Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Клинико-иммунологическая характеристика больных с различными стадиями фиброза печени вирусного генеза

005047746

На правах рукописи

СР^

ШИПУНОВ МАКСИМ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Клинико-иммунологическая характеристика больных с различными стадиями фиброза печени вирусного генеза

14.03.09 - «клиническая иммунология, аллергология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 О ДЕК 2012

Новосибирск 2012

005047746

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Останин Александр Анатольевич

Официальные оппоненты:

Колесникова Ольга Петровна, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, руководитель лаборатории экспериментальной иммунотерапии научного отдела ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН

Прокофьев Виктор Федорович, кандидат медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммуногенетики

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучию человека

Защита состоится «_»_ 2012 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.001.01 в ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Белогородцев С.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вирусные гепатиты занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии человека и являются одной из наиболее серьезных медикосоциальных проблем. Во многом это обусловлено не только широкой распространенностью данной патологии, но также латентностью течения, высокой частотой (до 75-80%) хронизации инфекции и повышенным риском развития различных осложнений, как правило, связанных с прогрессией фиброза печени.

Процесс фиброгенеза при вирусных гепатитах является ответной реакцией организма на повреждение печени, которая инициируется и поддерживается хроническим воспалением [Белобородова Е.В., 2010]. Наибольшую роль в развитии фиброза отводят локальным механизмам, в частности, звездчатым клеткам, способным при активации трансформироваться в пролиферирующие миофибробласты и продуцировать коллаген, а также тканевые ингибиторы металлопротеиназ - ферментов деградации коллагена [Schwabe R.F., 2003]. Ранее традиционным было представление о необратимости фиброза, однако в настоящее время доказана возможность его регресса, особенно, на начальных стадиях, но не на стадии морфологического цирроза, когда происходят глубокие изменения архитектоники печени. В связи с огромной ролью фиброза в патогенезе хронических вирусных гепатитов, особое значение приобретает мониторинг фиброзных изменений, который может позволить своевременно назначить адекватную терапию, и предупредить трансформацию фиброза печени в цирроз.

В настоящее время пункционная биопсия печени (ИБП) с последующим морфологическим исследованием биоптата считается «золотым стандартом» определения степени тяжести фиброза [Strader D.B., 2004]. К сожалению, данный метод имеет ряд существенных ограничений и недостатков [Bravo A.A., 2001]. Поэтому актуальным является поиск и разработка методов неинвазивной диагностики степени тяжести фиброза печени, которые отвечали бы определенным требованиям. Во-первых, были безопасны для больного и имели минимальное число противопоказаний и ограничений. Во-вторых, базировались на относительно простых тестах и были широкодоступны для лечебно-диагностических учреждений различного уровня. В-третьих, обладали бы достаточно высокой диагностической точностью (не ниже 80%) и информативностью в диагностике, как-определенных морфогистологических стадий фиброза, так и возможных переходных состояний. И наконец, в-четвертых, имели бы объективное выражение, например, в виде числовых индексов с установленными пороговыми значениями, что позволило бы исключить элемент субъективной оценки врача в интерпретации полученных результатов.

Исходя из вышесказанного, была сформулирована цель исследования:

Изучить клинико-лабораторные показатели и параметры иммунитета у больных хроническими вирусными гепатитами в зависимости от стадии фиброгенеза и на этой основе разработать диагностическую модель оценки тяжести фиброза печени.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ клинических и биохимических показателей, а также параметров иммунного статуса у больных хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) с различными морфогистологическими вариантами фиброза печени.

2. Оценить сывороточный уровень матричной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 у больных ХВГ в зависимости от степени тяжести фиброза печени.

3. Изучить ассоциированность клинико-иммунологических параметров с выраженностью фиброза печени и определить кандидатные маркеры для создания прогностической модели неинвазивной диагностики стадии фиброза у больных ХВГ.

4. На основе множественного, регрессионного анализа создать прогностическую модель неинвазивной диагностики фиброза печени и оценить ее информативность.

5. Изучить возможность использования разработанной модели для оценки выраженности фиброза у больных ХВГ в динамике проводимой комплексной терапии, а также у больных с диффузными заболеваниями печени невирусной этиологии.

Научная новизна. Получены новые данные, характеризующие особенности функционирования иммунной системы больных ХВГ с различной выраженностью фиброза печени. Установлено, что прогрессия фиброза (Fl/2—>F3—>F4) сопряжена с преимущественной активацией гуморального звена иммунитета, что проявляется увеличением в крови относительного содержания CD19+B-k;ictok и сывороточного уровня IgM, IgA, IgG и ЦИК, на фоне снижения абсолютного количества CD3+, CD4+ и С08+Т-лимфоцитов, а также нарушения функциональной (бактерицидной) активности моноцитов/нейтрофилов.

Впервые показано, что по сравнению со здоровыми донорами в сыворотке крови больных ХВГ с начальными F1/2 стадиями фиброза регистрируется достоверное увеличение концентрации метаплопротеиназ (ММП-9) и их тканевых ингибиторов (ТИМП-1), однако продукция этих медиаторов в целом остается сбалансированной, поскольку не сопровождается нарушением индекса соотношения ТИМП-1/ММП-9. Прогрессия фиброза (Fl/2—»F3—»F4) сопровождается снижением уровня ММП-9 в сочетании с достоверным увеличением концентрации ТИМП-1, что приводит к 2,6-4,0-кратному увеличению индекса соотношения ТИМП-1/ММП-9.

Впервые определена широкая панель биомаркеров фиброгенеза, включающая относительно простые, «рутинные» клинико-биохимические (СОЭ, тромбоциты, ПТИ, альбумин, тимоловая проба, прямой билирубин, ACT, ЛДГ, щелочная фосфотаза) и иммунологические (IgM, IgA, IgG, ПАН, ПАМ, СВ8+Т-клетки) показатели, а также редко используемые в клинической практике специфические тесты (сывороточный уровень и соотношение ТИМП-1/ММП-9).

Научно-практическая значимость. Разработан новый способ («ноу-хау») неинвазивной диагностики фиброза печени у больных ХВГ, который позволяет с помощью уравнения множественной регрессии с использованием 5 биохимических тестов (ПТИ, глюкоза, альбумин, ACT, ЛДГ) рассчитать интегральный индекс фиброза печени (ИИФП-биох). Ретроспективные, а также проведенные проспективные, лонгитудинальные клинические исследования показали, что значения ИИФП-биох в установленных интервалах позволяют определять соответствующую стадию фиброза (Fl/2 vi F3 vi F4) с диагностической точностью 86-87%, которая превышает точность эластометрии (69%) -общепринятого метода неинвазивной (инструментальной) оценки степени тяжести фиброза печени. Показано, что разработанная диагностическая модель может эффективно использоваться в мониторинге характера течения (стабилизация, прогрессия/регрессия) фибротического процесса у больных ХВГ на фоне проводимой комплексной терапии.

В случаях ошибочной и/или сомнительной диагностики с помощью ИИФП-биох, предложено использовать уравнение множественной регрессии «второго уровня», которое

позволяет на основании 4 иммунологических тестов (ПАН, ПАМ, CD8+T - и CDlTB-клетки) рассчитать дополнительный интегральный индекс (ИИФП-имм). Применение ИИФП-имм в комбинации с ИИФП-биох позволяет сократить количество диагностических ошибок с 13% до 2,3%.

Внедрение полученных результатов. Результаты исследования внедрены в практику работы иммунологического отделения клиники иммунопатологии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный способ неинвазивной диагностики с помощью интегрального индекса фиброза печени (ИИФП-биох), который рассчитывается по 5 биохимическим тестам (ПТИ, глюкоза, альбумин, ACT, ЛДГ), позволяет прогнозировать степень тяжести фиброза печени у больных ХВГ с диагностической точностью 86-87%

2. Использование в комбинации с ИИФП-биох дополнительного индекса (ИИФП-имм), который рассчитывается по 4 иммунологическим тестам (ПАН, ПАМ, CD8T - и С019+В-клетки) позволяет сократить количество диагностических ошибок с 13% до 2,3%.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийских научно-практической конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008; Иркутск, 2012), межлабораторных семинарах ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 132 страницах машинописного текста, включающего 32 таблицы и 9 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 194 литературных источника, в том числе, 154 иностранных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также разработано 1 «ноу-хау» НИИКИ СО РАМН.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.м.н., проф. A.A. Останину за поддержку и помощь, оказанную при работе над диссертацией; к.м.н. Гельфгату Е.Л., сотрудникам лаборатории клеточной иммунотерапии (зав. лабораторией - член-корр. РАМН, проф. Е.Р. Черных) и лаборатории клинической иммунопатологии (зав. лабораторией - д.м.н., проф. B.C. Кожевников) за практическую помощь в проведении экспериментальной части исследования; сотрудникам иммунологического отделения клиники иммунопатологии (зав. отделением - к.м.н., засл. врач РФ Н.М. Старостина) за помощь в проведении клинической части исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. 1) 68 здоровых доноров крови; 2) 257 больных хроническим вирусным гепатитом (С, В, С+В, C+B+D) с различной степенью тяжести фиброза печени 3) 40 больных с хроническими диффузными заболеваниями печени невирусной этиологии (аутоиммунный, криптогенный, биллиарный, токсический гепатит/цирроз).

Исследование проводили на базе клиники иммунопатологии ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН. Все лабораторные исследования проводили при поступлении больных в стационар, т.е. до выполнения пункционной биопсии печени и начала терапии. Общий анализ

периферической крови осуществляли на гемоанализаторе «HEMA-Screen 13» (Швейцария-Италия). Для разных целей из венозной гепаринизированной крови выделяли стандартными методами лейковзвесь и мононуклеарные клетки (МНК).

Определение субпопуляций клеток. Содержание различных субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+T - и CD 19*В-лимфоцитов), а также относительное количество моноцитов, экспрессирующих HLA-DR антигены, определяли на цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) с помощью программы CellQuest (Becton Dickinson, USA) методом проточной цитофлюориметрии, используя соответствующие FITC-меченные моноклональные антитела («Сорбент» и «МедБиоСпектр», Москва, Россия). Процент позитивных клеток, экспрессирующих соответствующие CD-маркеры, рассчитывали среди IО ООО клеток в лимфоцитарном регионе.

Оценка функциональной активности нейтрофилов/моноцитов. Функциональную активность фагоцитарных клеток оценивали по показателю активации нейтрофилов (ПАН) и моноцитов (ПАМ), определяемому по продукции перекиси водорода клетками после стимуляции зимозаном. Результат оценивался на многоканальном спектрофотометре (Multiskan MS, Labsystems, Финляндия) по интенсивности окрашивания пробы, которое происходило за счет окисления ортофенилдиамина в процессе катаболизма перекиси водорода.

Оценка уровня иммуноглобулинов. Уровень иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA в сыворотке крови определяли на многоканальном спектрофотометре с использованием соответствующих наборов реагентов («НПО СИНТЭКО», Россия) согласно инструкции фирмы-производителя.

Оценка уровня ММП-9 и ТИМП-1. В сыворотке крови 94 больных ХВГ и 18 здоровых доноров крови определяли концентрацию матричной металлопротеиназы-9 (ММП-9, нг/мл) и тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 (ТИМП-1, нг/мл) с использованием коммерческих иммуноферментных тест-систем human ММП-9 (total) (Quntikine®, R&D Systems) и human ТИМП-1 (Biosource), соответственно (пороговая чувствительность тест-систем составляла менее 1 нг/мл).

Биохимические исследования включали определение 30 показателей, в том числе уровень глюкозы натощак (мМоль/л), протромбиновый индекс (ПТИ, %), альбумин (г/л), тимоловая проба (Ед), общий и прямой билирубин (мкМоль/л), аланинамино-трансаминаза (AJ1T, мМоль/ч*л), аспартатамино-трансаминаза (ACT, мМоль/ч*л), лактатдегидрогеназа (ЛДГ, Ед/л), щелочная фосфотаза (ЩФ, Ед/л), гамма-глютамилтранспептидаза (ГГТП, Ед/л), холестерин (мМоль/л) и др.

Исследование маркеров вирусных гепатитов. Диагноз ХВГ подтверждался определением маркеров инфицирования методом иммуноферментного анализа (HbsAg, AT HBsAg, AT HBcore Ag, AT HBcore IgM, HbeAg, AT HbeAg IgG, AT HDV, AT HCV, AT HCcore IgM) и/или полимеразной цепной реакции (ДНК HBV и РНК HCV в сыворотке крови).

Морфогистологические исследования биоптатов печени. Образцы печеночной ткани для морфологического исследования получали в результате чрезкожной пункционной аппаратной биопсии печени под УЗИ-навигацией. Выраженность фиброза оценивали по шкале МЕТА VIR [Bedossa P., 1996].

Оценка эластичности печени. В отдельной подгруппе больных ХВГ (п=13) была проведена оценка эластичности печеночной ткани с помощью аппарата «Фиброскан» (Echosens, Франция).

Математическая обработка полученных данных проводилась методами описательной статистики на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows. Для оценки диагностической точности разрабатываемой математической модели, позволяющей оценивать степень тяжести фиброза печени, использовали также анализ операционных характеристик (ROC-аналга). [Пстрн Л., 2009].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе проводился ретроспективный анализ клинико-лабораторных и иммунологических параметров 174 больных ХВГ и 68 доноров из, так называемого, «обучающего» массива. Задачей этого этапа была характеристика фиброза печени на разных стадиях и поиск лабораторных предикторов, связанных с его профессией. Всем больным ХВГ была выполнена пункционная биопсия печени. По результатам гистологического исследования биоптатов F1 стадия была выявлена у 32 больных (18,39%), F2 стадия - у 41 (23,56%), F3 и F4 стадии - у 51 (29,31%) и 50 (28,74%) больных ХВГ, соответственно. В результате было выделено три подгруппы пациентов: с начальным (F1/2, п=73) и распространенным (F3, п=51) фиброзом, а также с морфологически документированным циррозом печени (F4, п=50). Больные с F1 и F2 стадией были объединены в одну группу, поскольку у них фиброз печени не сопровождается нарушением архитектоники органа и является потенциально обратимым. Здоровые доноры крови были условно приняты нами в качестве группы F0, т.е. без морфологических признаков фиброза печени.

Таблица 1. Сравнительная характеристика больных ХВГ с фиброзом печени

Подгруппы больных ХВГ / стадия фиброза

F1/2 (п=73) F3 (п=51) F4 (п=50)

Пол (м/ж) 55/18 36/15 34/16

Возраст (лет) 33(18-57) 39 (20 - 72) 47(18-68)

ИМТ 23,7(16,650-33,2) 25,13 (17,3-36,0) 28,9(16,5-48,3)

ХВГ/ ХВГ+ ЦП 73/0 33/18 7/43

Маркеры гепатита

С 59 (80,8 %) 35 (68,6 %) 31 (62,0%)

В 6 (8,2 %) 12(23,5%) 12(24,0%)

Смешанные формы 8(11,0%) 4 (7,8 %) 7(14,0%)

Фаза ХВГ

репликации 61 (83,6%) 30 (58,8%) 30 (60%)

интеграции 12 (16,4%) 21 (41,2%) 20 (40%)

Класс ЦП

по СЫШ-Ри^

А — 6/18 (33,3 %) 9/43 (20,9 %)

В — 12/18(66,7%) 20/43 (46,5 %)

С — — 14/43 (32,6 %)

Примечание. Данные представлены в виде Median (min-max) и частоты встречаемости признака. ИМТ- индекс массы тела, рассчитанный по формуле: весСкгУрост^м)2.

Общая характеристика больных в сформированных группах представлена в таблице 1. Видно, что утяжеление фиброза ассоциируется с увеличением возраста и индекса массы тела больных (соответственно, ^=0,44 и 0,32; р<0,001).

Таблица 2. Лабораторные параметры в подгруппах больных ХВГ с различной выраженностью фиброза печени

Параметры Доноры (Р0, п=38) Больные (П/2,п=73) Больные (РЗ, п=51) Больные (Р4, п=50) Р

Гемоглобин (г/л) 140 (128-150) 149 (137-162) 138 (125-149) 126* (113-139) -0,48 0,000001

Эритроциты (* 10 /л) 4,54 (4,2-4,9) 4,77 (436-532) 4,45 (3,96-4,78) 3,83* (3,42-439) -0,47 0,000001

Лейкоциты (»10%) 5,25 (4,5-6,4) 6,15* (53-7,1) 53 (3,5—6,8) 4,5 (ЗД-6,7) -0,27 0,002

Тромбоциты (*109/л) 220 (185 - 263) 275 (235 - 332) 153* (121-222) 127* (77-175) -0,61 0,000001

Лимфоциты (*109/л) 1,74 (1,47-2,16) 2,14 (1,75 - 238) 1,76 (1,11-231) 139* (0,92-1,97) -0,36 0,00003

СОЭ (мм/ч) до 10 8 (5-Ю) 13 (7-25) 24 (13-35) 0,50 0,000001

АЛТ (мМоль/ч*л) 0,34 (0,24-0,45) 1,2* (0,6-2,58) 1,55* (0,98-2,24) 1,72* (1,1-2,78) 0,16 0,08

АСТ (мМоль/ч*л) 0,32 (0,25 - 0,4) 0,57* (0,37 - 0,9) 0,86* (0,63-1,0) 1,37* (0,9-1,84) 0,47 0,000001

ЛДГ (Ед/л) 300 (268-357) 332* (292 - 394) 347* (317-421) 419* (339 - 526) 0,32 0,0002

Тимол, проба (Ед) 2,05 (0,94-3,1) 3,6* (1,8-5,3) 5,2* (2,4-7,4) 8,7* (5,5-13,4) 0,52 0,000001

Общ.бил (мкМоль/л) 9,0 (6,5-11,7) 14,6* (10,5-19,7) 15,5* (11,5-23,4) 38,0* (14,8-62,5) 0,39 0,000005

Прям.бил (мкМоль/л) 2,6 (1,2-3,2) 2,7 (1,8-3,8) 3,6 (2,1-7,3) 16,7* (6,4 - 36,8) 0,63 0,000001

ЩФ (Ед/л) 60,8 (48,0-76,4) 69 (59-81) 76* (59- 115) 107* (78 - 165) 0,40 0,000004

ГГТП (Ед/л) 16,7 (12,4-21,9) 24,3* (14,3^18,9) 45,6* (20,8-80,7) 43,6* (33,5-112) 0,28 0,001

Холестерин (мМоль/л) 4,5 (4,1-4,8) 4,6 (3,7-5,7) 4,1 (3,1-4,8) 3,7* (2,8-4,6) -0,27 0,002

ПТИ (%) 95 (92- 102) 97 (92 - 99) 91* (83 - 97) 79* (70 - 86) -0,65 0,000001

Альбумин (г/л) 45,5 (43,4-46,8) 44,7 (42,4^17,0) 40,3* (37,1-43,8) 32,8* (29,5-38,6) -0,69 0,000001

Глюкоза (мМоль/л) 4,4 (4,0-4,6) 4,1 (3,8-4,4) 4,3 (3,9 - 4,7) 4,5 (4-5,4) 0,28 0,001

Примечание: здесь и в табл. 3 данные представлены в виде медианных значений и интервартильного диапазона (1_С}-и(3); * достоверность различий между показателями у больных ХВГ и здоровых доноров (р<0,05, и критерий Вилкоксона-Мана-Уитни); г5 - коэффициент корреляции Спирмана исследуемых параметров со стадией фиброза; р - достоверность корреляционных взаимосвязей.

Сравнительная оценка «рутинных» параметров общего и биохимического анализа крови в сформированных подгруппах больных показала, что прогрессия фиброза четко ассоциируется с изменением (снижением и/или увеличением) целого комплекса показателей (табл. 2). Многие из этих маркеров характеризуют развитие известных, лабораторных синдромов фиброзного поражения печени [ВагаПег Я., 2005]. Так, анемия и панцитопения (тромбо-, лейко- и лимфопения) являются маркерами синдрома гиперспленизма. Помимо нарастающей панцитопении, утяжеление стадии фиброза печени четко коррелировало с развитием цитолитического синдрома (увеличение уровня АСТ [гв= 0,47], АЛТ и ЛДГ [Г5= 0,32]), а также с синдромом печеночно-клеточной недостаточности, который наиболее ярко проявлялся снижением уровня альбумина (г5= - 0,69), ПТИ (г^ - 0,65) и холестерина (г3= - 0,27). Прогрессия фиброза коррелировала также с нарастанием уровня общего (г8 = 0,39) и прямого (г5= 0,63) билирубина, ГТТП (гэ= 0,28), щелочной фосфатазы (г5= 0,40).

Была выявлена также статистически значимая прямая взаимосвязь тяжести фиброза с уровнем глюкозы (^ 0,28, р<0,01), что свидетельствует об участии печени в углеводном обмене.

Наличие хронической вирусной инфекции, а также лимфопении на продвинутых стадиях фиброза, может свидетельствовать о вовлеченности системы иммунитета у пациентов ХВГ в процесс фиброгенеза.

Таблица 3. Иммунный статус больных ХВГ с различной выраженностью фиброза печени

Показатели Доноры (Р0, п=68) Больные (Р1/2, п=73) Больные (БЗ, п=51) Больные (Р4, п=50) ГБ Р

СОЗ+клетки (%) 65 (57-71) 61* (41-81) 62 (37 - 89) 58* (25 - 85) -0,14 0,12

— ■г- СОЗ клетки (кл/мм3) 1129 (894-1390) 1175 (413-2134) 1093 (277-2343) 858 (155-2178) -0,29 0,000115

С04+клетки (%) 37 (31-42) 36 (17-47) 36 (20-49) 33* (13-55) -0,04 0,62

—^г- СР4 клетки (кл/мм3) 629 (466-852) 650 (208-1210) 631 (166-1484) 500 (94-1736) -0,24 0,001250

СБ8+клетки (%) 23 (18-28) 27* (14-54) 25 (15-41) 24 (15-39) -0,29 0,001

СВ8+клетки (кл/мм3) 424 (259-586) 530 (181-1437) 444 (117-860) 348 (50-717) -0,33 0,000011

С04/СР8 индекс 1,63 (1,17-2,0) 1,32* (0,45-2,5) 1,5 (0,49-2,8) 1,47 (0,56-3,2) -0,14 0,077539

С019В-клетки (%) 11 (5-20) 17* (6-36) 18* (2-29) 18* (3-38) 0,08 0,38

(г/л) 1,63 (1,3-2,2) 1,95 (0,78-5,4) 2,58* (0,47 - 8,7) 3,16* (0,8-10,4) 0,25 0,007

(г/л) 1,25 (1,0-1,6) 1,89* (0,99 -4,4) 2,61* (0,67 - 7,7) 4,04* (0,24 - 9,5) 0,54 0,000001

ДО (г/л) 9,5 (8,6-1,0) 13,17* (5,13-24) 15,8* (8,2-27,5) 22,19* ' (10,2-41) 0,51 0,000001

ПАМ (усл.ед.) 2,4 (1,7-2,9) 1,9* (1,2-3,4) 1,9* (1,1-4,5) 1,66* (1,1-3,3) -0,29 0,001

ПАН (усл.ед.) 2,38 (2,0-2,8) 4,8* (1,2-10,5) 4,36* (1,3-10,4) 3,04 (0,96-9,0) -0,47 0,000001

Действительно, сравнительный анализ параметров иммунного статуса больных в сформированных подгруппах показал (табл. 3), что прогрессия фиброза сопряжена со снижением абсолютного количества CD3 (rs= -0,29) и CD4 Т-клеток (rs= -0,23), а также абсолютного (rs= -0,33) и относительного (rs= -0,29) количества цитотоксических CD8TT-лимфоцитов. Кроме того, выявляются нарушения в фагоцитарном звене иммунитета в виде снижения функциональной активности моноцитов (ПАМ, rs= -0,29) и нейтрофилов (ПАН, rs= -0,47). В то же время, нарастание степени тяжести фиброза у больных с ХВГ ассоциируется с проградпентиым увеличением сывороточного уровня IgM (rs= 0,25), IgA (rs= 0,54), IgG (rs~ 0,51) и аутоантнтел (данные не представлены), что в сочетании с выраженным увеличением тимоловой пробы (rs = 0,52; табл. 2) может свидетельствовать о Till—>Th2 переключении, в том числе, с возможным развитием аутоиммунных реакций на фоне прогрессирующей печеночной деструкции в процессе фиброгенеза.

Прогрессия фиброза проявляется также изменением сывороточного уровня и баланса продукции ММР-9 и Т1МР-1. Из данных таблицы 4 видно, что по сравнению со здоровыми донорами в сыворотке крови больных на начальных FI/2 стадиях фиброза регистрируется достоверное увеличение концентрации и ММР-9, и TIMP-1. Тем не менее, индекс соотношения Т1МР-1/ММР-9, отражающий баланс продукции данных медиаторов, сохраняется на уровне нормативных значений (1,35 ± 0,18 и 1,41 ± 0,34 расч.ед. у доноров и больных, соответственно).

Таблица 4. Уровень и соотношение Т1МР-1 и ММР-9 в сыворотке крови здоровых доноров и больных ХВГ с различной выраженность фиброза печени.

Показатели Доноры (F0, п=18) Больные (F1/2, п=33) Больные (F3, п=27) Больные (F4, п=34) rs Р

ММР-9 (нг/мл) 308±35 559±82* 254±26 294±58* -0,44 0,000008

ТГМР-1 (нг/мл) 331±24 431±28* 535±27* 587±20* 0,44 0,000008

Индекс

Т1МР-1/ 1,35±0,1 8 1,41 ±0,34 2,6±0,24* 4,0±0,48* 0,54 0,000001

ММР-9

Примечание: данные в виде \1-S.E.. * достоверность различий между показателями у больных ХВГ и здоровых доноров <р<0,05). гч - коэффициент корреляции Спирмана исследуемых параметров со стадией фиброза: р - достоверность корреляционных взаимосвязей.

Прогрессия фиброза сопровождается практически 2-кратным снижением уровня ММР-9 в сочетании с достоверным увеличением концентрации ТТМР-1. В результате средние значения индекса соотношения ТГМР-1/ММР-9 возрастают с 1,41 ± 0,34 до 2,6 ± 0,24 и 4,0 ± 0.48 расч.ед. у больных с ИЗ и Б4 стадией, соответственно (ри<0,01). В целом по группе обследованных больных ХВГ (п=94) между степенью тяжести фиброза и уровнем ММР-9 была выявлена обратная корреляционная связь (г5= - 0,44; р<0,01). В свою очередь увеличение концентрации Т1МР-1 и индекса ТГМР-1/ММР-9 было прямо взаимосвязано с прогрессией фиброза (соответственно, г5= 0,44 и г5= 0,54; р<0,01).

Таким образом, проведенный сравнительный анализ свидетельствует о сопряженности степени тяжести фиброза печени с изменением целого комплекса

лабораторных тестов. Некоторые из них характеризуются сильной корреляционной взаимосвязью с выраженностью фиброза (rs> 0,45). К таковым можно огнестн и относительно простые, «рутинные» клинико-биохимнческие (СОЭ, тромбоциты. ПТИ. альбумин, тимоловая проба, прямой билирубин, ACT) и иммунологические (IgA. IgG) тесты, но также и редко используемые в клинической практике специфические маркеры фиброгенеза (ММР-9, TIMP-1). Полученные нами данные указывают на потенциальную возможность использования различных лабораторных показателей в качестве предикторов фиброза печени, что и послужило основанием для разработки неинвазивного метода диагностики фиброза печени.

При создании диагностической модели использовали множественный, линейный, пошаговый регрессионный анализ биохимических показателей с последовательным включением/исключением переменных при уровне порогов вероятностей равном 0.05. На «обучающем» массиве данных (174 больных ХВГ и 68 здоровых доноров) в соответствии с процедурой пошаговой регрессии в диагностическую модель было включено 5 биохимических параметров: альбумин, ПТИ, ACT, глюкоза, ЛДГ, каждый из которых имел соответствующие коэффициенты регрессии (Bi-Bs «ноу-хау»), В итоге диагностическая модель выражалась в виде следующей формулы:

ИИФП-биох= 3,0405405 + (-В,хальбумин (г/л|) + (-В2хПТИ [%|) + (В3хДСТ [мМоль/ч*л1) + (В4Хглюкоза (мМоль/л)) + (-В5*ЛДГ [Ед/л])

Используя полученное уравнение множественной регрессии, были рассчитаны ннтеграчьные индексы фиброза печени (ИИФП-биох) индивидуально для всех обследованных лиц из «обучающего» массива. Затем, на основе квантилыюго разбиения были выделены достоверно отличающиеся между собой пороговые значения и диапазоны, характерные для определенных морфологических стадий фиброза (табл. 5.). Таблица 5. Пороговые значения и диапазоны ИИФП-биох, значимые для диагностики стадии фиброза печени

Стадии фиброза ИИФП-биох SN SP

Признаков фиброза нет (Р0) <2,30 65% 71%

Начальные стадии (Р1/Р2) >2,30- <2,66 90,9 % 84.6 %

Распространенный фиброз/цирроз (РЗ/Р4) >2,84 80,8 % 90,9 %

В том числе, стадия РЗ >2,84- <3.04 62,5 % 92,8 %

В том числе, стадия Р4/цирроз >3,38 82.1 % 83.3 %

Кроме того, были определены интервалы значений ИИФП-биох, маркирующие переходные состояния из ¥2 в РЗ стадию (ИИФП > 2,66 - < 2,84), а также из РЗ в Р4 стадию (ИИФП >3,04-<3,38).

Диагностическую точность разработанной модели сначала проверили на 84 больных ХВГ (экзаменационная когорта №1), отобранных из «обучающего» массива методом случайного отбора. Результаты неинвазивной диагностики степени тяжести фиброза у 72 из 84 больных совпали с результатами морфологической оценки биоптатов печени, что указывает на высокую (на уровне 86%) диагностическую точность предложенного подхода.

Для дальнейшей валидизации метода в период с конца 2008 по конец 2010 годов было проведено проспективное, лонгитудинальное исследование, в которое было включено 115

больных ХВГ (экзаменационная когорта №2). Биохимический анализ крови проводили до начала терапии и пункционной биопсии печени. На экспертизу сообщалась информация только по 5 параметрам (уровень альбумина, ПТИ, АСТ, глюкозы, ЛДГ). Диагностическая точность разработанной модели в этих исследованиях составила 87,8% (совпадения результатов экспертизы с результатами морфологической оценки биоптатов печени в 101/115 случаев).

В целом эффективность разработанной диагностической модели по результатам проверки на 2-х экзаменационных массивах (п=84 и п=115) составила 87%. Только у 26 из 199 обследованных нами больных стадия фиброза, определенная с помощью ИИФП-биох, не согласовывалась с заключением морфогистологического исследования биоптата. Из этих 26 случаев ложноположительные (гипердиагностика) и ложноотрицательные (гиподиагностика) результаты были получены у 15 и 11 больных, соответственно.

Пункционная биопсия печени

Первичное обследование

Повторное обследование (через 12 мес)

Я ¥

Диагностическая модель

Изменение ИИФП через 12 мес

X х = 3

ч ¡3 £ § О V©

£

о ■&

а

£

5

-е-

3 "

3 а

5

4

10

Л

н и

Р1 (п=1) ¡4 Р1 (п=1)

ПП (п=2) Е) И1/2 (п=2)

Р2 (п=1) Е) Р2 (п=1)

РЗ (п=2) с) РЗ (п=2)

Р4 (п=10) с) Р4 (п=10)

Прогрессия фиброза (п=4) Р1/2 (п=2)

Р2/3 (п=1)

РЗ (п=1)

Регрессия фиброза (п=2) Р2 (п=1)

РЗ (п=1)

с) е)

Р2/3 (п=2)

Р4(п=1)

РЗ/4 (п=1)

Р1/2(п=!)

Р1/2(п=1)

2,18 —> 2,29 Д+0,11

2,35 -> 2,39 1,90->2,22 Д +0,04 Д +0,32

1,98->2,65 Д +0,67

3,16 ->2,90 2,67 — 2,96 Д -0,26 Д +0,29

3,45 -> 3,19 Д -0,26

2,06 2,75 2,43 — 2,67 Д +0,69 Д +0,24

2,85 -> 3,64 Д +0,79

4,0 -> 4,58 Д+0,58

3,42->3,18 Д -0,24

2,73 -> 2,6 Д-0,13

Рисунок 1. Динамика морфогистологической картины печени и изменение ИИФП- биох у больных ХВГ

Примечание: ИИФП-биох представлен в виде индивидуальных или медианных (для И4 стадии) значений, а также в виде разницы (Д) между повторным и первичным обследованием.

Как известно, фиброгенез является динамическим процессом, поэтому, задачей следующего этапа работы явилась оценка возможности использования разработанной прогностической модели для мониторинга больных ХВГ на фоне проводимой противовирусной и антифибротической терапии.

Для решения поставленной задачи были отобраны 22 больных ХВГ, которым проводилась повторная пункционная биопсия печени с интервалом не менее 12 мес. Было сформировано 3 подгруппы больных (рис. 1). Первую подгруппу составили 16 человек, у которых морфогистологическая картина фиброза печени сохранялась стабильной. Значения ИИФП-биох в динамике наблюдения у этих больных также мало изменялись и оставались в границах, соответствующих первоначально установленной стадии фиброза печени.

У 4 больных из второй подгруппы, несмотря на проводимую комплексную терапию, повторная пункционная биопсия выявила профессию фиброгенеза. Разработанная нами модель также свидетельствовала о дальнейшем утяжелении фибротического процесса.

У 2 больных с морфологически подтвержденным рефессом фиброза печени, расчет ИИФП-биох в динамике наблюдения также подтверждал уменьшение степени выраженности фибротического процесса.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о достаточно высокой эффективности разработанной диагностической модели в мониторинге характера течения фибротического процесса у больных ХВГ. При этом по сравнению с пункционной биопсией печени очевидным преимуществом неинвазивной диагностики является возможность многократной оценки степени тяжести фиброза, что позволяет врачу более четко представлять реальную картину фиброгенеза и, соответственно, своевременно вносить необходимые изменения в комплексную лечебную профамму.

Представлялось важным ответить на вопрос, насколько информативна разработанная диагностическая модель в определении степени тяжести фиброза у больных с диффузными заболеваниями печени невирусного генеза? Для решения этой задачи была сформирована отдельная фуппа пациентов (табл. 6).

Таблица 6. Эффективност ь разработанной модели неинвазивной диагностики стадии фиброза печени у больных гепатитами невирусного генеза

Диффузные заболевания печени п=40 Совпадение с результатами биопсии печени

токсический гепатит п=21 61,9% (13 /21)

аутоиммунные гепатиты п=13 53,8% (7/13)

другие гепатиты (криптогенный гепатит, болезнь Вильсона-Коновалова, болезнь Бадда-Киари) п=6 33,3% (2/6)

В результате было установлено, что предложенный метод неинвазивной диагностики степени тяжести фиброза, который разрабатывался на «обучающем» массиве больных ХВГ, малоинформативен у пациентов с гепатитами невирусной этиологии.

В современной клинической практике для диагностики степени тяжести фиброза всё чаще используют метод инструментальной оценки эластичности печеночной ткани. Данный метод, который получил название «эластометрии», также относится к неинвазивным

способам. В основе его лежит компьютерный анализ вибрационных импульсов с помощью аппарата «Фиброскан» (Echosens, Франция) [Lee М.Н., 2010; Takemoto R., 2009].

Таблица 7. Результаты оценки степени фиброза печени у больных ХВГ с помощью ИИФП и эластометрии

Биопсия печени ИИФП-биох Фиброэластометрия

Fl;n=2 F0/1; п=1 F3; п=1 (ложноположительный результат)

F2/3; п=1 (ложноположительный результат) F2; п=1 (ложноположительный результат)

F2; п=4 F2; п=3 F0; п=2 (ложноотрицательные результаты)

F3; п—1 (ложноположительный результат) F2; п=2

F3; п=1 F3 F3

F4; п-6 F3/4; п=2

F4; п=4 F4; п=6

Для того чтобы оценить информативность этих 2 способов неинвазивной диагностики фиброза печени (ИИФП и эластометрии) были отобраны 13 больных ХВГ, которым была также выполнена пункционная биопсия печени.

С помощью расчета ИИФП частота совпадений результата с данными биопсии составила 84,6% - в 2 случаях из 13 были получены ложноположительные результаты (табл. 7). Точность фиброэластометрии составила 69%: было получено 2 ложноположительные, и 2 ложноотрицательные ошибки, когда у больных с ¥2 стадией измерение эластических свойств печени вообще не показывало наличие фиброза (ИО). С клинической точки зрения ложноотрицательные результаты всегда являются более опасными, поскольку в этом случае имеет место недооценка степени тяжести фибротического процесса, а это в свою очередь сопряжено с неадекватным выбором лечебной тактики. Кроме того, интересным представляется один случай, когда с помощью неинвазивных методов у больного определялся клинически значимый фиброз в стадии Р2 (эластометрия) или даже переходное И2/3 состояние (ИИФП), тогда как результаты биопсии свидетельствовали о наличии фиброза в начальной Р1 стадии. Нельзя исключить, что в данном случае при проведении биопсии произошла «ошибка попадания», когда пункционная игла попала в участок ткани с менее выраженными изменениями, чем в целом по органу.

Как и любые другие методы исследования, разработанный нами подход не позволял полностью исключить диагностические ошибки, которые в нашем исследовании составили 13% (у 26 из 199 обследованных больных ХВГ заключения экспертизы не совпадали данными биопсии). С целью повысить эффективность неинвазивной диагностики на завершающем этапе работы на аналогичной методологической платформе с помощью регрессионного анализа иммунных предикторов фиброза была разработана диагностическая

модель «второго уровня». Для этого были дополнительно проанализированы показатели иммунного статуса больных ХВГ и здоровых доноров, поскольку ранее было показано, что отдельные иммунологические параметры находятся в тесной корреляционной взаимосвязи с выраженностью фиброза (табл. 3). Из обучающего массива данных было сформировано 3 группы: 50 здоровых доноров крови - в качестве группы КО, 14 больных ХВГ с морфологически документированной начальной П стадией фиброза и 92 больных с продвинутыми VI и РЗ стадиями фиброза (табл. 8).

Таблица 8. Характеристика здоровых доноров (ГО) и больных ХВГ с начальной (П) и продвинутыми (ГО/З) стадиями фиброза печени

F0(n=50) Fl (n=14) F2/3 (n=92)

Пол (м/ж) 35/15 12/2 67/25

Возраст (лет) ХВГ/ ХВГ+ ЦП Median 35 32,5 34

min - max 20-62 (24 - 57) 14/0 (18-72) 74/18

ИИФП-имм Median 5,72 4,26* 3,32 #

LQ-UQ 5,10-6,24 3,91 -4,57 2,70 -3,70

Примечания: * ри = 0,0001 - достоверность различия F1 vs F0; # ри = 0,000001 - достоверность различия F2/3 vs F1 (U критерий Вилкоксона-Мана-Уитни).

При проведении множественного регрессионного анализа в качестве потенциальных регрессантов были проанализированы следующие показатели иммунного статуса: CD1943-клетки (%), IgM, IgA, IgG, ПАН, ПАМ, СЭ8+Т-лимфоциты (%). В результате процедуры пошаговой регрессии в модель были включены ПАН, ПАМ, С08+Т-лимфоциты и CD1 ТВ-клетки. Для каждого их них были получены соответствующие коэффициенты регрессии (В1-В4 «ноу-хау»),

В итоге диагностическая модель выражалась в виде следующей формулы: ИИФП-имм = 6,628824 + (-В1ХПАН [усл.ед.]) + (В2хПАМ [усл.ед.1) + (-В3хС08-Т-клетки |%]) + (-В4х СБ19-В-клетки [%])

Используя данное уравнение, были рассчитаны индексы фиброза печени с иммунологическими предикторами (ИИФП-имм). Из данных таблицы 8 видно, что средние значения ИИФП-имм в сформированных подгруппах больных с морфогистологическими стадиями фиброза F1 и F2/F3, а так же F1 и F0 достоверно различаются между собой. Кроме того, было установлено, что величина ИИФП-имм обратно коррелировала с гистологической стадией фиброза печени (rs= - 0,85; р<0,000001).

Полученные результаты послужили основанием для анализа операционных характеристик ИИФП-имм с целью определения значимости данного индекса в распознавании начальной (F1) и продвинутых (F2/F3) стадий фиброза, а так же в диагностике наличия и отсутствия фиброза печени (F1 и F0). Для этого были построены 2 характеристические кривые (receiver-operator curve, ROC). Проведенный ROC-анапиз показал (рис. 2), что площадь под кривой для ИИФП-имм при распознавании начальной (F1) и продвинутых (F2/F3) стадий фиброза составила 0,90 (95% ДИ 0,66 - 0,93; р=0,0002).

Площадь под ROC-кривой для ИИФП-имм (рис. 3), используемого для диагностики наличия или отсутствия фиброза печени (F1 и F0) составила 0,94 (95% ДИ 0,88 - 1,0; р=0,0001).

В соответствии с классификацией Swets J.A. [Swets J.А., 1988], площадь под кривой выше 0,9 характеризует тест, обладающий наиболее высокой диагностической точностью. Поскольку в нашем случае площадь под ROC-кривыми составляла 0,9 и 0,94, это свидетельствует о том, что ИИФП-имм, характеризуется высокой эффективностью как в распознавании начальной (FI) и продвинутых (F2/F3) стадий фиброза, так и в диагностике наличия/отсутствия фиброза печени (F1 и F0) у больных ХВГ.

ИИФП-имм для F1 vs F2/3

Г"

20 40 60 80 Специфичность, %

100

Рисунок 2. ЯОС-кривая, иллюстрирующая отношение между чувствительностью и специфичностью для различных точек разделения ИИФП-имм в распознавании Р1 и И/ГЗ

£ 40-

ИИФП-иммдля F1 vs F0

0 20 40 60 80 100 Специфичность, %

Рисунок 3. ИОС-кривая, иллюстрирующая отношение между чувствительностью и специфичностью для различных точек разделения ИИФП-имм в диагностике наличия и отсутствия фиброза печени (П и И))

Следующим шагом ЯОС-анализа стало определение чувствительности, специфичности и отношения правдоподобия для различных точек разделения. Для диагностики Р1 и ¥2Г?Ъ стадий фиброза наиболее оптимальной точкой разделения стало пороговое значение ИИФП-имм=4,14 расч.ед. (отношение правдоподобия 3,5), которое соответствовало максимальным показателям чувствительности (88%) и специфичности (75%). Для диагностики наличия/отсутствия фиброза наиболее оптимальной точкой разделения явилось пороговое значение ИИФП-имм=4,60 расч.ед. (отношение правдоподобия 7,5, чувствительность - 88%, специфичность - 88,4%).

Таким образом, в результате проведенного ЯОС-апализа удалось определить следующие пороговые значения и диапазоны ИИФП-имм: значения ИИФП-имм >4,60 свидетельствуют об отсутствии фиброза (Р0); в интервале 4,14 - 4,60 соответствуют начальной (Р1) стадии и <4,14 позволяют диагностировать продвинутые (Р2/РЗ) стадии фиброза печени у больных ХВГ.

Затем, были определены индивидуальные значения ИИФП-имм у больных ХВГ (п=26), у которых результаты определения стадии фиброза с помощью ИИФП-биох не совпадали с заключением морфогистологического исследования биоптата. В итоге, у больных с наиболее опасными, ложноотрицательными ошибками привлечение метода неинвазивной диагностики «второго уровня» позволило сократить число ошибочных заключений с 11 до 3 случаев. В подгруппе больных с ложноположительными результатами с помощью ИИФП-имм удалось сократить число ошибочных заключений с 15 до 4 случаев. На рисунке 4 показана эффективность разработанных нами подходов в случае использования

биохимического индекса в изолированном виде, а также в комбинации с иммунологическим интегральным индексом фиброза, что позволяет сократить количество диагностических ошибок с 13 до 2,3%.

Рисунок 4. Эффективность методов неинвазивной диагностики фиброза печени у

больных ХВГ

Выводы

1. Иммунные нарушения у больных ХВГ на фоне прогрессии фиброза проявляются увеличением в крови относительного содержания CD 19+В-клеток и сывороточного уровня IgM, IgA, IgG и ЦИК, снижением абсолютного количества CD3*. CD4* и CD8T-лимфоцитов, а также нарушением функциональной активности моноцитов/нетрофилов.

2. Начальные стадии фиброза печени (F1/2) у больных ХВГ характеризуются значимым увеличением сывороточного уровня металлопротеиназ (ММП-9) и тканевого ингибитора ТИМП-1, при этом продукция этих медиаторов остается сбалансированной, поскольку не сопровождается нарушением индекса соотношения ТИМП-1/ММП-9.

3. Прогрессия фиброза (Fl/2—>F3—»F4) сопровождается снижением уровня ММП-9 в сочетании с достоверным увеличением концентрации ТИМП-1, что приводит к сдвигу ТИМП-1/ММП-9 баланса в сторону 2,6-4,0-кратного доминирования тканевых ингибиторов металлопротеиназ.

4. Нарастание степени тяжести фиброза печени у больных ХВГ находится в прямой или обратной корреляционной взаимосвязи с биохимическими (ПТИ, альбумин, ACT, ЛДГ) и иммунологическими (IgM, IgA, IgG, ПАН, ПАМ, С08+Т-клетки) параметрами, что свидетельствует о возможности их использования в качестве биомаркеров фиброгенеза.

5. Интегральный индекс фиброза печени (ИИФП-биох), который рассчитывается по 5 биохимическим тестам (ПТИ, глюкоза, альбумин, ACT, ЛДГ), позволяет прогнозировать степень тяжести фиброза печени у больных ХВГ с диагностической точностью 86-87%, при этом использование дополнительного индекса (ИИФП-имм), который рассчитывается по 4 иммунологическим тестам (ПАН, ПАМ, CD8+T- и CD 19+В-клетки), позволяет сократить количество диагностических ошибок с 13% до 2,3%.

6. Разработанный метод неинвазивной диагностики (с помощью ИИФП) позволяет проводить мониторинг характера течения фибротического процесса на фоне проводимой терапии, превышает диагностическую точность эластометрии (69%), но является матоинформативным у больных хроническими гепатитами невирусного генеза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Черных Е.Р., Старостина Н.М., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Агапитова C.B., Шипунов М.В., Останин A.A., Козлов В,А. Цитокиновый профиль у больных хроническими вирусными гепатитами с фиброзом и циррозом печени // Мед иммунология.- 2006.- Т. 8, № 4,- С. 539-546.

2. Черных Е.Р., Старостина Н.М., Пальцев А.И., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Шипунов М.В., Селихова Ю.Б., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Никонов С.Д., Останин A.A., Козлов В.А. Аутологичные клетки костного мозга в лечении цирроза печени // Клеточные технологии в биологии и медицине.- 2007.- №4,- С. 231-237.

3. Останин A.A., Гельфгат Е.Л., Шипунов М.В., Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Хван Л.А., Пальцев А.И., Старостина Н.М., Черных Е.Р. Прогностическая модель неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническими вирусными гепатитами// Мед. иммунология,-2008.- Т. 10, №4/5,- С. 405-414.

4. Старостина Н.М., Шипунов М.В., Гельфгат Е.Л., Черных Е.Р., Останин A.A. Неинвазивная диагностика и мониторинг развития фиброза печени у больных хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) // Материалы Объединенного иммунологического форума (Санкт-Петербург, 2008).- Российский иммунологический журнал,- 2008,- Т. 2(11), № 2/3,- С. 261-262.

5. Григорьева А.Е., Агапитова C.B., Шипунов М.В., Старостина Н.М., Леплина О.Ю., Останин A.A., Черных Е.Р., Козлов В.А. Характеристика цитокинового баланса у больных хроническими вирусными гепатитами с фиброзом и циррозом печени // Материалы конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008).- Сибирский медицинский журнал.- 2008.- Т. 23, №3 (выпуск 1).- С. 78-79.

6. Черных Е.Р., Старостина Н.М., Пальцев А.И., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Шипунов М.В., Селихова Ю.Б., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Никонов С.Д., Останин A.A., Козлов В.А. Лечение цирроза печени с использованием трансплантации аутологичных клеток костного мозга // «Клеточные технологии. Теоретические и прикладные аспекты», Сборник трудов под ред. Козлова В.А., Сенникова C.B., Черных Е.Р., Останина А.А.Новосибирск: Наука, 2009.- С. 171 -188.

7. Шипунов М.В., Старостина Н.М., Гельфгат Е.Л., Черных Е.Р., Останин A.A. Иммунные предикторы фиброгенеза и их использование для неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническими вирусными гепатитами // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН,- 2012,- № 3 (часть 2).- С. 231-236

8. Шипунов М.В., Старостина Н.М., Черных Е.Р., Останин A.A. Эффективность методов неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническими вирусными гепатитами // Вестник Уральской медицинской академической науки,- 2012.- № 4 (41).-С. 184-185

9. Останин А.А., Гельфгат Е.Л., Шипунов М.В., Старостина Н.М., Черных Е.Р. Способ диагностики фиброза печени // «ноу-хау» НИИКИ СО РАМН (приказ 93-П от 17.10.2008), отозванная заявка на изобретение 1Ш 2007118845, приоритет от 21.05.2007.

Подписано к печати 23.11.2012 формат-60x84 1/8, Усл. печ. л. 1 Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 683 ООО " Типография ЮГУС", ИНН 5402467637, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4, тел.: (383) 226-14-56, 225-04-47

В настоящее время во всем мире вирусные гепатиты являются одной из наиболее серьезных медикосоциальных проблем. В структуре инфекционной патологии они составляют 16-30% и находятся на третьем месте после гриппа и острых респираторных вирусных инфекций. Очевидно, что заболеваемость вирусными гепатитами имеет исключительный характер, так как по темпам прироста и масштабам распространенности она значительно превосходит заболеваемость СПИДом. Считается, что почти треть населения земли инфицирована вирусом гепатита В. Для сравнения вирусом иммунодефицита человека инфицировано 30 млн человек. По данным ВОЗ ежегодно около 50 млн человек заболевают вирусным гепатитом В (НВУ), а умирают до 2 млн человек. В мире насчитывается также около 300 млн человек, инфицированных вирусом гепатита С (НСУ). Медикосоциальная значимость вирусных гепатитов определяется не только широкой распространенностью данной патологии, но также латентностью течения, высокой частотой (до 75-80%) хронизации инфекции и повышенным риском развития неблагоприятных исходов (цирроз печени, гепатокарцинома), а также существенными экономическими затратами на диагностические и лечебные мероприятия.

Летальность при хронических вирусных заболеваниях печени обусловлена осложнениями в виде формирования цирроза с печеночной недостаточностью и портальной гипертензией. Так установлено, что через 10 лет от момента инфицирования у 5-10% больных хроническим гепатитом С формируется цирроз печени, а через 20-30 лет уже у 20-25% инфицированных. Важно отметить, что прогрессирование фиброза (цирроза) печени у больных хроническим гепатитом В имеет еще более выраженные темпы.

Процесс фиброгенеза при хронических вирусных гепатитах (ХВГ) является ответной реакцией организма на повреждение печени, которая инициируется и поддерживается хроническим воспалительным процессом [46]. Развитие фиброза связано с избыточным отложением соединительной ткани в результате усиления продукции и нарушения деградации белков внеклеточного матрикса [2]. Наибольшую роль в развитии фиброза отводят локальным механизмам, в частности, звездчатым клеткам, способным при активации трансформироваться в пролиферирующие миофибробласты и продуцировать коллаген, а также тканевые ингибиторы металлопротеиназ - ферментов деградации коллагена [168].

Ранее традиционным было представление о необратимости фиброза, однако в настоящее время доказана возможность его регресса, особенно, на начальных стадиях фиброзирования печени. В то же время фиброз на стадии морфологического цирроза, характеризующийся глубоким изменением архитектоники паренхимы печени, считается необратимым. В связи с огромной ролью фиброза в патогенезе хронических вирусных гепатитов, большое значение при ведении пациентов имеет мониторирование фиброзных изменений, что позволяет своевременно начать адекватную терапию, и предупредить трансформацию фиброза печени в цирроз.

В настоящее время пункционная биопсия печени (ПБП) с последующим морфологическим исследованием биоптата считается «золотым стандартом» определения степени тяжести фиброза [177]. К сожалению, данный метод имеет ряд существенных ограничений и недостатков [56]. Пункционная биопсия является инвазивной методикой с определенным процентом осложнений (абдоминальные и торакальные кровотечения, пневмоторакс, ранения желчного пузыря и протоков, перитонит) вплоть до летальных исходов. Вследствие этого ПБП фактически приравнивается к малому оперативному вмешательству на органах брюшной полости. При ПБП существует вероятность так называемой «ошибки попадания», когда биопсийная игла попадает в участок ткани с менее или, наоборот, более выраженными изменениями, чем в целом в печени. Кроме того, информативен только пунктат длиной не менее 10-20 мм, содержащий не менее 7-9 портальных трактов, что не всегда удается достичь при проведении ПБП. У ряда пациентов биопсию печени невозможно выполнить, так как имеются противопоказания (кисты, гемангиомы печени, тромбоцитопения, различные нарушения гемостаза, гемофилия, и др.). Существенной проблемой является также необходимость выполнения повторных биопсий для динамической оценки фибротического процесса на фоне проводимой антифиброзной, противовирусной и гепатопротективной терапии.

Поэтому актуальным является поиск и разработка методов неинвазивной диагностики степени тяжести фиброза печени, которые бы отвечали бы определенным требованиям. Во-первых, были безопасны для больного и имели минимальное число противопоказаний/ограничений. Во-вторых, базировались на относительно простых исследованиях (тестах) и были широкодоступны для лечебно-диагностических учреждений различного уровня. В-третьих, обладали достаточно высокой диагностической точностью (не ниже 80%) и информативностью в диагностике, как определенных морфогистологических стадий фиброза, так и возможных переходных (пограничных) состояний. И наконец, в-четвертых, имели некое объективное выражение, например, в виде числовых индексов с установленными пороговыми значениями, что могло бы позволить исключить элемент субъективной оценки врача/исследователя в интерпретации полученных результатов.

Исходя из вышесказанного, была сформулирована цель работы: изучить клинико-лабораторные показатели и параметры иммунитета у больных хроническими вирусными гепатитами в зависимости от стадии фиброгенеза и на этой основе разработать диагностическую модель оценки тяжести фиброза печени.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи;

1. Провести сравнительный анализ клинических и биохимических показателей, а также параметров иммунного статуса у больных хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) с различными морфогистологическими вариантами фиброза печени.

2. Оценить сывороточный уровень матричной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора металл опротеиназ-1 у больных ХВГ в зависимости от степени тяжести фиброза печени.

3. Изучить ассоциированность клинико-иммунологических параметров с выраженностью фиброза печени и определить кандидатные маркеры для создания прогностической модели неинвазивной диагностики стадии фиброза у больных ХВГ.

4. На основе множественного, регрессионного анализа создать прогностическую модель неинвазивной диагностики фиброза печени и оценить ее информативность.

5. Изучить возможность использования разработанной модели для оценки выраженности фиброза у больных ХВГ в динамике проводимой комплексной терапии, а также у больных с диффузными заболеваниями печени невирусной этиологии.

Научная новизна

Получены новые данные, характеризующие особенности функционирования иммунной системы больных ХВГ с различной выраженностью фиброза печени. Установлено, что прогрессия фиброза (П/2—>РЗ—»Б4) сопряжена с преимущественной активацией гуморального звена иммунитета, что проявляется увеличением в крови относительного содержания СО!9+В-клеток и сывороточного уровня 1§М, ^А, и ЦИК, на фоне снижения абсолютного количества CD3+, CD4+ и CD8+T-лимфоцитов, а также нарушения функциональной (бактерицидной) активности моноцитов/нейтрофилов.

Впервые показано, что по сравнению со здоровыми донорами в сыворотке крови больных ХВГ с начальными F1/2 стадиями фиброза регистрируется достоверное увеличение концентрации металлопротеиназ (ММП-9) и их тканевых ингибиторов (ТИМП-1), однако продукция этих медиаторов в целом остается сбалансированной, поскольку не сопровождается нарушением соотношения ТИМП-1 /ММП-9. Прогрессия фиброза (Fl/2—>F3—>F4) сопровождается снижением уровня ММП-9 в сочетании с достоверным увеличением концентрации ТИМП-1, что приводит к 2,6-4,0-кратному увеличению индекса соотношения ТИМП-1/ММП-9.

Впервые определена широкая панель биомаркеров фиброгенеза, включающая относительно простые, «рутинные» клинико-биохимические (СОЭ, тромбоциты, ПТИ, альбумин, тимоловая проба, прямой билирубин, ACT, ЛДГ, щелочная фосфотаза) и иммунологические (IgM, IgA, IgG, ПАН, ПАМ, С08+Т-клетки) показатели, а также редко используемые в клинической практике специфические тесты (сывороточный уровень и соотношение ТИМП-1 /ММП-9).

Практическая значимость.

Разработан новый способ («ноу-хау») неинвазивной диагностики фиброза печени у больных ХВГ (но не у пациентов с гепатитами невирусного генеза), который позволяет с помощью уравнения множественной регрессии с использованием 5 биохимических тестов (ПТИ, глюкоза, альбумин, ACT, ЛДГ) рассчитать интегральный индекс фиброза печени (ИИФП-биох). Ретроспективные, а также проведенные проспективные, лонгитудинальные клинические исследования показали, что значения ИИФП-биох в установленных интервалах позволяют прогнозировать соответствующую стадию фиброза (Fl/2 vs F3 vs F4) с диагностической точностью 86-87%, которая превышает точность эластометрии (69%) - общепринятого метода неинвазивной (инструментальной) оценки степени тяжести фиброза печени. Показано, что разработанная диагностическая модель может эффективно использоваться в мониторинге характера течения (стабилизация, прогрессия/регрессия) фибротического процесса у больных ХВГ на фоне проводимой комплексной терапии.

В случаях ошибочной и/или сомнительной диагностики с помощью ИИФП-биох, предложено использовать уравнение множественной регрессии «второго уровня», которое позволяет на основании 4 иммунологических тестов (ПАН, ПАМ, CD8+T- и CD 19+В-клетки) рассчитать дополнительный интегральный индекс (ИИФП-имм). Применение ИИФП-биох в комбинации с ИИФП-биох позволяет сократить количество диагностических ошибок с 13% до 2,3%. Внедрение полученных результатов

Результаты исследования внедрены в практику работы иммунологического отделения клиники иммунопатологии ФГБУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный способ неинвазивной диагностики с помощью интегрального индекса фиброза печени (ИИФП-биох), который рассчитывается по 5 биохимическим тестам (ПТИ, глюкоза, альбумин, ACT, ЛДГ), позволяет прогнозировать степень тяжести фиброза печени у больных ХВГ с диагностической точностью 86-87%

2. Использование в комбинации с ИИФП-биох дополнительного индекса (ИИФП-имм), который рассчитывается по 4 иммунологическим тестам (ПАН, ПАМ, CD8+T- и СБ19+В-клетки) позволяет сократить количество диагностических ошибок с 13% до 2,3%.

Объем и структура диссертации:

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 132 страницах машинописного текста, включающего 32 таблицы и 9 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 194 литературных источника, в том числе, 154 иностранных.

Выводы

1. Иммунные нарушения у больных ХВГ на фоне прогрессии фиброза проявляются увеличением в крови относительного содержания CD19+B-клеток и сывороточного уровня IgM, IgA, IgG и ЦИК, снижением абсолютного количества CD3+, CD4+ и СБ8+Т-лимфоцитов, а также нарушением функциональной активности моноцитов/нейтрофилов.

2. Начальные стадии фиброза печени (F1/2) у больных ХВГ характеризуются значимым увеличением сывороточного уровня металлопротеиназ (ММП-9) и тканевого ингибитора ТИМП-1, при этом продукция этих медиаторов остается сбалансированной, поскольку не сопровождается нарушением индекса соотношения ТИМП-1 /ММП-9.

3. Прогрессия фиброза (Fl/2—>F3—>F4) сопровождается снижением уровня ММП-9 в сочетании с достоверным увеличением концентрации ТИМП-1, что приводит к сдвигу ТИМП-1/ММП-9 баланса в сторону 2,6-4,0-кратного доминирования тканевых ингибиторов металлопротеиназ.

4. Нарастание степени тяжести фиброза печени у больных ХВГ находится в прямой или обратной корреляционной взаимосвязи с биохимическими (ПТИ, альбумин, ACT, ЛДГ) и иммунологическими (IgM, IgA, IgG, ПАН, ПАМ, С08+Т-клетки) параметрами, что свидетельствует о возможности их использования в качестве биомаркеров фиброгенеза.

5. Интегральный индекс фиброза печени (ИИФП-биох), который рассчитывается по 5 биохимическим тестам (ПТИ, глюкоза, альбумин, ACT, ЛДГ), позволяет прогнозировать степень тяжести фиброза печени у больных ХВГ с диагностической точностью 86-87%, при этом использование дополнительного индекса (ИИФП-имм), который рассчитывается по 4 иммунологическим тестам (ПАН, ПАМ, CD8+T- и позволяет сократить количество диагностических ошибок с 13% до 2,3%.

6. Разработанный метод неинвазивной диагностики (с помощью ИИФП) позволяет проводить мониторинг характера течения фибротического процесса на фоне проводимой терапии, превышает диагностическую точность эластометрии (69%), но является малоинформативным у больных хроническими гепатитами невирусного генеза.