Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Клинико-лабораторная характеристика клеточных элементов периферической крови и функционального состояния эндотелия у женщин с бактериальным вагинозом

На правах рукописи

АХМАДУЛЛИНА Юлия Александровна

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЭНДОТЕЛИЯ У ЖЕНЩИН С БАКТЕРИАЛЬНЫМ ВАГИНОЗОМ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2013

005531776

005531776

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Гильманов Александр Жанович

Официальные оппоненты:

Козлов Антон Владимирович - доктор медицинских наук профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Северо-Западный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Дрыгин Алексей Никонорович - доктор медицинских наук, заместитель главного врача по научной работе ФГБУЗ Клиническая больница №122 им. Л.Г. Соколова ФМБА России.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 24 сентября 2013 г. в 15.00 ча;ов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.08 при ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кироьа» Министерства обороны Российской Федерации.

Автореферат разослан «_» июня 2013 г.

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук, профессор

Митин Юрий Алексеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

Среди патологических состояний, в этиологии и патогенезе которых значительная роль отводится бактериям и их компонентам, важное место занимает бактериальный вагиноз (БВ), широко распространенный среди женщин репродуктивного возраста. При БВ происходит замещение нормальной лактофлоры влагалища на условно-патогенные, преимущественно грамотрицательные, бактерии (Кира Е.Ф., 2001). Особый интерес вызывают физиологические и патофизиологические эффекты липополисахарида (LPS) внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Избыточное поступление LPS в системный кровоток влечет за собой развитие эндотоксиновой агрессии, способной быть причиной развития самых разнообразных синдромов (Лиходед В.Г., 2007).

С учетом таких особенностей патогенеза БВ, как повреждение эпителия влагалища бактериальными и лейкоцитарными ферментами и незавершенность фагоцитоза (Кира Е.Ф., 2001), можно предположить, что часть грамотрицательных бактерий и/или их LPS проникает через влагалищную стенку в лимфатические сосуды паравагиналыюй клетчатки и, в дальнейшем, попадает в системный кровоток, что может обусловливать целый ряд патофизиологических изменений в макроорганизме и активацию иммунологических механизмов, направленных на элиминацию патогена (Рябиченко Е.В., 2004). Поэтому очевидна необходимость детального изучения биологических эффектов LPS, в частности его влияния на клетки периферической крови, включая иммунные, и эндотелий, что позволит точнее определить патогенетическую роль липополисахаридемии и оптимизировать диагностические и лечебные мероприятия при данной патологии.

Степень разработанности темы исследования.

В работах отечественных и зарубежных ученых имеются сведения о бактериальном вагинозе у женщин (A.C. Анкирская, Е.Ф. Кира, В.И. Кисина, А.Р. Мавзютов, N.B. Ness, J.B. Bikowski, V. Pybus и др. авторы). В основном изучались

этиологические и клинические аспекты, диагностика и лечение дисбиоза влагалища. Бактериальный вагиноз проявляется комплексом патологических сдвигов на фоне резкого снижения уровня молочнокислой микрофлоры и колонизации влагалища бактериями вида Gardnerella vaginalis (часто в ассоциации с анаэробными бактериями). Поскольку одним из факторов патогенное™ грамотрицательных бактерий является капсульный липополисахарид (LPS), можно предположить, что он также играет определенную роль в развитии дисбиоза влагалища и иных патологических состояний организма, ассоциированных с персистенцией грамотрицательной флоры. До настоящего времени у женщин с дисбиотическими процессами во влагалище не определялись выраженность эндотоксинемии (концентрация LPS), уровни липополисахарид-связывающего белка (LBP) и антител класса IgG к соге-региону LPS.

В литературных источниках содержится информация о влиянии микробных эндотоксинов, в том числе бактериального LPS, на ряд клеток крови и эндотелий. Однако имеющиеся данные разрознены, противоречивы и в основном касаются инфекционных заболеваний и септических состояний. Вместе с тем, практически отсутствуют сведения о структурной и функциональной патологии клеточных элементов крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) и эндотелия при невоспалительной патологии, связанной с действием малых количеств липополисахарида грамотрицательных бактерий (вагинальный дисбиоз различной степени выраженности у женщин). Исследование этих аспектов позволило бы рассматривать изменения параметров крови при бактериальном вагинозе в связи с маркерами повреждения эндотелия и иммунными сдвигами как адаптивные либо патологические, способные усугублять течение заболевания и подлежащие патогенетической коррекции, что и послужило основанием для диссертационного исследования.

Цель исследования.

Определить особенности эндотоксинемии и ассоциированных с ней количественных и функциональных изменений клеток периферической крови и эндотелия у женщин с бактериальным вагинозом.

Задачи исследования.

1. Определить концентрацию бактериального липополисахарида, липополисахарид-связывающего белка, антител к соге-региону липополисахарида в плазме крови женщин с дисбиозом влагалища.

2. Оценить количественные и функциональные изменения клеток эритроидного, лейкоцитарного и тромбоцитарного звена периферической крови у пациенток с бактериальным вагинозом.

3. Оценить функциональные свойства эндотелия у женщин с бактериальным вагинозом.

4. Оценить цитокиновый статус у женщин с дисбиозом влагалища.

5. Определить патогенетическую значимость обнаруженных ' изменений, необходимость и возможные подходы к их коррекции.

Научная новизна исследования.

Выявлено, что в плазме крови пациенток с дисбиозом влагалища Ш ст. имеется достоверное повышение уровня LPS грамотрицательных микробов. Бактериальный вагиноз сопровождается изменениями цитокинового баланса с возрастанием плазменного уровня IL-2, IL-4, IL-6, TNF-a, снижением IL-ip, IL-10. Уровень IL-8 в плазме крови пациенток с дисбиотическими процессами во влагалище достоверно снижается при II ст. и повышается при Ш ст. БВ. Особенностями специфического иммунного ответа организма является достоверное увеличение выработки антител к соге-региону LPS при I и П ст. вагинального дисбиоза с последующим снижением при Ш ст., а также тенденция к активации синтеза LBP на начальных этапах БВ со снижением его уровня при прогрессировании дисбиоза.

Впервые обнаружено, что на фоне эндотоксинемии при БВ имеется тенденция к увеличению среднего объема эритроцитов и средней концентрации гемоглобина в эритроцитах, а также к повышению общего количества лейкоцитов с последующим их снижением по мере нарастания интоксикации. Обнаружена положительная корреляционная связь между степенью эндотоксинемии,

значениями лейкоцитарных индексов интоксикации и наличием вакуолизированных форм лейкоцитов в крови. Реакция тромбоцитарного звена периферической крови на эндотоксинемию заключается в снижении общего количества тромбоцитов и их агрегационных свойств и достоверном возрастании плазменного уровня тромбоксана В2.

Оценка состояния эндотелия в условиях системной эндотоксинемии при БВ показала противоречивую динамику уровня эндотелина, адгезивных молекул 8РЕСАМ-1 и вУСАМ-1 и снижение концентрации фактора Виллебранда по мере прогрессирования дисбиотического процесса.

Теоретическая и практическая значимость работы.

На основании обнаруженных изменений сформулированы подходы к целесообразности определения изменения клеточного состава периферической крови и эндотелиальной дисфункции на фоне эндотоксинемии при БВ, предполагающие контроль состояния гематологических и иммунологических показателей при выраженной степени патологии. При превышении индивидуальных адаптационных возможностей детоксицирующих систем организма, в том числе иммунной, возможно применение средств патогенетической терапии с дезинтоксикационным и иммунорегуляторным действием.

Методология и методы исследования.

Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного поиска. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого исследования с использованием клинико-лабораторных и статистических методов.

Положения диссертации, выносимые на защиту.

1. При декомпенсированном бактериальном вагинозе наблюдается нарастание уровня липополисахарида грамотрицательных бактерий в плазме крови пациенток. При этом на начальных этапах дисбиоза отмечается умеренное повышение концентрации липополисахарид-связывающего белка и нарастание

уровня антител к соге-региону липополисахарида в плазме крови, при прогрессировании дисбиоза их уровни снижаются.

2. Повышение плазменного уровня эндотоксина при дисбиозе влагалища сопровождается количественными сдвигами параметров клеточных элементов периферической крови: тенденцией к увеличению среднего объема эритроцитов, средней концентрации гемоглобина в эритроцитах, а также возрастанием общего количества лейкоцитов, которое снижается при нарастании интоксикации. С увеличением плазменной концентрации бактериального липополисахарида связано повышение лейкоцитарных индексов интоксикации и появление вакуолизированных форм лейкоцитов в крови. Реакция тромбоцитарного звена на эндотоксинемию проявляется достоверным возрастанием плазменного уровня тромбоксана В2 и тенденцией к снижению АДФ-зависимой агрегации тромбоцитов; выраженный дисбиотический процесс ассоциирован со снижением общего количества тромбоцитов, увеличением их среднего объема и показателя анизоцитоза.

3. В условиях вагинального дисбиоза в антиэндотоксиновые реакции вовлекается сосудистый эндотелий, что проявляется ростом плазменного уровня молекул адгезии яРНСЛМ-1 и 5УСАМ-1 и фазными изменениями эндотелина-1 и фактора Вштлебранда.

4. Среди причин количественных и качественных изменений элементов периферической крови при дисбиотическом процессе во влагалище определенное место могут занимать изменения цитокинового баланса: повышение уровня 1Ь-2, 1Ь-6, "ШГ-а, 1Ь-4, снижение \L-\fi, 1Ь-10, снижение 1Ь-8 при II ст. и его повышение при Ш ст. БВ.

Степень достоверности и апробация результатов.

Степень достоверности полученных результатов определяется достаточным количеством пациенток (151 женщина), рандомизацией и формированием основных групп наблюдения и группы контроля, адекватными методами исследования и корректными методами статистической обработки. Пациентки, составившие основную группу, были включены в исследование на основании

клинического диагноза бактериального вагиноза, поставленного с учетом анамнестических данных и подтвержденного лабораторными методами. Из исследования исключались женщины с сопутствующей соматической патологией. Добровольное участие пациенток в исследовании подтверждалось их письменным согласием.

Материалы диссертации были представлены на V региональном научном форуме «Мать и дитя» (Геленджик, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине (Омск, 2011); 21-м конгрессе ШСС - Международной федерации клинической химии и лабораторной медицины (Берлин, 2011). Апробация работы состоялась на совместном научном заседании сотрудников кафедр лабораторной диагностики ИПО, фундаментальной и прикладной микробиологии, акушерства и гинекологии №2, биологической химии, хирургических болезней и новых технологий, ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России (Уфа, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 5 - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах компьютерного текста, содержит 25 таблиц, 18 рисунков, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации и список использованной литературы, включающий 80 отечественных и 110 зарубежных авторов.

Конкурсная поддержка работы. Работа выполнена при поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.», в рамках реализации мероприятия 1.2.1 «Государственный контракт № П385 от 30 июля 2009 г.»

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В соответствии с целями и задачами работы было проведено лабораторное обследование 151 женщины в возрасте 18-45 лет (в среднем 26,2±0,5 лет), обратившейся в женскую консультацию ГКБ №21 г. Уфы в 2010-2011 годах для профилактического гинекологического осмотра и обследования. 83 пациентки с лабораторно верифицированным диагнозом БВ составили основную группу, 68 клинически здоровых женщин без признаков БВ - контрольную группу.

Для сравнительного анализа полученных результатов пациентки из основной группы по выраженности БВ были разделены на три подгруппы: 25 женщин (30,1 %; л=83) - с первой степенью дисбиоза; 28 пациенток (33,7 %, п=83) - со второй степенью БВ; 30 женщин (36,2 %, п=83) - с третьей степенью БВ. Диагноз бактериального вагиноза был установлен врачами акушерами-гинекологами женской консультации ГКБ №21 на основании клинических и анамнестических показателей, и верифицирован по данным световой микроскопии мазка из заднего свода влагалища и определения реакции вагинального секрета (рН-метрия). Для описания микроскопической картины влагалищного биоценоза проводилась световая микроскопия окрашенных по Граму мазков (микроскоп Люмам-Р8, JIOMO, г. Санкт-Петербург). Степень дисбиоза влагалища определялась микроскопически по критериям, предложенным Мавзютовым А.Р. и соавт. (2001). В дальнейшем проводились бактериологические посевы с количественным анализом микробиоценоза, молекулярно-генетическое (ПЦР) и иммунохимическое (ИФА, ИХЛ) исследование на наличие заболеваний, передаваемых половых путем.

Для оценки уровня эндотоксинемии и состояния антиэндотоксинового иммунитета у пациенток основной и контрольной групп до начала лечебных мероприятий проводилось определение в плазме крови концентрации липополисахарвда (LPS), антител класса IgG к соге-региону LPS и белка, связывающего LPS (LBP). Для определения уровня LPS применялся хромогенный ЛАЛ-метод (Лизат Амебоцитов Limulus) по конечной точке с использованием

тест-системы ENDOSAFE® ENDOCHROME™ производства HyCult Biotechnology (Голландия). Тест основан на способности липополисахарида грамотрицательных бактерий вызывать коагуляцию белковых фракций гемолимфы амебоцитов краба Limulus polyphemus. Количественное определение человеческого LBP и IgG к соге-региону LPS в плазме крови осуществляли иммуноферментным методом при помощи наборов HUMAN LBP ELISA КГГ и ENDOCAB ELISA (HyCult Biotechnology, Голландия).

Для определения концентрации в плазме крови цитокинов (TNF-a, IL-ip, IL-2, IL-6, IL-8, IL-4, IL-10) использовали твердофазный ИФА с применением тест-наборов «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Гематологические показатели периферической (венозной) крови определяли на гематологическом анализаторе Abacus Junior Human (Diatron, Австрия) по 18 параметрам, включая дифференцировку лейкоцитов на 3 группы. Для оценки морфологии клеток периферической крови проводили световую микроскопию окрашенных по Романовскому-Гимзе мазков крови на микроскопе Люмам-Р8. Оценивалась степень гипохромии, анизоцитоза пойкилоцитоза полихроматофилии эритроцитов; наличие патологических форм эритроцитов; патологических включений в эритроидных клетках, патологических и дегенеративных лейкоцитов и тромбоцитов. Исследование агрегационной способности тромбоцитов проводилось на лазерном агрегометре «BIOLA 230LA» (НПФ «Биола», Россия); в качестве индуктора агрегации применялся 0,2 мМ АДФ (НПО «Ренам», Россия).

Для количественного определения тромбоксана В2 использовался метод конкурентного ИФА с применением тест-набора Assay Designs Correkate-EIA Thromboxane B2 (Biomedica Gruppe, Австрия). Для определения концентрации фактора Виллебранда и эндотелина-1 (1-38) применялись наборы Technozym vWF:Ag ELISA (Technoclone, Австрия) и BIG ENDOTHELIN (Biomedica Gruppe, Австрия), основанные на твердофазном ИФА. Во всех иммуноферментных исследованиях использовался фотометр BioRad iMark (США) со светофильтром 450 нм.

В основу обеспечения качества исследований на преаналитическом этапе были положены требования ГОСТ Р 53079.4 - 2008. Для оценки качества гематологических исследований на аналитическом этапе ежедневно проводили трехуровневый контроль (низкий, нормальный, высокий уровень) с использованием контрольной крови Para 12 Extend (США). Для контроля качества в ИФА использовались контрольные материалы, входящие в состав наборов.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistika 5.1 (Реброва О.Ю., 2002).

Для проверки гипотезы о нормальности распределения параметра в выборочной совокупности использовали критерий Шапиро-Уилка (W). Если показатель имел нормальное распределение, то применялись методы параметрической статистики (расчет средней арифметической и ее стандартной ошибки, критерия Стьюдента, коэффициента линейной корреляции Пирсона). Для показателей, не имеющих нормального распределения, вычислялась медиана и проводился ранговый анализ по методу Краскела-Уоллеса. Достоверность различий количественных показателей оценивалась по критерию Манна-Уитни, а относительных показателей - по х2-критерию (Hollender M., et al.,1983). Различия оценивались как статистически значимые при р<0,05.

С целью проверки гипотезы о влиянии степени БВ на уровень эндотоксина и выраженность иммунного ответа (LBP и IgG-антител к соге-региону LPS) был использован метод дисперсионного анализа по Фишеру, позволяющий оценивать степень влияния одного или нескольких контролируемых факторов на «результативный признак» - переменную, зависимую от фактора или сочетания факторов. Результаты выражались через коэффициент силы влияния фактора Г|2 и показатели достоверности влияния - критерий F и уровень его значимости р. Влияние фактора менее 5 % в расчет не принималось.

Результаты дисперсионного анализа интерпретировались по значению г -коэффициента корреляции количественного или качественного признака с качественным или категориальным. Для сравнения отдельных средних значений использовался критерий Fd (Гареев Е.М., 2009).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Уровень LPS в плазме крови всех исследуемых групп женщин не превышал физиологической концентрации (0-1 EU/мл, согласно инструкции к тест-системе) и статистически значимо не различался, составив в среднем 0,54±0,52 EU/мл у пациенток с БВ против 0,38+0,33 EU/мл у здоровых женщин (М±о; р>0,05). Исключением был БВ Ш степени, когда уровень LPS значимо превышал показатели контроля.

Согласно результатам дисперсионного анализа, в нашем исследовании влияние фактора степени дисбиоза влагалища на уровень LPS оказалось статистически значимым (F=5,7, р<0,001), хотя и относительно слабым (г\2=10%; г=0,32). Так, при третьей степени БВ (рисунок 1) средний уровень LPS (0,69+0,56 EU/ мл) оказался достоверно (р<0,001) выше, чем при первой и второй степенях (0,39±0,26 EU/ мл и 0,37±0,22 EU/ мл, соответственно); между последними статистически значимых различий не обнаружено (р>0,8). При дисбиозе третьей степени мера внутригрупповой случайной вариации уровня LPS (Sd) была статистически значимо выше (р<0,003), чем при первых двух степенях дисбиотического процесса, что отражает значительную неоднородность пациенток по этому параметру при БВ Ш ст. Вследствие различия дисперсий в группах для проверки наблюдаемых тенденций применялись непараметричеекме критерии. Критерий Краскела-Уоллеса подтвердил статистическую значимость наблюдаемых тенденций (Нк=8,1, р<0,05), критерий Манна-Уитни - значимость различий Ш степени дисбиоза с первой и второй (U>200, р<0,03).

Рисунок 1 - Средние значения концентрации липополисахарида у пациенток с различной степенью вагинального дисбиоза и у здоровых женщин. По оси абсцисс: 0 - контрольная группа; 1,2,3 - степени дисбиоза, по оси ординат -концентрация LPS в EU/мл, ГДИ - границы доверительных интервалов для средних значений, СО - стандартная ошибка средней.

Уровень ЬВР у всех обследованных женщин был существенно выше референтных значений (до 10 мкг/мл, согласно руководству к тест-системе). При третьей степени БВ уровень ЬВР (23,3±16,5 мкг/мл) оказался значимо (р<0,02) ниже, чем у пациенток с отсутствием БВ или при первых двух его степенях (рисунок 2), которые, в свою очередь, достоверно не отличались друг от друга (р=0,3-0,8). Отмечалось возрастание неоднородности пациенток (увеличение Бс!) по уровню ЬВР при третьей степени дисбиоза.

Ш гди : ±сс » Средние по

Рисунок 2 - Средние значения концентрации ЬВР у пациенток с различной степенью вагинального дисбиоза и у здоровых женщин. По оси абсцисс: 0 -контрольная группа; 1,2,3 - степени дисбиоза, по оси ординат - концентрация ЬВР в мкг/мл, ГДИ - границы доверительных интервалов для средних значений, СО -стандартная ошибка средней.

При анализе изменений уровня антител класса к соге-региону

липополисахарида обнаружено, что их концентрация в крови пациенток была значительно выше, чем в группе контроля, и сильно зависела от степени дисбиотического процесса во влагалище (г|2=32 %, г=0,56; Г=22,6; р<0,0001): она была выше при первой степени БВ (1,15±0,81 Ми/мл) в сравнении со второй (0,56+0,28 Ми/мл) и третьей (0,45+0,27 МЫ/мл) степенями; различия между последними не были выраженными (р>0,3). Таким образом, наблюдалась четкая тенденция к снижению уровня анти-соге антител по мере прогрессирования дисбиотического процесса во влагалище.

У женщин с БВ отмечались изменения ряда гематологических показателей, в основном не превышающие порог достоверности. При оценке эритроидного

звена выявлено, что среднее количество эритроцитов у женщин с различными степенями дисбиоза влагалища (4,38±0,59, 4,39+0,35, 4,35+0,52x1012 /л) имело значимую тенденцию к уменьшению (р<0,05) по сравнению со здоровыми лицами (4,68±0,40х1012/л), но при этом не выходило за пределы физиологической нормы. Различие межиндивидуальной вариабельности числа эритроцитов в группах женщин с БВ оказалось статистически недостоверным (р>0,40). Изменения концентрации гемоглобина и гематокрита у женщин с дисбиозом влагалища и у здоровых лиц, а также по мере прогрессирования дисбиотического процесса не были статистически значимыми, и во всех обследуемых группах находились в пределах нормальных значений.

Результаты определения эритроцитарных индексов у женщин с дисбиозом влагалища и у здоровых пациенток представлены в таблице 1. Как видно из приведенных в ней данных, наблюдалось увеличение среднего объема эритроцитов у пациенток с БВ: показатель МСУ оказался значимо выше (р<0,05) при БВ по сравнению с контрольной группой.

Таблица 1. Эритроцитарные индексы у пациенток с БВ и у здоровых женщин (М±о)

Наименование показателя Контрольная группа (п=68) Женщины с БВ I ст. (п=25) Женщины с БВ II ст. (п=28) Женщины с БВ III ст. (п=30)

Средний объем эритроцита (МСУ), фл 77,45+6,43 80,47±6Д1* 80,45+4,17* 82,39+4,27*

Среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН), пкг 26,12+1,86 2б,39±1,83 26,95+1,92* 28,11+1,06*

Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС), г/л 337,58±10,95 324,25±7,41* 344,59+11,18* 338,52±17,18

Показатель анизоцитоза эритроцитов (1Ш\У), % 14,3±0,75 14,32+1,36 14,41+1,03 14,07±1,46

Примечание: *- достоверность различий (р<0,05 в тесте Манна-Уитни) по отношению к контрольной группе.

При межгрупповом сравнении среднего объема эритроцитов (MCV) у пациенток с различной степенью бактериального вагиноза не выявлено его достоверных изменений. Хотя тенденция к увеличению MCV при прогрессировал™ дисбиоза влагалища имеет положительную корреляционную связь с уровнем LPS в плазме крови у женщин с БВ.

Похожая картина наблюдалась в отношении среднего содержания гемоглобина в эритроците (МСН). Его средний уровень оказался достоверно выше у пациенток со II и III ст. дисбиоза влагалища по сравнению со здоровыми женщинами (р=0,021 и р=0,000012, соответственно) и пациентками с I ст. БВ.

Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС), напротив, имела значимую тенденцию (р=0,00001) к уменьшению у пациенток с I ст. бактериального вагиноза по сравнению со здоровыми лицами, и при нарастании степени дисбиоза влагалища достоверно (р=0,002) повышалась. Показатель гетерогенности эритроцитов по объему, характеризующий степень анизоцитоза (RDW), во всех исследуемых группах не выходил за пределы референтных значений (11,5-14,5 %).

Общее число лейкоцитов (WBC) во всех исследуемых группах не выходило за пределы референтных значений (4,0-9,0x10%), но наблюдалась достоверная тенденция (р<0,0001) к увеличению их числа у пациенток с дисбиозом влагалища II ст. (7,73± 1,76х 10у/л) по сравнению с контрольной группой (6,16±1,04х109/л) и значимое уменьшение (р=0,014) общего числа лейкоцитов у женщин с БВ III ст. (6,55±1,69х109/л) по сравнению с пациентками с БВ II ст.

Абсолютное количество различных популяций лейкоцитов также не выходило за референтные пределы. Однако при I ст. БВ наблюдалась достоверная тенденция к уменьшению числа палочкоядерных нейтрофилов (0,11 ±0,02x10ч/л; р=0,0007), эозинофилов (0,14+0,02x10ч/л; р=0,046), и лимфоцитов (1,79+0,11x10%; р=0,009) по сравнению с контрольной группой (0,19±0,01; 0,14±0,02; 2,21±0,07х10ч/л, соответственно). При II ст. дисбиоза влагалища наблюдалось достоверное (р=0,002) повышение базофилов по сравнению с контрольной группой (0,07±0,03 и 0,01±0,003х10ч/л, соответственно).

Одним из выражений лейкоцитарного звена на воздействие эндотоксинов служит изменение их популяционного состава, выражающееся в сдвигах лейкоцитарных индексов интоксикации (таблица 2).

Таблица 2. Лейкоцитарные индексы интоксикации у пациенток с различной степенью вагинального дисбиоза и у здоровых женщин (М ± о).

Показатели Контрольная группа (п=68) Женщины с БВ I ст. (п=25) Женщины с БВ II ст. (п=28) Женщины с БВ III ст. (п=30) Референтные значения

ЛИИ по Кальф- Калифу 1,23±0,53 1,93+0,69* 1,73±0,69* 1,98+0,72* 0,3-1,5

ЛИИ по Островскому 0,18+0,07 0,21±0,11 0.24+0,12* 0,52+0,58* 0.5-1.6

Коэффицент нейтрофилы/ лимфоциты 1,61±0,61 1,48±0,59 2,66±0,09 * ** 1,97+0,72 1,2-1,8

Примечание: *- достоверность различий (р<0,05 в тесте Манна - Уитни) по отношению к контрольной группе; ** - р<0,05 между группами пациенток с БВ I и II ст.; *** - р<0,05 между группами пациенток с БВ П и III ст.

Как видно из данных в таблице, ЛИИ по Кальф-Калифу имел значимую тенденцию к повышению у женщин с дисбиозом влагалища всех степеней, причем его значения превосходили пределы нормы (до 161 % по отношению к контролю). Лейкоцитарный индекс интоксикации по Островскому хотя и не выходил за нормальные пределы, но показывал значимую тенденцию к повышению по мере усугубления дисбиотического процесса (БВ П и Ш ст.). Сходные сдвиги наблюдались и в отношении коэффицента нейтрофилы/лимфоциты - «облегченного» варианта ЛИИ, причем наивысшее его значение вследствие особенностей реакции двух указанных видов лейкоцитов пришлось на БВ П ст.

При морфологической оценке клеток периферической крови у пациенток с БВ лейкоциты с токсигенной зернистостью не были обнаружены, однако в части клеток - как в нейтрофилах, так и в моноцитах - наблюдалась вакуолизация цитоплазмы. У здоровых женщин подавляющую массу составляют невакуолизированные моноциты; доля вакуолизированных клеток составляла 19 %. При дисбиозе влагалища I ст. она снижалась до 8 %, при БВ П и Ш степени доля вакуолизированных моноцитов возрастала до 52 % (р<0,002) и 43 % (р<0,02), соответственно.' Доля вакуолизированных нейтрофилов у здоровых женщин и у пациенток с I степенью БВ составляла 6 и 5 %, соответственно; при II степени

дисбиоза влагалища вакуолизированные нейтрофилы обнаруживались у 11 % женщин, при Ш степени - у 9 %.

Уровень тромбоцитов у пациенток с дисбиозом влагалища, как и у здоровых женщин, определялся в пределах физиологических значений (150-380x109/л). Вместе с тем, была отмечена тенденция к снижению их количества при БВ; достоверность подтверждена у пациенток с I степенью (280,84±66,51109/л) и Ш степенью дисбиоза (271,87±57,38х109/л; р=0,017 и р=0,0071, соответственно), хотя четкой зависимости от степени дисбиоза не наблюдалось.

Средний объем тромбоцитов (MPV) при умеренной эндотоксинемии у женщин с БВ и у здоровых лиц не выходил за пределы референтных значений, но имелась достоверная тенденция к его снижению у пациенток со II степенью дисбиоза влагалища (7,73 ± 0,70 фл) по сравнению с контролем (8,22±0,62 фл). Также было констатировано увеличение данного показателя у женщин с БВ Ш ст. (8,66 ± 0,56; р=0,007). Показатель анизоцитоза тромбоцитов (PDW) был увеличен (р=0,007) у женщин с БВ III ст. (39,18±1,87%).

Показатели агрегационной функции тромбоцитов у пациенток с дисбиозом влагалища, как и у здоровых женшин, в целом не выходили за физиологические пределы. Однако, наблюдалось статистически достоверное снижение агрегации тромбоцитов у пациенток с БВ III ст. (64,63±9,99%; р=0,002) по сравнению с группой контроля (70,74 ± 6,51%) и с женщинами, имеющими дисбиоз влагалища I ст. (б9,94±6,72%; р=0,014).

Концентрация тромбоксана В? (TxBi) в плазме крови пациенток возрастала по мере прогрессирования дисбиотического процесса (рис. 3), причем во всех исследуемых группах она превышала референтный уровень, составляющий 1-2 пг/мл (согласно инструкции к тест-системе).

Для оценки степени раздражения эндотелия кровеносных сосудов при воздействии эндотоксина у пациенток с БВ определялся плазменный уровень sPECAM-1, sVCAM-1, эндотелина-1 и фактора Виллебранда (vWF) (рис. 4-5). Из представленных данных видно, что у женщин с дисбиозом влагалища и в контрольной группе концентрация sPECAM-1 сохранялась в референтных пределах (42,8-91,0 нг/мл), однако отмечалось ее значительное увеличение

(р«0,0001) у пациенток с БВ III степени по сравнению с остальными группами. Средний уровень бУСАМ! при БВ также не выходил за референтные пределы (675-1693 нг/мл, согласно руководству к тест-системе), но прослеживался его рост по мере прогрессирования дисбиоза влагалища.

зо----------------

Здоровые I степень 11 степень III степень

Рисунок 3 - Концентрация ТхВ2 (пг/мл) в плазме крови пациенток с различной степенью дисбиоза влагалища.

ИГ гди

LZ3 ±со

• Средние п Группам

Рисунок 4 - Уровень 5РЕСАМ (нг/мл) в плазме крови пациенток с БВ и здоровых женщин.

Примечание: 0 - контрольная группа; 1,2,3 - степени дисбиоза, ГДИ -граиицы доверительных интервалов для средних значений. СО - стандартная ошибка средней.

1050 1000

Ш ГДИ

I I ¿со

• Средние по группам

Рисунок 5 - Уровень в УСАМ-1 (нг/мл) в плазме крови у пациенток с БВ и здоровых женщин.

Примечание: 0 - контрольная группа; 1, 2, 3 - степени дисбиоза, ГДИ -границы доверительных интервалов для средних значений, СО - стандартная ошибка.

Уровень бУСАМ-1 при I степени БВ был повышен по сравнению с контролем на 24 %, при II степени - на 37 %, при Ш степени - на 42 %; различия между контрольной группой и группами пациенток с БВ статистически значимы (р=0,0099, р=0,0001 и р=0,0018, соответственно). Достоверное нарастание уровня вУСАМ-1 при утяжелении БВ также подтверждается ранговым критерием Краскела-Уоллеса (Нк=14,9; р<0,005).

При оценке плазменного уровня эндотелина-1 было выявлено, что у пациенток с БВ и в контрольной г руппе он не превышал физиологической нормы (1 пг/мл), но вместе с тем наблюдалась тенденция к повышению его уровня у женщин с БВ Ш ст. по сравнению с контрольной группой (р=0,0005) и с пациентками с БВ I и II ст. (р=0,004 и р=0,00001).

Обнаружено достоверное увеличение другого важного маркера дисфункции эндотелия - фактора Виллебранда - у женщин с БВ I, II и III ст. по сравнению с контрольной группой (р=0,0019; р=0,00001; р=0,()195, соответственно). Также выявлены статистически значимые различия концентрации в зависимости от

степени дисбиоза влагалища - в частности, снижение его уровня у женщин с БВ Ш ст. по сравнению с пациентками с БВ I и П ст. (р=0,002 и р=0,0001).

Для определения возможных причин наблюдавшихся количественных и качественных сдвигов клеток периферической крови при БВ у пациенток оценивались уровни регуляторных факторов, в частности, гуморальных -плазменная концентрация цитокинов различной направленности действия. Анализ показал существенные сдвиги уровня ряда цитокинов у женщин с БВ по сравнению с контрольной группой (таблица 3).

Таблица 3. Концентрация цитокинов в плазме крови пациентов с БВ и здоровых женщин (пг/мл; М ± о).

Показа тели Референтный уровень (пг/мл) Контрольная группа (п=68) Женщины с БВ I ст. (п=25) Женщины с БВ П ст. (п=28) Женщины с БВ Ш ст. (п=30)

ЮТ-а <6 5,96+4,29 23,93+11,75* 33,39±28,09* 15,38±19,63*

П.-1Р < 11 6,38±2,24 3,54±1,96* 1,42±1,14* 2,32±2,09*

П.-2 < 10 1,46±1,64 8,91+4,32* 2,83+2,11* 10,29±10,68*

ГЬ-4 <10 0,83±0,46 0,86±0,68 1,04±0,51 1,23±0,57*

1Ь-6 < 10 0,45±0,42 0,76±0,41* 1,12±0,57* 1,45±1,21*

1Ь-8 <10 6,29±1,75 6,89±1,77 4,49±1,53* 7,28±2,42*

П.-10 <20 35,9+14,1 39,3±16,0 26,5+21,5* 23,6±23,9*

Примечание: *- достоверность различий (р<0,05 в тесте Манна-Уитни) по отношению к контрольной группе.

Изменения цитокинового баланса проявлялись в тенденции к повышению уровня провоспалительных 1Ь-2,1Т-6, ТОТ-а в плазме крови; наибольшие сдвиги отмечались в отношении ЮТ-а. Максимальный уровень 1Ь-8 наблюдался у женщин с Ш ст. дисбиоза влагалища. Иная картина сложилась с 1Ь-1р, концентрация которого у пациенток с БВ статистически значимо снижалась. Уровень 1Ь-4 по мере утяжеления БВ возрастал, а концентрация 1Ь-10 по мере развития дисбиотического процесса, наоборот, уменьшалась.

Отмеченные тенденции находят частичное подтверждение в ходе корреляционного анализа полученных данных (таблица 4). Установлена статистически значимая слабая прямая корреляционная связь между уровнем

эндотоксина и концентрацией 1Ь-2 и 1Ь-10, а также обратная связь средней силы между уровнем ЬВР в крови и концентрацией ГЬ-4.

Таблица 4. Корреляция уровня липополисахарида и связывающих его белков с плазменной концентрацией различных цитокинов у женщин с БВ.

Корреляционная связь между: и уровнем эндотоксина (LAL-тест) и уровнем LBP и уровнем anti-core IgG

TNF-a г = 0,138 Р = 0,153 г = -0,233 Р = 0,022* г = 0,187 Р= 0,116

IL-lß г = 0,139 Р = 0,153 R= 0,232 Р = 0,022* г= 0,187 Р = 0,116

IL-2 г = 0,218 Р = 0,023* г = -0,406** Р< 0,001 г = 0,015 Р = 0,899

IL-4 г =-0,001 Р = 0,986 г =0,046 Р = 0,658 г = -0,227 Р = 0,058

IL-6 г = 0,122 Р = 0,247 г =-0,007 Р = 0,944 г = 0,105 Р = 0,423

IL-8 г = 0,170 Р = 0,078 г = -0,192 Р = 0,061 г = -0,137 Р = 0,250

IL-10 г = 0,282 р = 0,004* г = -0,108 Р = 0,305 г = -0,061 Р = 0,616

Примечания: г - коэффициент корреляции, Р - показатель его статистической значимости. * - достоверная корреляционная связь любой степени, ** - достоверная корреляционная связь средней степени.

Уровень LBP и содержание IL-ip также имели слабую прямую взаимозависимость, LBP и TNF-a - слабую обратную взаимосвязь. Кроме того, при повышении уровня антител класса IgG к соге-региону LPS проявлялась тенденция к снижению уровня IL-4.

ВЫВОДЫ

1. В плазме крови пациенток с декомпенсированным бактериальным вагинозом (III степень) наблюдается увеличение концентрации липополисахарида грам-отрицательных бактерий. Специфический иммунный ответ организма на начальных этапах бактериального вагиноза проявляется нарастанием титра антител к соге-региону липополисахарида с последующим их снижением при утяжелении дисбиоза. Концентрация липополисахарид-связывающего белка имеет тенденцию к снижению при прогрессировании дисбиотического процесса.

2. Рост уровня эндотоксина при дисбиозе влагалища сопровождается тенденцией к увеличению среднего объёма эритроцитов, средней концентрации гемоглобина в эритроцитах, а также общего количества лейкоцитов (с их снижением по мере утяжеления дисбиоза). С выраженностью эндотоксинемии связано возрастание лейкоцитарных индексов интоксикации и появление вакуолизированных форм лейкоцитов в крови. Реакция тромбоцитарного звена на эндотоксинемию различной выраженности проявляется значимым возрастанием плазменного уровня тромбоксана В2 и тенденцией к снижению АДФ-зависимой агрегации тромбоцитов. Более выраженный дисбиотический процесс ассоциирован со снижением общего количества тромбоцитов, увеличением их среднего объема и показателя анизоцитоза.

3. Реакция клеток сосудистого эндотелия на эндотоксинемию при бактериальном вагинозе проявляется ростом в плазме крови уровня молекул адгезии бРЕСАМ-1, УСАМ-1 и фазными изменениями маркеров эндотелиальной дисфункции (эндотелии-1, фактор Виллебранда).

4. Изменения цитокинового баланса при вагинальном дисбиозе проявляются существенным повышением уровня ГЬ-2, 1Ь-6, ЮТ-а, 1Ь-4, снижением ГЬ-1Р, ТЬ-Ю. Плазменный уровень 1Ь-8 снижается при субкомпенсированной стадии и повышается при декомпенсированной стадии бактериального вагиноза.

5. При бактериальном вагинозе I и П степени поступление липополисахарида грамотрицательных микробов в организм не вызывает выраженного иммунопатогенного эффекта и не приводит к существенным количественным и качественным изменениям клеточных элементов периферической крови. Дисбиоз влагалища Ш степени, сопровождающийся ростом уровня липополисахарида в плазме, достоверными изменениями цитокинового статуса, функциональных показателей лейкоцитарного и тромбоцитарного звеньев периферической крови и эндотелия, может рассматриваться как промежуточная стадия на пути к явному патологическому процессу, при которой может потребоваться проведение корригирующих мероприятий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При лабораторном обследовании пациенток с бактериальным вагинозом III степени для объективной оценки тяжести токсического воздействия и дифференциации дисбиотической и воспалительной реакции, дополнительно к общепринятым тестам, рекомендуется определять плазменный уровень LPS, количество лейкоцитов в крови, долю вакуолизированных моноцитов и лейкоцитарный индекс интоксикации.

2. При декомпенсированном дисбиоза влагалища для оценки степени и направленности реагирования иммунной системы и, при необходимости, решения вопроса о проведении дезинтоксикационных и иммунокорригирующих мероприятий рекомендуется определение концентрации TNF-a, IL-6, IL-10, а также уровня антител к соге-региону LPS в плазме крови.

3. Пациенткам с субкомпенсированным и декомпенсированным течением дисбиоза влагалища рекомендуется мониторинг состояния тромбоцитарного звена периферической крови (по уровню ТхВ2) и эндотелия (по концентрации sPECAM-1, sVCAM-1) с целью своевременного предупреждения развития нарушений микроциркуляции и тромботических осложнений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование показало, что декомпенсированный-бактериальный вагиноз сопровождается более выраженной эндотоксинемией и некоторым снижением показателей специфического иммунного ответа по сравнению с компенсированным и субкомпенсированным дисбиозом. Эндотоксин грамотрицательных бактерий у женщин с дисбиотическими процессами во влагалище оказывает наибольшее влияние на тромбоцитарное звено периферической крови и эндотелий, что проявляется тенденцией к снижению общего количества тромбоцитов и их агрегационной способности, а также изменениями (преимущественно ростом) уровня маркеров эндотелиальной дисфункции. В числе причин и/или медиаторов указанных сдвигов можно отметить фазные сдвиги уровня различных цитокинов.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Перспективы дальнейшей разработки темы заключаются в возможности исследования гематологических показателей и маркеров эндотелиальной дисфункции при различных патологических состояниях, сопровождающихся эндотоксинемией (дисбактериоз кишечника, гнойная хирургическая патология и др.), с целью определения «пороговой» концентрации липополисахарида, оказывающей существенное влияние на структурно-функциональное состояние клеток периферической крови и эндотелия и требующей дезинтоксикационных и, при значительной выраженности изменений, иммунокорригирующих мероприятий. Перспективен также анализ влияния гематологических и иммунных изменений, ассоциированных с эндотоксинемией, на клиническое течение заболеваний и степень их курабельности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Ахмадуллина, Ю.А. Параметры гемограммы при бактериальном вагинозе у женщин репродуктивного возраста / Ю.А. Ахмадуллина, Ю.Р. Гайсина, К.Р. Бондаренко, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 10. - С. 19.

2 Гайсина, Ю.Р. Взаимосвязи параметров гемостаза и клинических проявлений бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста / Ю.Р. Гайсина, К.Р. Бондаренко, А.Н. Еникеев, Ю.А. Ахмадуллина, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. -2010.-№10.-С. 20.

3 Гайсина, Ю.Р. Эндотоксинемия и влияние микробных липополисахаридов на систему гемостаза у женщин с бактериальным вагинозом / Ю.Р. Гайсина, Ю.А. Ахмадуллина, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Медицинский вестник Башкортостана. - 2011. - Т. 6, № 3. - С. 155-158.

4 Гайсина, Ю.Р. Об исследовании сывороточных иммуноглобулинов у женщин репродуктивного возраста при дисбиозе влагалища / Ю.Р. Гайсина, К.Р. Бондаренко, Ю.А. Ахмадуллина, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - № 10. - С. 6.

5 Ахмадуллина, Ю.А. Адгезивные молекулы, эндотелии и фактор Виллебранда как показатели реакции эндотелия на эндотоксическое воздействие

при бактериальном вагинозе / Ю.А. Ахмадуллина, Ю.Р. Гайсина, Г.А. Идрисова, А.Р. Мавзютов, А.Ж. Гильманов // Медицинский алфавит. Современная лаборатория. - 2011. - № 22. - С. 22-23.

6 Ахмадуллина, Ю.А. Маркеры эндотоксинемии и эндотелиальной дисфункции у женщин с бактериальным вагинозом / Ю.А. Ахмадуллина, Ю.Р. Гайсина, А.Р. Мавзютов, А.Ж. Гильманов // Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований: материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной диагностике. - Омск, 2011. - С. 3640.

7 Бондаренко, К.Р. Иммунопатогенетические эффекты липополисахаридов грамотрицательных бактерий при бактериальном вагинозе / К.Р. Бондаренко, Ю.Р. Гайсина, Ю.А. Ахмадуллина, А.А. Мавзютова, А.Р. Мавзютов // Мать и дитя: материалы V регионального научного форума. — Геленджик, 2011. - С. 185186.

8 . Alimadullina, Yu. Hemostasis and CBC shifts caused by entotoxicosis at vaginal dysbiosis / Yu. Ahmadullina, Yu. Gaisina, K. Bondarenko, A. Mavzjutov, A. Gilmanov // Clin Chem Lab Med. -2011. -Vol. 49 (May 2011), Special Supplement. -P. S605.

9 Ахмадуллина, Ю.А. О реакции тромбоцитарного звена на эндотоксикоз, ассоциированный с бактериальным вагинозом / Ю.А. Ахмадуллина, Ю.Р. Гайсина, Г.А. Идрисова, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - № 9. - С. 68.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

БВ - бактериальный вагиноз

ИФА, ELIS А - иммуноферментный анализ (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

JIAJI - лизат амебоцитов Limulus

ЛИИ - лейкоцитарный индекс интоксикации

ЭТ - эндотоксин

Anti-core LPS IgG - антитела к глубоким детерминантам соге-региона

липополисахарида

IgG - иммуноглобулины класса G

IL - интерлейкин

LBP - lipopolysaccharide binding protein, липополисахарид-связывающий белок

LPS - lipopolysaccharide, липополисахарид

TNF-a - фактор некроза опухолей-a

ТхВ2 - тромбоксан В2

vWF - фактор Виллебранда

АХМАДУЛЛИНА Юлия Александровна

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЭНДОТЕЛИЯ У ЖЕНЩИН С БАКТЕРИАЛЬНЫМ ВАГИНОЗОМ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 18.06.13 г. Формат 60x84'/i6. Бумага писчая. Печать па ризографе с оригинала. Гарнитура «Times». Объем: Усл. печ. л. 1,75. Уч.-изд. л. 1,17. Тираж 100 экз. Заказ №172.

Отпечатано в типографии ООО «ФЕНИКС», г. Уфа, Пр. Октября 71/16, тел. +7(347)246-90-23.