Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Клинико-лабораторная характеристика микроспоридиоза и криптоспоридиоза у ВИЧ-инфицированных пациентов.

На правах рукописи

СОКОЛОВА Ольга Игоревна

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОСПОРИДИОЗА И КРИПТОСПОРИДИОЗА У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ

14.01.09 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1Я АПР 2013

005052207

Санкт-Петербург - 2013

005052207

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» Правительства Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Яковлев Алексей Авенирович Официальные оппоненты:

Жданов Константин Валерьевич, доктор медицинских наук профессор

Федеральное государственное казенное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, начальник кафедры инфекционных болезней.

Лиознов Дмитрий Анатольевич, доктор медицинских наук

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства Здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой инфекционных болезней.

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора».

Защита состоится А0-02013 года в /«/ часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д215.002.01 на базе Федерального государственного казенного военного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Военно-медицинская академия имени 'С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова

Автореферат разослан « 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Пандемия ВИЧ-инфекции, охватившая планету, является одной из наиболее актуальных проблем современности. По Данным Всемирной Организации Здравоохранения на конец 2010 года в мире зарегистрировано 20104 миллиона ВИЧ-инфицированных. В регионе «Восточная Европа и Средняя Азия», к которому относится Россия, антиретровирусную терапию (АРВТ) получают 79430 человек, что составляет 21 - 29% от нуждающихся в АРВТ пациентов. Это один из самых низких показателей обеспеченности АРВТ в сравнении с другими регионами мира. Количество ВИЧ-инфицированных, погибающих от ВИЧ-ассоциированных заболеваний, возрастает. К самым распространенным СПИД-ассоциированным заболеваниям у взрослых и детей в странах нашего региона, не входящих в ЕС/ЕЭЗ, относятся туберкулез легких - 29%, туберкулез внелегочной локализации - 11% и синдром истощения, обусловленный ВИЧ-инфекцией - 13% [WHO; UNAIDS; UNICEF progress report, 2010, WHO; UNAIDS; UNICEF progress report, 2011].

Одной из причин синдрома истощения при ВИЧ-инфекции являются разнообразные микроорганизмы, поражающие желудочно-кишечный тракт. К ним относятся вирусные инфекции (цитомегаловирус, простой герпес, и аденовирусы), паразиты (криптоспоридии, Giardia и Isospora), грибы {Candida, Cryptococcus, Microsporidia, Histoplasma) и бактерии (Shigella, Salmonella, Listeria, микобактерии и спирохеты) [Huppmann, A.R., Orenstein, J.M., 2010]. Наиболее часто обнаруживаемые возбудители -цитомегаловирус, встречаемость 20,1%, Cryptosporidia - 19,6%, Microsporidia - 19,4% [Sharpstone, D., Gazzard, В., 1996], по другим данным цитомегаловирус, Candida, криптоспоридии и чуть реже микроспоридии [Hupptnann, A.R., Orenstein, J.M., 2010].

Возникновение микроспоридиоза и криптоспоридиоза сопровождается развитием синдрома мапьабсорбции, что приводит к длительным диареям и развитию синдрома истощения у ВИЧ-инфицированных пациентов [Kotler, D. Р., Orenstein, J. M, 1998; Cama,V. et al., 2007].

В клиниках Российской Федерации диагностика микроспоридиоза не выполняется, а диагностика криптоспоридиоза осуществляется с использованием устаревших методик. Данных по распространенности, клинической картине, спектру возбудителей, эпидемиологическим характеристикам криптоспоридиоза в России крайне мало, а исследования, посвященные микроспоридиозу человека, ранее не проводились никогда.

Степень разработанности темы исследования. Микроспоридии человека и вызываемые ими оппортунистические инфекции у больных иммунодефицитом активно изучались европейскими и американскими учеными, I. Desportes, A. Cali , Е. S. Didier, L. M. Weiss, D. M. Orenstein, C. Franzen и др. Микроспоридии человека в России не изучались. В то же время, в Санкт-Петербурге в Институте защиты растений (ВИЗР) активно работает научная группа под руководством известного паразитолога проф. И. В. Исси,

которая занимается проблемами биологии микроспоридий на паразито-хозяинных системах с участием насекомых. Особенности клинико-лабораторного течения и распространенность криптоспоридиозов человека освещены в работах Л. Ксяо., Р. Фанера., В. Кама (США) и др. В России большую роль в изучении криптоспоридиозов человека сыграла проф. Т. В. Бейер. Под ее руководством был отработан светооптический метод диагностики криптоспоридиоза у домашних животных и человека.

Настоящее исследование - попытка восполнить пробел в изучении микроспоридий и криптоспоридий человека в России, а также роли этих патогенов в развитии диарейного синдрому у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Цель исследования: изучить клинические проявления и лабораторные показатели при микроспоридиозе и криптоспоридиозе у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Задачи исследования:

1. Определить частоту встречаемости и видовой состав представителей рода Cryptosporidium и типа Microsporidia, выявленных у ВИЧ-инфицированных пациентов в Санкт-Петербурге.

2. Оценить клинические проявления и лабораторные показатели при микроспоридиозе у ВИЧ-инфицированных пациентов.

3. Изучить клинические проявления и лабораторные показатели при криптоспоридиозе у ВИЧ-инфицированных пациентов.

4. Исследовать факторы риска развития микроспоридиоза и криптоспоридиоза у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Научная новизна исследования.

Отработана и проведена клиническая диагностика микроспоридиоза у ВИЧ-инфицированных пациентов, определен видовой состав

микроспоридий, описаны клинико-лабораторные особенности течения криптоспоридиоза и микроспоридиоза, а также проанализирована значимость этих инфекционных заболеваний в развитии диарейного синдрома и синдрома потери веса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

В частности, показано, что частота встречаемости микроспоридиоза и криптоспоридиоза в Санкт-Петербурге - соответственно 19% и 17,2%. Основные виды микроспоридиий, паразитирующих в кишечнике ВИЧ-инфицированных пациентов это Encephalitozoon intestinalis, Enc. cuniculi, Enterocytozoon bieneusi и Enc. hellem, а криптоспоридий - Cryptosporidium parvum и С. hominis. Микроспоридиальные инфекции вызывают диарею, осложненную синдромом мальабсорбции, с преимущественным нарушением всасывания углеводов, что приводит к тяжелой (более 10%) потери веса и к развитию анемии. Микроспоридиоз чаще обнаруживается у ВИЧ-инфицированных пациентов с низким (менее 100 клеток/мл крови) количеством CD4(+) Т-лимфоцитов. Для криптоспоридиоза характерно развитие длительных (более 10 суток) диарей. Криптоспридиоз чаще обнаруживается у ВИЧ-инфицированных пациентов с количеством CD4(+)

Т-лимфоцитов менее 200 клеток/мл крови. Развитие микроспоридиоза характерно для лиц без определенного места жительства и для лиц, злоупотребляющих алкоголем. Развитие криптоспоридиоза ассоциировано с употреблением внутривенных наркотических препаратов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные позволяют расширить представления об оппортунистических инфекциях, возникающих при СПИДе. Проведенные исследования позволили определить группы риска, предложить методы диагностики криптоспоридиоза и микроспоридиоза и сформулировать рекомендации для практического здравоохранения.

Пациентов с ВИЧ-инфекцией, сопровождающейся длительной диареей, необходимо обследовать на микроспоридиоз и криптоспоидиоз, т.к. показана достаточно частая встречаемось микроспоридий и криптоспоридий у данной группы пациентов и выявлена взаимосвязь наличия этих возбудителей с развитием синдрома мальабсорбции. Пациентам с микроспоридиозом и криптоспоридиозом необходимо назначать специальную терапию или начинать антиретровирусную терапию для повышения уровня CD4(+) Т-лимфоцитов, иррадикации возбудителей, предотвращения синдрома мальабсорбции и восстановления функции кишечника.

ВИЧ-инфицированным пациентам без определенного места жительства, а также, имеющим зависимость от алкоголя, которые наиболее подвержены заражению микроспоридиями, следует назначать обследование на микроспоридиоз и криптоспоридиоз в обязательном порядке.

Отработаны лабораторно-клинические методы диагностики изучаемых патогенов. В частности, показано, что для диагностики и определения видовой принадлежности микроспоридиий предпочтительнее использовать метод ПЦР.

Методология и методы исследования.

В исследовании использованы общенаучные и специальные эпидемиологические, клинические, и лабораторные методы, широко используемые в современных научных исследованиях. К ним относятся: стандартные методы сбора эпидемиологического анамнеза и объективного осмотра больных; микроскопические методы анализа мазков с помощью световой и флуоресцентной микроскопии; молекулярно-биологические методы, такие как выделение ДНК, ПЦР, гель-электрофорез; анализ сиквенсов. Достоверность всех полученных результатов оценивалась статистическими методами.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Частота встречаемости микроспоридиоза в Санкт-Петербурге среди ВИЧ-инфицированных пациентов составила 19%. Основными выявленными видами микроспоридий были Encephalitozoon intestinalis, Enc. cuniculi, Enterocytozoon bieneusi и Enc. hellem. Частота встречаемости криптоспоридиоза составила 17,2%. Основными возбудителями были Cryptosporidium parvum и Cryptosporidium hominis.

2. Развитие микроспоридиоза характерно для лиц без определенного места жительства и для лиц, злоупотребляющих алкоголем. Развитие криптоспоридиоза ассоциировано с употреблением внутривенных наркотических препаратов.

3. Микроспоридиальные инфекции вызывают диарею, осложненную синдромом мальабсорбции, с преимущественным нарушением всасывания углеводов, что приводит к тяжелой (более 10%) потери веса и к развитию анемии. Микроспоридиоз чаще обнаруживается у ВИЧ-инфицированных пациентов с низким (менее 100 клеток/мл крови) количеством CD4(+) Т-лимфоцитов. Для криптоспоридиоза характерно развитие длительных (более 10 суток) диарей. Криптоспоридиоз чаще обнаруживается у ВИЧ-инфицированных пациентов с количеством CD4(+) Т-лимфоцитов менее 200 клеток/мл крови.

Степень достоверности и апробация результатов исследования.

Достоверность полученных результатов обусловлена

репрезентативностью и достаточностью выборки пациентов, включенных в исследование, объемом проанализированного материала, адекватностью методов исследования. Методологические подходы, использованные в исследовании, корректны и современны. Лабораторные эксперименты осуществлялись на сертифицированном и проверенном оборудовании.

Основные положения и материалы диссертации были представлены в виде докладов на 5-м Европейском протистологическом конгрессе (V European Congress of Protistology and XI European Conference on Ciliate Biology), Санкт-Петербург, 2004 г.; на 12-м Международном симпозиуме по оппортунистическим протестам (IWOP-12), Нью-Йорк, 2012 г., на 7-й и 8-й Ассамблеях молодых ученых и специалистов СПбГУ. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, а также две в иностранных журналах.

Результаты исследований внедрены в практическую деятельность кафедры Инфекционных болезней, эпидемиологии и дерматовенерологии Медицинского факультета СПбГУ, СПб ГУЗ Клинической инфекционной больницы им. С.П. Боткина, включены в план тематических занятий со студентами, интернами, ординаторами и аспирантами Медицинского факультета СПбГУ.

Личное участие автора в получении результатов. Автором выполнялось клиническое обследование пациентов, отбор образцов, разработка «Индивидуальной карта пациента», микроскопический анализ образцов от всех пациентов, формирование базы данных и статистический анализ полученных результатов. Автор принимал участие в подготовке проб и разработке методик для молекулярно-биологической части диссертационной работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, основной части, включающей обзор литературы, описание

материалов и методов и результатов исследования, заключения, состоящего из обсуждения полученных результатов и выводов, списка литературы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками, 28 таблицами и одним приложением. Список литературы содержит 145 источников, в том числе 7 отечественных и 138 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы.

Микроспоридиоз и криптоспоридиоз - оппортунистические инфекции у-пациентов с выраженным иммунодефицитом [Didier, Е. S., Weiss, L. M., 2006]. Зараженность микроспоридиозом больных СПИДом колеблется от 2 до 50% [Canning, Е: U., Hollister, W. S., 1990]. Самый распространенный вид микроспоридий человека — Enterocytozoon bieneusi, далее следуют Encephalitozoon. intestinalis, Enc. cuniculi и Enc. hellem [Didier, E. S., Weiss, L. M., 2006, Endeshaw, T., et al., 2006]. Реже встерчаются другие виды микроспоридий. Частота встречаемости криптоспоридиоза составляет 5 -20% [Cama, V. et al., 2007]. У человека паразитируют 2 вида криптсопоридий — С. parvum, передающийся к человеку от животных, и С. hominis, для которого характерен антропонозный механизм передачи [Cama, V. et al., 2007, Raccurt, С. et al., 2006, Muthusang, D. et al., 2010].

Возникновение этих заболеваний сопровождается поражением слизистой оболочки кишечника и развитием ряда патологических изменений, проявляющихся в снижении активности гликолитических ферментов: лактазы, а-глюкозидазы, а также в снижении абсорбции крахмала, d-ксилозы и некоторых моносахаров [Kotler, D. P., Orenstein, J. M., 1998, Schmidt, W., 1997]. В результате формируется синдром мальабсорбции и диарейный синдром, с длительностью более 4-х недель [Endeshaw, T. et al., 2006, Bern, С. et al., 2005], который приводит к выраженному снижению массы тела [Dascomb, К. et al., 1999]. Некоторые виды способны вызывать диссеминированные процессы [Didier, E. S., 1995, Dillingham, R. А., 2002].

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена в клинической инфекционной больнице им. С.П. Боткина. Всего было обследовано 158 ВИЧ-инфицированных пациентов.

Для выявления микроспоридий и криптоспоридий изучались образцы стула, взятые у пациентов, находящихся в стационаре. В группу пациентов, обследуемых на микроспоридиоз, было включено 158 пациентов, а в группу обследуемых на криптоспоридиоз - 99 пациентов. Критерии включения: ВИЧ-инфицированные пациенты с диареей в возрасте от 20 до 50 лет. Критерии исключения: ВИЧ-инфицированне пациенты, получающие АРВТ, выявление шигеллеза и сальмонеллеза при бактериологическом исследовании.

Клиническое наблюдение за больными включало в себя сбор анамнеза заболевания и эпидемиологических данных, опрос пациента, анализ историй болезней пациентов, анализ температурной кривой во время нахождения в 2 стационаре и оценка динамики веса пациентов за последние 2 года. Также

изучались лабораторные показатели клинического анализа крови, данные микроскопического исследования кала, посевов кала на бактерии родов Shigella, Salmonella, условно-патогенную флору, грибы рода Candida. Иммунологические показатели снижения С04-клеток оценивались однократно в ближайшие 2 недели до или после сбора кала на исследования.

Среди обследованных на микроспоридиоз было 107 мужчин и 51 женщина (67,7% и 32,3% соответственно). Средний возраст женщин составил 31,0 ± 8,27 лет, а мужчин - 32,3 ± 8,56 лет. Среднее количество CD4 (+) Т-лимфоцитов для всех пациентов составило 106,5 кл/мкл (Рю=11, Р9о=543).

Среди обследованных на криптоспоридиоз, было 64 мужчины и 35 женщин (64,6% и 35,4% соответственно). Возраст женщин составил 30,0 ± 6,96 лет, а мужчин - 33,7 ± 9,24 лет. Среднее количество CD4(+) Т-лимфоцитов для всех пациентов составило 63,5 кл/мкл (Рю=9, Р9о=450).

Для выявления микроспоридий и криптоспоридий от одного до трех последовательных образцов стула от одного пациента собирались в течение трех дней и хранились либо в 2,5% растворе К2Сг207 при температуре 4°С, либо замороженными при температуре -20°С. Всего было собрано 247 образцов от 158 пациентов.

Световая микроскопия. Для выявления микроспоридий стекла с нанесенными мазками стула фиксировали метанолом, окрашивали флуоресцентным красителем Калькофлором и/или Голубым Трихромом и просматривали под микроскопом Leica DM 2500. Для выявления криптоспоридий фиксированные мазки окрашивали карбол-фуксином (модификация окраски по Цилю-Нильсену) (Garcia et al., 1983) и просматривали в световом микроскопе при увеличении 1.000Х.

ГШР-диагностика. Выделение ДНК из образцов кала для диагностики микроспоридиоза и криптоспоридиоза проводилось по методике Xiao, L. et al. (2002). Амплификация ДНК выполнялась методом вложенного ПЦР (nested PCR).

Сиквенирование продуктов ПЦР. Для видовой диагностики микроспоридиозов ампликоны нужного размера вырезали из 2% агарозного геля. ДНК извлекали из геля с помощью набора Wizard SV Gel and PCR Cleanup System (Promega, Madison, WI, USA) согласно инструкции производителя. ПЦР для сиквенирования проводилась на амплификаторе системы Applied BioSystems BigDie Terminator (version 3.1); ПЦР-продукты анализировалась на сиквенаторе Beckman Coulter Seq 8000 DNA sequencer. Для сиквенирования использовали гтраймеры MSP-3, МСП-4А, и MSP-4B; каждый ампликон прочитывался в двух направлениях.

Для видовой диагностики криптоспоридиоза реакцию сиквенирования осуществляли при помощи набора реагентов DYEnamic ET dye terminator cycle sequencing kit (US81090, Applied Biosystems) с праймерами AL3532, AL3534 и промежуточным праймером AL3533: 5'-GAG ATATATCTTGGTGCG-3 '.

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). С

целью установления вида криптоспоридий ДНК, амплифицированную с помощью ПЦР (ББи гТША области геномной ДНК), подвергали рестрикционному анализу. Для рестрикции ПЦР продукта использовали две рестриктазы: Ээр! и Узр1 (Сибэнзим, Россия) (Таблица 1).

Для статистической обработки данных использовалась программа 81а^иса 6.0.

Таблица 1

Распределение длин рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР ЗБи _области у представителей разных видов криптоспоридий_

Вид возбудителя криптоспоридиоза Фермент рестрикции Длины получаемых при рестрикции фрагментов (количество пар оснований), ♦жирным выделены видимые в геле фрагменты

С. hominis Sspl 450,267,111, 12, И

VspI 561,115,104,71

С. parvum Sspl 450,267,108, 12, 11

VspI . 629,115, 104

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Диагностика возбудителей. Световая микроскопия показала наличие спор микроспоридий в стуле у 17 пациентов после окраски мазков Калькофлором, и у 19 пациентов после окраски Трихромом. Метод ПЦР выявил наличие ДНК микроспоридии у 28 пациентов (Таблица 2).

Таблица 2

Количество пациентов, у которых были диагностированы

Оба красителя Калькофлор - Трихром - Оба красителя - Всего

отр. положит. положит. положит.

PCR-отриц. 125 1 2 2 130

PCR-положит. 10 3 4 11 28

Всего 135 4 6 13 158

Инфицированными микроспоридиями мы считали пациентов, в образцах от которых возбудители были обнаружены при использовании ПЦР или обоих методов световой микроскопии. Таковыми оказались 30 (19%) из 158 обследованных пациентов.

Сиквенирование продуктов ПЦР и сравнение полученных сиквенсов с имеющимися в базе данных Генбанка позволило идентифицировать большинство видов микроспоридий. Вид Е. intestinalis был выявлен у 21 пациента (70%), Е. amiculi - у 3 человек (10%), Е. hellem - у одного (3,33%), а Е. bieneusi - у 2 (6,66%) пациентов. У одного пациента были обнаружены микроспоридии двух видов Е. intestinalis и Е. cuniculi (Таблица 3).

Таблица 3

Результаты обследования пациентов на микроспоридии методами _световой микроскопии, ПЦР и сиквенирования___

Вид возбудителя № паи Номер образца, исследуемого различными методами'

1 2 3

PCR LM CAL PCR LM CAL PCR LM CAL

Епс. intestinalis 63 + + + + + + н/и2 + +

69 + + + + - - + - -

70 + - - + - - - + -

71 + - - - - - н/с**

72 + - - н/с

73 + - - + + + н/с

76 - - - + - - н/с

77 + + + н/с

80 + - - + + + | н/с

81 + + + + + + н/с

137 + - + н/с

138 + - + н/с

139 + + + н/с

140 + - - н/с

141 + + - н/с

142 + + + - + 1 + 1

145 - н/и - н/и 1 + - +

152 + + + н/с

154 + - - н/с

1564 + - + | + 1 + 1 н/с

158 + - - н/с

Епс. cuniculi str. Г 5 + - - | - 1 - 1 н/с

Str. II5 124 + - - н/с

156J + - + | + 1 + 1 н/с

Епс. hellem 114 + - + н/с

Microspori dium spp. sp6 l6 16 + - - н/с

SP. 2 58 - - - + - -

Eni. bieneusi 1 + + + + + + + + +

118 - н/и + - + н/с

Неизвестный вид7 66 - - - - + + н/с

79 - + + н/с

Примечания: 1 - PCR - полимеразная цепная реакция, LM - световая микроскопия мазков, окрашенных Трихромом, Са1 - световая микроскопия мазков, окрашенных калькофлором; 2 - здесь и во всей таблице: н/и - образец не исследовался; 3 - здесь и во всей таблице: н/с - образец не собран; 4 — у пациента № 156 обнаружено 2 вида микроспоридий: Е. intestinalis и Е. cuniculi; 5 — обнаружено 2 штамма Е. cuniculi: штамм 1 — str 1 и штамм 2 -str 2; 6 - два неизвестных вида отнесены к роду Microsporidium spp.; 7 - возбудители, обнаруженные только методами световой микроскопии, не определены до вида.

Кроме того, было выявлено два новых сиквенса, принадлежащих к неописанным ранее видам микроспоридий. Они показали низкую гомологию с сиквенсами микроспоридий, имеющимися в Генбанке и были

предварительно помещены в сборный род Мкго.чрог1сИит до тех пор, пока эти виды не будут описаны морфологически и классифицированы (номера в Генбанке вС? 408913 и вС) 408914). Микроспоридии, обнаруженные только методами световой микроскопии у двух пациентов (6,66%), до вида не определены (Таблица 3).

При микроскопии мазков кала от 99 пациентов, окрашенных карбол-фуксином, ооцисты криптоспоридий были выявлены у 16 (16,2%) пациентов. С помощью ПЦР наличие криптоспоридий хотя бы в одном образце от пациента было выявлено у 17 (17,2%) пациентов. У 9 пациентов результаты ПЦР-диагностики и световой микроскопии совпали.

У 8 пациентов наличие криптоспоридий методами световой микроскопии не было подтверждено ПЦР. Таким образом, у 24 (24,2%) из 99 пациентов криптоспоридиоз был выявлен хотя бы одним из используемых методов. Учитывая субъективность микроскопического анализа и возможность подтверждения наличия криптоспоридий в ПЦР-положительных образцах методом ПДРФ, только диагнозы, подтвержденные ПЦР, расценивались как положительные на криптоспоридиоз (Таблица 4).

Таблица 4

Количество пациентов, положительных при обследовании на _ криптоспоридии различными методами __

СМ* - положит. СМ-отрицат Всего

PCR-отриц. 7 75 82

PCR-положит. 9 8 17

Всего 16 83 99

*- СМ - световая микроскопия

Таким образом, встречаемость криптоспоридиоза в нашем исследовании составила 17,2%: возбудители были обнаружены у 17 из 99 пациентов, включенных в анализ по криптоспоридиозу. При выполнении ПДРФ было обнаружено, что у 6 (35,3%) пациентов возбудитель криптоспоридиоза относится к виду Cryptosporidium hominis, а у 11 (64,7%) — Cryptosporidium parvum (Таблица 5). При сиквенировании ПЦР-положительных образцов ДНК криптоспоридий была обнаружена во всех образцах, однако результаты видовой идентификации не во всех случаях совпали с результатами ПДРФ. Анализ такого несоответствия требует дополнительных исследований.

Возрастно-половой состав пациентов в зависимости от наличия микроспоридиоза или криптоспоридиоза. Среди 30 пациентов, инфицированных микроспоридиями, было 12 (40%) женщин и 18 (60%) мужчин в возрасте от 22 до 57 лет (32,6 ± 8,9 лет). В группе пациентов без микроспоридиоза было 39 (30,5%) женщин и 89 (69,5%) мужчин. Средний возраст пациентов без микроспоридиоза составил 31,7 ± 8,4 лет и колебался от 18 до 62 лет. Возрастной и половой состав группы пациентов с микроспоридиозом достоверно не отличался от возрастного и полового состава группы пациентов без микроспоридиоза (р=0,6 и р=0,4 соответственно).

Таблица 5

Результаты обследования пациентов на криптоспоридии методами _световой микроскопии, ПЦР и ПДРФ.__

№ пац. Результат СМ Результат ПЦР серии образцов кала Результат ПДРФ

№1 №2 №3

145 + + + + С. parvum

115 - + + + С. parvum

95 + + + - С. parvum

96 + - + + С. parvum

80 - + - - С. hominis

81 + + - - С. hominis

92 + + - ■ - С. hominis

159 + + + С. parvum

165 - + + н/д* С. parvum

75 - ' + н/д С. hominis

154 - - + н/д С. parvum

120 н/д + н/д н/д С. hominis

127 + + н/д н/д С. parvum

139 + + н/д н/д С. parvum

170 + + н/д н/д С. parvum

177 - + н/д н/д С. parvum

178 - + н/д н/д С. hominis

*н/д - исследование не выполнялось

Среди 17 пациентов с криптоспоридиозом было 4 (32,5%) женщины и 13 (76,5%) мужчин. Средний возраст больных с криптоспоридиозом составил 33,5 ± 9,9 лет и колебался от 20 до 57 лет. Среди 82 пациентов без криптоспоридиоза были 31 (37,8%) женщина и 51 (62,2%) мужчина. Средний возраст пациентов без криптоспоридиоза составил 32,2 ± 8,4 лет и колебался от 18 до 62 лет. Возрастной и половой состав группы пациентов с криптоспоридиозом и без криптоспоридиоза достоверно не различались (р=0,6 и р=0,3 соответственно).

Уровни СР4+ Т-лимфоцигов у пациентов в зависимости от наличия микроспоридиоза или криптоспоридиоза. Уровень С04+ Т-лимфоцитов у пациентов с микроспоридиозом колебался от 4 до 647 кл/мкл и составил, в среднем, 62 кл/мкл (Р10=12, Р90=553). Он достоверно не отличался (р=0,2) от уровня СБ4+ Т-лимфоцитов у пациентов без микроспоридиоза, у которых он колебался от 0 до 1061 кл/мкл и, в среднем, составил 140 кл/мкл (Рю=8, Р90=543). С помощью точного теста Фишера, было показано, что среди пациентов с микроспоридиозом количество больных с уровнем С04+ Т-лимфоцитов <100 кл/мкл был достоверно выше, чем среди пациентов без

микроспоридиоза (рдвуХсторонний=0,02).

У пациентов с криптоспоридиозом уровень СБ4 (+) Т-лимфоцитов колебался от 7 до 647 кл/мкл и составил, в среднем, 50кл/мкл (Рю=9, Р90=196). Он был достоверно ниже (р<0,05), чем у пациентов без криптоспоридиоза, у которых уровень СИ4 (+) Т-лимфоцитов колебался от 0 до 636 кл/мкл и, в среднем, составил 74 кл/мкл (Рю=11, Р9о=450).

Встречаемость патогенных и условно-патогенных инфекций желудочно-кишечного тракта у пациентов с микроспоридиозом и криптоспоридиозом. Среди пациентов с микроспоридиозом 12 человек (57,2%) переносили разнообразные инфекции ЖКТ. Из них у 3 (10%) были выявлены облигатно патогенные возбудители (p. Shigella, р. Salmonella). Среди пациентов без микроспоридиоза инфекции ЖКТ были выявлены у 51 человека (52%), у 12 (10%) из них были обнаружены облигатно патогенные возбудители.

Среди исследованных на криптоспоридиоз, семь (77,8%) пациентов с криптоспоридиозом и 47 (85,5%) без криптоспоридиоза переносили патогенные и условно-патогенные инфекции ЖКТ. Облигатно патогенные возбудители были выявлены у 2 (10,5%) пациентов с криптоспоридиозом и у 13 (13,3%) пациентов без криптоспоридиоза. Достоверных различий в частоте встречаемости сопутствующих инфекций ЖКТ между пациентами с микроспоридиозом и без микроспоридиозоа, с криптоспоридиозом и без криптоспоридиоза выявлено не было (р=0,7 и р=1,0 соответственно).

Пациенты, переносившие сальмонеллез и дизентерию, были выведены из дальнейшего анализа. Учитывая равномерное распределение инфекций ЖКТ, вызываемых условно-патогенной флорой, среди разных групп пациентов (с микроспоридиозои и без микроспоридиоза, с криптоспоридиозом и без криптоспоридиоза), было решено, что эти инфекции ЖКТ не могли значимо повлиять на результаты исследования. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что наличие патогенных и условно-патогенных возбудителей не влияло на частоту встречаемости микроспоридиоза и криптоспоридиоза у исследованных больных.

Влияние микроспоридиоза и криптоспоридиоза на показатели микроскопического исследования кала. При исследовании копрограмм было показано, что наличие микроспоридиальной инфекциии достоверно чаще провоцировало развитие диарейного синдрома с возникновением мальдигестии и мальабсорбции, с преимущественным нарушением всасывания углеводов. Консистенция стула при микроспоридиозе могла быть как кашицеобразной, так и жидкой. Микроспоридиальная инфекция не приводила к увеличению количества эритроцитов, лейкоцитов и слизе в стуле, т.е. к развитию колитического синдрома (Таблица 6).

Криптоспоридиоз не оказывал существенного влияния на показатели копрограмм.

Клинические проявления микроспоридиоза и криптоспоридиоза. Оценка клинических данных показала, что длительность диарейного синдрома у пациентов с исследуемыми инфекциями была достоверно выше, чем у пациентов без этих инфекций, и составляла более 10 суток (11 (Рю=0, Р90=24) при микроспоридиозе и 17,5 суток (Рю=0, Р90=112) при криптоспоридиозе). При этом заражение микроспоридиями, как и криптоспоридиями не увеличивало частоту жалоб на диарею, У пациентов с микроспоридиальной инфекцией частота стула была в среднем 5 раз в день, с

криптоспоридиалъной - 4. Частота стула достоверно не отличалась от таковой у пациентов без исследуемых инфекций (Таблицы 7 и 8).

Таблица 6

Распределение различных изменений в копрограммах у пациентов с

Признак Признак выявлен Кол-во пациентов (%) Признак не выявлен Кол-во пациентов (%) Всего пациентов (%) р

Микро +' Микро — Микро + Микро-

Неоформленный стул 19(17,1) 73 (65,8) 0 19(17,1) 111 (100) 0,04

Нарушения всасывания б, ж, у 19(17,1) 69 (62,2) 0 23 (20,7) 111 (100) 0,02

Нарушения всасывания б 6 (5,3) 31(28) 13(11,7) 61 (55,0) 111 (100) 1,0

Нарушения всасывания ж 7 (6,3) 24 (21,6) 12 (10,8) 68 (61,3) 111(100) 0,4

Нарушения всасывания у 18(16,2) 66 (59,5) 1 (0,9) 26 (23,4) 111(100) 0,04

б, ж, у - белки, жиры, углеводы

Никаких различий в возникновении жалоб на боли в животе, тошноту, рвоту, газообразование у пациентов с микроспоридиозом и без микроспоридиоза, с криптоспоридиозом и без криптоспоридиоза выявлено не было. У пациентов с микроспоридиозом достоверно чаще регистрировалась тяжелая (более 10%) потеря массы тела.

Таблица 7

Частота возникновения различных симптомов у пациентов в зависимости

Симптом Симптом выявлен Кол-во пациентов (%) Симптом не выявлен Кол-во пациентов (%) Всего пациентов (%) Р

Микро +' Микро — Микро + Микро -

Диарея >10 дней 12(10,9) 20(18,2) 8(7,3) 70(63,6) 110(100) 0,002

Диарея < 10 дней 8 (7,3) 70 (63,6) 12(10,9) 20(18,2) 110(100)

Лихорадка (1 тела > 37,3°С) 24(15,5) 99 (63,9) 5(3,2) 27(17,4) 155 (100) 0,52

Снижение массы тела 26(16,8) 63 (40,7) 3(1,9) 63(40,61 155 (100) 0,0001

Снижение массы тела <10% 7 (7,9) 32 (34,8) 19(21,3) 31(36,0) 89 (100) 0,043

>10% 19(21,3) 31 (36,0) 7 (7,9) 32(34,8) 89 (100) 0,043

1 - Микро +, пациенты с микроспоидиозом; 2 - Микро пациенты без микроспоридиоза;

Особенности показателей клинического анализа крови у пациентов с микроспоридиозом и криптоспоридиозом. Было показано, что у пациентов с

микроспоридиозом, по сравнению с больными без этой инфекции, достоверно чаще встречались: снижение уровня гемоглобина - 108 ± 25,5 г/л (р=0,023), снижение уровня эритроцитов - 3,4 ± 0,7-109 кл/мкл (р=0,02), и повышение уровня СОЭ - 50 мм/ч (р=0,004). Последний показатель характеризовался как повышением среднего уровня, так и большей частотой высоких (С03>20 мм/ч) значений. При криптоспоридиозе уровень лейкоцитов был заметно ниже - 5,7 ± 3,79-109 кл/мкл, чем у пациентов без криптоспоридиоза - 7,2 ± 4,31 -109 кл/мкл, однако данные оказались недостоверными (р=0,2). Других тенденций относительно влияния криптоспоридиоза на показатели гемограмм замечено не было.

Таблица 8

Частота возникновения различных симптомов у пациентов в зависимости

от наличия криптоспоридиоза.

Симптом Симптом выявлен Кол-во пациентов (%) Симптом не выявлен Кол-во пациентов (%) Всего пациентов (%) Р

Крипто +' Крипто — Крйпто + Крипто -

Диарея >10 дней 7(11,3) 18(29) 1(1,6) 36(58,1) 62 (100) 0,006

Диарея < 10 дней 1 (1,6) 36(58,1) 7(11,3) 18(29) 62 (100)

Лихорадка (1тела >37,3°С) 15(15,3) 68 (69,4) 2(2) 13(13,3) 98(100) 1,0

Снижение массы тела 13 (13,1) 56 (56,6) 4(4) 26 (26,3) 98(100) 0,6

Снижение массы тела <10% 8(11,6) 19 (27,5) 5 (7,2) 37(53,6) 69(100) 0,1

>10% 5 (7,2) 37 (53,6) 8(11,6) 19(27,5) 69(100)

]-Крипто +, пациенты с криптоспорвдиозом; 2-Крипто- пациенты без криптоспоридиоза

Особенности эпидемиологического анамнеза пациентов с микроспоридиоозом и криптоспоридиозом. Для выявления возможных факторов риска развития микроспоридиоза были проанализированы следующие данные анамнеза жизни: условия жизни (отдельная / коммунальная квартира, лицо БОМЖ); употребление инъекционных наркотиков; гомосексуальные половые контаткы; беспорядочная половая жизнь; злоупотребление алкоголем; место проживания (иногородний/ житель Санкт-Петербурга); наличие домашних животных. Было показано, что злоупотребление алкоголем встречалось в группе пациентов с микроспоридиозом достоверно чаще, чем у пациентов без микроспоридиоза (р=0,02). Также значимо влиял на наличие микроспоридиоза фактор «Лицо БОМЖ» (р= 0,04). В группе пациентов с криптоспоридиозом достоверно чаще встречался фактор «употребление инъекционных наркотиков» (р=0,05).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В Санкт-Петербурге уровень зараженности микроспоридиозом и криптоспоридиозом сопоставим с уровнем данных заболеваний в развивающихся странах или уровню заболеваемости в эпоху до широкого распространения АРВТ. Более частое выявление вида Enc. intestinalis, с

зоонозным механизмом передачи, по сравнению с Ent. beineusi, а также выявленный в нашем исследовании штамм 2 Enc. cuniculi, ранее выделявшийся только у животных, главным образом, грызунов, могут свидетельствовать о том, что в Санкт-Петербурге микроспоридиоз является зоонозой инфекцией. Возможно, преобладание Enc. intestinalis в наших образцах и наличие' «крысиного» штамма Enc. cuniculi отражает неблагополучные санитарно-эпидемиологические условия, что косвенно подтверждается данными о широкой распространенности острых кишечных инфекций в Санкт-Петербурге [Яковлев А.А. и др., 2010]. Более частое выявление С. parvum (64,7%), по сравнению с С. hominis (35,3%), подтверждает идею о зоонозном распространении исследуемых инфекций.

Обнаружение генотипов двух потенциально новых видов микроспоридий (номера в Генбанке CG408911 и CG408912), возможно, расширяет круг-известных патогенов человека.

Большинство пациентов с микроспоридиозом (69%) и криптоспоридиозом (76,5%) находились на продвинутых стадиях ВИЧ-инфекции с выраженной иммуносуппрессией, количеством CD4(+) Т-лимфоцитов менее 100 кл/мкл. Однако неожиданным оказалось, что 5 (17,2%) больных с микроспоридиозом имели уровень CD4(+) Т-лимфоцитов более 400 кп/мкл. Выявленные изменения показателей копрограмм, такие как изменение консистенции стула и наличие признаков нарушения всасывания в тонком кишечнике, в первую очередь, углеводов, говорят о вероятной роли микроспоридий в возникновении диарей у ВИЧ-инфицированных пациентов. Длительность диареи при микроспоридиозе в нашем исследовании была несколько ниже, чем описывается в литературе, и составила в среднем 11 дней. Снижение массы тела было выявлено у большинства пациентов с микроспоридиозом (89%): у 73% пациентов вес снизился более чем на 10%, что соответствует данным литературы [Endeshaw, Т. et al., 2006].

ВЫВОДЫ

1. Частота встречаемости микроспоридиоза в Санкт-Петербурге среди ВИЧ-инфицированных пациентов составила 19% (30 из 158). Были выявлены 4 известных вида: Encephalitozoon intestinalis - у 21 пациента (70%), Епс. cuniculi - у 3 (10%), Enterocytozoon bieneusi -у 2 (6,66%), Enc. hellem - у одного (3,33%) пациента; и два неописанных ранее генотипа микроспоридий (Microsporidium 1 и Microsporidium 2).

2. Частота встречаемости криптоспоридиоза в Санкт-Петербурге среди ВИЧ-инфицированных пациентов составила 17,2%, (17 из 99). Cryptosporidium parvum был выявлен у 11 (64,7%) пациентов и Cryptosporidium hominis - у 6 (35,3%) пациентов.

3. Микроспоридиальная инфекция у ВИЧ-инфицированных протекала с развитием длительной диареи с возникновением синдрома мальабсорбции, с преимущественным нарушением всасывания углеводов. Длительность диареи в среднем составляла 11 суток и приводила к тяжелой (более 10%) потере веса. Микроспоридиоз достоверно чаще выявлялся у ВИЧ-

инфицированных пациентов с количеством CD4(+) клеток менее 100 кл/мкл. Микроспоридиоз приводил к снижению уровня гемоглобина и эритроцитов и сопровождался повышением уровня С03>20 мм/ч.

4. Клиническим симптомом криптоспоридиальной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов является развитие диарейного синдрома, длящего, в среднем, 17,5 суток. Криптоспоридиоз чаще наблюдался у пациентов с низким (50 кл/мкл) уровнем CD4 (+).

5. Микроспоридиоз чаще диагносцировался у людей, злоупотребляющих алкоголем и у лиц «БОМЖ», а криптоспоридиоз - у лиц, употребляющих внутривенные наркотики.

РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для лабораторной диагностики микроспоридиоза целесообразно использовать молекулярно-биологические методы исследования (ПЦР) с расширенным набором праймеров для диагностики видов возбудителей. Для повышения эффективности диагностики криптоспоридиоза помимо обследования методом световой микроскопии образцов стула, окрашенных по Цилю-Нильсену, следует проводить ПЦР.

2. Для исследования на криптоспоридиоз образцы следует хранить в 2,5% растворе К2Сг207, при температуре 4°С. Образцы, предназначенные для исследования на микроспоридиоз, могут храниться либо в К2Сг207, либо замороженными при температуре -20°С.

3. В группу риска по микроспоридиозу у ВИЧ-инфицированных пациентов следует включать следующие показатели: снижение CD4 (+) лимфоцитов менее 100 кл/мкл; длительность диареи более 10 дней; снижение массы тела более 10%; сочетание анемии и длительной диареи; наличие в анамнезе злоупотребления алкоголем и/или фактора «лицо без определенного места жительства».

4. Обследование на криптоспоридиоз следует проводить ВИЧ-инфицированным пациентам с уровнем CD4 Т-лимфоцитов менее 200 кл/мкл и длительной, более 10 дней, диареей, особенно пациентам, употребляющим внутривенные наркотики.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Перспективным направлением развития темы «Клинико-лабораторная характеристика микроспоридиоза и криптоспоридиоза у ВИЧ-инфицированных пациентов» является расширение исследуемой группы пациентов для изучения географического распространения патогенов, и более полного статистического анализа возможных путей передачи возбудителей, а также тестирование на микроспоридиоз других биологических жидкостей для исследования путей диссеминации микроспоридиоза. Другим направлением развития темы может стать изучение эффективности этиотропной терапии изученных заболеваний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Соколова О И. Первый случай обнаружения спор микроспоридий у ВИЧ-инфицированного пациента в России / Соколова О. И., Демьянов А. В., Соколова Ю Я и др. - Альманах «Инфекционные болезни - 2003>> поя ред. А. 1. Рахмановой А. А. Яковлева, Е. Н. Виноградовой. - СПб, НИИХ СПбГУ, 2004. - С. 210-214

2 Demyanov A.V. Occurrence of Microsporidia and Cryptosporidia in stool samples from HIV positive patients with chronic diarrhea in The City Hospital for Infectious Diseases St. Petersburg, Russia / A. V. Demyanov, О. I Sokolova, V. A. Cama, A. A. Yakovlev et al. // Protistology. - №5(1). - P.21.

3 Соколова, О. И. Проблема микроспоридиальных инфекции человека. Первое исследование распространения кишечных микроспоридиозов среди- ВИЧ-инфицированных пациентов в России / О. И. Соколова, А. А. Яковлев // «Медицина XXI век».-2009,-Т. 3,-С. 23-35.

4 Соколова, О. И. Опыт использования технологии FTA для сбора, архивирования .. молекулярного анализа ДНК микроспоридий из клинических образцов / О. И. Соколова, А. В. Демьянов, Л. С. Боверс, Е. С. Дидье и др. // Цитология. - 2011. - №53(11). - С. 911-914.

5 Соколова, О. И. Микроспоридиоз у ВИЧ-инфицированных пациентов / О. И. Соколова, А. В. Демьянов, Л. С. Боверс, Е. С. Дидье и др. // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. — 2011. - № 3(3). - С. 63-70' . „

6 Kucerova, Z. Microsporidiosis and Ciyptospondiosis in HIV/AIDS Patients m St. Petersburg, Russia: Serological identification of microsporidia and Ciyptospondium parvum in sera samples from HIV/AIDS patients / Z. Kucerova, О I. Soto ova, A. V. Demyanov, M. Kvac et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 2011. - №27(1). - P.13-

7 ' Sokolova, O.I. Emerging ,microsporidian infections in Russian HIV-infected patients / О. I. Sokolova, A. V. Demyanov, L. C. Bowers, E. S. Didier et al // J. Clm. Microbiol. - 2011. - №49(6). - P. 2102-2108.

8 Соколова, О.И. Криптоспоридиоз у ВИЧ-инфицированных пациентов: диагностика и клинико-лабораторная характеристика / О.И. Соколова А.В. Демьянов, В.А. Дедов, Ю.Я. Соколова и др. // Журнал инфектологии. - 2012. -

f4(2)Soko\ovio. I. Microsporidia and Cryptosporidia in HIV-infected patients in St Petersburg, Russia. / Sokolova О. I., Demyanov A. V., Dedov V. A., Didier E. S. et al. // Proceedings from 12th International workshops on opportunistic protists (Tarrytown, New York).-2012.-P.31-32.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ APBT - антиретровирусная терапия, ВИЧ - вирус иммунодефицита человека, ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, ЖКТ - желудочно-кишечный тракт,

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных франментов,

ПЦР - полимеразная цепная реакция,

рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота,

СМ - световая микроскопия,

СОЭ - скорость оседания эритроцитов,

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита.

Подписано в печать 02.04.13 Формат 60x84/16

Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 219

Типографии ИМсдЛ, 194044, С116., ул. Академики Лсбсдепп, 6.