Автореферат и диссертация по медицине (14.00.43) на тему:Клинико-иммунологические и морфологические изменения при терапии бронхиальной астмы иммунодепрессивными препаратами

На правах рукописи

ЗЫКОВ Кирилл Алексеевич

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ТЕРАПИИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ ИММУНОДЕПРЕССИВНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ.

14.00.43 - пульмонология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

д 2 АПР 2003

Москва-2009 г.

003466326

Работа выполнена в Лаборатории пульмонологии НИМСИ ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития РФ»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Соколов Евгений Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Александров Олег Васильевич доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН, Маколкин Владимир Иванович

доктор медицинских наук, профессор Ильина Наталия Ивановна

Ведущая организация: ФГУ «Научно-исследовательский институт пульмонологии» ФМБА России

Защита диссертации состоится 20 апреля 2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 121001.01 при ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации (по адресу: 103875, Москва, ул. Воздвиженка, д.6.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «УНМЦ» УД Президента РФ по адресу: 121359, Москва, ул. Маршала Тимошенко,21.

Автореферат разослан

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Список сокращений

АТФ - аденозинтрифосфат

БА - бронхиальная астма

БАЛ - бронхо-альвеолярный лаваж

ГКС - клюкокортикостероиды

ИЛ - ингерлейкин

ИЛр - рецептор интерлейкина

ИФН - интерферон

МДА - малоновый диальдегид

Мф - Мелфалан

НСТ - нитросиний тетразолий

СОД - супероксиддисмутаза

ФБС -фибробронхоскопия

ФНО - фактор некроза опухолей

ЦсА - Циклоспорин А

CD - cluster of differentiation (кластер дифференцировки)

FEV1 - forced expiratory volume

FVC - forced vital capacity

PEF - peaked expiratory flow

Th - T-helper

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Бронхиальная астма (БА) является серьезной медико-социальной проблемой, сокращая среднюю продолжительность жизни мужчин на 6,6 и женщин - на 13,5 лет (Федосеев Г.Б., 1996). По данным ВОЗ смертность от БА составляет более 250 ООО человек ежегодно. Эпидемиологические исследования показали увеличение количества пациентов с тяжелыми формами заболевания - около 3% от всех больных БА (Annesi, 2005). По данным экспертов в России в настоящее время около 7 миллионов больных БА, из них около 1 миллиона - с тяжелыми формами (Чучалин А.Г., 2003).

Как известно, персистирующее воспаление в бронхиальном дереве -ключевой фактор патогенеза БА, который остается до конца не выясненным (McFadden E.R., 2001). При БА постоянно происходят параллельные процессы: повреждения и регенерации тканей (Федосеев Г.Б., 1998; Barnes PJ, 1999, Sokolov EI, 2000), что приводит к ремоделированию легких, с которым связывают хронизацию и утяжеление астмы (Соколов Е.И., 2000; Черняев А.Л., 2001; Bousquet J, 1995; James AL, 1997). Исход тяжелой БА зависит от степени клинико-иммунологических и морфологических изменений, и от степени обратимости этих процессов (Wilson JW, 1997, 1999). Разработка новых подходов к лечению данной патологии возможна только на основе изучения взаимосвязей между клинико-функциональными, иммунологическими и морфологическими изменениями дыхательных путей.

В лечении БА в настоящее время ведущим направлением является противовоспалительная терапия (Global Initiative in Asthma, 2007), основными представителями которой являются глюкокортикостероиды (ГКС). При этом применение имеющихся противовоспалительных средств не предодставляет полный контроль над воспалительным процессом в бронхах и не приводит к дальнейшему снижению смертности от БА. В России серьезной проблемой также является большое количество больных на лечении системными ГКС из-за бесконтрольного их назначения в прошлом (Чучалин А.Г., 2000).

В этих условиях актуальной является проблема поиска противовоспалительных препаратов, являющихся альтернативой ГКС (Bel Е., 2000; Cher L., 1999). Предложены теоретические обоснования для применения иммуно-депрессивных препаратов у пациентов с тяжелой формой заболевания, однако оно ограничено побочными эффектами (Dykewicz M.,2001; Floreani А.,1997; Frew А.,2001). Для снижения стероидзависимости пациента применялись препараты: тролеандомицин, ауранофин, циклоспорин, метотрексат. В ряде случаев удавалось снизить поддерживающую дозу кортикостероидов (Alexander А., 1995; Evans D., 2001), но их применение при БА остается сомнительным из-за большой вариабельности эффектов, большого количества побочных реакций и ограниченного клинического опыта (GINA,2007).

Применение ультра-малых доз обосновывается предшествующими данными об их механизмах действия, отличных от действия терапевтических концентраций препарата (Пухальский, 1991, 1995). В случае ультра-малых доз не происходит образования внутрицепочечных и межцепочечных сшивок ДНК, а наблюдается взаимодействие данного препарата с рецепторными структурами клетки (в частности с рецептором к ИЛ-2). На кафедре внутренних болезней №3 МГМСУ нами была разработана методика лечения бронхиальной астмы ингаляциями ультра-низких доз алкилирующего препарата Мелфалан (Мф) (Соколов Е.И., 2002; Zykov К, 2000, 2001). На основании полученных клинических и лабораторных данных сделано заключение о противовоспалительном эффекте предлагаемой терапии, приводящей к клиническому улучшению и регенеративным изменениям бронхиального эпителия. Таким образом, комплексное исследование клинико-иммунологических и морфологических изменений при лечении астмы иммунодепрессивными препаратами дает возможность более полно определить основные звенья патогенеза заболевания, улучшить имеющиеся и разработать на этой основе новые методы его лечения.

Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Изучить патогенетическую взаимосвязь клинических, иммунологических и морфологических изменений бронхиального дерева на фоне терапии

бронхиальной астмы ультра-низкими дозами иммунодепрессивных препаратов с различным механизмом действия (Мф и ЦсА).

задачи исследования.

1. Оценить клиническую эффективность и безопасность применения ингаляций ультра-низких доз иммунодепрессивных препаратов с различным механизмом действия у пациентов с бронхиальной астмой.

2. Исследовать динамику механики внешнего дыхания у больных БА при лечении низкими дозами иммунодепрессивных препаратов (Мф и ЦсА).

3. Оценить динамику эндоскопической картины в бронхиальном дереве при применении ингаляций ультра-низких доз Мф.

4. Исследовать гисто- и ультраструктурные изменения эпителия бронхов больных БА при лечении иммунодепрессивными препаратами.

5. Осуществить сравнительный анализ динамики показателей клеточного (лимфоцитарного и фагоцитарного) и гуморального иммунитета (иммуноглобулинов и цитокинового спектра крови и бронхо-альвеолярного смыва) при лечении Мф и ЦсА.

6. Провести корреляционный анализ изменений функциональных, иммунологических и морфологических параметров у пациентов исследуемых и контрольной групп.

7. Исследовать in vitro дозозависимость действия алкилирующего препарата Мф на биохимические параметры крови.

8. Разработать патогенетическое обоснование применения иммунодепресив-ных препаратов для лечения бронхиальной астмы.

9. Разработать метод лечения бронхиальной астмы низкими дозами ЦсА и рекомендации по применению иммунодепрессивных препаратов в составе комплексной терапии больных бронхиальной астмы.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Ингаляции ультра-низких доз алкилирующего препарата Мф у пациентов с обострением БА не проявляют иммунодепрессивного эффекта, обладают противовоспалительным и иммуномодулирующим действием, что приводит к положительному клиническому эффекту, выражающемуся в снижении тяжести обострений, потребности в короткодействующих /32-агонистах, повышении толерантности к физической нагрузке; уменьшении эндоскопических признаков воспаления в бронхах; нормализации гисто-ультраструктуры эпителиального пласта.

2. Ингаляции ультра-низких доз ЦсА у пациентов с контролируемой БА не проявляют иммунодепрессивного эффекта, обладают противовоспалительным и иммуномодулирующим действием, что приводит к положительному клиническому эффекту.

3. Иммуномодулирующее действие ингаляций Мф и ЦсА опосредуется системой цитокинов ИЛ-5, ИЛ-8, ИФН-7.

4. Лабораторным маркером противовоспалительной активности ингаляций ультра-низких доз Мф и ЦсА является экспрессия маркеров активации лимфоцитов периферической крови (CD25 и CD95).

5. Экспериментальное исследование in vitro продемонстрировало, что действие алкилирующего препарата Мф на эритроциты крови является дозо-зависимым и в ультра-низких концентрациях приводит к снижению окси-дативного стресса.

6. Выявленная взаимосвязь клинико-иммунологических и морфологических изменений при лечении БА ингаляциями ультра-низких доз иммуноде-прессивных препаратов отражает ведущую роль иммунологических механизмов в развитии БА и возможность использования выявленных изменений в иммунной системе как мишеней для терапевтического воздействия.

7. Разработан новый метод лечения бронхиальной астмы ЦсА, отличающийся от прототипов ингаляционным способом введения препарата,

ультра-низкими разовыми и курсовыми дозировками. Уточнены разовые и курсовые дозировки и периодичность курсов ингаляций ультра-низких доз Мф.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые выявлена патогенетическая взаимосвязь клинико-иммунологических и морфологических изменений при лечении бронхиальной астмы ингаляциями ультра-низких доз иммунодепрессивных препаратов с различным механизмом действия, определены основные мишени иммуно-тропного воздействия предлагаемых методик.

Впервые показана определена эффективность и установлена безопасность применения ингаляций ультра-низких доз ЦсА у пациентов с средне-тяжелой и тяжелой персистирующей бронхиальной астмой; выявлен имму-номодулирующий эффект у данной группы больных.

Впервые показана взаимосвязь изменений клинико-функциональных, иммунологических параметров и показателей морфологического состояния бронхиального эпителия при применении ингаляций ультра-низких доз Мф.

Впервые проведено сравнение иммунотропного действия ультранизких доз иммунодепрессивных препаратов с различным механизмом действия (Мф и ЦсА), показано отличие механизмов иммунотропного действия.

Впервые выявлена взаимосвязь динамики клинических и иммунологических показателей при применении ингаляций ультранизких доз Мф и ЦсА.

Впервые разработаны показания/противопоказания для лечения ингаляциями ультра-низких доз Мф и ЦсА.

Впервые в эксперименте in vitro показано противоположное дозозави-симое действие на биохимические параметры эритроцитов различных концентраций (ультра-низких и терапевтических) алкилирующих препаратов; показано уменьшение оксидативного стресса при применении ультра-низких концентрациях алкилирующих препаратов.

На основании проведенного исследования разработаны новые методы лечения БА ингаляциями ультра-низких доз Мф и ЦсА и определен комплекс наиболее информативных лабораторных маркеров для мониторинга эффективности лечения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

На основании изучения клинико-иммунологических и морфологических изменений при терапии БА иммунодепрессивными препаратами разработан новый дифференцированный подход к лечению умеренной и тяжелой персистирующей БА при стабильном течении и обострении.

Разработанные новые методы лечения умеренной персистирующей и тяжелой персистирующей БА ингаляциями ультра-низких доз алкилирующе-го препарата Мелфалана и Циклоспорина А позволяют повысить эффективность терапии БА.

Определенные дополнительные лабораторные параметры позволяют оценивать выраженность воспалительного процесса и проводить мониторинг эффективности лечения ингаляциями ультра-низких доз иммунодепрессив-ных препаратов с различным механизмом действия. ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ:

Результаты исследования внедрены в клиническую практику Лаборатории пульмонологии НИМСИ МГМСУ, отделения пульмонологии ГКБ№70, а также используются в педагогическом процессе кафедры факультетской терапии и профболезней МГМСУ, кафедры клинической иммунологии МГМСУ, НИИ клинической кардиологии им АЛ.Мясникова Российского кардиологического научно-производственного комплекса. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Материалы исследования представлены в виде докладов на ежегодных международных конгрессах Европейского Респираторного Общества (ERS): 10-й конгресс ERS в Мадриде, Испания, 1999 года; 11-й - Флоренция, Италия, 2000 год; 12-й - Берлин, Германия, 2001 год; 14-й - Глазго, Великобри-

тания, 2004 год; докладов на Национальных конгрессах по болезням органов дыхания: 18-й конгресс Екатеринбург, 2008; 16-й конгресс, Санкт-Петербург, 2006; доклада на Ученом Совете НИИ пульмонологии Росздрава, 2007 год; конгрессе «Интерастма-2003», Санкт-Петербург; конференциях «Актуальные проблемы пульмонологии», 2004, 2005, 2006 года, Москва. Апробация диссертации состоялась 25.06.08 на научно-практической конференции кафедры факультетской терапии, госпитальной терапии №2, иммунологии, лаборатории пульмонологии МГМСУ Росздрава, внутренних болезней МБФ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, отдела иммунологии РКНПК Росздрава. ПУБЛИКАЦИИ.

Всего по материалам диссертации опубликовано 36 печатных работ в отечественных и зарубежных печатных изданиях, из них 13 в центральной российской печати и зарубежных журналах, рекомендованных ВАК для публикаций основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук и 3 патента РФ на изобретения по теме диссертации. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 250 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с описанием материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 44 таблицы и 31 рисунок. Библиография включает 317 источников из них 68 - отечественные и 249- зарубежные.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Характеристика групп обследованных больных и дизайн исследования.

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской Декларацией в модификации 41 Мировой Медицинской Ассамблеи (Гонконг, 1989), требованиями Good Clinical Practice, а также с законами РФ. Все пациенты перед включением в исследование подписывали форму информированного согласия. Госпитализированные пациенты находились в пульмонологическом отделении ГКБ№70 г.Москвы. Амбулаторные пациенты наблюдались в

Лаборатории пульмонологии НИМСИ МГМСУ.

Клиническое исследование состояло из двух частей:

1. Оценка эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз Мф у пациентов с обострением БА;

2. Пилотное исследование по оценке эффективности и безопасности применения ингаляций ультра-низких доз ЦсА при стабильном течении БА.

Пациенты

Для участия в исследовании произведено скрининговое обследование 420 пациентов с БА. В соответствии с критериями включения/исключения для дальнейшего участия в исследование были включены 56 человек, (29 -мужчин и 27 - женщин).

Распределение больных по возрасту и полу приведено в таблице 1.

Таблица 1

Распределение больных по полу и возрасту.

Пол Возраст Мужчины Женщины Всего

Контроль Мф ЦсА Контроль Мф ЦсА

30-40 лет - 1 - 1 1 - 3

41-50 лет 3 - - 3 5 - 11

51-60 лет 6 5 3 1 4 - 19

61-70 лет 4 6 1 4 2 6 23

Всего 13 12 4 9 12 6 56

29 27

Все пациенты страдали персистирующей БА умеренной (30 пациентов) и тяжелой (26 пациентов) степени тяжести (согласно критериям вША, 2002). Возрастной диапазон пациентов составлял от 30 до 70 лет (56,6+1,7). Средний срок заболевания 11,6±2,4 лет (от 2 до 30 лет). У всех пациентов зафиксирована обратимая бронхообструкция ДРЕУ1> 12% и 200 мл при проведе-

нии бронходилятационного теста с короткодействующим |32-агонистом по стандартной методике.

Критерии включения в исследование:

1. Клинический диагноз бронхиальной астмы средней или тяжелой степени, в соответствии с классификацией тяжести астмы по вЖА, 2002 года;

2. Подписание информированного согласия на участие в исследовании;

3. Возраст от 30 до 70 лет включительно;

4. Пол - мужчины и небеременные женщины (мужчины и женщины с детородным потенциалом с эффективной контрацепцией);

5. Наличие прироста РЕУ1>12% и 200 мл при проведении фармакологической пробы с /32-агонистом при компьютерной спирометрии.

6. Возможность адекватно выполнять требования протокола исследования.

Критерии исключения из исследования:

1. Пациенты, не подписавшие информированное согласие;

2. Беременные, кормящие женщины или женщины с детородным потенциалом, не пользующиеся эффективной контрацепцией;

3. Наличие в анамнезе указаний на использование иммунотропных препаратов за 6 месяцев до начала исследования;

4. Неспособность оптимально выполнять спирометрию и заполнять дневник;

5. Наличие атопической бронхиальной астмы;

6. Муковисцидоз или бронхоэктатическая болезнь в анамнезе;

7. Наличие клинически значимых сопутствующих заболеваний сердечнососудистой, эндокринной, нервной систем, печени, почек, которые по мнению исследователя могут повлиять на получаемые результаты;

8. Аллергия, на какой либо из компонентов используемых препаратов.

При изучении эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз Мелфалана дополнительным критерием включения являлось наличие обострения БА, с острыми или подострыми эпизодами прогрессирующего ухудшения дыхания, кашля, хрипов, чувства заложенности в груди или их

этих симптомов, при снижении РЕР от 70%, но не более, чем до 25% от лучших показателей, что соответствовало умеренному и тяжелому обострению.

При изучении эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз Циклоспорина А дополнительным критерием включения в исследование являлось наличие у пациента БА вне обострения как минимум в течение 4 недель до включения в исследование.

Для клинической характеристики пациентов использовался клинический индекс, включающий в себя следующие показатели: одышка, кашель, толерантность к физической нагрузке, частота и тяжесть приступов, частота использования р2-агонистов. Вышеперечисленные показатели оценивались по четырехбальной системе; при этом, наибольшая выраженность признака соответствовала 3 баллам, а отсутствие признака - 0. Частота использования короткодействующих р2-агонистов оценивалась по следующей схеме: 0 р/сут

- 0 баллов, 1-3 р/сут - 1 балл, 4-6 р/сут - 2 балла, более 7 р/сут - 3 балла.

Интенсивность кашля оценивался по следующей шкале: 0 — нет; 1

— слабый кашель (незначительное покашливание по утрам); 2 — умеренный кашель (покашливание по утрам и на протяжении дня); 3 — сильный кашель.

Дизайн исследования по оценке эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз Мелфалана у пациентов с обострением БА.

Исследование было организовано как одноцентровое, проспективное, рандомизированное, плацебо-контролируемое. Дизайн исследования представлен на Схеме 1.

Стандартная терапия обострений БА, осуществлялась в соответствие с рекомендациями вША, 2002 года. После рандомизации 1:1 пациенты первой группы помимо стандартной терапии получали дополнительно ингаляции Мф (0,1 мг в 0,9% р-ре ЫаС1) в течение 5 дней (группа Мф). Пациенты второй группы помимо стандартной терапии получали ежедневные ингаляции плацебо (0,9% р-р ИаС1) в течение 5 дней (контрольная группа).

Схема 1.

Дизайн исследования по оценке эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз Мф при обострении БА.

Разовая доза составляла 0,1 мг Мф, растворенного в 2 мл физиологического раствора (концентрация препарата в растворе 0,05 мг/мл). Раствор для ингаляции готовился непосредственно перед процедурой. Ингаляции проводились в течение 5 дней ежедневно 1 раз в сутки (курсовая доза 0,5 мг Мф).

В группе пациентов, включенных в исследование, 31 (67%) из 46 человек получали системные ГКС на постоянной основе. Суточная поддержи-

вающая доза системных ГКС составляла от 5 до 20 мг (в среднем 8,75±3,81мг) в пересчете на преднизолон.

Контрольная группа состояла из 9 женщин и 13 мужчин в возрасте от 31 года до 69 лет (55,0±2,1), с давностью заболевания от 2 до 10 лет (6,2±1,2). Умеренно персистирующая БА выявлена у 50% пациентов, тяжелая - у 50%.

Группа Мф состояла из 12 женщин и 12 мужчин в возрасте от 38 до 69 лет (55,4±1,2), с давностью заболевания от 4 до 30 лет (12,7±2,5). Умеренно персистирующая БА выявлена у 45,5% пациентов, тяжелая - у 54,5%.

Группы Мелфалана и контроля были сопоставимы по полу, возрасту и клинической характеристике заболевания.

Дизайн исследования по оценке эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз ЦсА у пациентов с БА стабильного течения.

Исследование было организовано как одноцентровое, пилотное, проспективное. Дизайн проведенного исследования представлен на Схеме 2.

Стандартная терапия БА стабильного течения проводилась в соответствие с GINA, 2002 года. Помимо стандартной терапии пациенты получали ингаляции ЦсА по 1 мг ежедневно в течение 5 дней.

Группа ЦсА состояла из 6 женщин и 4 мужчин в возрасте от 51 до 70 лет (63,7±2,3), с давностью заболевания от 5 до 20 лет (11,3±2,1). Умеренно персистирующая БА выявлена у 60% пациентов, тяжелая - у 40%.

В группе пациентов, включенных в исследование, 3 (30%) из 10 человек получали системные ГКС на постоянной основе. Суточная доза системных ГКС составляла от 5 до 10 мг (6,8±1,8 мг) в пересчете на преднизолон.

Ежедневно 1 раз в сутки в течение 5 дней выполнялись ингаляции 1 мг ЦсА, в 2 мл физиологического раствора (курсовая доза - 5 мг ЦсА).

Методика ингаляции Мф и ЦсА.

Согласно разработанной нами методике для ингаляций использовалась система для проведения бронхопровокационных проб («Bronchoscreen-II», Erich Eager, Германия), позволяющая определить точную дозу введенного

препарата и контролировать уровень аэродинамического сопротивления /RAW/ методом перекрытия воздушного потока, для исключения местного ирритативного действия препарата. Все растворы готовились непосредственно перед ингаляцией, длительность которой составляла 30-40 минут до поступления заданной дозировки препарата к пациенту. Осуществлялся контроль бронхиальной проходимости (спирометрия или пикфлуометрия) до и после каждой ингаляции для исключения бронхоконстрикторного действия препарата.

Схема 2.

Дизайн исследования по оценке эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз ЦсА при БА стабильного течения.

Методы исследования

Исследование проводилось с использованием лабораторных (общеклинических и специальных) и инструментальных методов: функциональных (спирометрия), рентгенологических, эндоскопических (фибробронхоскопия).

Исследования выполнены на базе Лаборатории пульмонологии НИМ-СИ, кафедры клинической иммунологии МГМСУ, Онкологического научного центра РАМН, Центра иммуногенетики РАМН, Российского кардиологического научно-производственного комплекса, ГКБ №70.

Обследование пациентов проводилось до лечения и через 5 дней после окончания курса ингаляций в контрольной группе и группе Мф и через 14 дней в группе ЦсА, а оценка клинического индекса у пациентов контрольной группы и группы Мф через 3 месяца, в группе ЦсА - через 1 месяц после окончания курса ингаляций.

Общеклинические методы исследования включали в себя: развернутый анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи.

Функциональные методы исследования.

Компьютерная спирометрия с анализ кривой «поток-объем» проводился по стандартной методике на аппарате «SuperSpiro» (MicroMedical, Великобритания), получаемые результаты выражались в процентах к должной величине. Оценивались показатели: FVC, FEV1, PEF, MEF75, MEF50 и MEF25. Пикфлуометром (MicroMedical, Великобритания) пациенты 2 раза в день фиксировали пиковую скорость потока на выдохе.

Специальные лабораторные методы исследования: фенотипирование лимфоцитов периферической крови, исследование функциональной активности фагоцитов периферической крови, определение цитокинового статуса в периферической крови и жидкости бронхиального смыва.

Инструментальные методы исследования включали в себя:

Рентгенологическое обследование заключалось в выполнении рентгенографии органов грудной клетки по общепринятой методике.

Фибробронхоскопию выполняли под местной анестезией фиброброн-хоскопом BF-30 фирмы «Olympus», Япония трансназально в лежачем положении больного. Помимо атропинизации проводилась дополнительная пре-медикация ß-агонистами и ГКС. При дыхательной недостаточности проводилась кислородотерапия. Производился бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ) и

биопсия слизистой оболочки бронхов. Учитывая, что состояние пациентов не соответствовало международным критериям отбора больных для проведения БАЛ (ERS, 1990), то для получения жидкости БАЛ применялась не стандартная, а щадящая методика, заключающаяся в инсталляции 10 мл физиологического раствора в бронхиальное дерево с последующей аспирацией бронхиального содержимого. До лечения щипцевая биоспия выполнялась из шпоры VIII бронха, а после лечения - из шпоры VI бронха.

Для характеристики эндоскопической картины воспалительных изменений бронхов была использована классификация Г.И.Лукомского и соавт. (1982). Для математической обработки результатов эндоскопического исследования применялась качественно-количественная оценка воспалительных изменений бронхиального дерева (Нечаев В.И. 1980). Учитывались: гиперемия, отек, количество секрета, его вязкость и характер. Оценка проводилась по 4-х балльной шкале, при этом отсутствие патологических изменений принималось за 0 баллов, а максимальная выраженность признака - за 3 балла.

После получения материала при ФБС для гисто-ультраструктурного исследования бронхобиоптаты обрабатывались по стандартной методике с заливкой в аралдит. Полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и толуидиновым синим и просматривали в электронном микроскопе JEM-100 С-Х (Japan) при ускоряющем напряжении 80 кв.

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось методом проточной цитофлуорометрии. Процент антигенположи-тельных клеток, экспрессирующих дифференцировочные антигены (CD3 ,CD4,CD8,CD 16,CD20,CD25,CD95), определяли в «гейте» лимфоцитов на проточном цитофлуориметре «FACScan» (Becton Dickinson, США) с использованием ФИТЦ (флюоресцеин-5-изотиоцианат) меченых моноклональ-ных антител производства НПЦ «Медбиоспектр». В каждом образце накапливали не менее 10000 событий. Анализ проводился с использованием программного обеспечения Consort 32 "Lysys II" версии 1.02 (3).

Функциональная активность нейтрофилов оценивалась по их способности поглощать частицы латекса, как в базальных, так и в стимулированных условиях. Определяли фагоцитарную активность, фагоцитарный индекс и резервную возможность фагоцитоза при стимуляции зимозаном. HCT - тест. Принцип НСТ-теста, косвенно отражающего переваривающую способность фагоцитов, основан на восстановлении поглощенного растворимого нитросинего тетразолия (HCT) в нерастворимый диформазан продуктами окислительно-восстановительных реакций. Подсчет проводили на 100 ней-трофилах. Определяли процент НСТ+ клеток и индекс стимуляции.

Иммуноферментное исследование цитокинового спектра крови и жидкости БАЛ проводили с помощью иммуноферментных тест-систем производства «Протеиновый контур» и «Цитокин» (Россия) на ридере Anthos 2020 (Австрия). В ходе работы исследованы концентрации ИЛ-4, ИЛ-5, sIL-2R, ИФН-у и ФНО-а в сыворотке крови и концентрации ИЛ-5, ИЛ-8, ИФН-у и ФНО-а в жидкости БАЛ.

Экспериментальное исследование влияния ультра-низких концентраций Мелфалана на биохимические показатели крови in vitro.

На базе НИИ педиатрии Научного центра здоровья детей РАМН (д.м.н. Е.М.Васильева) исследовалось влияние Мф на эритроциты 10 здоровых добровольцев in vitro, средний возраст 46±3,4 года. В пробу №1 добавляли физиологический раствор (контроль). Сравнивалось воздействие на эритроциты различных концентраций Мф (1,0 мкг/мл - проба №2 и 0,1 мкг/мл -проба №3), меньшая из которых соответствовала расчетной концентрации препарата в бронхиальном секрете пациентов при ингаляциях in vivo.

Во всех образцах проводилось исследование: активности общей активируемая аденозинтрофосфатаза (АТФазы); Ca,Mg- АТФазы; Na/K-АТФазы, активности супероксиддисмутазы (СОД); интенсивности процессов перекис-ного окисления по уровню общего, связанного и свободного малонового ди-альдегида (МДА) и механического и перекисного гемолиза эритроцитов,

проценту прироста гемолиза эритроцитов; уровня внутриклеточных свободных катионов: железа, магния, меди, цинка и фосфат аниона.

Об активности Ca, Mg- и Na/K-АТФаз судили по приросту неорганического фосфата в течение 60-минутной инкубации в среде, содержащей 3 шМ MgC12 , 120 mM NaCl, 20 шМ KCl, 3 шМ АТФ, 10 mM HEPES (pH 7,4). Без уабаина определялась общая АТФазная активность, а в присутствии 3 шМ уабаина - активность Са,М§-АТФазы. По разности судили об активности Ыа,К-АТФазы.

Содержание фосфора в среде определяли спектрофотометрически по методу Лоури-Лопеца в модификации Скулачева.

Активность СОД исследовалась с помощью стандартных наборов фирмы Randox на спектрофотометре DU530 (Beckman Coulter, США).

Перекисные процессы изучались скрининг-методом определения интенсивности метаболических процессов в мембране эритроцита в соответствии с ранее описанной методикой. При этом исследовались: механический и перекисный гемолиз эритроцитов, процент прироста гемолиза эритроцитов, уровень общего, связанного и свободного МДА.

Содержание катионов и фосфата определяли на автоматическом анализаторе Synchron СХ 5Д, (Beckman Coulter, США).

Статистическая обработка результатов

Для описательной статистики массивов данных, подвергающихся нормальному распределению, применялось М±м. Для описания непараметрических данных использовалась медиана и 25 и 75 персентили. Статистическая обработка данных проводилась с использованием параметрических - Т-критерий Стьюдента, коэффициент корреляции Пирсона и непараметрических - критерий Уилкоксона и коэффициент корреляции Спирмена методов. Различия считались достоверными при р<0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.1 Исследование эффективности лечеиия пациентов с БА ингаляциями ультра-низких доз Мф.

Клиническое состояние больных группы Мф и контроля до и через 3 месяца после лечения представлены в Таблице 3.

На основании приведенных данных можно сделать вывод, что у пациентов контрольной группы через три месяца после проведенной терапии наблюдается тенденция к снижению частоты и тяжести приступов и значимое снижение частоты использования Рг-агонистов - с 1,9±0,3 до 1,3±0,4 (р<0,05), что свидетельствует о положительном клиническом эффекте проводимой стандартной терапии.

Таблица 3.

Динамика клинических показателей у больных до и после лечения

Группа Мф Группа контроля

Показатель До лечения Через 3 мес. До лечения Через 3 мес.

Одышка 1,7±0,2 1,3±0,2** 1,8+0,2 1,б±0,4

Кашель 1,5+0,2 1,2±0,1 1,5+0,2 1,2±0,3

Наруш. толер. к физ. нагр. 2,1±0,2 1,1+0,1** 2,0±0,3 1,7+0,3

Частота исп. рг-агонистов 1,8±0,2 1,4±0,2* 1,9±0,3 1,3+0,4*

| Приступы частота 2,3±0,1 1,4+0,4* 2,2±0,1 1,7+0,3

тяжесть 1,9+0,2 0,8±0,1** 2,2+0,1 1,4±0,4

Клинический индекс 1,9±0,1 1,2±0,1* 2,0±0,1 1,7±0,3

"-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,05)

""-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,005)

При этом у пациентов группы Мф после проведенного лечения наблюдается достоверное уменьшение одышки, частоты использования р2-агонистов, увеличение толерантности к физической нагрузке, тенденция к уменьшению кашля. Анализируя характер приступов у пациентов группы МФ можно отметить, что как частота развития приступов, так и тяжесть приступов достоверно снизились. Пациенты, получавшие ингаляции ультранизких доз Мф самостоятельно купировали возникающие приступы (в основном, ингаляциями короткодействующих Рг-агонистов), в то время как больные контрольной группы, часто были вынуждены прибегать к медицинской помощи. Клинический индекс у пациентов группы Мф также достоверно снизился. Все вышеизложенное свидетельствует о положительном клиническом эффекте ингаляций ультранизких доз Мф.

3.1.2 Исследование механики внешнего дыхания

Данные компьютерной спирометрии больных до и 5 дней после курса ингаляций представлены в таблице 4. Как видно из приведенной таблицы, у пациентов контрольной группы после проведения стандартной терапии наблюдается достоверное увеличение РЕУ1, РЕР, МЕР75% (крупные бронхи).

Таблица 4.

Спирометрические данные пациентов до и после курса ингаляций

Основная группа Контрольная группа

До лечения после лечения до лечения после лечения

?мс 75,9+4,1 90,8±4,43* 71,7±4,4 81,99±5,17

55,3+4,5 69,15+5,62* 53,0±4,3 65,00±5,52*

РеР 50,9+3,8 70,5±5,27* 48,8±3,8 64,81+4,7*

МеР75 31,2±3,9 43,75+5,90* 30,8+4,6 40,57+5,51*

МеР5о 26,8+3,3 38,1±4,46* 23,8±3,6 31,85±4,06

МеР25 34,2+3,1 44,05±4,12* 32,3+3,0 38,37±3,88

*-отмечены статистически значимые изменения (р<0,05)

При этом у пациентов группы Мелфалана наблюдается статистически

значимая положительная динамика всех скоростных показателей дыхания -FVC, FeVl, PeF, MeF75, MeF50, MeF25 (более выраженная, чем у пациентов контрольной группы).

В обеих группах значимого роста RAW во время ингаляций Мф и плацебо, не зафиксировано, что свидетельствовало об отсутствии ирритативного эффекта Мф. На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что ингаляции ультранизких доз Мф улучшают показатели спирометрии у больных умеренной и тяжелой персистирующей БА

3.1.3 Оценка эндоскопической картины бронхиального дерева. Описание динамики эндоскопической картины в группе Мелфалана представлено в Таблице 5.

Таблица 5.

Динамика воспалительных изменений бронхов до и после курса ингаляций

Группа Мелфалана Контрольная группа

Показатель До лечения После лечения До лечения После лечения

Гиперемия 0,6±0,1 0,2+0,1* 0,7±0,1 0,5±0,2

Отек 1,4±0,2 0,6+0,1** 1,1±0,1 0,6+0,2*

Секрет количество 1,7+0,1 1,1+0,2* 1,5±0,2 1,0±0,2**

Вязкость 1,9±0,2 0,7+0,1** 1,3+0,2 1,1+0,2

Характер 1,2±0,1 0,7±0,1** 1,0±0,2 1,1 ±0,2

♦-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,02)

♦♦-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,001) По данным фибробронхоскопии при лечении ингаляциями ультранизких доз Мф наблюдалось резкое снижение вязкости секрета (с 1,9±0,2 до 0,7±0,1, р<0,01). Отмечено изменение характера секрета с серозно-гнойного на слизистый (с 1,2±0,1 до 0,7±0,1, р<0,03), в то время как в контрольной группе его вязкость и характер менялись незначимо. Гиперемия, отек слизистой оболочки бронхиального дерева, вязкость и характер секрета значимо уменьшались в группе Мф по сравнению с контрольной (р<0,03). Число па-

циентов с положительной динамикой по данным ФБС среди больных основной группы, больше, чем в контрольной группе (85 и 61%, соответственно).

Представленные данные свидетельствуют о том, что добавление ингаляций ультра-низких доз Мф к терапии обострений БА не имеет местноразд-ражающегося действия и имеет к выраженный противовоспалительный эффект по сравнению со стандартной терапией.

3.1.4 Морфологическое исследование бронхобиоптатов.

При морфологическом исследовании бронхобиоптатов после лечения Мф в 60% случаев у пациентов отмечалась положительная динамика гисто-ультраструктуры слизистой оболочки бронхов.

Рисунок 1.

Трансформация бронхиального эпителия при астме

Пациент П. 63 лет. Слущивание эпителиоцитов. Сосуды полнокровны, с большим количеством эозинофилов. Полутонкий срез, окраска гематоксилином и эозином. хбОО

Морфологические изменения заключались в восстановлении мукоци-лиарного аппарата эпителиоцитов, нормализации количества и ультраструктур бокаловидных клеток, восстановлении межклеточных контактов, пролиферации эпителиоцитов и их органелл (в основном, митохондрий), уменьшении отека слизистой оболочки, уменьшении количества клеток воспаления в

подслизистом слое вплоть до восстановления целостности эпителия как пласта (Рисунок 1,2).

Восстановление эпителиальных структур. Большое количество ресничек. Нормализация соотношения реснитчатые/бокаловидные клетки. Полутонкий срез, окраска гематоксилином и эозином. хбОО

При традиционном лечении положительная динамика по данным брон-хобиоптатов отмечалась только в 23% случаев, и заключалась в уменьшении инфильтрации клеточными элементами слизистой оболочки без полноценной регенерации эпителия.

3.1.5 Исследование клеточного и гуморального иммунитета.

При фенотипировании лимфоцитов периферической крови после лечения в обеих группах не было зафиксировано значимых изменений уровней CD3, CD4, CD8, CD 16, CD20, что свидетельствует об отсутствии иммуноде-прессивного действия ингаляций Мф. В то же время при лечении ингаляциями ультра-малых доз Мф выявлено достоверное снижение уровня CD95 (Fas-рецептор) (Рисунок 3) с 32,85±4,71 до 21,16±4,01 (р<0,05), что доказывает снижения активации этих клеток. У пациентов основной группы отмечена тенденция к снижению экспрессии CD25 (легкая цепь рецептора к ИЛ-2), также являющимся маркеров активации клеток. В контрольной группе этот

Рисунок 2. Динамика того же пациента.

ощ

показатель, напротив, имел тенденцию к увеличению.

Рисунок 3.

Показатели фенотипирования лимфоцитов больных основной и контрольной групп до и после лечения (в % к исходному уровню)

%

-У ( А £ f- р<0,05

Су /

CD3 CD4 CD8 CD20 CD16 CD25 CD95 CD4/CD8 i Контрольная группа Основная группа

*-данные представлены в виде медиан, для остальных показателей приведены средние значения

Таблица 6.

Показатели фагоцитарного иммунитета до и после лечения

М±2ш - интервал нормы, определяемый как среднее ± два стандартных отклонения.

Группа Мелфалана Группа контроля

Показатель Норма До лечения Через 5 дней До Лечения Через 5 дней

ФАН % 70,0±20,0 46,9±2,6 46,4±2,2 46,4±2,7 48,9±2,9

ФЧ 5,5±3,5 3,8±0,2 4,7±0,3* 4,5±0,4 4,1±0,3

ФР % 13,5±1,7 12,4±1,5 13,0±1,7 13,4±1,6

нет % 15,0±5,0 26,5±1,4 21,4±1,6 22,3±2,3 25,3±2,7

спонтанный

нет % 55,0±25,0 48,7±2,5 48,1±2,2 45,6±1,7 49,4±1,6

стимулир.

ИС 5,5±1,5 1,9±0,2 2,4±0,2 2,2±0,3 2,0±0,2

"-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,02)

Всем пациентам проводилось исследование показателей фагоцитоза до лечения и в динамике (Таблица 6).

Анализируя таблицу 6 можно сделать вывод, что фагоцитарная активность нейтрофилов и фагоцитарный резерв, через 5 дней и через три месяца после лечения, не имеют различий по сравнению с исходным уровнем, в то время как фагоцитарное число при лечении Мф непосредственно после лечения достоверно (р<0,02) увеличивается (4,7±0,3) по сравнению с исходным уровнем (3,8±0,2), что свидетельствует об иммуномодулирующем влиянии ингаляций Мф на фагоцитарное звено иммунной системы и об отсутствии иммунодепрессивного действия.

Результаты исследования уровня цитокинов в периферической крови и жидкости БАЛ представлены в таблицах №7 и 8.

Таблица 7.

Динамика уровня цитокинов в сыворотке крови пациентов контрольной

группы (пкг/мл)

Группа контроля Группа Мелфалана

Показатель До лечения После лечения До Лечения После Лечения

ИЛ-4 259,1±174,4 253,3±164,6 161,6±111,0 120,6±87,0*

ил-=5 2,3±0,8 11,9±8,0 4,3±1,1 3,84±1,64*

ИФН-у 6,1±3,3 4,2±2,8 21,1±6,6 11,9±5,0

ФНО-а 63,3±37,4 85,9±31,3 51,7±18,2 43,8±16,0

"-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,05)

При анализе Таблицы 7 можно сделать вывод, что уровни цитокинов в образцах сыворотки крови пациентов контрольной группы после проведенной стандартной терапии достоверно не отличались от исходных значений, за исключением ФНО-а, имевшем тенденцию к увеличению. При этом, в сыворотке крови пациентов группы Мф после проведенного курса ингаляций наблюдается статистически значимое (р<0,05) снижение уровня ИЛ-4 с 161,6±111,0 до 120,6±87,0, ИЛ-5 с 4,3±1,1 до 3,84±1,64, тенденция к сниже-

нию уровня ИФН-у и ФНО-а. Данная динамика цитокинов свидетельствует о системном противовоспалительном эффекте терапии ингаляциями ультранизких доз Мелфалана.

Таблица 8.

Динамика уровня цитокинов в бронхиальном смыве до и после лечения

(пкг/мкМ мочевины)

Группа контроля Группа Мелфалана

Показатель До лечения После лечения До Лечения После лечения

ИЛ-5 38,1±15,1 19,9±7,5 15,1±4,2 27,1±8,0

ИЛ-8 3053,0±1115,0 1528,0±286,0 1850,0±554,0 3697,0±1404,0

ИФН^у 34,9±12,1 29,1±11,7 14,1±2,6 38,5±10,6*

ФНО-а 210,0±100,1 177,8±103,4 202,0± 101,7 231,6±72,4

*-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,05)

Анализируя Таблицу 8, можно сделать вывод, что уровни цитокинов в образцах бронхиального смыва пациентов контрольной группы после проведенной стандартной терапии достоверно не отличались от исходных значений. Однако необходимо отметить, что после лечения в образцах бронхиального смыва наблюдается тенденция к снижению уровня ИЛ-8. При этом у пациентов группы Мф наблюдается достоверное (р<0,05) увеличение уровня ИФН-у с 14,1±2,6 до 38,5±10,6 и тенденция к увеличению ИЛ-5, ИЛ-8 и ФНО-а. Необходимо также отметить, что после лечения соотношение ИЛ-5/ИФН-у, меняется в сторону ИФН-у, свидетельствуя о смещении воспалительного ответа в ТЫ сторону.

3.1.6 Исследование безопасности ингаляций Мф Побочных эффектов в процессе лечения Мф и ЦсА отмечено не было. При проведении данной работы ни один из пациентов основной или контрольной групп не выбыл из исследования. Показатели клинического анализа крови не претерпели изменений в обеих группах. Лишь в группе Мф отмече-

28

но значимое повышение количества тромбоцитов (с 302,82+15,17 до 362,56±24,62 х109/л), что мы связываем со снижением воспалительного процесса в бронхиальном дереве при применении Мф, уменьшением потребления тромбоцитов в легких и повышением их количества на периферии. Динамика показателей биохимического анализа крови, анализа мочи была незначима в обеих группах. Не было зафиксировано изменений показателей лабораторных анализов, связанных с развитием характерных для терапевтических доз препаратов побочных эффектов.

3.2.1 Исследование эффективности лечения пациентов с БА ингаляциями ультра-низких доз ЦсА.

Изменения клинического состояния больных группы ЦсА, которое оценивалось до и через 3 месяца после лечения представлены на Рисунке 4.

Рисунок 4

Динамика клинических показателей в группе Циклоспорина А в баллах

□ до лечения □ после лечения

*р<0,05 ** р<0,02 *** р<0,01

У пациентов группы ЦсА наблюдается выраженная динамика клиниче-

ских показателей. После проведенного лечения наблюдается достоверное уменьшение одышки, кашля, частоты использования р2-агонистов, частоты и

тяжести приступов. Клинический индекс, являющийся показателем, объединяющим все клинические параметры, также достоверно снизился в группе Циклоспорина А. Эти изменения свидетельствуют о хорошем клиническом эффекте ингаляций ЦсА у пациентов со стабильным течением умеренной и тяжелой персистирующей БА.

3.2.2 Исследование механики внешнего дыхания Всем пациентам проводилось исследование механики внешнего дыхания. Данные представлены в таблице 9.

Таблица 9.

Динамика показателей спирометрии больных группы Циклоспорина А

Показатели До лечения Через 14 дней

FVC 82,0±7,1 79,4±6,0

FeVI 63,3±8,0 68,0+7,9

PeF 53,2±7,1 54,4±7,4

MeF75 39,4+8,5 51,0±12,4

MeF50 32,7+7,6 41,7+10,8

MeF25 40,6±8,9 42,0+7,4

Наблюдается тенденция к увеличению MeF75 (с39,4±8,5 до 51,0+12,4) и MeF50 (с 32,7±7,6 до 41,7+10,8), что свидетельствует о положительном действии ингаляций ультранизких доз Циклоспорина А. При этом отсутствие достоверной динамики скоростных показателей дыхания в группе ЦсА, вероятно, обусловлено тем, что пациенты находились в стадии ремиссии бронхиальной астмы и имели показатели, близкие к лучшим персональным данным до исследования.

При проведении ингаляций ЦсА значимого роста RAW, не зафиксировано, что свидетельствовало об отсутствии ирритативного эффекта ЦсА.

3.2.3 Оценка эндоскопической картины бронхиального дерева.

Описание динамики эндоскопической картины в группе Циклоспорина А представлено в Таблице 10.

Рисунок 5

Динамика показателей воспаления в группе Циклоспорина А в баллах

2 1,5 1

0,5 О

□ до лечения □ после лечения

о ОЁЁЕВ

гиперемия отек количество вязкость характер

секрета секрета секрета

В группе ЦсА наблюдается тенденция к уменьшению гиперемии (с 0,5±0,2 до 0,1+0,1), отека (с 1,6+0,3 до 1,1+0,4), количество секрета не меняется (до лечения 1,8+0,4, после 1,8±0,3), вязкость и характер секрета существенно не изменяются (с 1,5+0,4 до 1,3±0,2 и с 1,3±0,3, до 1,0±0,0 соответственно). Интерпретация полученных данных представляет определенные сложности из-за малого количества пациентов, которым была проведена бронхоскопия (Рисунок 5).

Представленные данные свидетельствуют о том, что добавление ингаляций ультра-низких доз ЦсА к терапии стабильной БА не имеет местнораз-дражающегося действия.

3.2.4 Исследование клеточного и гуморального иммунитета.

При фентипировании лимфоцитов периферической крови значимых изменений уровней СБЗ+, СБ4+, СБ8+, СЭ20+, СБ 16+, С095+клеток в группе ЦсА выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии иммуно-

депрессивного действия ингаляций ультранизких доз ЦсА на лимфоцитарное звено иммунной системы (Рисунок 6).

Рисунок 6

Динамика СО лимфоцитов в группе Циклоспорина А в %

65 п

□ до лечения □ после лечения

При применении ингаляций ультра-низких доз Циклоспорина-А наблюдается стойкая тенденция к снижению экспрессии СГ)25 (легкая цепь рецептора к ИЛ-2) с 3,5±1,2 до 1,3±0,5, (не достигшая статистической достоверности из-за малого количеств наблюдений), что свидетельствует об уменьшении активации лимфоцитов периферической крови.

Всем пациентам после проведенной терапии было выполнено исследование фагоцитарного звена иммунитета. Сравнительный анализ показателей до и после лечения представлен в Таблице 10.

Анализируя таблицу 10 можно сделать вывод, что после проведенного лечения у пациентов группы ЦсА наблюдается тенденция к увеличению фагоцитарного резерва и статистически значимое увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов с 40,6±2,5 до 47,2±2,9 (р<0,002) и фагоцитарного чис-

ла с 3,9±0,4 до 5,3±0,5 (р<0,02). Это свидетельствует об иммуномодулирую-щем влиянии ингаляций ЦсА на фагоцитарное звено иммунной системы и об отсутствии иммунодепрессивного действия.

Таблица 10.

Показатели фагоцитарного звена иммунитета группы ЦсА до и после лечения

Показатель Норма До лечения Через 14 дней

ФАН % 70,0±2,2 40,6±2,5 47,2±2,9*

ФЧ 5,5±0,4 3,9±0,4 5,3±0,5**

ФР% 10,8±1,6 15,0±3,0

НСТ % спонтанный 15,0±0,7 17,8±1,4 19,8±1,6

НСТ % стимулир. 55,0±3,5 54,3±2,2 62,2±2,4

ИС 5,5±0,2 3,6±0,4 3,3±0,2

"-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,002)

"""-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,02)

В ходе работы были исследованы уровни цитокинов в сыворотке крови. Результаты исследования представлены в Таблице 11. Анализируя таблицу 36, можно сделать вывод, что в сыворотке крови пациентов группы Циклоспорина А после проведенного курса ингаляций наблюдается тенденция к снижению уровня растворимого рецептора к ИЛ-2 (что является важным, так как ЦсА блокирует выработку ИЛ-2), в то время как уровни ИФН-у после лечения не отличаются от исходных значений.

Таблица 11.

Динамика уровня цитокинов в крови пациентов группы ЦсА (пкг/мл)

Показатель До лечения После лечения

ИФН-у 2,1±0,3 2,1±0,3

ИЛ-2р 590,3±64,9 495,0±38,6

3.2.5 Исследование безопасности ингаляций ЦсА

Динамика параметров развернутого анализа крови у пациентов группы ЦсА после проведенного лечения отсутствует. При оценке биохимического анализа крови и общего анализа мочи у пациентов группы Циклоспорина А после лечения изменений по сравнению с исходными значениями не наблюдается, что позволяет исключить наличие побочных эффектов, характерных для терапевтических концентраций ЦсА.

3.3 Исследование взаимосвязи клинических, иммунологических, эндоскопических и морфологических параметров.

Нами была прослежена взаимосвязь динамики показателей СО лимфоцитов и клинических проявлений. При проведении корреляционного анализа выявлена зависимость изменений экспрессии СБ95 (маркер активации) на лимфоцитах и клинических признаков в группе Мф. При исследовании взаимосвязи динамики клинических показателей и СБ-маркеров выявлена корреляция интенсивности кашля, тяжести приступов и нарушения толерантности к физической нагрузке с СЭ95 у пациентов, получавших ингаляции ультранизких доз Мелфалана, а также частоты приступов - с СБ8 и нарушения толерантности к физической нагрузке - с СБ20 у пациентов, получавших ингаляции ультра-низких доз Циклоспорина А. Выявленные корреляции являются прямыми - снижение экспрессии СО лимфоцитов сопровождается уменьшением степени выраженности клинических проявлений (Таблица 12).

В группе Мелфалана наблюдается достоверная прямая корреляция между СБ95 и кашлем, тяжестью приступов и нарушением толерантности к физической нагрузке. Выявленные закономерности демонстрируют клиническую значимость снижения СБ95 после лечения Мф, доказывая противовоспалительный эффект проводимой терапии.

Известно, что С08(цитотоксические лимфоциты) являются основой противовирусного иммунитета, а СЭ20 (В-лимфоциты) - антибактериального иммунитета посредством дифференцировки в плазматические клетки с по-

следующим синтезом антител. Выявленные закономерности при лечении ЦсА позволяют предположить, что повышение CD8 и CD20, возможно, связано с увеличением вирусной и бактериальной нагрузки, которая играет важную роль в развитии обострения при бронхиальной астме.

Таблица 12

Коэффициент корреляции клинических показателей и CD лимфоцитов

Показатель Циклоспорин А Мелфалан

CD8 CD20 CD95

Кашель - - 0,5 (р<0,02)

Тяжесть приступов - - 0,4 (р<0,05)

Частота приступов 0,5 (р<0,05) - -

Нарушение толер. к физ. нагрузке - 0,6 (р<0,02) 0,5 (р<0,02)

При исследовании взаимосвязи динамики показателей СБ лимфоцитов и эндоскопических признаков воспаления выявлена прямая корреляция СБ95 с вязкостью секрета и характером секрета. При этом необходимо отметить, что зависимость является прямой - снижение С095 сопровождается уменьшением степени выраженности эндоскопических признаков воспаления

(Таблица 13).

Таблица 13

Коэффициент корреляции эндоскопических признаков воспаления и СБ95

Показатель Мелфалан

CD95

Вязкость секрета 0,4 р<0,01

Характер секрета 0,4 р<0,02

Снижение уровня С095, наблюдаемое у пациентов, получавших ингаляции ультранизких доз Мф, свидетельствует об уменьшении активации кле-

ток, снижении активности воспалительного процесса в бронхах и, как следствие, уменьшении эндоскопических признаков воспаления.

При исследовании взаимосвязи динамики клинических показателей и показателей фагоцитоза выявлена корреляция таких клинических показателей как одышка с фагоцитарным числом в группе Мелфалана, а также частоты приступов с фагоцитарной активностью нейтрофилов и кашля, частоты использования р2-агонистов, частоты и тяжести приступов с фагоцитарным числом в группе Циклоспорина А. Необходимо отметить, что зависимость является обратной - увеличение показателей фагоцитоза сопровождается уменьшением степени выраженности клинических проявлений (Таблица 14).

Таблица14

Коэффициент корреляции клинических симптомов и показателей фагоцитоза

Показатель Циклоспорин А Мелфалан

ФАН ФЧ ФЧ

Одышка отсутствует отсутствует -0,4 р<0,05

Кашель отсутствует -0,4 р<0,05 отсутствует

Тяжесть приступов отсутствует -0,5 р<0,02 отсутствует

Частота приступов -0,6 р<0,02 -0,7 р<0,002 отсутствует

Частота использования Р2-агонистов отсутствует -0,7 р<0,001 отсутствует

При исследовании взаимосвязи динамики показателей фагоцитоза и эндоскопических признаков воспаления в группе Мелфалана выявлена корреляция фагоцитарного числа с гиперемией слизистой бронхов, вязкостью и характером секрета. Необходимо отметить, что зависимость изменений фагоцитарного числа и эндоскопических признаков воспаления является обратной - увеличение фагоцитарного числа сопровождается уменьшением эндоскопических признаков воспаления (Таблица 15).

Положительная динамика показателей фагоцитоза у пациентов, получавших ингаляции ультранизких доз Мелфалана и Циклоспорина А, вероятно, обусловлена противовоспалительным действием данных препаратов, что

приводит к уменьшению воспалительных процессов и нормализации фагоцитарной функции. Можно также предположить, что прямое иммуномодули-рующее действие Мф и ЦсА на фагоциты приводит к уменьшению бактериальной нагрузки, что также оказывает положительное влияние на клинику и эндоскопические признаки воспаления.

Таблица 15

Коэффициент корреляции эндоскопических признаков воспаления и показателей фагоцитоза

Показатель Мелфалан

ФЧ

Вязкость секрета -0,5 р<0,02

Характер секрета -0,5 р<0,02

Полученные данные о взаимосвязях клинических, иммунологических, эндоскопических и морфологических показателей подтверждают важную роль активации лимфоцитарного звена и фагоцитарного звеньев иммунной системы в патогенезе БА и актуальность разработки новых методов терапии, направленных на коррекцию этих звеньев. Это позволяет рекомендовать проведение фенотипирования лимфоцитов и исследование фагоцитарной функции для мониторинга состояния пациентов и контроля эффективности терапии ингаляциями иммунодепрессивных препаратов с различным механизмом действия.

3.4 Результаты исследования влияния ультра-низких концентраций Мелфалана на биохимические показатели крови in vitro.

В ходе исследования, (Таблица 16) выявлено значительное повышение общей АТФазной активности при добавлении Мелфалана в низкой концентрации 0,1 мкг/мл (р<0,05). Повышение концентрации в 10 раз вызывало некоторое снижение активности данного фермента. Отмечено повышение ак-

тивности Ca.Mg-АТФазы при концентрации Мф 0,1 мкг/мл (р<0,05) и отсутствие каких-либо изменений при более высоких концентрациях.

Нами не выявлено достоверных изменений в интенсивности механического гемолиза эритроцитов (показатель, характеризующий жесткость/хрупкость мембран) под влиянием Мелфалана в группах №2 и 3.

При инкубации эритроцитов с высокими концентрациями Мф значимо увеличивался перекисный гемолиз эритроцитов (р<0,01) в группе №2 по сравнению с контролем (1,77±0,13 и 1,42±0,07, соответственно), при этом влияние малых доз препарата в группе №3 было менее выраженным.

При использовании Мф в дозе 0,1 мкг/мл в группе №3 несколько снижалось содержание в них связанного МДА, уровень его не изменялся при введении больших доз препарата в группе №2. Изменение уровня свободного МДА в эритроцитах было разнонаправленным - повышалось при введении низких доз в группе №3 (0,75±0,19, р<0,01 по сравнению с контролем и группой №2), и достоверно снижалось под влиянием высоких концентраций Мф в группе №2 по сравнению с группой №1 (0,075±0,08 и 0,29±0,06, соответственно). В группе №3 снижение связанного и увеличение свободного МДА под воздействием Мф сопровождалось тенденцией к повышению активности Ca,Mg-ATOa3bi и снижению - Ыа,К-АТФазы.

Как известно, СОД является одним из самых активных антиоксидантов, и ее активность в клетках легких пациентов с БА обратно коррелирует с тяжестью заболевания (Smith, 1997). Важно отметить, что малые дозы Мф не влияли на активность СОД, а большие - на 40% снижали активность фермента (р<0,01) по сравнению с контролем.

Выявлено незначительное повышение уровня свободного внутриэрит-роцитарного магния (Mgi„) в группе №2 и более значительно повышение данного показателя в группе №3, достоверно (р<0,05) отличающееся от контроля (0,36±0,02 и 0,34±0,02 ммоль/л, соответственно).

Таблица 16.

Исследования влияния различных концентраций Мелфалана на биохимические показатели эритроцитов периферической крови in vitro (M±m).

Параметр Группа №1 контроль Группа №2 1,0 мкг/мл Группа №3 0,1 мкг/мл

Активность общей АТФазы 276,15±10,86 257,8±10,24 284,6±14,84 *

Активность Са/М§-АТФазы 256,65±11,33 256,3±15,25 273,1±12,87

Активность Ш/К-АТФазы 36,25±6,39 -5,05±7,51* 32,95±9,58

Механ. гемолиз эрироцитов 0,915±0,16 1,01±0,18 0,96±0,1

Перекис, гемолиз эрироцитов 1,42±0,07 1,77±0,13* 1,555±0,23

МДА общий 2,845±0,15 2,595±0,04 3,105±0,06

МДА связанный 2,49±0,12 2,495±0,07 2,35±0,16

МДА свободный 0,29±0,06 0,075±0,08 0,75±0,19

сод 14,54±0,96 10,615±2,47*t 15,39±1,18

М82+ 0,34±0,02 0,35±0,05 0,36±0,02*

Ее3+ 2 5,4± 1,04 24,93±3,65 24,25±2,45

Си2+ 3,015±0,21 2,945±0,11 3,8±0,18*t

гп2+ 23,05±1,57 23,35±1,80 22,95±1,0

* - различия достоверны (р<0,05) между исследуемой Группами №3 и 1; | - различия достоверны (р<0,05) между Группой №2 и Группой №3

При исследовании уровня Си2+ и отмечено, что при применении низких доз Мелфалана в группе №3 увеличивалось содержание ионов меди по сравнению с контролем (3,8±0,18 и 3,015±0,21 ммоль/л, соответственно), в то время как концентрация цинка не менялась в группах.

Таким образом, проанализировав полученные данные, можно сделать заключение о различном дозозависимом действии различных концентраций алкилирующего препарата Мелфалан на эритроциты периферической крови. Концентрации, которые достигаются в организме при применении стандартных дозировок Мф в онкологической практике, приводят к усилению пери-кисного окисления липидов, увеличивая активность оксидантного стресса. При этом нами установлено, что ультра-малые концентрации, примененные нами в ходе клинического исследования, не только не оказывают отрицательного влияния на показатели перикисного окисления липидов, но и положительно действуют на активность общей , Са,^^-АТФаз и Ыа/К-АТФаз, что улучшает окисидантный-антиоксидантный статус и не оказывает цитопато-генного действия. В заключение можно сделать вывод о перспективности применения ультра-низких доз Мелфалана у пациентов с бронхиальной астмой для снижения оксидантного стресса.

3.5 Гипотетический механизм действия ультра-низких доз Мф и ЦсА

На основании полученных в ходе работы данных нами разработан гипотетический механизм действия ингаляций ультра-низких доз Мелфалана и Циклоспорина А, представленный на Рисунке 7.

Наблюдаемые клинико-иммунологические, функциональные, эндоскопические и морфологические взаимосвязи- снижение экспрессии СБ25 и СБ95 на клетках периферической крови, увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов и фагоцитарного числа в периферическом кровотоке, коррелирующие с положительной динамикой клинических, эндоскопических и морфологических признаков, увеличение уровней ИФН-у, ИЛ-5 и ИЛ-8 в жидкости бронхиального смыва, снижение уровня растворимого рецептора ИЛ-2 в сыворотке крови - могут являться маркерами эффективности проводимой терапии. Данные маркеры могут быть использованы не только для оценки эффективности лечения, но и для определения показаний к дифференцированному назначению ингаляций ультранизких доз Мелфалана и Цик-

лоспорина А в зависимости от исходных изменений как клинических, так и иммунологических параметров.

Цитотоксическое действие CD8, —|_повреждение эпителия_

Воспаление в бронхиальном дереве

При снижении концентраций препаратов снижается их токсичность, уменьшается количество мишеней для действия препаратов, что приводит к повышению специфичности. При снижение дозы механизм действия препаратов связан не с цитостатическим, а с иммуномодулирующим эффектом (Рисунок 7).

Полученные нами данные свидетельствуют о влиянии ингаляций ультранизких доз Мелфалана и Циклоспорина А на патогенетические механизмы развития астмы, что связано с модулированием процессов воспаления в результате блокады рецептора ИЛ-2 Мелфаланом и блокадой экспрессии генов синтеза ИЛ-2 и растворимого рецептора ИЛ-2 Циклоспорином А. Все вышеизложенное позволило создать новый метод лечения обострений умеренной

Рисунок 7

Предполагаемый механизм действия

Мелфалан

Циклоспорин А

и тяжелой персистирующей БА ингаляциями ультра-низких доз Мелфалана и стабильного течения БА - ингаляциями ультра-низких доз Циклоспорина А.

ВЫВОДЫ:

1. Ингаляции ультра-низких доз Мелфалана для лечения обострений, а Циклоспорина А - для лечения стабильной персистирующей бронхиальной астмы средне-тяжелого и тяжелого течения являются безопасными и клинически эффективными методами лечения, приводящими к снижению частоты и тяжести обострений, потребности в короткодействующих /32-агонистах, повышению толерантности к физической нагрузке.

2. Показатели механики внешнего дыхания у больных с обострением бронхиальной астмы при лечении ультра-низкими дозами Мелфалана улучшаются после проведенного курса ингаляций.

3. Противовоспалительное действие ингаляций ультра-низких доз Мелфалана при эндоскопическом исследовании выражается в достоверном снижении гиперемии, отека и вязкости секрета.

4. Противовоспалительное действие Мелфалана приводит к регенераторным изменениям эпителия, вплоть до восстановления его структурной целостности как пласта, выявленным при гисто- и ультраструктурном исследовании, что отражает взаимосвязь иммунологических и морфологических изменений при лечении пациентов с бронхиальной астмой ингаляциями Мелфалана.

5. Ингаляции ультра-низких доз Мелфалана и Циклоспорина А не оказывают иммунодепрессивного действия на лимфоцитарное и фагоцитарное звенья иммунитета, демонстрируя иммунотропную активность.

6. В алгоритме лабораторной диагностики эффективности ингаляций ультра-низких доз Мелфалана и Циклоспорина-А наиболее информа-

тивным маркером служит снижение экспрессии СБ25 и СЭ95 лимфоцитов периферической крови.

7. Иммуномодулирующие эффекты ингаляций ультра-низких доз Мелфа-лана и Циклоспорина-А опосредуются через цитокины - ИЛ-5, ИЛ-8, растворимый рецептор ИЛ-2, ИФН-у.

8. Выявлена взаимосвязь клинических и иммунологических показателей, доказывающая ключевой характер иммунотропного действия ультранизких доз иммунодепресивных препаратов. При лечении Мелфаланом интенсивность кашля, тяжесть приступов, нарушение толерантности к физической нагрузке, вязкость и гнойность бронхиального секрета ассоциированы с активностью лимфоцитов и фагоцитов периферической крови. При лечении Циклоспорином А частота приступов ассоциирована с количеством цитотоксических лимфоцитов периферической крови и с активностью фагоцитов; кашель, частота использования Р2-агонистов, частота и тяжесть приступов - с фагоцитарным числом, а нарушение толерантности к физической нагрузке - с количеством В-лимфоцитов крови.

9. Выявлена дозозависимость эффекта Мелфалана на биохимические параметры эритроцитов, при ультра-низких концентрациях препарата в среде приводящего к улучшению оксидантно-антиоксидантного статуса, а при обычных терапевтических концентрациях - к усилению окси-дантного стресса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Учитывая доказанную в ходе исследования безопасность и клиническую эффективность, пациентам с обострением умеренной персистирующей и тяжелой персистирующей бронхиальной астмы рекомендовано проведение курса ингаляций ультра-низкими дозами апкилирующего препарата Мелфалан (0,1 мг) в течение 5 дней ежедневно.

2. Учитывая доказанную в ходе исследования безопасность и клиническую эффективность, пациентам со стабильным течением умеренной персистирующей и тяжелой персистирующей бронхиальной астмы рекомендовано проведение курса ингаляций ультра-низкими дозами иммунодепрессив-ного препарата Циклоспорин А.

3. При определении пациентов, для лечения которых могут применяться разработанные методики, необходимо использовать выработанные показания/противопоказания.

4. При применений ингаляций ультра-низких доз Мелфалана и Циклоспорина А необходимо проведение комплекса предварительных исследований (компьютерная спирометрия по стандартной методике с проведением бронхолитической пробы с 400 мкг сальбутамола; рентгенологическое исследование легких, электрокардиографическое исследование; лабораторные анализы: общий анализ крови с оценкой лейкоцитарной формулы; общий анализ мочи; биохимический анализ крови (общий белок, мочевина, креатинин, АсАТ, АлАТ, билирубин, глюкоза, С-реактивный белок) с повторением функциональных и лабораторных исследований после проведения курса ингаляций.

5. Больным умеренной персистирующей и тяжелой персистирующей бронхиальной астмой в комплекс обследования рекомендовано включение иммунологических методов обследования с проведением фенотипирова-ния лимфоцитов периферической крови с определением маркеров активации, показателей фагоцитоза и уровней цитокинов в сыворотке крови и

жидкости бронхиального смыва для оценки эффективности проводимого лечения.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Соколов Е.И., Зыков К.А. и др. Ингаляции ультра-малых доз алкилирую-щих препаратов в лечении бронхиальной астмы. Пульмонология, 2002, №3, с.82-89.

2. Соколов Е.И., Пухальский А.Л., Зыков К.А. и др. Иммуномодулирующие эффекты ингаляций ультра-низких доз алкилирующего цитостатика мел-фалана у больных бронхиальной астмой. Пульмонология, 2002, №5, с.81-86.

3. Соколов Е.И., Зыков К.А., Цыпленкова В.Г. и др. Сравнительная морфологическая характеристика слизистой оболочки бронхов у больных хроническим обструктивным бронхитом и бронхиальной астмой. Архив патологии, 2000, №4, Том 62, с.31-37.

4. Патент РФ на изобретение «Препарат для лечения бронхиальной астмы» по заявке №2008115088/14(016791) (приоритет от 21.04.2008) -получено положительное решение от 16.12.2008 на выдачу патента РФ на изобретение. Авторы: К.А.Зыков, Е.И.Соколов и др.

5. Патент РФ на изобретение «Препарат для лечения бронхиальной астмы» по заявке №2008115088/14(016789) (приоритет от 21.04.2008) -получено положительное решение от 16.12.2008 на выдачу патента РФ на изобретение. Авторы: К.А.Зыков, Е.И.Соколов и др.

6. Патент РФ на изобретение №2162322 от 27.01.2001 «Препарат для лечения бронхиальной астмы и способ ее лечения». Авторы: Е.И.Соколов, К.А.Зыков и др.

7. Соколов Е.И., Зыков К.А., Пухальский А.Л. и др. Новый метод лечения бронхиальной астмы ингаляциями ультра-малых доз алкилирующих препаратов. Сб.научный трудов Московского государственного медико-стоматологического университета «Актуальные проблемы пульмонологии» М.2004, с.80-84.

8. Рвачева A.B., Лебедев С.Н., Зыков К.А Влияние ингаляций низких доз иммунодепрессивных препаратов на клеточное звено иммунитета больных тяжелой бронхиальной астмой. Сб.научных трудов Московского го-

сударственного медико-стоматологического университета «Актуальные проблемы пульмонологии-2006» М.2006, с.81-85.

9. Рвачева A.B., Лебедев С.Н., Зыков К.А Иммунологические критерии оценки эффективности ингаляций ультра-низких доз алкилирующего ци-тостатика Мелфалана у больных тяжелой бронхиальной астмой. Сб.научный трудов Московского государственного медико-стоматологического университета «Актуальные вопросы клинической медицины» М.2005- с. 134-135.

Ю.Зыков К.А., Рвачева A.B., Гришина Т.И. Исследование субпопуляционно-го состава лимфоцитов при лечении больных бронхиальной астмой ингаляциями ультра-низких доз алкилирующих цитостатиков. Сборник трудов 4 Конгресса РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», М.2001, Том II с.442

11 .А.В.Аверьянов, К.А.Зыков. Роль протеазно-антипротеазного дисбаланса в развитии эмфиземы легких. Респираторная медицина, №1,2007, с.29-35

12.3ыков К.А., В.И.Шевелев, А.В.Рвачева и др. новый метод лечения стеро-идзависимой бронхиальной астмы ингаляциями ультра-низких доз алкилирующего препарата Мелфалан. Астма, 2003, Том 4, №1, с.64.

1 З.Зыков К.А., Рвачева А. В., Босых Е.Г. Роль эозинофильного катионного протеина в оценке аллергических реакций немедленного типа. Сборник научных трудов XVII Национального конгресса по болезням органов дыхания, Казань, 2007 год.

14.Е.И.Соколов, К.А.Зыков, A.B. Рвачева и др. Оценка функционального состояния фагоцитов при лечении ультра-низкими дозами Алкерана. Russian Journal of Immunology, 1999, Vol.4, Suppl.l, p.120

15.Рвачева A.B. Зыков К.А. Влияние ингаляций ультра-низких доз алкилирующих цитостатиков на субпопуляционный состав лимфоцитов у больных бронхиальной астмой. / Сборник трудов XXIV Юбилейной Итоговой научной конференции молодых ученых, посвященной 80-летию МГМСУ, М. 2002, с. 18.

16.Лебедев С.Н., Зыков К.А., Рвачева A.B. Оценка безопасности и клинической эффективности ингаляций ультра-малых доз алкилирующих цитостатиков в лечении бронхиальной астмы. /Сборник трудов XXV Итоговой научной конференции молодых ученых МГМСУ, М. 2003, с.24.

17.Вахрушкина О.Е., Рвачева А.В., Дмитриева Е.А., Зыков К.А. Эффективность и безопасность иммуномодулятора Серамила в комплексной терапии обострений хронического бронхита.// Сб. трудов XXVII Итоговой конференции молодых ученых МГМСУ. - Москва, 2005. - с.78-80.

18.Матько Л.Ю., Гришина Т.И., Зыков К.А., Михайлова А.А. Иммуномоду-ляторы в комплексной терапии обострений хронического бронхита. Российский аллергологический журнал, 2006, №3, стр.63-68.

19.Рвачева А.В., Зыков К.А., Лебедев С.Н. Иммуномодулирующие свойства ингаляций ультра-низких доз алкилирующего цитостатика Мелфалана у больных бронхиальной астмой. /Сборник трудов XXV Итоговой научной конференции молодых ученых МГМСУ, Москва - 2003, с.25.

20.Рвачева А.В., Лебедев С.Н., Зыков К.А. Исследование фагоцитоза у больных бронхиальной астмой при лечении ингаляциями ультра-низких доз иммунодепрессивных препаратов. / Сборник трудов XXIV Юбилейной Итоговой научной конференции молодых ученых, посвященной 80-летию МГМСУ, Москва - 2002, с. 18.

21.Зыков К.А., Рвачева А.В. Отдаленные результаты лечения пациентов с бронхиальной астмой ингаляциями низких доз алклилирующего препарата Мелфалан. Сборник трудов XXIII Итоговой научной конференции молодых ученых МГМСУ, Москва - 2001, с.46.

22.Зыков К.А., Рвачева А.В. Механизмы иммунотропного действия ингаляций низких доз Мелфалана. Сборник трудов XXIII Итоговой научной конференции молодых ученых МГМСУ, Москва - 2001, с.57.

23.K.Zykov, S.Lebedev, A. Rvacheva et al. The inhalations of low-doses of cyclosporin A for bronchial asthma treatment. European Respiratory Journal, 2005, Vol. 26, Suppl.49, P428

24.K.Zykov, A.Pukhalsky, T. Grishina, A. Rvatcheva et al. Immunomodulating activity of inhalations of ultra-low doses of alkylating drug melphalan for severe bronchial asthma treatment. European Respiratory Journal, 2004, Vol.24, Suppl. 48, P3564.

25.K.Zykov, V.Shevelev, et al. Gaining the control over severe asthma with the inhalations of very low doses of alkylating drug European Respiratory Journal, 2002, Vol.25, Suppl.48, P448.

26.E.Sokolov, K.Zykov, A.Pukhalsky, et al. The inhalation of very low doses of alkylating drug as the treatment of severe asthma: five-year results. European Respiratory Journal, 2002, Vol. 25, Suppl.48, P449

27.K.A.Zykov, V.I.Shevelev, et al. New method of treatment of steroid-dependant asthma with inhalations of ultra-low doses of alkylating drug: clinical results. European Respiratory Journal, 2001, Vol. 21, Suppl.41, P424

28.A.E.Polivanova, K.A.Zykov, A.V.Averyanov et al. Neutrophil elastase in severe COPD and asthma exacerbation. European Respiratory Journal, 2006, Vol. 28, Suppl.50, P424

29.E.I. Sokolov, K.A. Zykov, et al. Inhalations of ultra-low doses of alkylating drug for the treatment of steroid-dependant asthma: anti-inflammatory effect of therapy. European Respiratory Journal, 2001, Vol. 21, Suppl.41, P1798

30.E.I.Sokolov, K.A.Zykov et al: Therapy of asthma with melphalan: paradoxical effect of alkylating drug inhalation. European Respiratory Journal, 1999, Vol. 14, Suppl.30, P2225

31.V.G.Tsyplenkova, K.A.Zykov, E.I.Sokolov. Therapy of steroid-dependent asthma with inhalation of very low doses of the melphalan: ultrastructural changes of bronchial epithelium. European Respiratory Journal, 2000, Vol. 16, Suppl.31, P620

32.E. I. Sokolov, A. L. Pukhalsky, G. V. Shmarina, K. A. Zykov Inflammatory signs in asthmatic patients treated with inhaled alkylating drug in ultra-low doses. European Respiratory Journal, 2000, Vol. 16, Suppl.31, P1975

33.K. A. Zykov, V. G. Tsyplenkova, A. L. Pukhalsky et al. New approach to treatment of steroid-dependent asthma: inhalation of very low doses of alkylating drug. European Respiratory Journal, 2000, Vol. 16, Suppl.31, P2460

34.A.PukhaIsky, K.Zykov Ultra-low doses of Melphalan in the treatment of patients with severe asthma: basis of new approach. 3-d Congress of Europea-nRegion International Union against Tuberculosis and Lung Diseases (IUATLD) Suppl. book, May, 2004. P.206

35.A.Pukhalsky, G.Shmarina, K.Zykov, et al. Disturbance of pro-inflammatory cytokine production in patients with cystic fibrosis lung disease. European Respiratory Journal, 2005, Vol. 26, Suppl.49, P2578

36.A.Pukhalsky, G.Shmarina, K.Zykov et al. Disturbance of pro-inflammatory cytokine production in patients with cystic fibrosis lung disease. September 2005, European Respiratory Journal, 2005, Vol.26, Suppl.49, p2578.

Подписано в печать 11.03.2009 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: (495) 785-00-38 www.autoref.webstolica.ru

Хронические обструктивные заболевания легких и, особенно, хронический бронхит и бронхиальная астма являются частой патологией. Около 10% взрослого населения нашей планеты страдают бронхиальной астмой (БА), которая занимает чрезвычайно важное место, как в структуре пульмонологической патологии, так и в современной клинике внутренних болезней. Эпидемиологические исследования показали увеличение количества пациентов с тяжелыми формами заболевания - около 3% от всех больных бронхиальной астмой [25,66].

В США количество больных бронхиальной астмой возросло с 6 миллионов в 1960 году до 15 миллионов к настоящему времени, что составляет около* 5% населения. Уровень смертности от бронхиальной астмы в США составляет 2 на 100 тысяч, прежде всего за счет возрастной группы от 5 до 34 лет [35, 102].

В Европе уровень заболеваемости астмой является одним из самых высоких в мире [306]. Среди общего количества детей 13,0% страдают бронхиальной астмой, среди взрослых аналогичная цифра составляет 8,4%, прирост заболевших астмой составляет ежегодно 2-4% [257]. Согласно данным страховых компаний, в Германии около 6% населения страдают бронхиальной астмой [270].

Объективная оценка эпидемиологической ситуации с бронхиальной астмой в России представляет определенные трудности. Несмотря на высокие показатели инвалидизации, продолжительности госпитализации и нетрудоспособности по данным Министерства здравоохранения, предоставленным для Всемирной организации здравоохранения, распространенность бронхиальной астмы в России не превышает 2-3 промилле (самые низкие показатели в мире) [7]. Это связано с тем, что, как правило, учитываются только пациенты с тяжелой формой заболевания. Однако, исследования, проведенные в последние годы, показали, что в России около 7 миллионов больных бронхиальной астмой, из них около 1 миллиона имеют тяжелые формы болезни [26,57]. По оценкам экспертов наша страна имеет наиболее высокие показатели по инвалидности, потере дней трудоспособности и продолжительности госпитализации [53,7]. Бронхиальная астма- сокращает среднюю продолжительность жизни мужчин на 6,6 лет и женщин - на 13,5 лет, является причиной инвалидности в 1,5% от общего числа инвалидов по всем причинам и 1,4% всех госпитализаций [27].

Астма является также и серьезной экономической проблемой. Так, в 90-х годах ежегодные расходы на госпитальный уход за* астматиками в США составили более 2 миллиардов долларов, а всего на противоастматические мероприятия было потрачено 6,21 миллиарда' долларов. Расходы на лечение пациентов с бронхиальной астмой в 1999 году в Германии составили 2 миллиарда евро [270]. Экономические потери от бронхиальной астмы в европейских странах в целом в 2003 году составили около 18 миллиардов евро (при этом прямые медицинские расходы - 7,9 миллиардов, и около — 10 миллиардов - косвенные экономические затраты) [115]. При этом важно отметить, что на пациентов с тяжелыми формами заболевания, составляющих 20% от всех больных, тратится более 80% средств [262].

Все вышеизложенные данные свидетельствуют о нерешенности проблемы лечения астмы на настоящий момент и об актуальности поиска новых методов лечения данного заболевания (особенно ее тяжелых форм).

Для решения задач попечению бронхиальной астмы необходимо четкое представление о ее патогенезе, однако, до настоящего времени он остается до конца не выясненным [282,141], поэтому на современном этапе очень важным является; получение научных данных, которые позволят сформулировать адекватную- патогенетическую теорию развития заболевания и на этой основе разработать целостную концепцию его лечения.

Изучению иммунологических особенностей бронхиальной астмы посвящено большое количество исследований, как в нашей стране, так и за рубежом. Сейчас не вызывает сомнения, что именно иммунная? система играет ключевую роль, как в развитии, так и в поддержании» данной-патологии [22,46,282].

Исследователи сходятся, во мнении, что в бронхиальном дереве больного астмой постоянно' происходят два параллельных процесса:-повреждение тканей из-за выброса медиаторов воспаления, а также процесс регенерации, из-за активации ростовых факторов [32,48^50,74]. Эти два постоянно протекающих процесса' приводят к ремоделирова-нию легких, т.е. изменению их архитектоники, с которым связывают хронизацию и утяжеление астмы [52,44,122].

Исход тяжелой астмы зависит от степени ремоделирования легких, степени1 обратимости этого процесса, а также характеристик воспалительного процесса, вызвавшего эти изменения [260,173,69,85].

В то же время отмечается крайняя> необходимость более углубленного изучения коррелятивных связей между функциональными параметрами легких, морфологическими изменениями дыхательных путей и иммунологическими! механизмами воспаления, лежащими? в основе этих изменений. При лечении противоастматическими препаратами данные по динамике этих показателей не являются систематизированными, а учитывая гетерогенность заболевания и выраженные различия между ее фенотипическими формами (нейтрофильная, эозино-фильная и т.д.), не представляется возможным формировать выводы о патогенезе астмы на основании усредненных величин, полученных в ходе различных исследований.

Следует подчеркнуть, что' необходимы комплексные исследования, объединяющие как функциональные, иммунологические, так и морфологические исследования материалов от одного пациента. Только такая комплексная оценка позволит выявить взаимозависимости между исследуемыми-параметрами и разработать доказательную» теорию патогенеза астмы.

В" лечении астмы в настоящее время ведущим направлением является-противовоспалительная терапия^ [117]. Лишь препараты этого направления' (главными представителями которых являются глюкокор-тикоиды) могут остановить развитие ремоделирования легких. Основными лекарственными базисными препаратами, применяемыми для-лечения бронхиальной астмы, глюкокортикостероиды, SR-формы теофилина, недокромил и кромоглигат натрия, антагонисты лейкотриено-вых рецепторов [282]. Но, несмотря на большой арсенал лекарственных препаратов, вопрос адекватной патогенетической терапии тяжелой бронхиальной астмы, остается не решенным [247,275].

С разработкой воспалительной теории бронхиальной астмы, приведшей к созданию новых групп противовоспалительных препаратов, у пульмонологов было связано много надежд, однако, как видно по статистическим данным по заболеваемости № смертности, появление новых лекарственных средств и схем лечения не привело к кардинальному улучшению ситуации. Некоторые авторы даже полагают, что терапия ингаляционными кортикостероидами является паллиативом [10] и не приведет к изменению негативных тенденций в развитии бронхиальной астмы. В России серьезной проблемой на настоящий момент также является высокий процент больных, находящихся- на лечении системными глюкокортикоидами, что произошло из-за бесконтрольного их назначения в прошлом [56].

В этих условиях для лечения^ стероидзависимой, стероидрези-стентной, «трудной» астмы, или заболевания с нейтрофильным фенотипом актуальной является проблема поиска препаратов, являющихся альтернативой глюкокортикоидами [61,215,295,189,99]. Разработаны теоретические обоснования для применения иммунодепрессивных препаратов у пациентов1 с тяжелой формой заболевания, однакоприме-нение данных- препаратов в практике лечения бронхиальной астмы ограничено из-за большого количества^побочных эффектов [111,121,124]. Для снижения зависимости пациента от приема оральных кортикосте-роидов применяется ряд препаратов, в частности, тролеандомицин, препараты солей золота, циклоспорин А (ЦсА), метотрексат и некоторые другие. Эти препараты применялись только у небольшого количества пациентов при попытке снижения системной кортикостероидной зависимости. Хотя существует ряд данных о том, что некоторые соединения, такие как Циклоспорин А, метотрексат, ауранофин и некоторые другие позволяют снизить поддерживающую дозу кортикостероидов [116,64,76,166,108,128,196,222], их применение при БА остается сомнительным из-за большой вариабельности эффектов, большого количества побочных реакций и ограниченного клинического опыта [282].

Учитывая, что использование ингаляционных лекарственных форм является наиболее физиологичным способом введения препарата при патологии легких, а также то, что доставка препарата непосредственно к месту действия позволяет точно определять концентрацию лекарства in situ и уменьшить общерезорбтивную дозу, работа в данном направлении является целесообразной и представляет большой интерес.

Ранее, на кафедре внутренних болезней №3 Московского государственного медико-стоматологического университета нами была разработана методика лечения бронхиальной астмы ингаляциями ультра-низких доз алкилирующего препарата Мелфалан (Мф) [43,45,113,112,164,165]. На основании полученных клинических и лабораторных данных авторы сделали заключение о противовоспалительном эффекте предлагаемой терапии, приводящей к регенеративным изменениям бронхиального эпителия и клиническому улучшению (при отсутствии побочных эффектов), а также о перспективности дальнейших исследований в этом направлении.

Таким образом, дальнейшее комплексное исследование клинико-иммунологических и морфологических изменений при лечении астмы иммунодепрессивными препаратами даст возможность более полно определить основные звенья патогенеза заболевания, улучшить имеющиеся и разработать на этой основе новые методы его лечения.

Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Изучить патогенетическую взаимосвязь клинических, иммунолоI гических и морфологических изменений бронхиального дерева на фоне терапии бронхиальной астмы ультра-низкими дозами иммунодепрессивных препаратов с различным механизмом действия (Мелфалан и

Циклоспорин А).

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Оценить клиническую эффективность и безопасность применения ингаляций ультра-низких доз иммунодепрессивных препаратов с различным механизмом действия у пациентов с бронхиальной астмой.

2. Исследовать динамику механики внешнего дыхания у больных Б А при лечении низкими дозами иммунодепрессивных препаратов (Мф и ЦсА).

3. Оценить динамику эндоскопической картины в бронхиальном дереве при применении ингаляций ультра-низких доз Мф.

4. Исследовать гисто- и ультраструктурные изменения эпителия бронхов больных БА при лечении иммунодепрессивными*препаратами,

5. Осуществить сравнительный анализ динамики показателей клеточного (лимфоцитарного и фагоцитарного) и гуморального иммунитета (иммуноглобулинов и цитокинового спектра крови и бронхо-альвеолярного смыва) при лечении Мф и ЦсА.

6. Провести корреляционный анализ изменений функциональных, иммунологических и морфологических параметров у пациентов исследуемых и контрольной групп.

7. Исследовать in vitro дозозависимость действия алкилирующего препарата Мф на биохимические параметры крови.

8. Разработать патогенетическое обоснование применения иммунодепрессивных препаратов для лечения бронхиальной астмы.

9. Разработать метод лечения бронхиальной астмы низкими дозами ЦсА и рекомендации по применению иммунодепрессивных препаратов в составе комплексной терапии больных бронхиальной астмы.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Ингаляции ультра-низких доз алкилирующего препарата Мф у пациентов с обострением БА не проявляют иммунодепрессивного эффекта, обладают противовоспалительным и иммуномодулирую-щим действием, что приводит к положительному клиническому эффекту, выражающемуся в снижении тяжести обострений, потребности в короткодействующих /32-агонистах, повышении толерантности к физической нагрузке; уменьшении эндоскопических признаков воспаления в бронхах; нормализации гисто-ультраструктуры эпителиального пласта.

2. Ингаляции ультра-низких доз ЦсА у пациентов с контролируемой БА не проявляют иммунодепрессивного эффекта, обладают противовоспалительным и иммуномодулирующим действием, что приводит к положительному клиническому эффекту.

3. Иммуномодулирующее действие ингаляций Мф и ЦсА опосредуется системой цитокинов ИЛ-5, ИЛ-8, ИФН-у.

4. Лабораторным маркером противовоспалительной активности ингаляций ультра-низких доз Мф и ЦсА является экспрессия маркеров активации лимфоцитов периферической крови (CD25 и CD95).

5. Экспериментальное исследование in vitro продемонстрировало, что действие алкилирующего препарата Мф на эритроциты крови является дозозависимым и в ультра-низких концентрациях приводит к снижению оксидативного стресса.

6. Выявленная взаимосвязь клинико-иммунологических и морфологических изменений при лечении БА ингаляциями ультра-низких доз иммунодепрессивных препаратов отражает ведущую роль иммунологических механизмов в развитии БА и возможность использования выявленных изменений в иммунной системе как мишеней для терапевтического воздействия.

7. Разработан новый метод лечения бронхиальной астмы ЦсА, отличающийся от прототипов ингаляционным способом введения препарата, ультра-низкими разовыми и курсовыми дозировками. Уточнены разовые и курсовые дозировки и периодичность курсов ингаляций ультра-низких доз Мф.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые выявлена патогенетическая взаимосвязь клинико-иммунологических и морфологических изменений при лечении бронхиальной астмы ингаляциями ультра-низких доз иммунодепрессивных препаратов с различным механизмом действия, определены основные мишени иммунотропного воздействия предлагаемых методик.

Впервые показана эффективность и установлена безопасность применения ингаляций ультра-низких доз ЦсА у пациентов с средне-тяжелой и тяжелой персистирующей бронхиальной астмой; выявлен иммуномодулирующий эффект у данной группы больных.

Впервые показана взаимосвязь изменений клинико-функциональных, иммунологических параметров и показателей морфологического состояния бронхиального эпителия при применении ингаляций ультра-низких доз Мф.

Впервые проведено сравнение иммунотропного действия ультранизких доз иммунодепрессивных препаратов с различным механизмом действия (Мф и ЦсА), показано отличие механизмов иммунотропного действия.

Впервые выявлена взаимосвязь динамики клинических и иммунологических показателей при применении ингаляций ультранизких доз Мф и ЦсА.

Впервые разработаны показания/противопоказания для' лечения ингаляциями ультра-низких доз Мф и ЦсА.

Впервые в эксперименте in vitro показано противоположное дозо-зависимое действие на биохимические параметры эритроцитов различных концентраций (ультра-низких-и < терапевтических) алкилирующих препаратов; показано уменьшение оксидативного стресса при применении ультра-низких концентраций алкилирующих препаратов.

На основании проведенного исследования разработаны новые методы лечения БА ингаляциями ультра-низких доз Мф и ЦсА и определен комплекс наиболее информативных лабораторных маркеров для мониторинга эффективности лечения.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 250 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с описанием материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 44 таблицы и 31 рисунок. Библиография включает 317 источников из них 68 — отечественные и-249- зарубежные.

Выводы:

1. Ингаляции ультра-низких доз Мелфалана для лечения обострений, а Циклоспорина А — для лечения стабильной персистирующей бронхиальной астмы средне-тяжелого и тяжелого течения являются безопасными и клинически эффективными методами лечения, приводящими к снижению частоты и тяжести обострений, потребности в короткодействующих /32-агонистах, повышению толерантности к физической нагрузке.

Т. Показатели механики внешнего дыхания у больных с обострением бронхиальной астмы при лечении ультра-низкими дозами Мелфалана улучшаются после проведенного курса ингаляций.

3. Противовоспалительное действие ингаляций ультра-низких доз *. Мелфалана при эндоскопическом исследовании выражается в достоверном снижении гиперемии, отека и вязкости секрета.

4. Противовоспалительное действие Мелфалана приводит к регенераторным изменениям эпителия, вплоть до восстановления-, его структурной целостности как пласта, выявленным при гис-то- и ультраструктурном исследовании, что отражает взаимосвязь иммунологических и морфологических изменений при лечении пациентов с бронхиальной астмой ингаляциями Мелфалана.

5. Ингаляции ультра-низких доз Мелфалана и Циклоспорина А не оказывают иммунодепрессивного действия на лимфоцитарное и фагоцитарное звенья иммунитета, демонстрируя иммуно-тропную активность.

6. В алгоритме лабораторной диагностики эффективности ингаляций ультра-низких доз Мелфалана и Циклоспорина-А наиболее информативным маркером служит снижение экспрессии CD25 и CD95 лимфоцитов периферической крови.

7. Иммуномодулирующие эффекты ингаляций ультра-низких доз Мелфалана и Циклоспорина-А опосредуются через цитокины — ИЛ-5, ИЛ-8, растворимый рецептор ИЛ-2, ИФН-у.

8. Выявлена взаимосвязь клинических и иммунологических показателей, доказывающая ключевой характер иммунотропного действия ультра-низких доз иммунодепресивных препаратов. При лечении Мелфаланом интенсивность кашля, тяжесть приступов,, нарушение толерантности к физической нагрузке, вязкость и гнойность бронхиального секрета ассоциированы с активностью- лимфоцитов и фагоцитов периферической крови. При лечении Циклоспорином А частота приступов ассоциирована с количеством цитотоксических лимфоцитов периферической крови и с активностью фагоцитов; кашель, частота использования р2-агонистов, частота и тяжесть приступов - с фагоцитарным числом, а нарушение толерантности к физической нагрузке - с количеством В-лимфоцитов крови.

9. Выявлена дозозависимость эффекта Мелфалана на биохимические параметры эритроцитов, при ультра-низких концентрациях препарата в среде приводящего к улучшению оксидантно-антиоксидантного статуса, а при обычных терапевтических концентрациях - к усилению оксидантного стресса.

Практические рекомендации:

1. Учитывая доказанную в ходе исследования безопасность и клиническую эффективность, пациентам с обострением умеренной персистирующей и тяжелой- персистирующей бронхиальной астмы рекомендовано проведение курса ингаляций ультра-низкими дозами алкилирующего препарата Мелфалан (0,1 мг) в течение 5 дней ежедневно.

2. Учитывая доказанную в ходе исследования безопасность „и клиническую' эффективность, пациентам со стабильным течением умеренной персистирующей и тяжелой персистирующей*бронхиальной астмы рекомендовано проведение курса* ингаляций ультра-низкими. дозами иммунодепрессивного препарата Циклоспорин А.

3. При определении пациентов, для лечения которых могут применяться разработанные методики, необходимо использовать выработанные показания/противопоказания.

4. При применений ингаляций ультра-низких доз Мелфалана и Циклоспорина А необходимо проведение комплекса предварительных исследований (компьютерная спирометрия по стандартной методике с проведением бронхолитической пробы с 400 мкг сальбутамола; рентгенологическое исследование легких, электрокардиографическое исследование; лабораторные анализы: общий анализ крови с оценкой лейкоцитарной формулы; общий анализ мочи; биохимический анализ крови (общий белок, мочевина, креатинин, АсАТ, АлАТ, билирубин, глюкоза, Среактивный белок) с повторением функциональных и лабораторных исследований после проведения курса ингаляций.

5. Больным умеренной персистирующей и тяжелой персистирую-щей бронхиальной астмой в комплекс обследования рекомендовано включение иммунологических методов обследования с проведением фенотипирования лимфоцитов периферической крови с определением маркеров активации, показателей фагоцитоза и уровней цитокинов в сыворотке крови и жидкости бронхиального смыва для оценки эффективности проводимого лечения.