Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Клинико-иммунологические взаимосвязи при системной красной волчанке и других диффузных болезнях соединительной ткани

На правах рукописи

СОЗИНА Александра Васильевна

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ПРИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ И ДРУГИХ ДИФФУЗНЫХ БОЛЕЗНЯХ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ

14 00 36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

р-ч». *гт V ГП

□□30У0417

Санкт-Петербург 2007

003070417

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им акад И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор

Тотолян Арег Артемович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Климович Владимир Борисович

доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталия Михайловна

Ведущая организация Государственное Учреждение Институт ревматологии РАМН

Защита диссертации состоится

„ ^ „

-^ЛАД^- 2007 года в час. на заседании Диссертационного совета Д 001 022 01 при Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул академика И П Павлова, д 12

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН

Автореферат разослан " ^ " ОХ^-е-Ал-Я— 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Бурова JIА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Подкласс диффузных болезней соединительной ткани (ДБСТ) включает группу нозологических форм, характеризующихся системным типом воспаления различных органов и систем, сочетающимся с развитием аутоиммунных и иммунокомплексных процессов, а также избыточным фиброзообразованием [Насонова В А, 1989] К данному подклассу относятся такие распространенные заболевания как системная красная волчанка (СКВ), синдром Шогрена (СШ), системная склеродермия (СС), смешанное заболевание соединительной ткани (СЗСТ)

Обычное клинико-лабора горное обследование и инструментальные исследования в большинстве случаев не позволяют подтвердить диагноз ДБСТ, и именно иммунологическое обследование помогает в объективизации диагноза Важность его применения можно подчеркнуть тем, что иммунологические показатели составляют 2 из 11 критериев, используемых для постановки диагноза СКВ [Тал ЕМ, 1982] Также велика роль иммунологического обследования при необходимости дифференциальной диагностики близких нозологических форм и других заболеваний с воспалительной симптоматикой

Основным иммунологическим феноменом, характерным для ДБСТ, является присутствие в сыворотке крови больных антинуклеарных антител Антинуклеарные антитела (AHA) представляют собой семейство из более чем 100 аугоантител, направленных против нуклеопротеиновых и белковых компонентов ядра и цитоплазмы клетки [Bradwell А, 2003] Разнообразные методы используются в клинической практике для выявления лишь 20 из них Хотя клиническое применение конкретных показателей исследовано сравнительно хорошо, однако четких рекомендаций о последовательности использования различных тестов, комбинации тестов, а также о предпочтительных методах выявления аутоантител не разработано Это затрудняет иммунологическую диагностику системных заболеваний и требует выработки клинически обоснованного алгоритма диагностики

Апоптоз клеток кожи и лимфоцитов периферической крови, по всей видимости, представляет основной источник антигенного материала при СКВ и является основным механизмом индукции AHA [Carciola-Rosen LA,1994] Нарушение клиренса иммунных комплексов рассматривается в качестве основного механизма патогенеза СКВ

Классическая иммунологическая теория указывает на то, что продукция антител, в том числе аутоантител, контролируется и управляется соответствующими цитокинами В то же время, экспериментальные исследования показали, что сыворотка больных СКВ способна индуцировать синтез цитокинов, в том числе IL-ip, EL-8, IL-10 и TNF-a в культурах мононуклеаров периферической крови [Ronnelid J, 2003] Этот механизм опосредован FcyRs, что позволяет рассматривать иммунные комплексы (ИК), содержащие аутоашитела, в качестве одной из причин увеличения продукции цитокинов

Кроме того, современные исследования указывают на то, что не только иммуноглобулины в составе ИК имеют иммуномодулирующую функцию, но и аутоантигены, прежде всего содержащие нуклеиновые кислоты, стимулируют клетки иммунной системы и индуцируют иммунные ответы, включая синтез провоспалительных цитокинов Этот механизм опосредован связыванием ДНК- и РНК- содержащих аутоанигенов в составе ИК с Toll like receptors (TLR), в частности TLR 7/9, на поверхности анигенпрезентирующих клеток [Chnstensen S R., 2007]

Цель работы. Цель настоящего исследования состояла в изучении роли цитокинов и аутоантител в патогенезе и диагностике диффузных болезней соединительной ткани

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Оптимизировать метод определения антинуклеарных антител с использованием в качестве субстрата клеточной линии НЕр-2

2 Изучить изолированную встречаемость и сочетанную встречаемость антинуклеарного фактора, антител к двуспиралыюй ДНК, антител к экстрагируемому нуклеарному антигену и антител к кардиолипину у больных с подозрением на диффузные болезни соединительной гкаи и

3 Изучить клиническое значение выявление антинуклеарного фактора, антител к двуспиралыюй ДНК и антител к кардиолипину при системной красной волчанке

4 Изучить клиническое значение выявления антинуклеарного фактора, криоглобулинов с активностью ревматоидного фактора, ангител к альфа-фодрину у больных синдромом Шогрена

5 Изучить клинико-патогенетическое значение определения цитокинов у больных с системной красной волчанкой и роль иммунологических показателей для оценки клинической активности заболевания у больных системной красной волчанкой

6 Разработать алгоритмы поэтапного, комплексного обследования пациентов с диффузными болезнями соединительной ткани

Научная новизна. В данной работе была впервые определена сочетанная встречаемость широкого спектра антинуклеарных антител в популяции больных диффузными болезнями соединительной ткшш Санкт-Петербурга и Ленинградской области

Впервые была проанализирована диагностическая значимость панели тестов, включающих определение антинуклеарного фактора, антител к экстрагируемому нуклеарному антигену, антител к двуспиралыюй ДНК, антител к кардиолипину, что позволило определить их место в диагностике диффузных болезней соединительной ткани На основании полученных данных были разработаны диагностические алгоритмы использования лабораторных методов выявления аутоантител для диагностики диффузных болезней соединительной ткани

Была разработана модификация метода культивирования эпителиоидной клеточной линии аденокарциномы гортани человека НЕр-2 в лунках предметного стекла для определения антинуклеарного фактора

В результате применения метода мультиплексного анализа содержания цитокинов в сыворотке больных системной красной волчанкой была установлена взаимосвязь продукции цитокинов и повышения концентрации аутоантител в сыворотке больных системной красной волчанкой

Практическая значимость работы. В ходе работы была разработана, апробирована и внедрена в лабораторную практику панель тестов, выявляющая антинуклеарный фактор, антитела к двуспиральной ДНК, антитела к экстрагируемым нуклеарным антигенам, антитела к кардиолипину Впервые в России были разработаны стандартные протоколы доаналитического, аналитического и постаналитического определения антинуклеарного фактора на клеточной линии НЕр-2

Была разработана программа внешнего контроля качества определения антинуклеарных антител, которая с 2006 года внедрена в Федеральную систему внешней оценки качества клинических лабораторных исследований

При анализе сочетанной встречаемости антинуклеарного фактора, антител к двуспиральной ДНК и антител к кардиолипину было установлено, что изолировашю антитела к кардиолипину встречаются только в 0,6% случаев Установлено, что

повышение уровня патологии до 50 МЕ/мл при определении антител к двуспиральной ДНК позволяет увеличить специфичность обследования до 95%

Теоретическая значимость работы. В ходе работы удалось показать взаимосвязь между продукцией цитокинов и содержанием аутоаитител в сыворотке больных системной красной волчанкой

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1 Повышение продукции цитокинов у больных с системной красной волчанкой связано с увеличением уровня аутоантител, что указывает на патогенетическую взаимосвязь этих иммунологических феноменов

2 Иммунологическое обследование больных с подозрением на диффузные болезни соединительной ткани должно бьггь этапным и комплексным, с использованием в качестве скриниговых тестов сочетанного определения антинуклеарного фактора и антител к экстрагируемому нутслеарному антигену, а в качестве подтверждающих тестов определение антител к двуспиральной ДНК, антител к рибонуклеопротеиновым антигенам и антител к кардиолипину

3 Объем лабораторного иммунологического обследования больных с системной красной волчанкой включает определение антинуклеарного фактора, антител к двуспиральной ДНК и антител к кардиолипину для проведения дифференциальной диагностики с диффузными болезнями соединительной ткани, определение теста волчаночной полоски для дифференциальной диагностики кожных и системных форм волчанки, определение концентрации ГЬ-6, уровня антинуклеарного фактора и антител к двуспиральной ДНК дня мониторинга активности заболевания

Личный вклад автора в проведение исследования Данные, представленные в работе, получены лично автором Автором выполнены все этапы стандартизации тестов для выявления антинуклеарного фактора и антител к двуспиральной ДНК методом непрямой иммунофлюоресценции Автором была проведена оценка наличия криоглобулинов с активностью ревматоидного фактора в сыворотке больных синдромом Шогрена, исследование материала биопсии кожи методом прямой иммунофлюоресценции Серологическое обследование образцов на наличие антител к двуспиральной ДНК, кардиолипину, экстрагируемому нуклеарному антигену методом иммуноферментного анализа, измерение концентрации цитокинов производилось сотрудниками НМД по молекулярной

медицине СПбГМУ им акад И.П Павлова Клиническое обследование пациентов с ДБСТ и группы контроля производилось сотрудниками отделения ревматологии Ленинградской областной клинической больницы, городской больницы № 25 г Санкт-Петербурга, сотрудниками клиники кожных болезней СПбГМУ им акад И П Павлова, а также сотрудниками Российского НИИ гематологии и трансфузиологии Росздрава

Реализация работы.

Тесты по выявлению антинуклеарного фактора, методы определения специфичности антинуклеарных антител, иммунофлуоресцентное исследование биоптатов кожи внедрены в практическую диагностическую работу клиник СПбГМУ им акад И П Павлова, и доступны для пациентов лечебно-профилактических учреждений Санкт-Петербурга и Ленинградской области Апробация работы.

Основные положения диссертационного исследования были доложены на VII, VIH, IX и X Всероссийском научном форуме с международным участием имени акад В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2003, 2004, 2005, 2006), XIth International Student Congress of Medical Sciences (Гронинген, 2004), IV и V конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа (2004, 2005), 7й John Humphrey Advanced Summer programme in immunology (Москва, 2005), на межвузовской конференции Общества Молодых Ученых СПбГМУ им акад ИП Павлова «Санкт-Петербургские научные чтения — 2005», заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного общества иммунологов (2007) Объем н структура работы.

Диссертация изложена на 142 страницах, включает список сокращений, введение, обзор литературы, характеристику обследованных больных и описание методов исследования, три главы собственных наблюдений, обсуждение результатов исследования, выводы, практические рекомендации, список литературы Работа иллюстрировала 36 таблицами и 16 рисуиками Библиографический указатель включает 152 источника (13 отечественных и 139 иностранных) Публикации.

По теме диссертационного исследования опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика обследованных больных.

Для решения поставленных задач была обследована группа больных из 1688 человек, включавшая 276 пациентов с установленным диагнозом ДБСТ (112 больных системной красной волчанкой, 8 пациентов с дискоидной красной волчанкой, 15 больных с синдромом Шогрена и 141 пациент с ревматоидным артритом), 1312 человек с подозрением на наличие ревматической патологии и 100 человек группы контроля

Средний возраст больных с диагнозом системная красная волчанка составил 41,8±1,3 лет, среди них было 96 женщин (91,2%) и 9 мужчин (8,8%) Среди обследованных лиц преобладала 2-3 степень активности иммуновоспалительного процесса (57,1%) В зависимости от длительности заболевания больные СКВ были разделены на две группы впервые выявленная (СКВвв) и текущая СКВ (СКВгек) При этом 20% (21/105) составили больные с СКВвв, а 80% (84/108) с СКВтс, Средний стаж заболевания СКВтек составил 11,2±0,9 лет

Средний возраст больных страдающих, синдромом Шогрена, составил 55,8±3,2 лет, среди обследованных пациентов был только один мужчина. У 9 человек наблюдалась первичная (СШпер), а у 6 - вторичная (СШет) форма заболевания Причем у 5 больных СШет развился на фоне ревматоидного артрита и у одного больного в сочетании с системной склеродермией Длительность заболевания составила у больных с СШпер 10,5±2,8 лет, а у пациентов с СШВГ3,8±0,8 года

Методы исследования. У всех больных проводилось стандартное общеклиническое обследование, выполнялись инструментальные методы исследования (ЭКГ, ЭхоКГ, рентгенография органов грудной клетки, УЗИ органов брюшной полости) Больным с СШ дополнительно выполнялось УЗИ слюнных желез, проводился осмотр офтальмолога с выполнением функциональных тестов (Ширмера, Норна) Для определения активности течения СКВ, наряду с оценкой клинической активности, были использованы индексы клинико-лабораторной активности заболевания SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index) и BILAG (British Isles Lupus Assessment Group)

Для выявления АНФ применялся метод непрямой иммунофлюоресценции (нРИФ) с использованием в качестве субстрата клеточной линии аденокарциномы

гортани человека НЕр-2 в оригинальной модификации Для стандартизации данного метода была использована референтная сыворотка АНФ ВОЗ 1063, с концешрацией аутоантител 100 ME/мл Вешний контроль качества данного метода в течение 5 лет (2003-2007) осуществляли с помощью международной программы внешнего контроля качества Labquality В 2006 году на основе данного метода была разработана национальная программа контроля качества, являющаяся частью Федеральной системы внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК)

Антитела к экстрагируемому нуклеарному антигену (ЭНА) IgG, антитела к кардиолипину (KJT) IgG/IgM, антитела к бета-2 гликопротеину-1 IgG/igM, антитела к альфа-фодрину IgG/IgA определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов (Orgentec, Германия) Антитела к двуспиральной Д1Ж (дсДНК) IgG выявлялись методом ИФА и нРИФ в оригинальной модификации, с использованием в качестве субстрата простейшего жгутикового микроорганизма Crithidia luciliae (КЛИФ) Антинуклеарные антитела определяли с помощью иммуноблота (Euroimmun, Германия), содержащего следующие рекомбинантные антигены Sm, RNP/Sm, SS-A, SS-B, Scl-70, Pm-Scl, CENT-B, PCNA, дсДНК, нуклеосомы, гистоны, Jo-1, AMA-M2

Иммунологический анализ сыворотки крови больных СШ включал определение содержания криоглобулинов с активностью ревматоидного фактора, определение специфических аутоантител

Образцы кожи 15 больных с системной и дискоидной формами красной волчанки были исследованы на наличие отложений иммуноглобулинов и компонентов комплемента (тест волчаночной полоски)

Мультиплексное определение панели цитокинов EL-lß, IL-6, G-CSF, IFN-y проводили в сыворотке больных СКВ и группе доноров крови с использованием коммерческих наборов и прибора ВЮ-Р1ех (BIO-RAD, США)

Полученные в работе данные обрабатывали с помощью статистической программы SPSS (версия 13 0) Для описания качественных данных использовали частотный анализ, сравнение групп проводили с использованием критерия хи-квадрат Для описания количественных признаков использовали стандартные показатели дескриптивной статистики Все количественные признаки в работе представлены в виде М±т, где М - среднее значение, т - ошибка среднего Уровень

значимости для всех статистических тестов принимали равным 0,05, что является стандартным уровнем для медико-биологических исследований Результаты исследования и их обсуждение.

Для разработки практического алгоритма диагностики ДБСТ было проведено сопоставление результатов обнаружения AHA разными методами При изучении групп пациентов с различными ДБСТ было показано, что аутоантитела в качестве диагностического теста не обладают абсолютной специфичностью Антинуклеарный фактор был обнаружен у 3 из 100 доноров крови, причем у всех лиц титры не превышали 1/80 (25 МЕ/мл), что рассматривается как низкие титры АНФ (табл 1)

Таблица 1

Выявление АНФ при ДБСТ, ревматоидном артрите и у доноров кровп

Группы обследованных Антинуклеарный фактор, чел Антинуклеарный фактор, МЕ/мл

негативный позитивный среднее значение (М±т) максимально е значение

синдром Шогрена 0 (0%) 15(100%) 516,7±205,4 3200

системная красная волчанка 22 (21%) 83 (79%) 395,5±56,3 3200

ревматоидный артрит 93 (65,9%) 48 (34,1%) 41,5±7,8 800

здоровые доноры 97 (97%) 3 (3%) 1,0±0,6 50

Присутствие аутоантител в крови здорового человека представляет собой естественный биологический феномен Вероятной причиной образования аутоантител считают перекрестную реактивность иммуногенных эпитопов инфекционных агентов и собственных молекул организма При ДБСТ титры АНФ значительно выше, причем средние значения достигают 500 МЕ/мл при СШ и 400 МЕ/мл при СКВ, что дает возможность дифференцировать нормальное состояние и заболевание Это позволяет рассматривать титр 1/160 в качестве границы патологии Хотя границей нормы является обнаружение АНФ в титре равном или большем 1/40, обнаружите низких тшров АНФ (1/40-1/160) является сравнительно неспецифичным

Для анализа сочетанной встречаемости аутоантител были исследованы сыворотки крови 1312 больных, направленных на обследование в иммунологическую лабораторию Среди лиц с подозрением на ДБСТ АНФ регистрировался в 23,5% (309/1318) случаев, что в 10 раз выше, чем популяционная встречаемость этого показателя

Среда лиц е высокоположительными результатами АНФ - 1/320 и выше была выделена группа, которая составила 172 человека. Чаще всего в этой группе наблюдали гранулярный и гомогенный типы свечения ядра (рис. 1). Обращает на

50% 48%

Рисунок 1. Частота встречаемости тиков свечения ЛНФ у лиц с подозрением на ДБСТ (п=! 72). ГОМ-гомогенный, ГР — гранулярный. ЦП нитоплазмагичажий, ЯДР - ядрьпиковый, ЦМ- центромериый

себя внимание встречаемость ядрышковош и центромерного типов окрашивания ядра клетей, характерных ;цтя склеродермия и CREST синдрома, и указывающая, в целом, на большую встречаемость этих заболеваний, достигающую до 8% от всех ДБСТ.

Хотя выполнение теста АНФ позволяет выявлять большинство AHA, однако описана ipynna высокорастворимых компонентов ядра, которые могут утрачиваться в процессе фиксации монослоя клеток. Эти антигены объединяются под названием экстра! ируемый нуклеарный антиген (ЭНА), в состав которого входят SS-A, SS-B, Sin, Ul-RNP, Sel-70. Нами было проведено сопоставление выявления АНФ и антител к ЭНА, которые определялись методом ИФА (табл. 2).

Таблица 2

Сочеталная встречаемость АНФ и антител к ЭНА у лиц е подозрением на ДБСТ(п=280)

Антитела к ЭНА Антинуклеарный фактор

негативный позитивный

обнаружены 20 34

не обнаружены 2Í0 16

При исследовании сывороток позитивных по антителам к ЭГ1А и негативных по АНФ с помощью нммупоблота АНА в 64% из них были обнаружены антитела к 88-А антигену. Рассчитав клинико-лабораторные параметры метода, мы определили, что чувствительность и специфичность определения антител к ЭНА относительно выявления АНФ составляет 67,9% и 89,4% соответственно. При этом, специфичность 36% позитивных по антителам к ЭНА и негативных по АНФ

сывороток установить не удалось Поскольку данные образцы составляют 7,4% от общего количества положительных больных, эти результаты были оценены как ложноположительные

Для того чтобы определить антигенные мишени у больных с положительными результатами выявления АНФ и/или антител к ЭНА, был использован метод иммуноблота AHA При обнаружении гранулярного типа свечения АНФ преобладают антитела к SS-A антигену, а также выявляются антитела к Sm, RNP/Sm, SS-B антигенам У пациентов с гомогенным типом свечения АНФ с помощью иммуноблота выявлялись антитела к нуклеосомам, гистонам и дсДНК Следует обратить внимание, что у многих из них определялись антитела к рибонуклеопротеинам SS-A, реже SS-B, Sm и RNP/Sm Таким образом, гомогешшй тип свечения ядра, связанный с наличием антител к компонентам хроматина, не исключает наличие в сыворотке больных антител к РНК-содержащим антигенам

Антитела к дсДНК имеют особое значение при СКВ Высокая специфичность данных аутоантител при этом заболевании явилась основанием для их включения в критерии постановки диагноза СКВ Наличие антител к дсДНК обуславливает развитие шопус-нефрита у больных с данной патологией При сопоставлении выявления антител к дсДНК и АНФ было обнаружено, что в более чем 10% результатов ИФА метода выявление антител к дсДНК при использовании предлагаемой производителем границы патологии не согласуется с результатами обнаружения АНФ (табл 3) Эти ложно- положительные результаты

Таблица 3

Сочетанная встречаемость АНФ и антител к дсДНК у лиц с подозрением на ДБСТ (п=614)

Антитела к дсДНК АНФ АНФ позитивный, %

негативный позитивный тип свечения

ГОМ ГР ЯДР цм ЦП

>25 МЕ/мл 42 151 59 38 3 0 0

(>50 МЕ/мл) (19) (85) (67) (32) 0) - -

<25 МЕ/мл 332 89 19 67 1 11 2

можно объяснить неспецифическим связыванием антител Было показано, что при увеличении границы патологии в 2 раза с 25МЕ/мл до 50МЕ/мл специфичность теста возрастает до 95%

Для оценки специфичности обнаружения аутоантител к дсДНК был использован иммунофлюоресцентный тест с клетками простейшего микроорганизма О 1иы1ше По данным проведенного исследования только у 3 из 28 больных с отсутствием АНФ и наличием высокой концентрации антител к дсДНК было обнаружено специфическое свечение клеток простейшего

Другим важным методом диагностики системных заболеваний является выявление антител к кардиолипину (КЛ), которые являются основным представителем семейства антифосфолипидных антител Целесообразность изолированного определения антител к КЛ как метода диагностики антифосфолипидного синдрома находится под вопросом Была определена сочетшшая встречаемость антител к КЛ и АНФ, совместно с антителами к дсДНК (табл 4)

Таблица 4

Сочетанная встречаемость АНФ, антител к дсДНК и антител к КЛ у лиц с подозрением на ДБСТ (п=162)

Сочетание АНФ и антител к дсДНК

Антитела к КЛ АНФ позитивный, АНФ позитивный, АНФ негативный,

антитела к дсДНК антитела к дсДНК антитела к дсДНК

позитивные негативные негативные

позитивные 8 0 6

низкие титры 0 0 5

высокие титры 8 0 1

негативные 13 17 11В

В обследованной группе высокие титры антител к КЛ выявлялись сочетанно с АНФ и антителами к дсДНК, что указывает на наличие у них ревматической патологии, прежде всего СКВ В то же время высокое содержание антител к КЛ без АНФ и антител к дсДНК было обнаружено только у одного пациента Это обуславливает целесообразность комбинированного определения антител к КЛ и АНФ

Для уточнения клинического значения выявления антител при ДБСТ была проанализирована группа пациентов с клинически подтвержденной СКВ Подавляющее число пациентов было позитивно по АНФ (79%), причем у тех больных, у которых был обнаружен АНФ, отмечались преимущественно титры 1/320 и выше Для того чтобы проанализировать значимость обнаружения высоких титров АНФ, было проведено сопоставление между клиническими данными больных с низкими и высокими (>100 МЕ/мл) титрами АНФ (рис 2)

50

ад 30 20 10 о

Рисунок 2. Клинические поражения систем и органов у больных СКВ в зависимости от серо позитивности по ЛИФ, (%Хп~;83). **р<0,005; ***р<0,0005

Было обнаружено, что у пациентов с высокими титрами АИФ отмечается

значительно более выраженное поражение кожи, нервной системы, чаще

присутствуют артриты, серозиты и лихорадка, Эта результаты соотносятся с

лабораторными находками у этих пациентов, в том числе с более высокими уровнями

СОЭ и С-реактивного белка (СРВ), а также наличием пшергаммаглобулинсмии. Для

оценки активности заболевания в двух группах были использованы расчетные

индексы клинико-лабораторной активности заболевания, которые были достоверно

повышены у больных с высокими титрами А11Ф, так, индекс SLEDA1 был повышен в

2,5, а индекс BILAG - в 1,5 раза. Это указывает на взаимосвязь высоких титров АНФ с

активностью заболевания у серопотитивных больных.

Для того чтобы уточнить роль определения типа свечения ядра, были

сопоставлены результаты клиннко-лабораггориого обследования пациентов с двумя

преобладающими типами свечения АНФ: гомогенным и ¡ранулярным. Было

обнаружено, что у лиц с гомогенным типом свечения ядра чаще отмечались

поражения кожи, нервной системы, лихорадка и цитопении, были выше индексы

клинико-лабораторной активности заболевания. Таким образом, при выявлении

гомогенного типа окраигиванта ядра АНФ наблюдалось более агргссинное течение-

СКВ.

□ АНФ> ЮОМЕ/ш Я АНФ< IDOME/mj *

* ** L** t*

***

юряжепие ^ артриты поражение поражение №рошш щпшешш .№хорадка нервной ' и миозит почек кожи и системы слизистых

Было проведено сравните титров АНФ в зависимости от терапии, получаемой пациентами Хотя имелась лишь тенденция к достоверности различия, однако надо подчеркнуть, что у больных, которым назначалась более агрессивная терапия, титры АНФ были значительно ниже, чем в группе больных, получавших менее агрессивную терапию Это может объясняться подавлением иммунопатологического процесса под действием агрессивной иммуносупрессивной терапии. Этот вывод может быть подтвержден отдельными наблюдениями за динамикой АНФ и других разновидностей AHA у пациентов с СКВ, получающих терапию стероидными гормонами и цитостатиками Таким образом, титры АНФ могут использоваться для оценки эффективности проводимой иммуносупрессивной терапии

Для определения клинического значения отдельных разновидностей AHA при СКВ было проведено сопоставление клинических проявлений у больных серопозитивных по антителами к КЛ и дсДНК В группе больных СКВ со значительным увеличением концентраций аутоангител к КЛ и антител к дсДНК отмечалось увеличение таких показателей острофазового ответа как СРБ, бета-2 и гамма-глобулшювой фракции протеинов, а также выраженное увеличение СОЭ При анализе клинико-лабораторных индексов активности СКВ также было обнаружено, что у больных с наличием антител к дсДНК и КЛ отмечаются достоверно большие значения индекса SLEDAI, также несколько чаще выявляются высокие степени клинической активности заболевания

Синдром Шогрена представляет собой ДБСТ, сопровождающуюся гипергаммаглобулинемией и синтезом широкого спектра аутоантител У всех больных с СШ был обнаружен АНФ, у 87% сочетание с РФ В отличие от СКВ, при СШ не удалось обнаружить взаимосвязь между клиническими проявлениями заболевания и титрами аутоантител У 27% больных СШ были обнаружены криоглобулины, представляющие собой криопреципитирующие ИК, в составе которых определялась активность РФ У одной больной с наибольшим содержанием криоглобулинов в сыворотке крови наблюдался выраженный геморрагический васкулит и артралгии В качестве нового диагностического маркера СШ была изучена встречаемость антител к альфа-фодрину, который рассматривается как основной антиген при СШ Были проанализированы уровни антител к альфа-фодрину классов IgM и IgA в группе контроля и больных СШ На основе результатов

обследования контрольной группы были установлены границы нормы, которые оказались близки нормам, рекомендуемым производителем тест системы. Увеличение содержания антител к альфа-фодрину было обнаружено только у 27% больных. Взаимосвязи выявления аутоантител с какими либо клиническими проявлениями или вариантом течения СШ установить не удалось.

У 15 пациентов с дискаиддой и системной формами (фасной волчанки с помощью метода прямой иммунофлюоресценции были обследованы биоптаты кожи. Тест вдлчаночной полоски оказался положительным у 80% пациентов в данной группе и превосходил по встречаемости АНФ, который выявлялся только у 33% пациентов. Таким образом, прямое иммунофлуоресцетное исследование биоптагов кожи является более информативным но сравнению с серологическим обследованием. Феномен образования «волчаночной полоски» может предварять появление аутоантител в сыворотке крови и отражает начальные стадии сенсибилизации иммунной системы.

В ряде исследований было показано, что сыворотка больных СКВ способна индуцировать синтез цитокинов в культурах монануклеаров периферической крови. Предполагают, что этот механизм опосредован РсуКв и позволяет рассматривать ИК, содержащие аутоантитела, в качестве одной из причин увеличения продукции цитокинов. Дня того чтобы сопоставить синтез цитокинов с клиническими параметрами СКВ и продукцией аутоантител было проведено измерение уровней цитокинов 1Ь-1(1, 1Ь-6, О-СБР и [РМу в сыворотке у 61 больного СКВ и 28 клинически здоровых доноров крови (рис, 3).

□ больные СКВ ■ доноры |фОВИ

20 15 10

5

□ больные СКВ ■ доноры крови

¡ЫЬсй (РЫ-еатта

Рисунок 3. Сравнение концентраций 11,-6,0-СЬР (пг/мл) в сыворотках больных СКВ и доноров крови. **р<0,005; ***р<0,0005

На основе измерения уровней цитокинов в группе клинически здоровых доноров крови была определена верхняя граница нормы. Концентрации всех исследованных цитокинов в сыворотках больных СКВ были достоверно выше, по сравнению с концентрациями в сыворотках группы контроля (табл. 5),

Таблица 5

Концентрации цитокинов в сын «ротке доноров крови (п=2Я)

Показатель Концентрация цитокинов пг/мл (М) Максимальная концентрация цитокинов, пг/мл (М+35)

IL-lp 0,055 0,377

IL-6 3,470 8,655

IFN-y 0,779 4,013

G-CSF 0,403 2,215

Была обнаружена взаимосвязь между продукцией цитокинов и присутствием в сыворотке AI ÎA. Так, при выявлении антител к дсДНК отмечались достоверно более высокие концентрации IL-1 р и [FNy. У пациентов с высокими титрами АНФ наблюдались достоверно более высокие концентрации IL-6 (рис. 4),

___ _ IЦ--6

IM

! 2 3

Условные обозначения:

■ - антнтсла обнаружены □ - антитела не обнаружены

1- АНФ

2- антитела кдсДПК lgG

3- антагела к кардиолштину IgG/IgM

*р<0,05

Рисунок 4. Сравнение концентрации 1 FN-y, IL-lj5, IL-б (пг/мл) в сыворотках больных СКВ с отрицательными и положительными значениями АНФ (< 1 ООМЕУмл,> 1 ООМЕ/мл), антител к дсДНК (<5 ОМЕ/мл >50МЕ/мл), антител к кардиолипину IgG/IgM (<20/3OGPL/MPL/мл,>20/30 GPL/MPL/мл).

В целом, у серо позитивных больных концентрации провошалительных цитокинов были выше по сравнению с концентрациями данных показателей у серо негативных больных. Это соответствует данным об индукции продукции цитокинов под действием аутоантител in vitro и позволяет предположить о взаимосвязи между этими показателями. Для того чтобы сопоставить сывороточные концентрации цитокинов с другими клиническими и лабораторными показателями активности при СКВ была определена частота обнаружения уровней цитокинов выше расчетной границы нормы. Наиболее часто отмечалось увеличение концентраций 1L-6, сывороточные уровни которого были повышены у 51% больных СКВ, в то время как другие цитокины значительно уступали JL-й по встречаемости повышенных значений {рис. 5),

Условные обозначения: 1 -

2 - в-СВР 3-1Ь-1р

4 - поражение почек

5 - поражение суставов

6 - поражение кожи

7 - СОЭ

8 - С-рекуивный белок

9 - 11,-6

10 - гипергаммаглобулинемия

11 -АНФ

12 - тест волчаночной полоски

Рисунок 5. Сравнение процента встречаемости показателей клиннко-лабораторной активности у больных СКВ (п=Ч05).

Частста обнаружения повышенных уровней П.,-6 при СКВ сопоставима с ускорением СОЭ и увеличением концентраций СРВ, Кроме того, было обнаружено, что наибольшей встречаемостью при СКВ обладают такие показатели как гипергаммаглобулинемия, АНФ и тест волчаночной полоски при исследовании биопсий кожи. Это может служить косвенным свидетельством важное™ активации гуморального звена иммунитета в патогенезе СКВ.

Широкий спектр методов, который был использован в данной работе, обусловлен методическими особенностями выявления аутоантител. На первом этапе тестирования целесообразно использовать методы, обладающие

максимальной чувствительностью, позволяющие обнаружить антитела к максимально широкому спектру антигенов. Уточнение специфичности выявленных аутоантител возможно при использовании подтверждающих тестов, назначенных по результатам первичного обследования.

На основе данных диссертационного исследования был предложен следующий алгоритм поэтапною и комплексного обследования больных с подозрением на ДБСТ (рис. 6).

подозрение на наличие диффузной болезни соединительной ткани

не определяются /

антитела к ЭНА — ■ -t

АНФ (ПЕр-2) —►титр <1:160 +

титр >1:160 тип свечения

■ диагноз сомнителен

определяются —

гомогенный/перифери чески й гранулярный ядрышковый/центромерный цитоплазматический

СКВ (вторичный АФС)

дсДНК

AT к кардиолипину (IgG/IgM) AT к 6era2-i ликопротеину! гест вол чаи ич ной полоски

Склеродермия CREST

ПМ/ДМ ПБЦ/АИГ-1,2,3

иммуноблот антануклеарных антител (SS-A 60/52 к/1л, SS-B. Sm/RNP, CENT-B, куклеосомы, ги стоны, Rib-p, Scl-70, Jo-1, Рш-Scl)

Рисунок 6. Алгоритм поэтапного и комплексного обследования больных с подозрением на ДБСТ.

АНФ - антинуклеарный фактор, ЭНА - экстрагируемый нуклеарный антиген, СКВ -системная красная волчанка, АФС - антнфосфолипидный синдром, СШ - синдром Шогрена, РА - реиматоидный артрит, ЮРА - ювенильный ревматоидный артрит, CREST -симптомакомплекс включающий Calcinosis, Ravnauld's phenomenon. Esophageal involvement, Sclerodactyly, Teleangiectasias, ПМ/ДМ - полимиозит/дерматомиозит, ПБЦ/АИГ - первичный биллиарный цирроз/аутоиммунный гепатит.

ВЫВОДЫ

1. Анализ сочетанной встречаемости ангинуклеарного фактора и антител к двуспиральной ДНК у большж с диффузными болезнями соединительной ткани позволил установить, что при повышении в два раза границы патологии теста по определению антител к двуспиральной ДНК (до 50 МЕ/мл) у больных позитивных по ангинуклеарному фактору специфичность обследования возрастает до 95%.

2 Антитела к кардиолипину у больных с диффузными болезнями соединительной ткани преимущественно обнаруживаются в сочетании с антителами к двуспиральной ДНК и антинуклеарным фактором

3 Увеличение уровней антинуклеарных антител встречается и у здоровых лиц и при различных аутоиммунных заболеваниях, но при диффузных болезнях соединительной ткани титры значительно выше, что позволяет при дифференциальной диагностике больных с аутоиммунными заболеваниями использовать в качестве границы патологии значения антинуклеарного фактора выше 100МЕ/мл

4 У больных системной красной волчанкой с высокими титрами и гомогенным типом свечения антинуклеарного фактора наблюдаются высокие показатели клинико-лабораторной активности (высокие значения международных индексов активности заболевания SLEDAI и BILAG)

5 Антитела к кардиолипину и двуспиральной ДНК встречаются при гомогенном типе свечения антинуклеарного фактора и коррелируют с клинико-лабораторной активностью системной красной волчанки

6 Определение антинуклеарного фактора и ревматоидного фактора при синдроме Шогрена существенно превосходит по клинико-лабораторной информативности выявление антител к альфа-фодрину

7 Увеличение продукции IL-ip, IL-6 и IFN-y у больных с системной красной волчанкой взаимосвязано с повышением уровня антинуклеарных антител, что указывает на их роль в патогенезе заболевания

8 Продукция IL-6 при системной красной волчанке сопоставима с показателями острофазового ответа, такими как СОЭ, гипергаммаглобулинемия, что позволяет использовать определение данного цитокина в качестве дополнительного маркера активности заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Поскольку использование клеточной линии НЕр-2 в качестве субстрата для определения антинуклеарного фактора позволяет оценивать не только титр аутоантител, но и описывать тип свечения ядра, данный тест рекомендуется для скринингового обследования пациентов с подозрением на диффузные болезни соединительной ткани

2 Для повышения информативности и специфичности обследования больных с диффузными болезнями соединительной ткани рекомендуется сочеташюе определение антинуклеарного фактора, антител к двуспиральной ДНК и антител к кардиолипину

3 При отрицательных результатах теста по определению антинуклеарного фактора у лиц с подозрением на диффузные болезни соединительной ткани необходимо определение антител к экстрагируемому нуклеарному антигену

4 При обнаружении гомогенного типа свечения антинуклеарного фактора целесообразно дальнейшее определение антител к двуспиральной ДНК, тогда как при выявлении гранулярного типа свечения ядра необходимо исследование спектра антител к рибонуклеопротеиновым антигенам

5 Для диагностики и дифференциальной диагностики кожных и системных форм волчанки необходима биопсия кожи с выполнением теста волчаночной полоски

6 Для диагностики диффузных болезней соединительной ткапи рекомендуемые диагностически значимые уровни тестов составляют для антинуклеарного фактора ЮОМЕ/мл (1/320), для антител к двуспиральной ДНК 50МЕ/мл и для антител к кардиолипину IgG/IgM 30/20 GPL/MPL/мл

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Статьи в научных журналах

1 Мазинг (Созина) А В , Лапнн С В , Тотолян Арег А Выявление АНФ с использованием клеточной линии НЕр-2 // Бюллетень НИИ кардиологии им ВЛ Алмазова - 2004 - том П -№1 - С 144-146

2 Созина AB, Неустроева ЮА, Тихомирова ТА, Лапин С В Сочсташгая встречаемость аутоантител у больных с диффузными бочезнями соединительной ткани // Медицинская иммунология -2007 -Т9,№1 -С 69-76

3 Беляева ИЛ>, Лапин С В, Созина А В, Мазуров В И, Тотолян Ара А, Антитела к цитруллин-содержащим антигенам в диагностике и прогнозировании течения раннего ревматоидного артрита // Медицинская иммунология -2007 -Т9, №1 -С 77-84

Тезисы конференции

1 Мазинг (Созина) А В , Лапин С В, Маслянский А Л, Мазуров В И, Тотолян Арег А Выявление алтиперинуклеарного фактора при ревматоидном артрите методом непрямой иммунофлюоресцепции //Медицинская иммунология -2002 -Т4 -№2 -С 203

2 Мазинг (Созчна) AB, Дании СВ, Тотолян Арег А Разработка методики выявления антинуклеарных антител методом непрямой иммунофтюоресценции с использованием в

качестве субстрата клеточной линии НЕр-2 // Медицинская иммунология - 2003 - Т 5 -№3-4 - С 260-261

3 Мазинг (Созина) Л.В, Лапин С В, Маслянский АЛ, Беляева И Б, Тсгголян Арег А Выявление антинуклеарных антител на клеточной линии НЕр-2 у больных ревматоидным артритом // Материалы IV конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа-Великий Новгород,-2004 - С 81-82

4 Mazing (Sozrna) А V, Lapin S V, Totolian Areg A The clinical significance of antinuclear antibodies testing in patients with rheumatoid arthntis // International Student Congress of Medical Sciences, Groningen, - 2004 pp 52-53

5 Мазинг (Созина) А. В, Лапин С В, Тотолян Арег А Выявление антинуклеарного фактора, антикератиновых антител и антиперинуклеарного фактора у больных с ревматоидным артритом//Медицинская иммунология -2004 -Т6 -№3-5 - С 238

6 Созина А.В, Лапин С В, Маслянский АЛ, Иливанова Е П, Тотолян Арег А Значение определения типа свечения антинуклеарного фактора у больных с диффузными болезнями соединительной ткани //Медицинская иммунология -2005 -Т7,№2-3 -С 282

7 Sozrna AV, Lapin SV, Maslyanskyi AL, Ilivanova EP, Totolian Areg A. The clinical significance of antinuclear antibodies m patients with connective tissue diseases // 7th John Humphrey Advanced Summer programme in immunology The interface between immunology and medicine September 5-9,2005 p48

8 Роскошная ДН, Созина AB, Лапин С В Диагностическое значение выявления волчаночной полоски (Lupus Band) у больных с красной волчанкой // Материалы Российской научно-празсшческой конференции дерматовенерологов «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» - Санкт-Петербург- 2005 С 43^14

9 Созина А В, Лапин С В, Маслянский А Л, Иливанова ЕЛ, Тотолян Арег А Иммунологическая диагностика диффузных болезней соединительной ткани // Материалы V конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа - Санкт-Петербург - 2005 - С 102-103

10 Созина А В, Лапин С В , Тотолян Арег А Подходы к иммунологической диагностике диффузных болезней соединительной ткани // Медицинская иммунология - 2006 - Т 8, №2-3 - С 233

11 Шульман А М, Шульман М А, Созина А В, Лапин С В , Тотолян Арег А, Шемеровская ТГ Использование различных методов оценки активности заболевания у больных системной красной волчанкой // Медицинская иммунология -2006 -Т8, №2-3 - С 239240

Подписано к печати 18 /М 07 Формат 60x80 1/16 Бумага писчая

Печать офсетная Печ л 1 0 Тираж J00 экз Заказ № 92 СПбГУНиПТ 191002, Санкт-Петербург, ул Ломоносова 9 ИИКСПбГУПиПТ 191002, Санкт-Петербург, ул Ломоносова 9

Актуальность темы.

Подкласс диффузных болезней соединительной ткани (ДБСТ) включает группу нозологических форм, характеризующихся системным типом воспаления различных органов и систем, сочетающимся с развитием аутоиммунных и иммунокомплексных процессов, а также избыточным фиброзообразованием [8]. К данному подклассу относятся такие распространенные заболевания как системная красная волчанка (СКВ), синдром Шогрена (СШ), системная склеродермия (СС), смешанное заболевание соединительной ткани (СЗСТ) и полимиозит.

Основным представителем этой нозологической группы является системная красная волчанка. Эпидемиологические исследования последних лет показали, что СКВ встречается во всех климатогеографических зонах земного шара, однако отмечаются возрастные и расовые отличия в частоте заболевания. Женщины болеют чаще, чем мужчины соотношение примерно 610:1. Возраст дебюта заболевания находится от 15 до 40 лет. В среднем в странах Европы и Америки заболеваемость СКВ колеблется от 1,8 до 7,6 случаев в год на 100000 населения [51]. Системная красная волчанка чаще встречается у представителей негроидной расы, чем у европеоидной [86]. По данным Минсоцздрава РФ за 2002 год диагноз СКВ впервые в жизни был установлен у 6900 человек, следовательно, первичная заболеваемость СКВ в России составила 4,6 случаев в год на 100000 населения [2]. Для Санкт-Петербурга с 5-ти миллионным населением согласно этой статистике может быть диагностировано 230 новых случаев СКВ в год. Хотя заболеваемость синдромом Шогрена отмечается во всех возрастных группах, обычно первые клинические симптомы появляются в возрасте 30-50 лет, причем в 10-25 раз чаще страдают женщины [11].

Обычное клинико-лабораторное обследование и инструментальные исследования не позволяют подтвердить диагноз ДБСТ, и именно иммунологическое обследование помогает в объективизации диагноза. Его диагностическое значение можно подчеркнуть тем, что иммунологические показатели составляют 2 из 11 критериев, используемых для постановки диагноза СКВ [132]. Также велика роль иммунологического обследования в дифференциальной диагностике близких нозологических форм и других заболеваний с воспалительной симптоматикой.

Основным иммунологическим феноменом, характерным для ДБСТ, является присутствие в сыворотке крови больных антинуклеарных антител. Антинуклеарные антитела (AHA) представляют собой семейство из более чем 100 аутоантител, направленных против нуклеопротеиновых и белковых компонентов ядра и цитоплазмы клетки [132]. Уже в течении 30 лет в качестве диагностических маркеров используется определение антинуклеарного фактора, антител к двуспиральной ДНК, антител к кардиолипину, ревматоидного фактора. Кроме того, за последние 10-15 лет были уточнены многие внутриклеточные мишени аутоантител, что позволило значительно расширить методический потенциал обследования пациентов.

Для выявления аутоантител применяется широкий спектр методов: непрямая иммунофлюоресценция, иммуноферментный анализ, латекс-агглютинация, функциональные тесты и иммуноблот. Появляются новые методические разработки для выявления аутоантител, основанные на белковых чипах. К таким новым методам можно отнести мультиплексный анализ по технологии Luminex [119], который позволяет проводить определение до 100 различных биологических маркеров одновременно.

По данным ряда авторов проводивших сопоставление результатов тестов по выявлению различных видов AHA между собой наблюдаются расхождения результатов при использовании различных лабораторных методов [98, 146] Так, не у всех пациентов с наличием в сыворотке высоких титров антинуклеарного фактора определяемого методом непрямой иммунофлуоресценции при дальнейшем обследовании удается обнаружить антитела к экстрагируемому нуклеарному антигену или двуспиральной ДНК.

Применение всего спектра методов позволяет решить вопросы диагностики и дифференциальной диагностики ДБСТ с другими нозологическими формами. Однако недостатком остается сравнительная дороговизна иммунологического обследования. Одним из вариантов решения данной проблемы является разработка алгоритмов поэтапного и комплексного обследования пациентов с ДБСТ. Таким образом, на первом этапе назначаются скриниговые тесты, которые обладают высокой чувствительностью и позволяют исключить диагноз ДБСТ. При положительных результатах первого этапа обследования целесообразно применять специфичные подтверждающие тесты. Использование данного подхода при постановке диагноза ДБСТ позволяет учитывать данные иммунологического обследования, полученное путем сопоставления результатов выполнения различных методов определения аутоантител.

Апоптоз клеток кожи и лимфоцитов периферической крови, по всей видимости, представляет основной источник антигенного материала при СКВ и является основным механизмом индукции АНА [28]. Нарушение клиренса иммунных комплексов рассматривается в качестве основного механизма патогенеза СКВ.

Классическая иммунологическая теория указывает на то, что продукция антител, в том числе аутоантител, контролируется и управляется соответствующими цитокинами. В то же время, экспериментальные исследования показали, что сыворотка больных СКВ способна индуцировать синтез цитокинов, в том числе 1Ь-1р, 1Ь-8, 1Ь-10 и ТИБ-а в культурах мононуклеаров периферической крови [105]. Этот механизм опосредован Бсу!^, что позволяет рассматривать иммунные комплексы (РОС), содержащие аутоантитела, в качестве одной из причин увеличения продукции цитокинов.

Кроме того, современные исследования указывают на то, что не только иммуноглобулины в составе РЖ имеют иммуномодулирующую функцию, но и аутоантигены, прежде всего содержащие нуклеиновые кислоты, стимулируют клетки иммунной системы и индуцируют иммунные ответы, включая синтез провоспалительных цитокинов. Этот механизм опосредован связыванием ДНК- и РНК- содержащих аутоанигенов в составе ИК с Toll like receptors (TLR), в частности TLR 7/9, на поверхности анигенпрезентирующих клеток [31].

Цель работы: изучить роль цитокинов и аутоантител в патогенезе и диагностике диффузных болезней соединительной ткани.

Задачи работы:

1. Оптимизировать метод определения антинуклеарных антител с использованием в качестве субстрата клеточной линии НЕр-2.

2. Изучить изолированную встречаемость и сочетанную встречаемость антинуютеарного фактора, антител к двуспиральной ДНК, антител к экстрагируемому нуклеарному антигену и антител к кардиолипину у больных с подозрением на диффузные болезни соединительной ткани.

3. Изучить клиническое значение выявление антинуклеарного фактора, антител к двуспиральной ДНК и антител к кардиолипину при системной красной волчанке.

4. Изучить клиническое значение выявления антинуклеарного фактора, криоглобулинов с активностью ревматоидного фактора, антител к альфа-фодрину у больных синдромом Шогрена.

5. Изучить клинико-патогенетическое значение определения цитокинов у больных с системной красной волчанкой и роль иммунологических показателей для оценки клинической активности заболевания у больных системной красной волчанкой.

6. Разработать алгоритмы поэтапного, комплексного обследования пациентов с диффузными болезнями соединительной ткани.

Научная новизна. В данной работе была впервые определена сочетанная встречаемость широкого спектра антинуклеарных антител в популяции больных диффузными болезнями соединительной ткани Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

Впервые была проанализирована диагностическая значимость панели тестов, включающих определение антинуклеарного фактора, антител к экстрагируемому нуклеарному антигену, антител к двуспиральной ДНК, антител к кардиолипину, что позволило определить их место в диагностике диффузных болезней соединительной ткани. На основании полученных данных были разработаны диагностические алгоритмы использования лабораторных методов выявления аутоантител для диагностики диффузных болезней соединительной ткани.

Была разработана модификация метода культивирования эпителиоидной клеточной линии аденокарциномы гортани человека НЕр-2 в лунках предметного стекла для определения антинуклеарного фактора.

В результате применения метода мультиплексного анализа содержания цитокинов в сыворотке больных системной красной волчанкой была установлена взаимосвязь продукции цитокинов и повышения концентрации аутоантител в сыворотке больных системной красной волчанкой.

Практическая значимость работы. В ходе работы была разработана, апробирована и внедрена в лабораторную практику панель тестов, выявляющая антинуклеарный фактор, антитела к двуспиральной ДНК, антитела к экстрагируемым нуклеарным антигенам, антитела к кардиолипину. Впервые в России были разработаны стандартные протоколы доаналитического, аналитического и постаналитического определения антинуклеарного фактора на клеточной линии НЕр-2.

Была разработана программа внешнего контроля качества определения антинуклеарных антител, которая с 2006 года внедрена в Федеральную систему внешней оценки качества клинических лабораторных исследований.

При анализе сочетанной встречаемости антинуклеарного фактора, антител к двуспиральной ДНК и антител к кардиолипину было установлено, что изолированно антитела к кардиолипину встречаются только в 0,6% случаев. Установлено, что повышение уровня патологии до 50 МЕ/мл при определении антител к двуспиральной ДНК позволяет увеличить специфичность обследования до 95%.

Теоретическая значимость работы. В ходе работы удалось показать взаимосвязь между продукцией цитокинов и содержанием аутоантител в сыворотке больных системной красной волчанкой.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Повышение продукции цитокинов у больных с системной красной волчанкой связано с увеличением уровня аутоантител, что указывает на патогенетическую взаимосвязь этих иммунологических феноменов.

2. Иммунологическое обследование больных с подозрением на диффузные болезни соединительной ткани должно быть этапным и комплексным, с использованием в качестве скриниговых тестов сочетанного определения антинуклеарного фактора и антител к экстрагируемому нуклеарному антигену, а в качестве подтверждающих тестов определение антител к двуспиральной ДНК, антител к рибонуклеопротеиновым антигенам и антител к кардиолипину.

3. Объем лабораторного иммунологического обследования больных с системной красной волчанкой включает: определение антинуклеарного фактора, антител к двуспиральной ДНК и антител к кардиолипину для проведения дифференциальной диагностики с диффузными болезнями соединительной ткани; определение теста волчаночной полоски для дифференциальной диагностики кожных и системных форм волчанки; определение концентрации 1Ь-6, уровня антинуклеарного фактора и антител к двуспиральной ДНК для мониторинга активности заболевания.

Личный вклад автора в проведение исследования. Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором выполнены все этапы стандартизации тестов для выявления антинуклеарного фактора и антител к двуспиральной ДНК методом непрямой иммунофлюоресценции. Автором была проведена оценка наличия криоглобулинов с активностью ревматоидного фактора в сыворотке больных синдромом Шогрена, исследование материала биопсии кожи методом прямой иммунофлюоресценции. Серологическое обследование образцов на наличие антител к двуспиральной ДНК, кардиолипину, экстрагируемому нуклеарному антигену методом иммуноферментного анализа, измерение концентрации цитокинов производилось сотрудниками НМЦ по молекулярной медицине СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Клиническое обследование пациентов с ДБСТ и группы контроля производилось сотрудниками отделения ревматологии Ленинградской областной клинической больницы, городской больницы № 25 г. Санкт-Петербурга, сотрудниками клиники кожных болезней СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, а также сотрудниками Российского НИИ гематологии и трансфузиологии Росздрава.

Реализация работы. Тесты по выявлению антинуклеарного фактора, методы определения специфичности антинуклеарных антител, иммунофлуоресцентное исследование биоптатов кожи внедрены в практическую диагностическую работу клиник СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, и доступны для пациентов лечебно-профилактических учреждений Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования были доложены на VII, VIII, IX и X Всероссийском научном форуме с международным участием имени акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2003, 2004, 2005, 2006), XIth International

Student Congress of Medical Sciences (Гронинген, 2004), IV и V конференции по tb ревматологии Северо-Западного федерального округа (2004, 2005), 7 John Humphrey Advanced Summer programme in immunology (Москва, 2005), на межвузовской конференции Общества Молодых Ученых СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова «Санкт-Петербургские научные чтения - 2005», заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного общества иммунологов (2007).

выводы

1. Анализ сочетанной встречаемости антинуклеарного фактора и антител к двуспиральной ДНК у больных с диффузными болезнями соединительной ткани позволил установить, что при повышении в два раза границы патологии теста по определению антител к двуспиральной ДНК (до 50 МЕ/мл) у больных позитивных по антинуклеарному фактору специфичность обследования возрастает до 95%.

2. Антитела к кардиолипину у больных с диффузными болезнями соединительной ткани преимущественно обнаруживаются в сочетании с антителами к двуспиральной ДНК и антинуклеарным фактором.

3. Увеличение уровней антинуклеарных антител встречается и у здоровых лиц и при различных аутоиммунных заболеваниях, но при диффузных болезнях соединительной ткани титры значительно выше, что позволяет при дифференциальной диагностике больных с аутоиммунными заболеваниями использовать в качестве границы патологии значения антинуклеарного фактора выше 100 МЕ/мл.

4. У больных системной красной волчанкой с высокими титрами и гомогенным типом свечения антинуклеарного фактора наблюдаются высокие показатели клинико-лабораторной активности (высокие значения международных индексов активности заболевания SLEDAI и BILAG).

5. Антитела к кардиолипину и двуспиральной ДНК встречаются при гомогенном типе свечения антинуклеарного фактора и коррелируют с клинико-лабораторной активностью системной красной волчанки.

6. Определение антинуклеарного фактора и ревматоидного фактора при синдроме Шогрена существенно превосходит по клинико-лабораторной информативности выявление антител к альфа-фодрину.

7. Увеличение продукции IL-1(3, IL-6 и IFN-y у больных с системной красной волчанкой взаимосвязано с повышением уровня антинуклеарных антител, что указывает на их роль в патогенезе заболевания.

8. Продукция IL-6 при системной красной волчанке сопоставима с показателями острофазового ответа, такими как СОЭ, гипергаммаглобулинемия, что позволяет использовать определение данного цитокина в качестве дополнительного маркера активности заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Поскольку использование клеточной линии НЕр-2 в качестве субстрата для определения антинуклеарного фактора позволяет оценивать не только титр аутоантител, но и описывать тип свечения ядра, данный тест рекомендуется для скринингового обследования пациентов с подозрением на диффузные болезни соединительной ткани.

2. Для повышения информативности и специфичности обследования больных с диффузными болезнями соединительной ткани рекомендуется сочетанное определение антинуклеарного фактора, антител к двуспиральной ДНК и антител к кардиолипину.

3. При отрицательных результатах теста по определению антинуклеарного фактора у лиц с подозрением на диффузные болезни соединительной ткани необходимо определение антител к экстрагируемому нуклеарному антигену.

4. При обнаружении гомогенного типа свечения антинуклеарного фактора целесообразно дальнейшее определение антител к двуспиральной ДНК, тогда как при выявлении гранулярного типа свечения ядра необходимо исследование спектра антител к рибонуклеопротеиновым антигенам.

5. Для диагностики и дифференциальной диагностики кожных и системных форм волчанки необходима биопсия кожи с выполнением теста волчаночной полоски.

6. Для диагностики диффузных болезней соединительной ткани рекомендуемые диагностически значимые уровни тестов составляют: для антинуклеарного фактора 100МЕ/мл (1/320), для антител к двуспиральной ДНК 50МЕ/мл и для антител к кардиолипину ^в/^М 30/20 ОРЬ/МРЬ/мл.