Хронические гепатиты B и C: иммунопатогенез и иммунодиагностика фиброзных изменений в печени

Малова, Елена Сергеевна

Диссертации по медицине → Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Хронические гепатиты B и C: иммунопатогенез и иммунодиагностика фиброзных изменений в печени

АВТОРЕФЕРАТ

Малова, Елена Сергеевна Москва 2011 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.09

Автореферат диссертации по медицине на тему Хронические гепатиты B и C: иммунопатогенез и иммунодиагностика фиброзных изменений в печени

МАЛОВА Елена Сергеевна

ХРОНИЧЕСКИЕ ГЕПАТИТЫ ВИС: ИММУНОПАТОГЕНЕЗ И ИММУНОДИАГНОСТИКА ФИБРОЗНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ПЕЧЕНИ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология 14.01.09 - инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

О 3 Оса ¿011

Москва-2011

4853810

Работа выполнена в государственном ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные консультанты:

доктор медицинских наук

ЕРЕМИНА

Ольга Федоровна

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

ЮЩУК

Николай Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

БОРИСОВА Алла Михайловна

доктор медицинских наук, профессор

ЯРИЛИН

Александр Александрович

доктор медицинских наук, профессор

ТОКМАЛАЕВ

Анатолий Карпович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава

Защита диссертации состоится «16» февраля 2011 г. в «17» часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.26 в ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.б).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов.

Автореферат разослан « »_2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Т.А.Славянская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность проблемы

По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) по меньшей мере 400 миллионов жителей планеты страдают хроническим гепатитом В (ХГВ) и около 2 миллиардов имеют серологические маркеры перенесенной или текущей инфекции вирусом гепатита В (ВГВ) [You J. et al, 2008; Das A. et al., 2008]. Среди инфицированных ВГВ примерно у 10% взрослых и 90% новорожденных происходит хронизация инфекции [Pol S, 2006; Meuleman Р. et al., 2006; You J. et al., 2008], в 10-30% случаев связанная с повышенным риском развития прогрессирующей болезни печени, включая фиброз, цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному [Chang J.J., Lewin S.R, 2007; Janssen H.L. et al., 2004; Ganem D., Prince A.M., 2004; Pol S., 2006]. Ежегодно в мире около миллиона инфицированных ВГВ погибает от неблагоприятных исходов заболевания [Dunn С. et al, 2007; Seeger С, Mason W.S, 2000; Das A. et al, 2008]. Тем не менее в последние годы отмечается падение частоты встречаемости прогрессирующего течения ХГВ в мире вообще и в России, в частности [Г.Г. Онищенко, А.Б. Жебрун, 2009; Rantala М, van de Laar M.J, 2008], и у 70-80% инфицированных на протяжении многих лет сохраняются нормальные показатели функции печени, что, однако, не предотвращает в полной мере вероятность формирования у них декомпенсации печеночной функции и развития гепатоцеллюлярной карциномы [Chen J.D, 2010; Shi Y.-H, Shi C.-H, 2009].

Вирусом гепатита С (ВГС), по последним данным ВОЗ, в мире инфицировано около 500 миллионов человек [Козлов В.К, Стельмах В.В, Радченко В.Г, 2009; Quiroga J.A. et al, 2006; Pham T.N, Michalak T.I, 2008; Boettler T. et al, 2005]. Хроническим гепатитом С (ХГС) страдает до 2% популяции развитых стран, в России число инфицированных ВГС составляет не менее 2 миллионов человек [Козлов В.К, Стельмах В.В, Радченко В.Г, 2009; Dolganiuc A, Szabo G, 2008]. Острая ВГС-инфекция в 75-85% случаев завершается формированием хронической формы заболевания с частотой неблагоприятных исходов в пределах 20-50% для цирроза печени и 20-30% для гепатоцеллюлярной карциномы [Murakami Н. et al, 2004; Nahon Р. et al, 2008]. \J \

Известно, что в основе патогенеза воспалительных и фиброзных изменений в печени при хронических гепатитах В и С лежат сложные взаимодействия между вирусом и иммунной системой хозяина, и любое повреждение ткани печени при данных инфекциях является иммуноопосредованным [Ratnam D., Visvanathan К., 2008; Baumert T.F., Thimme R., von Weizsäcker F., 2007; Bertoletti A, Gehring A.J., 2006; Meuleman P. et al., 2006]. Тем не менее, большинство современных исследователей делает акцент на изучении специфических механизмов иммунного реагирования, что закономерно проявляется недостаточной изученностью роли факторов врожденного иммунитета, в частности, CD 5 6+ клеток, в иммунопатогенезе хронических вирусных поражений печени и составляет актуальный аспект решения проблемы в целом.

При хронических гепатитах В и С прогноз заболевания и тактика ведения больных в большой степени зависят от выраженности фиброзного процесса в печени [Глушенков Д.В. и др., 2008; Павлов и др., 2006; Sporea I. et al., 2008]. Процедура биопсии печени, являющаяся на современном этапе «золотым стандартом» диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С, несет в себе определенный риск для здоровья пациентов, а современный уровень гистологической оценки образцов имеет ряд недостатков, снижающих ее диагностическую точность [Stauber RE, Lackner С., 2007; Павлов и др., 2008]. Кроме того, все существующие неинвазивные способы диагностики фиброза при хронических вирусных гепатитах не систематизированы, имеют ряд ограничений в применении и проявляют определенное несовершенство в сравнении с результатами биопсии печени [Poynard Т., 2010; Gebo К.А., 2002; Rosenberg W.M. et al., 2004; Lambert J. et al., 2008]. Перечисленные аргументы подчеркивают актуальность поиска альтернативных путей диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С и объясняют причину повышенного интереса современных исследователей к неинвазивным методам прогнозирования стадий фиброза.

Таким образом, решение задач по совершенствованию методов неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С на базе иммунологических концепций относится к числу актуальных проблем современного российского и мирового здравоохранения.

Цель исследования

Системный анализ, клинико-иммунологическое обоснование и оценка эффективности новых методических подходов к определению стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С для совершенствования неинвазивной диагностики при данных заболеваниях на основе неизвестных ранее аспектов иммунопатогенеза.

Задачи исследования

1. Провести мета-анализ современного состояния проблемы неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С с целью выявления перспективных направлений ее решения.

2. Сформировать новый методический подход к разработке способа неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С на основе иммунологических данных.

3. Провести оценку новых принципов неинвазивной диагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С с позиций патогенетического и диагностического значения субпопуляционного состава и функционального состояния лимфоцитов.

4. Разработать критерии неинвазивной иммунодиагностики (Иммунотесты) стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С и дать оценку их диагностической точности, прогностической значимости, чувствительности и специфичности.

5. Установить влияние эпигенетических факторов (пола, возраста, уровня вирусной нагрузки, генотипического варианта ВГС) на результаты Иммунотестов при хронических гепатитах В и С.

6. Предложить диагностические алгоритмы на основе клинического применения Иммунотестов при хронических гепатитах В и С.

7. Сопоставить диагностическую и прогностическую значимость разработанных Иммунотестов при хронических гепатитах В и С с другими апробированными методами с использованием мета-анализа.

Научная новизна работы

При выполнении диссертационных исследований впервые:

• Проведен системный анализ мирового опыта по использованию

методов неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С за последние 6 лет.

• Установлены основные направления совершенствания методов неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С на основе иммунологических данных.

• Предложен новый методический подход к оценке иммунологических данных как критериальных признаков отдельных стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С.

• Уточнен иммунопатогенез хронических гепатитов В и С, а также фиброзных изменений в печени при данной патологии с участием СО56+ клеток.

• Разработан оригинальный способ неинвазивной иммунодиагностики стадии (начальной) фиброзных изменений в печени при хроническом гепатите В - Иммунотест ХГВ/Р1.

• Разработан оригинальный способ неинвазивной иммунодиагностики стадии БЗ (предцирротической) фиброзных изменений в печени при хроническом гепатите С - Иммунотест ХТС/БЗ.

• Показаны диагностическая точность, чувствительность, специфичность и прогностическая ценность положительного результата разработанных Иммунотестов при неинвазивной диагностике соответствующих стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С.

• Выявлена независимость оценки Иммунотестов ХГВ/Р1 и ХГС/РЗ от половозрастных характеристик больных, вирусной нагрузки, генотипа вируса гепатита С.

• Установлены основные направления диагностического применения Иммунотестов и алгоритм их использования при неинвазивной диагностике соответствующих стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С.

• Методом мета-анализа доказана высокая эффективность и конкурентоспособность разработанных Иммунотестов в сопоставлении с другими способами неинвазивных диагностики фиброза печени при хронических гепатитах В и С.

Теоретическая и практическая значимость

Методом мета-анализа было установлено, что основным недостатком существующих неинвазивных приемов диагностики стадий фиброза печени является их ориентация на регистрацию количественных характеристик нарастания фиброзных явлений, что, в отличие от гистологического способа оценки, не всегда дает возможность четко установить стадию фиброзного процесса. Использование иммунологических данных в оценке фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С позволило сформулировать новый методический подход к проблеме неинвазивной диагностики стадий фиброза, заключающийся в том, что каждой стадии фиброза печени при данных заболеваниях соответствуют качественно различные состояния клеток иммунной системы, а при переходе от одной стадии к другой происходит смена ключевых ролей ее отдельных компонентов.

На примере углубленного изучения функциональной роли С056+ клеток в становлении фиброзных изменений в печени были получены новые научные данные о патогенетической роли этой популяции лимфоцитов в развитии реакций врожденного иммунитета и фиброза печени при хронических гепатитах В и С, что позволило создать уточненные схемы иммунопатогенеза названных патологических состояний. С позиций нового методического подхода была показана уникальность иммунологических сдвигов со стороны СБ56+ лимфоцитов на стадии фиброза печени при хроническом гепатите В и на стадии БЗ при хроническом гепатите С.

На основе полученных данных разработаны Иммунотест ХГВ/Р1 и Иммунотест ХГВ/РЗ для использования в клинической практике в качестве методов неинвазивной иммунодиагностики хронических гепатитов В и С. Проведена предварительная клиническая апробация разработанных Иммунотестов в процессе диспансерного наблюдения больных хроническими гепатитами В и С. С использованием мета-анализа и других приемов статистики показана конкурентоспособность Иммунотестов по диагностической точности, чувствительности, специфичности и прогностической ценности положительного результата по сравнению с другими неинвазивными методами диагностики фиброза печени при хронических гепатитах В и С.

Внедрение результатов работы в практику и учебный процесс

Новые сведения о современном состоянии проблемы неинвазивной диагностики фиброза печени и роли СЮ56+ лимфоцитов в развитии реакций врожденного иммунитета и фиброзного процесса в печени при хронических гепатитах В и С, а также уточненные схемы иммунопатогенеза названных заболеваний доведены до научной аудитории в ходе публикаций обзорного характера и используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета (МГМСУ).

Разработанные Иммунотесты для неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническим гепатитом В и прогноза цирроза печени у больных хроническим гепатитом С используются в научной и практической деятельности лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ МГМСУ (г.Москва), медицинской компании «Гепатолог» (г. Самара), «Лечебно-диагностического центра иммунологии и аллергологии» (г.Самара).

Получено положительное решение Роспатента о выдаче патента на изобретение по заявке № 2009144106/15(062739) от 30.11.2009 г. «Способ оценки фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С».

На способы прогнозирования цирроза печени при хроническом гепатите С и диагностики начала фиброзных изменений в печени при хроническом гепатите В получены разрешения Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения на применение медицинских технологий: ФС № 2009/392 от 08.12.2009 г. «Способ иммунопрогнозирования цирроза печени при хроническом вирусном гепатите С» и ФС № 2010/029 от 24.02.2010 г. «Способ иммунопрогнозирования фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом В».

Положения, выносимые на защиту

1. Проведение мета-анализа состояния неинвазивной диагностики фиброза печени при хронических гепатитах В и С позволило определить основные направления их совершенствования и обосновать новый методический подход к решению проблемы с использованием иммунологических методов.

2. СБ56+ лимфоциты играют значительную роль в иммунопатогенезе хронических гепатитов В и С, специфично проявляющуюся на стадии Р1 фиброза

печени у больных хроническим гепатитом В и на стадии F3 у больных хроническим гепатитом С.

3. Специфичные изменения иммунологических показателей на стадии Fl фиброза печени у больных хроническим гепатитом В позволили разработать Иммунотест XTB/F1 для мониторингового определения дебюта фиброзного процесса.

4. Специфичные изменения иммунологических показателей на стадии F3 фиброза печени у больных хроническим гепатитом С позволили разработать Иммунотест XTC/F3 для мониторингового определения предцирротических изменений и формирования группы риска по развитию цирроза печени.

Апробация диссертации

Апробация диссертационной работы проведена на совместном научном заседании лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ и кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Московского государственного медико-стоматологического университета. Материалы диссертации доложены и обсуждены в рамках International Congress «Advances in Immunology and Allergology at the Threshold of the XXI Century», 2000 (Eilat, Israel); VII Международного конгресса по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие», 2001 (Нью-Йорк, США); IV съезда иммунологов и аллергологов СНГ, 2001 (Москва); I Съезда физиологов СНГ, 2005 (Сочи); International Symposium «Interaction of Neural and Immune Systems in Health and Disease», 2007 (Sankt-Petersburg); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению», 2010 (Москва); XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 2010 (Москва); XV Международного конгресса по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, 2010 (Дубай, ОАЭ); XXI съезда физиологического общества им. И.П.Павлова, 2010 (Москва-Калуга); XV Российской конференции «Гепатология сегодня», 2010 (Москва); II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, 2010 (Москва); 14th International Congress of Immunology, 2010 (Kobe, Japan); Межрегионального форума «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии -междисциплинарные проблемы», 2010 (Санкт-Петербург).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 29 научных работ, из них 11 в журналах, рекомендованных ВАК, 2 статьи в зарубежных изданиях, 1 решение о выдаче патента РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 238 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы по материалам и методам исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 36 таблицами, 58 рисунками, 5 клиническими примерами. Список литературы содержит 496 источников, из которых 52 отечественных и 444 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Объем, характер и методы проведенных исследований

Для решения поставленных задач проведено обследование 212 человек: в составе основных групп исследования с верифицированным диагнозом хронического гепатита В (ХГВ) — 37 больных, хронического гепатита С (ХГС) — 127 больных, в составе групп сравнения 10 пациентов с алкогольным циррозом печени и 6 больных первичным билиарным циррозом печени, в составе контрольной группы 32 добровольца - клинически здоровые лица. Пациенты наблюдались в инфекционных клинических больницах № 1 и № 2 г. Москвы, клинике пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии им. В.Х.Василенко ММА им. И.М.Сеченова, Медицинской Компании «Гепатолог» г. Самары. Включение в группы производилось в строгом соответствии с критериями включения и исключения.

Критериями включения в основные группы служили: верифицированный диагноз хронического гепатита В (НВеА§-негативного, без Б-агента) или С; отсутствие этиотропной терапии в течение последних 6 месяцев перед обследованием; наличие полученных в течение последнего месяца данных биопсии печени, положительных результатов на наличие в крови вируса гепатита В или С по данным ПЦР, а также позитивных результатов серологических исследований; возраст от 18 до 60 лет; информированное согласие на обследование. Критериями отбора в группы сопоставления являлись: наличие

верифицированного диагноза заболевания; отсутствие по результатам обследования вирусных гепатитов В и С; наличие полученных в течение последнего месяца данных биопсии печени и/или результатов эластографии печени, а также результатов гематологический и биохимических исследований крови, ультрасонографического обследования брюшной полости; возраст от 18 до 60 лет; информированное согласие на обследование. Критериями отбора в контрольную группу являлись: отсутствие каких-либо жалоб и клинико-лабораторных признаков острых и хронических заболеваний на момент обследования; отсутствие в анамнезе сведений, позволяющих причислить обследуемых к категории часто и длительно болеющих лиц, лиц с хроническими заболеваниями, с признаками инфекционно-воспалительных, аллергических, аутоиммунных, иммунодефицитных состояний; отсутствие по данным анамнеза, результатам ПЦР, серологических и биохимических исследований вирусных гепатитов В и С, других заболеваний печени; возраст от 18 до 60 лет; информированное согласие на обследование. Критерии исключения пациентов из исследования были следующие: наличие тяжелых соматических заболеваний, сопутствующих аутоиммунных заболеваний и заболеваний соединительной ткани, тяжелых заболеваний эндокринной системы, онкологических заболеваний, ВИЧ-инфекции, органических заболеваний центральной нервной системы; сочетание хронического гепатита В и С; возраст до 18 лет или старше 60 лет; отсутствие информированного согласия на обследование; нарушение больным протокола исследования.

Итоговое соотношение мужчин и женщин в сформированных группах показало некоторое преобладание числа мужчин среди обследованных лиц, при этом в двух основных группах, группах сопоставления и контрольной группе распределение по полу примерно соответствовало друг другу, а различия не превышали 9%. При анализе возрастного состава пациентов они распределялись по трем возрастным группам: 18-30 лет, 31-45 лет, старше 45 лет. Возрастной состав групп обследованных характеризовался преобладанием (на 15%) лиц среднего возраста (31-45 лет) при ХГС, а также в контрольной группе, и преобладанием (на 9-13%) возраста старше 45 лет в группах сопоставления.

Всем пациентам проводилось единое обследование, включавшее:

1. Клиническое исследование периферической крови (гемометрия) на гематологическом анализаторе фирмы «BECMAN-COULTER» (США) с определением стандартного набора показателей в составе: абсолютное число лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, абсолютное содержание гемоглобина, относительный показатель гематокрита, абсолютное и относительное число гранулоцитов, лимфоцитов, моноцитов.

2. Биохимическое исследование крови с определением общего билирубина, холестерина, мочевины, креатинина, глюкозы, общего белка, альбуминов, протромбинового индекса, а также активности аспаратаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАГ), гаммаглугамилтранспептидазы (ГГТ) и щелочной фосфатазы на биохимических анализаторах Hitachi Roche - 902 Automatic analyzer (Япония), Erba XL-600 (Германия), A-25 Bio Systems (Испания).

3. Определение в сыворотке крови маркеров вирусных гепатитов методом иммуноферментного анализа (ИФА) при помощи диагностических тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Россия), Sanofi Diagnostics Pasteur (Франция), НПО «Диагностические системы» (Россия), «La Roche» (Швейцария), др.

4. Качественное и количественное определение ДНК ВГВ и РНК ВГС в крови и определение генотипа ВГС методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с преимущественным использованием диагностических наборов ДНК-сорб, АмплиСенс-200, ЭФ-200 и РИБО-сорб, РЕВЕРТА, АмплиСенс-200, ЭФ-200.

5. Ультрасонографическое исследование органов брюшной полости по месту наблюдения пациентов на аппаратах Esaote Megas, SonoFine, GE Logiq, др.

6. Хронический гепатит В (HBeAg-негативный, без D-агента) диагностировали в случае длительности заболевания более 6 месяцев, наличия HBs антигена, анти-HBcorIgG и ДНК ВГВ в крови. Хронический гепатит С диагностировали в случае длительности заболевания более 6 месяцев, наличия анти-HCV и РЖ ВГС в крови. Диагноз цирроза печени устанавливался на основании комплексной оценки анамнестических данных, клинико-лабораторных и инструментальных показателей, в т.ч. снижения общего количества тромбоцитов, протромбинового индекса, альбумина в крови, признаков

портальной гипертензни при ультрасонографическом исследовании брюшной полости, данных эзофагогастродуоденоскопии с оценкой состояния вен пищевода и кардиалыюго отдела желудка.

7. Все пациенты основных групп были подвергнуты в стационарных условиях чрезкожной пункционной биопсии печени иглами «Hepafix» (типа Menghini) диаметром 1,2-1,6 мм по методу Менгини под местной анестезией с последующим гистологическим исследованием биоптатов, проведенным в лабораториях стационарных баз по месту наблюдения пациентов. Оценка степени (стадии) фиброза печени в биоптатах при хронических гепатитах В и С проводилась полуколичественным методом по критериям шкалы METAVIR.

8. Изучение клеточного состава крови обследуемых выполнялось посредством иммунологического лабораторного исследования венозной крови в лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний отдела клинической медицины НИМСИ МГМСУ с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) после автоматизированной пробоподготовки цельной крови с помощью моноклональных антител (МКАТ) и включало определение: (1) типовой иммунограммы, (2) субпопуляционного состава, (3) функционального состояния CD56+ клеток в крови.

При определении типовой иммунограммы проводилось изучение абсолютного и относительного числа CD45+/CD3+ клеток (общего числа Т-лимфоцитов), CD3+/CD4+ (Т-хелперов), CD3+/CD8+ (цитотоксических Т-клеток), CD3+/CD56+ (ЕКТ), CD19+ (В-лимфоцитов), CD3-/CD16+/CD56+ (естественных киллеров) при использовании стандартизированного комплекта моноклональных антител (МКАТ) BD Multitest 6-Color TBNK Reagent (BD Biosciences, США).

Определение относительного содержания субпопуляций CD56bright и CD56dim естественных киллеров (ЕК) в крови проводился методом проточной цитофлуориметрии на основе проб с меченными РЕ-Су5 anti-CD56 МКАТ (IOTest, Beckman Coulter). Относительное число субпопуляций CD4+, CD8+ и CD8-/CD4-(DN) ЕКТ лимфоцитов выявлялось с использованием комплекта МКАТ BD Multitest 6-Color TBNK Reagent (BD Biosciences, США).

Для анализа функционального состояния CD56+ клеток регистрировались уровни экспрессии на их мембране следующих маркеров: (1) килшшг-ингибирующих рецепторов (КТО.) из суперсемейства иммуноглобулинов (CD158a,h), 2) ингибирующих рецепторов суперсемейства лектинов С-типа (CD94), 3) активирующих рецепторов суперсемейства лектинов С-типа (NKG2D), 4) гликопротеидов, ассоциированных с мембраной лизосом и отражающих состояние гранулярного аппарата клетки (CD 107а), 5) рецепторов естественной цитотоксичности (NKp46), б) CD 16 рецепторов, опосредующих механизм антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦТ). Определение относительного количества CD56+ клеток, экспрессирующих все перечисленные маркеры, за исключением CD 107а, проводилось в раздельной пробе крови с использованием в каждом случае комплекта из двух моноклональных антител: меченных РЕ-Су5 anti-CD56 МКАТ и меченных РЕ специфических МКАТ (IOTest, Beckman Coulter, США). Для регистрации CD56+ клеток, несущих маркер CD 107а, производилось внутриклеточное определение данного рецептора с использованием пермабилизирующих компонентов фирмы Beckman Coulter и комплекта из двух моноклональных антител: меченных FITC anti-CD 107а МКАТ и меченных PeiCP-Cy5-5 anti-CD56 МКАТ (BD Biosciences, США).

Тестирование уровней всех классов иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG, IgE), уровней интерферона у (ИФНу), интерлейкинов 10 и 13 (ИЛ10, ИЛ13) в сыворотке крови, а также трансформирующего фактора роста р (ТФРР) в плазме крови осуществлялось методом ИФА с использованием комплекта аппаратуры (планшетный фотометр «OPSYS MR» (ридер) фирмы «THERMOLABSYSTEMS» (Финляндия), планшетный вошер ПП2-428 фирмы «ИММЕДТЕХ» (Россия), принтер «EPSON» (Япония) для раздельного определения в соответствии с инструкцией по применению аппаратуры и комплекта МКАТ.

9. Для статистической обработки данных применялись методы дискриптивной статистики, сравнение величин осуществлялось приемами непараметрической статистики с использованием критериев Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова и критерия у2 в соответствии с распределением данных. Для подтверждения информативности и диагностической значимости проведенных исследований проводился дискриминантый анализ с определением

стандартизированного канонического коэффициента дискриминантной функции (СККДФ). Определение влияния отдельных факторов на гетерогенность данных для разработанных критериальных значений на основе критерия Фишера (F) проводилось методом дисперсионного анализа. Наличие межгрупповой дисперсии устанавливалось путем расчета отношения шансов (ОШ). Соответствие чувствительности и специфичности разработанных способов иммунодиагностики стадий фиброза печени характеризовались методом линейной регрессии с построением ROC-кривой и расчетом площади под кривой - AUROC. Математическая обработка данных проводилась на основе пакета статистических программ SPSS 17.0. Мета-анализ способов неинвазивного определения стадий фиброза печени у больных хроническим гепатитом В и С осуществлялся с использованием программы Comprehensive Meta-Analyse Version 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Новый методический подход к разработке способов неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С. Для реализации поставленной цели был осуществлен системный обзор методов неинвазивного определения стадий фиброза печени для выявления основных проблем, связанных с данным направлением диагностики хронических гепатитов В и С, с последующим проведением мета-анализа данных.

В процессе проведения мета-анализа анализировалась база данных, содержащая все доступные исследования в форме рандомизированных моделей, опубликованные различными авторами за 2005-2010 гг. Предварительный отбор включал поиск данных литературы по запросам «Liver fibrosis diagnosis & chronic viral hepatitis b & с» («диагностика фиброза печени при хронических вирусных гепатитах В и С»), «Liver fibrosis noninvasive diagnosis» («неинвазивная диагностика фиброза печени»), «Noninvasive markers of liver fibrosis» («неинвазивные маркеры фиброза печени»), «Noninvasive markers of liver fibrosis & liver biopsy» («неинвазивные маркеры фиброза печени и биопсия печени»), полученных из следующих источников информации: PubMed/MedLine, Embase, Google Scholar, Cochrane library, Фонды Центральной научной медицинской библиотеки ММА им.И.М.Сеченова (ЦНМБ), Портал межбиблиотечной информации «Сигла», Библиотечный каталог российских диссертаций,

официальный сайт ФГУ ФИПС (Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам), сайт Европейского Патентного Бюро (European Patent Office). Поиск проводился среди работ, относящихся к предметным областям биологии, медико-биологических наук, медицины. Ссылки по всем отобранным источникам оценивались на соответствие предмету поиска, в частности, возможности использования неинвазивных методов диагностики фиброза печени при ХГВ и ХГС.

Для детального ознакомления с отобранными источниками нами были разработаны критерии включения данных в мета-анализ: рандомизированный характер клинического исследования; материалом для исследования служили больные хроническим гепатитом В или С в возрасте старше 18 лет без сопутствующих инфекционных заболеваний (ВИЧ, туберкулез, др.) и иммунопатологических состояний, не получавшие последние 6 месяцев противовирусного лечения; наличие сопоставления неинвазивного и инвазивного (биопсия) методов исследования печени с определением в ходе последнего стадии фиброза органа по шкале МЕТА VIR; цифровые данные, полученные неинвазивным методом, распределены по стадиям фиброза; данные подвергнуты соответствующей статистической обработке с обязательным построением ROC-кривой и указанием AUROC.

При ознакомлении с источниками литературы по предмету проведенных исследований было проанализировано 1478 публикаций, из них 1372 зарубежных и 106 отечественных источников, в том числе 41 патентное исследование. Для детального полнотекстового ознакомления было отобрано 117 источников, дальнейший анализ которых проводился в четком соответствии с критериями включения работ в мета-анализ. В результате 86 публикаций были исключены из дальнейшего анализа как несоответствующие выбранным критериям включения. В конечном итоге мета-анализ проводился на основе 31 статьи, включающих 21 проспективное исследование, выполненное как на базе одного клинического центра, так и многоцентровое, 5 масштабных ретроспективных исследований. Кроме того, были использованы данные трех обзоров литературы и двух мета-анализов.

В качестве ведущего критерия оценки эффективности неинвазивных методов диагностики использовалось соответствие чувствительности и специфичности диагностического способа в форме построения ROC-кривой на основе использования уравнения взвешенной линейной регрессии с вычислением площади под кривой - AUROC, что позволило оценить диагностическую и прогностическую значимость каждого метода, дать количественную характеристику его эффективности и сопоставить таковую с диагностической информативностью других методов. При этом, чем выше уровень соответствия чувствительности и специфичности способа, тем большей диагностической точностью характеризуется метод и тем больше площадь пространства под ROC-кривой - AUROC, а способ диагностики, у которого AUROC <0,5, не рассматривается в современной статистике в качестве диагностически и прогностически значимого [Poynard Т. et al., 2007; Zhou X., Obuchowski N., McClish D., 2002].

Мета-анализ показал, что неинвазивные методы диагностики фиброза печени, описанные на основе построения ROC-кривых и вычисления AUROC, чрезвычайно разнообразны. Для неинвазивной диагностики ХГС различными авторами было применено три варианта эластографии печени, 8 вариантов сочетания неспецифических биохимических и гематологических тестов, дыхательный тест, 7 разновидностей тестов индикации прямых сывороточных маркеров фиброза печени, предложено три специальных индекса прогнозирования фиброза. Все эти методы были рассмотрены в 18 источниках широкой географии исследования, а общее число обследованных пациентов составило 11328 человек со средним возрастом от 35 до 55 лет.

Спектр исследований, посвященных неинвазивной диагностике ХГВ, был значительно уже: в 8 литературных источниках, освещающих эту проблему, были проанализированы 9 тестов на основе неспецифических показателей, 4 варианта сочетания подобных тестов с эластографией, 1 случай использования методов прямой индикации маркеров фиброза, еще в одном - предложен специальный прогностический индекс. Всего в рамках рассмотренных исследований было обследовано 2120 пациентов ХГВ со средним возрастом от 33 до 48 лет.

В 5 исследованиях данные по неинвазивной диагностике фиброза печени у 5444 больных со средним возрастом от 35 до 54 лет описывались при хронических гепатитах В и С без разграничения последних. Эти данные касались преимущественно методов визуализации и Фибротеста, а также их комбинации.

Результаты проведенного мета-анализа наглядно отражены в виде форест-графиков средних значений и 95%-ных доверительных интервалов (95%ДИ) А1ЛЮС методов неинвазивной диагностики фиброза печени при хронических гепатитах В и С, представленных на рисунке 1. Диагностическая значимость того или иного теста предполагалась в тех случаях, когда среднее значение и 95% ДИ А1Л10С превышают величину 0,8, отмеченную на графике вертикальной линией. При этом широкий диапазон ДИ свидетельствует о низкой диагностической точности метода.

ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТ С

FM Fä2 Fä3 F4

F&1 Fä2 Fä3 F4

Fi>2 F ä 3 F4

F S 2 F £ 3 F4

Fä2 F4

-c —й

I II I I I I

0! 03 M

AUROC minus 0.50

.Методы визуализации, в т.ч эластогра-"фия

Фибротест/ Актитест

APRI / AAR

Индексы на основе рутинных биохимических; гематологических показателей

Прямые маркеры фиброза

а)

ХРОНИЧЕСКИИ ГЕПАТИТ В

FS2 F23 F4

FM F £ 2 F £ 3 F4

F22 F£3 F4

F £ 2 Fä3

F22 F>3 F4

-L-

аз оз м AUROC minus 0.50

Методы визуализации, в т.ч. эластогра-фия

Фибротест / Актитест

АРР1/ АЭРи!

Индексы на основе рутинных биохимических/ гематологических показателей

-О- Комбинированные ме-I_ тоды

0.5

б)

Рис. 1. Форест-график AUROC методов неиивазивеиой диагностики хронических гепатитов С (а) и В (б)

Мета-анализ прогностического значения неинвазивных методов диагностики ХГС (рисунок 1а) показал, что наиболее эффективный диагностический прием при определении степени фиброза печени - транзиентная эластография и другие методы визуализации, диагностическая значимость которых нарастала по мере развития фиброзных изменений от стадии Б1 к циррозу печени (Р4). Диагностическое значение других распространенных приемов неинвазивной диагностики на основе прямых и непрямых сывороточных маркеров фиброза, по данным большинства исследователей, имели при ХГС достаточную степень информативности лишь на стадиях значимого фиброза печени (>Р2) и, особенно, при циррозе.

При ХГВ (рисунок 16) диагностическая значимость широко используемых неинвазивных методов была значительно ниже и проявлялась, как правило, на поздних этапах фиброзного процесса. С этой точки зрения наиболее оправданным при данном заболевании было применение комбинации эластографии печени с другими тестами (Фибротестом, Актитестом, АРЫ, др.), что продемонстрировано авторами в виде высоких значений А1ЖОС и относительно узким диапазоном 95%ДИ уже начиная со стадии фиброза

Таким образом, мета-анализ, проведенный на большом массиве научных данных, позволил выявить основные проблемы неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С. Так, современные неинвазивные методы диагностики фиброза печени не всегда позволяют четко регистрировать стадии фиброзного процесса, что было бы очень важно с точки зрения адекватной терапии указанных заболеваний. Регистрация начальных фиброзных изменений в печени встречалась исключительно редко (чаще диагностировалось наличие фиброза в целом - Р>1) и распространялась при ХГС только на эластографию печени, а при ХГВ на воспроизведение Фибротеста/Актитеста при низких значениях А1ЖОС. Значимый фиброз печени (Р>2) охарактеризован на уровне неинвазивных методов диагностики достаточно полно и рассмотрен практически во всех источниках литературы. Несколько меньше внимания исследователи уделяли прогностической значимости на уровне А1ЖОС при выраженном фиброзе (Р>3) и циррозе (Б4) печени. При этом, начиная со стадии Р2, соотношение чувствительности и специфичности методов

проявлялось примерно на одинаковом уровне. Кроме того, существующие способы, основанные на определении визуальных и сывороточных маркеров фиброза, регистрировали, как правило, количественное нарастание фиброзных изменений, в чем значительно «проигрывали» биопсии печени, при которой в ходе гистологического исследования отмечались качественные морфологические сдвиги. Обращал на себя внимание и тот факт, что среди методов неинвазивной диагностики фиброза печени на уровне глубокой статистической проработки практически не были представлены способы, основанные на учете иммунологических данных. Возникал вопрос о принципиальной возможности регистрации качественных иммунологических сдвигов в соответствии со стадиями фиброза печени при ХГВ и ХГС, оценить которую было решено при изучении типовых иммунограмм пациентов основных групп. При этом иммунологическое обследование больных хроническими гепатитами В и С проводилось в строгом соответствии со стадиями фиброзных изменений в печени по шкале МЕТА VIII.

Первую группу обследования составили 37 больных ХГВ, среди которых по данным пункционной биопсии печени отсутствие фиброза (БО) диагностировано у 4-х больных (10,8%), начальная стадия фиброзных изменений в печени (Б1) у 16 больных (43,2%), умеренный фиброз (Б2) у 5 пациентов (13,6%), выраженный (РЗ)

- у 3 (8,1%), цирроз печени (Б4) - у 9 (24,3%). В связи с малочисленностью группы на стадии РЗ, значительно снижающей возможность статистической обработки данных, группы больных ХГВ на стадиях Б2 и БЗ были объединены в единую группу Б2-Р3 в составе 8 человек. Также под нашим наблюдением находилось 127 больных ХГС с различной выраженностью фиброзных изменений в печени: 14 больных (11,0%) с отсутствием фиброза печени - стадия Р0; 56 больных (44,1%) со стадией фиброза Р1; 12 (9,4%) больных - Р2; 9 больных (7,1%)

- РЗ; 36 больных (28,4%) со стадией фиброза Р4. Контрольную группу составили 32 клинически здоровых человека.

Типовое иммунологическое обследование больных ХГВ и ХГС оказалось малоинформативным для разработки критериев перехода одной стадии фиброза в другую, однако оно показало, что характер иммунного реагирования различен на разных стадиях фиброзного процесса, и отчасти подтвердило возможное участие

СБ56+ клеток в фиброгенезе в целом, а естественных киллеров — ЕК (СБ16+/СВ5б+) в развитии цирроза печени, в частности.

Кроме того, именно на основе типового иммунологического обследования в совокупности с результатами мета-анализа был сформирован новый методический подход к разработке способов неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С. Основу нового методического подхода составляло положение о том, что при данных заболеваниях иммунные механизмы принимают непосредственное участие в формировании фиброзного процесса, по мере развития которого происходит смена ключевых ролей отдельных компонентов иммунной системы. В число положений нового методического подхода входили также тезисы о том, что иммунологические сдвиги, сопровождающие фиброз печени при хронических вирусных гепатитах, проявляют высокую степень зависимости от стадии фиброзного процесса и различны при ХГВ и ХГС, а среди компонентов иммунной системы одну из ключевых ролей в формировании фиброзных изменений в печени играют СБ56+ клетки (естественные киллеры и ЕКТ). Соответствие функционального состояния последних стадиям фиброзного процесса потребовало углубленного изучения.

Последующее углубленное исследование СЮ56+ лимфоцитов у больных хроническими гепатитами В и С в соответствии со стадиями фиброза печени проводилось одновременно на нескольких уровнях: путем определения субпопуляционного состава этих клеток, регистрации уровня экспрессии ими ингибирующих и активирующих рецепторов, маркеров гранулярного аппарата, а также путем выявления уровня секреции регуляторных цитокинов, способных определять как функциональное состояние этих клеток, так и развитие фиброзных изменений в печени - ИФНу, ТФРР, ИЛ10 и ИЛ13.

Обоснование нового методического подхода к разработке способа неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных ХГВ. Анализ показателей экспрессии рецепторов функционального состояния СБ56+ лимфоцитов в крови больных ХГВ продемонстрировал динамическое изменение способности данных клеток к проявлению цитотоксических свойств на разных стадиях фиброза печени. Кроме того, в процессе проведения углубленных

иммунологических исследований у больных ХГВ удалось подтвердить предположение о четком соответствии характера иммунологических сдвигов отдельным стадиям фиброзного процесса. При этом наиболее характерные изменения со стороны СБ56+ клеток наблюдались на стадии фиброза И, а 5 из набора тестированных параметров могли иметь критериальное значение в идентификации данной стадии в определенном диапазоне величин. К их числу принадлежали содержание в крови СОЗ+/СБ8+ клеток (Тцтл); С04+ и СБ8+ субпопуляций ЕКТ (СБЗ+СВ56+); число СБ56+ клеток, экспрессирующих рецептор естественной цитотоксичности - №Ср46+; уровень ТФРр. Стойкое повышение уровня последнего в крови больных ХГВ относительно контроля сопровождало развитие фиброзных изменений в печени на всех стадиях, что согласовывалось с профиброзным действием данного цитокина по данным литературы [Галимова С.Ф. и др., 2001; Пинцани М., 2002].

Интересно, что информативность 4 из 5 показателей как критериальных значений была установлена с использованием дискриминантного анализа и не выявлялась при общепринятом статистическом подходе. Оказалось, что практически все эти показатели, кроме содержания моноцитов и уровня ТФРр, на стадии И давали два варианта отклонения: в сторону повышения и в сторону снижения, что не улавливалось при анализе средних величин (рисунок 2).

»О .

"/О

7 а •

¡.о | о I

• -•*-. С03+/С08+ * СОЗ+/СВ5в«/СР4~«-

—♦ -С03+/С05в+/С08+ ■ С0Б6ч/С016+/ПКрП6

Рис. 2. Разнонаправленные сдвиги величин критериальных параметров стадии фиброза печени 1 у больных хроническим гепатитом В

На следующем этапе исследования выяснялось, могут ли критериальные

показатели из числа иммунологических параметров при ХГВ быть дополнены

другими клинико-лабораторными данными, полученными в ходе опроса,

физикалыюго осмотра пациентов, а также общеклинических (гематологических и биохимических) исследований крови.

Таблица 1. Частота встречаемости основных клинических симптомов на разных стадиях фиброза печени у больных хроническим гепатитом В

Клинические проявления Частота встречаемости на стадиях фиброза (%) Р

РО И Р2 РЗ Р4

Общая слабость 75,0 81,2 80,0 66,7 88,9 0,584

Повышенная утомляемость 50,0 56,2 60,0 66,7 66,7 0,657

Нарушение сна 0 0 40,0 33,3 44,4 0,083

Снижение аппетита 25,0 18,8 20,0 0 33,3 0,129

Суставные, мышечные боли 25,0 12,5 20,0 33,3 22,2 0,762

Чувство тяжести в правом подреберье 50,0 31,2 40,0 66,7 77,8 0,498

Диспепсия (тошнота, боли в животе, диарея, др.) 25,0 18,8 40,0 33,3 55,6 0,417

Кожный зуд 0% 12,5% 20,0% 0% 22,2% 0,145

Кровоточивость десен, слизистой носа 25,0% 25,0% 60,0% 66,7% 88,9% 0,066

«Печеночные знаки» на коже 25,0% 31,2% 60,0% 66,7% 88,9% 0,093

Гепатомегалия 50,0% 43,8% 80,0% 66,7% 100% 0,056

Спленомегалия 25,0% 18,8% 20,0% 33,3% 44,4% 0,724

Плотность печени при пальпации 25,0% 31,2% 60,0% 66,7% 100% 0,062

Клинические проявления ХГВ (таблица 1) ограничивались набором преимущественно неспецифических жалоб и физикальных данных, не предоставляющих возможность дифференцировать значимые фиброзные изменения в печени с их отсутствием. В перечень представленных симптомов намеренно не включались признаки верификации диагноза цирроза печени, поскольку они не могут быть применены для характеристики фиброзного процесса в целом. Стадия фиброза Р4 была наиболее богата симптоматикой, тем не менее, статистическое сопоставление частоты встречаемости отдельных симптомов на различных стадиях фиброза печени (с использованием критерия х) не позволило установить достоверность (р<0,05) клинических различий.

Комплексный анализ гематологических сдвигов у больных ХГВ, включавший определение стандартизированного канонического коэффициента дискриминантной функции (СККДФ), дополнил перечень информативных

параметров относительным содержанием моноцитов в крови. Данный показатель демонстрировал достоверные различия между группами больных ХГВ при их распределении в соответствии со стадиями фиброза печени и, таким образом, претендовал на роль прогностического критерия прогрессирования фиброза с переходом от одной стадии к другой. Биохимические показатели, несмотря на многочисленные отклонения от контроля, не показывали достоверных различий между группами обследованных, что определило их низкую информативность для диагностики стадий фиброза печени у больных ХГВ.

Анализ частоты встречаемости диапазонов каждого из информативных показателей на различных стадиях фиброза печени у пациентов ХГВ позволил подтвердить особую диагностическую значимость шести отобранных параметров только для начальной стадии фиброза печени (И), поскольку каждый из отмеченных критериальных признаков регистрировался не менее чем у 81,2% больных. При анализе стадия фиброза БО была принята нами за исходную сравнительную позицию условного мониторинга больного, а принципом отбора того или иного признака в качестве диагностического критерия служила относительно высокая (не менее 80%) частота регистрации критериальных значений показателя в исследуемой группе. В ходе анализа сопоставлялись диапазоны значений (минимум-максимум) показателей каждой последующей стадии по отношению к предыдущей, что позволило выделить такие критериальные значения параметра, которые не были зафиксированы на предыдущей стадии, а также установить частоту их встречаемости в каждой группе.

Таким образом, углубленное изучение субпопуляционного состава и функциональной активности СБ56+ клеток (ЕК и ЕКТ) крови показало возможность формирования набора критериальных признаков для иммунодиагностики, в первую очередь, начальных фиброзных изменений в печени (И) при ХГВ. Было установлено 6 критериальных признаков для регистрации Р1 стадии фиброза печени у больных ХГВ в виде диапазона значений показателей с частотой встречаемости выше 70%, не регистрируемых на других стадиях. Итоговая шкала критериев иммунодиагностики стадии И фиброза

печени у больных ХГВ, названная нами Иммунотеетом ХГВ/Р1, представлена на таблице 2.

Таблица 2. Шкала критериев иммунодиагностики стадии 1 фиброза печени у больных хроническим гепатитом В

Критериальные параметры Диапазон критериальных значений Частота регистрации

ниже: выше:

Моноциты, % 3,6% - 81,2%

С03+/С08+, % 19,6% 30,8% 100%

С03+/С056+/С1Э4+, % 2,9% 9% 87,5%

С03+/С056+/С08+, % 71,8% 82,4% 81,2%

С056+/МСр46+, % 35% 62% 100%

ТФРР, пг/л - 10,3 пг/л 93,8%

Обоснование нового методического подхода к разработке способа неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных ХГС.

На следующем этапе наших исследований апробация нового методического подхода к разработке Иммунотестов для неинвазивного определения стадий фиброза печени была произведена на основе оценки патогенетического значения СБ56+ лимфоцитов у больных ХГС. Уровни исследования С056+ клеток при ХГС соответствовали таковым при ХГВ. Посредством углубленного изучения состояния популяции этих клеток на разных стадиях фиброза печени при ХГС были выявлены наиболее значимые сдвиги в их составе (рисунок 3).

На данном этапе работы нами были установлены достоверные различия между стадиями фиброзных изменений в печени по ряду тестированных параметров. Наибольшие отклонения касались роста доли субпопуляции СБЗ+/СБ56+/СБ4+ ЕКТ, снижения экспрессии СБ94+ рецептора на поверхности ЕК клеток и маркера цитотоксических гранул СБ 107а, падения уровня ТФР(3 в крови больных на 3-й стадии фиброза в сравнении с предыдущей стадией, и снижения продукции ИЛ-10 на протяжении стадий Р1 - РЗ. Значимые изменения субпопуляций ЕКТ (СВЗ+/СБ56+/СВ4+ и СОЗ+/СВ56+/СБ8+) и показателей функциональной активности С056+ клеток (экспрессии №СС21) и СБ 107а) проявлялись также на стадии фиброза печени Р4 в сравнении со стадией РЗ. Эти данные вызывали особый интерес с позиций декларируемого нами подхода к разработке Иммунотестов, а наибольшего внимания с этих позиций заслуживала

стадия фиброза БЗ, иммунологические сдвиги при которой требовали дальнейшего изучения роли СБ56+ клеток в прогрессировании фиброза на этапах И2—>БЗ и РЗ—>Р4.

ИФНу

ТФРРйО-!,

СРЗ+.абс.

С03+/С04+,%

С03+/С04+,а... С03+/С08+,% ;. С03+/С08+,а... СРЗ+/С056+,%

С03+/С05б+/„.

С034/С056+/...

С03+/С056+/-.-

-яо

•

£2

-рз

---Р4

Рис. 3. Астрограмма соответствия иммунологических данных стадиям фиброза печени у больных хроническим гепатитом С

Далее нами устанавливалось диагностическое значение возможных дополнительных критериальных параметров из перечня клинических симптомов, состава гемограмм и биохимических тестов.

Характеристика клинических проявлений ХГС у наблюдаемых больных по перечню симптомов соответствовала таковой при ХГВ. Анализ частоты встречаемости основных клинических признаков в соответствии со стадиями фиброза печени показал, что на стадии Б4 отчетливо прослеживается тенденция к более частой регистрации отдельных симптомов. Эта тенденция принимала статистически достоверный характер только по двум признакам из 13 - (1) кровоточивости десен и слизистой носа и (2) плотности печени при пальпации. Попытка статистически сопоставить частоту встречаемости этих симптомов,

исключая стадию Р4, достоверности различий не продемонстрировала (р = 0,286 и 0,429, соответственно).

Комплексное исследование гематологических и биохимических изменений при ХГС в зависимости от стадии фиброза печени выявило значимое число достоверных различий между группами обследованных больных, однако попытка установить информативность этих отклонений для дифференциации отдельных стадий фиброза печени с помощью дискриминантного анализа, показала довольно низкие (<0,3) значения СККДФ, что позволяет считать использованные в исследовании гематологические и биохимические параметры непригодными на роль критериальных признаков отдельных стадий фиброза печени у больных хроническим гепатитом С.

На следующем этапе работы посредством дискриминантного статистического анализа были выявлены иммунологические параметры, претендовавшие на статус информативных критериев фиброгенеза. Наибольшую значимость имели такие параметры как доля СИ56+ клеток, экспрессирующих ККр46 рецептор, относительное содержание В-лимфоцитов (СБ45+/СВ19+) и ЕКТ (СОЗ+/СБ56+) в крови, число ЕК, лишенных способности к АТЗЦТ (СБ 16-) и экспрессирующих маркер цитотоксических гранул (СО 107а), то есть преимущественно показатели функциональной активности СБ56+ клеток крови.

Для выявления конкретного диагностического и прогностического значения отмеченных информативных параметров анализировалась частота встречаемости диапазонов значений каждого из них на разных стадиях фиброза печени у больных ХГС по принципам, описанным выше для ХГВ. В итоге в качестве информативных показателей крови больных ХГС были отобраны девять признаков. При дальнейшем исследовании наиболее значимые сдвиги тестированных параметров были выявлены на 3-й стадии фиброзных изменений в печени (БЗ), что позволило перевести их в разряд критериальных, отличающих данную стадию фиброза печени при ХГС, и объединить в шкалу для иммунодиагностики данной стадии фиброза печени у больных ХГС, названную нами Иммунотестом ХГС/РЗ (таблица 3).

Таблица 3. Шкала критериев иммунодиагностики стадии 3 фиброза печени у больных хроническим гепатитом С (Иммунотест ХГСЖЗ)

Критериальные параметры Диапазон критериальных значений Частота регистрации

ниже: выше:

СОЗ+/ СЭ56+, % - 3,7% 100%

СБЗ+/ С056+, абс. - 0,08*107л 88,9%

СЭЗ+/С056+/С04+, % - 23,8% 100%

С03+/С056+/С08+, % 47,6% 66,7% 100%

Сй56+/ С094+, % 46,7% 62% 100%

С056+/ ЫКС21Х-, % 95,9% 98,4% 100%

С056+/ ЫКр46+, % 28,9% 40,5% 100%

С056+/СШ07а+,% 98,2% - 100%

ТФРр, пг/л 11,0пг/л - 100%

Таким образом, в процессе анализа удалось отобрать критериальные признаки 3-й стадии фиброзных изменений в печени при ХГС, что позволило с большой долей вероятности прогнозировать риск развития цирроза печени. Все отобранные критерии выявлялись при углубленном иммунологическом тестировании крови и имели четкие диапазоны значений, позволявшие проводить их диагностическую оценку.

Способ оценки Иммунотестов для неинвазивной диагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С и влияние на его результаты эпигенетических факторов. Апробированный на предыдущих этапах исследования новый методический подход не только позволил разработать критерии иммунологической диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С, но и создал предпосылки для получения на основе этих критериев оригинальных неинвазивных способов определения некоторых стадий фиброзных изменений в печени при названных заболеваниях -Иммунотестов ХТВЯЧ и ХГС/БЗ, а также сопоставить эти способы с другими схожими по целям диагностическими приемами с использованием мета-анализа.

Для осуществления последнего потребовалось уточнить способ оценки результатов иммунодиагностики по отобранным критериям в соответствии с исследованиями других авторов, а также охарактеризовать гетерогенность полученных данных путем выявления их зависимости от отдельных эпигенетических факторов, входящих в индивидуальную характеристику каждого

пациента и способных повлиять на особенности течения у него фиброзного процесса при хронических гепатитах В и С.

При разработке способа оценки результатов Иммунотестов ХГВЛ?1 и ХТС/ТЗ была предпринята попытка создания для этого шкалы баллов. Попытка определения весового коэффициента для каждого показателя с помощью регрессионного анализа успеха не принесла, в то время как соответствие каждого индивидуального показателя иммунограммы у больного диапазону значений одного из критериальных признаков, оцененная в 1 балл, оказалась весьма эффективной. При этом максимальная оценка Иммунотеста ХТВЯЧ составляла по числу критериальных признаков 6 баллов, а Иммунотеста ХГС/РЗ - 9 баллов.

Влияние таких эпигенетических факторов как пол, возраст пациента, уровень вирусной нагрузки и генотипический вариант ВГС на диагностическое значение Иммунотестов при хронических гепатитах В и С оценивалось посредством дисперсионного анализа (Р-тест) с определением критерия Фишера и соответствующего ему р неоднородности (при р неоднородности <0,05 группа больных с наличием того или иного признака считалась гетерогенной). Помимо этого, было проанализировано отношение шансов (ОШ) в разных подгруппах для характеристики межгрупповой дисперсии.

Дисперсионный анализ влияния различных факторов на оценку тестов в баллах ни в одной группе больных хроническими вирусными гепатитами не выявил гетерогенности тестируемых критериальных показателей по половому или возрастному признаку, уровню вирусной нагрузки и генотипу ВГС. Что касается деталей определения влияния уровня вирусной нагрузки, то по нашим наблюдениям у больных ХГВ регистрировалась преимущественно низкая вирусная нагрузка (<10000 копий/мл), за исключением 1 случая умеренной нагрузки (от 10000 до 100000 копий/мл) на стадии фиброза Б4, которая не влияла на достоверность различий показателей. Что касается ХГС, то низкая вирусная нагрузка (менее 2000000 копий/мл) преобладала на всех рассматриваемых в данном разделе стадиях, а «не 1Ь» генотип выявлен только у 6 из 127 пациентов, что также не сопровождалось влиянием на достоверность наблюдаемых различий.

Таким образом, оценка критериальных признаков в баллах оказалась наиболее рациональным способом определения отдельных стадий фиброза печени

у больных хроническими гепатитами В и С и позволил рассчитать относительные шансы (ОШ) соответствия полученных данных целям исследования. В целом, ОШ без учета пола колебались от 0,93 до 1,05 для Б1 стадии ХГВ и от 0,89 до 1,33 для РЗ стадии ХГС, что позволяет предполагать значение общей оценки разработанных Иммунотестов ХГВ/Р1 и ХГС/РЗ в баллах как достоверных способов неинвазивной иммунодиагностики названных стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С.

Следующий этап исследований предполагал проведение расширенного многокомпонентного статистического анализа диагностической эффективности Иммунотестов ХГВ/Р1 и ХГС/РЗ в соответствии с их оценкой в баллах. Статистическая обработка проводилась в четырех основных направлениях: (1) подсчет количества удовлетворяющих критериям баллов для каждой группы пациентов (из расчета один признак равен одному баллу); (2) вычисление в каждой группе обследования 95% доверительного интервала (ДИ) оценки Иммунотестов в баллах; (3) оценка достоверности различий 95%ДИ в разных группах по сравнению с диагностируемой стадией с использованием критерия Колмогорова-Смирнова; (4) определение чувствительности и специфичности метода по доле ложнопозитивных тестов в группах сопоставления и ложнегативных тестов при сравнении с контрольной группой.

Иммунотест ХГВ/И как неинвазивный способ иммунодиагностики начала фиброзных изменений в печени у больных хроническим гепатитом В. На рисунке 4 продемонстрировано сопоставление статистически рассчитанных 95%ДИ, как наиболее вероятных диапазонов значений Иммунотеста ХГВ/Р1, для оценки разных стадий фиброза печени у больных ХГВ и у пациентов групп сопоставления (больных ХГС, алкогольным циррозом печени, первичным билиарным циррозом печени). Сравнительный анализ Иммунотеста ХГВ/Р1 по 95%ДИ подтвердил его достоверное отличие (в сторону повышения) от аналогичных интервалов во всех других клинических ситуациях, при этом ни в одной другой группе сопоставления показатель 95% ДИ не достигал нижней границы такового на стадии Р1 при ХГВ.

Баллы в

Стадии FO Fl F2/3 F4 FO Fl F2 F3 F4 Цирроз v- -■> к__>

—v

хгв

"xfxT

алко- первичн. голь- били-ный аоный

Рис. 4. 95%ДИ оценки в баллах стадий фиброза печени при различных заболеваниях с помощью критериев Иммунотеста XTB/F1

Благодаря указанным обстоятельствам, Иммунотест XTB/F1 характеризовался довольно высокой чувствительностью, специфичностью, диагностической точностью и прогностической ценностью положительного результата. В соответствии с данными Altman D.G., Bland J.M. [1994] за чувствительность способа диагностики принималась доля позитивных результатов теста в группе больных; за специфичность способа — доля негативных результатов теста в группе здоровых лиц; диагностическая точность предусматривала определение доли истинных результатов теста среди исследуемой популяции; наконец, прогностическая ценность положительного результата рассчитывалась с учетом чувствительности, специфичности теста и распространенности диагностируемого патологического состояния среди исследуемой популяции.

Иммунотест ХГВ/Fl проявил очень высокую чувствительность (100%), специфичность на уровне 91% и диагностическую точность 92%. Рассчитанная с учетом приведенных показателей прогностическая ценность положительного результата Иммунотеста ХГВ/Fl была максимальной, достигая 100%. Все это в совокупности позволяет дать Иммунотесту ХГВ/Fl довольно высокую оценку.

На рисунке 5а представлена ЯОС-кривая и значения АШ.ОС при использовании Иммунотеста ХГВ/П у больных ХГВ на диагностируемой стадии фиброза печени. Показатель А1ЖОС, равный 0,978, подтверждает высокий уровень соответствия чувствительности и специфичности, а также диагностической точности Иммунотеста ХГВ/И на начальной стадии фиброзных изменений в печени (Р1) при ХГВ. В то же время на других стадиях диагностическая точность Иммунотеста ХГВ/П находилась за пределами положительной оценки (<0,5). Прогностическая ценность предложенного теста позволила отнести его качество по величине А1ЖОС (>0,90) в разряд «отличных» неинвазивных методов диагностики фиброза печени [Павлов Ч.С. и др., 2007].

Кроме того, проведенный статистический анализ предлагаемого способа иммунодиагностики позволил уточнить алгоритм определения начальной стадии фиброза печени (И) у больных ХГВ, который складывался из нескольких этапов, подробным образом описанных в разделе практических рекомендаций.

ROC Curve

Specificity

AUROC = 0,978

ROC Curve

F3 Specificity

AUROC = 0,993

Рис. 5. ШЭС-кривые оценки в баллах Иммунотестов: ХГВ/П на 1-й стадии фиброза печени у больных ХГВ (а), ХГС/РЗ на 3-й стадии фиброза печени у больных ХГС (б)

Иммуиотест ХТС/Ю как иеиивазивиый способ иммунодиагностики начала фиброзных изменений в печени у больных хроническим гепатитом С.

Анализ диагностического значения Иммунотеста ХТС/ТЗ проводился путем сопоставления статистически рассчитанных диапазонов значений 95%ДИ на

стадии фиброза печени РЗ при ХГС и при других патологических состояниях (рисунок 6). Группами сопоставления в данном фрагменте исследования служили больные с другими стадиями фиброза печени при ХГС, с различными стадиями фиброза печени при ХГВ и циррозами печени невирусной этиологии (алкогольный, первичный биллиарный). Как показывает рисунок, балльная оценка на 3-й стадии фиброза при ХГС по 95%ДИ достоверно превышала таковую во всех других группах сопоставления. При этом разрыв между нижней границей 95%ДИ для Иммунотеста ХГС/РЗ, использованного по назначению - на стадии РЗ у больных ХГС, и балльной оценкой этого способа тестирования на других стадиях этого же заболевания и при другой патологии печени был довольно велик. Диагностически значимая величина 95%ДИ составляла 8,15 - 8,96 и довольно специфично указывала на наличие у больного ХГС стадии РЗ фиброза печени, причем в 100% случаев.

Баллы ю ■ 8 ■ 6. 4 ■

1 '1 ± т ф Ш 11

2' о ■ 1 1

-2

Стадии ИО Р1 Б2/3 Р4 БО V. У V. Р1 ¥2 БЗ ¥4 Цирроз

V ХГВ ХГС голь- били-ный арный

Рис. 6.95% доверительные интервалы оценки в баллах разных стадий фиброза при хронических заболеваниях печени с помощью критериев для Ю у больных хроническим гепатитом С

Отмечено было также выраженное расхождения критериальных признаков у больных ХГС на стадии фиброза Р2 с критериями ХГС/РЗ. На этой стадии Иммунотест ХГС/РЗ показывал минимальный интервал, также значительно

отличавшийся от такового в группах сопоставления, что создавало в перспективе возможности мониторингового определения прогрессирования фиброза печени на этапе Р2—Столь же высокое диагностическое значение приобретало падение 95%ДИ при переходе стадии предцирротических изменений (РЗ) в стадию Р4.

Диагностическая информативность Иммунотеста ХГС/РЗ при оценке > 8 баллов была очень высокой: чувствительность и прогностическая ценность положительного результата были максимальными - около 100%, а специфичность и диагностическая точность составляли 98 и 99%, соответственно.

ЯОС-кривые в случае применения Иммунотеста ХГС/РЗ в отношении всех стадий данного заболевания подтвердили наибольшую прогностическую ценность, чувствительность и специфичность (А1ЛЮС=0,993) предложенного способа иммунодиагностики для стадии фиброза РЗ при ХГС (рисунок 56) и позволили оценить его качество как отличное. На других стадиях фиброзного процесса в печени, взятых в данном случае у больных ХГС для сравнения, указанные критерии не являлись диагностически и прогностически значимыми.

Алгоритм определения стадии РЗ фиброза печени у больных ХГС с помощью Иммунотеста ХГС/РЗ, разработанный в ходе статистического анализа предлагаемого способа иммунодиагностики, представлен в разделе практических рекомендаций.

Использование Иммунотеста ХГС/РЗ для определения у больных ХГС стадии предцирротических изменений является высокоэффективным приемом неинвазивной диагностики фиброза печени и позволяет в процессе мониторинга иммунологических данных больных сформировать группу риска развития цирроза печени, что чрезвычайно важно при данном заболевании. Кроме того, данный фрагмент исследования создал возможность использования полученных нами данных для сравнения с исследованиями способов неинвазивной диагностики, рассматриваемых другими авторами, в процессе мета-анализа.

Мета-анализ неинвазивной диагностики фиброза печени при хронических гепатитах В и С с учетом собственных данных. Только в трех публикациях, отражающих результаты научных изысканий, проведенных другими авторами в исследуемой нами области, удалось найти сведения о соответствии данных биопсии по стадиям фиброза печени неинвазивным методам диагностики.

Именно эти данные были сопоставимы с результатами собственных наблюдений (рисунок 7).

F1 F2 F3 F4

F1-Û-

F2-

F3 F4

ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТ С

Павлов Р.С.,

2008. Тран-

зиентная

эластография

F1-0-

F2-

F3 F4

FHJ-F2 F3 F4

F1-0-

F2-1

F4-

ТТТ

II I I I i И II II

Коновалова О.Н., 2009 Транзиентная эластография

Poynard Т., 2007

Фибротест

Малова Е.С. . 2010 "V" Иммуно-m ест Xrc/F3

Малова Е.С., 2010

Forns index

Малова Е.С., 2010 FIB-4

Малова Е С., _2010

APRI

Малова Е.С.,

2010

AAR

I II M I

DJ 0.2 0.3 0.4 0.5

AUROC minus 0.50

ХРОНИЧЕСКИИ ГЕПАТИТ В

F1 F2 F3 F4-

F2_

F4-+-

F1-0-F2 _ FS"^ F4-

-Ш-

I I I I I I II M I I

Коновалова O.H., 2009 Транзиент-■ ная эласто-графия

Poynard Т., 2007

Фибротест

-ф- Малова Е.С., 2010 Иммуно-тест ХГВ/FI

Il I I I

0.1

0.2 0.3 0.4

AUROC minus 0.50

Малова Е.С., 2010 Forns index

Малова ЕС., 2010 APRI

Малова ЕС., 2010 AAR

0.5

б)

Рис. 7. Форест-график AUROC с учетом собственных данных при ХГС (а) и ХГВ (б)

Довольно весомым и диагностически точным представляется исследование, проведенное Ч.С.Павловым и др. [2008], по оценке транзиентной эластографии печени при ХГС. Уже на стадии фиброза F1 значения AUROC были довольно высоки (0,90), хотя и имелся более значительный, чем на остальных стадиях

диапазон 95%ДИ. На 2-й и 3-й стадиях фиброза печени диагностическая точность метода в значениях AUROC была примерно одинаковой и несколько выше, чем на стадии F1. Наиболее высокая диагностическая точность эластографии достигалась на стадии фиброза печени F4, что в полной мере соответствует клиническому опыту применения этого метода.

Данные О.Н.Коноваловой [2009] по использованию этого же метода при ХГС были менее точными, поскольку характеризовались очень большим интервалом 95%ДИ. Следующее довольно объемное по массиву данных исследование было выполнено T.Poynard et al. [2007] и посвящено диагностическому значению Фибротеста. По величине и 95% ДИ AUROC оно было примерно одинаковым на разных стадиях фиброза печени, а средние значения показателя колебались в пределах 0,64-0,66, то есть были относительно невысоки. Полученные нами данные по Иммунотесту XTC/F3 принципиально отличались от характера оценки других методов. На стадиях Fl, F2 и F4 значения AUROC были чрезвычайно низки, но на стадии F3 фиброза уровень соотношения чувствительности и специфичности метода (AUROC=0,993) были значительно выше, чем при других методах (рисунок 7а). Проведенное нами сравнение по величине AUROC Иммунотеста XTC/F3 с различными индексами на стадии фиброза печени F3, определенными нами в ходе собственных исследований, также показало преимущество тестируемого способа диагностики.

Таким образом, Иммунотест XTC/F3 имеет относительно узкую область применения - для диагностики стадии предцирротических изменений F3 при ХГС, но именно благодаря этому обстоятельству предлагаемый нами способ обладает чувствительностью и специфичностью около 100% и может использоваться с прогностической целью - для отнесения больных ХГС в группу риска по развитию цирроза печени.

Иммунотест ХГВ/Fl (рисунок 76) продемонстрировал уникально высокую диагностическую точность на стадии начала фиброзных изменений в печени (F1) при ХГВ и по средним значениям AUROC значительно опережал другие методы. На стадиях F2-F3 величины и 95%ДИ AUROC снижались ниже 0,8 и практически утрачивали свое диагностическое значение на стадии F4.

Следовательно, мета-анализ подтвердил выраженную

конкурентоспособность Иммунотеста ХГВ/Fl по сравнению с наиболее часто применяемыми методами неинвазивной диагностики фиброза печени при ХГВ. Рекомендуемый набор критериальных признаков и диапазонов их значений, оцененный в баллах, позволяет с высокой диагностической точностью установить начало фиброзных изменений в печени, что является актуальной диагностической задачей при данном заболевании.

ВЫВОДЫ

1. Основу нового методического подхода к разработке способов неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С составляет положение о непосредственном участии иммунных механизмов в формировании фиброзных изменений в печени, по мере развития которых происходит смена ключевых ролей отдельных компонентов иммунной системы, а иммунологические сдвиги проявляют высокую степень зависимости от стадии фиброзного процесса и различны при хронических гепатитах В и С.

2. Целесообразность нового методического подхода к оценке фиброзных изменений в печени у больных хроническими гепатитами В и С подтверждена в ходе собственных исследований данными мета-анализа современного состояния неинвазивной диагностики указанных заболеваний, а также результатами изучения типовых иммунограмм на разных стадиях фиброза печени.

3. Роль одного из ведущих компонентов иммунной системы в развитии дебюта фиброзных изменений в печени при хроническом гепатите В и стадии предцирротических изменений в печени при хроническом гепатите С выполняют CD56+ лимфоциты (естественные киллеры и ЕКТ) различных фенотипов.

4. К числу неизвестных ранее особенностей патогенеза ХГВ, максимально выраженных в дебюте фиброзного процесса в печени (стадия фиброза FI), принадлежат: дисбаланс в соотношении CD4+ субпопуляции ЕКТ, обладающей способностью регулировать соотношение Тх1/Тх2, и CD8+ ЕКТ с супрессорной активностью; падение экспрессии активирующих лектиновых рецепторов (NKG2D); дискоординация экспрессии рецептора естественной цитотоксичности

(>1Кр46); рост содержания в крови ТФРр; дихотомия со стороны численного состава цитотоксических Т-клеток, падение числа моноцитов в крови.

5. Иммунопатогенетические особенности хронического гепатита С, связанные с функциями СБ56+ клеток и максимально выраженные на стадии фиброзного процесса РЗ, включают: значительный рост в крови относительного и абсолютного числа СБЗ+/С056+ клеток, а также содержания С056Ьп§Ь1 субпопуляции естественных киллеров; изменение соотношения СЭ4+ и СБ8+ субпопуляций ЕКТ в пользу СВЗ+/СБ56+/СБ4+ клеток; падение экспрессии ингибирующих пектиновых рецепторов С094 при дихотомии со стороны экспрессии активирующих ЫКШБ; дискоординация цитотоксических свойств СВ56+ клеток по экспресии рецептора естественной цитотоксичности (№Ср46) и маркеру цитолитических гранул (СБ 107а); падение уровня профиброзного цитокина ТФРр и рост уровня ИЛ-10 с его противофиброзными эффектами.

6. Уточненные схемы иммунопатогенеза хронических гепатитов В и С и новый методический подход к неинвазивной диагностике фиброза печени позволили разработать Иммунотест ХГВ/Р1, включающий 6 параметров иммунного статуса с учетом диапазонов их значений, для идентификации стадии Р1 у больных ХГВ, а также Иммунотест ХГС/РЗ на основе 9 иммунологических параметров в определенных диапазонах значений для идентификации стадии РЗ у больных ХГС.

7. Результаты общеклинических методов исследования (анализ клинических данных, гемометрия, биохимические исследования крови) значительно уступают по информативности Иммунотестам ХГВ/Р1 и ХГС/РЗ.

8. Иммунотест ХГВ/Р1 в 95% доверительном интервале 5,27 - 5,77 и Иммунотест ХГС/РЗ в 95% доверительном интервале 8,15 - 8,96 обладают диагностической точностью 92-98%, чувствительностью 100%, специфичностью 91-99%, прогностической ценностью положительного результата 100% при высоком уровне взаимосвязи чувствительности и специфичности (АШЮС) -0,978 и 0,993, соответственно.

9. Иммунотесты ХГВ/Р1 и ХГС/РЗ не требуют учета пола и возраста пациентов, вирусной нагрузки и генотипа возбудителя, предназначены для неинвазивного мониторинга больных хроническими гепатитами В и С и, по

данным мета-анализа, обладают высокой конкурентоспособностью по отношению к другим методам неинвазивной диагностики фиброза печени при данных заболеваниях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Иммунотест ХГВ/Р1 предназначен для диагностики стадии Р1 фиброза печени у больных с верифицированным диагнозом хронического гепатита В при первичной диагностике фиброза, а также в ходе мониторинга пациентов с данным заболеванием при отсутствии фиброза (стадия РО) и на начальной стадии фиброзного процесса (стадия Б1), установленных посредством биопсии печени с гистологической оценкой образцов печеночной ткани по шкале МЕТА УТЯ.

2. Иммунотест ХГВ/Р1 заключается в определении иммунологических параметров крови: моноциты <3,6%; СВЗ+СБ8+ клетки <19,6% или >30,6%; СВЗ+/СБ56+/СБ4+ клетки <2,9% или >9%; СБЗ+/СВ56+/С08+ клетки <71,8% или >82,4%; СБ56+/Жр46+ клетки <35% или >62%; ТФРР >10,3 пг/л. Суммарная оценка Иммунотеста ХГВ/Р1 проводится в баллах по числу совпадений показателей у больного с предложенными диапазонами значений.

3. При величине 5-6 баллов Иммунотест ХГВ/Р1 считается положительным, при величине < 4 - отрицательным.

Положительный результат Иммунотеста ХГВ/Р1 у больных хроническим гепатитом В следует расценивать: при мониторинге на стадии РО как дебют фиброзного процесса (переход на стадию Р1); при первичной диагностике фиброза и на стадии Р1 как наличие стадии Р1 фиброза печени.

Отрицательный результат Иммунотеста ХГВ/Р1 у больных хроническим гепатитом В в любой клинической ситуации следует расценивать отсутствие стадии Р1 фиброза печени.

4. Иммунотест ХТС/ТЗ предназначен для диагностики стадии РЗ фиброза печени у больных с верифицированным диагнозом хронического гепатита С при первичной диагностике фиброза, а также в ходе мониторинга пациентов с данным заболеванием на стадиях фиброза Р1-РЗ, установленных посредством биопсии печени с гистологической оценкой образцов печеночной ткани по шкале МЕТАУШ.

5. Иммунотест XTC/F3 заключается в определении иммунологических параметров крови: CD3+CD56+ клетки >3,7% или Х),08*109/л; CD3+/CD56+/CD4+ клетки >23,8%; CD3+/CD56+/CD8+ клетки <47,6% или >66,7%; CD56+/ CD94+ клетки <46,7%; CD56+/ NKG2D+ клетки <95,9% или >98,4%; CD56+/NKp46+ клетки <28,9% или >40,5%; CD56+/ CD107a+ клетки <98,2%; ТФРр <11,0 пг/л. Суммарная оценка Иммунотеста XTC/F3 проводится в баллах по числу совпадений показателей у больного с предложенными диапазонами значений.

6. При величине 8-9 баллов Иммунотест XTC/F3 считается положительным, при величине < 7 - отрицательным.

Положительный результат Иммунотеста XTC/F3 у больных хроническим гепатитом С следует расценивать как наличие стадии F3 фиброза печени. Положительный результат Иммунотеста XTC/F3 является показанием для отнесения больного в группу риска по развитию цирроза печени.

Отрицательный результат Иммунотеста XTC/F3 у больных хроническим гепатитом С при первичной диагностике фиброза печени и на стадиях F0-F2 следует расценивать отсутствие стадии F3 фиброза печени. Отрицательный результат Иммунотеста XTC/F3 у больных хроническим гепатитом С при мониторинге больного на диагностированной ранее стадии F3 фиброза следует расценивать как угрозу развития цирроза печени, что является показанием к проведению пункционной биопсии печени.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. И.П.Балмасова, М.И.Панина, Е.С.Ефратова. Аминорегупяторные взаимосвязи лимфоцитов различных категорий // International Journal of Immunorehabilitation. - 2000. - Vol. 2, № 2. - P. 94.

2. I.P.Balmasova, M.I.Panina, E.S. Efratova. Amine-regulatory interaction of various catégories of lymphocytes // International Journal of Immunorehabilitation. - 2000. -Vol.2, №3.-P.129.

3. М.В.Калышенко, Е.С.Ефратова, О.В.Лавров. Иммунологические особенности ряда вирусных инфекций у больных с наркотической зависимостью // International Journal of Immunorehabilitation. - 2001. - Vol.3, №1. - P. 86.

4. М.В.Калышенко, И.П.Балмасова, Е.С.Ефратова. Влияние наркотической зависимости на иммунологическую перестройку организма при некоторых вирусных инфекциях //Аллергология и иммунология. -2001. - Т.2, №2. - С.58.

5. Е.В.Кабанова, Е.С.Малова, И.П.Балмасова, Р.И. Сепиашвили. Система больших гранулярных лимфоцитов при носительстве вирусов гепатитов В и С // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т.6, № 4. - С. 472-479.

6. Т.А.Славянская, Е.В.Кабанова, Е.С.Малова, Е.В.Плескановская. Иммунодиагностика носительства вирусов гепатитов В и С в нагрузочных тестах с биогенными аминами // Научные труды I Съезда физиологов СНГ. Сочи. - 2005. - Т. 2. -С. 106.

7. И.В.Нестерова, И.П.Балмасова, В.А.Козлов, Е.С. Малова, Р.И. Сепиашвили. Синдром хронической усталости и иммунной дисфункции у лиц с рецидивирующими инфекциями: клинико-иммунологические черты и особенности серотонинергической регуляции // Цитокины и воспаление. - 2006. - Т. 5, № 2. - С. 3-14.

8. Р.И.Сепиашвили, И.П. Балмасова, Е.В.Кабанова, Е.С.Малова, Т.А. Славянская. Вирус гепатита В: биология, иммунопатогенез, система ЕК/ЕКТ при вирусной персистенции // ЖМЭИ. - 2006. - № 6. - С. 76-83.

9. Р.И.Сепиашвили, И.П. Балмасова, Е.В.Кабанова, Е.С.Малова, Е.В. Плескановская. Вирус гепатита С: биология, иммунопатогенез, система ЕК/ЕКТ при вирусной персистенции // ЖМЭИ. - 2006. - № 7. - С. 109-116.

10. I.P.Balmasova, N.D.Yushchuk, O.O.Znoiko, E.V. Shmeleva, E.S. Malova et al. NK/NKT Ratio as a Prognostic Marker of Chronic Hepatitis С // New Horizons in Allergy, Asthma & Immunology. Editor R.Sepiashvili. Medimond International Proceedings. - 2009. -P. 183-188.

11. I.V.Nesterova, I.P.Balmasova, E.S.Malova. Peculiarities of disorders of antiviral immunity in chronic fatigue syndrome in association with viral infections // Abstracts of International Symposium «Interaction of Neural and Immune Systems in Health and Disease». Sankt-Petersburg. - 2007. - P. 13.

12. И.П. Балмасова, Н.Д. Ющук, О.О.Знойко,..., Е.С.Малова и др. Соотношение субпопуляций ЕК/ЕКТ как прогностический критерий хронического гепатита С // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10, № 3. - С. 340-343.

13. И.П.Балмасова, Е.С.Малова, Е.В.Шмелева и др. Состояние рецепторного аппарата естественных киллеров в начале фиброзных изменений в печени у больных хроническим вирусным гепатитом В // Российский аллергологический журнал. — 2010. — № 1, вып. 1.-С. 18-19.

14. Е.С.Малова, И.П.Балмасова, Е.В.Шмелева и др. Естественная цитотоксичность на разных стадиях фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С // Российский аллергологический журнал. - 2010. - № 1, вып. 1. - С. 114115.

15. Е.С.Малова, И.П.Балмасова, Е.В.Шмелева и др. Функциональное состояние CD56+ клеток при фиброзе печени у больных хроническим вирусным гепатитом В // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение № 35. Материалы XV Российской конференции «Гепатология сегодня». Москва. - 2010. -С. 39.

16. Е.С.Малова, Е.В.Шмелева, И.П.Балмасова и др. Естественная цитотоксичность при фиброзе печени у больных хроническим вирусным гепатитом С // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение № 35. Материалы XV Российской конференции «Гепатология сегодня». Москва. - 2010. -С. 40.

17. И.П.Балмасова, Е.С.Малова, Е.В.Шмелева, О.Ф. Еремина. Иммунодиагностика начала фиброзных изменений в печени при хроническом вирусном гепатите В // Сборник материалов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва. - 2010. - С. 40.

18. Е.В.Шмелева, Е.С.Малова, И.П.Балмасова и др. Характеристика рецепторного аппарата естественных киллеров при хроническом вирусном гепатите С // Сборник материалов XVII Российско- го национального конгресса «Человек и лекарство». Москва. - 2010. - С. 306.

19. И.П.Балмасова, Н.Д. Ющук, Е.С.Малова и др. Иммунологические признаки дебюта фиброзных изменений в печени у больных хроническим гепатитом В // Международный журнал по иммунореабилитации. - 2010. - Т. 12, № 2. - С. 104.

20. Е.С.Малова, Е.В.Шмелева, И.П.Балмасова, Н.Д. Ющук. ЕКТ на разных стадиях фиброза печени у больных хроническим гепатитом С // Международный журнал по иммунореабилитации. - 2010. - Т. 12, № 2. - С. 127.

21. E.S.Malova, E.V.Shmeleva, I.P.Balmasova et al. Immunologic signs of fibrous changes debut in the liver of patients with chronic hepatitis В // Advances in allergy, asthma & immunology: from basic science to clinical management. Ed. Revas Sepiashvili. MEDIMOND International Proceedings. - 2010. - P. 115-119.

22. И.П.Балмасова, Е.В.Шмелева, Е.С.Малова и др. Естественные киллеры во взаимодействиях врожденного и приобретенного иммунитета // Тезисы докладов XXI съезда физиологического общества им. И.П.Павлова. Москва-Калуга. - 2010. - С. 48.

23. I.P.Balmasova, E.S.Malova, N.D.Yushchuk, E.V. Shmeleva. Expression of C-lectin-type receptors with natural killers in prognosis of cirrhosis in chronic hepatitis С patients // International Immunology. - 2010. - Vol. 22, N 1. 14th International Congress of Immunology, Kobe, Japan. Day 2. - PP-025-115.

24. И.П.Балмасова, Е.С.Малова, Е.В.Шмелева и др. Трансформирующий фактор роста р и цитотоксичность CD56+ клеток при фиброзе и циррозе печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С // Российский аллергологический журнал. - 2010. - № 5. - Вып. 1. - С. 21-22.

25. Е.С.Малова, Н.Д.Ющук, И.П.Балмасова, Е.В.Шмелева. CD56+ лимфоциты и иммунопатогенез хронического гепатита С // Иммунология. - 2010. - Т.31. - № 6. - С. 310-315.

26. Е.С. Малова, И.П. Балмасова, Н.Д. Ющук и др. Связь между экспрессией рецепторов лектинового типа нормальными киллерами и выраженностью фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С // ЖМЭИ. - 2010. - № 6. - С. 48-52.

27. Е.С.Малова, О.Ф.Еремина, Н.Д.Ющук, И.П.Балмасова. Мета-анализ неинвазивных способов определения стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 8. - С. 122-129.

28. Е.С.Малова, Н.Д.Ющук, О.Ф.Еремина, И.П.Балмасова. Иммунопатогенез хронического гепатита В и его связь с молекулярной биологией вируса гепатита В // Физиология и патология иммунной системы. - 2010. - Т. 14, № 7. - С. 14-24.

29. Н.Д.Ющук, И.П.Балмасова, О.О.Знойко, ..., Е.С. Малова и др. Способ оценки фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С / Положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2009144106/15(062739) от 30.11.2009 г.

Малова Е.С.

«Хронические гепатиты В и С: иммунопатогенез и иммунодиагностика фиброзных изменений в печени»

В работе сформулирован новый методический подход к разработке способов неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С, основу которого составляет положение о смене ключевых ролей отдельных компонентов иммунной системы на разных стадиях фиброзного процесса. Целесообразность такого подхода подтверждена данными мета-анализа современного состояния неинвазивной диагностики указанных заболеваний, а также результатами изучения типовых иммунограмм у больных хроническими гепатитами В и С на разных стадиях фиброза печени. Было установлено, что роль одного из ведущих компонентов иммунной системы в развитии дебюта фиброзных изменений в печени при хроническом гепатите В и стадии предцирротических изменений в печени при хроническом гепатите С выполняют CD56+ лимфоциты (естественные киллеры и ЕКТ) различных фенотипов. Уточненные схемы иммунопатогенеза хронических гепатитов В и С с участием CD56+ лимфоцитов позволили разработать Иммунотест ХГВ/Fl, включающий б параметров иммунного статуса, для идентификации стадии F1 у больных ХГВ, а также Иммунотест XrC/F3 на основе 9 иммунологических параметров в определенных диапазонах значений для идентификации стадии F3 у больных ХГС. Иммунотест ХГВ/Fl в 95% доверительном интервале 5,27 - 5,77 и Иммунотест ХГОТЗ в 95% доверительном интервале 8,15 - 8,96 обладают диагностической точностью 92-98%, чувствительностью 100%, специфичностью 9199%, прогностической ценностью положительного результата 100% при высоком уровне взаимосвязи чувствительности и специфичности (AUROC) - 0,978 и 0,993, соответственно.

Malova E.S.

"Chronic hepatitis В and С: immunopathogenesis and immunodiagnosis of flbrotic changes in liver"

It was developed a new methodologic approach to the methods of non-invasive liver fibrosis stages in chronic hepatitis В and С patients which based on the changing the key roles of immune system components at different stages of flbrotic process. Feasibility of this approach is confirmed by the meta-analysis of the current status of non-invasive diagnostic methods in these diseases, as well as the results of the study of routine immunogramms in chronic hepatitis В and С patients at various stages of liver fibrosis. It was found that one of the major components of the immune system in the debut of flbrotic changes in chronic hepatitis В and at precirrhotic stage in chronic hepatitis С were CD56+ lymphocytes (natural killer cells and NKT) of different phenotypes. On the basis of refined schema of chronic hepatitis В and С immunopathogenesis with CD56+ lymphocytes participation have developed Immunotest CHB/F1, comprising 6 parameters of immune status for identification of F1 stage in chronic hepatitis В patients and Immunotest CHC/F3 based on 9 immunological parameters for identification of F3 stage in chronic hepatitis С patients. The diagnostic accuracy of Immunotest CHB/F1 at 95% confidence interval 5.27-5.77 and Immunotest CHC/F3 at the 95% confidence interval 8.15-8.96 was 92-98%, the sensitivity was 100%, the specificity was 91-99%, and positive predictive value was 100%, the level of sensitivity and specificity ratio (AUROC) was 0.978 and 0.993 respectively.

Формат 60x90/16. Заказ 983. Тираж 100 экз. Подписано в печать 27.12.2010 г. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Хронические гепатиты B и C: иммунопатогенез и иммунодиагностика фиброзных изменений в печени

Автореферат диссертации по медицине на тему Хронические гепатиты B и C: иммунопатогенез и иммунодиагностика фиброзных изменений в печени

Похожие научные работы

Каталог диссертаций