бактерий в цельной крови человека.

Установленная в процессе выполнения диссертационной работы удивительная способность живых клеток S. aureus вызывать при всех исходных микробных нагрузках, превышающих 1 м.к./фагоцит, в интервале времени от 3 до 4 ч, полную азурофильную дегрануляцию с высвобождением эласта-зы только из активных фагоцитов (около 100 % в опытах с нормальной сывороткой и около 50 % в присутствии инактивироваипой сыворотки), свидетельствует о том, что этот феномен можно использовать на практике, видимо, как для быстрой оценки фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов, так и в качестве косвенного показателя эффективности кил-линга бактерий в цельной крови человека. Доля фагоцитов, в которых развивалась такая деграпуляция, строго коррелировала с долей клеток, принимающих участие в поглощении и киллинге S. aureus , а также с интенсивностью развивающегося в крови бактерицидного эффекта.

Полученные в работе результаты подтверждаются литературными данными об участии соответственно 100 % и 50 % пейтрофилов в киллинге стафилококка, опсонизированного нормальной и инактивированной сывороткой (Bassoe C-F. et al., 1984), о способности опсонизированного стафилококка индуцировать in vitro дегрануляцию нейтрофилов крови человека с высвобождением эластазы (Ohlsson, Olsson, 1977; Figueredo et al., 1999), а также о важной роли такой дегрануляции в обеспечении киллинга клеток S. aureus ( Odeberg, Olsson, 1976). Однако, на модели цельной крови, контамипиро-ванной клетками золотистого стафилококка, в диссертационной работе впервые установлено, что данная информация может быть получена с использованием проточной цитометрии на субпопуляционном уровне за очень короткий промежуток времени и для ее получения пе требуется более 0,1 мл цельной крови, что открывает, на наш взгляд, принципиально новые возможности для изучения и оценки результата взаимодействия в системе "хозяин-микроорганизм".

Полученные биохимические и цитохимические данные свидетельствуют, что высвобождение лейкоцитарной эластазы из лизосомальных гранул фагоцитов в процессе дегрануляции приводит к утрате адсорбции в гранулах АО, но не приводит к достоверному повышению эластазной активности в нормальной сыворотке. Это может быть связано с высвобождением фермента в процессе индуцируемой стафилококком дегрануляции не в плазму крови, а на поверхность цитоплазматичсской мембраны активированных пейтрофилов, где он присутствует, как известно, у всех пациентов со стафилококковыми инфекциями и может быть обнаружен с использованием меченых специфических антител к белку эластазе (Morcus et al, 1998; Gaudin et al., 1997). Кроме того, согласно полученным в работе экспериментальным данным в момент развития дегрануляции пейтрофилов в сыворотке крови снижалась активность основного ингибитора эластазы (al-ПИ).

Образование в сыворотке биохимически неактивных комплексов эластазы с al-ПИ подтверждается многочисленными литературными данными, свидетельствующими, что подавляющая доля молекул эластазы присутствует ! t в крови в виде таких комплексов. Причины развития дисбаланса в системе эластаза-ингибиторы только начинают изучаться (Aasen, Ohlsson, 1978; Owen et al., 1997; Доценко В. J1. с соавт., 2000). В частности, требуется более детальное изучение механизма подавления активности ингибиторов эластазы радикалами кислорода (Weiss et al., 1984; Ossanna et al., 1986; Liouet al., 1995), a также факторов, способствующих нарушению электростатической адсорбции молекул эластазы на поверхности фагоцитов (транспорт кальция через мембрану фагоцитов, взаимодействие нейтрофилов с хемоаттракгантами. цитокинами и др.) и, как следствие, способствующих ее секреции в плазму крови человека (Owen et al., 1997).

Применение быстрого цитофлуориметрического метода оценки дегрануляции пейтрофилов крови человека может повысить эффективность решения всех этих задач, поскольку утрата способности гранул поглощать молекулы красителя АО свидетельствует о высвобождении эластазы из азурофильных гранул фагоцитов и, если фермент биохимическими методами не выявляется в сыворотке крови, можно с высокой степенью вероятности утверждать, что он находится на клеточной поверхности, где функционирует в присутствии сывороточных ингибиторов и играет важную роль в развитии воспаления и инфекционных осложнений (Carulli, 1996), либо в комплексе с сывороточными ингибиторами. В процессе выполнения диссертационной работы появление активности свободной эластазы в сыворотке крови было зарегистрировано только в условиях резко пониженной активиости термолабильного al-ПИ в ииактивированной сыворотке.

При выполнении работы были получены также важные, на наш взгляд, экспериментальные данные о существовании зависимости между процессами дегрануляции и деградации ДНК в лейкоцитах. Деградацию ДНК в активных фагоцитах (апоптоз нейтрофилов) регистрировали после связанного с фагоцитозом повышения относительного содержания ДНК в нейтрофилах (ДНК фагоцита + ДНК всех поглощенных бактерий), а также после завершения дегрануляции, сопутствующей активному фагоцитозу. В случае эффективного киллинга стафилококка быстрая гибель нейтрофилов с высвобождением эластазной активности предотвращала гибель лимфоцитов по типу апоптоза, так как в лимфоцитах (около 30 % лейкоцитов крови) не развивалось процесса деградации ядерного хроматина. На модели цельной крови человека, коптаминированной живыми клетками S.aureus, впервые получена информация, подтверждающая хорошо известную способность клеток первой линии иммунологической защиты (нейтрофилов) предотвращать in vivo (в очаге воспаления) повреждение иммунокомпетентных клеток, характерное для генерализации инфекционного процесса и высокой степени интоксикации организма.

Результаты диссертационной работы подтверждают ранее полученные литературные данные о том, что метод проточной цитофлуориметрии позволяет контролировать не только процесс деградации внутриклеточной ДНК, но и процесс повышения содержания ДНК в отдельных клетках, связанный с активным фагоцитозом бактерий iп vitro (Кравцов A. JI. с соавт., 1994; Кравцов A.JL, 1997), либо с заражением клеток организма человека и животных внутриклеточными паразитами в условиях in vivo (Alvarez-Barrientos et al., 2000). Они согласуются с современными представлениями о последовательности развития в клетках процессов деграпуляции и деградации ДНК, а также о важной роли высвобождаемой при дегрануляции эла-стазы в запуске механизма апоптоза ( Pelerszegi et al., 1999).

В процессе выполнения диссертационной работы впервые были получены экспериментальные данные о длительной задержке процессов деграпуляции и апоптоза нейтрофилов крови человека в результате резкого снижения их фагоцитарной и киллерпой активности по отношению к стафилококку (в опытах с инактивированной сыворткой). В условиях in vitro это приводило к резкому снижению дозы инфекционного агента, способной вызывать интенсивное повреждение лейкоцитов крови человека по исследуемым параметрам с задержкой по времени, к развитию дисбаланса в системе эластаза-ингибиторы и к гибели в крови пе только активных фагоцитов, но и не принимающих участие в фагоцитозе бактерий лейкоцитов ( в том числе и лимфоцитов). Длительной отсрочкой апоптоза нейтрофилов объясняют причину генерализации воспалительного процесса и развития инфекционных осложнений, типичных для сепсиса ( А.Н. Маянский, 1999).

Экспериментальные данные, полученные в диссертационной работе на ) модели in vitro, свидетельствовали о высокой вероятности развития дегенеративных изменений, регистрируемых методом проточной цитометрии в лизосомальном аппарате и ядерном хроматине лейкоцитов крови у пациентов с пониженной фагоцитарной активностью нейтрофилов. Причем, наиболее интенсивные изменения по исследуемым параметрам должны были развиваться в крови больных с наиболее тяжелыми инфекционными осложнениями, у которых доля поврежденных клеток (индекс дегенерации) превышает 50 % (Козинец Г.И. с соавт., 2001). Это требовало подтверждения в клинических условиях и заключительным этапом диссертационной работы явилось исследование лейкоцитов крови у инфицированных новорожденных отделения реанимации с различной степенью тяжести инфекционного процесса и различным уровнем активности в сыворотке крови лейкоцитарной эластазы.

На выбор именно новорожденных в качестве объекта исследования повлияли литературные данные о склонности детей 2-3 месяцев жизни к инфекционным осложнениям, в том числе к сепсису, вследствие недостаточной фагоцитарной и бактерицидной активности полиморфноядерных лейкоцитов (Чеспокова Н.П. с соавт., 1999), о развитии при сепсисе у новорожденных резко выраженного дисбаланса в системе эластаза-ипгибиторы (Баталова Л.Б., 1987), а также о повышенной чувствительности лейкоцитов крови внутриутробно инфицированных новорожденных к индуцированному инфекционными агентами апоптозу (Талаев В.Ю. с соавт., 1999). Наряду с этими показателями (элаетазная активность и интенсивность деградации ДНК лейкоцитов) в диссертационной работе впервые контролировали в цельной крови новорожденных интенсивность деграпуляции нейтрофилов с использованием метода проточной цитофлуориметрии. Было установлено, что летальному исходу инфекционного процесса у детей предшествует очень интенсивная дегрануляция нейтрофилов крови с утратой способности около 80 % этих клеток адсорбировать АО в азурофильных гранулах с эластазной активностью. Причем, именно в данной подгруппе инфицированных новорожденных регистрировали достоверное повышение в сыворотке крови эластазной активности, а также резкое повышение в крови относительного содержания апоптотических клеток (более 50 %, р < 0, 001), несущих ДНК на стадии деградации. В группе неинфицированпых детей фактически отсутствовали дегенеративные изменения по исследуемым показателям.

Таким образом, результаты клинических исследований подтверждают экспериментальные данные, полученные на модели in vitro. С одной стороны, они свидетельствуют о высокой информативности метода проточной цитофлуориметрии и использованной в работе модели (цельной крови человека, инфицированной бактериями in vitro) с точки зрения изучения факторов, определяющих исход взаимодействия в системе "хозяин -микроорганизм". С другой стороны, па основании опытов in vitro, подтвержденных клиническими исследованиями, можно сделать вывод о важном прогностическом значении при инфекциях очень быстро получаемых цитофлуоримег-рических данных. Для получения в течении 10 мин информации о состоянии в лейкоцитах крови пациента азурофильных гранул с эластазной активностью требуется всего капля крови, в то время как альтернативные биохимические исследования требуют значительно большего количества исследуемого материала, реактивов и, главное, не менее 2-3 ч времени, что может иметь большое практическое значение для своевременного прогнозирования у пациентов инфекционных осложнений и выбора необходимого курса терапии.