Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Клинико-иммунологические и генетические особенности больных хроническим гепатитом С в отдаленном периоде

На правах рукописи

005536533

Кузнецов Сергей Дмитриевич

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С В ОТДАЛЕННОМ ПЕРИОДЕ

14.01.09 - инфекционные болезни 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

.31 ОКГ 2013

Москва-2013

005536533

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Роспотребнадзора.

Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Макашова Вера Васильевна

Доктор медицинских наук, профессор Шабалина Светлана Васильевна

Официальные оппоненты:

Кравченко Алексей Викторович - доктор медицинских наук, профессор

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник специализированной научно-исследовательской лаборатории эпидемиологии и профилактики СПИД

Калгожин Олег Витальевич - доктор медицинских наук, профессор

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. ИМ. Сеченова» МЗ РФ, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии

Ведущая организация: ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» МЗ РФ.

Защита диссертации состоится «22» ноября 2013 года в 12:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.114.01 в ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора (111123, Москва, ул. Новогиреевская, д. За).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан « ) { » октября 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Горелов Александр Васильевич

Актуальность проблемы

В настоящее время проявления эпидемического процесса гепатита С характеризуются снижением частоты острых форм, увеличением удельного веса хронических форм и коинфекции, изменением возрастного состава больных в сторону омоложения и, что самое главное, приростом показателей смертности населения от цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [Онищенко Г.Г., 2013; Negro F. et al., 2011].

Именно вирусный гепатит С является основной причиной формирования хронических заболеваний печени. Это вызвано тем, что вирус гепатита С (ВГС) — уникальный адаптоген, который способен ускользать от иммунного контроля, создавая новые антигенные варианты, задерживать формирование Т-клеточного ответа при остром гепатите С, что способствует переходу в 7085% в хронический форму, а также вызывать повторную реинфекцию у выздоровевших людей [Seef L.B. et al., 2003].

В последние годы изучение течения ВГС-инфекции привело к изменению терапевтической тактики. Длительность противовирусной терапии (ПВТ) в настоящее время определяется не только генотипом вируса, но и скоростью снижения вирусной нагрузки [Сюткин В.Е., 2009]. Как показано некоторыми исследователями, все это может быть обусловлено нарушением баланса системы иммунитета [Ebihara Т. et al., 2008; Irshad М. et al., 2008], то есть, следует отметить, что на эффективность терапии оказывают влияние не только «факторы вируса» — генотип ВГС и вирусная нагрузка, но и «факторы хозяина». Несомненно, что в формировании различных вариантов течения и исходов гепатита С важная роль принадлежит состоянию иммунной системы пациента [Ивашкин В.Т. и соавт., 2002; Нагоев Б.С. и соавт., 2009]. Среди многочисленных факторов хозяина значительную роль играют также генетические особенности больного. В настоящее время выявляют несколько групп человеческих генов (ИЛ-28А, ИЛ-28В, ИЛ-29), для которых показана взаимосвязь между их полиморфизмом и вариантами течения хронического гепатита С (ХГС) [Тихонова Н.Ю. и соавт., 2012]. Наибольшее значение придают полиморфизму в регионе, примыкающем к гену ИЛ-28В. Показано, что

полиморфизм ИЛ-28В определяет не только вероятность самопроизвольной элиминации вируса, но и ответ на ПВТ |ЧЗе Б. е1 а1., 2009].

Исследования системы иммунитета больных ХГС и полиморфизма генов фрагментарны и неоднозначны по результатам. Между тем, эти вопросы имеют большое теоретическое и практическое значение, т.к. позволяют глубже понять патогенез ХГС и его исходы, а значит, выработать прогностические критерии ответа на лечение, что диктует необходимость дальнейших исследований в этом направлении.

Цель работы - определить клинико-иммунологические и генетические особенности у больных хроническим гепатитом С в отдаленном периоде. Задачи исследования:

1. Выявить клинико-биохимические и вирусологические особенности при длительном естественном течении ХГС.

2. Определить показатели иммунного статуса больных ХГС при естественном течении.

3. Исследовать клинико-биохимические и вирусологические показатели у больных ХГС до противовирусной терапии и в отдаленном периоде в зависимости от вирусологического ответа на ПВТ.

4. Установить различия параметров иммунитета у больных ХГС в зависимости от ответа на лечение.

5. Оценить значение полиморфизма гена ИЛ-28В у больных ХГС.

6. Провести корреляционный анализ между клиническими, биохимическими и иммуногенетическими показателями у больных ХГС в отдаленном периоде при естественном течении и у леченых пациентов в зависимости от ответа на противовирусную терапию.

Научная новизна

Впервые проведена комплексная оценка клинико-биохимических и иммунологических показателей при длительном естественном течении ХГС, а также у леченых больных в отдаленном периоде в зависимости от ответа на ПВТ.

У больных ХГС после лечения в отдаленном периоде в зависимости от ответа на ПВТ выявлены различия показателей иммунного статуса,

связанные с возрастом, генотипом, длительностью инфицирования, активностью АДТ и выраженностью фибротических изменений в печени.

При длительном естественном течении и в отдаленном периоде у больных ХГС, получавших ПВТ, установлены корреляционные взаимосвязи между содержанием иммунокомпетентных клеток и возрастом, длительностью заболевания, уровнем АЛТ и стадией фиброза печени.

Подтверждено значение генетического полиморфизма ИЛ-28В в московской когорте больных хроническим гепатитом С для прогноза эффективности ПВТ.

Практическая значимость

Разработаны дополнительные иммуно-генетические критерии прогноза ответа на противовирусную терапию. Показана ценность определения длительности инфицирования по двум параметрам: срокам выявления специфических антител и времени вероятного заражения.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены и обсуждались на научно-практической конференции молодых ученых ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора «Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней» (Москва, 2009 год), II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным заболеваниям (Москва, 2010 год), научно-практической конференции НИИ Вирусологии и Ташкентского института усовершенствования врачей «Актуальные проблемы инфекционных заболеваний» (Ташкент, 2010 год).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них - 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад

Автор принимал непосредственное участие в сборе анамнеза и осмотре больных. Автором лично проведена оценка клинико-лабораторных, иммунологических, вирусологических показателей; подготовлен аналитический обзор зарубежных и отечественных источников, осуществлен отбор методов исследования и статистическая обработка полученных

результатов; проведен анализ и интерпретация данных, сформулированы выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, содержащий 58 отечественных и 117 зарубежных источников. Материалы проиллюстрированы 64 таблицами, 21 рисунком, 12 выписками из истории болезни.

Характеристика пациентов и методы исследования

В течение 2010-2012 годов в исследование было включено 153 больных хроническим вирусным гепатитом С. Пациенты были обследованы на базе клинического отдела инфекционной патологии ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (директор - академик РАМН, профессор Покровский В.И.), научно-консультативного клинико-диагностического центра (заведующий - к.м.н. Чуланов В.П.) и лаборатории иммунологии специализированной научно-исследовательской лаборатории эпидемиологии и профилактики СПИД (заведующий — академик РАМН, профессор Покровский В.В.) ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Все исследования проводились в строгом соответствии с требованиями биомедйцинской этики согласно Женевской конвенции о правах человека (1997 г.) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000 г.) на основании разрешения локального этического комитета. В связи с этим у всех пациентов было получено письменное добровольное информированное согласие на проведение обследования.

Критериями включения больных в исследование были: возраст более 18 лет, верифицированный диагноз хронического вирусного гепатита С в период заболевания более 1 года, отсутствие злоупотребления наркотическими веществами и алкоголем (согласно нормам принятым ВОЗ).

Из исследования исключались пациенты моложе 18 лет, имеющие сопутствующий вирусный гепатит В, Д или другие заболевания,

вызывающие поражение печени, ВИЧ-инфекцию, туберкулез легких в анамнезе, аутоиммунные, онкологические заболевания, заболевания соединительной ткани, злоупотребляющие наркотическими веществами и алкоголем, а также - беременные женщины.

Диагноз ХГС устанавливался на основании данных эпидемиологического анамнеза (указание на перенесенные операции и другие парентеральные вмешательства, переливания крови и ее компонентов, визиты к стоматологу, внутривенные инъекции наркотиков), клинико-анамнестических данных (наличие симптомов вирусного гепатита в течение 6 месяцев и более, гепатоспленомегалии, определяемой при объективном исследовании физикальными методами), результатов лабораторных исследований (характерные изменения биохимических показателей и обнаружение маркеров вируса гепатита С методом ИФА и ПЦР, фиброэластометрии печени).

Для строгой верификации диагноза и исключения вирусных гепатитов другой этиологии, а также ВИЧ-инфекции всем больным проводился анализ сыворотки крови на выявление НВзА£, анти-НВсоге ^М/^С, анти-ВГО ^М/ДО, анти-ВИЧ.

В исследование были включены 96 мужчин (62,7%) и 57 женщин (37,3%) в возрасте от 18 до 72 лет, средний возраст пациентов составил 38,9 ±0,8 лет. Пациенты возрастной группы 18-40 лет составляли более половины (65,4%) от общего количества больных, 41-60 лет - 30,7%, доля лиц, имевших возраст старше 60 лет, достигала 3,9%. Таким образом, преобладали лица молодого, трудоспособного возраста.

У 123 обследованных больных (80,4%) были выявлены сопутствующие заболевания, в структуре которых преобладали болезни желудочно-кишечного тракта (62,6%), отягощенный аллергологический анамнез (29,3%), заболевания мочеполовой системы (27,6%) и прочие (23,6%).

При генотипировании ВГС было обнаружено, что у 86 больных (56,2%) ХГС был выявлен 1 генотип вируса. Среди остальных 67 больных (43,8%) с «не 1» генотипом ВГС преобладал 3 генотип - у 60 пациентов (39,2%), у 7 пациентов (4,6%) был выявлен 2 генотип ВГС.

По результатам сбора эпидемиологического анамнеза, клинико-анамнестических и лабораторных данных определялся примерный срок с момента инфицирования ВГС. По данным эпидемиологического анамнеза в 5,1% случаях он был от 1 до 5 лет, у 30,4% - от 6 до 10 лет и у 64,5% больных — более 10 лет. Длительность инфицирования, определяемая по срокам выявления анти-ВГС, существенно отличалась: так, в 38,6% случаях она была от 1 до 5 лет, у 43,4% - от 6 до 10 лет и только у 18,0% больных - более 10 лет.

Больные были разделены на группы в зависимости от наличия курса противовирусной терапии и устойчивого вирусологического ответа (рис. 1). Из 153 наблюдавшихся 45 пациентов (29,4%) составили группу естественного течения (не получавшие ПВТ), 108 (70,6%) человек в анамнезе получали противовирусную терапию (препараты интерферона-альфа и рибавирина в стандартных дозировках), из которых устойчивого вирусологического ответа достигли — 58 (37,9%) чел., а 50 (32,7%) чел. не ответили на ПВТ.

г

хгс

естественного течения п=45

Ответившие на ПВТ =58

Леченые больные п=108

Не ответившие на ПВТ п=50

1 генотип п=36

«не 1» генотип п=14

Рис. 1. Дизайн исследования

Группу сравнения составили 30 здоровых доноров, не отличавшихся от больных по полу и возрасту, давших информированное согласие на обследование, и не имевших в анамнезе сведений, позволяющих причислить их к категории часто болеющих лиц, при отсутствии у них признаков инфекционно-воспалительных, аутоиммунных и иммунодефицитных состояний; при отсутствии по данным анамнеза и результатам серологических, биохимических и ПЦР исследований вирусных гепатитов другой этиологии, а также других заболеваний печени

Методы исследования, использованные в работе

Для решения поставленных в работе задач были использованы следующие методы исследования:

1. Общеклинические методы исследования включали следующие: осмотр пациента, сбор анамнеза, анализ показателей периферической крови, определение параметров биохимического анализ крови (определение общего белка и белковых фракций, общего и прямого билирубина, холестерина, железа сыворотки, AJIT, ACT, щелочной фосфатазы, гамма-ГТП).

2. Для выявления поражения внутренних органов и систем проводили инструментальные исследования: ультразвуковое исследование органов брюшной полости, фиброэластометрию печени на аппарате FibroScan FS-502 («Echosens», Франция) с определением стадии фиброза по шкале METAVIR.

3. Сыворотка крови была исследована на специфические маркеры вирусных гепатитов В, С, Д методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на спектрофотометре "Multiscan Rc" («Labsystems», Финляндия).

4. Показатели клеточного иммунитета (субпопуляционный состав лимфоцитов — общий состав Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), общее количество В-лимфоцитов (CD19+), ЕК-Т-клеток (CD3+CD56+), ЕК-клеток (CD16+) исследовались с помощью моноклональных антител фирмы «Beckman Coulter» в многоцветном анализе на проточном цитометре Epics XL. Состояние гуморального иммунитета оценивали по уровню сывороточных

иммуноглобулинов (А, М, G), концентрацию которых определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини.

5. Количественный анализ РНК ВГС в сыворотке крови определялся методом ПЦР с использованием тест-системы «АмплиСенс HCV-Монитор», генотипирование ВГС проводилось методом ПЦР с помощью коммерческой тест-системы «АмплиСенс HCV-генотип» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии).

6. Генотипирование полиморфных локусов (rsl2979860, rs8099917) гена ИЛ-28В осуществляли методом ПЦР в реальном времени, используя комплект реагентов для определения генетических полиморфизмов ИЛ-28В (НПО «ДНК-Технология», Россия).

7. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы IBM SPSS Statistics 21.0. Определялось процентное выражение ряда данных, средняя арифметическая, стандартная ошибка средней арифметической, среднеквадратическое отклонение. Для оценки статистической значимости различий между независимыми выборками использовался U-критерий Манна-Уитни и Т-критерий Стьюдента, между связанными выборками - W-критерий Вилкоксона. Для корреляционного анализа применялись методы Спирмена и Пирсона.

Результаты собственных исследований

При естественном течении ХГС чаще регистрировались лица молодого возраста - до 40 лет (68,9%). Преобладали пациенты с 1 генотипом - 62,8%. У большинства больных (75,6%) отмечались сопутствующие заболевания, из них преобладали болезни желудочно-кишечного тракта - в 41,2% случаев. Клиническая картина ХГС естественного течения характеризовалась небольшим количеством симптомов: слабость - в 15,6%, увеличение печени -в 31,1%, вторичные печеночные знаки - в 64,5%.

Активность основных печеночных ферментов при ХГС естественного течения регистрировалась достоверно выше показателей здоровых лиц. Уровень AJIT составил 71,45±11,01 МЕ/л против 20,6±1,54 МЕ/л в контрольной группе (р<0,003). Была проанализирована активность AJIT в зависимости от степени повышения: в пределах нормы, выше нормы (до 3-х норм) и выше 3-х норм. Уровень AJIT регистрировался в пределах

нормальных величин у 22 чел. (48,9%), до 3-х норм - у 16 (35,6%) и только у 7 чел. (15,5%) выше 3-х норм. Таким образом, большинство больных ХГС имели нормальный и умеренно повышенный уровни AJIT.

Длительность естественного течения ХГС составила в среднем 6,87±1,02 лет (колебалась в диапазоне от 1 года до 16 лет). Длительность заболевания хроническим гепатитом С достоверно отличалась в зависимости от сроков выявления анти-ВГС и возможного инфицирования согласно данным эпидемиологического анамнеза - на момент обнаружения антител сроки постановки диагноза запаздывали на 10 лет. В связи с этим, была отдельно проанализирована активность AJIT по длительности эпиданамнеза и срокам выявления анти-ВГС. Не выявлено достоверной разницы по уровню основных печеночных ферментов как от длительности заболевания по срокам выявления антител, так и по длительности гепатита по данным эпиданамнеза. Уровень ACT оставался одинаковым в различные периоды наблюдения. Максимальная активность AJIT, отражающая степень цитолиза гепатоцитов, как по ее выраженности, так и по удельному весу, приходилась на период от 5 до 10 лет заболевания. С увеличением длительности хронического процесса активность AJ1T уменьшалась, даже при отсутствии противовирусной терапии.

Был проведен анализ взаимосвязи вирусной нагрузки (ВН) и генотипа ВГС, а также ВН и активности АЛТ. Выявлено, что степень ВН у больных ХГС естественного течения была выше при 1 генотипе и высоком уровне АЛТ (выше трех норм). Из 8 больных ХГС с активностью АЛТ больше трех норм у 7 чел. (87,5%) была и высокая вирусная нагрузка (> 400 тыс. МЕ/мл). Кроме того, при низкой ВН количество больных с нормальной и умеренной активностью АЛТ было достоверно больше, чем пациентов с уровнем АЛТ больше трех норм - 16 чел. (94,1%) против 1 чел. (5,9%), р<0,001.

Результаты обследования 37 больных ХГС естественного течения (22 чел. с 1 генотипом, 15 - с «не 1») при помощи транзиентной фиброэластометрии показали, что у большинства пациентов (75,7%) фиброз печени регистрировался в стадии F0-F1, а стадия фиброза зависела от генотипа. Так, если больные ХГС с «не 1» генотипом со стадией фиброза от

РО до Р2 были все 15 человек, то со стадиями РЗ-Р4 регистрировались пациенты только с 1 генотипом - 5 чел. (22,7%), таким образом, продвинутая стадия фиброза регистрировалась только у данной категории больных (р<0,01). Кроме того, фиброз печени РЗ-Р4 отмечался лишь у больных с умеренно повышенной и высокой активностью АЛТ и не наблюдался у пациентов ХГС естественного течения с нормальным уровнем аланиновой трансамйназы.

Поражение печени в виде выраженного фиброза в стадиях РЗ-Р4 было взаимосвязано со сроками постановки диагноза - по данным эпиданамнеза или по срокам обнаружения антител к ВГС. В первом случае выраженный фиброз отсутствовал в течение 10 лет и, наоборот, он диагностировался уже в первые 5 лет с момента обнаружения антител.

Ретроспективный анализ клинико-лабораторных данных больных ХГС, получавших противовирусную терапию, показал, что в обеих группах как ответивших, так и не ответивших на лечение, преобладали пациенты мужского пола и молодого возраста - до 40 лет.

Сопутствующие заболевания регистрировались достоверно чаще у больных, не ответивших на ПВТ - у 45 человек из 50 (90%), в то время как у ответивших, таких пациентов было только 44 из 58 (75,9%), р<0,05.

Продолжительность диспансерного наблюдения после курса ПВТ варьировалась от 2 до 13 лет и составила 4,68±0,45 лет. Сроки инфицирования ВГС по данным эпиданамнеза оказались одинаковыми, как в группе ответивших, так и в группе не ответивших на лечение больных — 11,52±0,72 и 12,8±0,93 лет (р>0,05), соответственно.

До начала ПВТ удельный вес основных клинических симптомов был одинаков как в группе ответивших, так и не ответивших на лечение, кроме такого объективного симптома, отражающего тяжесть хронического гепатита С, как увеличение селезенки, который достоверно чаще встречался у больных, не ответивших на ПВТ - 30% против 13,8% (р<0,05). Основные биохимические показатели до начала ПВТ в обеих группах больных были выражены одинаково, как по удельному весу, так и по их уровню, т.е. группы были сопоставимы.

Ответ на ПВТ зависел от генотипа ВГС: чаще отвечали больные с «не 1» генотипом - 67,2% против 32,8% с 1 генотипом (р<0,001).

После проведенной терапии в отдаленном периоде основные клинические симптомы, такие как слабость, боли в области печени, нарушение стула, также, как и объективные симптомы - увеличение печени и селезенки, вторичные печеночные знаки - встречались достоверно чаще у больных ХГС, не ответивших на терапию. Удельный вес больных с нормальной активностью основных ферментов (AJIT, ACT, ГГТП) в отдаленном периоде был достоверно выше у больных, ответивших на лечение (р<0, 100%

80% -

60%

40%

20%

0%

Ответившие Не ответившие

Рис.2. Взаимосвязь между исходной активностью АЛТ и ответом на ПВТ Ретроспективный анализ исходного уровня АЛТ, степени вирусной нагрузки и ответа на ПВТ не выявил взаимосвязи между этими показателями в обеих группах больных. Показана достоверная разница удельного веса больных ХГС от начальной активности АЛТ как у ответивших, так и у не ответивших на терапию пациентов (рис.2). Так, если в группе ответивших удельный вес пациентов с умеренным уровнем АЛТ составил 35,3%, то в группе не ответивших - 62,8% (р<0,01). И, наоборот, больных с высокой активностью основного печеночного фермента было значимо больше в группе ответивших на лечение - 58,8% против 32,5% у не ответивших

.01).

Р <0,01

= Р<0,01

; 62,8 -

S>3N S >N-3N □ N

(р<0,01). Таким образом, достоверно чаще отвечали пациенты с исходно высоким уровнем АЛТ.

Ретроспективно была проанализирована исходная вирусная нагрузка у больных ХГС в зависимости от генотипа вируса и ответа на лечение. Выявлено, что ответ на ПВТ у больных ХГС с разными генотипами не был взаимосвязан с уровнем вирусной нагрузки. Однако, удельный вес пациентов с «не 1» генотипом, имевших высокую степень вирусной нагрузки, был достоверно выше по сравнению с низкой степенью, независимо от ответа на лечение.

Исходные данные фиброэластометрии показали, что среди больных ХГС с 1 генотипом, ответивших на ПВТ, не регистрировались пациенты со стадией фиброза РЗ-Р4, и, наоборот, при отсутствии ответа на лечение выраженный фиброз РЗ-Р4 имели 27,6% пациентов (р<0,001).

У больных ХГС с «не 1» генотипом не выявлено взаимосвязи стадии фиброза печени и ответа на ПВТ. Несмотря на наличие фиброза РЗ-Р4 до начала ПВТ, они отвечали на лечение, в отличие от пациентов с 1 генотипом, т.е. можно констатировать, что выраженность фиброза печени имеет прогностическое значение только у больных ХГС с 1 генотипом.

Анализ взаимосвязи активности АЛТ и стадии фиброза печени по данным фиброэластометрии до начала ПВТ показал, что в группе больных, ответивших на лечение, не регистрировались пациенты с фиброзом РЗ-Р4 при нормальном уровне этого фермента В группе не ответивших на ПВТ больных с таким фиброзом было 33,3%.

Таким образом, можно предположить, что при нормальной активности АЛТ и отсутствии выраженного фиброза РЗ-Р4 до начала ПВТ больные ХГС скорее всего ответят на лечение. Наоборот, при сочетании повышенного уровня АЛТ и «продвинутого» фиброза - успех терапии крайне сомнителен.

В отдаленном периоде выявлено, что у не ответивших на лечение больных с увеличением активности АЛТ возрастал удельный вес пациентов с фиброзом печени в стадии РЗ-Р4 до 50% при активности АЛТ выше трех норм.

Установлены прямые взаимосвязи между выраженностью фиброза печени и длительностью инфицирования.

Анализируя состояние иммунного статуса больных, выявлено, что при ХГС естественного течения содержание СОЗ, СВ4 и СБ 19 было достоверно выше параметров здоровых доноров, а СО 16+, наоборот, - ниже (рис. 3). Эти данные согласуются с результатами других исследователей [Павлова Л.Е., 2002; Понежева Ж.Б., 2011; N1 }., 2003] и не совпадают с данными Яковенко М.А. (2007), где до начала ПВТ были зарегистрированы низкие значения С04+.

(1)3+

] 68,91 63,37

р=0,038

СЭ4+

С016+

СО 19+

40,97 33,73

13,12 |

18,91 Г Р=о,ооз

12,62

10,3

р=0,025

р=0,003

о

20

40

60

м Больные ХГС й Здоровые

80

%

Рис.3. Показатели клеточного иммунитета у здоровых доноров и больных ХГС при естественном течении При изучении иммунного статуса здоровых доноров разных возрастных категорий выявлено, что количество СЭЗ+ и СЭ4+ как в абсолютном, так и процентном отношении, было значимо выше у старшего поколения. Соответственно, иммунорегуляторный индекс у них также был выше -2,25±0,26 против 1,56±0,13 (р<0,05) у молодых людей. У больных ХГС старше 40 лет также отмечалось достоверное увеличение ПРИ - 3,18±0,53 против 2,03±0,18 у молодых (р<0,01), но за счет достоверного уменьшения

С08+ как в процентном 16,0±1,69 против 22,56±1,39 (р<0,01), так и абсолютных значениях-233,0±44,16 против 390,18±36,05 (р<0,05).

Таким образом, если у здоровых с возрастом происходит изменение иммунного статуса за счет повышения Т-хелперной функции, то у больных ХГС — за счет уменьшения Т-клеток супрессоров, что свидетельствует о Т-супрессорном иммунодефиците.

Исследование иммунного статуса в зависимости от длительности заболевания по данным эпиданамнеза выявило достоверное уменьшение процентного содержания СБ8+ при длительности инфицирования ВГС больше 15 лет по сравнению с продолжительностью заболевании до 5 лет (р<0,01). Иммунорегуляторный индекс у них был выше по сравнению с показателями больных ХГС при длительности гепатита 6-10 лет (р<0,05). Полученные данные можно объяснить тем, что с увеличением заболевания больше 15 лет отмечается достоверное снижение СБ8+. Вместе с тем, к этому периоду возрастает процентное содержание СБ19+ - 16,0±1,6 против 1-1,63± 1,04 (р<0,05). При продолжительности ХГС до 5 лет снижается уровень ДО - 1299,67±99,47 против 1650,24±74,62 (р<0,05), что свидетельствует о формировании иммунного ответа по Т112-типу.

Анализ иммунологических показателей у больных ХГС в зависимости от активности АЛТ не выявил каких-либо значимых изменений по клеточным показателям, однако достоверно увеличивалось содержание 1§М при нормальном уровне ^О, что может свидетельствовать о задержке гуморального иммунного ответа у больных ХГС при повышенной активности АЛТ.

При анализе параметров иммунного статуса в зависимости от генотипа ВГС и степени вирусной нагрузки каких-либо значимых изменений не обнаружено.

Анализ взаимосвязи показателей иммунитета и стадии фиброза печени показал, что при фиброзе РЗ-Р4 отмечалось достоверное уменьшение как процентного, так и абсолютного количества С08+ по сравнению с его уровнем при фиброзе Р1-Р2 (р<0,05). За счет этого выявлено значимое

увеличение иммунорегуляторного индекса при фиброзе РЗ-Р4 по сравнению с фиброзом Р1-Р2 (р<0,05).

Кроме этого, у больных ХГС с фиброзом РЗ-Р4 стадии наблюдалось достоверное уменьшение абсолютного содержания СОЗ+ (р<0,05), а также значимое увеличение ^А (р<0,05) по сравнению с данными при фиброзе ЕО. Это согласуется с данными других исследователей [Никитин В.Ю. и соавт., 2009].

При оценке показателей иммунного статуса до и после курса противовирусной терапии в группе ответивших на ПВТ больных обнаружено достоверное повышение уровня СШ9+, а у не ответивших — 1§М в отдаленном периоде.

Анализ состояния иммунного статуса у ответивших пациентов в зависимости от возраста не выявил достоверных изменений. В группе не ответивших на ПВТ наблюдалась тенденция к уменьшению СБЗ+ в старшей возрастной группе (р=0,053) и повышению 1§М по сравнению с ответившими на терапию больными (р=0,065).

Анализ изменения параметров иммунного статуса у больных ХГС в зависимости от длительности инфицирования по данным эпидемиологического анамнеза показал, что у не ответивших больных не было значимой динамики уровня субпопуляций Т-лимфоцитов. Наоборот, у пациентов, ответивших на лечение, выявлено достоверное повышение СОЗ+, СЭ4+, СЭ8+, С016+, СБ56+ и 1цА при увеличении длительности заболевания. Это может свидетельствовать о включении компенсаторных механизмов в системе иммунного статуса при положительном ответе на противовирусную терапию.

Анализируя изменение иммунологических показателей в зависимости от длительности гепатита по данным выявления анти-ВГС, обнаружено, что у не ответивших на лечение больных наблюдалось достоверное уменьшение СОЗ+ и СБ16+ при длительности болезни более 15 лет, что говорит об усилении иммунодепрессивных механизмов. У ответивших пациентов регистрировалось только кратковременное снижение процентного

содержания CD4+ при наблюдении в течение 6-10 лет, а в дальнейшем каких-либо значимых изменений не было.

У ответивших на ПВТ больных гепатитом в отдаленном периоде не выявлено' взаимосвязи изменения показателей иммунного статуса с активностью AJ1T. Необходимо подчеркнуть, что в группе ответивших на лечение не регистрировались пациенты с высокой активностью AJIT. Наоборот, у не ответивших на терапию больных ХГС было обнаружено достоверное уменьшение как процентного, так и абсолютного содержания CD16+ при высокой активности АЛТ (больше трех норм) по сравнению с нормальными цифрами АЛТ. Это согласуется с данными других авторов [Ивашкин В.Т. и соавт., 2002; Li Y el al., 2004; Par G. et al., 2002].

Анализ состояния иммунологических параметров в зависимости от генотипа ВГС и ответа на ПВТ показал, что у ответивших на лечение больных значимых изменений между разными генотипами не выявлено. У не ответивших пациентов обнаружено достоверное увеличение относительного содержания CD19+ при 1 генотипе по сравнению с «не 1» генотипом. Кроме того, уровень IgA был достоверно выше у не ответивших на терапию больных ХГС с «не 1» генотипом, чем у ответивших пациентов с таким же генотипом.

При оценке иммунного статуса у не ответивших на ПВТ больных в зависимости от выраженности вирусной нагрузки не выявлено каких-либо достоверных изменений.

Анализ состояния иммунограммы в зависимости от выраженности фиброза печени у не ответивших на лечение больных ХГС (рис. 4) показал достоверное снижение CD4+ при фиброзе F3-F4 по сравнению с F1-F2 и F0 стадий, а уровень IgM был значимо выше при F0, чем при F1-F2.

У больных ХГС естественного течения выявлены сильные отрицательные корреляционные связи между CD4+ и CD16+ (г=-0,755, р=0,00000003), CD8+ и ИРИ (г=-0,741, р=0,00000006), средние положительные связи между возрастом и ИРИ (г=0,465, р=0,001), уровнем IgM и степенью фиброза (г=0,374, р=0,035), активностью АЛТ и IgM (г=0,369, р=0,019).

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

39,36

38,83

шш

ШШШШ

. V///////////////A

■¡¡¡И

29,88

■УЖМЖ,

ш '

р=0,033

р=0,018

ш

□ F0 0F1-F2 ШF3-F4

Рис.4. Уровень CD4+ в зависимости от стадии фиброза печени у не ответивших на ПВТ

У больных ХГС естественного течения выявлены сильные отрицательные корреляционные связи между CD4+ и CD16+ (г=-0,755, р=0,00000003), CD8+ и ИРИ (г=-0,741, р=0,00000006), средние положительные связи между возрастом и ИРИ (г=0,465, р=0,001), уровнем IgM и степенью фиброза (г=0,374, р=0,035), активностью AJIT и IgM (г=0,369, р=0,019).

В отдаленном периоде при устойчивом вирусологическом ответе установлены сильная отрицательная связь между CD8+ и ИРИ (г=-0,736, р=0,00000009), средние отрицательные связи между CD4+ и CD16+ (г=-0,439, р=0,001), CD4+ и IgA (г=-0,381, р=0,005), а также положительная связь между IgA и IgM (г=0,358, р=0,009).

У не ответивших на ПВТ - отрицательные связи: сильная между CD8+ и ИРИ (г=-0,738, р=0,00000001) и средние между генотипом и CD19+ (г=-0,305, р=0,039), активностью AJIT и CD16+ (г=-0,371, р=0,011), длительностью заболевания по срокам обнаружения анти-ВГС и уровнем CD56+ (г=-0,342, р=0,021).

Для решения вопроса о влиянии генетических факторов на эффективность противовирусной терапии в московской когорте больных ХГС было обследовано 70 пациентов, получавших ПВТ, которые были разделены на 2 группы: 1-я группа — ответившие на лечение - 37 человек, 2-я

группа - 33 больных - не ответившие на ПВТ. У них было проведено генотипирование полиморфных локусов гена ИЛ-28В с определением генотипов С/С, С/Т, Т/Т (ге 12979860) и 0/0,Т/0,Т/Т (ге8099917).

У больных, ответивших на ПВТ, достоверно чаще регистрировались «благоприятные» генотипы С/С (гз12979860) и Т/Т (г«8099917) (рис.5). Так число больных с генотипом С/С по гену ИЛ28В локуса ге 12979860 в группе ответивших было достоверно больше, чем в группе не ответивших на ПВТ: 56,8% против 24,2% соответственно (р<0,001). Наоборот, количество пациентов с генотипом С/Т регистрировалось значительно чаще у больных, не ответивших на ПВТ : 66,7% против 29,7% соответственно (р<0,001).

Ответившие на ПВТ (п=37)

Не ответившие на ПВТ (п=33)

¡■¡12979860

р<0.001

р<0,001

вас.

ш СЛЕЗ Т,Т

Ответивлше на ПВТ (п=37)

Не ответившие на ПВТ (п=33)

/■¡8099917

Рис.5. Частота обнаружения различных генотипов в локусах ге 12979860 и ге8099917 гена ИЛ-28В в зависимости от ответа на ПВТ

Аналогичные результаты получены и по гену ИЛ-28В локуса rs8099917. Так, чаще отвечали на лечение больные ХГС, имевшие генотип Т/Т -78,4±6,8% против 45,5±8,7% у не ответивших (р<0,001). Наоборот, не ответили на ПВТ пациенты с «неблагоприятным» T/G генотипом - 45,5±8,7% против 16,2±6,1% соответственно (р<0,001). Это согласуется с результатами других исследований [Тихонова Н.Ю. и соавт., 2012; Николаева Л.И. и соавт., 2012].

При анализе взаимосвязи генотипов в локусах гена ИЛ-28В, генотипа вируса и эффективности лечения, было обнаружено, что при ответе на ПВТ у больных ХГС с 1 генотипом чаще отмечался генотип Т/Т в локусе rs 12979860 гена ИЛ-28В - 36,4% против 3,9% при «не 1» генотипе (р<0,05). Если же пациенты не отвечали на лечение, то в большем проценте выявлялся генотип С/Т как при 1, так и «не 1» генотипе — 66,7%, что также подтверждают данные других авторов. Аналогичный анализ в локуса rs8099917 не выявил значимых различий.

Оценка иммунологических показателей в зависимости от ответа на ПВТ и генотипов локусов rs 12979860 и rs8099917 гена ИЛ-28В выявила достоверную разницу в относительных (р=0,002) и абсолютных (р=0,017) значениях B-лимфоцитов, которые были ниже у ответивших на ПВТ в группе с генотипом С/С, чем с «не-С/С» в локусе rs 12979860. Уровень IgM был достоверно выше у не ответивших на ПВТ пациентов с генотипом «не-С/С» в локусе rs 12979860, чем у ответивших с тем же генотипом (р=0,015).

Следовательно, благоприятными прогностическими факторами ответа на ПВТ можно считать: инфицирование «не 1» генотипом вируса, генотипы С/С (rs 12979860) и Т/Т (rs8099917) гена ИЛ-28В.

Выводы

1. При естественном течении ХГС выявлено преобладание пациентов молодого возраста (68,9%), нормальный уровень цитолитической активности (48,9%), F0-F1 стадии фиброза печени (76%), высокая степень вирусной нагрузки только при 1 генотипе (68%).

2. Иммунный статус больных ХГС естественного течения характеризовался достоверным повышением СБЗ+, СВ4+, С019+ и снижением СБ16+ по сравнению со здоровыми. Обнаружено значимое уменьшение количества СБ8+ и нарастание ИРИ у больных ХГС старше 40 лет. Установлена зависимость уровня СБ8+ от длительности заболевания. При инфицировании более 15 лет выявлено снижение содержания СБ8+ и увеличение СБ19+. При фиброзе РЗ-Е4 отмечено значимое уменьшение количества СБ8+, С019+ и повышение уровня ^А.

3. До начала ПВТ у ответивших пациентов достоверно чаще, чем у не ответивших, определялся «не 1» генотип ВГС (67% против 33%) и высокая активность АЛТ (59% против 32%).

4. У больных ХГС с устойчивым вирусологическим ответом при фиброзе Р0 с увеличением длительности инфицирования наблюдалось повышенное содержание СБЗ+, СБ4+, СЭ84, СБ16+ и ^А. При отсутствии ответа на ПВТ регистрировался наименьший уровень СЭ4+ только при фиброзе ¥4.

5. У больных ХГС естественного течения выявлены сильные отрицательные корреляционные связи между СБ4+ и С016+, СБ8+ и ИРИ, средние положительные связи между возрастом и ИРИ, активностью АЛТ и ^М, степенью фиброза и уровнем 1§М.

6. При устойчивом вирусологическом ответе в отдаленном периоде установлена сильная отрицательная корреляционная связь между СБ8+ и ИРИ. средние отрицательные связи между СЭ4+ и С016+, С04+ и ^А, а также положительная связь между ^А и 1§М.

7. У не ответивших на ПВТ больных выявлена сильная отрицательная корреляционная связь между СБ8+ и ИРИ и средние отрицательные связи - между генотипом и СБ19+, активностью АЛТ и СБ16+, длительностью заболевания и СБ56+.

8. У ответивших на ПВТ больных ХГС достоверно чаще регистрировался «благоприятный» генотип С/С (56,8% против 24,2%) в ге 12979860 и Т/Т (78,4% против 45,5%) в ге8099917 локусе гена ИЛ-28В. У не ответивших на ПВТ - преобладали генотипы С/Т (66,7% против 29,7%) и Т/О (45,5% против 16,2% у ответивших).

Практические рекомендации

У больных хроническим гепатитом С рекомендуется определять содержание CD19+, IgM и полиморфизм гена ИЛ-28В (локусы rs 12979860 и rs8099917) как дополнительные критерии прогноза эффективности противовирусной терапии.

Список печатных работ по теме диссертации

1. Макашова В.В. Клинико-иммунологическая характеристика больных хроническим гепатитом С в отдаленном периоде / Макашова В.В., Кузнецов С.Д., Сходова С.А., Шабалина C.B. // Актуальные вопросы гепатологии: мат. 8 международ, симпозиума гепатологов Беларуси. -Могилев, 1-2 октября 2009. - С.74-75.

2. Кузнецов С.Д., Макашова В.В., Сходова С.А. Шабалина C.B. Клинико-иммунологическая характеристика больных хроническим гепатитом С в отдаленном периоде / Кузнецов С.Д., Макашова В.В., Сходова С.А. Шабалина C.B. // Материалы 15-ой Российской конференции «Гепатология сегодня». - Москва, 15-17 марта 2010. - С. 38.

3. Николаева Л.И. Маркеры инфицирования вирусным гепатитом С у больных через несколько лет после окончания антивирусной терапии / Николаева Л.И., Макашова В.В., Петрова Е.В., Самохвалов Е.И., Альховский C.B., Кузнецов С.Д., Токмалаев А.К. // Материалы 15-ой Российской конференции «Гепатология сегодня». - Москва, 15-17 марта 2010.-С. 42.

4. Кузнецов С.Д. Иммунный ответ больных хроническим гепатитом С в отдаленном периоде / Кузнецов С.Д., Макашова В.В., Николаева Л.И., Шабалина C.B. // Материалы II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным заболеваниям. - Москва, 29-31 марта 2010. - С. 162.

5. Макашова В.В. Хронический гепатит С, отдаленные исходы и иммунная система / Макашова В.В., Кузнецов С.Д., Шабалина C.B., Флоряну А.И. // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных заболеваний». - Ташкент, 21-22 октября 2010. — С. 91.

6. Кузнецов С.Д. Противовирусная терапия хронического вирусного гепатита С / Кузнецов С.Д., Макашова В.В., Шабалина C.B. // Инфекционные болезни. - Москва, 2010. - Т. 8, № 2. - С. 50-54.

7. Кузнецов С.Д. Иммунный ответ больных хроническим гепатитом С в отдаленном периоде / Кузнецов С.Д., Макашова В.В., Шабалина C.B.,

Флоряну А.И. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. — Хабаровск, 2010. - №17. - С. 64-70.

8. Кузнецов С.Д. Система иммунитета после противовирусной терапии у больных хроническим гепатитом С в отдаленном периоде / Кузнецов С.Д., Макашова В.В., Шабалина C.B., Флоряну А.И. // Материалы 16-ой Российской гастроэнтерологической недели. - Москва, 11-13 октября 2010.-С. 217.

9. Кузнецов С.Д. Специфический гуморальный иммунитет при хроническом гепатите С / Кузнецов С.Д., Макашова В.В., Николаева Л.И., Шабалина C.B., Флоряну А.И. // Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным заболеваниям. - Москва, 28-30 марта 2011.-С. 196.

10. Кузнецов С.Д. Особенности иммунного ответа больных хроническим гепатитом С / Кузнецов С.Д., Макашова В.В., Шабалина C.B. // Инфекционные болезни. — Москва, 2011. — Т. 9, № 3. - С. 68-72.

11. Кузнецов С.Д. Динамика иммунологических показателей у больных ХГС до лечения и в отдаленном периоде / Кузнецов С.Д., Макашова В.В., Флоряну А.И., Шабалина C.B. // Материалы IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным заболеваниям. - Москва, 26-28 марта 2012.-С. 207.

12. Кузнецов С.Д. Клинико-лабораторная характеристика естественного течения хронического гепатита С / Кузнецов С.Д., Макашова В.В., Шабалина C.B., Билалова А.Р., Флоряну А.И. // Материалы V Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным заболеваниям. - Москва, 25-27 марта 2013. - С. 223.

Подписано в печать 20.10.2013 Формат 60x90/16, объем 1,0 п.л. Тираж 100 экз. ООО «КопиПринт» 105064, г. Москва, ул. Земляной Вал, д. 24/32.